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Amaranto:

Ciencia y Tecnología

Amaranto:

Ciencia y Tecnología

Editor

Eduardo Espitia Rangel

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Mejoramiento Genético de Cereales (Amaranto, Avena y Trigo) Celaya, Guanajuato, México Libro Científico No. 2 Diciembre 2012

Eduardo Espitia Rangel Nació en el rancho El Varal de Cabrera, Municipio de Abasolo, Gto. el 12 de agosto de 1957 en el seno de una familia campesina muy humilde. Estudió la carrera de Ingeniero Agrónomo en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro en Saltillo Coah., Maestría en Ciencias en el Colegio de Posgraduados y Doctorado en la Universidad de Nebraska en Lincoln con especialidad en mejoramiento genético de plantas. A la fecha ha publicado más de 75 artículos científicos, 6 libros, 54 publicaciones de difusión y divulgación, 37 tesis dirigidas o asesoradas, 15 capítulos de libro y ha participado en la liberación de 26 variedades mejoradas (16 de trigo, 6 de avena y cuatro de amaranto). Las líneas de investigación actuales comprenden mejoramiento genético de trigo, avena y amaranto en áreas como: conservación y uso de recursos genéticos, resistencia a sequía, contenido y calidad de proteínas en trigo, calidad forrajera de avena, mejoramiento genético para resistencia a enfermedades en cereales y genética biométrica. Actualmente es coordinador de la Red de Amaranto del Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos, Director Regional del CIR Centro del INIFAP y miembro del Sistema Nacional de Investigadores Nivel 3.

Amaranto: Ciencia y Tecnología Primera Edición 2012 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina Delegación Coyoacán, C.P. 04010 México, D.F. Teléfono (55)3871-8700 Derechos Reservados® ISBN: 978-607-425-897-4 No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la trasmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de la institución. Cita correcta: Autor(es) de capítulo. 2012. Título del capítulo. In: Espitia Rangel E. (ed). Amaranto: Ciencia y Tecnología. Libro Científico No. 2. INIFAP/SINAREFI. México, pp (páginas del capítulo consultado).

Eduardo Espitia Rangel Editor Crea Diseño Gráfico Diseño y diagramación

Diana Escobedo López Edición

Comité Editorial del CIRCE Presidente Dr. Eduardo Espitia Rangel Secretario Dr. A. Josué Gámez Vázquez Vocales M.C. Santa Ana Ríos Ruíz Dra. Martha Blanca G. Irizar Garza Dr. Francisco Becerra Luna Dra. Alma Velia Ayala Garay Dr. Alejandro Rodríguez Guillén Revisores Técnicos José Luis Anaya López, Erica Muñíz Reyes, Mario González Chavira, Víctor Montero Tavera, Oscar A. Grageda Cabrera, Gerardo Armando Aguado Santacruz, José Luis Pons Hernández, Luis Antonio Mariscal Amaro, Talina Olivia Martínez Martínez, Miguel Ángel Ávila Perches, José Roberto Augusto Dorantes González, Salvador Horacio Guzmán Maldonado, María Guadalupe Herrera Martínez, Alvaro Loza Peña y Bertha Larque Saavedra.

Al “nonillo” del Varal Municipio de Abasolo, Gto. y a todos los niños campesinos que han tenido que luchar inmensamente para llegar a ser alguien en la vida.

SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIÓN Lic. Enrique Martínez y Martínez Secretario

Lic. Jesús Aguilar Padilla Subsecretario de Agricultura

Prof. Arturo Osornio Sánchez Subsecretario de Desarrollo Rural

Lic. Ricardo Aguilar Castillo Subsecretario de Alimentación y Competitividad

Lic. Marcos Bucio Mújica Oficial Mayor

SERVICIO NACIONAL DE CERTIFICACIÓN DE SEMILLAS

INSPECCIÓN

Y

Ing. Enriqueta Molina Macías Directora General del SNICS

M. en C. Rosalinda González Santos Subdirectora de Recursos Fitogenéticos

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Dr. Pedro Brajcich Gallegos Director General

Dr. Salvador Fernández Rivera Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación

M.Sc. Arturo Cruz Vázquez

Coordinador de Planeación y Desarrollo

Lic. Marcial García Morteo

Coordinador de Administración y Sistemas

CENTRO DE INVESTIGACIÓN REGIONAL CENTRO Dr. Eduardo Espitia Rangel Director Regional

Dr. Alfredo Josué Gámez Vázquez Director de Investigación

Dr. Mario Martín González Chavira Director de Planeación y Desarrollo

C.P. Manuel Ortega Vieyra Director de Administración

CAMPO EXPERIMENTAL BAJÍO M.C. Roberto Paredes Melesio Jefe de Campo

Autores Alma Velia Ayala-Garay

Diana Escobedo-López

Ana Paulina Barba-de la Rosa

Dora María Sangerman-Jarquín

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C., San Luis Potosí, S.L.P.

Araceli Díaz-Ortega

Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Coyoacán, México, D.F.

Ariana Navarro-Meléndez

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Bajío, Celaya, Guanajuato.

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Eduardo Espitia-Rangel

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Bajío, Celaya, Guanajuato.

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Enrique Maldonado-Cervantes

Aurora Montúfar-López

Erandi Vargas-Ortiz

Axel Tiessen

Erica Muñiz-Reyes

Carlos Alberto Núñez-Colín

Fannie Isela Parra Cota

Ciro. G. S. Valdés-Lozano

Gabriel Alejandre-Iturbide

Subdirección de Laboratorios y Apoyo Académico, Instituto Nacional de Antropología e Historia, México, D.F.

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Bajío, Celaya, Guanajuato.

División de Estudios de Posgrado, Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Nuevo León, Marín, N. L.

Cristina Mapes-Sánchez

Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Coyoacán, México, D.F.

Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C., San Luis Potosí, S.L.P.

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Instituto Politécnico Nacional, Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Durango. Durango, Dgo.

Guadalupe Palomino

Laboratorio de Citogenética, Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Coyoacán, México, D.F.

Hugo S. Aguilar-Hernández

Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C., San Luis Potosí, S.L.P.

Javier Martínez

Laboratorio de Citogenética, Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Coyoacán, México, D.F.

Jesús García-Pereyra

Instituto Tecnológico del Valle del Guadiana, Durango, Dgo.

John P. Délano-Frier

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

José Ángel Huerta-Ocampo

Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C., San Luis Potosí, S.L.P.

José Blancas

Centro de Investigaciones en Ecosistemas. Universidad Nacional Autónoma de México. Campus Morelia. Morelia, Michoacán.

José Luis Arellano-Vázquez

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Juan Manuel Hernández-Casillas Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Julio A. Massange-Sánchez

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Lorena Cortés-Espinoza

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Luz Gabriela Campos-Silva

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Bajío, Celaya, Guanajuato.

Kena Casarrubias-Castillo

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Micaela de la O-Olán

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Miriam Jazmín Aguilar-Delgado

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Bajío, Celaya, Guanajuato.

Norma A. Martínez-Gallardo

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Paola A. Palmeros-Suárez

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Patricia Rivas-Valencia

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Paula A. Castrillón-Arbeláez

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Rubí V. Reyes

Laboratorio de Citogenética, Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Coyoacán, México, D.F.

Sara Hirán Morán-Bañuelos

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Campo Experimental Zacatepec.

Silvia Edith Valdés-Rodríguez

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato), Irapuato, Gto.

Víctor Cuauhtémoc Hernández

Ruiz-

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Valle de México, Coatlinchán, Estado de México.

Contenido Etnohistoria Amaranto (Amaranthus), planta ritual mesoamericana.

3-13

Tzoalli, de cuerpo de dioses a alegría de mortales.

15-27

Genética molecular El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento.

31-48

Identificación de genes de respuesta a estrés por calcio y sequía en amaranto.

49-58

Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés.

59-74

Análisis proteómico del amaranto, sometido a herbivoría y evocadores de resistencia a insectos.

75-84

Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros.

85-97

La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia.

99-111

Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano.

113-127

Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto

129-144

Recursos genéticos Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México.

147-163

Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp.)

165-181

Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura.

