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Extendidos Cromosómicos a partir de Sangre Periférica de Mamíferos Índice mitótico y conteo cromosómico de linfocitos T en humanos.

Natalia Arango López1 Isabel Moreno López2 Diana Rosero Morillo3 Mildren Ivana Andrade Paredes4 Ingeniería Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín [email protected] Ingeniería Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín [email protected] Ingeniería Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín [email protected] Ingeniería Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín [email protected] Junio 28, 2019

___________________________________________________________________________________________________________ Resumen Para la obtención de un extendido cromosómico de linfocitos T provenientes de sangre periférica de humano se estableció experimentalmente y de acuerdo con un protocolo de cultivo, un cultivo primario al que se le adicionó, entre otros, medio de cultivo RPMI 1640, SBF, PHA 10% y una muestra de sangre periférica de una de las integrantes del equipo de trabajo; y luego se incubó por un periodo de tiempo de 55 horas a 37°C. Por otro lado, para la obtención de los extendidos cromosómicos, se realizaron tratamientos posteriores al cultivo, en particular: de cosecha, fijación, goteo y coloración. Subsiguientemente, se visualizaron los cromosomas de una única muestra, se calculó su índice mitótico, obteniendo un resultado de 4.4%, y se hicieron conteos de estos. Con estos resultados se pretendió, en últimas, analizar la correcta o incorrecta ejecución del protocolo de cultivo, los diversos factores incidentes en el(los) error(es) obtenido(s) y el correcto o incorrecto establecimiento de un cultivo primario de a partir de una muestra de linfocitos T proveniente de sangre periférica humana. Palabras Clave: Cultivo primario, extendido cromosómico, linfocitos T, índice mitótico, conteo. ________________________________________________________________________________________________________________________

1. Introducción El cultivo celular se refiere a la remoción de células de un animal o planta para su posterior crecimiento en un entorno artificial favorable. Las células pueden ser extraídas del tejido directamente, o pueden derivarse de una línea celular o cepa celular que ya se ha establecido previamente. [1] En particular, un cultivo primario hace referencia a la etapa del cultivo posterior al aislamiento de las células, pero anterior al primer subcultivo después del cual se convierte en una línea celular. Puntualmente, es el obtenido después de una serie de procesos selectivos que comprenden: • La adquisición de la muestra. • El aislamiento del tejido. • La disección y/o desagregación. • El cultivo después de la siembra del cultivo.[2] Por su parte, una línea celular o subclon implica un aumento en el número total de células a lo largo de varias generaciones. Algunas tienen una vida útil limitada, pero predominan en ellas las células con la mayor capacidad de crecimiento o proliferación, lo que da como resultado un alto grado de uniformidad genotípica y fenotípica en la población celular. [3] Dependiendo de su origen, las células animales crecen como una monocapa adherente o en suspensión: Las células adherentes dependen del anclaje y se propagan como una monocapa unida al recipiente de cultivo celular. Este

apego es esencial para la proliferación: muchos cultivos celulares adherentes dejan de proliferar una vez que se vuelven confluentes (es decir, cuando cubren completamente la superficie del recipiente de cultivo celular), y algunos mueren si se dejan en estado de confluencia por un largo periodo de tiempo. La mayoría de las células derivadas de los tejidos dependen del anclaje. Las células de suspensión pueden sobrevivir y proliferar sin estar unidas a un sustrato. Las células hematopoyéticas (derivadas de la sangre, el bazo o la médula ósea), así como algunas líneas celulares transformadas y células derivadas de tumores malignos pueden crecer en suspensión. [4] Las células sanguíneas, por ejemplo, se forman en la medula ósea a partir de células madre. Se clasifican según su funcionalidad y grado de diferenciación (Figura 1).

Figura 1. Tipos de células sanguíneas en humanos. Adaptado de: https://www.lls.org/sites/default/files/file_assets/sp_bloodcellschart.pd f

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El cultivo estas células es, además, una práctica frecuente con fines diagnósticos y, en general, para la realización de estudios de citogenética, disciplina que trata sobre la estructura y el comportamiento de los cromosomas, así como de las implicaciones genéticas derivadas de su estudio. [5] Un cromosoma es la estructura que resulta del empaquetamiento del ADN y las proteínas previo a la división celular para su segregación posterior en las células hijas. Es debido a esto que es posible observar distintas formas de los cromosomas dependiendo de la fase de la mitosis en la que se encuentren. Los cromosomas utilizados para estudios de citogenética son los ubicados, específicamente, en la metafase y presentan cuatro formas básicas (Figura 2) y se clasifican de acuerdo con la longitud de los brazos, así como por la posición del centrómero.

