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• Edinson Morales Gil

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AUTOMATIZACION EN HEMOTERAPIA Y BANCO DE SANGRE HISTORIA DE BANCO DE SANGRE  

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Antes de Cristo | Desde las civilizaciones antiguas la sangre era de vital importancia ya que era sagrada para ellos. Después de Cristo 100 -1492 | Se tenía la idea de que la sangre transmitía vida. En el circo romano se bebían la sangre de los gladiadores porque creían que así adquirirían su fuerza. 1492 | Al Papa Inocencio VIII, se le realizó una transfusión de sangre, la cual no funcionó y murió. 1505-1576 | Planteamiento de la idea de la transfusión, durante la Primera Guerra Mundial, impuesta por Jerónimo Cordano. 1615 | Libavius descubrió el procedimiento de una transfusión directa. 1628 | William Harvey publicó el descubrimiento de la circulación de la sangre y las funciones del corazón. 1657 | Richard Lower practicó la primera transfusión sanguínea, que fue de animal a animal (perro-perro) 1658 | Jean Swammerdam descubre por primera vez los glóbulos rojos en la sangre de una rana. 1667 | Jean Baptiste Denis realiza la primera transfusión de sangre, al introducir sangre de oveja en un ser humano 16 de Diciembre de 1668 | Se lleva a cabo la primera transfusión de sangre humana en París. 1670 | El gobierno de París prohíbe las transfusiones. Secundada por el parlamento Inglés e incluso por el papado. Esto fue durante algunos años. 1674 | Anthony Leeuwenhoek descubre los glóbulos rojos humanos. | 1685 | Aparece la primera ilustración de una transfusión sanguínea | Diciembre 22 de 1818| transfusión sanguínea de brazo a brazo. James Blondell aplica la transfusión sanguínea en diversas personas, teniendo éxito en la mitad de ellos. ( por lo que se le llamó “PADRE DE LA TRANSFUSION MODERNA” 1845 | Se inicia en México la práctica y el estudio de la Transfusión sanguínea. Junio 6, se aplica en México la primera transfusión sanguínea. 1869| Hicks trato de evitar la coagulación de la sangre la transfusión, usando bicarbonato de sodio y fosfato sódico. 1873 | El medico polaco E. Gesellius freno el reavivamiento de las Transfusiones al publicar un inquietante descubrimiento; que las transfusiones ocasionaban la muerte a mas de la mitad de los receptores. 1878 | El doctor francés Georges Hayem perfecciona una solución salina que podría utilizarse como sustituyente de la sangre. 1900 | El investigador Karl Landsteiner identifico las sustancias responsables de la coagulación y desarrollar la clasificación de la sangre en cuatro grupos primarios denominados: “A”, “B”, “O” y “AB”.

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1901 | Se publico un libro de los primeros grupos sanguíneos. | 1912 | Se experimenta la manera de cómo mantener el estado natural de la sangre con la sustancia CITRATO DE SODIO. 1914 | Un medico belga, Albert Hustin, descubre que mediante una cantidad de citrato de sodio, acido cítrico, junto con glucosa se puede evitar la coagulación de sangre. El 9 de noviembre Luis Agote, realizo la primera transfusión de sangre conservada con anticoagulante “citrato de sodio”. Esto conduce al almacenamiento de la sangre y a la creación de los bancos de sangre. 1921 | Se implementa un método para el manejo de la sangre. 1925 | Se fundó en México el primer “Banco de Sangre” donde se realizo la primera transfusión de sangre en el país, en la Ciudad de México. | 1932 | El Dr. Rodolfo Ayala González crea el servicio de Transferencia en el hospital Dr. Uribe fundo el primer Centro de Atención Hospitalaria. 1936 – 1937 | Primer Banco Comercial de Sangre. Dr. Ricardo Kerchner muere en 1967 por una transfusión incompatible en Chicago. (EUA) 1940 | Los patólogos Estadounidenses Kart Landteiner y Alexander Wiener detecta por primera vez un nuevo aglutinógeno el factor Rh (+) y Rh (-) en la sangre de un mono (Macaco Rhesus). Que permite hacer más segura la transfusión de sangre. 1941 | Dr. Drew funda el Banco de Sangre en la Cruz Roja Mexicana Presbiteriano. | 1943 | Se fundó un Banco de Sangre en el Hospital General. 1962 | Se crea el Banco de Sangre, en el local donde estaba el triunfo de la Revolución, un Banco de Sangre Privado y un Laboratorio Clínico. 1963 | Producción por primera vez de los reactivos diagnosticadores hemoclasificadores del sistema de grupos sanguíneos ABO y Rh. 1965 | Se produce otro importante salto de calidad, al comenzar la producción del plasma liofilizado; este plasma se almacenaba durante años, y fue empleado en desastres naturales ocurridos en Iraq, Perú, entre otros. | 1974 | El 23 de Abril la Sria. De Salud inicia en México la Donación altruista de sangre PRONADOSA. 1982 | Inicio de la plasmaféresis para la producción de los diagnosticadores que luego se extiende a la producción de plasma hiperinmune antitétano y anti-hepatitis B. 1983 | El Centro incrementa paulatinamente sus trabajadores, en este año ya la plantilla es de 83 trabajadores con un amplio plan de producción y servicios, por lo que comienza la construcción de un nuevo edificio. 1987 | Se creó en México el Centro Nacional de Transfusión Sanguínea (C. N. T. S.).Agosto 25 se prohíbe el comercio de la sangre en México y se establece su donación voluntaria y gratuita. | 1988 |Se inicia la creación de los 31 Centros Estatales de la Transfusión Sanguínea(C.E.T.S.)

