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• Fariha Ghaada Ghaada

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DETERMINACION DE PROTEINAS EN LA QUINUA (chenopodium quinoa) I Introducción Las proteínas son componentes importantes de los alimentos, cuyas fuentes, tanto de origen vegetal como animal, debido a su gran importancia nutricional y comercial, han sido estudiados con detalle. El aporte de las proteínas como alimento estructurante y como fuente energética y funcional es ampliamente conocido. Las propiedades físicas y organolépticas de muchos alimentos, así, como la consistencia y textura de la carne, el queso o el pan, dependen en gran medida de la naturaleza de las proteínas que los constituyen. Asimismo, en alimentos elaborados con una presencia menor de proteínas, pueden jugar un papel muy importante, influyendo en las características funcionales, como la formación de emulsiones, geles, espumas y la absorción de agua o aceite. Además de su papel básico en la nutrición, las proteínas poseen propiedades fisicoquímicas que les otorgan propiedades funcionales (confieren sus propiedades químicas y físicas a los productos en los que se emplean y contribuyen a la calidad del producto final) en formas muy específicas al ser adicionadas a ciertos alimentos. La industria alimentaría ha recurrido en forma habitual a la utilización de productos proteicos con fines tecnológicos y funcionales. A partir de esta necesidad, se desarrollaron distintos procesos para aislar o extraer las proteínas de sus fuentes animales o vegetales. Obteniéndose los aislados y concentrados proteicos II Objetivos  Determinar el porcentaje proteico de la quinua (chenopodium quinoa) con el método de kjendahl y realizar consideraciones que se debe tener en cuenta sobre el método aplicado. III Marco teórico 3. 1 ASPECTOS GENERALES

3. 1. 1 Clasificación Botánica De La Quinua De acuerdo a Bambrilla (1972), citado por Ríos y Kamishikiriyo (1977), se tiene la siguiente clasificación botánica: Reino: Vegetal División: Fanerógamas Clase: Angiospermas Sub clase: Dicotiledóneas Orden: Centrospermas Familia: Quenopodiáceas Género: Chenopodium Especie: Chenopodium quinoa 3. 1.2 Descripción de la planta La planta de la quinua (Chenopodium quinoa) puede llegar a medir entre 0,5 m y 3,5 m de altura, dependiendo de la variedad y piso ecológico donde se cultive, su tallo puede ser recto o ramificado, de color variable. La espiga de la quinua, denominada panoja, tiene entre 15 cm y 70 cm, puede llegar a tener un rendimiento de 220 g de granos por panoja. Las

semillas o granos pueden ser blancos, café, amarillos, grises, rosados, rojos o negros (Repo-Carrasco, 1988). El pericarpio del fruto está pegado a la semilla, presenta alveolos, a su vez el grano o semilla, que es un dicotiledón, está envuelto por el episperma (casi adherido). El embrión está formado por los cotiledones y la radícula, y constituye la mayor parte de la semilla que envuelve al perisperma, tal como se ilustra en la Figura 1.

** Figura 1: Estructura del grano de quinua (Chenopodium quinoa) Fuente: Villacorta y Talavera, 1976. **http://tesis.unjbg.edu.pe:8080/bitstream/handle/unjbg/120/17_Alvarez_Carita_YC_FCAG_Industrias_Alimentarias_2012.pdf?sequence =1

El episperma ha sido estudiado por Villacorta y Talavera (1976), quienes describen cuatro capas:    

Una capa externa que determina el color amarillo de la semilla de superficie rugosa, quebradiza y seca. Se desprende fácilmente con agua caliente (80 ºC - 100 ºC). En esta capa se ubica la saponina. La segunda capa difiere de la primera en el color y solo es observable cuando la primera es translúcida. La tercera capa es una membrana delgada, opaca y ligeramente amarilla. La cuarta capa es translúcida y está formada por una hilera de células que cubre el embrión.

3. 1.3 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL GRANO DE QUINUA (Chenopodium quinoa) Según Pérez et al. (1997), la quinua es catalogada como un pseudocereal, debido al comportamiento aminoacídico que es similar al de las leguminosas. El contenido de proteínas y grasa de este grano es más alto que en el de otros cereales, en el Cuadro 1 se puede apreciar la composición química del grano de quinua. Cuadro 1: Composición del grano de quinua (g/100g).

