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Simposio: “Actualización de Análogos de GnRH” FISIOLOGÍA DEL GnRH, MECANISMOS DE ACCIÓN DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAS. Dr. Carlos Libertun IBYME-CONICET y Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, UBA.

Introducción Quisiera referirme en esta charla a una molécula que modificó profunda y positivamente el ejercicio de la medicina de la reproducción: la hormona hipotalámica liberadora de gonadotrofinas o GnRH. Su hallazgo y la dilucidación de la estructura química primaria fue un hito fundamental. Tres décadas después, aun nos sorprenden los aportes conceptuales que este descubrimiento hace a la comprensión de la fisiología y fisiopatología de distintos cuadros nosológicos, y a la potencial aplicación terapéutica de las moléculas análogas derivadas del GnRH. El GnRH es un decapéptido, (piro) Glu - His Trp - Ser - Tir - Gli - LeuArg - Pro - Gli - NH2, que es secretado por un pequeño número de neuronas encefálicas a la circulación portal, por la que llega a la adenohipófisis y libera LH y FSH por acción directa sobre los gonadotropos. Al actuar sobre sus receptores específicos en la adenohipófisis ejerce variadas acciones, algunas bien caracterizadas mientras que otras no totalmente esclarecidas. Se conocen las acciones sobre la síntesis y secreción de FSH y LH, como también sobre la expresión de sus propios receptores. Además, mantendría la integridad estructural y funcional de los gonadotropos (1).

frecuencia de descarga se acelera por la acción fundamental de los estrógenos. También sería de importancia la relación de la neurona decapeptidérgica con la glía y endotelio adyacentes. La importancia de esta discreta red neuronal, que utiliza distintos neurotrasmisores, es crítica para la regulación de la secreción de gonadotrofinas y consecuentemente para la gametogénesis y secreción gonadal, y debe considerarse en la práctica que todo fármaco que actúa sobre el sistema nervioso central puede, potencialmente, alterarla. Durante el desarrollo, las neuronas decapeptidérgicas son un caso único de migración centrípeta en el encéfalo, pues se originan por fuera del mismo en la placoda olfatoria. Migran a través del primer par craneano hasta ubicarse, aproximadamente la mitad de las neuronas migrantes, en la región hipotalámica. Desde aquí envían sus axones al plexo portal primario. La otra mitad de neuronas GnRH se ubican en otras regiones, no llegando a tener terminaciones secretoras en el plexo portal; utilizarían al decapéptido como neurotransmisor o neuromodulador en circuitos neurológicos relacionados con la reproducción y la conducta sexual. El origen de estas neuronas en la placoda, explicaría los hallazgos de los casos clínicos en los que, trastornos de la olfación, se asocian con hipogonadismo como en el Síndrome de Kallman (2-3).

La neurona decapeptidérgica El GnRH y sus variantes moleculares naturales En el adulto los somas de la neurona GnRH se distribuyen difusamente a través de la base del cerebro anterior. Un grupo, de 500 a 1000 neuronas, se organizan en un centro pulsátil, único, en la región basal del hipotálamo. Si bien cada neurona tiene una pulsatilidad intrínseca, propia, individual, todas ellas se coordinan en dicho centro, intercomunicadas como una red, para liberar GnRH a la circulación portal, sincrónicamente cada 45-60 minutos. Sobre dicho centro actúan influencias centrales y periféricas que modulan la pulsatilidad del mismo. Por ejemplo, hacia la mitad de ciclo menstrual y antes y durante el pico de FSH y LH, la 18 Revista de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

La GnRH se cliva de una preprohormona en las neuronas hipotalámicas. El cDNA de la preproGnRH humana fue clonado. Codificaría una proteína de 921 aminoácidos en la que el decapéptido es precedido por un péptido señal de 23 aminoácidos y continuado por una secuencia Gly-Lys-Arg donde se cliva y procede la amidación del terminal carboxílico, y un fragmento asociado de 56 aminoácidos (GAP). Este último, el péptido asociado GAP, fue postulado como inhibidor de la secreción prolactínica pero esto no se confirmó in vivo. El gen GnRH humano descripto originalmente

