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Aislamiento y conservación, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq Practica 1

Manual de practicas

Ingeniería de bioprocesos Ing. Jorge Paul Castro Cosio Ingeniería Bioquímica Plan de estudios: IBQA-2010-207


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Aislamiento y conservación, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq Practica 1

Introducción.

El presente manual cuanta con una selección de practicas que permitarán al estudiante desarrollar las competencias mínimas necesarias para su incorporación en la industria biotecnologica. Del mismo modo, se presentan temáticas y puntos críticos que son necesarios se aborden durante el quiahacer del ingeniería bioquímico.

Al realizar las practicas propuestas, el alumno retomara conceptos básicos como la preparación de soluciones amortiguadoras, medios de cultivo complejos y quimicamente definidos, así como pondrá en practica los conocimientos adquiridos sobre ingeniería genética, metabolismo secundario, bioquímica y microbiología industrial, de tal modo que el curso de la materia de ingeniería de bioprocesos se convierte en un taller multidisciplinario.

Además, las practicas se encuentran estructuradas para ayudar al ñalumno a cumplir con un proyecto semestral, el cual tiene como fin el diseñar, modelar y optimizar un bioproceso existente, partiendo del hecho de la optimización de los recursos naturales y la inclusión de productos biofuncionales en el desarrollo regional, por lo cual, al final de cada practica se retoman conceptos teóricos esenciales para la puesta en marcha y funcionamiento de los bioproceosos.

Se toman como estudios de caso, para el diseño de estas practicas, bioprocesos exitosos que actualmente proveen de bioproductos básicos o finos a la industria biotecnología, para, finalmente; concluir con el escalamiento de un proceso relacionado con la bioingeniería en donde se retomaran los conceptos de síntesis, modelamiento, simulación y optimización de procesos industriales. 


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Contenido. Aislamiento y conservación de microorganismos de interés biotecnológico. .................................................4 Parámetros de control de los sistemas de fermentación. .................................................................................12 Producción de ácido cítrico por fermentación sumergida con A. niger (upstream & downstream). .......... 21 Anexos. ....................................................................................................................................................................27

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Aislamiento y conservación de microorganismos de interés biotecnológico. Practica 1, Ingeniería de bioprocesos. 1.

Objetivo. Aislar, seleccionar y conservar microorganismos de interés biotecnológico e industrial, capaces de producir metabolitos o de metabolizar sustratos específicos, como la glucosa.

2.

Introducción. Introducción aquí…

3.

Materiales, reactivos y soluciones. Materiales de laboratorio. •

Bolsas estériles para muestreo.

•

Cajas petri esteriles de 90 x 100 mm.

•

Tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm.

•

Tubos con tapón de rosca de 15 x 150 mm.

•

Pipetas graduadas de 1 mL, con divisiones de 0.1 mL, esteriles.

•

Pipetas graduadas de 5 mL, con divisiones de 0.1 mL, esteriles.

•

Pipetas graduadas de 10 mL, con divisiones de 0.1 mL, esteriles.

•

Mechero de Bunsen o Fisher, con manguera para toma de gas.

•

Incubadora de convección, con un rango de trabajo de 35ºC ± 1ºC.

•

Mortero y mano de mortero esteriles.

Reactivos y soluciones. •

Agar papa dextrosa

•

Agar nutritivo

•

Agar Czapek

•

Agar Czapek modificado (1% Almidón, ninhidrina)

•

Agar de leche descremada

•

Agar Dworkin-Foster modificado.

•

Ácido clorhídrico 1N

•

Hidróxido de sodio 1N

•

Kit para tinción Gram

•

Azul de lactofenol

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Material biológico

4.

•

Tierra de cultivo que se encuentre cercana a las raíces de la planta seleccionada.

•

Cepa de Staphylococcus aureus.

Metodología. Aislamiento primario. (1) Pesar 1 g de la muestra y agregar a un tubo con 9 mL de agua destilada estéril, agitar vigorosamente hasta la homogeneización total. (2) Realizar diluciones seriadas base 10, transfiriendo 1 mL de la dilución inicial a un tubo con 9 mL de agua destilada estéril, hasta obtener una dilución 10-9. (3) Transferir 500 µL de las diluciones impares, a partir de la dilución 10-5, a una placa de agar Czapek , selle las placas con papel parafilm e incubar a 30ºC ± 2ºC de 24 a 48 h y hasta 3 días de ser necesario. (4) Registre la morfología macroscópica y microscópica de las colonias aisladas, seleccione las de interés y realice un resiembra en agar Czapek selle las placas con papel parafilm e incube a 30ºC ± 2ºC de 24 a 48 h y hasta 3 días de ser necesario, conserve en refrigeración hasta su uso. Selección de los microorganismos de interés biotecnológico. (5) Realizar una suspensión 1.0 McF de los aislamientos primarios y realizar las siguientes inoculaciones en un tercio de los siguientes medios: •

Czapek 1% almidón, incubar a 30ºC ± 2ºC por 72 h. Al término de la incubación agregar 1 gota de lugol sobre las colonias y registrar la presencia de enzimas aminolíticas.

•

Czapek 1% ninhidrina, incubar a 30ºC ± 2ºC por 72 h. Al término de la incubación registrar la presencia de halos púrpuras alrededor de las colonias, estos indican la producción de aminoácidos.

•

Dworkin-Foster modificado, incubar a 30ºC ± 2ºC por 72 h. Al término de la incubación registrar la presencia de halos amarillo alrededor de las colonias, estos indican la producción de ácidos orgánicos.

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•

Realizar una suspensión 1.0 McF de la cepa de S. aureus en solución salina estéril al 0.85%, insertar un hisopo estéril, exprimir el excedente en las paredes del tubo y sembrar masivamente en una placa de AST. Sobre está, colocar la gota de los cultivos problema, incubar a 30ºC ± 2ºC por 72 h. Al término de la incubación registrar los halos de inhibición.

Conservación de los microorganismos de interés biotecnológico. (6) Seleccionar una de las siguientes técnicas de conservación, de acuerdo al microorganismo identificado: •

Cultivos bacterianos: Conservación por vitrificación. -

Realice un cultivo en CST y deje incubar a 30ºC ± 2ºC durante toda la noche, una vez concluida la incubación pare el crecimiento sumergiendo el cultivo en un baño de agua fría a 4ºC ± 2ºC durante 1 a 2 min e inmediatamente comience el proceso de conservación.