Valores nutricionales del grano de quinua

Fuente: Fontúrbel, F a. Proteínas: La mayor parte de las proteínas se encuentran en el germen, este representa aproximadamente el 30% del peso de toda la semilla. En 1978 Scarpati de Briceño, determinó las fracciones proteicas de la quinua, un 45% estaba conformado por albúminas y globulinas, 23% por prolaminas y un 32% por glutelinas. Las proteínas solubles (albúminas y globulinas) tienen mayor contenido de aminoácidos esenciales, especialmente lisina, que las proteínas insolubles (prolaminas y glutelinas) (Repo-Carrasco, 1995). La lisina, aminoácido limitante en los alimentos de origen vegetal se encuentra en la quinua en una proporción del doble que en la de otros cereales, la concentración de metionina es el 25% más que la de otros cereales, la concentración de triptófano es más o menos el mismo que en la cebada, avena y trigo. Siendo su aminoácido limitante la metionina (Pérez et al., 1997).

b. Lípidos: Un 6,1% de la composición total de la quinua está representada por lípidos. De los cuales un 48% está constituido por el ácido oleico, 50,7% de ácido linoléico, 0,8% de ácido linolénico y 0,4% de ácidos saturados con el ácido palmítico como predominante (Bruin, 1964, citado por Repo-Carrasco, 1988).

c. Carbohidratos: El contenido de carbohidratos en la quinua difiere según sus variedades (ver Cuadro 3). El almidón es el principal carbohidrato, pues constituye entre un 58,1 - 64,2%, este se ubica en el perisperma a diferencia de los cereales que lo almacenan en el endospermo.

d. Vitaminas y minerales: El grano de la quinua no solo es importante por la calidad de sus proteínas, sino también por el contenido de las mismas, existen vitaminas del grupo B en apreciable cantidad al igual que en los cereales comunes, pero a diferencia de ellos en su composición tiene vitamina C, lo que le da la superioridad en la ración alimentaria. La quinua es rica en fósforo y potasio (representa hasta un 65% del total de cenizas), el contenido en hierro y calcio en la quinua es mayor a la del trigo, aunque esta última siga siendo deficiente en proporción con el fósforo, para la relación Calcio: Fósforo (Paredes, 1993). Bruin (1964), citado por RepoCarrasco (1988), menciona que la quinua contiene relativamente una alta cantidad de vitamina E (46 ppm -59 ppm de M.S.) Proteínas Las proteínas forman parte de las enzimas, los anticuerpos, la sangre, la leche, la clara de huevo, etc. Son moléculas complejas, la más pequeña de las conocidas tiene una masa molecular de 5 000; las más grandes tienen masas moleculares del orden de los diez millones. Ejemplo de una proteína "sencilla" es la llamada lactoglobulina (presente en la leche) que tiene una masa molecular de sólo 42 mil y una fórmula aproximada de C(1864)H(3012) O(576) N(468) S(21). A semejanza de los carbohidratos, las proteínas están formadas de unidades más pequeñas (en este caso los llamados aminoácidos), las cuales se unen para formar cadenas más largas. Tan sólo en las plantas se cuentan más de 100 aminoácidos identificados, sin embargo hasta la fecha sólo unos 22 han sido identificados como constituyentes de las proteínas. Los aminoácidos se emplean en la digestión para construir nuevas proteínas y tienen, como podía suponerse, un grupo ácido (llamado carboxil) -COOH y un grupo amino -NH2 o imino = NH. Ambos grupos están unidos, junto con un átomo de hidrógeno, al mismo átomo de carbono (llamado carbono a). La diferencia entre los aminoácidos radica en la cadena R de átomos unida al grupo antes descrito. Ejemplo de la estructura de los aminoácidos: R – (H)CN(H2) – COOH Ejemplos de proteínas

La complejidad del encadenamiento de los aminoácidos es extraordinaria: se puede tener cadenas rectas, enrolladas, dobladas; en la Figura 2 se representa esquemáticamente la hemoglobina, proteína contenida en la sangre. Al parecer los encadenamientos se logran entre los carbonos a de los aminoácidos, eliminando agua. Las cadenas de proteínas pueden estar acomodadas paralelamente, como en la lana, el pelo o el tejido fibroso de la pechuga de pollo, o bien estar enredadas semejando una bola de estambre, como en la clara de huevo. Pueden desempeñar funciones muy diversas en el organismo; la miosina, por ejemplo, es una proteína contráctil presente en los músculos y también una enzima que hidroliza al ATP. Figura 2. Representación esquemática de la molécula de hemoglobina.