(GnRH I), tendría una compleja regulación de su expresión por acciones de los factores de transcripción y las hormonas esteroides y peptídicas relacionadas con la reproducción. Estudios filogenéticos indican que el GnRH es una molécula muy antigua y que durante la evolución, a partir de un gen ancestral común, se derivaron distintas formas moleculares. Hasta hoy se describieron 15 distintas variantes moleculares del GnRH, desde peces a mamíferos, y al menos dos, incluyendo la descripta precedentemente (GnRH I), se hallan en los antropoides. Al GnRH I, aislado originalmente de mamíferos y presente en humanos, se suma el encontrado primeramente en aves y luego en mamíferos, llamado cGnRH II. Se postula que durante la evolución estos péptidos adquirieron distintas funciones reguladoras en el SNC, y fuera del mismo donde también se los halla. En SNC actúa como hormona reguladora de las g o n a d o t rofinas y como neuro t r a n s m i s o r / neuromodulador; en gónadas, placenta y en ciertos tumores actuaría como regulador paracrino (4-5). Receptores al GnRH La primera acción del GnRH para ejercer su efecto en el gonadotropo, es reconocer y unirse con gran afinidad y especificidad a un receptor de membrana, el GnRH-R. Es éste una estructura de 328 aminoácidos en el humano, con variantes según la especie, y siete dominios transmembrana acoplados a la proteína G. El primer receptor hallado, GnRH I-R, carece de una región C terminal intracitoplasmática como se encuentra en otros receptores ligados a proteína G. También el tercer loop intracelular es relativamente corto. Ambas características son importantes para la internalización y desensibilización de los receptores que utilizan la proteína G. En cambio, un receptor recientemente descripto en peces, anfibios y también en primates, el GnRH II-R, tiene una pequeña cola carboxílica citoplasmática y luego de su unión al GnRH II, se fosforila, internaliza y desensibiliza. En resumen, el hallazgo de variantes moleculares del GnRH en las diversas especias, más el distinto efecto del decapéptido según el tejido, llevó lógicamente a postular la posibilidad de más de un GnRH-R. Así se identificaron algunos de ellos en vertebrados, que difieren en el tercer loop extracelular y la cola intracelular, que podría distinguir entre las distintas variantes del péptido. Se postula que un GnRH-R ancestral, dio origen a distintos receptores que evolucionaron en paralelo con sus ligandos. El GnRH-R se identificó primero en los gonadotropos adenohipofisarios. Con el aislamiento

del GnRH-R cDNA, la expresión de GnRH-R mRNA fue hallado en otras áreas como distintas regiones cerebrales y órganos tales como ovario, testículo y placenta. Experimentalmente se observó que en muchos órganos el efecto del GnRH inhibe la diferenciación y crecimiento celular. Esto se debería a la existencia de distintos receptores o cascada de segundos mensajeros, diferentes a la que emplearía el decapéptido en el gonadotropo. Estas diferencias en el receptor GnRH y/o en el segundo mensajero según el órgano, tiene enorme importancia práctica pues abre la posibilidad de hallar análogos con efecto selectivo y exclusivo sobre un grupo celular. Nuevos estudios serán necesarios para precisar la importancia relativa de estos receptores en la fisiología reproductiva del humano, y los efectos farmacológicos de los análogos. En cuanto al modelo tridimensional molecular del receptor, incluye la disposición hacia el exterior de un “bolsillo” hidriofílico determinado por la disposición de los loops, con cuatro lugares de interacción con el agonista, y que resulta de importancia para la unión de los fármacos. El número de GnRH-R en la hipófisis es regulado por el estado endócrino. Aumentan justamente antes del pico preovulatorio de gonadotrofinas y luego decrece. Su cantidad aumenta por la gonadectomía y decrece por los andrógenos, la preñez y la lactancia. Muy importante es el efecto que ejerce el propio decapéptido sobre su receptor. La acción dependería de la concentración y frecuencia del los pulsos que llegan a los receptores. Así, se ha observado que la respuesta secretora es mayor ante un segundo pulso de GnRH que ante el primero, si los pulsos están separados por un tiempo definido. A este efecto se lo denomina de self-priming o autopotenciación. A cantidades fisiológicas del péptido, se observa inicialmente una caída en el número de receptores (down regulation), con menor respuesta del gonadotropo. Esta fase primera es seguida por una segunda de aumento en el número de receptores (upregulation), pero que no implica un mayor sensibilidad del gonadotropo. Esto se debería a que los gonadotropos responden cerca del máximo secretor, con sólo 20 % de los receptores ocupados. Concentraciones pequeñas, fisiológicas, del decapéptido estimulan la síntesis del receptor y lo mantiene a niveles fisiológicos, en cambio concentraciones altas y constantes provocan downregulation de los receptores y desensibilización de los gonadotropos, por complejos mecanismos como la internalización del complejo receptorGnRH y modificaciones en los segundos mensajeros. Revista de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