183-201

Distribución del amaranto cultivado y sus parientes silvestres y sus posibles zonas de adaptación en México.

203-211

Citogenética y mejoramiento genético Número cromosómico (2n) y cariotipo en especies de grano y verdura de Amaranthus spp. de México.

215-226

Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto.

227-247

Selección y adaptación de variedades criollas de amaranto (Amaranthus cruentus L.) en el Noreste de México.

249-256

Hábito de crecimiento de la inflorescencia y su relación con la calidad física y fisiológica de semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.).

257-265

Plagas y enfermedades Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.).

269-290

Proteínas y propiedades funcionales Caracterización bioquímica y estructural de las proteínas de reserva de amaranto.

293-302

Amaranto: propiedades benéficas para la salud.

303-312

Situación actual, rentabilidad y comercialización El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos.

315-330

La rentabilidad del amaranto en la Región Centro de México.

331-340

Formas de consumo del amaranto en México.

341-354

Presentación La Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), coordinado por el Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas (SNICS) desde el año 2002, a través del Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura (SINAREFI), cuyas actividades principales son llevar a cabo acciones conjuntas que contribuyan a la conservación, conocimiento y uso sostenible de los Recursos Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura (RFAA). Conforme al Plan Nacional de Acción para la conservación de los RFAA en México, operando como mecanismo de coordinación de asociaciones civiles, organizaciones no gubernamentales, universidades, centros de investigación y productores. En este sentido el SINAREFI ha promovido la integración de redes por género. De esta manera hace tres años se integró la Red Amaranto cuyo Plan de Acción consta de una serie de estrategias y acciones en cuatro áreas prioritarias: conservación y mejoramiento in situ, conservación y mejoramiento ex situ, uso y potenciación de los RFAA y creación de capacidades. El propósito fundamental de la Red Amaranto es colectar, estudiar, conservar y caracterizar el germosplasma de Amaranthus. Se pretende formar una colección nacional única de germoplasma de amaranto que incluya las colecciones institucionales y personales con fines de conservación y uso de la variabilidad genética de Amarathus; otro compromiso importante de la Red es posicionar el recurso ante la sociedad en general ya que la mejor forma de conservarlo será utilizándolo. Dentro de la estrategia de creación de capacidades se tiene planeado la producción de diversos medios de divulgación a fin de lograr un mayor conocimiento del amaranto entre investigadores, académicos, estudiantes, productores, transformadores y sociedad en general. Es dentro de esta estrategia que nació la idea de Amaranto: Ciencia y Tecnología; libro que contiene el estado del arte en el conocimiento de este recurso, el cual está integrado por las secciones que a continuación se describen. La primera parte denominada Etnohistoria donde se presenta información sobre el uso de Amaranto en México en ceremonias prehispánicas, la manera en que a partir de la semilla se elaboraba el tzoalli para representar a sus dioses y luego era consumido por quienes asistían a las ceremonias. Contiene también información de cómo estas costumbres todavía se conservan en algunas comunidades y se sigue utilizando el amaranto en rituales de petición y cómo se siguen elaborando figuras antropomorfas, zoomorfas y de cerros con tzoalli como parte de ofrendas.