Estructura de las proteínas Las proteínas constituyen un grupo de sustancias muy heterogéneas, lo cual está dado por el hecho de que las moléculas proteicas son sustancias de elevada masa molar, formadas por un número variable de aminoácidos diferentes, lo que trae consigo una gran diversidad de estructuras como puede apreciarse incluso desde su clasificación. De manera general puede plantearse que son iones dipolares anfóteros que migran en campos eléctricos y al igual que los aminoácidos tienen puntos isoeléctricos característicos. La cadena que compone el esqueleto de las proteínas está formada por uniones amidas relativamente estables y con vistas a lograr un análisis más adecuado de su estructura se acostumbra a establecer determinados niveles de organización también denominados niveles estructurales que son: Nivel de organización primario o estructura primaria. Nivel de organización secundario o estructura secundaria. Nivel de organización terciario o estructura terciaria. Nivel de organización cuaternario o estructura cuaternaria. Funciones Funciones estructurales Ciertas partes del organismo animal, que sirven de sostén y protección a muchos tejidos están formadas por proteínas, ejemplo de las cuales son: 

La queratina, que se encuentra en las uñas, pezuñas, cuernos, lana, piel, plumas, caparazón de los moluscos



La elastina, se encuentra en los ligamentos.



El colágeno, en los tendones.



La fibroína, en la seda.

Funciones energéticas Ésta es una de las funciones secundarias que desempeñan las proteínas pero que es necesario tenerla en cuenta porque son capaces de liberar 4 kcal/g al ser metabolizadas. En casos extremos, en que el organismo no disponga de otros alimentos energéticos, puede consumir sus propios tejidos y utilizar las proteínas de éstos como fuente de energía. Funciones específicas 

Las nucleoproteínas, que se encuentran en el núcleo de las células, son responsables de la reproducción y de la transmisión de las características hereditarias.



Las enzimas, que están en todos los tejidos y actúan como catalizadores biológicos en las reacciones metabólicas.



Las cromoproteínas, que en su mayoría sirven para transportar gases, como la hemoglobina, en la sangre de los vertebrados, que transporta el oxígeno desde los pulmones hasta las células de los tejidos.

Varias hormonas, vacunas, antibióticos y virus, que son sustancias de gran actividad biológica, están formados por proteínas. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS Método de Kjeldahl En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total que las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no proteínas como las proteínas verdaderas. En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de ebullición y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el destilado se retiene o bien por un ácido normalizado y se valora por retroceso, o en ácido bórico y valora directamente. El método Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993) PROCEDIMIENTO El método consta de tres etapas: DIGESTIÓN – DESTILACIÓN – TITULACIÓN. En la DIGESTIÓN se produce la descomposición del nitrógeno que contienen las muestras orgánicas utilizando una solución de ácido concentrado. Esto se obtiene haciendo hervir la muestra en una concentración de ácido sulfúrico. El resultado es una solución de sulfato de amonio. En la etapa de DESTILACIÓN se libera amoniaco, el cual es retenido en una solución con una cantidad conocida de ácido bórico. Inicialmente se realiza una destilación con vapor por el método de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la obtención del destilado. Al final, se utiliza la TITULACIÓN para valorar finalmente la cantidad de amonio presente en la muestra destilada. REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL DIGESTIÓN catalizadores→ (1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 proteína calor→ NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN (2) (NH2)SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) → NH4 + H2BO3- (ión borato) TITULACIÓN El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl (o H2SO4) estandarizado: (4) H2BO3- + H+ → H3BO3 PROCESO DE DIGESTIÓN