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La importancia de estos eventos es que explicarían la base del uso farmacológico del GnRH y de sus agonistas, ya que su administración masiva y continua lleva, luego de una descarga inicial de FSH y LH, a la supresión de la secreción gonadotrofica (6-10). Mensajeros secundarios en el gonadotropo Luego del estímulo con GnRH se incrementa el metabolismo de los fosfolípidos, el calcio intracelular, y se acumula inositol fosfato en el gonadotropo. Al unirse el GnRH a su receptor y mediado por las proteínas G (Gq y G11), activa la fosfolipasa C y la hidrólisis del fosfatidilinositol en inositoltrifosfato y diacilglicerol, que activan finalmente la proteinquinasa C. El calcio intracelular, movilizado desde sus depósitos e ingresado desde el exterior por canales voltaje dependientes, juega un papel fundamental tanto en los procesos de transmisión de señales intracelulares como en los secretorios de FSH y LH. También se ha demostrado que el GnRH-R puede acoplarse a otras proteínas G como la Gi y la Gs, inhibiendo o estimulando la adenilato ciclasa, además de activar otras fosfolipasas, la vía de las quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y la vía de las tirosina quinasas. Por lo tanto, distintos segundos mensajeros pueden estar involucrados en generar la multiplicidad de respuestas observadas ante un estímulo de GnRH (11). Análogos Peptídicos El uso farmacológico, clínico, de moléculas análogas al decapéptido es muy frecuente. Se han desarrollado análogos al decapéptido original por sustitución de uno o varios aminoácidos del mismo, que son activos por vía endovenosa, intramuscular, subcutánea o por vía nasal, pero no por vía bucal. El uso clínico del GnRH y sus análogos puede ser con fines terapéuticos, para inducir la descarga de LH y la ovulación; o en otros casos para provocar hipogonadismo hipogonadotrófico en ciertos tumores hormonodependientes, endometrosis, pubertad precoz, etc. y como medio de diagnóstico, para distinguir un trastorno de la secreción gonadotrófica de origen hipofisario de otro extrahipofisario. Con estos análogos se busca alguna ventaja sobre el decapéptido original para su utilización médica; por ejemplo aquellos de larga duración pueden requerir sólo una aplicación mensual. En general los análogos tienen mayor afinidad por el receptor que la hormona endógena y permanecen unidos más tiempo. En una primera fase, el análogo se une al receptor y descarga FSH y 20 Revista de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

