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CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA Jorge Acuña1, Katherin Orozco1, Xilena Peña1 & Carlos Pérez1 1

Universidad del Atlántico Facultad de Ciencias Básicas Programa de Biología En esta práctica de laboratorio se analizó la cromatografía, es decir, la separación de dos compuestos en una capa delgada, utilizando como sustancias el azul de metileno (C16H18ClN3S) y el permanganato de potasio (KMnO4) en un extremo de la placa, donde se observó la fase estacionaria y la fase móvil. A su vez se utilizó un indicador de luz ultravioleta, para mirar el revelado de las fases, contenidas en los absorbentes y dando paso a obtener el Rf de dichos compuestos en la placa. Palabras clave: cromatografía, fase móvil, fase estacionaria, placa. Introducción La cromatografía en capa delgada es una técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de química orgánica. Permite la separación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos. El método se basa en la remoción selectiva de los componentes de una fase a medida que esta base fluye a través de una segunda fase estacionaria. La separación se debe a que los componentes de la mezcla son atraídos con distinta fuerza por la fase estacionaria a medida que fluye a través de ella. Aquel componente que es atraído con mayor fuerza por la fase estacionaria va quedándose atrás mientras que el componente atraído con menor fuerza va más adelante que los demás a medida que van fluyendo a través de la fase estacionaria. [1]

Figura 1. Cromatografía en capa delgada (CCD).

El término Rf se define como la razón: Rf = Distancia recorrida por la zona/ Distancia recorrida por el frente del disolvente. La determinación de un Rf requiere, pues, la medición de las distancias desde el punto de aplicación de la muestra hasta el centro de la zona o banda en estudio y hasta el borde extremo alcanzado por el frente del disolvente. Los valores de Rf permiten la identificación de los componentes de la muestra, puesto que se pueden comparar con los valores obtenidos con sustancias patrón sometidas al mismo proceso cromatográfico. En las obras de consulta que tratan de la cromatografía de adsorción y de partición se suelen encontrar gran cantidad de datos de Rf. La identidad de dos valores de Rf no es suficiente para identificar positivamente una especie química, pero proporciona una evidencia circunstancial que puede confirmarse por medio de algún reactivo específico. [2] La mayor parte de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente que permite la visualización de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). El indicador absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un compuesto activo en el UV evita que el indicador absorba la luz en la zona en la que se encuentra el producto, y el resultado es la visualización de una mancha en la placa que indica la presencia de un compuesto.

En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualización (o revelado) del cromatograma requiere utilizar un agente revelador. Este tiene que reaccionar con los productos absorbidos proporcionando coloreados.

cristales de la primera sustancia o sustancia A (permanganato de potasio) y se le adicionó unas gotas de cloruro de metileno y etanol para disolverla, del mismo modo se hizo con la segunda sustancia o sustancia B (azul de metileno).

Objetivos Aplicar la cromatografía en capa delgada como técnica de separación de una mezcla de componentes.   

Conocer la eficiencia y aplicación de la CCD. Analizar la influencia del eluyente en la separación cromatográfica. Calcular valores de Rf de varias sustancias.

Figura 3. Permanganato de potasio en vidrio de reloj preparado para la sustancia A.

Parte experimental En esta práctica se llevó a cabo la cromatografía en placa delgada de dos compuestos orgánicos: permanganato de potasio (KMnO4) y azul de metileno (C16H18N3ClS), además, de la mezcla de estos dos: KMnO4 + C16H18N3ClS.

Figura 4. Azul de metileno en vidrio de reloj preparado para la sustancia B.

Figura 2. Estructuras geométricas del permanganato de potasio y azul de metileno respectivamente.

Inicialmente se obtuvo una placa de cromatografía (fase inmóvil), se trazó con lápiz una línea inferior a 1 cm aproximadamente del borde inferior y se señaló sobre ella tres puntos, de forma que no quedara uno tan cerca del otro ni del borde lateral de la placa. Luego, en un vidrio de reloj se agregaron unos cuantos

Posteriormente, con un tubo capilar, se toma el líquido de la sustancia A, y sobre el punto correspondiente ya marcado sobre la placa, se añade un poco de esta, generando una pequeña mancha circular; en el siguiente punto se realiza el mismo procedimiento con la sustancia B, (fig. 5.) y en el último punto se mezclan ambas sustancias agregando primero una a la placa y luego la otra. Seguidamente, en un Beaker que contenía un poco de eluyente (fase móvil), se introdujo la placa cromatográfica, y fue tapado con el vidrio reloj para que el eluyente ascendiera por capilaridad. Antes de que el llegara al otro extremo de la placa, ésta se sacó del Beaker y con un lápiz se hizo una señal indicando hasta dónde llegó el eluyente y se dejó secar.

Por último, se examinaron las manchas corridas a lo largo de la placa. No hubo necesidad de exponer la placa a la luz ultravioleta ya que las sustancias ya estaban teñidas y se pudo observar fácilmente.

Figura #. Resultado final de cromatografía en capa delgada. El valor de la constante de Rf se determinó gracias a la toma de medidas luego de la finalización de los procedimientos, en donde desde el punto inicial hasta el centro del recorrido de la sustancia es el valor de distancia del compuesto, mientras que desde el punto inicial hasta el límite de la placa es denominada la distancia fase móvil.

Figura 5. Sustancia A, B y mix en la placa.

