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DETERMINACION DE ACETAMINOFEN EN UN JARABE POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC) María camila pacheco rivera 1664383 ([email protected]) Jefferson Zúñiga Realpe 1463507 ([email protected])

Facultad de ciencias naturales y exactas, departamento de química, tecnología química Universidad del Valle, Cali, Colombia

RESUMEN

La práctica realizada consistió en la determinación por cromatografía (HPLC) del contenido de acetaminofén en un jarabe. Para ello se utilizó una solución de 200 ppm de acetaminofén preparada por disolución del reactivo grado analítico, posteriormente se tomaron alícuotas que fueron disueltas quedando con concentraciones de disoluciones patrón de 2.0, 4.0, 8.0, 12.0, 16.0 ppm, a estas soluciones se les determino el contenido de acetaminofén por cromatografía (HPLC) obteniendo en el espectro picos de concentración de acetaminofén, con estos datos se realizó una curva de calibración y por extrapolación de la señal obtenida para la muestra problema se determina la concentración de esta, luego por cálculos del factor de dilución obtenemos la concentración de acetaminofén en el jarabe con resultado de 2117.117 ppm y para el segundo de 1564.112 ppm con un porcentaje de error de 29.42% y 47.86% respetivamente CÁLCULOS Y RESULTADOS A partir de acetaminofén grado analítico se preparó una solución estándar para posteriormente diluirla y construir la curva de calibración Cantidad necesaria de acetaminofén analítico para preparar 100 mL de solución a 200 ppm 100,00 𝑚𝐿 ∗

200,00 𝑚𝑔 = 20 𝑚𝑔 1000 𝑚𝐿

Se disolvió 20 mg de acetaminofén en 5 ml de metanol y se completó hasta el aforo en un matraz de 100 mL.

Se realizó 5 soluciones patrón de 2,0 a 16,0 ppm a partir de la solución de 200 ppm. 50,0 𝑚𝐿 ∗ 2,0 𝑝𝑝𝑚 = 0,5 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 200 𝑝𝑝𝑚 Tabla 1. Datos de [ ] y Área bajo la curva [ ] ppm

Área mAU *s

2,0

212,46654

4,0

414,71863

8,0

925,30383

12,0

1397,41882

16,0

1568,27625

Con los datos anteriores se realizó una gráfica por extrapolación determinar la concentración de la muestra problema Grafica 1. Curva de calibración para el acetaminofén

acetaminofén en las disoluciones, luego multiplican las concentraciones obtenidas por el factor de dilución y así hallamos la concentración de acetaminofén en el jarabe original 𝐴𝑟𝑒𝑎 = 46,034 + 102,1 𝑥

𝑥=

𝑥1 =

𝐴𝑟𝑒𝑎 − 46,034 102,1

622,4419 − 46,034 102,1 = 5,64 𝑝𝑝𝑚

Ahora utilizamos el factor de dilución Se determinó la siguiente ecuación de la recta

5,64 𝑝𝑝𝑚 𝑥

10 𝑚𝐿 25 𝑚𝐿 𝑥 0.666 𝑚𝐿 1 𝑚𝐿

𝐴𝑟𝑒𝑎 = 46,034 + 102,1 𝑥 = 2117,117 𝑝𝑝𝑚 R² = 0,9749

Concentración de acetaminofén en el jarabe Tabla 2. Áreas obtenidas para las muestras problema MUESTRA Área mAU *s

1

622.4419

2

471.4639

Con los datos obtenidos de área bajo la curva para las muestras problemas obtenemos la concentración de

Realizando el mismo cálculo para la segunda repetición obtenida 1564,112 𝑝𝑝𝑚 Podemos observar que ninguna de estas concentraciones se asemeja a la real del producto, ahora calcularemos los porcentajes de error, para así tener una medida de que tan errónea se realizó la práctica. %𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 =

=

|𝑉𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝑉𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 | 𝑥 100 𝑉𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜

|3000 − 2117,117| 𝑥 100 30000 = 29,42 %

El error para el segundo seria %𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = 47,86%

DISCUSIÓN La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. En la práctica se llevó a cabo la determinación del contenido de acetaminofén en una muestra de jarabe por medio de la cromatografía liquida de alta resolución, para la preparación de esa muestra se utilizó un jarabe con una concentración 3000 ppm del cual debimos tomar una alícuota de 0.666 mL para obtener 20 mg de acetaminacion, se tomó una alícuota de 1 mL y se transfirió a un matraz de 25 mL y se completó hasta el aforo. Se analizó la muestra por duplicado en el equipo por cromatografía liquida de igual manera la soluciones patrón para realizar la curva

