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• César Ramírez Pérez

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO CAMPUS AMEALCO

MATERIA: BIOINGENIERÍA

TRABAJO: BIOREACTOR

MAESTRA: KARLA ZAVALA GUTIÉRREZ

INTEGRANTES: CÉSAR RAMÍREZ PÉREZ HERMINIO MIRANDA RODRÍGUEZ MARIANA HERNÁNDEZ MALDONADO

Introducción El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbico. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En términos generales, un biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) al organismo o sustancia química que se cultiva. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un biorreactor puede ser de tres modos distintos: El fermentador (o biorreactor) tiene dos objetivos primordiales: a) proporcionar oxígeno a las células que se están cultivando en suspensión y b) mantener las condiciones ambientales básicas (como temperatura, oxígeno disuelto y pH) en los niveles que sean óptimos para la producción del metabolito de interés. El equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentador. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatización, suministro de oxígeno, entradas para adición de nutrientes, control del pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o, también, métodos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. Clasificación de los Biorreactores Clasificación Operativa Tanto biorreactores como fermentadores se clasifican primeramente de acuerdo al modo de operación: discontinuo, semicontínuo, continuo. Esta es una clasificación operativa y se aplica a cualquier reactor, sea químico o biológico (biorreactor). En los reactores biológicos el modo de operación define el sistema de cultivo que es el mismo y delimita la clasificación procesalproductiva del bioproceso (cultivo). Al operar un biorreactor en una determinada

categoría (discontínuo, semicontínuo, contínuo), automáticamente queda determinado el modo de cultivo del sistema y se definen los parámetros y las características operativas y de diseño que intervienen en el proceso productivo del sistema. Clasificación Biológica Los sistemas biológicos deben interaccionar con el ambiente externo para poder crecer y desarrollarse; es por eso que los biorreactores se clasifican biológicamente de acuerdo al metabolismo procesal del sistema de cultivo: anaeróbico, facultativo, aeróbico. Los bioprocesos de cultivo y las fermentaciones están basados en el metabolismo celular del cultivo. El metabolismo define los parámetros y características operativas-biológicas de diseño y de operación del biorreactor. Estas características son las que intervienen en la parte biológica del sistema y tienen que ver con el crecimiento, productividad y rendimiento del cultivo; por lo que, definen la clasificación biológica-procesal del sistema de cultivo. Clasificación Biológica-Operativa Ambas clasificaciones; la biológica y la operativa, son procesalmente interdependientes y en su conjunto afectan el diseño final del biorreactor. Al conjuntarse ambas clasificaciones, se conjuntan también la función operativa y la biológica para establecer entre ambas un propósito de utilización, el modo de cultivo y el bioproceso. Siendo el propósito de utilización, el destino de cultivo del biorreactor; para qué tipo de cultivo va a ser utilizado el biorreactor; el modo de cultivo es sinónimo de sistema de cultivo y el bioproceso es en sí, todo el proceso. En términos generales, un biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) al elemento que se cultiva. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un biorreactor puede ser de tres modos distintos: 1. Lote (Batch) 2. Lote alimentado (Fed-Batch) 3. Continuo o quimiostato Diseño de un biorreactor discontinuo Un sistema de cultivo discontinuo no posee alimentación (F1) o lavado (F2); se carga el contenido del biorreactor (tanda o lote) con el medio de cultivo y luego se inocula con el cultivo (células o microorganismos) y se deja crecer hasta obtener el producto (biomasa o metabolito). Balances y ecuaciones El primer balance que debe realizarse en cualquier sistema es el Balance General o Global; en él se toma en consideración únicamente – el sistema – como una caja negra – el ambiente externo y – los flujos – que entran (F1) y

salen (F2) e interaccionan con el ambiente externo. De esta forma el primer balance es: Balance general biomasa Velocidad de Acumulación = Velocidad de Entrada – Velocidad de Salida + Velocidad de Formación – Velocidad de Consumo Balance General por componente Una vez dado el balance general de biomasa, debe tomarse en cuenta que, en un sistema de cultivo, existen muchos componentes: sustratos, productos, compuestos metabólicos que conforman el caldo de cultivo (medio interno); incluso la biomasa, se considera un componente en sí misma. A partir del balance general, debe establecerse un balance general para cada componente del cultivo o la biomasa. De acuerdo al enunciado del balance general: la velocidad de acumulación del componente

es el flujo de entrada

componente

por la concentración inicial del

[velocidad de entrada] menos el flujo de salida

por la

concentración del componente i [velocidad de salida]; más la velocidad de formación del componente [formación] menos la velocidad de consumo del componente [consumo]: Ec.1 Respecto a las velocidades de formación y consumo: Si se trata de un componente metabólico, responden a la acumulación (formación) del componente dentro de la célula y al consumo del metabolito por parte de la célula (consumo). Si se trata de biomasa, formación corresponde a la generación de biomasa y el consumo al consumo de biomasa durante el bioproceso; esto es, a la producción metabólica en el primer caso y a la producción o productividad en el segundo. Nomenclatura • • • • • • •

= volumen del cultivo (m³) = caudal de alimentación (m³/s) = caudal de salida (m³/s) = concentración del componente en la alimentación (kg/m³) = concentración del componente en el lavado (kg/m³) = velocidad de formación del componente (kg/m³s) = velocidad de consumo del componente (kg/m³s).