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1993 | Se creo la Nom-003-SSA2-1993.Esta Norma tiene por objeto uniformar las actividades, criterios, estrategias y técnicas operativas del Sistema Nacional de Salud, en relación con la disposición de sangre humana y sus componentes. Con fines terapéuticos. 1998| Fue la última reestructura integral que se efectuó en el Instituto de la salud del Estado de México. En marzo del mismo año se firmó un Convenio entre la Federación de Ingenieros Biomédicos para poner en marcha el Programa de Educación, Salud y Alimentación. 4 de marzo de 2000 | Mediante le decreto 156 se crea la Secretaria de Salud del Estado de México 13 de Diciembre de 2001 | Mediante el decreto 41 se publica el Código Administrativo del Estado de México 2004 | Se autorizó las modificaciones a la estructura del Instituto. 14 de Junio de 2004 | Día Mundial del Donante de Sangre 2005 |Se aprueba la estructura de la Unidad Estatal de la Protección Social 2007 | Los Bancos de Sangre luchan a través de campañas por la donación altruista de sangre, para abastecer la alta demanda. |

¿QUÉ ES UN BANCO DE SANGRE? Un banco de sangre es la entidad encargada o responsable de la selección del donante, recolección, análisis, procesamiento, almacenamiento, en la distribución de la sangre y sus componentes, en las pruebas del receptor, siguiendo estrictos controles de calidad. 1. SELECCIÓN Los servicios de banco de sangre promoverán la donación voluntaria, altruista y repetitiva de sangre a través de programas de educación a la población. Los donantes serán sometidos a un proceso de selección, que incluye una entrevista médica y examen físico, para asegurarse que cumplan con las normas establecidas de selección del donante, además se le realiza un examen de laboratorio pre donación que consiste en la hemoglobina y hematocrito y el tipaje sanguíneo. 2. RECOLECCIÓN: Los insumos utilizados para la donación deben ser estériles y desechables. La sangre será recolectada utilizando métodos asépticos y en sistemas estériles cerrados (bolsas para colectar sangre deben estar transparente, estériles y con el anticoagulante claro) 3. ANALISIS: La metodología que se emplea para evaluar las enfermedades que pueden ser transmitidas por transfusión de hemoderivados a evolucionado velozmente en conjunto con todos los avances tecnológicos. Con el pasar de los años se han

ido incorporando técnicas para detectar nuevos agentes infecciosos y la tecnología cada día evolucionará más. Las pruebas que son obligatorias realizar a cada donante de sangre en la República de Panamá son: 1. Hbsag (Antígeno de superficie de la hepatitis b) 2. Hbcore (anti-core de la hepatitis b) 3. H.C.V. (virus de la hepatitis c), 4. H.I.V., (Virus de la inmunodeficiencia humana), 5. CHAGAS (Enfermedad de chagas), 6. SIFILIS. 7. Rastreo de anticuerpos irregulares (Prueba de antiglobulina indirecta).