Los errores en los resultados se deben principalmente al mal uso que se le puede dar las pipetas y al mal uso del equipo al momento de inyectar la muestra, a la dificulta que se tenga en el manejo de la muestra, para que a la hora de diluirla muestra tomada sean las muestras exactas las que se necesita y no más ni menos porque al final las diferencias se notaron en los resultados obtenidos por arrojaron resultados muy diferentes entre sí; llevando así a distintos resultados en cuanto a la concentración real del acetaminofén, de lo cual podríamos inferir que el análisis realizado fue mal manejado. La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada, esto se debe a su alta sensibilidad, y sus determinaciones cuantitativas exactas, su capacidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, salud, medioambiente. Algunos ejemplos de estas sustancias incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas, por lo cual es ampliamente usada en el control de calidad de medicamentos y en determinación de ingredientes activos en productos farmacéuticos. Para la determinación de acetaminofén llevada a cabo se tiene en cuenta su polaridad por lo cual, es afín a sustancias polares, razón para realizar la cromatografía de fase inversa en donde

se utiliza una fase estacionaria apolar y una fase móvil polar, en nuestro caso una mezcla 50:50 de metanol-agua la cual arrastra a su paso el acetaminofén presente en la muestra, el tiempo de retención de este depende de su afinidad con la fase móvil o la fase estacionaria, observamos un tiempo de retención bajo (1.923 minutos aproximadamente) con lo cual comprobamos la polaridad del acetaminofén. Una representación del equipo puede verse en la figura 1; este equipo tiene cuatro recipientes donde se recopilan los disolventes, cada recipiente posee un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes.

Un limitante en la precisión de las medidas es la reproducibilidad que se puede introducir la muestra en la columna. La dificultad es por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Los volúmenes son muy pequeños (de unas pocas décimas de micro litro). El cromatógrafo emplea un bucle de muestra (ver figura 2), éste dispositivo nos permite la elección de tamaños de muestra que van desde 5 a 500 µL. La muestra se introduce en el bucle mediante una micro jeringa que toma un volumen (en este caso 20 µL) y lo traslada al cromatógrafo. Figura 2. Representación esquemática de un bucle de muestra.

Figura 1. Representación esquemática De un equipo de HPLC

Para que la fase móvil se desplace a través de la columna y los demás componentes, los equipos emplean un sistema de bombeo.

Las columnas se construyen con un tubo de acero inoxidable de diámetro interno

uniforme el cual oscila entre 4 y 10 mm, tienen una longitud promedio entre 10 y 30 cm y los tamaños de partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 µm. Los solventes fueron desgacificados por filtrado a gravedad a través de un filtro de poros muy pequeños con el objetivo de eliminar los gases disueltos y las partículas de polvo o partículas sólidas en solvente Figura 3. Representación esquemática de un detector UV

El más utilizado es el UV/Vis, sobre todo el espectrofotómetro, que registra sustancias que absorben la radiación ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elución en gradiente SOLUCIÓN AL CUESTIONARIO 1) Cuál es la composición de la columna C18 usado en la práctica? Explique. R/ El formato C18 de tipo monomérico incorpora enlaces de cadenas alquil C18 a un único átomo de sílice sobre la

estructura del gel de sílice. Las columnas de tipo monomérico C18-MS-II y la serie MS tiene una excelente reproducibilidad de síntesis, muy buena reproducibilidad lote a lote y cortos periodos de tiempo para la estabilización de la fase móvil. Por otro lado el formato C18 polimérico incorpora un proceso de silanización trifuncional por el que el grupo octadecil se une a 2 ó 3 átomos de sílice sobre la estructura del gel de sílice. Esto aumenta el efecto de la silanización lo que proporciona una estabilidad de columna mucho mayor, particularmente en condiciones ácidas de la fase móvil. La capacidad de reconocimiento estérico también es mucho mayor que las de las columnas C18 del tipo de silanización mono funcional.

2) Explique porque la cuantificación en HPLC con curva de calibración por patrón externo es precisa mientras que cromatografía de gases es aconsejable realizada con el uso de un patrón interno R/ en cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue con el uso de patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres asociadas a la inyección de la muestra. En este procedimiento se introduce en cada estándar y en la muestra una cantidad exactamente medida de patrón interno y la relación de las áreas (o alturas) del analito y del patrón interno sirven como parámetro analítico.

Para poder aplicar este método satisfactoriamente es necesario que el pico del patrón interno este bien separado de los picos de los demás componentes de la muestra; por otra parte el pico del patrón debería aparecer cerca del pico del analito. Con un patrón interno adecuado se pueden conseguir precisiones relativas mejores que el 1%.

dañarlo, para su eliminación se usa principalmente el filtrado al vacío. 

Es posible la utilización de distintos tipos de detectores, siendo los más comunes el UV-Vis y el infrarrojo, la utilización un tipo de detector en especial depende del analito.

CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA 

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Es una técnica muy útil y precisa para la separación, identificación y cuantificación de los componentes presentes en una muestra determinada, de especial importancia en la industria farmacéutica al ser de carácter decisorio para determinar la calidad, estabilidad y tiempo de expiración de un producto. Es muy importante filtrar los solventes a utilizar, ya que se pueden encontrar partículas disueltas en ellos que afecten el resultado o dañen el instrumento. Es necesario tener cuidado especial con la fase móvil utilizada, la cual no puedo contener gases, que afectarían seriamente el equipo pudiendo

I.

SKOOG, HOLLER. LEARY. Principios de Análisis instrumental. 5ed. Madrid: McGraw Hill, 1994. 730794 pp.

II.

SKOOG, WEST. DOUGLAS. Química Analítica 4ed. Madrid: McGraw Hill, 1990. 527-561 pp.

III.

AIRES, H. GILBERT. Análisis Química Cuantitativo 2ed. Madrid Castillo pág. 180-187

IV.

MILLER, J. N. and MILLER J. Estadística Química Analítica 2ed. Addison-Wesley Iberoamericana; pág. 87- 100.

V.

http://www.scribd.com/doc/17065477/ HPLC-Aplicaciones-en-compuestosorganicos (28/04/2010).