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• Javier Rodriguez Muñoz

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BIOPROCESOS AVANZADOS M.Sc. Ing. Joshelyn M. Paredes Zavala [email protected]

FUNDAMENTOS DE TECNOLOGÍAS MOLECULARES

La unidad de vida: La Célula La molécula de la vida: El DNA La unidad de la herencia: El Gen

La fuente de material genético: Los Cromosomas Replicación del DNA Transcripción y traducción del código genético

DNA Molécula de vida

Fundamental en el estudio de los Bioprocesos

Clonación e Ingeniería Genética

Manipulaciones esenciales en Bioprocesos

UNIDAD ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE TODA FORMA DE VIDA

Bacterias

Ser Humano

• 1 célula

• 75 trillones

 Comportamiento  Capacidad de degradación  Producción de enzimas

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE PROPORCIONA A LAS CÉLULAS INSTRUCCIONES PARA LA SÍNTESIS DE UNA PROTEINA ESPECÍFICA O UN TIPO PARTICULAR DE RNA

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Células somáticas

Gametos

MITOSIS

MEIOSIS

2 células hijas

Hasta 4 células hijas

23 pares de cromosomas

23 cromosomas

Diploide: 2n

Haploide: n

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

REPLICACIÓN DEL ADN • https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw

TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN • https://www.youtube.com/watch?v=8_f-8ISZ164

Si la secuencia de una cadena de una molécula de DNA es 5'-AGCTCTACGGCTGCTATTC-3‘ ¿cuál es la secuencia de la cadena complementaria?

Considera la siguiente secuencia de mRNA: 5'AGCACCAUGCCCCGAACCUCAAAGUGAAACAAAAA3'.

¿Cuántos codones están incluidos en este mRNA? ¿Cuántos aminoácidos son codificados por esta secuencia?

Si la secuencia de una cadena de una molécula de DNA es 5'-AGCTCTACGGCTGCTATTC-3‘ 3’-TCGAGATGCCGACGATAAG-5’ ¿cuál es la secuencia de la cadena complementaria?

Considera la siguiente secuencia de mRNA: 5'AGCACCAUGCCCCGAACCUCAAAGUGAAACAAAAA-3'. Met-Pro-Arg-Tre-Ser-Lis-Parada

¿Cuántos codones están incluidos en este mRNA? ¿Cuántos aminoácidos son codificados por esta secuencia? 7/5

Considera la siguiente secuencia de DNA: 5‘-TTTATGGGTTGGCCCGGGTCATGATT-3' 3'-AAATACCCAACCGGGCCCAGTACTAA-5

Transcribe cada una de estas secuencias a mRNA.

¿Qué secuencia de DNA (superior o inferior) produce un mRNA funcional que contiene un codón de inicio?

¿Cuál es la secuencia de aminoácidos del polipéptido producido a partir de este mRNA?

Considera la siguiente secuencia de DNA: 5‘-TTTATGGGTTGGCCCGGGTCATGATT-3‘ 3’-AAAUACCCAACCGGGCCCAGUACUAA-5’ 3'-AAATACCCAACCGGGCCCAGTACTAA-5 5’-UUUAUGGGUUGGCCCGGGUCAUGAUU-3’

Transcribe cada una de estas secuencias a mRNA.

¿Qué secuencia de DNA (superior o inferior) produce un mRNA funcional que contiene un codón de inicio?

¿Cuál es la secuencia de aminoácidos del polipéptido producido a partir de este mRNA? Met-Lys-Trp-Pro-GlySer-Par

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

Enzimas de Restricción Plásmidos de DNA Transformación

Selección Características y tipo de vectores Aplicaciones

60’s: Especulación: Cortar y Pegar

70’s: Realidad: Descubrimiento de Enzimas de Restricción y Plásmidos de DNA

CLON

Molécula, célula u organismo que ha sido producido a partir de otra entidad única

Tecnología del DNA recombinante

Clonación de Genes

Ingeniería Genética

Endonucleasas de restricción

Rompen el enlace fosfodiester que une nucleótidos adyacentes Secuencias de reconocimiento o posición de restricción. Cortan usualmente de 4 a 6 pb. Algunas cortan 8 pb. Secuencias de reconocimiento: palíndromos. Extremos cohesivos (sobresalientes) y extremos romos (no sobresalientes).