-

Transfiera el cultivo a un tubo conico estéril y centrifugue a 10,000 rpm durante 10 min, decante el líquido cuidando de dejar una porción junto con el pellet.

-

Resuspenda el pellet con el líquido sobrante y agregue 3 mL de CST estéril, seleccione una de las siguientes soluciones crioprotectantes y utilice el cultivo como diluyente para alcanzar la concentración final indicada, (Nota: la selección del crioprotector debe realizarse en función del tipo del microorganismo, para esto debe realizar una búsqueda bibliográfica exhaustiva):

-

-

Glicerol al 30%, diluir al 50%.

-

Leche descremada al 30%, diluir al 50%.

-

DMSO al 50%, diluir al 5%.

Estabilizar la suspension (crioprotectante - cultivo) a temperatura ambiente durante 15 min, después de este tiempo comienza el deterioro celular; y lleve a congelación a -20ºC ± 2ºC.

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Conservación en crioperlas. -

Lavar y neutralizar las perlas de vidrio, para esto se deben colocar en un matraz o vaso de precipitado y colocar ácido clorhídrico al 10% y agitar vigorosamente hasta lograr la separación de las impurezas, retirar el ácido y lavar repetidamente con agua hasta lograr la neutralidad (pH 7.0 ± 0.2), colocar en un frasco limpio y esterilizar a 121ºC @ 15 lb por 15 min.

-

Realizar los pasos mostrados en el apartado para , utilizando como soporte las perlas, colocar de 20 a 25 perlas en cada criotubo y seguir los pasos indicados.

-

Una vez que se ha estabilizado la suspensión, retirar el liquido con ayuda de pipeta y congelar inmediatamente a -20ºC ± 2ºC.

•

Cultivos fúngicos: Preservación en arena. -

Filtre el líquido al vacío en un soporte de filtrado estéril; esto separará las hifas y conidias de las esporas, transfiera el filtrado a un tubo para centrífuga tipo falcon de 50mL estéril y centrifugar el cultivo a 10,000 rpm durante 10min a 15min.

-

Resuspender el pellet en el mismo líquido sobrante y adicionar 1.5mL de agua destilada estéril y homogenizar hasta la reintegración total del paquete celular, adicionar el líquido a un tubo con arena estéril, sellar y congelar.

Preservación en sílica. -

Utilizar un cultivo esporulado como inoculó. Llenar un tubo con tapón de rosca de 13 x 100 mm a un tercio con cristales de sílica y esterilizar los tubos a 160ºC - 180ºC de 1 a 6 h, hasta asegurar que la sílica se encuentra completamente seca.

-

Dispensar de 1.5 mL de una solución al 5% (v/v) de leche descremada dentro del cultivo, agitar suavemente cuidando de homogeneizar las esporas en el líquido, tomar 1 mL de la suspensión y dispensar en los tubos con sílica (ya enfriada), agitar por inmersión para asegurar que se expone a la mayor área superficial, hasta que el líquido sea absorbido por los cristales de sílica y congelar a -20ºC ± 2ºC.

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(7) Realizar el seguimiento de la conservación a las 4, 8 y 16 semanas, para esto utilizar el siguiente procedimiento para descongelación: -

Retrire una de las replicas del congelador e inmediatamente lleve a un baño de agua caliente a 30ºC ± 2ºC, mantenga durante 5 min y retire, una vez que se haya descongelado el líquido o el medio de soporte comenzara un efecto de deterioro celular, por lo cual se debe iniciar el proceso de recuperación de forma inmediata.

-

Siembre una gota en una placa de Czapek o AST, según corresponda, e incube a 30ºC ± 2ºC, evalué la viabilidad de la cepa de acuerdo al crecimiento obtenido.

5.

Resultados. (1) Utilice las tablas para registrar sus observaciones y, posteriormente; discuta sus resultados.

Muestreo: Muestra:

Cantidad utilizada (g):

Punto de recolección: Condiciones durante el muestreo:

Identificación: Aislamiento

Características macroscópicas

Características microscópicas

Identificación final

Medio utilizado

1 2 3 4 5 6

Identificación de características de interés biotecnológico: Aislamiento

AMY

AMI

AcOrg Dc

Dv

Dc/Dv

Prot

Característica de interés identificada

1 2

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3

Seguimiento de la conservación (utilice una tabla por cada cepa conservada): Método:

ID Cepa:

Tiempo

Pruebas realizadas

Identificación

Observaciones

4 sem 8 sem 16 sem Método:

ID Cepa:

Tiempo

Pruebas realizadas

Identificación

Observaciones

4 sem 8 sem 16 sem Método:

ID Cepa:

Tiempo

Pruebas realizadas

Identificación

Observaciones

4 sem 8 sem 16 sem

6.

Manejo de residuos. (1) Manejar todos los desechos provenientes de cultivos y resiembras de microorganismos como potencialmente peligrosos, para esto realizar las siguientes actividades: •

Colocar todo el material autoclave en bolsas plásticas y esterilizar a 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar y desechar como residuos comunes.

•

Los materiales no autoclavables (que se deforma con el calor), se deben separar y esterilizarse a parte de los autoclavables en un ciclo de 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar y desechar como residuos comunes.

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(2) Manejar todos los residuos de sustancias químicas o mezclas de sustancias químicas como potencialmente peligrosos cuando no se conozca la composición de las mezclas, realizar las siguientes actividades para el desecho de los residuos químicos: •

Clasificar los residuos químicos peligrosos de acuerdo a su peligrosidad, estos se deben de caracterizar como CRETIB (Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Tóxico e Inflamable).

•

Colocar una etiqueta para identificar el residuo, esta debe listar los componentes de la mezcla, las proporciones a la que se encuentran e indicar únicamente la característica de la sustancia de mayor peligro.

•

Los residuos químicos peligrosos se almacenan hasta por 1 año, coloque el frasco en el lugar destinado para este fin, consulte con el jefe del laboratorio.

9.