Balance General por componente para cada modo de operación La ecuación de balance general por componente Ec. 1, por ser general, se define para una operación continua. La condición fundamental de toda operación continua es: En una operación continua el flujo de entrada (F1) debe ser igual al flujo de salida (F2): F1 = F2 Esta condición se conoce como flujo en estado estacionario (FEE). Para modelar el comportamiento de la biomasa del cultivo en el estado estacionario (EE) además de la condición de flujo (FEE) debe haber equilibrio en la densidad o concentración de ésta. Esto se conoce como quimioestásis o equilibrio quimioestático y es por eso que a los sistemas de cultivo continuo se les llama quimioestatos. Está condición está dada por la ecuación: dV/dt = F1 – F2 Ec. 2. Bajo la condición de FEE y suponiendo que la densidad del cultivo y de la alimentación son iguales (Ec.2, quimioestásis) la Ec.1 se reduce a: dCi/dt = F (Ci1 – Ci) + V (rfi – rci) Ec. 3. La ec.3 que se conoce como ecuación de balance para una operación continúa en estado estacionario. De no existir el estado estacionario (EE) se producirían dentro del biorreactor dos condiciones de flujo indeseables: Si F1 > F2 se produce el rebalse o desborde del biorreactor, condición que se da cuando el flujo de entrada sobrepasa la capacidad del reactor. Si F2 > F1 se produce el lavado o drenado de producto o biomasa, condición que se da cuando el flujo de salida sobrepasa la capacidad del reactor. Cuando el modo de operación es semicontinuo (fed-batch) el caudal de salida F2 es nulo (F2 = 0) por lo que, el volumen V aumentará con el tiempo en función del caudal de entrada: dV/dt = F Ec.4. Y en el balance de materia se anula el término F2Ci resultando: d(VCi/dt) = FCio + V (rfi - rci) Ec.5. Observe que el volumen que permanece dentro del operador diferencial es porque varía con el tiempo (Ec.4), en tanto que el otro no lo hace (Ec.3). Esa es la razón por la que una operación semicontinua tiene duración limitada en el tiempo (el volumen no puede incrementarse más allá del volumen de trabajo o volumen útil del biorreactor). El tiempo que dura una operación semicontinua se conoce como tiempo de residencia (tr) y es el tiempo que dura el cultivo o bioproceso en un sistema semicontinuo. Cuando el modo de operación es discontinuo (batch) ambos caudales son nulos (F1 = F2 = 0) por lo que, el volumen es constante y se anulan los términos F1 Cio, F2 Ci en la Ec.1.Eso da como resultado: dCi/dt = rfi – rci Ec.6. La duración de un cultivo discontinuo (batch) es también, limitada en el tiempo, pero se diferencia de la del cultivo semicontinuo (fed-batch) en que depende únicamente de las condiciones iniciales del cultivo; esto por cuanto, no existe

alimentación (F1). Una vez cargado el biorreactor e inoculado el medio de cultivo, la concentración de la biomasa aumenta gracias a los nutrientes, pero una vez que el sustrato que limita el crecimiento se haya agotado, el crecimiento ya no es posible y finaliza el cultivo. Por este motivo, el tiempo que dura el cultivo dentro de un biorreactor con un modo de operación discontinuo se llama tiempo de cultivo (tc). Balances individuales Los principales balances por componente en su forma individual son: • • • •

Balance de Biomasa: d (VX) / dt = FiXi + VrgX – FoXo – VrcX rgX = µX (velocidad de crecimiento celular) rcX = kdX (velocidad de muerte celular) Balance de Sustrato: d (VS) / dt = FiSi – FoSo – VrcS

Balance de Sustrato: d (VS) / dt = Fi(40) – Fo(20) – (2)(.5)(.02)

• • • • •

rcS = qSX / YX/S = µX / YG + m X + qPX / YP Balance de producto: d (VP) / dt = FiPi – FoPo – VrgP rgP = qP X Balance de Oxígeno: d (VCL) / dt = FiCLi – FoCLo – VrcO2 + VNiO2 Balance de Anhídrido Carbónico: d(VCCO2) / dt = FiCCO2i – FoCCO2o + VrgCO2 – VNoCO2

Nomenclatura • • • • • • • • • • • • • • • • • •

V: Volumen del líquido en el biorreactor, L t: Tiempo, h y: Concentración del componente y en el líquido dentro del biorreactor, g/L X: Concentración de biomasa en el líquido dentro del biorreactor, g/L S: Concentración de sustrato en el líquido dentro del biorreactor, g/L P: Concentración de producto en el líquido dentro del biorreactor, g/L CL: Concentración de oxígeno en el líquido dentro del biorreactor, g/L C*: Concentración de oxígeno en el líquido en equilibrio con el gas, g/L CCO2: Concentración de CO2 en el líquido dentro del biorreactor, g/L F: Velocidad de flujo de líquido, L/h Ni: Velocidad de transferencia de un componente del gas al líquido, g/Lh No: Velocidad de transferencia de un componente del líquido al gas, g/Lh rg: Velocidad de generación, formación o producción, g/Lh rc: Velocidad de consumo o utilización, g/Lh µ: Velocidad específica de crecimiento celular, h-1 qS: Velocidad específica de consumo de sustrato, g/gh qP: Velocidad específica de formación de producto, g/gh m: Velocidad específica de consumo de sustrato para mantenimiento celular, g/gh

• • • • • •

Kd: Velocidad específica de muerte o declinación celular, h-1 YP: Coeficiente (estequiométrico) de rendimiento de producto basado en el consumo de sustrato consumido para formación de producto, g/g YP/S: Coeficiente de rendimiento de producto basado en el consumo total de sustrato, g/g YG: Coeficiente de rendimiento de biomasa basado en el consumo de sustrato para crecimiento, g/g YX/S: Coeficiente de rendimiento de biomasa basado en el consumo total de sustrato, g/g kLa: Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, h-1

