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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ

Facultad de Ciencias Naturales y Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Exactas Escuela de Biología Escuela de Biología

Informe n°3 Informe N°2: Diluciones seriadas II Punto Isoeléctrico de Aminoácidos y Proteínas

QM 300

3er Año

1er Sem.

14 de abril

2015 Tec. Médica

Título: Diluciones seriadas 2 Resumen: En la presente experiencia con la finalidad de adquirir destrezas en la preparación de diluciones; además de determinar la concentración desconocida de las mismas mediante la utilización del espectrofotómetro, el cual proporciona las variables para dicho cálculo; se procedió a realizar una serie de diluciones seriadas a partir de una solución madre 25 mM, empleando una dilución de 1:2, realizando seis diluciones con lo que se obtuvo las siguientes concentraciones: C(inicial)=25 mM, M1=12.5 mM, M2=6.25 mM, M3=3.125 mM, M4=1.562 mM, M5=0.781 mM, M6=0.391 mM, M7=0.195 mM Obteniendo como resultado un volumen final de 1mL, en donde se tomó 0.5mL de soluto y 0.5mL de solvente. Podemos concluir que una dilución puede ser útil para obtener resultados más manejables.

Objetivo:  Adquirir destrezas en la preparación de diluciones seriadas empleadas en el laboratorio.  Confeccionar gráficas de Abs. vs C para determinar la concentración de una muestra desconocida.

Introducción: DILUCIÓN La dilución es el procedimiento que se sigue para preparar una disolución menos concentrada a partir de una más concentrada.

Definición general de disolución: Una dilución es una mezcla homogénea, uniforme y estable, formada por dos o más sustancias denominadas componentes. La sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de solvente, y a la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta. El soluto puede ser un gas, un líquido o un sólido, y el disolvente puede ser también un gas, un líquido o un sólido. (Domingo, A., 2014) DILUCIONES SERIADAS Hay muchas situaciones en que las cantidades de sustancia necesarias para ver un efecto son extremadamente pequeñas (por ejemplo un fármaco para tratar una enfermedad, una hormona para estudiar su efecto en un animal de experimentación, etc.) y difícilmente se pueden pesar o medir en esas proporciones tan pequeñas. En esas situaciones es necesario recurrir a la preparación de una solución de alta concentración (o solución de stock o solución madre) y hacer diluciones seriadas a partir de ésta. (Machado, S., 2006).

Un espectrofotómetro es un dispositivo utilizado para medir la luz a una longitud de onda determinada. Está compuesto por dos partes: un espectrómetro y un fotómetro. El espectrómetro proporciona luz a una longitud de onda específica. El fotómetro mide la intensidad de la luz. Mediante el cálculo de la cantidad de luz que una solución es capaz de absorber y la aplicación de la ley de Beer, el espectrofotómetro puede determinar la concentración de una solución con color. (Radcliff, D., 2014).

Materiales, Reactivos y Equipo: Materiales:  Pipeta Capacidad: 5mL Marca:  Vaso químico Capacidad: 100mL Marca: Kimax  Tubos de ensayo Capacidad: 100mL  Espátula Capacidad: 100 ml

D=0,1 g  Espectrofotómetro: Marca:  Laptop: Marca: Toshiba Modelo: Satélite

Metodología:

I.

cálculos previos para preparar 50mL de dicromato de potasio a 25mM.

Reactivos:  Agua destilada (H2O) ,  Dicromato de potasio (K2Cr2O7) Concentración: 25 mM Apariencia: Anaranjado intenso. Masa molar: 294,18 g/mol. Punto de fusión: 671,15 K (398 °C). Punto de ebullición: 773,15 K (500 °C). Densidad: 2.676 (a 25 °C respecto al agua a 4 °C). Solubilidad: 130 g/l a 20 °C en agua Riesgos a la salud: El principal problema de este producto es su capacidad para corroer e irritar piel, ojos, membranas mucosas y tracto respiratorio, así como hígado y riñones, por lo que es peligroso inhalado, ingerido o por contacto con la piel. Se ha informado de efectos tóxicos de este producto sobre los sistemas circulatorio y nervioso central, pulmones, corazón, riñones y tracto gastrointestinal de conejos expuestos a concentraciones crónicas. Equipo:  Balanza analítica: Marca: Sartorius Max 220g

Solución Madre: se realizó los

II.

