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CARACTERIZACIÓN, COMPARACIÓN DE CROMOSOMAS POLITÉCNICOS Y UBICACIÓN DE MARCADORES CROMOSÓMICOS EN Gigantodax basinflatus Y Gigantodax sp. (DIPTERA: SIMULIIDAE) BOGOTÁ-COLOMBIA. Edison Arvey Alfonso Niño. Slendy Julieth Rodríguez Alarcón. Andrea Johana López Moreno. Leidy Alejandra Rodríguez Aldana.1 1 Estudiantes de Licenciatura en Biología. Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Citogenética. RESUMEN: Los cromosomas politénicos son producidos por repetidos ciclos de ADN sin división celular cuyas copias se organizan de manera continua formando un único cromosoma gigante, manteniendo un permanente estado interfásico. Han sido encontrados en las glándulas salivales de dípteros, ya que el patrón de bandeo de estos cromosomas permite construir un mapa citogenético para un mejor análisis de especies de importancia económica, clínica y veterinaria, como los de la familia simuliidae. Se colectaron larvas de Gigantodax sp de la Quebrada la Vieja Bogotá-Colombia, identificando sus principales marcadores cromosómicos para compararlos con los registrados de Gigantodax basinflatus. Los cromosomas politénicos de Gigantodax sp se caracterizaron por presentar inversiones en los cromosomas II, diferenciándose así las hembras de los machos. Cada cromosoma posee un marcador que le identifica de forma más conspicua, siendo este en el cromosoma I la región NOR, en el cromosoma II doble burbuja y en el cromosoma III el telómero festoneado. Palabras Clave: Cromosomas politénicos larvales, interfase, marcadores cromosómicos. ABSTRACT: Polytene chromosomes are produced by repeated cycles of DNA without cell division, copies of which are arranged to form a continuous single giant chromosome, maintaining a permanent interphase state. Has been found in the salivary glands of Diptera, as the pattern banding of these chromosomes can build a cytogenetic map for better analysis of economically important species, clinical and veterinary as the family Simuliidae. Larvae of Gigantodax sp, were collected from Quebrada la Vieja Bogota-Colombia, identifying key markers chromosome for comparison with basinflatus Gigantodax registered. Gigantodax polytene chromosomes were characterized by sp investment in chromosomes II, differing and females of males. Each chromosome has a marker that identifies more conspicuous and this in chromosome I NOR region on chromosome II double bubble and the telomere on chromosome III scalloped. Key Words: Larval polytene chromosomes, interphase chromosome markers.

INTRODUCCION. Los cromosomas politénicos son cromosomas gigantes que están presentes en algunos ciliados, plantas superiores y principalmente en glándulas salivares de Dípteros. Este tipo de cromosomas debe su tamaño, a un fenómeno especifico en el cual los ciclos de replicación del ADN se repiten continuamente sin que haya una división de célula, en consecuencia estos cromosomas aumentan de tamaño y son muy fáciles de observar al microscopio por la gran cantidad de detalles que ellos presentan (Karp, 2005). Fueron descubiertos en 1881 por Balbiani, siendo comprendido hasta medio siglo más tarde “(Kostoff, 1930; Painter, 1933,1934; Heitz and Bauer, 1933; King and Beams, 1934; Bridges, 1935) donde fueron analizados en las glándulas salivales de larvas de los dípteros (Drosophila, Chironomus, Bibio)” (Lacadena, 1996), siendo estos individuos de gran aporte para este tipo de estudios. Los simuliidae son una familia de dípteros con distribución cosmopolita, encontrándose en Colombia los géneros Simulium de la subfamilia simiuliini, y Gigantodax de la subfamilia prosimuliini. Ambos parecen idénticos, pero Simulium presenta escotadura gular, esclerito anal con un anillo incompleto que rodea los cercos dispuestos allí, branquias anales con varias ramificaciones e histoblasto con cuatro filamentos cortos, gruesos y bien definidos (Needham, P.R, 1982). Mientras que Gigantodax no tiene escotadura gular, presenta el anillo completo del esclerito anal, branquias anales con tres ramificaciones bien definidas e histoblasto con ramificaciones muy delgadas y largas (branquiales la mitad largos y la otra mitad cortos) (Roldán, 2003). Estos simulidos tiene gran importancia tanto médica como veterinaria más que todo las hembras ya que estas son hematófagas y transmiten la filaria Onchocerca volvulus, los