Una serie de condiciones interrelacionadas en el proceso de digestión determinan la velocidad de la reacción y de la descomposición de nitrógeno en sulfato de amonio, como son la cantidad de calor transferida, la cantidad de sales para elevar la temperatura de ebullición del ácido, el catalizador empleado y el tiempo de la digestión. El ajuste de cualquiera de estos parámetros tiene influencia sobre el resto. Hay estudios que determinan los parámetros para obtener las condiciones óptimas dependiendo de la matriz de las muestras. Por ejemplo, la cantidad de ácido necesario varía dependiendo de la grasa que contiene la muestra. A más grasa, más ácido se requiere. También varía con el tiempo de la digestión. A mayor tiempo, más ácido perdido por evaporación. El tiempo de digestión debe determinarse dependiendo de la cantidad de recuperación mediante la utilización de muestras de matriz conocida. La adición de sales es útil para elevar la temperatura de ebullición del H2SO4. Dependiendo del tipo de sales empleadas, la temperatura puede pasar de ser de 330ºC estando el ácido sulfúrico sólo, a una de 400ºC, con lo que se acelera el ritmo de la descomposición y se acorta el tiempo de la digestión de forma considerable. PROCESO DE DESTILACIÓN El producto de la digestión suele ser diluido con agua libre de amoniaco para minimizar los efectos de las mezclas que contienen altas proporciones acido/sales. La mayor parte del NH3 es destilado y atrapado en la solución ácida durante los primeros 5 a 10 minutos de ebullición, pero dependiendo del volumen de la mezcla de la digestión y del método seguido entre 20 y 140ml de condensado puede ser recogido para obtener una completa recolección del nitrógeno. A veces se requiere alargar la destilación, lo cual produce mayor cantidad de agua pero esto no hace variar los resultados a la hora de hacer la valoración. La velocidad de la destilación varía con la capacidad de enfriamiento del condensador y con la capacidad de generar calor del calefactor. El sistema de calentar por arrastre de vapor de agua acelera la obtención del destilado. Utilizando una solución receptora a base de ácido bórico no se necesita dosificar con precisión, ya que la titulación mide exactamente la cantidad de amoniaco neutralizando a 1:1 el complejo formado por el amoniaco y el ácido bórico. De hecho, se puede añadir bastante bórico con el fin de asegurar la completa absorción del amoníaco. La solución receptora debe permanecer a 45ºC para evitar la pérdida de amoniaco. PROCESO DE VALORACIÓN El ácido bórico captura el gas de amoníaco y forma un complejo amoníaco-bórico. Cuando el amoníaco es capturado el color de la solución receptora cambia. Se procede de la siguiente forma: • Valorar el destilado con HCl o H2SO4 hasta el cambio de color. (Punto final: pH 4.65) Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra Moles de H2SO4= 2Moles de NH3 = 2Moles de N en la muestra De hecho, se pueden utilizar diferentes indicadores para obtener un viraje lo más limpio y pronunciado. Si se hace difícil detectar el punto de viraje, puede ser útil utilizar una solución de referencia de blanco. CÁLCULOS Al hacer los cálculos hay que tener en cuenta la solución receptora y los factores de dilución utilizados en proceso de destilación. Se pueden tomar referencias en los métodos de referencia publicados. • Realizar el cálculo:

mg N = N x V x 14 Dónde: N = Normalidad del ácido de valoración V = Volumen de ácido consumido 14 = Peso atómico del nitrógeno. • Para pasar a contenido de proteínas corregir por el factor adecuado según la naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto) • Periódicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado. % Proteins = P2/P0 x 100 x F Dónde: P2: Nitrógeno (mg). P0: Peso de la muestra (mg). F: Factor proteínico. (6.25 por defecto) IV Materiales y métodos La materia prima a analizar fue la quinua Materiales y reactivos

 Ácido sulfúrico concentrado  Catalizador (sulfato de potasio + sulfato de cobre)  Ácido bórico : indicador de pH (rojo metilo)  Ácido clorhídrico, aprox. 0.1 N  Hidróxido de sodio 40%  Agua destilada  Balones de digestión  Matraz Erlenmeyer  pipeta