Ejercicios. (1) Describa los procesos generales de aislamiento para los siguientes géneros de microorganismos: •

Aspergillus spp.

•

Spirulina spp.

•

Methanococcus spp.

•

Sphingomonas spp.

•

Bacillus spp.

•

Acinetobacter spp.

(2) Describa brevemente las características que debe tener un organismo para ser considerado como de interés para la biotecnología o como organismo modelo. (3) Menciona 5 organismos de interés, además de los presentados en esta práctica, y describa brevemente su importancia en la biotecnología. (4) Describa los siguientes procesos preservación: •

Sistema de lotes semilla

•

Preservación en agua de mar

•

Preservación en crioperlas

•

Liofilización

•

Preservación en algodón

•

Preservación por ultracongelación

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(5) Menciona 5 agentes crioprotectantes utilizados para la preservación de microorganismos de interés biotecnológico, la concentración en que se utiliza, el tipo de citotoxicidad y el mecanismo de acción. (6) Menciona las colecciones o bancos biológicos más importantes a nivel internacional, que son fuente de material biológico valioso para los procesos biotecnológicos. (7) Realice un resumen de una cuartilla sobre la importancia de los bancos biológicos en el desarrollo de procesos biotecnológicos y el mejoramiento de bioproductos. 10. Referencias bibliográficas. 1.

Okafor N, Modern industrial microbiology and biotechnology,Science Publishers, (2007) ISBN 978-1-57808-434-0.

2.

Cinar A, Parulekar S J, Ündey C, Birol G, Batch fermentation modeling, monitoring and control, Marcel Dekker Inc., (2003), ISBN: 0-82-47-4034-3.

3.

Doble M, Kruthiventi A K, Gaikar V G, Biotransformations and bioprocess, Marcel Dekker Inc., (2004), ISBN: 0-8247-4775-5.

4.

Baltz R H, Demain A L, Davies J E, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 3rd Ed., ASM Press, (2010), ISBN: 978-1-55581-512-7.

5.

Simpson R, Sastry S K, Chemical and bioprocess engineering: Fundamentals concepts for first-year students, Springer.

6.

El-Mansi E M T, Bryce C F A, Dahhou B, Sanchez S, Demain A L, Allman A R, Fermentation microbiology and biotechnology, CRC Press, (2012), ISBN: 978-1-4398-5581-2.

7.

Waites M J, Morgan N L, Rockey J S, Higton G, Industrial Microbiology: An introduction, Blackwell Science, (2001), ISBN: 0-632-05307-0.

8.

Atlas R M, Handbook of microbiological media, 4th Ed., CRC Press, 2010.

9.

Humber R A, Capitulo V-5 Fungi: Preservation of cultures, en Manual of Techniques in Insect Pathology, esitado por Lacey L A, Academic Press, London, 1997, Pages 269-279, ISBN 9780124325555, http:// dx.doi.org/10.1016/B978-012432555-5/50015-4.

10. Stanbury P F, Whitaker A and Hall S J, Capitulo 6 - Culture preservation and inoculum development, en Principles of Fermentation Technology, 3rd Ed., Butterworth-Heinemann, Oxford, 2017, Pages 335-399, ISBN 9780080999531, http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-08-099953-1.00006-5. 11. Cryopreservtaion guide, Thermo Scientific Nalgene and Nunc, www.thermoscientific.com/coldstorage.


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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq Practica 1

Parámetros de control de los sistemas de fermentación. Practica 3, Ingeniería de bioprocesos. 1.

Objetivo. Establecer los parámetros de control en los sistemas de fermentación a través de la perturbación deliberada de las condiciones de crecimiento y su afección sobre la cinética de crecimiento microbiano.

2.

Introducción. Saccharomyces cerevisiae fue uno de los primeros microorganismos utilizados para la producción de proteína unicelular y compuestos biotecnológicos, con alrededor de 200,000 ton/año de biomasa producida, siendo, probablemente, el microorganismo más utilizado en la industria de los bioprocesos, (Suárez-Machin C, et al, 2016). Es capaz de metabolizar diferentes tipos de azucares, entre ellos la glucosa (como monosacáridos reductores) y sacarosa (disacárido no reductor), siendo este ultimo el de mayor importancia en la bioingeniería, dado su utilidad en los procesos de panificación y obtención de biocombustibles, por ejemplo, (Batista A, et al, 2004). La presente practica tiene por objetivo introducir al estudiante en los procesos relacionados con la ingeniería de fermentaciones, específicamente aquellos que permiten el control de los parámetros de crecimiento, su manipulación y mejoramiento, para lograr la obtención de productos biotecnológicos de interés. Al utilizar al organismo modelo S. cerevisiae se asegura que la experiencia en el laboratorio impacte directamente sobre su desarrollo profesional.

3.

Materiales, reactivos y soluciones. Materiales de laboratorio.1 •

Caja petri estéril de 90 x 100 mm.

•

Pipetas graduadas de 1 mL, con divisiones de 0.1 mL, estériles.

•

Pipetas graduadas de 5 mL, con divisiones de 0.1 mL, estériles.

•

Pipetas graduadas de 10 mL, con divisiones de 1 mL, esteriles.

•

Frasco de vidrio con tapa de metal y cierre hermético, con capacidad mínima de 1 L.

•

Matraz Erlenmeyer con tapa de rosca de 500 mL y 1000 mL de capacidad.

•

Sistema de mangueras para distribución de aire (diferentes calibres, translucida).

•

Filtro para jeringa de 0.25 µm.

1

Nota: utilice material estéril, a menos que se indique lo contrario. Todo material consumible (plásticos, aplicadores, puntas de pipetas, pipetas de cristal, etc.) que sea esterilizado por vapor húmedo tiene una caducidad de 1 mes a partir de la fecha de esterilización.

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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq Practica 1

•

Probeta de cristal graduada de 250 mL o 500 mL.

•

Camará de Neubauer

•

Cubetas o celdas de espectrofotometría de 1 cm, de plastico o cuarzo pulido.

•

Tiras indicadoras de pH o potenciómetro.

•

Mechero de Bunsen o Fisher, con manguera para toma de gas.

•

Bomba de aireación (para pecera).

•

Picnometro.

