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Bioquímica

PRACTICA Nº 2

PROTEINAS RELACION DE EXPERIMENTOS 1. Desnaturalización de proteínas y actividad biológica 2. Identificación de la presencia de proteínas en la orina 3. Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo 4. Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo

INTRODUCCIÓN La concentración de hidrogeniones en el medio en que se encuentra disuelta una proteína, determina importantes variaciones en la carga eléctrica de la misma. En general una proteína se carga positivamente cuando se encuentra disuelta en un medio de pH inferior al de su punto isoeléctrico (pI), en tanto que se carga negativamente cuando el pH del medio en que encuentra es superior al valor de su pI. El punto isoeléctrico de las proteínas con un alto contenido en aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina), es alto, como el caso del citocromo c, que tiene un valor de pI de 10,7. Cuando una proteína tiene un alto contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y glutámico), tendrán un pI bajo, como el caso de la pepsina que tiene un pI cercano a 1. En general la mayor parte de las proteínas globulares tiene un pI que varia entre 5,0 y 9,0.

Cuando la proteína esta en un medio de pH que coincide con su valor de pI, no solo es incapaz de migrar en un campo eléctrico sino que su solubilidad llega al mínimo, incluso algunas llegan a precipitar.

La determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo es una determinación de laboratorio muy utilizada en clínica. Es la cuantificación se suele hacer por diversos métodos, sin embargo, aquellos que utilizan ciertas reacciones de color, que dan las proteínas, son los más difundidos. Uno de ellos es el que utiliza la reacción de Biuret.

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Desde hace mucho tiempo se conoce que al calentar la urea hasta 180°C, se descompone para rendir amoniaco y un compuesto denominado biuret. Este último en presencia de iones cúpricos y en medio alcalino, rinde una coloración violeta. No solamente el biuret es capaz de dar esta reacción, otras sustancias que tienen dos radicales CONH2 o CH2NH2, también pueden hacerlo; incluso estos radicales están unidos mediante átomos de carbono o de nitrógeno. De la misma manera, los péptidos con más de dos enlaces peptídicos dan positividad a esta reacción, que es comúnmente conocida como la reacción de Biuret.

Con aplicación de la reacción de Biuret se ha estandarizado un método para la determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo y que se utilizará en la presente práctica. Los valores normales para este método son de 6 a 8 g%. Por debajo de 6 g% se habla de hipoproteinemia y por encima de 8g% hablamos de hiperproteinemia.

A pesar de existir una concentración tan alta de proteínas en el suero, normalmente no se detectan proteína en la orina, explicable por la incapacidad de las proteínas (macromoléculas) de atravesar los poros de la membrana basal del glomérulo renal. Por esta razón el encontrar proteínas en cantidades demostrables en la orina de un paciente, es una situación de mucho cuidado desde el punto de vista médico.

Las proteínas pueden ser identificadas en la orina, de manera muy sencilla, al calentar una muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cuál es indicativo de la desnaturalización de las proteínas por el calor. Sin embargo debe tenerse en cuenta que los fosfatos también pueden enturbiar la orina; la distinción puede hacerse considerando que los fosfatos se vuelven solubles en medio ácido.

En muchos casos no resulta suficiente hacer la determinación de las proteínas del suero sanguíneo, sino que es también necesario establecer las concentraciones de las diferentes fracciones proteicas. En este sentido, se usa un

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procedimiento denominado electroforesis de las proteínas del suero, que nos permite aislar las diferentes fracciones y cuantificarlas.

El procedimiento de la electroforesis está basado en el procedimiento de las moléculas eléctricamente iónicas según el pH del medio, serán moléculas susceptibles de ser separadas por electroforesis. La velocidad de migración de estas macromoléculas dependerá de la intensidad de su carga eléctrica, su tamaño y forma, la naturaleza del soporte sobre el cuál migran, la fuerza iónica del medio, la temperatura, etc. Se entiende que este procedimiento también será de utilidad para la separación de las proteínas de otros líquidos biológicos , como liquido cefalorraquídeo, liquido amniótico, orina, etc.

La electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo, como comúnmente se realiza, determina la separación de 5 fracciones proteicas, que ordenadas en función de su velocidad de migración, son las siguientes: albúmina, alfa 1 globulina, alfa2 globulina, beta globulina y gamma globulina. La albúmina es la más homogénea, no contiene lípidos, su peso molecular es de 69,000; su PI es aproximadamente 4,9 y es la de mayor velocidad de migración. Tiene como función importante su participación en

el equilibrio hídrico

y además el

transporte de una serie de sustancias como la bilirrubina, los ácidos grasos, etc La albúmina también se une a drogas que son poco solubles en el agua, como barbitúricos, digitálicos, aspirina, etc. Normalmente, el 50% del calcio plasmático está unido a la albúmina y esto debe tomarse muy en cuenta para explicar las manifestaciones de hipocalcemia asociadas a las situaciones en las cuales disminuye la concentración de albúmina plasmática.

Las alfa globulinas incluye dos fracciones electroforéticas, las alfa 1 PI (5.1) y las alfa 2 (5.5 – 5.8). Las principales alfa 1 globulinas, son la proteína C reactiva y las lipoproteínas de alta densidad (HDL): en tanto que las alfa 2 globulinas son la haptoglobina, ceruloplasmina y protrombina. La beta globulina (PI 5.4 – 6.3) incluye la proteína transportadora de fierro (transferrina) y a las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Las gamma globulinas (PI 6.3 – 7.3), contiene las diferentes

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inmunoglobulinas, como la inmunoglobulina G (Ig G) que corresponde al 80%, la inmunoglobulina A (Ig A) que representa un 13% y a otras inmunoglobulinas, que se encuentran en menor concentración (Inmunoglobulinas M, D, E, etc.).

La técnica más comúnmente usada para la separación de las proteínas del suero sanguíneo por electroforesis consiste en depositar unos microlitros de suero en una tira de papel filtro humedecida con buffer barbital pH 8.6 . Los extremos de la tira luego son introducidos en dos recipientes que contienen el mismo tampón y que están en contacto con los electrodos. En vista que el PI de todas las fracciones, es menor que el pH del tampón, se cargarán negativamente y por lo tanto migrarán al polo positivo. Como quiera que la intensidad de carga de las diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamaño, migrarán a diferente velocidad. Esto quiere decir que una vez desconectado el aparato de la fuente eléctrica, quedarán separadas las fracciones y será posible su identificación si las teñimos con un colorante específico para proteínas (como el amido black). La cuantificación de cada fracción se hará en función de la intensidad de color que tiene cada banda y que puede hacerse por diversos métodos, como con el uso de un aparato llamado densitómetro que nos grafica un pico para cada fracción y cuya area es proporcional a su intensidad de color.

La tabla siguiente muestra los valores que podemos considerar como normales tanto en valores absolutos (g%) como en valores relativos (porcentaje).

TABLA 1: VALORES NORMALES PARA LAS DIFERENTES FRACCIONES PROTEICAS DEL SUERO SANGUINEO SEPARADAS POR ELECTROFORESIS AL PAPEL Albúmina PORCENTAJE 50 - 58

Alfa 1 Alfa 2 Beta globulina globulina globulina 4-7 7 -11 11 - 15

Gamma Globulina 14 – 22

gr POR 100 ml DE SUERO

3,24 – 4,42 0,36 – 0,48 0,54 – 0,72 0,78 – 1,04 0,80 - 160

En la tabla 2 se muestran las variaciones en la concentración de las

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diferentes fracciones electroforéticas de las proteínas del suero sanguíneo en algunas enfermedades en donde este método es de gran ayuda en su diagnóstico.

TABLA 2. VARIACION DE LAS FRACCIONES DEL ELECTROFORETOGRAMA DE LAS PROTEINAS SÉRICAS EN ALGUNAS ENFERMEDADES. ENFERMEDAD P.T. Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma Infecciones agudas

N

N

A(+)

Endocarditis bacteriana

N

N

A(++)

Plasmocitoma beta

N

N

Artritis reumatoide

N

D(+)

Hipogammaglobulinemia

NöD

Mieloma múltiple

A

Síndrome nefrótico

D(+) D(++)

Desnutrición

D(+) D(+)

Cirrosis hepática

D(+) D(+)

A(++) A(+) N

A(++) D(++)

N

A(+++) A(+)

A(+)

Rietmann y Daniels señalan que la electroforesis de las proteínas séricas (“serum protein electrophoresis” SPE), junto con la determinación de las proteínas séricas totales debe ser considerado como un procedimiento rutinario para cualquier paciente, como ayuda en el diagnóstico y en el control de la enfermedad que tiene.

