• Categories
• Termopar
• Química
• Energía y recursos
• Ciencia
• Productos químicos

Citation preview

1

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIA CAMPUS GUANAJUATO

INGENIERIA DE BIORREACTORES DISEÑO DE UN BIORREACTOR AIRLIFT PARA LA PRODUCCION DE ACIDO GIBERÉLICO

6FM1

BARRIENTOS GARCIA ENRIQUE ORTIZ HERNANDEZ VICTOR HUGO GRANADOS GONZALEZ JOSE GUADALUPE MARTÍNEZ LIZAMA OSCAR ADRIAN

PROFESORA DIANA RAMIREZ SAENZ 28 de noviembre de 2014

2

INDICE • • • • • • • • • • • • • • • •

Fundamento Antecedentes Objetivos Definición, justificación y selección del microorganismo Parámetros cinéticos y volumen de operación Simulación (modelo de Monod) Factores de forma Descripción del biorreactor tipo Arilift Simulación de Cultivo Continuo Dimensionamiento del Biorreactor Descripción del sistema de agitación, condiciones de operación, reología y potencia del motor Descripción del mecanismo de transferencia de masa en el reactor Criterios de escalamiento Instrumentación Esterilización del biorreactor y del medio de cultivo. Conclusión

FUNDAMENTO PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO

3

La producción de ácido giberélico tiene gran importancia en la industria agrícola, para el análisis físico y biológico de semillas, como el estudio de la Avena sativa, Hordeum Vulgare, Secale Cereale y Triticum Aestivum. Este ácido es además un regulador de crecimiento que se usa para estimular y regular el desarrollo de las plantas, en fenómenos como reforzar la dominancia apical, estimulación de la floración, aumento del fructificación, rompiendo la dormición de las semillas, suprimiendo el estrés causado por algunos virus y actividad antibacteriana, (E.P. Yúfera, 1995). El hongo Gibberella Fujikuroi, produce ácido giberélico, este hongo generalmente tiende a infectar plantas y provoca que estas tengan un desarrollo anormal, por ejemplo, cuando infecta a la planta de arroz produce el desarrollo de tallos muy largos. El producto aislado se comporta como una hormona de crecimiento vegetal, estimulando el crecimiento de los tallos y el desarrollo de los brotes. Las plantas también producen ácido giberélico, como una hormona natural de crecimiento en los vegetales, (E. P. Yúfera, 1995). El costo de la producción de ácido giberélico mediante fermentación sumergida es muy alto, principalmente por su rendimiento extremadamente bajo y al extenso procesamiento en el downstream, se han llevado a cabo estudios para disminuir el costo de producción de ácido giberélico usando varios enfoques, (S. Bandelier y col. 1997). Por ejemplo: a) La optimización de nutrientes y de las condiciones del cultivo. b) Desarrollo de nuevas técnicas (células inmovilizadas, cultivos por lote alimentado). c) Técnicas de bajo costo para la extracción del componente. Otra alternativa es la fermentación en estado sólido, la cual tiene ventajas económicas en la producción de biomasa y metabolitos en la producción agrícola industrial. CRECIMIENTO DE GIBBERELLA FUJIKUROI EN UN REACTOR AIRLIFT Los parámetros más importantes para el desarrollo de Gibberella Fujikuroi en el reactor Airlift son la retención de gas, la velocidad del fluido en los tubos ascendente y descendente, la determinación del

4

tiempo de mezclado, la velocidad determinada del gas que fluye hacia la superficie. La transferencia de masa, es determinada con el coeficiente volumétrico de transferencia de masa, el cual es determinado en función de la velocidad del gas en el tubo ascendente y como una función del tiempo de fermentación, (M. C. Chavez y Col., 2007). BIORREACTOR AIR-LIFT Es un reactor para fermentación, en el cual el uso de una corriente de aire es esencial, ungiendo como la fase dispersante en la recirculación de componentes, como las células y el medio dentro del reactor. Es funcional en procesos de carácter aerobio. La forma típica de un Airlift contiene un tubo inyector de aire en el fondo del reactor, por el cual el aire entra a alta velocidad, impulsando el contenido dentro del reactor, generando burbujas en el caldo las cuales suben a la superficie generando una corriente de arrastre en el fluido cercano, provocando un flujo hacia arriba, al llegar el fluido a la superficie pierde la velocidad de arrastre por la liberación de la burbuja, aumentando su densidad, y por gravedad fluye ahora hacia abajo con una mínima concentración de aire disuelto, generando recirculación, (D. G. Rao, 2010).

ANTECEDENTES La producción de ácido giberélico es un proceso que actualmente es relevante en la industria alimentaria debido a la necesidad de generar investigación relacionada con los sistemas de plantación como es el uso de sustratos y/o cultivos sin suelo en contenedores, al igual que otras prácticas hortícolas adecuadas que permitan el incremento de la producción. Por lo tanto, determinar cuáles serían algunos sustratos que puedan ser utilizados por los productores, constituye una nueva fuente de investigación, cómo hechos destacados podemos mencionar a los procesos elaborados en Venezuela que evalúan los efectos de diferentes sustratos y ácido giberélico sobre el crecimiento, producción y calidad de la fresa, debido a la fuente de trabajo que representa para las zonas altas de ese país. La introducción de semillas modificadas genéticamente para su reproducibilidad da lugar a una producción tardía. La aplicación de ácido giberélico, puede mejorar el crecimiento celular, dando lugar a la recolección temprana de cultivos. Un ejemplo claro es lo que sucede en el estado de Chihuahua en México donde a se evalúa la acción del ácido giberélico sobre la producción hidropónica del tomate.