•

Balanza analítica, con capacidad de hasta 120 g.

•

Balanza granataria digital, con capacidad de hasta 2000 g.

•

Equipo para destilación por arrastre de vapor.

•

Microscopio binocular con objetivo de 10x, 50x y 100x.

•

Termopares digitales.

•

Espectrofotómetro.

Reactivos y soluciones. •

Caldo YPD o caldo Dextrosa Sabouraud.

•

Agar papa dextrosa o agar Dextrosa Sabouraud.

•

Solución de glucosa al 10%, esteril.

•

H3PO4, 2N.

•

KOH, 2N.

•

Patrón de turbidez de McFarland.

•

Solución de patrón de glucosa (1.0 g·L-1 hasta 30 g·L-1).

Material biológico •

4.

Saccharomyces cerevisiae, cultivo puro en placa de agar YPD.

Metodología. Preparación del inoculo para la fermentación. (1) A partir de una cepa tipificada de Saccharomyces cerevisiae en agar YPD, realice una suspensión en solución salina 0.85%, y lleve a 1.0 McF (aprox. 3.0 x 108 cel·mL-1), prepare 100 mL. (2) Tome 1 mL y diluya en 99 mL de SS 0.85 (Dil 1:100), a partir de esta realice diluciones seriadas hasta 10-9, transfiera 10 mL en cada paso; y siembre las diluciones 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 por vaciado en placa en agar DSA, transfiriendo 1 mL de cada dilución por triplicado, incube a 28ºC ± 2ºC durante toda la noche, conserve en refrigeración la suspensión 1.0 McF hasta su uso, no más de 7 días.

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(3) Calcule el log10 de la cuenta bacteriana además de la media, desviación estándar y desviación estándar relativa (SDR), elabore una hoja de calculo y reporte sus observaciones. Armado y puesta en marcha. (1) Por equipo, arme el reactor de acuerdo a lo indicado en la figura 1. Reactor 1: 5

1

Equipo 1 4

2

1. 2. 3. 4. 5.

Medio de cultivo estéril Solución de glucosa 10% Aireación Extracción de gases CO2 Jeringa de muestreo

3

Reactor 1: 5

1

Equipo 2 4

2

1. 2. 3. 4. 5.

Medio de cultivo estéril Solución de glucosa 10% Tapón de hule Extracción de gases CO2 Jeringa de muestreo

3

Reactor 3: 5

1

Equipo 3 4

2

1. 2. 3. 4. 5.

Medio de cultivo estéril Solución de H3PO4 2 N Tapón de hule Extracción de gases CO2 Jeringa de muestreo

3

Reactor 3: 5

1

Equipo 4 4

2

1. 2. 3. 4. 5.

Medio de cultivo estéril Solución de KOH 2 N Tapón de hule Extracción de gases CO2 Jeringa de muestreo

3

(2) Realizar perforaciones en la tapa de un frasco para cada uno de los tubos dispensadores y para la jeringa de muestreo mostrados en la figura 1, agregar una barra de agitación magnética de 3 cm, cerrar los frascos y colocar un tapón de algodón en cada orificio y cubrir con cinta, esterilizar a 121ºC@15 lb por 15 min, esterilizar también las mangueras y puntas de jeringa necesarias.

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(3) Utilice los datos obtenidos en la preparación del inoculo (3) para calcular el volumen de inoculo necesario, a partir de la suspensión 1.0 McF, considere que se requieren 1.0 x 108 cel/mL, tome el volumen calculado y agregue a cada frasco de reacción conteniendo el 80% de medio de fermentación estéril, arme en asepsia el sistema de acuerdo a lo siguiente: •

Aireación: tome una manguera adecuada y con ayuda de una T divida el flujo, como máximo coloque tres tomas por bomba, el flujo deberá diseccionarse al fondo del frasco sin que este interfiera con la agitación; conecte a la punta de la manguera un filtro para jeringa de 0.20 µm, uno por cada división, el nivel de aireación debe ser de 0.6 - 0.9 vvm.

•

Extracción de CO2: coloque un tubo de plástico estéril o cuerpo de jeringa en el orificio para la extracción de los gases, la punta que se introduce en el frasco no debe tocar el caldo de fermentación, colocar en el extremo externo un tapón de algodón.

•

Jeringa de muestreo: colocar la aguja de jeringa estéril en el orificio, cuidando de sellar con ayuda de un tapón de algodón, colocar en el extremo de unión a la jeringa un tapón de algodón, este se debe retirar con asepsia cada vez que se coloque la manguera para retirar la muestra.

•

Alimentación de medio nuevo: en una botella estéril coloque una cantidad suficiente de medio de fermentación estéril y ajuste el flujo de la manguera para una adición de 5 a 10 gotas por min.

•

Alimentación de soluciones: en una botella estéril coloque una cantidad suficiente de la solución estéril a utilizar y ajuste el flujo de la manguera para una adición de 5 a 10 gotas por min.

(4) Incube los reactores a 28ºC ± 2ºC con agitación y tome muestras a los tiempos 0, 1, 2, 16, 24, 48 y 72 h, en cada muestreo retire 50 mL de caldo, conserve en congelación todas las muestras tomadas, etiquete cada una de ellas con el tiempo de muestreo y el número de equipo. (5) Conserve un blanco del medio de cultivo sin inocular bajo las mismas condiciones que las muestras.

Análisis de las muestras. (1) Analizar las muestras tomadas durante el proceso de fermentación de acuerdo a lo siguiente:

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•

Cuantificación de la biomasa: •

Tome 1 a 3 mL de la suspensión y vacíe en un celda espectrofotométrica y cuantifique a 600nm.

•

Tome 1 mL de la suspensión y realice diluciones en SS 0.85%, hasta 10-9 y siembre por vaciado en placa las diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 en agar DSA e incube a 28ºC ± 2ºC durante 24h a 48h.

•

Filtrar al vacío, utilizando filtros a peso constante; el medio sobrante cuidando de cuantificar el volumen. Secar los filtro con la biomasa en una estufa a 70ºC durante 24h, dejar enfriar en un desacador y determinar el peso seco. Calcular el peso seco de biomasa por volumen de medio utilizado.