EXPERIMENTO 1 DESNATURALIZACION DE PROTEINAS Y ACTIVIDAD BIOLOGICA

Objetivos 1. Verificar como la desnaturalización de la proteína determina la perdida de su actividad biológica 2. Verificar la acción de varios agentes desnaturalizantes Método Estudio de la actividad de la catalasa de los hematíes en presencia de

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diversos agentes desnaturalizantes

Procedimiento 1. Rotular 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y medir respectivamente, 0,1 ml de sangre diluida (dos gotas de sangre en 100 ml de agua destilada), 0,1 ml de sangre diluida hervida, sangre diluida en presencia de Urea 8 M y sangre diluida en SDS al 3 % (0,1 ml) 2. Medir en cada tubo 5 ml de peróxido de hidrogeno 0,05 M y mezclar 3. Con ayuda de una varilla de vidrio depositar en el fondo de cada tubo un circulo de papel filtro y tomar el tiempo que tarda en cada tubo para subir hasta la superficie

Resultados

Complete la siguiente tabla En solución Desnaturalización En presencia En presencia acuosa por calor de Urea 8 M de SDS

Catalasa Tiempo

de

flotación Actividad enzimática (+)

INTERROGANTES 1.- Junto al nombre de cada agente desnaturalizante describa su mecanismo de acción a) Urea 8 M _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

b) SDS : _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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c) DTT : _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

2.- Escriba la reacción química catalizada por la catalasa

_______________________________________________________________

_______________________________________________________________

3.- Es la catalasa una proteína simple o conjugada?. Fundamente su respuesta _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

4.- Con qué experimento(s) podría demostrar que la desnaturalización no afecta la estructura primaria de la proteína _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

5.- Que importancia podría tener en clínica la búsqueda de actividad catalasica en la orina _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

6.- Una proteína desnaturalizada puede variar su movilidad electroforética ¿Por qué? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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EXPERIMENTO 2 IDENTIFICACION DE LA PRESENCIA DE PROTEINA EN LA ORINA.

Objetivo Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de proteínas en la orina

Método Coagulación de las proteínas por el calor

Procedimiento 1.- Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición. Observar lo que sucede 2.- En caso observe enturbiamiento, añada alguna gotas de solución de ácido acético al 2%. Apreciar si la turbidez persiste o desaparece 3.- Haga el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le serán proporcionadas. Resultados 1.- Llene el espacio en blanco escribiendo + cuando hay turbidez y – cuando no la hay o cuando desaparece la turbidez ORINA X

ORINA Y

ORINA Z

Calentando la muestra Añadiendo ácido acético

DIAGNOSTICO:

Orina X ______________________________ Orina Y ______________________________ Orina Z ______________________________

INTERROGANTES 1.- Puede una proteína coagulada dar la reacción de biuret. Fundamente su respuesta _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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2.- Que puede decir de un líquido biológico que al ser calentado se pone turbio y con el añadido de unas gotas de limón desaparece su turbidez _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

EXPERIMENTO 3 DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos Mediante el uso de la reacción de Biuret y la aplicación del método de fotocolorimetrias hacer la determinación cuantitativa de las proteínas de una muestra biológica (suero sanguíneo).

Método Determinación de las proteínas totales del suero por el método de biuret

Procedimiento 1. A 0,1 ml de suero sanguíneo añadir 1,9 ml de agua destilada y mezclar 2. Medir 1 ml de la solución anterior en un tubo de ensayo y añadir 4 ml del reactivo de biuret. Mezclar 3. Dejar en reposo 30 minutos y medir la absorbancia en el fotocolorímetro utilizando filtro verde 4. Preparar al mismo tiempo un blanco, que llevará 1 ml de agua destilada en lugar del suero diluido 5. Durante el desarrollo de este experimento se proporcionará la lectura del estándar, que se preparará en la misma forma que la muestra, solo que en lugar de suero sanguíneo se usará una solución de proteínas, de concentración 7 gr%.

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Resultados

Llenar los espacios en blanco : Lectura bruta

Lectura neta

Tubo Muestra ( M )

___________

__________

Tubo Blanco ( B )

___________

___________

Tubo Estándar ( St )

__________

___________

FACTOR DE CALIBRACION: __________________

Concentración de proteína de la muestra en el volumen del suero usado: _____en g por 100 ml de suero

INTERROGANTES

1. Se puede hacer la determinación fotométrica de la concentración proteica, sin utilizar una reacción de color ?. Fundamente su respuesta _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

2. Cuál es el objeto de preparar el blanco? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

3. Porqué se utilizó el filtro verde del fotocolorímetro para medir la absorbancia de la solución en el experimento 1? _______________________________________________________________

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EXPERIMENTO 4 ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos 1.- Reconocer las diferentes fracciones proteicas que aparecen luego de realizada la electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo 2.-

Identificar

las

alteraciones

cualitativas

y

cuantitativas

en

el

electroforetograma y proponer un diagnostico en los casos de alteración.