principales transmisores de O. volvulus son complejos de especies como S. damnosum, S. guianense, S. oyapockense, S. ochraceum, S. metallicum y S. exiguum, siendo el principal transmisor para América Latina S. ochraceum s.l (Rodríguez & Pérez, 2005). Wygondzinsky y Coscaron reconocen ocho grupos de especies entre Gigantodax, el G. brophyi, G. cilicinus, G. cormonsi, G, cortesi, G, igniculus, G, minor, G, multifilis y G. wrightik los cuales contienen 17,11,10, 4, 2, 4,1 y 15 especies respectivamente (Moulton, 1996). Rothfels (1981) encontró evidencias citológicas que soportan la hipótesis que dice que estos dípteros retornan a sus cursos de agua natales para ovopositar en especies como Prosimulium mixtum, en tres riachuelos cerrados y encontrando que los riachuelos contienen larvas de esta especie de dípteros, con inversiones especificas para esta población en el brazo del cromosoma IIL y IS. Además los cromosomas paternos de estas poblaciones específicas se repiten año tras año. (Lualon, 2006) Los estudios de los cromosomas de las gandulas salivales han sido de gran importancia en la taxonomía del número de dípteros en el mundo. Las diferencias observadas en los patrones de bandeo permiten el reconocimiento de especies hermanas biológicamente distintas lo cual es útil para establecer la identidad de especies y sus relaciones filogenéticas (Coscarón, 1998). Por lo cual, el propósito de este estudio fue caracterizar y comparar los cromosomas politénicos de Gigantodax sp. de la Quebrada la Vieja Bogotá-Colombia y Gigantodax basinflatus (Vargas, 2002).

MATERIALES Y MÉTODOS: Las larvas de Gigantodax sp. con el histoblasto negro o gris fueron colectadas en la quebrada de la vieja, ubicada a una altura de 2722 metros, a 4 grados, 39 horas y 23 minutos de latitud norte; y a 74 grados, 2 horas y 47 minutos de longitud oeste, en Bogotá. Se siguió la metodología de Arteaga y Muñoz (1999) donde las larvas fueron preservadas en Carnoy (tres partes de etanol al 90% por una de acido acético) y refrigeradas hasta empezar el estudio citogenético. Pasa a diferenciarse los géneros Simulium y Gigantodax, basados en el esclerito anal (completo en Gigantodax e incompleto en Simulium), luego las larvas se abren ventralmente con un corte del sexto al noveno segmento abdominal y se extraen las glándulas salivares que están al lado del intestino. Estas glándulas se pasan a una IS:

3” basales

IL:

marcador mayor “3” subterminales Patrón del telómero

IIS: anillo de Balbiani Cordón de zapato central Doble burbuja Trapezoide tres bandas bien IIL: definidas Parabalbiani

lamina con acido acético al 60%, y posteriormente se aplica una gota de OLA (orecina lactoacetica), se deja actuar 10 minutos y se realiza un “squash” con la laminilla; el acido láctico fluidifica el montaje y facilita el squash, y la orceina es un colorante del grupo de las oxazinas, que tiñe específicamente la cromatina generando patrones negros en las zonas donde se une con heterocromatina (constitutiva y facultativa), por ello se hace más fácil la identificación de los marcadores cromosómicos principales y específicos del genero Simulium. Posteriormente se identificaron y compararon los marcadores universales encontrados en Gigantodax sp. y de Gigantodax basinflatus (familia Simuliidae), con ayuda de la siguiente tabla (Muñoz de Hoyos, 1990): Además de construir el idiograma de Gigantodax sp. (basal “3”) (“marker”) (“subterminal 3”) (“Balbiani ring”) (“shoestring”) (“double Hubble”) (“trapezoide (al)”) (“3 sharp”) (“parabalbiani”)