Subíndices • • • • • •

i = Ingreso o = Salida S = Sustrato P = Producto O2 = Oxígeno CO2 = Anhídrido carbónico

Casos Generación de Biomasa: cuando la operación discontinua tiene como objetivo la generación de biomasa (células o microorganismos); se parte del supuesto de que no se forma producto y que la relación µ-S puede ser representada por la ecuación de Monod, con lo que las ecuaciones de balance de biomasa y balance de sustrato limitante de la velocidad quedan: Balance de biomasa: d (X)/dt = µm (XS / Ks + S) Balance de sustrato: d (S)/dt = -µm / Yx/s (XS / Ks + S) El sistema de ecuaciones posee solución analítica, pero en ésta, no aparece X en forma explícita, por lo que, resulta de poca utilidad. Afortunadamente, es posible analizar casos particulares, haciendo algunas suposiciones. En el caso de tomar en cuenta únicamente la fase exponencial del crecimiento, cumple que: S » Ks y las ecuaciones se reducen a las originales, salvo que µ es substituida por µm: Balance de biomasa: d (X)/dt = µmX Balance de sustrato: d (S)/dt = µmX / Yx/s Dado que bajo tales condiciones el crecimiento ocurre al máximo valor de posible, integrando la ecuación de balance de biomasa con las condiciones: t = 0, X = Xo se obtiene una expresión para la concentración de biomasa en función del tiempo: X = Xo eˆµmt o bien: lnX = lnXo + µmt

La ecuación establece que para S » Ks, el crecimiento es exponencial y permite calcular el valor de µm graficando el valor del logaritmo de X (ln X) en función del tiempo (t). En forma similar, la concentración de sustrato limitante de la velocidad en función del tiempo es: S = So – [(Xo / Yx/s) (eˆµmt - 1)] Conforme el sustrato se agota, S disminuye y la condición de S se hace comparable a Ks con lo que dX/dt comienza a disminuir (fase de desaceleración), hasta hacerse finalmente nula (S = 0); en este punto, se alcanza la máxima concentración de biomasa y finaliza el cultivo, pues se ha alcanzado la fase estacionaria. La concentración final de biomasa (Xf) se puede calcular si se conoce Yx/s: Yx/s = - (Xf – Xo) / (Sf – So) Dado que Sf = 0, Xf = Xo + Yx/sSo Lo usual es utilizar estas ecuaciones para calcular Yx/s. Note que antes de la fase exponencial existe una fase de retardo durante la cual, la concentración de biomasa no se modifica substancialmente pero, ocurren cambios en la composición macromolecular y en el "estado fisiológico" de las células del cultivo. Si por algún motivo debe tomarse en cuenta esta fase, se debe aplicar una corrección a la ecuación la concentración de biomasa en función del tiempo: lnX = lnXo + µm (t – tr) donde tr es el tiempo de retardo; es decir, la modificación consiste en restarle al tiempo real, el tiempo transcurrido hasta que comienza el crecimiento exponencial. Normalmente, la fase de retardo no es deseable, tanto por la pérdida económica como por el tiempo desperdiciado; para minimizarla se hace crecer el inóculo aparte, en un medio de cultivo igual al que se va a emplear en el bioproceso (cultivo o fermentación) y luego se procede a transferirlo cuando las células ya se encuentran en la fase exponencial. La última fase es la decaimiento o muerte y consiste en la disminución de la concentración celular de la biomasa por lisis o muerte celular. Ecuación de Diseño de un Biorreactor Discontinuo Ideal Un sistema de cultivo discontinuo es un sistema discreto en cuanto al movimiento de biomasa, ya que no hay flujos. Como condiciones de idealización en un biorreactor discontinuo ideal se supone que el cultivo y su medio están perfectamente agitados y que los parámetros de velocidad (r) son constantes en todo el volumen del sistema (volumen de control); es decir, que la mezcla es perfecta. La otra consideración es que se trabaja con velocidades y componentes individuales (i), por lo que se utiliza la definición de conversión del componente i (Xi), en vez de biomasa; es decir, se trabaja el componente metabólico, no la célula. La ecuación de balance del componente i es: d (Xi)/dt = rxi = µXi

Teniendo en cuenta la definición de conversión y diferenciando Ni respecto al tiempo: dNi/dt = -NiodXi/dt Sustituyendo en la ecuación de balance: -NiodXi/dt = rxiV Separando en variables e integrando: ∫ (Nio/-rxiV) dXi = ∫ dt donde los límites de integración son: Xio (conversión de entrada) y Xf (conversión final) para la conversión y to = 0 (tiempo inicial) y tf (tiempo total de reacción) para el tiempo de reacción. Integrando obtenemos: t = Nio ∫ dXi/-rxiV la ecuación general de diseño para un biorreactor discontinuo ideal. Análisis de Fenómenos de Transporte Sistemas de Intercambio Térmico La transferencia de calor es un proceso el que se intercambia energía en forma de calor entre distintos cuerpos o entre diferentes partes de un mismo cuerpo que están a distinta temperatura. El calor se transfiere por una combinación de dos o más de estos tres procesos: convección, conducción o radiación. Uno de los mecanismos térmicos (proceso) suele predominar sobre los otros dos, también es posible que los tres procesos se den simultáneamente. La conducción es el proceso dominante en los intercambiadores de calor de casco y tubos y en el tubo serpentín. Aunque el mecanismo exacto de la conducción no se comprende, se sabe que se debe al movimiento (energía cinética) de los electrones libres que se mueven por la red cristalina del sólido y transportan energía cuando existe una diferencia (gradiente) de temperatura. Ley de Fourier: J = KδT/δx Donde J = densidad de corriente de energía (J/m²s); K = conductividad térmica (constante característica del material). La velocidad de conducción de calor (J) a través de un cuerpo sólido (medida por unidad de sección transversal) es proporcional directamente al negativo del gradiente de temperatura que existe en dicho cuerpo. Tabla de Conductividades Térmicas y Propiedades de Metales