5

En la industria agrícola se desarrollan técnicas para aumentar la producción mediante el uso y promoción de promotores de crecimiento para los vegetales, el uso de Gibberella Fujikuroi para producir ácido giberélico mediante lotes de fermentación sumergida es una herramienta de alta eficacia para promover la producción en este sector. En esta investigación su utilizo un modelo ortogonal para investigar los efectos de la tempera, pH, la relación entre fuente de carbono y nitrógeno y concentraciones de harina de arroz sobre la producción de ácido giberélico por Gibberella Fujikuroi en biorreactores fluidizados. En biorreactores fluidizados la producción de este ácido puede ser en promedio 3.90 g L-1, más de tres veces más grande que los reportados por fermentaciones sólidas y sumergidas, donde los parámetros antes mencionados son los que más impactaron en la producción de dicho ácido, donde el pH fue el que más afecto la producción. Para este experimento los efectos de la temperatura, pH, la concentración de fuente de carbono y fuente de nitrógeno y los cambios en la concentración de harina de arroz, no tuvieron gran impacto con respecto a una pobre producción, lo contrario se mostraron rendimientos mayores. Para producción de ácido giberélico se ha implementado técnicas de inmovilización celular, que permiten concentrar la biomasa en espacios reducidos, la reutilización de biocatalizador y la separación facilitada de la biomasa. La utilización de sistemas de producción que utilizan células inmovilizadas representa una alternativa viable para la producción de metabolitos secundarios de interés biotecnológico, sin embargo la utilización de un biorreactor air-lift produce una mayor concentración de oxígeno, proporcionando un mayor rendimiento en los procesos metabólicos. (Molina y colaboradores) El biorreactor air-lift proporciona aireación, siendo un factor clave para la remoción del calor metabólico, CO2 y metabolitos volátiles ocluidos entre las partículas, junto con su efecto regulador de la humedad del biorreactor. Además por su configuración geométrica, induce la recirculación del medio de cultivo, lo que hace más atractiva e indicada su aplicación para el desarrollo eficiente de cualquier tipo de fermentación sumergida. (Cruz, 2007)

OBJETIVOS

6

OBJETIVO GENERAL Determinar los parámetros cinéticos, dimensionales y escalares para el diseño de un biorreactor tipo Airlift empleado para la producción de ácido giberélico con una cepa de Gibberella Fujikuroi. OBJETIVOS ESPECIFICOS 

      

Definir las condiciones específicas de crecimiento de Gibberella Fujikuroi en un reactor de tipo Airlift necesarias para la producción de ácido giberélico. Definir una ecuación balanceada que describa a la cinética de crecimiento por balanceo de electrones. Realizar una cinética de crecimiento teórica de acuerdo a las condiciones de crecimiento adecuado para el hongo. Realizara una simulación de la cinética con los parámetros obtenidos. Diseñar una simulación para un sistema de lote alimentado y continuo. Establecer las dimensiones apropiadas de un biorreactor tipo Airlift para un volumen de siete litros. Determinar las variables de medición y control. Especificar el instrumental necesario para el funcionamiento óptimo de un biorreactor tipo Airlift para determinar los parámetros de producción de ácido giberélico.

DEFINICIÓN, JUSTIFICACIÓN Y SELECCIÓN DEL MICROORGANISMO (GIBERELLA FUJIKUROI) Las giberelinas son un grupo de hormonas encargadas de regular el crecimiento de las plantas, en su estructura química lo constituyen de diterpenos, los cuales están compuestos por cuatro estructuras de isopreno que forman como ligadura tres anillos, además de formar un puente de lactona. Existen alrededor de 79 tipos de giberelinas que han sido documentadas e identificadas en bacterias y plantas. A esta gran variedad de giberelinas se les designa como GA1, GA2, GA3 hasta llegar a GA79. La diferencia que existe entre cada una de ellas se debe a la presencia y localización de doble ligadura y al número de grupos carboxilo, carbonilo e hidroxilo dentro de la molécula (Grove 2001). De estos 79 tipos, 25 son producidas por el hongo gibberella (Jones 1968).

7

El ácido giberelico (GA3) es producido por microorganismos, donde el hongo ascomiceto Giberella Fujikuroi es el más empleado para su producción (Jefferys 1970). El GA3 es el compuesto más importante del grupo de las giberelinas, este acido es sólido cristalino blanco soluble en agua cuando no excede de 5 g/L. es fácilmente soluble en solventes orgánicos tales como etanol, metanol, acetato de etilo, acetato de butilo y acetona. El hongo Giberella Fujikuroi es un hongo cuyo estado imperfecto es denominado fusarium moniliforme, su aspecto de cultivo es muy variable y es causante de la enfermedad “Bakanae” en la planta de arroz. (Durand 2002)

Figura 1. Vista microscópica de fusarium moniliforme Pertenece al orden Maniliales familia Tuberculariaceas. Una característica que es muy remarcada en este hongo es la formación de macroconidios falciformes de varias células y frecuentemente presenta también microconidios monocelulares.Es productor de un pigmento color violeta, perteneciente al grupo de las Bikaverinas que presenta amplias posibilidades de aplicación en la industria farmacéutica y cosmetología (Kumar 1970).Por lo tanto se considera que G. Fujikuroi es el microorganismo más adecuado para la producción de GA3. FACTORES QUE AFECTAN LA FERMENTACION GIBERELENICA (GA3) Los rendimientos que se consideran óptimos de una fermentación dependen de factores como: cepa utilizada, tipo y preparación del inoculo, concentración y tipo de nutrientes, temperatura, pH y suministro de oxígeno. Las características del medio de fermentación son fundamentales para la obtención de buenos rendimientos de ácido giberelico, siendo