IIIS: grupo de bandas (“heavy band Group”) pesadas (“blister”) Ampolla (“frazzled end”) Telómero festoneado IIIL: banda basal pesada Marcador basal 3 grupos pesados

(“heavy basal band”) (“basal marker”) (“three heavy groups”)

RESULTADOS Y DISCUSION: I.

MORFOLOGIA

En la quebrada de la Vieja, Bogotá Colombia se encuentran larvas de la familia Simuliidae, presentando dos géneros, Simulium y Gigantodax, identificadas para el presente artículo en su totalidad como Gigantodax sp. Estas larvas presentan una longitud de 56 mm. Presentan una cápsula cefálica color marrón, los segmentos abdominales presentan bandas marrones

Fig. 2. ESCLERITO ANAL. Los brazos del esclerito anal forman un anillo y los dientes del submentòn se encuentran reunidos en 3 grupos conspicuos (Roldán 2003).

Fig. 3. Filamentos Branquiales. Gigantodax sp. Presenta cinco ramas con 15 filamentos aproximadamente. Fig. 1 Larva Gigantodax sp.

II. COMPLEMENTO CROMOSÓMICO El complemento cromosómico de todos los géneros de Simulidos estudiados es de tres pares de cromosomas (2n=6) (Rothfles. 1979). El cromosoma I es metacéntrico, mientras que el II y el III son submetacéntricos con una relación de 2:1 en el tamaño de los brazos (Hirai et al. 1994, tomado de Arteaga & Muños, 1999). Estos cromosomas politénicos tienen gran importancia en la investigación citogenética y “surgió a partir de cuándo se demostró la constancia del patrón de bandas (Painter, 1933), lo cual permitió construir los primeros mapas citológicos (Bridges, 1935, 1938) y contribuir al desarrollo de la teoría cromosómica de la herencia por cuanto contribuyó a establecer la relación entre la ordenación lineal de los genes sobre los cromosomas (Bridges, 1935 Citado en Lacadena, 1996)”. De esta manera, los idiogramas reflejan de mejor manera los marcadores universales identificados en los Simulidos Gigantodax sp. y Gigantodax basinflatus, donde el cromosoma I de ambos muestra los “two blocks” (proximal al telómero en IS), el “heavy” y “marker” (en IL), junto

Figura N.4 Cromosoma I Gigantodax sp.

con la Región Organizadora Nucleolar (NOR). En el cromosoma II no se observa ninguna inversión siendo notorio el “Antifaz” con Eucromatina a lado y lado del Centrómero, en el IIS se observan el “Anillo de Balbiani”, “Trapezoidal” y “Doble Burbuja” con el “Cordón de Zapato” central a ella, este ultimo más evidente en Gigantodax sp; en el IIL solo se diferenció el “Parabalbiani”. En cuanto al cromosoma IIIS fue común para ambos individuos el telómero festoneado, la “Ampolla” y el “Heavy”, y en el brazo largo el “3 heavy group”. Cromosoma I. Gigantodax sp. Este es el cromosoma más largo de los 3 (presenta en su totalidad 43 regiones), su centrómero se encuentra en la mitad del cromosoma (en la región 22); en su brazo S los marcadores NOR (región 17 ), y “Two Blocks” (2B) en la región 10,el Glazed en la región 6; y en el brazo L el “Marker” (región 33 ) y “Heavy Bands” (HG) en la región 36 (figura 4).

Mientras que en Gigantodax basinflatus el centrómero se encuentra ubicado en el brazo corto del cromosoma (en la región 12); en su brazo IS los marcadores NOR (región 16 ), y “Two Blocks” (2B) en la

región 8,y el Glazed en la región 6; y en el brazo IL el “Marker” (región 33 ) y “Heavy Bands” (HG) en la región 36 (figura 5).