Diluciones Seriadas: se realizó los cálculos para preparar 5mL de dilución seriadas 1:2, con los que se realizaron las diluciones.

III.

Determinación de la longitud de onda máxima: se seleccionó una de las diluciones y se siguió las instrucciones del profesor para determinar la longitud de onda máxima del dicromato de potasio.

IV.

Curva de calibración: después de haber realizado la lectura de la absorbancia de las diluciones preparadas a la longitud de onda determinadas se construyó una gráfica A vs C empleando el método de regresión lineal, luego se determinó la ecuación de la línea recta para las disoluciones preparadas.

Resultados: 6.25𝑚𝑀 ×

I.

Solución Madre:

1 = 3.125𝑚𝑀 2

4. C4= C1 × D= 3.125𝑚𝑀 ×

1 = 1.562𝑚𝑀 2

5. C5= C1 × D= 1.562𝑚𝑀 ×

1 = 0.7812𝑚𝑀 2

6. C6= C1 × D=

Datos: I.

0.7812𝑚𝑀 ×

Cálculos de la madre (mg/mL):

concentración

Concentración Molar: 25mM=0.0025M Volumen de solución madre: 50mL= 0.05L Calcular los gramos de dicromato que se necesitan: 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 [𝑀] = 𝑃. 𝑀 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝐿)

7. C7= C1 × D= 1 = 0.195𝑚𝑀 2 Determinar el volumen del soluto y solvente a partir de un volumen final de 5mL de solución. 0.391𝑚𝑀 ×

V (soluto)= V (solución) × D= 5mL ×

Gramos = M×P.M.×V= 0.0025M×294.18g/mol×0.05L = 0.367gramos. II. Cálculos de concentraciones de las diluciones seriadas 1:2 a partir de la concentración madre 25mM. 1. C1= Ci × D=

1 2

= 2.5mL

V (solvente)= V (solución) – V (soluto)= 5mL - 2.5mL= 2.5mL

1

25𝑚𝑀 × = 12.5𝑚𝑀 2

C1= 12.5mM 2. C2= C1 × D= 1

12.5𝑚𝑀 × 2 = 6.25𝑚𝑀

3. C3= C1 × D=

1 = 0.391𝑚𝑀 2

D= 1:2, FD= 2, V (soluto)= 2.5mL, V (solvente)= 2.5mL, V (solución)= 5mL.

C5=0.781mM C2= 6.25mM D= 1:4, FD= 4, V (soluto)= 2.5mL, V (solvente)= 2.5mL, V (solución)= 5mL.

D= 1:32, FD= 32, V (soluto)= 2.5mL, V (solvente)= 2.5mL, V (solución)= 5mL.

C6=0.391mM C3= 3.125mM D= 1:8, FD= 8, V (soluto)= 2.5mL, V (solvente)= 2.5mL, V (solución)= 5mL.

D= 1:64, FD= 64, V (soluto)= 2.5mL, V (solvente)= 2.5mL, V (solución)= 5mL.

C4= 1.562mM

C7=0.195mM

D= 1:16, FD= 16, V (soluto)= 2.5mL, V (solvente)= 2.5mL, V (solución)= 5mL.

D= 1:128, FD= 128, V (soluto)= 2.5mL, V (solvente)= 2.5mL, V (solución)= 5mL.

III. Tabla de datos y gráfico: Tabla n° 1: Datos de la absorbancia versus la concentración. Absorbancia Concentración (Y) (X) (blanco) 0 0 0.141 0.459 0.354 0.917 0.792 1.83 1.54 3.76

1.2

1.201

Absorbancia

1.4

y = 0.3548x + 0.09 R² = 0.9829 R= 0.99141

1

0.8 0.618

0.6 0.4

0.371 0.269 0.228

0.2 0

0 0

1

2

3

Concentración

Lectura espectrofotométrica: λ=467nM Fig. N°1: Grafico donde se muestra la relación de absorbancia vs concentración. IV. Ecuación: Y= 0.3548x + 0.09

Discusión: Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de onda, esto significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda. Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