Las unidades de las magnitudes están expresadas en el Sistema Internacional de Unidades de Medida. Cálculo de Resistencias Térmicas Para calcular la resistencia térmica es necesario transformar las ecuaciones que modelan los distintos mecanismos de transferencia de calor para que presenten la siguiente forma: (Ta - Tb) / Q-punto = expresión matemática = Rth La expresión de la resistencia térmica Rth es diferente en cada sistema y depende del mecanismo de transferencia. Resistencia térmica en la conducción En estos casos se debe distinguir entre las diferentes geometrías que se presentan en cada elemento resistivo; las configuraciones geométricas más usuales: pared plana, pared cilíndrica y pared esférica. Cilindro; Circuito eléctrico análogo para cilindro; Paredes conectadas en serie; Circuito eléctrico análogo para paredes compuestas conectadas en serie; Paredes compuestas conectadas en paralelo; Circuito eléctrico análogo para una pared compuesta conectada en paralelo. Intercambiadores de Calor Un intercambiador de calor es un dispositivo diseñado para transferir calor por un mecanismo mixto de convección entre la película de un líquido procesado (medio cultivo) y la pared de un sólido metálico, seguido de la conducción del calor transferido al área transversal del sólido metálico (tubo o placa) y nuevamente la transmisión de calor por convección desde la pared del sólido metálico a otro fluido procesado (agua). Existen diversas formas de diseñar un intercambiador de calor. Arriba: un serpentín es un tubo metálico que se encarga del intercambio térmico; el líquido refrigerante recoge (absorbe) o transmite el calor. Abajo: una camisa o chaqueta es un dispositivo cerrado de intercambio térmico; en tanto que, un regenerador de calor es un dispositivo abierto. En todos los casos el mecanismo mixto de intercambio térmico es la convección que conduce el calor entre sólidos metálicos estáticos y superficies fluidas móviles.

Intercambiadores de Tubos: Doble Tubo: es el tipo más sencillo de intercambiador de calor; está formado por dos tubos metálicos concéntricos (paralelos) de diámetros diferentes; el fluido que se debe calentar o enfriar entra y fluye por el tubo de menor diámetro; el fluido térmico que ejecuta la acción, fluye por el espacio anular entre los dos tubos; éste espacio es el área de transferencia de calor. Existen dos configuraciones para la dirección del flujo fluido:

a) Flujo paralelo: los dos fluidos entran por el mismo extremo y fluyen en el mismo sentido. b) Contraflujo: los fluidos entran por los extremos opuestos y también fluyen en sentidos opuestos. En un intercambiador de calor en flujo paralelo la temperatura de salida del fluido frío nunca puede ser superior a la temperatura de salida del fluido caliente. En un intercambiador de calor en contraflujo la temperatura de salida del fluido frío puede ser superior a la temperatura de salida del fluido caliente. El caso límite ocurre cuando la temperatura de salida del fluido frío es igual a la temperatura de entrada del fluido caliente. La temperatura de salida del fluido frío nunca puede ser superior a la temperatura de entrada del fluido caliente. Compactos: son intercambiadores de calor multitubulares y están diseñados para alcanzar una gran área superficial de transferencia de calor por unidad de volumen. La razón entre el área superficial de transferencia de calor y su volumen se denomina densidad de área (b). Un intercambiador con b > 700 m2/m3 se clasifica como compacto. En los intercambiadores de calor compactos los dos fluidos fluyen en direcciones ortogonales entre sí (90°) esta configuración de flujo recibe el nombre de flujo cruzado y se clasifica en función del mezclado: a) Flujo cruzado mezclado: uno de los fluidos fluye libremente en dirección ortogonal al otro sin restricciones; b) Flujo cruzado no mezclado: se disponen las placas para guiar el flujo de uno de los fluidos en dirección ortogonal al otro sin que se mezclen. Casco y Tubos: es el tipo más común de intercambiador para aplicaciones industriales; están formados por gran cantidad de tubos metálicos contenidos dentro en un casco o carcasa metálica. Los tubos se disponen con sus ejes paralelos al eje del casco; la transferencia de calor tiene lugar, a medida que el

fluido que se desea calentar o enfriar, se mueve (fluye) por el interior de los tubos metálicos; mientras que, el fluido térmico se fluye por fuera de éstos, dentro del área de transferencia encerrada por el casco. Los intercambiadores de casco y tubos se clasifican según: a) Número de pasos por el casco; b) Número de pasos por los tubos.