8

primordiales la fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales minerales y factores de crecimiento(Brucker 2001).El oxígeno tiene un efecto y un papel muy importante cuando las células están en crecimiento, ya que la demanda de oxigeno aumenta, y si existen inhibiciones del gas por un periodo largo de tiempo, decrece la producción de GA 3, CO2 y metabolitos volátiles ocluidos entre las partículas, lo que podría generar un aumento en la humedad. La aireación del reactor permite que el crecimiento del microorganismo se realice en condiciones aeróbicas y ricas en nutrientes. Para el caso de hongos existen diversos tipos de inóculos (micelio, esporas) sin embargo, las esporas fúngicas del hongo Gibberella Fujikuroi presentan características de tamaño, forma y estado fisiológico más uniforme y se manejan más fácilmente que la masa micelial (Mandels 1996). La velocidad de crecimiento y la acumulación de producto también son afectadas por variaciones de temperatura y pH. La temperatura optima de crecimiento de G. Fujikuroi se encuentra entre 31 y 32°C, mientras que la mayor producción de ácido giberelico se logra obtener a 29°C, a temperaturas superiores se acumulan otras giberelinas como A 4 y A7. (Borrow 2001) BIOSINTESIS DE GA3 La ruta metabólica para la síntesis de GA 3 ocurre en cuatro etapas: (Jones 1968) 1. Formación de la unidad isopreno o su equivalente biológico a partir de acetil CoA o leucina. 2. Deshidratación y descarboxilacion de mevalonil 5 fosfato para dar un isopreno activo seguida de la condensación de unidades de isopreno para formar terpenos alicíclicos. 3. Ciclación de las estructuras aliciclicas. 4. Posteriores modificaciones de la estructura ciclizada que conducen a la formación de las distintas giberelinas. El análisis de la biosíntesis de GA 3 revela que existe una gran similitud con el anabolismo de grasas, lo que hace suponer que la presencia de estas moléculas en el medio puede provocar una alteración de la producción de GA3.

9

FERMENTACION ADECUADA PARA EL CRFECIMIENTO DE GIBBERELLA FUJIKUROI En los últimos años se ha ido generado un gran interés por las fermentaciones en estado sólido con aireación directa, esto se debe a los altos rendimientos que genera. Además de la excelente productividad, este tipo de fermentación ofrece otras ventajas prácticas y económicas (Grove 2001). Las fermentaciones en estado sólido son aquellas en las cuales el crecimiento microbiano y la formación del producto se llevan a cabo en la superficie de sustratos sólidos. La fase solida puede brindar una superficie rica y compleja de nutrientes y además un soporte para el crecimiento microbiano. Se pueden obtener condiciones selectivas para el crecimiento fúngico humedeciendo los sólidos con medio a bajo pH y con alta densidad de inoculo de esporas (Durand 2002). Unas de las ventajas que ofrece la aireación en reactor tipo Airlift, es que la aireación se facilita por espacios entre las partículas de sustratos y partículas de la mezcla, por lo que el rendimiento del producto puede ser mucho más alto que en un tratamiento con medio líquido. INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE FERMENTACION EN LA PRODUCCION DE GIBERELINAS Cada hongo tiene un desarrollo en sus propiedades anatómicas, morfológicas y sobretodo fisiológicas. Se ha demostrado que las condiciones óptimas para la producción del ácidoliberalice se dá en cultivos en donde la fuente de nitrógeno se restringe parcialmente a la par que se desarrolla el micelio al metabolizar la fuente de carbono (Kumar 1970) Como fuente de nitrógeno se ha utilizado preferentemente nitrógeno amoniacal y también como fuentes alternativas se pueden emplear semillas de cereales o plantas. En lo referente a la fuente de carbono es ideal un proceso de liberación gradual o lenta para evitar un fenómeno de represión catabólica. Se ha demostrado que la sacarosa es mejor que la glucosa como fuente de carbono pero también se pueden utilizar aceites de semillas de cereales, maíz o ajonjolí.

10

La producción de ácido giberélico depende mucho del pH, este intervalo ahonda entre los 3 y 5.5, si no se respeta este parámetro la velocidad de producción y de velocidad tienden a decrecer (Brucker 2001) El medio ambiente gaseoso o de aireación contribuye de manera considerable en la velocidad de formación de biomasa y de biosíntesis del ácidoliberalice en el estado sólido. Tiene la propiedad de establecer un monitoreo de la actividad biológica por determinaciones de parámetros como humedad, temperatura, cantidad de oxígeno y de CO2.

PARÁMETROS CINÉTICOS Y VOLUMEN DE OPERACIÓN Para producción de ácido giberélico, se parte de la siguiente ecuación: C6 H 12 O6 +0.026 NH 4 Cl+O2 →C H 1.79 O0.50 N 0.20+C 19 H 22 O6+ CO2 + H 2 O Dónde: C6 H 12 O6 → Dextrosa=Fuente de Carbono NH 4 Cl →Cloruro de Amonio=Fuente de Nitrogeno O2 → Oxigeno=Fuente de Oxigeno C H 1.79 O0.50 N 0.20 →Gibberella fujikuroi=Biomasa C19 H 22 O6 → Acido giberelico= producto

Se determinan los coeficientes estequiométricos para determinar el balance general de la ecuación anterior (ver Anexo 1), quedando de la siguiente manera:

C6 H 12 O6 +0.026 NH 4 Cl+1.741 O2 → 2.99C H 1.79 O0.50 N 0.20 +0.001118C 19 H 22 O6 +CO 2 + H 2 O

11

DETERMINACION DE LOS PARAMETROS CINETICOS Se utilizó la cepa H-984 del hongo Gibberella Fujikuroi utilizando como fuente de nitrógeno NH4Cl y como fuente de carbono Dextrosa. Las variables independientes involucradas en este proceso fueron el pH, cantidad de carbono y cantidad de nitrógeno y la variable dependiente fue la producción de Ácido Giberélico (GA 3).El proceso se llevó a cabo en un reactor tipo Airlift con un volumen de capacidad de 4 litros. Se monitoreo la evolución de biomasa, glucosa, consumo de nitrógeno y producción de ácido giberélico en un periodo de 50 Horas. Se registraron los siguientes datos a partir de la cinética de crecimiento Tabla 1. Datos obtenidos para la producción de ácido giberélico, así como los respectivos rendimientos de sustrato, biomasa y producto. Tiemp o h

Produc to g/L

Sustrato (residual ) g/L

Biomasa g/L

LAN(X/x0 )

50 45.78 43.45

Sustrato (consumi do) g/L 0 4.22 6.55

0 25 50

0 0 0.03

75

2.15 8.67 10.31

0 1.3944 1.5676

0 0 0.00368

0 2.0545 1.574

0 0.48673 0.63530

0.045

34.33

15.67

10.52

1.5878

0.00538

0.6713

1.48954

100

0.055

32.56

17.44

12.33

1.7465

0.0054

0.7069

1.41443

125

0.0886 5 0.102

30.01

19.99

10.89

1.6223

0.01014

0.5448

1.83562

25.89

24.11

8.5

1.3745

0.01606

0.35255

2.83647

145

Ypx

Yxs

1/Yxs

Los datos proporcionados en la Tabla No. 1 fueron colocados en una hoja Excel para aplicar su regresión y obtener así los parámetros como la velocidad de crecimiento (µ), generación de producto en la fase estacionaria (mp), coeficiente de mantenimiento celular (ms), generación del producto en etapa estacionaria (qp) y (qs). Gráfico 1. Variación en la concentración de sustrato consumido, sustrato residual y biomasa.

Yps

0 0 0.004 58 0.002 87 0.003 15 0.004 43 0.004 23

12

Sustrato (residual) g/L Linear (Sustrato (residual) g/L) Sustrato (Consumo) Linear (Sustrato (Consumo)) Biomasa g/L Linear (Biomasa g/L) 60 40 Concentración, g/L 20 0 0

20

40

60

80 100 120 140 160

Tiempo, h

En el gráfico No. 1 podemos notar las variaciones de consumo de sustrato por el hongo, observamos que a un tiempo de 148 horas el sustrato se ha consumido totalmente, pero a un tiempo de 100 horas la biomasa comienza sus mecanismos de defensa (fase de senescencia) reduciéndose la concentración de biomasa. Gráfico 2. Velocidad de producción de ácido giberélico. 0.12 0.1 0.08 Ácido giberélico, g/L 0.06 0.04 0.02 0 0

50

100

150

200

Tiempo, h

La cantidad de ácido giberélico producido es menor debido a que el hongo emplea la mayor parte del sustrato para su mantenimiento celular, así como para su reproducción, esto se ve atenuado debido a la presencia de nitrógeno en forma de NH4Cl en el medio. En la sección de anexos se incluyen los gráficos para la determinación del coeficiente específico de crecimiento global del rendimiento Ypx con

13

respecto al tiempo para obtener coeficiente de mantenimiento celular en fase estacionaria (mp) y el coeficiente de mantenimiento celular (ms).

SIMULACIÓN (MODELO DE MONOD) Tabla 2. Datos obtenidos de la simulación al utilizar MathCad.

Se observa en la tabla 2 los datos arrojados en la simulación realizada a través de MathCad utilizando el modelo de Monod debido a que el proceso de producción de ácido giberélico se ajusta a las variables y condiciones del Modelo de Monod, así teniendo en cuenta los parámetros cinéticos que dependen de la concentración de sustrato consumido y producto producido, ya que la proporción de producción es pequeña a comparación de la proporción de consumo. Al analizar los datos se obtiene que la concentración de sustrato es consumida casi en su totalidad a un tiempo de 141.176 horas, tiempo en la cual existe una concentración de ácido giberélico de 0.535g/L, con una concentración final de biomasa de 5.816g/L, esto infiere que la célula utiliza la mayor

14

parte del sustrato (mayor porcentaje) a su mantenimiento celular que a la producción de ácido giberélico. Gráfica 3. Cinética de producción del ácido giberélico dependiente de la dextrosa y la biomasa.

Se observa en la gráfica No. 6 que la concentración de productos es proporcional a la biomasa generada, sin embargo los requerimientos de sustrato son muchos, infiriendo que un mayor porcentaje de sustrato consumido es utilizado para el mantenimiento celular y no a la producción de ácido giberélico.

FACTORES DE FORMA Existen diferentes características físicas e importantes, en cuanto a la selección y diseño del reactor adecuado se refiere, las cuales son conocidas como

15

factores de forma. Estos factores se desarrollan de acuerdo al método de fermentación o tipo de producción que se desea realizar, pues describen las dimensiones del reactor basado en las características que el proceso requiere cumplir para proveer las condiciones óptimas para el cultivo. Para el caso de la producción del ácido giberélico (

GA 3 ), a través del hongo Gibberella

Fujikuroi se requiere utilizar un reactor cuyos factores de forma faciliten la generación del producto, mediante la fermentación sumergida, como es el caso del reactor Airlift. Los factores de forma del biorreactor son diseñados en base a una relación patrón del tipo de reactor que se desea diseñar (Airlift 1:3 o 1:6) entre el diámetro y la altura de este, partiendo de un volumen de operación establecido para el tanque modelado, que permita determinar el diámetro adecuado. Con lo cual a partir del diámetro y del esquema del reactor se calcularan los demás factores que darán estructura al tanque piloto (L. T. Harry, 2006).