•

Grafique el cambio de biomasa contra el tiempo, como absorbancia y cel/mL, obtenga el modelo matemático para ∆X.

•

Determinación del pH: •

Con ayuda de un electrodo o tiras medidoras, tome el pH de cada filtrado, realice una curva de pH contra el tiempo.

•

Cuantificación de la utilización de glucosa: •

Prepare una curva patrón de glucosa en agua destilada estéril y filtrada, para los siguientes puntos: 1.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15, 20, 25 y 30 g/L, (una curva por todo el grupo). Realice la cuantificación de los azucares reductores a través del método de DNS tanto para la curva patrón como para 1 mL de cada muestra problema, en caso de no poder utilizar este método cuantifique por medio del método de Fehling, de acuerdo a lo indicado en el anexo 2.

•

Determinación de alcohol (método del dicromato):

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•

Prepare una solución estándar de etanol al 10% (v/v) en agua destilada, a partir de esta realice diluciones tomando 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 mL y lleve cada uno a un volumen final de 10 mL utilizando agua destilada.

•

Transfiera 3.5 mL de cada punto de la curva a un tubo limpio y agregue 1.5 mL de la solución de dicromato de potasio y ácido sulfúrico (K2Cr2O7:H2SO4), agite gentilmente e incube a 60ºC por 30 min.

•

Tras el tiempo de incubación cuantifique la concentración de alcohol (v/v) a 600nm. Repita para cada muestra a analizar, utilizando un blanco de reactivos.

•

Grafique la concentración de etanol (v/v) vs absorbancia para la curva estándar, y tras la estimación del etanol para cada punto de muestreo la concentración de alcohol vs el tiempo, describir la cinética para el producto.

•

Determinación de alcohol (método del picnómetro): •

Tomar 30 mL del filtrado de cada muestra y destilar, anotando el volumen exacto de la muestra a destilar, y recuperar en un vaso de precipitados, anotar el volumen del destilado.

•

Ponga a peso constante el picnómetro en una estufa a 70ºC y, posteriormente, deje enfriar en un desecador, registre el peson final.

•

Llene el picnómetro con agua hasta el aforo y tome el peso con precisión.

•

Repita para cada muestra destilada, utilice un picnómetro a peso constante por muestra y, determine la gravedad especifica utilizando la siguiente relación:

ge = •

Wp+m − Wp

Wp+H2O − Wp

Utilice el valor de la ge para buscar en las tablas de la AOAC el valor correspondiente al porcentaje de alcohol y, a partir de la siguiente relación, calcular el volumen de alcohol en la muestra:

VEtOH,mL =

(Vm )(vtabla ) 100

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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq Practica 1

•

Grafique la concentración de etanol contra el tiempo y calcule la concentración de etanol producido en el reactor.

5.

Resultados. (1) Reporte sus observaciones y calcule los siguientes parámetros: a.

Concentración de glucosa: estime la taza de utilización de glucosa respecto al tiempo para los sistemas experimentales utilizados, realice una gráfica.

b.

Concentración de alcohol:, estime la taza de producción de alcohol respecto al tiempo y al sustrato, realice una gráfica.

c.

Concentración de biomasa:, estime la producción de biomasa respecto al tiempo a partir del conteo en placa y el peso seco de de biomasa.

d.

Parámetros cinéticos: calcule la para S. cerevisiae en los diferentes sistemas experimentales, ademas de: •

Eficiencia de consumo de glucosa (E).

•

Rendimiento respecto al sustrato (YX/S) y del producto (YP/S) discuta sus resultados,

•

Tazas especificas de crecimiento celular (μ), consumo de glucosa (qs) y de producción de alcohol (qp).

Estimación de los parámetros de control (variables de respuesta) en la fermentación. Ensayo

E(%)

YX/S

YP/S

μ (h-1)

qs (h-1)

qp (h-1)

1 2 3 4

(2) Utilice el software necesario para realizar las gráficas de concentración, crecimiento y de afectación de parámetros, cree las tablas adecuadas para presentar la información, los gráficos deben presentarse con las barras de error, (utilice la desviación estándar de tres mediciones consecutivas).

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(3) Realice un diagrama de flujo de proceso que muestre cada una de las etapas de la práctica realizada, así como los controladores que se requieren para asegurar que los parámetros de control se mantienen correctamente. 6.

Manejo de residuos. (1) Manejar todos los desechos provenientes de cultivos y resiembras de microorganismos como potencialmente peligrosos, para esto realizar las siguientes actividades: •

Colocar todo el material autoclave en bolsas plásticas y esterilizar a 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar y desechar como residuos comunes.

•

Los materiales no autoclavables (que se deforma con el calor), se deben separar y esterilizarse a parte de los autoclavables en un ciclo de 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar y desechar como residuos comunes.

(2) Manejar todos los residuos de sustancias químicas o mezclas de sustancias químicas como potencialmente peligrosos cuando no se conozca la composición de las mezclas, realizar las siguientes actividades para el desecho de los residuos químicos: •

Clasificar los residuos químicos peligrosos de acuerdo a su peligrosidad, estos se deben de caracterizar como CRETIB (Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Tóxico e Inflamable).

•

Colocar una etiqueta para identificar el residuo, esta debe listar los componentes de la mezcla, las proporciones a la que se encuentran e indicar únicamente la característica de la sustancia de mayor peligro.

•

Los residuos químicos peligrosos se almacenan hasta por 1 año, coloque el frasco en el lugar destinado para este fin, consulte con el jefe del laboratorio.

9.

Ejercicios. (1) Conteste las siguientes preguntas, deberá entregarlas anexas a su diagrama de flujo al iniciar la sesión de laboratorio. 1.

¿Cuáles son las rutas metabólicas que deben permanecer inalteradas durante la fermentación de levaduras para la producción de etanol?.

2.

¿Cuáles parámetros de control pueden manipularse para aumentar la producción de etanol?.

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3.

¿Existe algún tipo de inhibición en la fermentación alcohólica? y si es así, ¿Qué rutas se ven involucradas?.

4.

¿Las simulación puede ser utilizada como una alternativa rentable al trabajo de laboratorio? Explique su respuesta.

5.

Describa la ruta metabólica para la obtención de etanol, glicerol y ácido acético a partir de carbohidratos.