Materiales y Métodos •

2 botes de plástico de 2L

• Un motor de ventilador • Una resistencia para calentar agua • Un atomizador •

Un contenedor de agua de 3 litros forma de tazón**

• Desarmador de cruz y plano •

Un eje de metal con aspas***

• Tornillos •

3 tapas de diferentes tamaños

• Plastiloca*** • Cables •

Cinta de aislar negra***

• Termómetro

Diseño Experimental Lactobacilos INTRODUCCIÓN: La flora ácido láctica ha sido tema de muchos estudios por analista de la leche a nivel mundial. El ácido láctico de fermentación se ha convertido en un importante producto químico en estado puro o en forma de sales recibe diversas aplicaciones;

industria alimenticia, farmacéutica, industria textil, industria de materias plásticas etc. Cuando decimos flora ácido - láctica, nos referimos a la gran diversidad de microorganismos presentes en la lactosa, que son capaces de producir ácidos, ya sean perjudiciales para el producto o beneficioso para el mismo. El ácido láctico existe como indicios en la leche fresca, con un porcentaje medio de 30 mg/lts. Es ante todo, el resultado de la fermentación láctica, y según estudiaremos más adelante, dentro de la industria láctea pude presentar un carácter beneficioso o perjudicial. El género a estudiar va a ser la flora ácido láctica de los lactobacilos, este género están menos abundante en la leche cruda, pero si juega un papel importante en la preparación de diversas leches fermentadas, como ejemplos nombramos, los yogurt, leche acidófila. También este género está presente en la saliva de los seres humanos, en las caries dentarias y en el intestino del hombre y animales. Los lactobacilos los estudiamos como termófilos, que se desarrollan de manera normal a temperatura de 45 ºC y los mesófilos que son menos resistentes a las temperaturas, su desarrollo ideal se da a 30 ºC, a una temperatura > 40 ºC, no se desarrollan. El término Lactobacillus es la unión de un prefijo y una raíz: lacto que significa leche y bacillus que quiere decir en forma de barra o vara. Por otro lado, acidophilus quiere decir con afinidad por los ácidos. Esta bacteria crece, fácilmente, en medios mucho más ácidos que los ideales para otros microorganismos (pH 4-5 o menores) y crece en condiciones óptimas a unos 45 ºC. El L. acidophilus crece de manera natural en una gran variedad de alimentos, incluidos la leche, la carne, el pescado y los cereales. No solo está presente en los intestinos de los animales y en el del propio ser humano, sino también en la boca y la vagina. El L. acidophilus absorbe la lactosa y la metaboliza formando ácido láctico. Ciertas variedades genéticamente similares (conocidas como heterofermentivas) también producen etanol, dióxido de carbono y ácido acético como subproductos (hay que reseñar que el L. acidophilus produce exclusivamente ácido láctico). Como cualquier bacteria puede ser eliminada por un exceso de calor, humedad, o la luz solar directa.

Lactobacilos: Son bacilo microaerófilos, gram positivos y catalasa negativos, estos organismos forman ácido láctico como producto principal de la fermentación de los azúcares. Los Lactobacilos homofermentativos dan lugar a ácido láctico como producto principal de fermentación. Este grupo está integrado por Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus delbrueckü. Los Lactobacilos heterofermentativos producen además de ácido láctico, dióxido de carbono, etanol y otro productos volátiles; Lactobacillus fermenti es heterofermentativo y es capaz además, de dar buen crecimiento a temperaturas elevadas (45 ºC, 113 ºF).

Lactobacillus; Característica del Microorganismo: Morfológicamente, algunos bacilos son bastones delgados y largos; otros son algo parecido al colibacilo, pero, al contrario de este, todos son grampositivos. Casi todos son inmóviles, pero se han señalado excepciones. Muchos cultivos muestran una forma diplobacilar característica, a menudo reniforme. Frecuentemente los cultivos viejos muestran considerable pleomorfismo. Los Lactobacilos, son microaerófilos o anaerobios, pero después de cultivos continuos, algunas cepas pueden desarrollarse en presencia de aire. Sus necesidades nutritivas son complejas, y la mayor parte de las cepas no puede cultivarse en los medios nutritivos ordinarios, q menos que se enriquezcan con glucosa y suero. Las necesidades individuales de aminoácidos varían de dos a 15; en general , se requiere piridoxina, tiamina, riboflavina, biotina, ácido fólico y ácido nicotínico, variando las necesidades en cada caso. Estos requerimientos nutritivos variados tienen aplicación práctica en técnicas de dosificación microbiológica de vitaminas y de algunos aminoácidos, para los cuales son mas sensibles que los métodos químicos disponibles. En concentración adecuada, hay cierta relación definida, incluso lineal, entre la concentración de vitamina en un medio de cultivo adecuado, pero exento de vitamina, y el desarrollo o la cantidad de ácido producidos. Algunos bacilos forman parte de la flora intestinal normal y pueden predominar en lactantes e individuos con ingestión elevadas de azúcares, especialmente lactosa. Se supuso que la flora intestinal de lactobacilo era preferible a una flora proteolítica de coliformes, ya que tendía a inhibir los trastornos degenerativo aumentando la vitalidad en personas de edad avanzada, y que esa flora podía establecerse consumiendo leches fermentadas o leches búlgaras y acidófilos. De esta manera puede alterarse la composición de la flora intestinal, y también mediante el consumo de cantidades equivalentes de leche azucarada, pero el cambio es pasajero, y no está demostrado que esa flora intestinal por sí misma favorezca la salud. Aunque se han encontrado raros casos de relación de Lactobacilos con procesos patológicos como endocarditis y enfermedad febril, estas bacterias esencialmente no son patógenas, excepto las raras veces que pueden relacionarse con caries dentales. Son fundamentalmente interesante en la industria de derivados lácteos y de fermentación, donde tienen importancia considerable. La clasificación de los Lactobacilos se ha basado en la fuente de donde se aislaron. Los Lactobacilos, según los productos de fermentación de azúcar, se dividen en dos grupos. El grupo homofermentativo es el mayor y convierte casi completamente el azúcar fermentada en ácido láctico; el grupo heterofermentativo está constituidos por formas que producen cantidades importantes de otros productos de fermentación, incluyendo bióxido de carbono, etanol y ácido acético. En tanto el estudio de aglutinógenos es complicado, por la neta tendencia de lactobacilo a la aglutinación espontánea en solución salina, entre los Lactobacilos heterofermentativos son demostrable diez diferentes