SISTEMA DE AIREACIÓN El sistema de aireación en este tipo de reactor es una de sus principales características, debido a que tanto su sistema de aireación como el de agitación son generados mediante el suministro de gas en un difusor o distribuidor el cual ocasiona la formación de burbujas en el fluido o medio de cultivo generando un esfuerzo cortante mucho menor al de un impulsor, lo que lo convierte en un proceso que requiere menos energía que la agitación mecánica. Además de que al reducir el esfuerzo cortante se evita el daño celular por cizallamiento, sin embargo se deberá tener en cuenta que, la agitación deberá ser tan eficiente como para no dañar la célula y al mismo tiempo para proveer un mezclado y transferencia de masa adecuados (Martínez, 2007). La inyección de gas en este tanque, permite se realice la aireación del medio y facilita la fluidización de los sólidos presentes en el mismo, debido al constante movimiento del fluido inducido por la burbujas, por lo tanto cuando se presentan valores altos para el coeficiente de transferencia de oxigenación, la demanda alta de oxigeno se satisface eficientemente en este reactor, por el sistema de aireación. Otro factor a considerar es que, el diseño del equipo y el flujo del líquido, ocasionan que el calor sea distribuido rápida y uniformemente ya que como se mencionó anteriormente la relación altura diámetro es de 1:3 lo que lo convierte en un reactor angosto en donde, la turbulencia del líquido será mayor y como consecuencia la transferencia de calor y de masa serán por ende mayores (Martínez, 2007) Al igual que el proceso de aireación y agitación el mezclado forma parte importante de este sistema, para el caso del reactor Airlift esta operación se

16

lleva de manera adecuada debido a que los nutrientes, células y productos se distribuyen uniformemente en el fluido. Ocasiona también efectos sobre la forma y funcionalidad de las células provocando cambios en la transferencia de masa (nutrientes, metabolitos), tomando en cuenta nuevamente que la fuerza de mezclado deberá ser óptima para evitar el daños en las células involucradas y que el metabolito de interés se produzca (Gurrola, 2007)

TRANSFERENCIA DE MASA La transferencia de masa en el reactor es de vital importancia debido a que de esta depende la alimentación de oxígeno, CO2 y partículas sólidas del medio hacia el interior de la célula a través de una ruta o etapas de transferencia masa. Para esto cabe resaltar que durante a nivel industria los reactores trabajan a niveles altos de turbulencia en el fluido por lo que el transporte conectivo es predominante en el seno del líquido ignorando así la resistencia asociada. Aunado a esto se debe tener en cuenta que para que las burbujas suministradas permanezcan siempre retenidas en el seno del líquido y se efectué la transferencia de masa adecuada, el oxígeno que se bombea al interior del tanque deberá ser suministrado de manera continua debido a que mientras mayor sea el tiempo de retención de las burbujas en el seno del líquido mayor será la transferencia de masa (Chisti, 2005)

ETAPAS DE LA TRANSFERENCIA DE MASA 1.- Transferencia del sustrato de acuerdo a la fase gaseosa, liquida, o solida a la interface liquida acuosa (por difusión). 2.- Transporte mediante una capa delgada de la fase acuosa, la cual rodea a la burbuja de gas, líquido o partícula solida (difusión y convección). 3.- Transporte a través del seno del líquido por convección (turbulencia) hacia una capa delgada que cubre al microorganismo a alguna partícula donde se encuentre el microorganismo (pueden ser pellets, aglomerados o soportes inmovilización). 4.- Transporte por difusión a través de la capa de fase acuosa hacia la superficie celular 5.- Transporte del exterior de la membrana celular hacia el interior de la célula donde se efectúa la reacción (Nielsen, 2003)

17

Figura 2. Etapas de transporte de masa hacia el interior de la célula

Los fenómenos de transferencia de masa que ocurren durante el crecimiento de microorganismos en medio líquido, implican disolución de nutrientes, transferencia de productos y uno de los más importantes corresponde a la transferencia de oxígeno. La transferencia de masa en los reactores Airlift con amplia variación y contradicción debido a que los reactores y los procedimientos experimentales son diferentes. Tradicionalmente el método para mejorar la transferencia de oxígeno se basa en el incremento de la velocidad de aireación, con el fin de producir un régimen de turbulencia que además de mejorar el mezclado, incremente la velocidad de transferencia de masa gas-líquido, disminuyendo la viscosidad que afecta los efectos de coalescencia en la fase gaseosa que reducen el área de contacto.

18

Figura 3. Representativa de un Biorreactor Airlift

DESCRIPCION DEL BIORREACTOR AIRLIFT Este tipo de reactor es también identificado como biorreactor de elevación con aire o en rizo (Scriban, 1985). Están comprendidas en 4 zonas distintas, cada una de ellas tiene su propio patrón de flujo, este a su vez consiste en dos secciones interconectadas principalmente por bafle o tubo de draft. Una región es asperjada con gas y es llamada ascendente o riser, donde la dispersión del gas en el líquido se da generalmente en dos fases en dirección paralela. Esta sección retiene la concentración de gas más alta en el reactor y es en esta sección donde ocurre la mayor parte del fenómeno de transferencia de oxígeno.