LH, a veces masivamente (acción agonista), pero luego de agotado el gonadotropo y permanecer unido al receptor evita la acción del GnRH endógeno, llevando a la hiposecreción gonadotrófica, a veces duradera, e hipogonadismo (acción antagonista). El mecanismo sería de down regulation y desensibilización, implicando mecanismo de recepción y postrecepción en el gonadotropo, y que llevan al hipogonadismo farmacológico. Primeramente se logro el bloqueo selectivo de la secreción gonadotrófica mediante el empleo contínuo del GnRH original, poco práctico, y luego más fácilmente mediante agonistas de larga duración. En ambos casos el GnRH o el agonista se une al receptor del gonadotropo persistente, pero reversiblemente, de tal manera que desaparecido el fármaco desaparece la hipogonadotrofinemia y el hipogonadismo. La modificación de la secuencia aminoacídica, aun el cambio de un solo aminoácido, puede alterar la conformación tridimensional del péptido y la interacción con el “bolsillo” exterior en el receptor. Puede actuar como agonista o antagonista, dependiendo del segundo loop extracelular del receptor. Esquemáticamente la re p re s e n t a c i ó n tridimensional del decapéptido indica un plegamiento alrededor de la glicina en posición 6, y así es unido al receptor. La substitución en dicha posición por D aminoácidos estabiliza la molécula y decrece su metabolismo. Mientras que ambos extremos están involucrados en la unión al receptor, el amino terminal también lo está en la activación y el reemplazo aquí da lugar a los antagonistas. P e ro el uso de agonistas tiene ciertos inconvenientes. Primeramente, hay una estimulación inicial de la secreción gonadotrófica que puede durar días o semanas, y provocar efectos indeseables y contraproducentes al comienzo del tratamiento. Por otro lado, al ser sólo activo por vía inyectable o por vía nasal hace mas difícil su dosificación, con posible aparición de efectos locales en la zona de inyección. En general son fármacos caros. Todas estas razones afecta la aceptación por parte del paciente. Llevó años conseguir antagonistas que reúnan las condiciones para su uso ventajoso en clínica. Estos antagonistas se unen al GnRH-R y bloquean la llegada del decapéptido endógeno, lo que lleva directamente a la hiposecreción de FSH y LH, es decir sin la descarga inicial de las mismas como lo hacen los agonistas. Actuarían por competencia del antagonista con el péptido endógeno por unirse al receptor y el efecto es reversible. La primera generación de antagonistas eran moléculas hidrofílicas y

reemplazaban His en posición 2 y Trp en 3. Luego, la incorporación de D-aminoácidos en posición 6, como el detirilex, aumentaba la actividad antagonista, pero incrementaba también el efecto liberador de histamina lo que limitaban su uso clínico. En una tercera y reciente generación de antagonistas este efecto indeseable se neutralizó reemplazando el D Arg por D-ureideoalkil aminoácidos en posición 6, como el Abarelix, Antarelix, Cetrorelix, Genirelx e Iturelix. Llamativamente si bien ambas gonadotrofinas caen abruptamente por los antagonistas, el descenso es menos drástico para la FSH, sugiriendo la coexistencia de otro mecanismo regulador para esta hormona. Los nuevos antagonistas brindarían una mejor farmacodinamia, baja toxicidad y mayor tolerabilidad y permitirían una amplia aplicación clínica. El empleo sería en las situaciones en las que se desea inhibir reversiblemente la secreción gonadotrófica; por ejemplo, la prevención inmediata del pico normal de LH en tratamientos de fertilidad o, más indirectamente, bloqueo de la secreción gonadal por hipogonadotrofinemia en casos de patologías dependientes de las hormonas ováricas y testiculares. Otro indicación es la inhibición directa del antagonista sobre ciertos tumores (12-14). Antagonistas no peptídicos Los agonistas y antagonistas peptídicos requieren su administración, muchas veces como preparados de larga duración. Un gran esfuerzo se está desarrollando para la obtención de antagonistas no peptídicos que pueda ser administrado por vía oral. Esto representaría una enorme ventajas sobre los inyectables, como mayor aceptación por los pacientes, mayores facilidades de dosificación y economía. El comienzo y terminación de acción del fármaco puede ser facilitado por su administración oral en lugar del depot. Las moléculas no peptídicas que se están estudiando como base para el desarrollo de los antagonistas, varían enormemente en su química, y van desde algunas moléculas emparentadas con las benzodiazepinas, hasta otras como la relacionadas con el antimicótico ketocanazol. En general son moléculas pequeñas que ocuparían el “bolsillo” hidrofílico del receptor de GnRH. Si bien observamos hoy el advenimiento de los nuevos antagonistas que comienzan a adquirir preeminencia en la práctica diaria debida a sus ventajas sobre los agonistas, debemos considerar en los próximos años la posibilidad de contar con un nuevo grupo de antagonistas no peptídicos, activos por vía bucal y que se hallan actualmente en investigación (15).

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