Cromosoma II.

Trapezoidal (Tp) muy cerca al centrómero. En el brazo IIL se observan“3 sharp” o 3 bandas ubicadas proximales al telómero (sección 65 ), constituidas por heterocromatina facultativa y el Parabalbiani (PB) con una banda basal bien definida distal al centrómero (región 71). (figura 6).

El centrómero está ubicado en la sección 55 (submetacéntrico). El brazo S evidencia los marcadores Anillo de Balbiani (AB) (próximo al telómero, en la región 46 ), el Cordón central a la Doble Burbuja (CCDB) ubicada en la parte distal del brazo, entre el centrómero y el anillo de Balbiani (en la sección 48 ), y el

En Gigantodax basinflatus el centrómero se ubica en la sección 54 (submetacéntrico). El brazo IIS evidencia los marcadores Anillo de Balbiani (AB) (próximo al telómero, en la región 46 ), el Cordón central a la Doble Burbuja (CCDB) ubicada en la parte distal del brazo, entre el centrómero y el anillo de Balbiani (en la sección 46 ), y el

Trapezoidal (Tp) muy cerca al centrómero en la región 53. En el brazo IIL se observan“3 sharp” o 3 bandas ubicadas proximales al telómero (sección 73), constituidas por heterocromatina facultativa y el Parabalbiani (PB) el cual no se diferencia de manera conspicua ya que se confunde con el cormosoma I. (figura 7).

Fig. 6 Cromosoma II Gigantodax sp., donde se observan los marcadores Trapezoidal, el anillo de Balbiani y el Cordón central a la doble burbuja.

Cromosoma III. En Gigantodax sp., esta caracterizado por presentar el telómero festoneado (TF) que sirve como partida para describir del brazo corto del cromosoma, la FIG 8.A presenta un telómero abierto lo cual indica un polimorfismo flotante ya que la presencia de fenomeno no se encuentra en todas las células como se puede observar en la FIG 8.B en el telómero de este cromosoma III, se ubica en la sección 77.

El cromosoma generalmente es submetacentrico, pero no pudo verse, ya que no se realizo el método de bandeo C, entonces es un poco complejo de ubicarlo en el cromosoma; en el brazo corto (IIIS) se encuentra la Ampolla (Am), constituida por eucromatina empaquetada en la sección 80, y el marcador “Heavy” (H) constituido por una serie de bandas compuestas por heterocromatina facultativa en la región 84. En el brazo largo (IIIL), en la sección 92 se presenta el “Marker” (pequeña porción de eucromatina empaquetada), y en la región 96 las 3 Bandas Pesadas (3HG), con gran cantidad de heterocromatina facultativa (figura 9).

Fig. 8. A. Cromosoma III Gigantodax sp., presenta el telomero festoneado. Perteneciente, a una hembra. B. presenta una inversión, perteneciente a un macho.

Fig. 9. A, el cromosoma III, el brazo más corto esta caracterizado por un telómero festoneado en la sección 2, un heavy en la sección 79, seguido de un blíster (BL), y bandas oscuras en la sección 80. En el brazo IIIL encontramos las tres bandas pesadas en la sección 95 y un área pálida formada por unas series de bandas marcadas en la sección 96-98 en la parte distal del brazo. Hay una inversión paracéntrica simple flotante entre la sección 85-90 lo cual indica que esta larva es macho. Mientras que en la figura 7B en el brazo IIIS se observa el heavy en la sección 79, el blister (BL) en la región 80, el descondensamiento del DNA lo cual hace que la región tenga mayor tamaño, y al final del brazo largo IIIL encontramos las tres bandas pesadas en la sección 95. No hay presencia de inversiones por lo tanto esta larva es hembra.