Método Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo en un medio de pH 8,6 y usando como soporte papel filtro

Procedimiento 1.- En la figura adjunta se presentan seis electroforetogramas con sus valores de proteínas totales, así como también los valores para cada fracción. El primero (A) corresponde a una persona normal y los siguientes (B, C, D, E y F) a pacientes.

2.- Utilizando la Tabla 2 proceda a hacer el diagnostico para cada uno de ellos

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Nombre Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma TOTAL

% 58.1 2.9 9.8 13.8 15.4 100

Prot. g% V.N.(%) 4.13 52.0 - 68.0 0.15 2.0 - 4.0 0.52 7.0 - 11.2 0.74 10.0 - 15.8 0.83 11.0 - 18.0 6.4

Nombre Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma TOTAL

% 26.5 2.7 42.4 16.1 12.3 100

Prot. g% V.N.(%) 0.66 52.0 - 68.0 0.06 2.0 - 4.0 1.06 7.0 - 11.2 0.40 10.0 - 15.8 0.30 11.0 - 18.0 2.5

Nombre Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma TOTAL

% 28.8 2.7 7.3 10.4 50.8 100

Prot. g% V.N.(%) 2.90 52.0 - 68.0 0.27 2.0 - 4.0 0.73 7.0 - 11.2 1.05 10.0 - 15.8 5.13 11.0 - 18.0 10.1

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Nombre Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma TOTAL

Nombre Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma TOTAL

Nombre Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma TOTAL

% 40.2 5.2 7.8 12.0 34.8 100

% 50.1 10.2 11.2 14.8 13.7 100

% 46.6 5.3 13.6 17.5 17.0 100

Prot. g% 3.01 0.39 0.58 0.90 2.61 7.5

V.N.(%) 52.0 - 68.0 2.0 - 4.0 7.0 - 11.2 10.0 - 15.8 11.0 - 18.0

Prot. g% V.N.(%) 2.75 52.0 - 68.0 0.56 2.0 - 4.0 0.61 7.0 - 11.2 0.81 10.0 - 15.8 0.75 11.0 - 18.0 5.5

Prot. g% 4.19 0.47 1.22 1.57 1.53 9.0

V.N.(%) 52.0 - 68.0 2.0 - 4.0 7.0 - 11.2 10.0 - 15.8 11.0 - 18.0

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Resultados 1.- Llene la Tabla con las cifras obtenidas. PACIENTE

P.T.

Albúmin Alfa-1

Alfa-2

Beta

Gamma

a B

Valor en % Valor en g%

C

Valor en % Valor en g%

D

Valor en % Valor en g%

E

Valor en % Valor en g%

F

Valor en % Valor en g%

2.- El diagnostico probable es: Paciente B _______________________________________________ Paciente C _______________________________________________ Paciente D _______________________________________________ Paciente E _______________________________________________ Paciente F _______________________________________________

INTERROGANTES 1.- Como será el electroforetograma de las proteínas del plasma sanguíneo _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2.- Si en lugar de buffer de pH 8,6, se emplea otro de pH 3,8, que diferencias importantes esperaría encontrar en el electroforetograma _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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3.- Cuál sería la diferencia fundamental entre el procedimiento usado para la separación de las proteínas séricas y para la separación de las lipoproteínas séricas _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

4.- Un paciente con padecimiento renal crónico fue hospitalizado con edema generalizado y una proteinuria de 13 g/24hrs. Si las proteínas totales del suero fueron 4.74 g% y el porcentaje para las diferentes fracciones fue de 23.2%, 8.0 %, 31.1 %, 17.7% y 20.0 % para albúmina, alfa1, alfa2, beta y gamma, respectivamente, estimar la concentración absoluta de cada _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

5.- Se puede hacer electroforesis de una muestra de orina, de un paciente sospechoso de Proteinuria?. Fundamente su respuesta _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

6.- Que fracciones proteicas se presentan en una electroforesis de líquido cefalorraquídeo, cuáles serán las diferencias con el perfil del suero sanguíneo? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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