19

Figura 4. Estructura interna de un biorreactor tipo Airlift. El líquido que ingresa al domo de la columna entra en una zona de liberación de oxigeno (zona II), que es un separador gas-liquido donde la gran mayoría del oxígeno dispersado es eliminado. El líquido libre de gas fluye hacia la segunda sección que se le conoce como descendente o downcomer y viaja hacia el fondo de la columna (zona IV) completando así el ciclo y reingresando a la zona de ascenso (Scragg, 2001).

Figura 5. Zonas de un

biorreactor airlift.

La cantidad de aire necesaria para la reacción biológica es suficiente para actuar como la única fuente de movimiento del líquido (Scragg, 2001). Las características del funcionamiento de los biorreactores Airlift dependen principalmente de la velocidad de inyección del gas y la velocidad de recirculación del líquido (Chisti y Moo, 2002). En este tipo de reactores, se recomienda el uso de bafles para conseguir la separación de las dos zonas. Debe quedar completamente sellado a las paredes del reactor de manera que no haya forma de paso del líquido o del medio de la sección riser a la downcomer a excepción de la recirculación. En la siguiente tabla, se mencionan algunas características generales del biorreactor tipo Airlift (Gutiérrez, 2011). Tabla 3. Características del biorreactor Airlift CARACTERISTICA

B. AIRLIFT

RELACION ALTURA/DIAMETRO

Entre 3 y 7

AGITACION

Neumática

20

FACTORES QUE INFLUYEN EN EL FUNCIONAMIENTO

Velocidades de inyección del gas y de circulación del líquido.

VENTAJA

Altamente eficiente en energía

DESVENTAJAS

KLa relativamente bajos aunque superiores a la columna de burbujeo

USOS

Cultivo de células bacterianas y levaduras, fermentaciones con hongos, cultivo de células animales y vegetales, tratamiento de aguas residuales.

Entre otras propiedades, las ventajas principales de los biorreactores airlift con respecto a las columnas de burbujas son:    

Mayor capacidad de transferencia de masa. Mayor velocidad superficial de líquido y gas. Riesgo de contaminación bajo debido a su sellado hermético, su orientación vertical facilita su limpieza y esterilización. Control en las condiciones de cultivo.

SIMULACIÓN DE CULTIVO CONTINUO El cultivo continuo es un sistema abierto con volumen constante, al que continuamente se añade medio fresco de un reservorio y del que se retira medio usado que contiene microorganismos y sustancias de desecho a una velocidad constante, siendo estas el ácido giberélico. Por lo tanto, el medio se renueva y su composición no cambia a lo largo del tiempo, lo que permite mantener el crecimiento de la población de forma indefinida, una vez alcanzado el estado de equilibrio. Tabla 4 Se observan los datos a partir de una simulación de cultivo continuo.

21

Donde la columna cero es la variación de volumen, 1 es la biomasa, 2 es el producto y 3 es sustrato.

Gráfica 4. Cinética de producción de ácido giberélico a partir de dextrosa y biomasa producida para un cultivo continúo.

Podemos observar en el gráfico No. 7 como al mantener constante el flujo de sustrato, compuesto por la fuente de nitrógeno NH 4C y la fuente de carbono dextrosa, existe una dilución del producto, es decir una dilución de ácido giberélico producido por el hongo Gibberella Fujikuroi, el cual se ve

representado en la tabla 4 con valores negativos, estos valores negativos se producen debido a las cantidades mínimas producidas de ácido giberélico y las grandes cantidades de sustrato suministradas al cultivo continuo del biorreactor Airlift, así como la dilución hecha a la biomasa antes de llegar al equilibrio.

Tabla 5. Datos obtenidos de la simulación de cultivo continuo para la producción de ácido giberélico.

22

Gráfico 5. Representación de las cantidades de biomasa, producto y sustrato para un cultivo El gráfico No. 8 muestra el volumen de operación que permanece constante, continuo en un bioreactor Airlift sin embargo se observa que existe una disminución de biomasa producida por la dilución de la misma hasta un tiempo aproximado de 25 horas, tiempo en el cual se llega a un equilibrio entre la biomasa contenida en el biorreactor, la

23

dilución provocada por el flujo continuo del medio de cultivo, así como la producción del ácido giberélico. El cultivo entra en fase de mantención, período en que ocurre gran parte de la síntesis de ácido giberélico. Como factores dependientes de la producción se encuentran la humedad, tiempo de auto clavado, pH, perfiles de alimentación fed-batch, además de los sustratos. La biomasa total aumentará aun cuando no existe urea disponible en el medio. Esto indicará que el hongo Gibberella

Fujikuroi acumularía parte del nitrógeno proveniente de la urea, para luego, bajo condiciones de limitación externa, proceder a su consumo. Esto indicaría que producciones más importantes de ácido giberélico se obtienen con tiempos de cultivo más largos.