El centrómero de este cromosoma en Gigantodax basinflatus tampoco se pudo ubicar, debido a que no se realizó el bandeo C; en el brazo corto (IIIS) se encuentra el telomero festoneado en la sección 81 la Ampolla (Am), constituida por eucromatina empaquetada en la sección 80, y el marcador “Heavy” (H) constituido por una serie de bandas compuestas por heterocromatina facultativa en la región 79. En el brazo largo (IIIL), en la sección 86 se presenta el “Marker” (pequeña porción de eucromatina empaquetada), y en la región 98 las 3 Bandas Pesadas (3HG),

con gran cantidad de heterocromatina facultativa (figura 10). También se ha reportado la Región organizadora Nucleolar en este cromosoma de especies como Simullium sumapazaense y G.basinflatus (Vargas, 2002), demostrando la gran movilidad de este marcador, probablemente en relación con su función de síntesis del ARNr, pues los genes que codifican esta molécula son muy específicos para cada especie y debido a esto necesitan una asociación especifica con un cromosoma en particular.

Comparación de Idiogramas Gigantodax sp. y G. basinflatus.

de

se identifico y ubico los marcadores cromosómicos universales encontrándose las siguientes diferencias:

En el ideograma diseñado para Gigantodax sp y Gigantodax basinflatus

A. Gigantodax sp.

Fig. 11. Distribución de secciones del complejo cromosómico: A. Idiograma Gigantodax sp. Cromosoma I 41%, Cromosoma II 32% y Cromosoma III 29%. B. Idiograma Gigantodax basinflatus Cromosoma I 43%, Cromosoma II 32% y Cromosoma III 25%.

B. Gigantodax basinflatus.

FIG 12. Distribución de secciones del complejo cromosómico: A Ideograma Gigantodax basinflatus. Cromosoma I 43%, Cromosoma II 32% y Cromosoma III 25%.

En el cromosoma I: IL el marcador “two blocks” (2B) está en una posición más proximal con respecto al telómero en

Gigantodax sp que en G. basinflatus, en este ultimo el “2b” se ubica más cercano al telómero. En IS se encuentra el NOR

en la posición específica para todo el género Gigantodax (Coscaron. 1998). En cuanto al cromosoma II se observa una inversión paracentrica en Simulium sp. desde el trapezoidal (Tp) hasta un poco antes del parabalbiani (PB). El NOR puede encontrarse en IIS para la especie Simulium metallicum (Arteaga & Muñoz . 1999). Finalmente en el cromosoma III, observa una inversión pericéntrica en brazo S y el NOR puede encontrase este brazo para la especie sumapazense (Vargas. 2002).

se en en S.

CONCLUSIONES •

•

A partir de la extracción, montaje de cromosomas politénicos de Gigantodax sp y ubicación de marcadores universales y específicos, se comparó con la especie G. basinflatus con la ayuda de un diseño de ideogramas para el complemento cromosómico de cada uno, encontrándose principalmente que las diferencias en la ubicación de los marcadores tanto de Gigantodax sp.y Gigantodax basinflatus se ven en pequeñas distancias de dos o máximo tres secciones separadas una de la otra, según sea el marcador, estas distancias están posiblemente dadas por las características de cada una de las especies o por una adaptación al medio. Gigantodax sp. Presenta cromosomas politénicos que permiten realizar estudios de marcadores universales con bastante facilidad, estos marcadores han sido descritos y ubicados en su mayoría, cabe destacar que el cromosoma II de

la muestra posee inversión incluyendo también el cromosoma III lo que indica que la muestra es de un macho, contrastándose con el de una hembra, los cuales ninguno de los dos cromosomas presentan inversiones. •

En el cromosoma III se hace imposible la identificación del centrómero en el caso de los cromsomas III, trabajandose con la posición de los marcadores para indicar cuál es el brazo largo o corto del cromosoma. Cada cromosoma posee un marcador que le identifica de forma más conspicua, siendo este en el cromosoma I la región NOR, en el cromosoma II doble burbuja y en el cromosoma III el telómero festoneado.

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