6.

Referencias bibliográficas. 1.

Atlas R M, Handbook of microbiological media, 4th Ed., CRC Press, 2010.

2.

Baltz R H, Demain A L, Davies J E, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 3rd Ed., ASM Press, (2010), ISBN: 978-1-55581-512-7.

3.

Cinar A, Parulekar S J, Ündey C, Birol G, Batch fermentation modeling, monitoring and control, Marcel Dekker Inc., (2003), ISBN: 0-82-47-4034-3.

4.

Clarke K G, Bioprocess engineering: an introductory engineering and life science approach, Woodhead Publishing, (2013), ISBN: 978-1-78242-168-9 (online).

5.

Diaz M, Ingeniería de bioprocesos, Ed. Parainfo (2012), ISBN 978-84-283-8123-9.

6.

Doble M, Kruthiventi A K, Gaikar V G, Biotransformations and bioprocess, Marcel Dekker Inc., (2004), ISBN: 0-8247-4775-5.

7.

Doran M P, Bioprocess engineering principles, 2nd Ed., Academic Press, Elsevier, (2013), ISBN: 978-0-12-220851.

8.

El-Mansi E M T, Bryce C F A, Dahhou B, Sanchez S, Demain A L, Allman A R, Fermentation microbiology and biotechnology, CRC Press, (2012), ISBN: 978-1-4398-5581-2.

9.

Nielsen J, Villadsen J, Lidén G, Bioreaction engineering principles, 2nd Ed., Kluwer Academic (2003), ISBN: 0-306-47349-6.

10. Okafor N, Modern industrial microbiology and biotechnology,Science Publishers, (2007) ISBN 978-1-57808-434-0. 11. Simpson R, Sastry S K, Chemical and bioprocess engineering: Fundamentals concepts for first-year students, Springer. 12. Waites M J, Morgan N L, Rockey J S, Higton G, Industrial Microbiology: An introduction, Blackwell Science, (2001), ISBN: 0-632-05307-0.


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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq Practica 1

Producción de ácido cítrico por fermentación sumergida con A. niger (upstream & downstream). Practica 4, Ingeniería de bioprocesos. 1.

Objetivo. Desarrollar las habilidades y aptitudes para el análisis de bioprocesos en la generación del upstream & downstream, haciendo uso de las competencias previas obtenidas, específicamente el manejo de microorganismos y la síntesis de procesos, así como los fundamentos de las bioseparaciones.

2.

Introducción. El ácido cítrico…

3.

Materiales, reactivos y soluciones. Materiales de laboratorio.2 •

Caja petri estéril de 90 x 100 mm.

•

Pipetas graduadas de 1 mL, con divisiones de 0.1 mL, estériles.

•

Pipetas graduadas de 5 mL, con divisiones de 0.1 mL, estériles.

•

Pipetas graduadas de 10 mL, con divisiones de 1 mL, estériles.

•

Matraz Erlenmeyer con tapa de rosca de 500 mL y 1000 mL de capacidad.

•

Probeta de cristal graduada de 250 mL o 500 mL.

•

Cámara de Neubauer.

•

Mechero de Bunsen o Fisher, con manguera para toma de gas.

•

Bureta graduada de 50 mL.

•

Microscopio binocular con objetivo de 10x, 50x y 100x.

•

Agitador orbital para 120 rpm o más.

Medios de cultivo, soluciones y reactivos. •

Caldo de fermentación (ver anexo 1).

•

Agar papa dextrosa, en placa.

•

Agar papa dextrosa en tubo con bisel largo.

•

NaOH 0.1 N.

•

Solución de fenolftaleina (como indicador).

•

Solución saturada de Ca(OH)2.

2

Nota: utilice material estéril, a menos que se indique lo contrario. Todo material consumible (plásticos, aplicadores, puntas de pipetas, pipetas de cristal, etc.) que sea esterilizado por vapor húmedo tiene una caducidad de 1 mes a partir de la fecha de esterilización.

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•

KOH, 2N.

•

Patrón de turbidez de McFarland.

•

Solución de patrón de glucosa (1.0 g·L-1 hasta 30 g·L-1).

Material biológico. •

4.

Aspergillus niger, cultivo puro en agar papa dextrosa o dextrosa Sabaourod.

Metodología. Preparación del inoculo para la fermentación. (1) A partir de una cepa tipificada de Aspergillus niger, realice una suspensión de esporas en solución salina 0.85%, y lleve aprox. 1.0 x 108 cel/mL utilizando SS 0.85 como diluyente, prepare 10 mL. Conserve en refrigeración hasta su uso. Armado y puesta en marcha de la fermentación. (1) Llene un frasco de reacción hasta el 80% de su capacidad con el caldo de fermentación estéril, agregue una barra de agitación. La tapa del frasco no debe tener orificios, o en su caso deben sellarse con un tapón de algodón. (2) Tome 1 mL de la suspensión de esporas estandarizada e inocule el frasco de reacción, inmediatamente coloque en agitación orbital sumergida a 28ºC ± 2ºC, en caso de no contar con el equipo utilice un agitador magnético en la mínima velocidad. (3) Tome muestras de 50 mL al tiempo 0, 2, 8, 16, 24, 48, 72, 96 y 120 h, recolecte el líquido en tubos cónicos de plástico estériles y congele. Análisis de las muestras. (1) A partir de cada muestra realice las siguientes determinaciones. •

Cuantificación de la biomasa: •

Filtrar el caldo de fermentación al vacío, utilizando filtros a peso constante; cuidando de cuantificar el volumen. Secar los filtro con la biomasa en una estufa a 70ºC durante 24h, dejar enfriar en un desecador y determinar el peso seco. Calcular el peso seco de biomasa por volumen de medio utilizado.

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•

Grafique el cambio de biomasa contra el tiempo, como absorbancia y cel/mL, obtenga el modelo matemático para ∆X.

•

Determinación del pH: •

Con ayuda de un electrodo o tiras medidoras, tome el pH de cada filtrado, realice una curva de pH contra el tiempo.