DIMENSIONAMIENTO DEL BIORREACTOR Gran parte de la información que se relaciona con la construcción de biorreactores tipo Airlift tienen origen empírico de tal manera que se han recomendado varias relaciones geométricas que pueden optimizar el tiempo de mezclado y la transferencia de masa en el fermentador (Gutiérrez, 2011). Especificaciones del equipo. Para el diseño del biorreactor Airlift se tomaron las siguientes consideraciones:  





 

Para facilitar el armado del equipo se propuso diseñarlo en tres partes: tapa, cuerpo y base, siendo un biorreactor tipo Airlift de circuito interno. El equipo será construido de vidrio, ya que brinda superficies lisas, no es tóxico, su coeficiente de transferencia de calor es poco (1.6 W/°C), además de su fácil limpieza. Las dimensiones se determinaron tomando en cuenta que la relación altura/diámetro debía ser 1:3, considerando un volumen total del tanque de 7 litros. El diseño de la tapa consta de cuatro entradas, dos con tapones de rosca que puedan servir para colocar electrodos medidores de oxígeno disuelto y pH, otros dos sin tapa en los que puedan introducirse termómetros o sirvan como entrada de líquidos. Se colocarán cuatro llaves de entrada o salida en el cuerpo, para que se pueda trabajar con volúmenes distintos o con cultivos semicontinuos. La unión entre las partes del biorreactores se llevará acabo empleando cuatro bridas de acrílico, empaques de neopreno, tornillos y tuercas para ajustarlas.

Diseño preliminar del equipo. En las siguientes figuras 6, 7 y 8 se muestran los esquemas de diseño del biorreactor con las dimensiones principales de las distintas partes y accesorios. El diseño final consta de un diámetro externo de

24

13 cm, diámetro del tubo interno de 7.54 cm, así como una longitud del biorreactor de 40 cm, con longitud del tubo interno de 30.8 cm. En la configuración diámetro (D2/D1) y longitud (L2/L1) se aprecían mayores ReL en la zona de descenso del biorreactor lo cual es relevante pues esta zona opera con Re no turbulentos. En el ascenso Re L son mayores. Se seleccionó esta configuración debido a la presencia de un Re que se mantiene alrededor de 1000 y es turbulento por definición para estos sistemas. Tabla 6. Se observan los valores de los diámetros de ambos cilindros (interno y externo) para un biorreactor tipo Airlift de circuito interno. Factores de forma D1 D2 L1 L2

Dimensión(m) 13 7.54 40 30.8

25

Figura 6. Biorreactor Airlift de circuito interno. Se observan las tres partes que conforman el biorreactor: tapa, cuerpo y base, así como sus respectivas dimensiones.

26

Figura 7. Vista frontal y superior de la tapa del biorreactor.

27

Figura 8. Base del biorreactor con el difusor de placa filtrante

TRANSFERENCIA DE OXIGENO La transferencia de oxigeno es el fenómeno en el cual este es transportado de una fase a otra, principalmente de una fase gaseosa a una liquida. (Scriban, 1985). Esta molécula es poco soluble en medio acuoso. El transporte del mismo de la fase gaseosa hacia las células debe permitir el mantenimiento de una concentración adecuada de oxígeno disuelto de manera que el crecimiento microbiano no se vea limitado (Nielsen, 2003). La demanda de oxígeno en un proceso fermentativo depende en gran parte de la concentración de biomasa y la actividad respiratoria que se relaciona con la velocidad de crecimiento. La transferencia se puede ver afectada por la temperatura, ya que cuando se tiene una temperatura baja, la solubilidad del oxígeno disminuye, intensidad de mezclado que puede afectar la viscosidad del medio. La transferencia de oxigeno de la fase gaseosa hacia el microorganismo a través de las burbujas como punto de partida de aire suministrado. El proceso ocurre en 8 pasos (Bailey, 1986): 1. Difusión desde el seno o núcleo del gas a la interfase gas-liquido. 2. Movimiento a través de la interfase gas-liquido.

28

3. Difusión del soluto a través de la región estancada adyacente a la burbuja. 4. Transporte del soluto a través del seno del fluido líquido. 5. Movimiento a través de la segunda región estancada asociada con la célula. 6. Transporte difusivo hacia el interior de la célula. 7. Si las células están en un floculo, agregado o partícula sólida, difusión a través del solido hasta la célula individual. 8. Transporte a través del citoplasma hasta el lugar de reacción. Figura 9. Esquema del transporte de oxigeno de la fase gaseosa al interior del microorganismo (Bailey, 1986)

DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA DE AGITACIÓN, CONDICIONES DE OPERACIÓN, REOLOGÍA Y POTENCIA DEL MOTOR. El Airlift tiene un tubo de aspersión dentro del tubo, lo cual mejora la circulación de transferencia del oxígeno e iguala la fuerza de corte en el reactor. Este tipo de biorreactor no tienen ninguna agitación mecánica, es un biorreactor neumático, la turbulencia producida por el flujo del fluido asegura un mezclado adecuado en el líquido, es ideal para cultivos aerobios ya que el coeficiente de transferencia de masa de oxigeno es alto en comparación con los reactores de tanque agitado (Chisti, 1989).

29

El Airlift se construye usando compartimientos ascendentes y descendentes separados, esta conectados por conductos horizontales en la parte superior e inferior el tubo ascendente y descendente se localizan en el mismo recipiente, estos son separados por un bafle de división o un tubo de aspersión concéntricos (Chisti, 1989). Los sistemas externos soportan velocidades mayores de circulación de líquido. La entrada de energía especifica está entre 2 a 3 kW/m3 y los esfuerzos de corte son bajos de 0.11 kW/m3. Los Airlift no tienen puntos de disparo de energía, los esfuerzos de corte son homogéneos y no provocan estrés en las células (Chisti, 1989). Los Airlift son ideales para cultivos aerobios refiriéndose al coeficiente de transferencia de masa del oxígeno.La ventaja de usar Airlift es tener un menor riesgo de que exista contaminación y que hay un control más cercano en la estabilidad genética de los organismos. La reología del caldo utilizado cambia usualmente. Gran cantidad de cultivos empiezan siendo newtoniano pero se transforman en ocasiones en no newtonianos. Las causas que provocan estos cambios de reología en los caldos de fermentación son debido a variaciones de algunas propiedades como (Chisti, 1989):      

Concentración celular. Concentración del producto. Concentración del sustrato. Flexibilidad y deformabilidad de las células. Morfología celular. Velocidad de ciza.