Figura 2. Clasificación de los cromosomas. Adaptado de: https://alevelbiology.co.uk/notes/chromosomes-introduction-structure-types/

El análisis de cromosomas se puede realizar de una gran variedad de tejidos, siendo el cultivo de linfocitos un método rápido que provee el número adecuado de células en división. Una manera de determinar dicho número adecuado de células en división es el cálculo del índice mitótico, que proporciona una relación entre las células que se encuentran en mitosis y aquellas que no. Además, su medida se relaciona con el estado metabólico de las células y puede indicar desbalances o eventos particulares en el organismo, y, al tratarse de células sanguíneas como los linfocitos, que forman parte del sistema inmune, su determinación cobra aún más importancia. [6] Se reportan, en la literatura, valores de índice mitótico en linfocitos en mujeres de 20 años de 2.6%, 3% y 0.2% (Figura 3). [7]

Figura 3. Índices mitóticos en linfocitos para diferentes sujetos. Adaptado de: http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v50n2/1676-2444-jbpml-50-02-0124.pdf

Esta práctica tenía por objetivo el evaluar la correcta ejecución del protocolo de obtención de extendidos cromosómicos a partir de sangre periférica de mamíferos, esto tras establecer un cultivo primario a partir de linfocitos T, implementar procedimientos de cosecha, fijación, goteo y tinción y realizar los cálculos del índice mitótico en las muestras obtenidas. 2. Metodología 2.1. Siembra de cultivo: En recipiente específico para realizar cultivos celulares, se adiciona 8ml de un medio de cultivo RPMI 1640 (cultivo diseñado específicamente para células humanas) suplementado con 1ml de suero fetal bovino (SFB) al 10%, se agrega antibiótico a concentraciones en el medio de 100µg/ml, con el fin de reducir el riesgo de contaminación por microrganismos indeseados y se complementa el medio con 0.1 mL de fitohemaglutinina (PHA), este compuesto actúa como agente extraño ante el cual reaccionan los linfocitos iniciando así su proliferación (agente mitogénico). Se realiza la recolección de sangre humana con heparina (anticoagulante que a diferencia de otros, no inhibe la proliferación celular), y después de obtener la muestra se procede a la siembra del medio de cultivo; el proceso de incubación se realiza en unas condiciones de 37°C (simulando el aumento de la temperatura corporal) durante 55 horas, se establece este tiempo porque los linfocitos tardan alrededor de 24 horas para responder al estímulo y después de ese tiempo su ciclo de proliferación se cumple cada 18 horas (el tiempo de incubación asegura que se haya culminado, al menos, un ciclo de proliferación). Es importante aclarar que el ciclo de proliferación no es estándar en cada organismo, puesto que existen respuestas más rápidas o cortas. El suero fetal bovino (SFB) proporciona nutrientes específicos y muchos factores de crecimiento que potencializan el crecimiento celular y lo mantienen activo, ya que el inductor principal de proliferación es la PHA. 2.2 Obtención de extendido cromosómico: 2.2.1. Cosecha: Cuando se cumplen 54 horas de incubación, se adicionan 100 µl de antimitótico (colcemid), el cual busca que las células que estén en mitosis permanezcan en una condición estática y no sigan con su ciclo, permitiendo así observar los cromosomas en su estado más condensado (metafase). Seguido de éste, se homogeniza el cultivo con agitación suave y se conserva en las mismas condiciones de incubación hasta completar las 55 horas. Se vierte el cultivo sobre un tubo cónico para centrifugar durante 7 minutos a 1000g y así obtener una separación por gradiente de los linfocitos, el plasma y las plaquetas y los granulocitos y glóbulos rojos del medio. Se descarta el sobrenadante (plasma y plaquetas). Posteriormente, se homogeniza la muestra y se completa un volumen de 7 ml con KCL 0.075 M, esta muestra se incuba durante 7 minutos a una temperatura de 37°C. El papel que juega el KCL, además de completar el volumen de linfocitos, es lisar los eritrocitos, las cuales son células presentes en el medio que no son objeto de estudio.