•

Cuantificación de la utilización de glucosa: •

Prepare una curva patrón de glucosa en agua destilada estéril y filtrada, para los siguientes puntos: 1.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15, 20, 25 y 30 g/L, (una curva por todo el grupo). Realice la cuantificación de los azucares reductores a través del método de DNS para la curva patrón.

•

Cuantificación de carborhidratos fermentables: •

•

Realice la inversión de la sacarosa de acuerdo a lo siguiente:

Cuantificación del ácido cítrico (AC): •

Agregue 10 mL de agua destilada estéril a 10 mL del liquido clarificado y de 1 a 2 gotas de fenolftaleina, titule con NaOH 0.1N hasta observar el primer vire de color permanente, calcule el porcentaje de ácido cítrico como:

% AC = •

•

Normalidad × Volumen de NaOH × W equivalente W de la muestra (g) × 10

Grafique el %AC vs el tiempo.

Determinación de la concentración final del ácido cítrico: •

Al término de la fermentación, filtre el volumen total del caldo con ayuda de una bomba de vacío utilizando un filtro Watchman No. 4 y reserve el filtrado.

•

Agregue un volumen igual de una suspensión saturada de Ca(OH)2 y ajuste el pH a 7.0 ± 0.2, para esto agregue una gota de fenoftaleina y lleve a neutralidad, una vez alcanzado el cambio de pH caliente la solución hasta 50ºC - 60ºC durante 20 min. Se formara un precipitado de citrato de calcio.

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•

Deje enfriar a temperatura ambiente y separe el citrato de calcio por filtración al vacío y lave la torta con agua destilada tres veces.

•

Agregue un volumen igual de H2SO4 concentrado del 60 - 70% y lleve a 90ºC durante 20 min, la mezcla no debe hervir, mantenga tapado el vaso de precipitados con ayuda de un vidrio de reloj.

•

Deje enfriar a temperatura ambiente y separe por filtración al vacío y recolecte el liquido clarificado, en este se encuentra el AC. Cristalice a temperatura ambiente durante 24h, separe por filtración, seque en un horno a 60ºC durante 24 h y cuantifique el peso de los cristales obtenidos, calcule el rendimiento de la producción de ácido cítrico.

• 5.

Obtenga el porcentaje en peso del ácido cítrico cristalizado.

Resultados. (1) Reporte sus observaciones y calcule los siguientes parámetros: a.

Concentración de sacarosa: estime la taza de utilización de glucosa respecto al tiempo para los sistemas experimentales utilizados, realice una gráfica.

b.

Concentración de ácido cítrico:, estime la taza de producción de alcohol respecto al tiempo y al sustrato, realice una gráfica.

c.

Concentración de biomasa:, estime la producción de biomasa respecto al tiempo a partir del conteo en placa y el peso seco de de biomasa.

d.

Parámetros cinéticos: calcule los siguientes parámetros para A. niger: •

Eficiencia de consumo de sacarosa (E).

•

Rendimiento respecto al sustrato (YX/S) y del producto (YP/S) discuta sus resultados,

•

Tazas especificas de crecimiento celular (μ), consumo de sacarosa (qs) y de producción de ácido cítrico (qp).

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Estimación de los parámetros de control (variables de respuesta) en la fermentación. Ensayo

E(%)

YX/S

YP/S

μ (h-1)

qs (h-1)

qp (h-1)

1 2 3 4

(2) Utilice el software necesario para realizar las gráficas de concentración, crecimiento y de afectación de parámetros, cree las tablas adecuadas para presentar la información, los gráficos deben presentarse con las barras de error, (utilice la desviación estándar de tres mediciones consecutivas). (3) Realice un diagrama de flujo de proceso que muestre cada una de las etapas de la práctica realizada, así como los controladores que se requieren para asegurar que los parámetros de control se mantienen correctamente. 6.

Manejo de residuos. (1) Manejar todos los desechos provenientes de cultivos y resiembras de microorganismos como potencialmente peligrosos, para esto realizar las siguientes actividades: •

Colocar todo el material autoclave en bolsas plásticas y esterilizar a 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar y desechar como residuos comunes.

•

Los materiales no autoclavables (que se deforma con el calor), se deben separar y esterilizarse a parte de los autoclavables en un ciclo de 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar y desechar como residuos comunes.

(2) Manejar todos los residuos de sustancias químicas o mezclas de sustancias químicas como potencialmente peligrosos cuando no se conozca la composición de las mezclas, realizar las siguientes actividades para el desecho de los residuos químicos: •

Clasificar los residuos químicos peligrosos de acuerdo a su peligrosidad, estos se deben de caracterizar como CRETIB (Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Tóxico e Inflamable).

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•

Colocar una etiqueta para identificar el residuo, esta debe listar los componentes de la mezcla, las proporciones a la que se encuentran e indicar únicamente la característica de la sustancia de mayor peligro.

•

Los residuos químicos peligrosos se almacenan hasta por 1 año, coloque el frasco en el lugar destinado para este fin, consulte con el jefe del laboratorio.

6.9. Ejercicios. (1) Conteste las siguientes preguntas, deberá entregarlas anexas a su diagrama de flujo al iniciar la sesión de laboratorio. Preguntas finales. • Explique la importancia del ácido cítrico en los procesos industriales, de tres ejemplos de su uso. • Describa la ruta metabólica para la obtención de ácido cítrico a partir de sacarosa y/o glucosa. • Describa el proceso industrial para la producción de ácido cítrico. 6.10.Referencias bibliográficas. 1. Atlas R M, Handbook of microbiological media, 4th Ed., CRC Press, 2010. 2. Baltz R H, Demain A L, Davies J E, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 3rd Ed., ASM Press, (2010), ISBN: 978-1-55581-512-7. 3. Cinar A, Parulekar S J, Ündey C, Birol G, Batch fermentation modeling, monitoring and control, Marcel Dekker Inc., (2003), ISBN: 0-82-47-4034-3. 4. Clarke K G, Bioprocess engineering: an introductory engineering and life science approach, Woodhead Publishing, (2013), ISBN: 978-1-78242-168-9 (online). 5. Diaz M, Ingeniería de bioprocesos, Ed. Parainfo (2012), ISBN 978-84-283-8123-9. 6. Doble M, Kruthiventi A K, Gaikar V G, Biotransformations and bioprocess, Marcel Dekker Inc., (2004), ISBN: 0-8247-4775-5. 7. Doran M P, Bioprocess engineering principles, 2nd Ed., Academic Press, Elsevier, (2013), ISBN: 978-0-12-220851. 8. El-Mansi E M T, Bryce C F A, Dahhou B, Sanchez S, Demain A L, Allman A R, Fermentation microbiology and biotechnology, CRC Press, (2012), ISBN: 978-1-4398-5581-2. 9. Nielsen J, Villadsen J, Lidén G, Bioreaction engineering principles, 2nd Ed., Kluwer Academic (2003), ISBN: 0-306-47349-6. 10. Okafor N, Modern industrial microbiology and biotechnology,Science Publishers, (2007) ISBN 978-1-57808-434-0. 11. Simpson R, Sastry S K, Chemical and bioprocess engineering: Fundamentals concepts for first-year students, Springer. 12. Waites M J, Morgan N L, Rockey J S, Higton G, Industrial Microbiology: An introduction, Blackwell Science, (2001), ISBN: 0-632-05307-0.