4

La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. (Baz, C., 2010). La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. (Sánchez, D., 2009). Lo anterior lo comprobamos experimentalmente, al utilizar una disolución de dicromato de potasio 25mM, de la cual extraímos 5 ml para llevar a cabo diluciones seriadas 1:2 (7 diluciones seriadas) que fueron preparadas a diferentes concentraciones. Estas concentraciones desconocidas, mediante la utilización del espectrofotómetro, con el cual obtuvimos la absorbancia de cada muestra, fue posible que se determinaran realizando los cálculos antes expuestos en la sección de resultados, obteniéndose que mientras más concentrada la sol., mayor absorbancia, esto debido a lo expuesto por la Ley de Beer: la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Por lo cual lógicamente mientras mayor concentrada esté la solución, mayor será su absorbancia. Elaboramos luego una gráfica de absorbancia vs concentración con los datos obtenidos en el espectrofotómetro

utilizando una luz de onda de λ=467nM, se puede deducir que la absorbancia aumenta con la concentración de las soluciones y la distancia que recorre el rayo de luz, debido a que hay mayor cantidad de analito (mayor cantidad de moléculas que adsorben energía para excitarse). Las cuales toman esta energía del ayo de luz, disminuyendo la intensidad de la radiación, por lo que la transmitancia disminuye al aumentar la concentración. (ANYELA, 2011). También se puede utilizar esta ecuación para conocer la pendiente y la ordenada al origen a partir de una ecuación dada como se muestra en la figura n°1 de la gráfica. Ejemplo: La ecuación y = 0.3548x + 0.09 tiene pendiente 0.3548 y coeficiente de posición 0.09. (R2 se llama coeficiente de determinación). Según el grafico nuestra R2 fue de 0.9829. Con la mayoría de las calculadoras científicas puede calcularse la ecuación de la recta y el coeficiente R. Este coeficiente nos informa del grado de relación entre dos variables. Si la relación es lineal perfecta, R será 1. El coeficiente R será positivo si la relación es positiva (al aumentar x aumenta y), y R será negativo en el caso contrario (si al aumentar x, disminuye y). Por lo que al calcular R a partir de R2 obtuvimos un valor aceptable de 0.99141, como lo muestra en la figura n°1. Para obtener fieles resultados es necesario ser cuidadosos con la manipulación de la muestra y de la celda, para evitar que las muestras se confundan; así como también ir de la muestra más diluida a la más concentrada para evitar mediciones de absorbancia erradas. (F. Javier Sánchez San Román, 2012).

Conclusiones: A través de esta práctica podemos concluir la importancia de adquirir destrezas para en empleo y preparación de soluciones y diluciones seriadas en el laboratorio clínico. Las diluciones en serie nos permite preparar diluciones homogéneas con concentraciones sumamente pequeñas, no solo en uso del área química sino como también en microbiología para la dilución de células bacterias. Con el espectrofotómetro medimos un espectro de luz. Absorbancia es la medición de la luz absorbida. Blanco es la medida inicial para poder descartar errores. A mayor concentración, mayor cantidad de luz es absorbida y viceversa. La ecuación relaciona Y (absorbancia) con X (la concentración de la solución en cada caso). Entonces, reemplazando el valor de absorbancia de la muestra incógnita en esta ecuación, puede obtenerse el valor de concentración, ya que es directamente proporcional a su absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración y la transmitancia es inversamente proporcional a esta.

Bibliografía: 

Baz, Catty (2010). Espectrofotometría. [En línea]. Consulta: 11 de abril de 2015. Disponible en: http://www.buenastareas.com/ensayos/ Espectrofotometr%C3%ADa/468724.ht ml

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Domingo, Alberto (2014). Diluciones seriadas. [En línea]. Licencia Creative Commons Atribución-NoComercialCompartirIgual 4.0 Internacional. Consulta: 28 de marzo del 2015. Disponible en: http://www3.uah.es/cuadernolab/p/inde x.php/category/estudiantes/ F. Javier Sánchez San Román, (2012). Salamanca. Correlación lineal y regresión. Consultado el 13 de abril del 2015. http://hidrologia.usal.es/practicas/correl acion/Correlacion_explicacion.pdf Machado, Silvana (2006). Diluciones. [En línea]. Consulta: 2 de abril de 2015. Disponible en: http://diluciones.blogspot.mx/2006/03/2 -diluciones-seriadas.html Radcliff, Denielle (2014). Cómo utilizar un espectrofotómetro. [En línea]. Consulta: 11 de abril de 2015. Disponible en: http://www.ehowenespanol.com/utilizar -espectrofotometro-como_46647/ Sánchez, Dario (2009). Ley De Beer. [En línea]. Consulta: 11 de abril de 2015. Disponible en: http://www.slideshare.net/jasd27/leyde-beer