4. PROCESAMIENTO: La sangre puede ser separada en diferentes componentes: a. Glóbulos rojos b. Plasma c. Plaquetas d. Crioprecipitado del factor VIII Y fibrinógeno LA PRUEBA DE COMPATIBILIDAD: Es un procedimiento en la cual veremos si hay compatibilidad serológica entre la sangre de un donante y un receptor de sangre. Es una de la pruebas de mayor importancia que se realiza en un servicio de medicina transfusional. El propósito de la prueba de compatibilidad es asegurar no administrar sangre incompatible al paciente a quien se le ha solicitado la transfusión de la misma.

OBTENCION DE LOS HEMOCOMPONENTES 

SANGRE TOTAL: la unidad de sangre total es el producto que resulta de la adición de 63 mL de solución anticoagulante-conservadora a los 450 mL de sangre obtenida de un donante. Su almacenamiento se realiza a 4ºC y durante el mismo las plaquetas y los leucocitos dejan de ser funcionantes a los pocos días de la extracción así como los factores de la coagulación. Es por lo que en los Bancos de Sangre se procesa la sangre total para obtener los diferentes hemoderivados: concentrado de hematíes, concentrado de plaquetas, plasma fresco congelado. Ello permite administrar a cada paciente únicamente el componente que precisa.

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CONCENTRADO DE HEMATÍES: el concentrado de hematíes es el componente que se obtiene después de haber retirado 200 a 250 mL de plasma de una unidad de 450 mL de sangre total tras haber sido centrifugada. Está indicada su transfusión en las anemias crónicas sintomáticas no corregibles por otras medias terapéuticas y en las pérdidas moderadas o agudas de sangre asociado a otros hemoderivados.

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CONCENTRADO DE HEMATÍES CONGELADOS: son hematíes que han sido congelados y almacenados a bajas temperaturas en presencia de un crioprotector que es eliminado por lavado antes de la transfusión. Se utiliza como método de autotransfusión de enfermos polisensibilizados y como conservación de fenotipos raros.

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CONCENTRADO DE HEMATÍES LAVADOS: son los hematíes que quedan después de lavar un concentrado de hematíes con suero fisiológico, eliminando la mayor cantidad posible de plasma. Se utiliza en pacientes con déficit de IgA, y en aquellos que presenten reacciones alérgicas graves a las proteínas plasmáticas.

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CONCENTRADO DE HEMATÍES POBRE EN LEUCOCITOS: son los hematíes que quedan después de retirar el contenido de leucocitos. Puede realizarse después de la recolección en los Bancos de Sangre o con filtros de desleucocitación en el momento de la transfusión. Su uso estaría indicado en pacientes que presenten reacciones de escalofríohipertermia por anticuerpos antileucocitarios; en prevención de la aloinmunización por anticuerpos leucoplaquetarios; y como alternativa a productos citomegalovirus negativos. Actualmente todos los hemoderivados se desleucocitan en los bancos de sangre antes del almacenamiento.

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CONCENTRADO DE PLAQUETAS: es aquel preparado que contiene las plaquetas obtenidas por separación de una unidad de sangre total (plaquetas random) o de un solo donante por citaféresis. La transfusión de plaquetas se usa terapéuticamente en enfermos con hemorragia por trombopenia o trastornos funcionales de las plaquetas.

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PLASMA FRESCO CONGELADO: una unidad de plasma fresco congelado es el componente que se obtiene tras centrifugación de una unidad de 450 mL de sangre total en las seis horas que siguen a su obtención. Tiene un volumen que oscila entre 200-250 mL. Puede almacenarse hasta un año a 30ºC. El plasma de donante único, puede obtenerse en mayores cantidades mediante plasmaféresis. Su transfusión está indicada en pacientes con sintomatología hemorrágica y alteraciones de las pruebas de la coagulación. Dada la presencia de isoaglutininas de grupo ABO, el plasma a transfundir debe ser isogrupo ABO con el receptor, o compatible. Otro uso del plasma fresco es como materia prima para la obtención de hemoderivados como albúmina, inmunoglobulinas, factores de coagulación, etc.