Sin embargo para simplificación de cálculos, se considera la mayoría de los caldos que permanecen constantemente con una viscosidad de tipo newtoniano. En los reactores con agitación neumáticos, se puede determinar la potencia ya sea por expansión isotérmica del gas o por la energía cinética del gas insertado (Chisti, 1989). En este caso se determinara la potencia mediante el uso de expansión isotérmica del gas que se mueve a través del reactor mediante la fórmula:

PG =ρL g uG LV

30

De acuerdo don Chisti, 1989, lo valores que ajustan al modelo pueden ser los siguientes: Sabiendo:

PG

Potencia tiempo

VL=0.054 m3 (Chisti, 1989) ρL=887 kg/m3 uG=0.3 m/s Por lo cual la potencia necesaria para el difusor se determina de la siguiente manera:

PG=VLρLguG PG=(0.054m3)(887kg/m3)(9.81m/s2)(0.3m/s) PG=140.9638 Watt = 0.189035 HP Para determinar el flujo se obtuvo el vvm al que crece de mejor manera para la producción de penicilina el cual oscila entre 0.5 y 1 vvm, dependiendo de la cepa (Chisti, 1989). Para términos prácticos se utilizó el promedio de 0.75 vvm. Por lo cual el flujo es de:

F vvm= V L 60 min 3 3 3 3 F=(0.75 maire /mmedio∗min ¿( 0.0056 mmedio )( 1h )=0.252 m /h Se calcula el area de la seccion transversal del riser A i=π r i

A i=π

(

2

2

0.0754 m =4.4651∗10−3 m 2 2

)

Conociendo el area y el flujo del gas se sustituye en la ecuacion:

31

U GR=

flujo gas Areatransversal 3

m 0.252 h m m U GR= =56.437 =0.01567 −3 2 h s 4.4651∗10 m

Ese valor de flujo se utilizó para determinar la simulación del proyecto, el cual se realizó de forma de operación tipo lote alimentado (fed-batch). (revisar archivo adjunto de Mathcad apéndice C).

DESCRIPCIÓN DEL MECANISMO DE TRANSFERENCIA DE MASA EN EL REACTOR El proceso de transferencia de masa en un biorreactor del tipo airlift es de suma importancia, pues además de estar introduciendo la cantidad suficiente de oxigeno para que se lleve a cabo el bioproceso también participa en el mecanismo de mezclado del biorreactor. Debido a esto el tamaño de burbuja introducido por el difusor debe ser el adecuado, pues e debe considerar el esfuerzo de corte que se genera en la célula debido al aire introducido. En un airlift la transferencia de masa se genera por una circulación fluida de líquido con aire (burbujas) que asciende el compartimiento interno y luego desciende por el compartimiento externo, favoreciendo también el mezclado perfecto. Un valor que permite conocer la cantidad de oxigeno disuelta en el medio de cultivo en el reactor es el K La que es el coeficiente de transferencia de masa de oxigeno. Los valores de este coeficiente depende principalmente de la velocidad con la que se esté agitando el medio y el tiempo, la velocidad está siendo introducido el oxigeno, el diseño del biorreactor, así como la reología del medio de cultivo. En general, disminuyen el K La: la viscosidad y el volumen del líquido y aumentan el K La: el área de transferencia, la agitación y la presencia de dispositivos que aumenten una, la otra, o ambas. (Eibl & Eibl, 2009) Existen diferentes métodos para estimar el KLa de manera experimental como los son (García, Ochoa, 2009) :

32

   

Métodos químicos. Método de la oxidación de sulfito de sodio. Absorción de CO2. Método dinámico.

El uso de correlaciones es un método que estima este valor de manera empírica, permitiendo así calcular los posibles valores de K La para el reactor a utilizar y asi realizar los ajustes necesarios en el diseño del proceso. Para un biorreactor airlift external-loop la correlación se basa en la velocidad que tarda en subir y bajar por el brazo externo del biorreactor, asícomo en la

AD relación que existe entre los diámetros de ambas secciones ( A G ¿ .

Utilizada

es la siguiente (García, Ochoa, 2009):

AD c d e ¿ V IR φ Ag k L a=C V as µba ¿

1+

Donde: C[=] Constante empírica. Vs[=] Velocidad superficial del gas (m s-1). VIR[=] Velocidad promedio del liquido en circulación (m s -1). µa[=] Viscosidad aparente. AD[=] Área transversal de la sección down-comer del reactor (m 2). Ag[=] Área transversal de la columna (m2). ɸ[=] Retención del gas en el reactor. Para las clásicas columnas de burbujas y usando agua pura se determinaron los valores de la contante C y el exponente a de 0.47 y 0.82 respectivamente. En una solución salina se propusieron los valores para C entre 0.12 y 9.5 y el exponente a con valores de 0.72-1.28. Para fluidos no newtonianos se introduce el término de la viscosidad aparente en la ecuación con el exponente b que puede tomar un valor de -0.8 a -1. Existen otros parametros establecidos de acuerdo a ciertas literaturas, de acuerdo con la siguiente figura.

33

Figura 10. Valor de los exponentes de la correlación para K La en un biorreactor airlift external-loop. Para introducir el aire al rector se utilizará un difusor de membrana de burbuja fina, ya que la burbuja generada por estos equipos tiene un diámetro de aproximadamente 10 mm. Ya que se ha demostrado que las burbujas pequeñas (