aglutinógenos, junto con algunos antígenos menores compartidos junto con la especie Leuconostoc. De las especies Lactobacilos diferenciables por reacciones fisiológicas, solo tres mencionamos. Lactobacillus acidophilus. Este organismo, cultivado por primera vez por Moro en 1900, a partir de heces de lactante, ha sido aislado del intestino de casi todos los mamíferos, muchos otros vertebrados y algunos invertebrados. Su cantidad aumenta en el intestino cuando aumenta el contenido de carbohidratos en la dieta; pueden ser predominantes cuando se ingiere una dieta láctea. Estos bacilos, bastante gruesos y de longitud variable, se disponen aislados, a pares frecuentemente algo flexionados en la unión, y en empalizadas. Las cadenas largas, las formas filamentosas y las formas en maza no son raras. Los cultivos jóvenes se tiñen uniformemente grampositivos; los cultivos viejos, a menudo muestran coloración listada o bipolar y pueden decolorarse fácilmente. Las colonias, generalmente pequeñas, pueden variar en su forma: de la opaca, redonda y lisa a la aplanada, translúcida e irregular, frecuentemente con aspecto de cristal. Las reacciones de fermentación son variables, pero la mayor parte de cepas producen ácido pero no gas, a partir de glucosa, lactosa, maltosa y sacarosa y coagulan la leche en 48 horas. El bacilo de Döderlein (1892), miembro común de la flora vaginal, que se cree ayuda a las defensas naturales contra la infección por contribuir a la acidez de las secreciones vaginales, parece ser idéntico a L. Acidophilus. Lactobacillus acidophilus: Está ampliamente diseminado y se halla en la leche productos lácteos y como comensal de tracto digestivo de los mamíferos. Se emplea para fabricar "leche ácida" y se supone se haya relacionado con la caries dental del hombre, en la que puede describirse como L. Odontolyticus. Los lactobacilo son importantes para la industria láctea y alimenticia y son comensales del hombre y de los animales. Bacilos Acidolácticos ("Lactobacilos"), Determinación a Nivel de Laboratorio: Para su enriquecimiento, puede utilizarse uno de los medios selectivos, según se pretenda descubrir todos o sólo aquellos que crecen a temperaturas medias. En el primer caso se utiliza el agar - acetato – talio Sharpe, besado en el medio mejorado de Briggs para los bacilos acidolácticos. Composición del agar – acetato – talio Jugo de tomate ---------------------------------- 100 c.c. (Neo-) peptona ---------------------------------- 20 gr Glucosa ---------------------------------- 20 gr Sal común ----------------------------------------- 5 gr

Almidón sol ----------------------------------------- 0,5 gr Yeastrel (prep.. levadura) -------------------------- 3 gr Twen 80 (mono–oleato de poli–oxietilen–sorbit) 1 gr Thioglicolato ------------------------------------------ 10 gr Acetato de talio ------------------------------------ 1 gr. Agar 15’0 gr, todo disuelto en 1.000 c.c. de agua; el pH final debe ser de 6.6 Preparación de jugo de tomate según Briggs: Se ponen 5’4 kg de tomates en 1 litro de agua destilada, se trocean los tomates en pequeños pedazos y el total se pasa por una prensa metálica. El jugo obtenido se filtra, se gradúa su pH en 7’0 y se somete durante 15 minutos a la acción del autoclave a 120 ºC; 100 c.c. de este producto corresponden en concentración a los 100 c.c. que se agregaban antes (Briggs) En lugar de la Neo peptona (Difco) podría emplearse también con los fines mencionados la caseína o peptona de carnes obtenidas mediante digestión trípsica; en vez de Yeastrel, puede utilizarse doble cantidad de extracto de levadura (Difco). Se distribuye en tubitos de ensayo a razón de 10 c.c. en cada uno y se esteriliza. Tras la siembra se incuban las placas 2 días a 37 ºC. Los bacilos acidolácticos del subgénero Thermobacterium se desarrollan muy bien, pero por desgracia los estreptococos acidolácticos no son inhibido por el acetato - de talio, por lo cual, cuando los bacilos no pueden reconocerse por las "ásperas" colonias (filamentosas) de las colonias lisas de los estreptococos, entonces debe recurrirse a su diferenciación por medios microscópicos. El medio acetato de Rogosa descrito más abajo en la modificación de Mabbitt y Zielinska es, como también ratifica Sharpe, especial para aquellos bacilos acidolácticos que crecen mejor a la temperatura de 30 ºC que a 37 ºC o más; se trata de las estreptobacterias homo fermentativas y betabacterias heterofermentativas. Agar Compuesto por agarosa, agaropectina, galactosa, acido uronico Levadura Existe la evidencia de que el pan era conocido alrededor del año 2600 a.C. en Babilonia, y ya en el siglo 12 a.C. era producido normalmente con una tecnología establecida. Lógicamente esto implica que el hombre dominaba ya el uso de a levadura para levar la masa preparada con harina y producir así el pan. En las primeras épocas se utilizaba la levadura obtenida de la fabricación de cerveza primero y de las destilerías después, hasta que finalmente se establecieron las plantas de producción de levadura durante el siglo 19.