ALMACENAMIENTO DE LOS HEMOCOMPONENTES Los métodos para el almacenamiento de los hemocomponentes HEMOCOMPONENTE

TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO

SANGRE TOTAL Y GLOBULOS ROJOS EMPACADOS

1-6º C

PLASMA FRESCO CONGELADO

-18º C PREFERIBLE A -30º C

CRIOPRECIPITADO

-18º C PREFERIBLE A -30º C

PLAQUETAS

21-22º C

La conservación de los hemocomponentes depende en gran parte de la temperatura de almacenamiento. Es por este motivo que los derivados de la sangre requieran un control estricto y monitoreo de las condiciones en las que se conservan, por lo que es importantísima la existencia de un sistema de alarma que no indique cualquier variación en la temperatura de conservación de los hemoderivados.

TRANSPORTE DE LOS COMPONENTES SANGUÍNEOS Los bancos de sangre deben disponer de un método de transporte de los componentes sanguíneos ejemplo: HEMOCOMPONENTE G.R.E.

TªC 1-10º C

P.F.C. , CRIOPRECIPITADO

PLAQUETAS

2024º C

RECOMENDACION

SOLUCIONES UTILIZADAS

La solución refrigerante no debe estar en contacto Barras de hielo, refrigerantes con el producto a químicos o barras congeladas transporta Mucho cuidado con el empacado es muy frágil

Hielo seco

Distancias cortas usar cajas de poli estireno almacenadas a 20-24º C.

Para distancias largas se necesitarán refrigerantes químicos o contenedores especiales

AREAS DEL BANCO DE SANGRE El Banco de sangre tiene como misión evaluar muestras biológicas, por medio de procedimientos que dan resultados confiables ya que la sangre es sometida a procesos estrictamente controlados con calidad e higiene, para la cual esta institución requiere y se divide de secciones especializadas en estos procesos:

1. RECEPCIÓN Y SALA DE ESPERA Es un espacio con iluminación adecuada amplia y limpia la cual debe tener una ambientación adecuada para darle al donante una buena experiencia al donar sangre.

2. ÁREA DE TRABAJO SOCIAL Es un cubículo para el registro confidencial de datos que identifica al candidato a donar para la historia clínica.

3.

ÁREA DE EXTRACCIÓN

Después de que el candidato a donar es entrevistado pasa a la toma de muestras de sangre, para realizar el procesamiento de la biometría hemática y examinar si la cantidad de hemoglobina, hematocrito, leucocitos y plaquetas, se encuentran dentro de rangos de normalidad. Asimismo, la muestra de sangre es centrifugada para observar las características macroscópicas del plasma y determinar si está lipémico o no. Los candidatos a donar que tienen plasma lipémico son diferidos o descartados, sugiriéndoles solicitar atención médica correspondiente por dislipidemia. Los resultados obtenidos son entregados al médico quien valoró al disponente para completar la selección del donador. El suero lipémico es

el que se obtiene cuando un paciente tiene el colesterol y los triglicéridos muy alto. Ese suero extraído de la sangre tiene aspecto lechoso por la gran cantidad de grasas que contiene. La persona diagnosticada como APTA para donar puede hacer donación de sangre completa y pasar al Área de flebotomía. O bien, donar sólo plaquetas y en este caso pasará al Área de aféresis .Al terminar la donación se brindan las recomendaciones para la pronta recuperación y cuidados después de la misma.

4. ÁREA DE FRACCIONAMIENTO HEMOCOMPONENTES:

Y

CONSERVACIÓN

DE

Aquí se reciben las unidades de sangre completa, son sometidas a un procedimiento de centrifugación con temperatura controlada y después separada en sus diferentes componentes: concentrado eritrocitario, concentrado plaquetario, plasma fresco y crioprecipitado (parte insoluble del plasma), para ser almacenados en las mejores condiciones de temperatura y seguridad.

5. ÁREA DE SEROLOGÍA INFECCIOSA En esta área se realizan los estudios de marcadores infecciosos como detección de anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis B, anticuerpos contra el Treponema pallidum, el Tripanosoma cruzi, Se hace el VDRL y brucella.

6. PRUEBAS CRUZADAS Las pruebas cruzadas pre transfusionales detectan reacciones Ag-Ac potenciales antes de que la sangre sea transfundida. Cada unidad de sangre extraída debe ser examinada y clasificada de forma individual para descartar incompatibilidades entre el donante y el receptor, a fin de que la transfusión se realice con las máximas garantías.