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Por último, se centrifuga bajo las mismas condiciones para descartar el sobrenadante con KCL y se re suspende el pellet. 2.2.2. Fijación: Para realizar el proceso de fijación se debe preparar una solución con metanol y ácido acético ambos puros en proporción 3:1. Se adicionan 7ml de este fijador fresco al tubo cónico y se agita con fuerza para evitar la formación de estructuras compactas, se debe mantener la muestra con el fijador al menos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Seguido a esto, se centrifuga a 1000g durante 7 minutos, descartando el sobrenadante y re suspendiendo el pellet en fijador completando un volumen de 5 mL, este procedimiento se repite reduciendo el volumen adicionado de fijador hasta que se obtenga un sobrenadante traslúcido. 2.2.3. Goteo: Se descarta el sobrenadante obtenido en la última centrifugación y se re suspende el pellet en 2 mL de fijador fresco. Para realizar el goteo es necesario limpiar los portaobjetos con una gasa impregnada de etanol al 70% y después introducirlos en agua con hielo. Luego, se deben sacar de forma horizontal para remover los excesos de agua. Se procede a realizar el goteo de la muestra a una altura de 45-60 cm, esto se hace con el fin de ocasionar un daño mecánico que rompa la membrana de las células y los cromosomas queden más expuestos, aptos para la visualización. Se deja escurrir la muestra de 20 a 30 segundos en una posición inclinada. A continuación, se flamea cuidadosamente el portaobjetos.

Figura 4. Identificación mitosis en la Placa 1.

Por su parte, para el conteo cromosómico se empleó la herramienta Paint y en diferentes aumentos se realizó el conteo de las fotografías de la Placa 1. Se obtuvo: Tabla 2. Conteo cromosómico de células en mitosis.

Célula en mitosis Placa 1 1 2 3 Promedio

44 42 41 42.33

42.33 ±1.53

2.3. Coloración: Para evaluar la dispersión de los cromosomas al microscopio se debe realizar una coloración homogénea que permita la visualización de los mismos, para esto se agrega una solución de Giemsa de 5 a 8 minutos directamente sobre la placa y después se lava con agua destilada para retirar el exceso de solución. Finalmente, se flamea cuidadosamente la placa y se procede a realizar la visualización en el microscopio. En caso de que la coloración de los cromosomas en metafase no sea la indicada, se realiza el proceso nuevamente hasta obtener un grado de coloración óptimo. 3. Resultados Se realizaron los cálculos para el índice mitótico en una sola muestra, denotada Placa 1. Para esto, se observó, bajo un microscopio óptico, una cantidad de 500 células en la única muestra disponible, en una magnificación de 40x. Se obtuvo:

(1) (2) Tabla 1. Índice Mitótico obtenido para la Placa 1.

Índice Mitótico

Placa 1 Total 0.044 4.4%

(1) Figura 5. Conteos cromosómicos en la Placa 1.

4. Discusión Para nuestro caso particular, se obtuvo un índice mitótico de 4.4%, con un promedio del conteo cromosómico de 42.44 ± 1.53. Refiriéndonos a la literatura (para linfocitos en mujeres de 20 años se reportan valores de I.C de 2.6%, 3% y 0.2% [7]; y