Es posible que la primera planta de producción comenzó a operar en Holanda en 1780 con el llamado proceso Dutch que era anaerobio y que tenía sólo rendimiento del 4 al 6% con respecto a la materia prima usada. Posteriormente se mejoró el rendimiento, que pasó a ser del 12-22% con el proceso Vienna, también conducido sin aire, en 1846. Con la introducción de la aireación en el proceso de producción, que tiene lugar en 1879, se aumentan considerablemente los rendimientos, que pasan a ser del 50 al 60% del teórico. La última etapa importante de modificación de la tecnología tiene lugar con la alimentación controlada de azúcar a los mostos en fermentación, cambio introducido por un científico danés, Sak, y un alemán, Hayduck, en 1919. Este proceso conocido como "Zulaufverfahren" es la base de todas las tecnologías posteriores que se basan en los principios de los procesos "batch" alimentado ya considerados. Los procesos de producción utilizaban granos como materia prima, hasta que el elevado costo de éstos produjo el reemplazo por las melazas de remolacha o de caña con las cuales pueden alcanzarse rendimientos cercanos al 100% del teórico. Actualmente se está tratando de encontrar otras fuentes de materias primas alternativas a las melazas, como el suero de leche hidrolizado. La producción mundial de levadura prensada (27-30% de materia seca) es considerable ya que en 1983 estaba en el orden de 1,763,000 toneladas, con un valor de 473,000, 363,000 y 83,000 toneladas correspondiente a Europa occidental, Norte y Centro América, y Sud América respectivamente. Con respecto al consumo anual per capita de levadura prensada (27-30% de materia seca) está en el rango de 1.5 a 2.1 Kg para los paises europeos, mientras que en paises de Sud América como Chile es de 1 Kg y en Argentina 0.6 Kg. Inicialmente fue la levadura de cerveza, el Saccharomyces uvarum, syn S. carlsbergensis, el empleado con fines de panificación. Posteriormente se la reemplazó por la levadura de las destilerías, y por la llamada levadura de panificación, que es el Saccharomyces cerevisiae. Se han ensayado también muchas otras cepas, no sólo del mismo género sino también las pertenecientes a distintas especies de Candida, Hansenula y Zygosaccharomyces, aunque ninguna de ellas demostró poseer ventajas sobre el Saccharomyces cerevisiae. El mejoramiento genético de cepas de S. cerevisiae de interés industrial para la producción de levadura prensada es dificultoso, porque no existe un conocimiento detallado de los genes comprendidos en las propiedades o características deseadas de dichas cepas. Las propiedades fundamentales son

aquellas relacionadas con la producción, que resultan en un crecimiento rápido y altos rendimientos a partir de las melazas con el mantenimiento de las propiedades de panificación exigidas, que son el poder fermentativo y la estabilidad del producto. Estas propiedades dependen de muchos genes que intervienen en los ciclos de la glicolisis y de los ácidos tricarboxilicos, como así también en el metabolismo del nitrógeno y en la síntesis de hidratos de carbono de reserva. Algunas cepas de interés industrial se han obtenido utilizando técnicas de hibridación que incluyen la fusión de protoplastos, ya explicada en el capítulo 3. La obtención de híbridos para mejorar una cepa no es siempre exitosa, ya que los productos de fusión (híbridos) tienen que cumplir con todas las características exigidas por las levaduras comerciales, ya comentadas. Es conveniente mencionar finalmente que el advenimiento de las técnicas de ingeniería genética ha abierto una nueva área de interés industrial en el campo de las levaduras. Sin embargo, hasta el presente esas técnicas no han sido de utilidad en la industria de la levadura de panificación, porque los logros alcanzados incluyen solamente propiedades bioquímicas relacionadas con pocos genes. Las cepas de levadura que han sido desarrolladas en los últimos años, permiten la producción de productos de interés farmacológico como la insulina, hormona de crecimiento bovina, interferón, vacuna contra la hepatitis B, se han originado en cepas de laboratorio definidas genéticamente y no en cepas de levaduras industriales. 1. Mantenimiento en medios de cultivo sólidos y repiques periódicos (cada 3 a 6 meses) en medio fresco, 2. bajo aceite mineral, 3. congeladas a -20 °C y después a -55 °C en medios que contienen leche o glicerol, 4. liofilización, y 5. mantenimiento a muy baja temperatura, en nitrógeno líquido (-196 °C). Tal vez el método más satisfactorio sea el de la liofilización, aunque pueden emplearse con éxito cualquier otro método que asegure la estabilidad, o sea que no se produzcan cambios en las propiedades bioquímicas de microorganismo. Los requerimientos nutricionales de los macroelementos más significativos pueden deducirse del conocimiento de la composición centesimal de las células. En el capítulo mencionado se estableció también la ecuación de formación de 100 g de levadura seca a partir de 200 g de sacarosa. De las fuentes de carbono y energía que pueden emplear el Saccharomyces cerevisiae figuran en primer lugar la glucosa y la sacarosa, aunque también pueden emplearse fructuosa, galactosa, maltosa y suero hidrolizado, ya que la