7. ÁREA DE INMUNOHEMATOLOGÍA. En esta área se realiza la determinación de grupos sanguíneos ABO y Rh (D), fenotipo del Rh, pruebas de compatibilidad, rastreo de anticuerpos irregulares, pruebas de coombs directo y coombs indirecto además de realizarse la Biometria hemática.

EQUIPOS DE BANCO DE SANGRE

AUTOMATIZACIÓN: Neo Galileo Equipo completamente automatizado grande de última generación para pruebas inmunohematólogicas. Características principales: 1. Sistema completamente automatizado 2. Acceso continuo para muestras, reactivos y soluciones 3. Lectura de códigos de barras para muestras reactivos y microtiras 4. Capacidad de hasta 244 muestras y 15 microplacas a bordo 5. Posibilidad de programar muestras de emergencia (STAT) 6. Amplio menú de pruebas 7. Almacenamiento e interpretación de resultados por foto 8. Conexión al Sistema Informático de Banco de Sangre Menú de Pruebas: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Determinación de Grupo Sanguíneo globular e inverso Determinación de Fenotipo eritrocitario Detección de Anticuerpos Irregulares Identificación de Anticuerpos irregulares Pruebas Cruzadas IgG Prueba de Antiglobulina Directa Estudio de Anticuerpos plaquetarios

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REFRIGERADOR PARA BANCO DE SANGRE Los refrigeradores para laboratorio, usos generales y banco de sangre están diseñados para brindar un correcto almacenamiento y preservación de productos farmacéuticos, medicamentos, reactivos, sangre y más. Aseguran que el producto se almacena en las mejores condiciones sanitarias y de temperatura, con un esbelto sistema de supervisión de alarmas y graficador de temperatura o datta logger de temperatura. Enfriamiento por aire forzado mediante el difusor colocado en la parte superior para tener temperatura homogénea y constante. El difusor se detiene al abrir la puerta. Se tiene uniformidad de +/- 1 º (Cuenta con certificación de calibración de planta). Deshielo automático con el desagüe al exterior y evaporación del deshielo. Control completo del refrigerador por microprocesador para mantener la temperatura entre 2º C a 8 ºC (configurable) en temperaturas ambientales de 42ºC. El controlador cuenta con un retardador de voltaje de cuatro minutos El display de temperatura y alarmas con dos dígitos y un número decimal . Alarmas audible y visual con batería de respaldo auto recargable para 48 horas (cuenta con indicador en caso de batería baja) para los siguientes casos: Temperaturas mayores a 8 º C y menores a 2 º C (configurable) Falla de suministro eléctrico Puerta abierta por más de 1 minuto (configurable) Falla de sensor de temperatura Batería baja Sistema con capacidad para conectar varias alarmas remotas Puerta con doble panel de vidrio termoestable con gas argón entre sus paneles. Con manija ergonómica y sistemas de auto cierre, empaque magnético que ofrece un sellado hermético y cerradura de seguridad con llave duplicado que no contacta el interior. Paneles externos en lámina galvanizada electrolíticamente cubierto con pintura epódica. Panel interior en acero inoxidable 304. Sin partes filosas, rebabas o sobrantes de material. Aislado con poliuretano de 38 kg/m3 de 5 cm de espesor, libre de CFC Compresor herméticamente sellado, silencioso y libre de mantenimiento Refrigerante ecológico libre de CFC (R134a) Condensador libre de mantenimiento Iluminación interior en luz blanca (luz fría) con switch en exterior 4 patas con base aislante niveladoras Alimentación eléctrica: 115V a 60 Hz con clavija polarizada

CENTRIFUGA REFRIGERADA La centrífuga de sobremesa para laboratorio con refrigeración LMC4200R proporciona control de temperatura del material biológico durante la centrifugación. El control de temperatura del denominado “estante frío” es un método de referencia para los enzimólogos y biólogos celulares porque garantiza las condiciones necesarias para la reproducibilidad de la etapa de preparación de muestras. La ausencia de control de temperatura en esta etapa puede causar resultados impredecibles. La LMC-4200R es una centrífuga moderna diseñada para funcionar con placas de microanálisis y tubos de 10 a 50 ml. Características:   