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también, en humanos sanos, 46 cromosomas con índice cromosómico de 0.03 ± 0.01. [8]) se estaría dentro del rango normal y dado a que los linfocitos T no estaban presentando una proliferación excesiva se puede concluir que la muestra pertenece a un individuo sano. Por otro lado, el conteo cromosómico está por debajo de la normal, lo cual, no necesariamente, implica la existencia de una nulisomía o alguna enfermedad similar, pues en principio el conteo únicamente logró realizarse en tres células en mitosis, siendo este un número realmente pequeño y, claro está, una muestra poco representativa para un ser humano. Además, no se obtuvo una correcta expansión de las células como se logra ver en las figuras 4 y 5 (donde los cromosomas siguen embebidos en la membrana y aglutinados), pues para lograrlo es necesario que, al momento de realizar la cosecha, la adición de la solución hipotónica (KCl) se realice estando ésta a una temperatura correcta. Cabe agregar que, a pesar de que el KCl se comenzó a temperar 2 horas antes, la temperatura deseada no se logró para el volumen que se había preparado, repercutiendo esto de manera negativa en los resultados y generando a su vez en una extensión más lenta. Por otro lado, las personas tienen diferentes reacciones a los agentes externos; el no poder observar buenos resultados (cromosomas bien definidos, extendido cromosómico apto) se puede atribuir también al hecho de que el sistema inmunológico de la donante de la muestra no dio una buena respuesta ante el agente mitogénico (PHA) o que éste posiblemente se agregó en un volumen menor al indicado en el protocolo; adicionalmente, puede deberse a que en el momento de agregar el agente antimitótico (colcemid), la mayoría de las células se encontraban en alguna parte de la interfase (pues en un tejido en crecimiento o en un cultivo celular, las células proliferantes no son sincrónicas) y por ende no tuvo muchas células diana para actuar; o que en el goteo, la muestra recolectada desafortunadamente carecía de células en mitosis, es por esto que al momento de realizar la visualización celular se observan varios núcleos activos (células en una fase del ciclo celular diferente a la mitosis). Es importante aclarar que a pesar de que se realizó la implementación del protocolo tal y como este lo indicaba, se tuvieron percances con los reactivos y los materiales suplementados en el laboratorio. Aun así, se logró obtener los dos cultivos primarios de sangre periférica de humano sin contaminación visible (Anexos, Figura 6) y se realizaron los procedimientos para la obtención de extendidos cromosómicos sin mayor problema operario (Anexos, Figura 7-11), con excepción del goteo, pues aquí, dado a que unas de las pipetas pasteur plásticas estaba dañada, ocasionó la pérdida de una de las muestras, es por esto que los datos obtenidos parten de una única placa. Conclusiones • En general, la ejecución del protocolo para la obtención de extendidos cromosómicos a partir de sangre periférica fue correcta. Se logra establecer un cultivo primario de sangre periférica sin contaminación visible y se realizan procedimientos de cosecha, fijación, goteo y tinción sin mayor influencia operaria. • El conteo cromosómico está sesgado por la falta de visibilidad, el grado de compactación y superposición de los cromosomas. • Los errores se atribuyen principalmente a que los reactivos se encontraban a condiciones no aptas de agregado.

Referencias [1]

Invitrogen, Life Technologies Corporation, Cell Culture Basics, Gibco and ThermoFisher Scientific, 2019.

[2]

Freshney,I. “Primary Culture,” en Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc, 2011, pp 163.

[3]

ThermoFisher Scientific, “What is Cell Culture?”, 2019. [Online]. Disponible en: https://www.thermofisher.com/co/en/home/references/gibco-cellculture-basics/introduction-to-cell-culture.html

[4]

Quiagen, “Animal Cell Culture”, 2019. [Online]. Disponible en: https://www.qiagen.com/br/service-and-support/learninghub/molecular-biology-methods/animal-cell-culture/

[5]

J. Herrera. “La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales”, Agronomía Colombiana 25, vol. 1, pp. 26-35. junio 6, 2007.

[6]

S. Bonilla, V. Betancur, C. Garzón, S. Montoya, M. Vargas. “Índice mitótico y conteo cromosómico en linfocitos T de humanos.”, 2018.

[7]

L. Crubelati, E. Papa, A. Tozzo, V. DellaRosa. “Viability of lymphocyte culture, at different times after blood collection, for karyotype analysis”, Universidade Estadual de Maringá. 2014.

[8]

Ostrosky, P. “El índice mitótico y la cinética de proliferación linfocitaria en el monitoreo biológico. Instituto de Investigaciones Biomédicas”, Universidad Nacional Autónoma de México. 2007.

Anexos

Figura 6. Cultivos

Figura 7. Muestras tras añadir KCl

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Figura 8. Muestras tras primera aplicación de fijador. .

Figura 9. Muestras tras centrifugación. .

Figura 10. Muestras tras centrifugación.

Figura 11. Pellet final.