Equipos

 Cocina pequeña de gas  Aparato de destilación Kjeldahl  Balanza analítica

El procedimiento consistió fue de la siguiente manera: Se pesó 0.3 g de muestra, luego se agregó 1 g del catalizador de oxidación (mezcla de sulfato de potasio y sulfato de cobre 50% cada uno) para acelerar la reacción. Se Limpió con un poco de agua el cuello del balón de digestión, luego se agregó 2.5 ml de ácido sulfúrico concentrado dando un color de la mezcla celeste y azul seguidamente se colocó el balón en la cocina de gas . La digestión termina cuando el contenido del balón es completamente cristalino. Se colocó la muestra digerida en el aparato de destilación, en un tubo que viene acondicionada en el equipo en este caso se lavó con una cantidad de agua para vaciar por completo la cantidad digestada añadiendo a esta un volumen de 40 ml aproximado de hidróxido sodio. Y por otro lado en un Erlenmeyer conteniendo 5 ml de la mezcla de ácido bórico más indicador de pH también se puso en la posición respectiva y se abrió la llave para poner en funcionamiento del condensador o llamado en la mayoría de los casos refrigerante,

inmediatamente conectar el vapor para que se produzca la destilación y recoger el destilado en el matraz con el ácido bórico e indicador que este último se añadió 3 gotas, la destilación termino cuando ya no pasa más amoniaco y hubo un viraje del indicador. Luego se procedió a la titulación con ácido clorhídrico valorado (aprox. 0. 1N) y se anotó el gasto.

V resultados Reacciones que ocurren en el proceso DIGESTIÓN catalizadores→ (1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 proteína calor→ NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN (2) (NH2)SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) → NH4 + H2BO3- (ión borato) TITULACIÓN (4) H2BO3- + H+ → H3BO3 Cálculos para hallar porcentaje de proteína en la quinua 𝒎𝒍 𝑯𝑪𝒍∗𝑵∗𝒎𝒆𝒒𝑵 𝑷𝒎

%N=

=

𝟒.𝟑∗𝟎.1∗0.014 =2.61*10-3 𝟐.𝟑𝟎𝟓𝟏

Porcentaje de proteína %Pt=%N*6.25=2.61*10-3*6.25=0.016 %Pt= 16.32 VI DISCUSIONES Según Pérez et al. (1997) el contenido de proteína en la quinua es de 12. 1% y Fontúrbel, F menciona que el

contenido de proteínas es de 12-16 % p/p según los resultados obtenidos se puede establecer que contenido encontrado proteico es de 16.32 cuyo valor está en duda puesto que no se conoce muy bien el peso real de la muestra, pero el valor encontrado se aproxima a los del valor ya encontrados.

VII conclusiones Según los resultados obtenidos en el trabajo realizado se concluye que el contenido proteico de la quinua fue 16.32 resultado que nos indica que puede ser un valor verdadero o no. Las consideraciones que se debe considerar en este proceso de la determinación de proteínas con este método que el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no proteínas como las proteínas verdaderas. En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el

punto de ebullición y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El método Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. Además el uso del ácido concentrado también está relacionado con el contenido de componentes diferentes a este como el caso de las grasas a mayor contenido de esta mayor uso de ácido y el tiempo de digestión el ácido utilizado se pierde por evaporación. VIII BIBLIORAFIA http://tesis.unjbg.edu.pe:8080/bitstream/handle/unjbg/120/17_Alvarez_Carita_YC_FCAG_Industrias_Alimentari as_2012.pdf?sequence=1 51. Villacorta, L. y Talavera, V. (1976). Anatomía del grano de quinua (Chenopodium quinoa Willd). Anales científicos. Vol. XIV: 39-45. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima. National Research Council. 1989. Lost crops of the Incas. National Academy Press, Washington D.C. USA. P414 Cáceres Vega E., Julio /1993. Cultivos Andinos. Producciones FM http://www.grupo-selecta.com/notasdeaplicaciones/sin-categoria/metodo-kjeldahl/ http://www.ecured.cu/index.php/Prote%C3%ADnas Pérez, A. M., Archondo, J., Pérez, C. M. y Medeiros, C. (1997). Mezclas alimenticias con cultivos andinos. La Paz: UMSA Collazos, C. (1975). La Composición de los Alimentos Peruanos. (5ª ed.). Lima: Ministerio de Salud, INS. http://coin.fao.org/coin-static/cms/media/16/13709776189580/potencial_ahrinas_de_quinua.pdf Fontúrbel, F. Problemática de la producción y comercialización de Chenopodium quinoaW. (Chenopodiaceae) debida a la presencia de las saponinas. Universidad de Chile. 2006, Revista Nº21, 6, 1-10