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Velocidad eficiente de refrigeración de la cámara: menos de 10 min. Mantenimiento de temperatura estable durante el funcionamiento. Configuración fácil de usar de los parámetros de centrifugación (velocidad, temperatura y tiempo) y visualización simultánea de los valores definidos y los valores reales. Específica para 12 tubos Funcionamiento seguro garantizado por la cámara de protección de metal y la cubierta del dispositivo, la parada automática en caso de desequilibrio (parada de emergencia, se muestra "DESEQUILIBRIO") y un bloqueo que mantiene la tapa cerrada mientras la centrifugadora está en funcionamiento. Selección del rotor;* Ajuste de la velocidad del rotor en RPM o RCF;* Múltiples modos de aceleración (Slow, Normal, Fast) y deceleración (0, Slow, Normal, Fast) y posibilidad de desactivar el frenado forzado;* Nivel de ruido bajo. Amplia elección de rotores accesorios.

AGITADOR DE EXTRACCIÓN AUTOMÁTICO PRESVAC AE-500ª El modelo AE-500A es mucho más que un sistema para la automatización de las donaciones de sangre. Es un equipo para monitorear y almacenar automáticamente todas las donaciones del banco de sangre que además le permite transferir los datos de las extracciones directamente a su computadora.    

Agitador de extracción y balanza digital con corte por volumen. Programación del volumen a extraer. Alarmas ópticas y audibles. Batería para funcionamiento en caso de corte eléctrico. CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS El AE-500A es un sistema simple, con un menú de comunicación con el usuario, que permite en forma rápida y segura la standarización y el control de las donaciones en un banco de sangre con transferencia de datos a través de una salida RS-232 y el procesamiento de los mismos por medio de nuestro software "SPCE".

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Programación del volumen a extraer. Tara automática de la bolsa y anticoagulante. Clamp de obturación de tubuladura automático y manual. Alarmas luminosas y audibles. Control y alarma de flujo bajo y alto. Control y alarma indicadora de falta de tubuladura. Agitación permanente de la unidad extraída. Pantalla de Cristal Líquido (PCL) de dos líneas por 16 caracteres con información de tiempo de donación, flujo de donación (ml/s), volumen colectado y alarmas. Programación de las variables en Español, Inglés y Portugués. Interfase de conexión a computador por salida RS-232. Almacenamiento de hasta 500 donaciones con todos los parámetros. Indicación automática de colocación de etiqueta en la bolsa. Manijas de transporte en el gabinete. Sistema de autocalibración. Batería de autocarga. 48 hs. de autonomía de batería en uso. Indicadores de estado de la batería.

MÁQUINA DE AFÉRESIS – 81000 DESCRIPCIÓN 

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Sistema automático de aféresis portátil, para la colección de plaquetas, plasma, concentrado eritrocitario y doble concentrado eritrocitario leucodepletados. Flujo continuo, unipunción, colección de componentes sanguíneos fuera de la centrífuga Pantalla touch screen Software en español Peso 96 Kg Sellador dieléctrico integrado (opcional) Memoria en caso de falla de energía Sensores de presión y ópticos para mantener la seguridad del donador

AGITADOR DE PLAQUETA LINEAL PRESVAC AP-96L La línea de agitadores de plaquetas de Presvac ofrece una amplia gama de capacidades y formas de almacenamiento de plaquetas.  Capacidad: 96 unidades de plaquetas / 32 bolsas de Apheresis.  Bandejas en una sola pieza perforadas para una circulación uniforme de aire.  Rodamientos de resina acetal permiten que la plataforma de almacenamiento tenga una agitación suave.  Motor libre de mantenimiento con forzadores de ventilación.

ANALIZADOR ELISA El analizador de ELISA es un espectrofotómetro especializado que dispone de filtros o rejillas de difracción que limitan el rango de longitudes de onda comprendidas entre los 400 y los 750. El sistema óptico es la fibra óptica para llevar la luz hasta los pozos de la placa, donde se encuentra la muestra bajo análisis. La luz que atraviesa la muestra tiene un diámetro que varía entre 1 y 3 mm. Un sistema de detección determina la absorbancia y, a través de un sistema de lectura, la convierte en datos que permiten interpretar el resultado de la prueba.