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Anexos. 1.

Preparación de medios de cultivo.
 Agar Czapek (ATCC M-312 modificado). Composición por litro: Sacarosa Agar bacteriológico Peptona NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4·7H2O pH 7.3 ± 0.2 @ 25ºC

Medio comercial: BD Diagnostic Systems. 30.0 g 15.0 g 5.0 g 3.0 g 1.0 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g

Medio comercial: No disponible de forma comercial. Preparación del medio: Añadir los componentes, excepto la sacarosa; a un volumen de 900 mL de agua destilada. Mezclar vigorosamente distribuir cerrar y reservar. En un matraz diferente agregar la sacarosa a 100 mL de agua destilada, mezclar vigorosamente, autoclavar ambas soluciones durante 15 min a 15 psi y 121ºC. Enfriar a 50ºC y combinar las soluciones en condiciones de esterilidad, mezclar vigorosamente y distribuir en placas Petri estériles o tubos estériles. Agar Czapek. Composición por litro: Sacarosa Agar bacteriológico NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4·7H2O pH 7.3 ± 0.2 @ 25ºC

30.0 g 15.0 g 2.0 g 1.0 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g

Medio comercial: BD Diagnostic Systems. Pre p a ra c i ó n d e l m e d i o : A ñ a d i r t o d o s l o s componentes a un volumen de 1L de agua destilada y mezclar vigorosamente, autoclavar ambas soluciones durante 15 min a 15 psi y 121ºC. Enfriar a 45 – 50ºC y distribuir en placas Petri estériles o tubos estériles. Caldo Czapek DOX. Composición por litro: Sacarosa NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4·7H2O pH 7.3 ± 0.2 @ 25ºC

Preparación del medio: Añadir los componentes a un volumen de 1L de agua destilada y mezclar vigorosamente. Distribuir en tubos o frascos. Autoclavar por 15 min @ 15 psi a 121ºC. Agar Dworkin-Foster [1958]. Composición por litro: Glucosa Ácido cítrico Ácido glucónico KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O (NH4)2SO4 Agar bacteriológico Verde de bromocresol ZnSO4·7H2O Elementos trazas: H3BO3 FeSO4·7H2O MnSO4·H2O CuSO4·5H2O MoO3 pH 5.5 ± 0.2 @ 25ºC

20.0 g 2.0 g 5.0 g 4.0 g 6.0 g 0.2 g 2.0 g 20.0 g 0.2 g 0.04 g 10.0 µg 1.0 mg 1.19 µg 78.22 µg 10.0 µg

Pre p a ra c i ó n d e l m e d i o : A ñ a d i r t o d o s l o s componentes a un matraz con 1L de agua destilada. Mezclar vigorosamente, autoclavar 15 min @ 15 psi y 121ºC. Enfriar a 50ºC y distribuir en placas Petri estériles. Agar Dextrosa Sabouraud pH 5.6. Composición por litro: Glucosa Agar bacteriológico Peptona micológica pH 5.6 ± 0.2 @ 25ºC

40.0 g 15.0 g 1.0 g

Medio comercial: Oxoid Unipath. Preparación del medio: Añadir los componentes a un volumen de 1L de agua destilada y mezclar vigorosamente. Autoclavar por 15 min @ 15 psi a 121ºC. Agar Soya Tripticaseína TSA.

30.0 g 3.0 g 1.0 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g

Composición por litro: Digerido pancreático de caseína Digerido papaíco de harina de soya Agar bacteriológico NaCl K2HPO4 Glucosa

40.0 g 3.0 g 15.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g

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pH 7.3 ± 0.2 @ 25ºC Medio comercial: Gran variedad de opciones comerciales. Preparación del medio: Añadir los componentes a un volumen de 1L de agua destilada y mezclar vigorosamente. Autoclavar por 15 min @ 15 psi a 121ºC. Caldo de fermentación, (YP, DS o PD) Composición por litro: Peptona Glucosa* Extracto de levadura** Agua destilada pH 6.5 ± 0.2 @ 25ºC

20.0 g 20.0 g 10.0 g 1000.0 mL

Preparación del medio: Añadir los componentes a un volumen de 1L de agua destilada y mezclar vigorosamente, calentar hasta la disolución total de los componentes. Distribuir en tubos o frascos. Autoclavar por 15 min @ 15 psi a 121ºC. Ajustar pH 6.5 ± 0.2. * La glucosa puede ser sustituida en el medio de fermentación por sacarosa, pero la cuantificación de la utilización del carbohidrato debe considerar la hidrólisis ácida antes de la cuantificación por el método del DNS. **El extracto de levadura puede ser sustituido por extracto de carne y glucosa, manteniendo la misma concentración final. Solución de dicromato de potasio:ácido sulfúrico. Solución de dicromato: K2Cr2O7 H2SO4 conc. Agua destilada

34 g 325 mL 500 mL

Preparación de la solución: Disuelva el dicromato de potasio en los 500 mL de agua, utilice un matraz de por lo menos el doble del volumen, agregue lentamente el ácido sulfúrico concentrado y mezcle gentilmente, de ser necesario coloque el matraz en una cama de hielo.

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