Discusión y resultados Siguiendo con los procedimientos indicados por el docente, luego de retirar la placa del beaker, dejarla secar e iluminarla con luz ultravioleta esta no tuvo ningún resultado aparente, por consecuente se preparó una mezcla de Diclorometanol al 50%, el cual fue aumentado 10 veces para así lograr que la fase móvil (líquido) se desplazara hasta la línea límite de recorrido. (fig. #)

𝑅𝑓 =

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑣𝑖𝑙

Rf para azul de metileno: 𝑅𝑓 =

1,05𝑐𝑚 = 0,25𝑐𝑚 4,2𝑐𝑚

Rf para la fase móvil mix: 𝑅𝑓 =

1,2𝑐𝑚 = 0,28𝑐𝑚 4,2𝑐𝑚

Conclusiones Figura #. Placa de vidrio sumergida en la solución preparada de Diclorometanol aumentado 10 veces. Al finalizar la práctica de cromatografía en capa delgada los resultados de la experiencia fueron los siguientes:

-

Finalizada la práctica se pudo concluir que, la cromatografía en capa delgada, funciona como método de reconocimiento de sustancias que se encuentran en una mezcla, debido al factor de retención que cada una de estas posea en específicos. La polaridad del eluyente es un componente determinante para hallar el factor de retención, de esta manera, se logró identificar la sustancia teniendo en cuenta que el permanganato de potasio es polar y el Diclorometanol, como eluyente, es apolar, por lo tanto la distancia de la columna aumentó.

Preguntas 1. ¿Cuáles son algunos criterios que deben tenerse en cuenta en la elección de absorbente en una separación cromatográfica determinada? Hay varios factores que deben tomarse en cuenta en la elección de un adsorbente para una separación cromatográfica determinada. Desde luego debe ser insoluble en el disolvente que se va a utilizar para la separación y no debe reaccionar con las sustancias que van a separarse ni debe actuar como catalizador de sus descomposición, transposición o isomerización, ha de tener un compuesto uniforme prescindiendo de su origen y debe ser incoloro cuando sean de localizar visualmente las unas correspondientes a compuestos coloreados. El adsorbente no debe ser ni de grano muy grueso ni muy fino, el diámetro medio de las partículas debe ser de unas 8 a 12 micras. El poder adsorbente de un producto determinado depende no solo de su naturaleza sino también del disolvente utilizando en la preparación del cromatograma. Por tanto no es posible establecer una clasificación rigurosa del poder adsorbente relativo a las distintas sustancias que se pueden utilizar. Sin embrago se puede establecer aproximadamente la siguiente clasificación: adsorbentes muy activos: alúmina con un contenido de agua pequeña, carbón activado y arcilla. Adsorbentes intermedios: gel de sílice, acido silícico, carbonato de calcio, fosfato de cálcico, magnesia y cal apagada, adsorbentes débiles: sacarosa, inulina, almidón y talco. 2. ¿En qué consiste la cromatografía de CCD preparativa? La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones, desde el aislamiento de 1 µg. de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una

mezcla de 100 g. La cromatografía preparativa se diferencia de la técnica básica en muchos aspectos. La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o tubo capilar. La siembra se realiza a lo largo de una línea recta (existen en el mercado diverso utensilios para evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra todavía queda muestra, se seca la primera siembra y se aplica la segunda, intentando que ésta quede sobre la anterior, para así conseguir que el frente sea lo más estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa. Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografía. Se utiliza un adsorbente con indicador fluorescente para ver en la lámpara ultravioleta donde han quedado las manchas de los diferentes compuestos, dichas manchas se marcan. Localizados los compuestos, éstos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una espátula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Posteriormente se coloca cada componente en un Erlenmeyer, y se mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Una vez separado se elimina el disolvente (destilación), con lo cual se obtiene el componente separado. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la placa separando totalmente una pequeña franja de placa, sobre la cual se aplica el revelador químico, y a partir de esta franja se marcan las franjas de compuestos. 3. Usted tiene un compuesto impuro y quisiera saber cuántas sustancias están contaminando su compuesto. Explique cómo lo haría utilizando cromatografía de capa delgada o de papel. Al realizar el procedimiento respectivo para una cromatografía de capa delgada la cual separa compuestos orgánicos de una muestra sirve para determinar si el compuesto orgánico esta impuro y que sustancias lo están contaminando. Por

consiguiente en la placa cromatografía de capa delgada al mirar el extendido de las sustancias en la placa se mostraran puntos o manchas al ser absorbida o atraídas con mayor fuerza por la capa estacionaria, por ende entre menos manchas allá en el extendido menos impura será esas manchas corresponderán a las sustancias que contaminan.

4. Investigue el nombre que reciben los reveladores de yodo y ácido sulfocrómico. ¿Por qué? Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos: químicos y físicos. Métodos químicos: Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores. Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras luego de ser carbonizadas. También es utilizado el permanganato potásico, que deja unas manchas de color amarillo. El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. Además de estos reveladores generales, existen otros específicos: 2,4 dinitrofenilhidracina (para aldehídos y acetonas). Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminoácidos).

Bibliografía 1. Durst, H.D. Gokel, G.k. Química orgánica experimental. 1995. Editorial Reverté. Pag 79. Barcelona España. 2. Pickering, W.F. Química analítica moderna. 1980. Editorial Reverté s.a. Pag 563. Barcelona, Bogotá, México. 3. Cromatografía de capa delgada, separación de los pigmentos de una planta. Alonso Marrugo González Profesor Químico- MsC-PhD. Universidad de Cartagena.