Fuente: Thieman & Palladino 2010

Fuente: Thieman & Palladino 2010

Fuente: Thieman & Palladino 2010

Forma circular de DNA autorreplicante DNA extracromosómico (citoplasma bacteriano) Tamaño pequeño: 1000 – 4000 pb Replicación independiente del cromosoma bacteriano Vehículo para la inserción y clonación del DNA Primer vector plásmido para clonación: pSC101

Fuente: Thieman & Palladino 2010

Fuente: Thieman & Palladino 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Proceso de inserción de DNA foráneo en bacterias

Tratamiento de células bacterianas con soluciones de cloruro cálcico Añade DNA de plásmido a células puestas a enfriar en hielo Calentamiento breve de la mezcla de células y DNA Plásmido de DNA ingresa a las células bacterianas, se replican y expresan sus genes Electroporación: pulso breve de electricidad de alto voltaje para hacer agujeros minúsculos en la pared celular bacteriana para el ingreso de DNA

Selección a favor

Selección en contra

• Facilita la identificación de bacterias recombinantes

• Evita el crecimiento de bacterias no transformadas y de bacterias que contienen plásmidos sin DNA foráneo

Selección antibiótica

Selección azulblanca

• Células bacterianas se siembran en agar con diversos antibióticos para identificar bacterias recombinantes y células no transformadas

• Gen lacZ codifica B-gal (enzima que degrada lactosa en glucosa y galactosa). • Interrupción por gen insertado: gen incapaz de producir B-gal funcional • Sustrato cromogénico: X-gal (similar a lactosa en estructura, se vuelve azul cuando lo rompe B-gal • Recombinantes blancas / No rec azules

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

Fuente: Thieman & Palladino, 2010

CLONACIÓN DE UN GEN • https://www.youtube.com/watch?v=arQU-bbxcUM

CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO VECTOR • https://www.youtube.com/watch?v=KRpik9mNRm0

Tamaño

Origen de replicación (ori)

• Suficientemente pequeños para que se puedan separar fácilmente del DNA cromosómico de la bacteria hospedadora • Sitio de replicación del DNA que permite a los plásmidos replicarse de forma separada del cromosoma de la célula hospedadora

Número de copias

• Número de plásmidos que hay en una célula. Normalmente menos de 12 plásmidos, deseable alto número de copias (cientos de miles por célula)

Polylinker

• Sitio de clonación múltiple (MCS). Fragmento de DNA con secuencias de reconocimiento para varias enzimas de restricción

Genes marcadores

• Permiten la selección e identificación de bacterias transformadas mediante un plásmido recombinante en comparación con las no transformadas. Ej. ampR, tetR, lacZ.

• Se utilizan para la transcripción del RNA in vivo e in vitro por RNApol. In vivo permite a células bacterianas fabricar RNA a partir de genes clonados y sintetizar proteínas. In vitro Secuencias del promotor de permite sintetizar sondas para estudiar la expresión génica. RNApol

Secuencias de cebadores

• Estos cebadores (primers u oligonucleótidos) permiten la secuenciación de nucleótidos de fragmentos de DNA clonado que hayan sido insertados en el plásmido.

Desde el punto de vista comercial, una ventaja de las patentes es que proporciona a las empresas privadas un incentivo para llevar al mercado una tecnología. Al mismo tiempo, esto puede ralentizar los avances en la búsqueda y aplicación de soluciones a problemas ambientales. ¿Patentar o no patentar? TÚ DECIDES.