levadura de cerveza no puede asimilar lactosa. También puede utilizarse etanol como fuente de carbono. El nitrógeno asimilable debe administrarse en forma de amoníaco, urea o sales de amonio, aunque también se pueden emplear mezclas de aminoácidos. Ni el nitrato ni el nitrito pueden ser asimilados. Aparte de carbono y el nitrógeno los macroelementos indispensables son el fósforo que se emplea comunmente en forma de ácido fosfórico y el Mg como sulfato de magnesio, que también provee S. Finalmente son también necesarios el Ca, Fe, Cu y Zn como elementos menores. Por ejemplo, se ha establecido que S. cerevisiae requiere 200 mg de Zn, 75 mg de Fe y 12-15 mg de Cu por litro de medio para crecimiento óptimo. Un requerimiento esencial está constituido por las vitaminas del grupo B como biotina, ácido pantoténico, inositol, tiamina, pyridoxina y niacina. Existen sin embargo algunas diferencias entre las distintas cepas. Entre las vitaminas mencionadas la biotina es requerida por la casi totalidad de las mismas. Los requerimientos cambian según las condiciones de cultivo, ya que el aumento de la aerobiosis disminuye los requerimientos de esa vitamina y el uso de urea como fuente de nitrógeno los aumenta por la necesidad de biosíntesis de 3 sistemas enzimáticos que contienen biotina. Se ha estimado que los requerimientos de la biotina son de 100 mg de biotina por 100 g de azúcar suministrados para el crecimiento de la levadura. El ácido pantoténico, que es un componente de la coenzima A, es también requerido por muchas especies, mientras pocas especies requieren inositol. Con respecto a la tiamina se ha demostrado que aumenta la actividad fermentativa de la levadura. Finalmente debe mencionarse al 02 como otro requerimiento nutricional para la producción de levadura. Como se estableció anteriormente se necesita 1 g de 02 para la producción de 1g de levadura seca en el caso de crecimiento en condiciones óptimas. El 02 se suministra con el aire que se inyecta en los medios durante la fermentación. Si existe limitación de 02 no se puede alcanzar los rendimientos óptimos que como vimos deben estar cercanos al 100% del teórico.La velocidad de transferencia de 02 requerida depende del proceso empleado. Si la máxima velocidad de alimentación es de 10 g de azúcar l -1 h-1 se puede lograr una productividad de 5 g l -1 h-1 de materia seca, y para la cual se requiere una velocidad de transferencia de 5 g de 02 1-1 h-1 que debe ser suministrada por el equipo. Tal como se mencionó en el capítulo 7 se debe asegurar por lo tanto un valor de coeficiente KLa que asegure esa valor de transferencia de oxígeno para que no exista limitación por el oxígeno. En el ejemplo citado el valor de KLa necesario es de 685 h -1. Los valores normales de la velocidad específica de crecimiento para levaduras están en el orden de 0,45 a 0,6 h -1 como máximo.

Como en realidad se utilizan para la producción de procesos tipo batch alimentado la cinética del proceso, ya considerada, predice un aumento de XV igual a

En la práctica comercial de la producción de levadura, la alimentación no es constante sino que se realiza según programas propios de cada industria. La aplicación de la ecuación logarítmica para calcular p debe hacerse con precaución, ya que m no es constante sino que va disminuyendo en función del tiempo, salvo en casos de alimentación programada para mantenerla constante durante intervalos cortos con una finalidad específica de calidad. La relación entre la velocidad específica de crecimiento y la concentración de sustrato puede ser representada por la ecuación de Monod. Para S. cerevisiae se ha establecido un valor de Ks igual a 25 mg glucosa l-1 , siendo m dependiente de la concentración de sustrato por debajo de S = 10 Ks, o sea 250 mg l-1 . La eficiencia de un proceso industrial de producción de biomasa como es el caso de la levadura se mide fundamentalmente en base al valor Y x/s, ya discutido con anterioridad en esta monografía. Los valores óptimos a partir de azúcares están alrededor de 0.5 g de biomasa seca por g de azúcar asimilada. En el caso de emplearse etanol, Yx/s puede alcanzar valores de 0.78 a 0.80. Con el aumento de la concentración del sustrato puede aumentarse m pero disminuye Yx/s porque se favorece la fermentación alcohólica, aún en exceso de 02 según el fenómeno Crabtree ya mencionado anteriormente. Debido al mismo rendimiento celular es función de m , y cuando esta es superior a 0.2 el rendimiento celular baja. Es por ello que ese valor es raramente excedido en la práctica industrial. La temperatura óptima del proceso se ha establecido en 28.5 °C; a mayores temperaturas disminuye el rendimiento, probablemente debido al aumento de energía de mantenimiento. El rendimiento celular puede también afectarse por la presencia de inhibidores como S02, ácido aconítico y metales pesados o restos de herbicidas o bactericidas que pueden estar presentes en las melazas. CONCLUSIONES Con este trabajo se concluyo la primera etapa para el diseño de un bioreactor casero para ser terminado con materias subsecuentes tales como electrónica, programación, entre otras.

Siempre con la finalidad de usar recursos reutilizables y de bajo costo tratando de igualar la tecnología en el mercado y así obtener nuestra propia tecnología para ser utilizada en las instalaciones dentro del campus. Bibliografía Comprehensive Biotechnology. The practice of Biotechnology: Current Commodity Products. Volume 3. Ed. Harvey W. Blanch, Stephen Drew and Daniel Wang. Pergamon Press (1985) Progress in Industrial Microbiology. Vol 23. Ed. M.R.Adams. Elsevier (1986) Microbial Technology. Vol. I, 2da. Ed. H.J.Pepple r y D. Perlman. Academic Press (1979).

Ciencia de la Leche; Principios de Técnicas Lecheras. 1ª edición en español de la 2ª edición francesa, junio 1970. Editorial: Continental S.A.Impreso en España Microbiología de la Fermentación. Industrial Galindo Enrique; Peña Carlos; Serrano-Carreón Leobardo. 2007. DOMESTICAR MICROORGANISMOS EN UN BIORREACTOR: LOS RETOS DEL BIOINGENIERO. UNAM http://www.biologia.edu.ar http://bioreactores.wordpress.com http://es.wikipedia.org