La segunda sección está integrada por información sobre Genética molecular. Se presenta el transcriptoma de novo de Amaranthus hypochondriacus L. el cual se está usando como base para el estudio de respuestas a estrés hídrico y salino, de defensa contra insectos y patógenos, se dan avances para conocer de qué manera se promueve el crecimiento y rendimiento al ser inoculado con microorganismos benéficos del suelo. Se está evaluando la función de genes asociados con pigmentación a la resistencia a estrés; esta información será de utilidad para la selección asistida en el mejoramiento genético del amaranto. La tercera sección muestra temas de recursos genéticos en la que se exponen los avances en la recolección de germoplasma de especies cultivadas y parientes silvestres, además de la caracterización morfológica de colectas de las especies representadas en la colección. Contiene además, información sobre la distribución de especies en el territorio colectado. La cuarta sección describe aspectos sobre mejoramiento donde se presenta información sobre la citogenética de materiales mexicanos y la metodología para el cruzamiento artificial y selección genealógica para amaranto. Se integra información sobre evaluación de variedades criollas en el Norte del país y el efecto del crecimiento determinado de la inflorescencia sobre la calidad física y fisiológica de semilla. Otro tema que se cubre es sobre los aspectos fitosanitarios del cultivo donde se incluye información sobre las plagas y enfermedades más importantes del cultivo. La quinta sección trata sobre proteínas y propiedades funcionales. En esta parte se expone información sobre la caracterización bioquímica y estructural de las proteínas de reserva de la semilla de amaranto; información sobre la caracterización de péptidos con importantes funciones biológicas encriptados en estas proteínas. Se ofrece una visión general de los péptidos bioactivos presentes en las proteínas de la semilla de amaranto, así como de los compuestos fitoquímicos presentes en la semilla y planta de amaranto, los cuales son benéficos para la salud. Finalmente en la sección de situación actual, rentabilidad y comercialización se hace una descripción de la cadena en el país sus perspectivas y retos. Además de información de la rentabilidad del cultivo del amaranto y las formas de consumo en México. El INIFAP, el SINAREFI y los integrantes de la Red Amaranto desean que la información de Amaranto: Ciencia y Tecnología sea de utilidad y que coadyuve al posicionamiento de este cultivo en México.

Etnohistoria

Capítulo I

Amaranto (Amaranthus spp.), planta ritual mesoamericana AMARANTH (Amaranthus spp.) A MESOAMERICAN RITUAL PLANT

Aurora Montúfar López Subdirección de Laboratorios y Apoyo Académico Instituto Nacional de Antropología e Historia Moneda 16, Centro, México, D.F., C.P. 06060 Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN

ABSTRACT

En esta investigación se vierte información etnográfica sucinta sobre el ritual de petición de lluvias en Temalacatzingo, Guerrero, que se celebra el 25 de abril, de cada año, en la cima del cerro Quiauhtépetl. Se destaca la montaña como lugar de culto y se hace énfasis en el contenido de figuras antropomorfas, zoomorfas, de cerros, etc., elaboradas en masa de semillas de alegría (Amaranthus hypochondriacus L.) como parte de la ofrenda. Esta investigación se compara con el registro de semillas de Amaranthus sp dentro de las ollas Tláloc de algunas ofrendas del Templo Mayor de Tenochtitlan. Al final, a la luz de algunos datos etnohistóricos de la Nueva España, se patentiza la relevancia ceremonial de la masa de Amaranthus (tzoalli) para reproducir las imágenes de los dioses del agua, entre otras entidades divinas de los mexicas, en sus fiestas mensuales del calendario solar y el ciclo agrícola del maíz. Así, se constata la continuidad de la tradición cultural mesoamericana, reelaborada por la influencia de la liturgia cristiana.

This paper presents ethnographic information about the asking for rain ritual at Temalacatzingo, Guerrero, Mexico, which is celebrated each April 25th on the peak of Quiauhtépetl Mountain. The paper emphasizes the function of the mountain as ceremonial area and the artifacts left by the inhabitants as offering, particularly the anthropomorphic and zoomorphic figures made of alegría seeds (Amaranthus hypochondriacus L). It compares the data obtained with the seeds of Amaranthus sp found inside the ollas Tláloc of some offerings of the Templo Mayor of Tenochtitlan. Finally, based on colonial etnohistorical data, the paper stress the ritual relevance of amaranth dough or tzoalli as raw material of water gods’ images, which were used by the mexicas in their monthly rituals associated with the Solar Calendar and the cycle of maize. As conclusion, it proves the persistence of Mesoamerican cultural tradition, re-elaborated by the Chretien liturgy.

Palabras clave: ofrenda, mexicas, nahuas, tzoalli, Mesoamérica.

Key words: offering, mexicas, nahuas, tzoalli, Mesoamerica. 3-13

Amaranto: Ciencia y Tecnología

INTRODUCCIÓN Las ceremonias de propiciación de las lluvias, entre muchas otras fiestas religiosas ligadas al calendario agrícola en México, manifiestan la relación recíproca entre los dioses y el hombre, en el marco de la naturaleza que los hospeda y que es regida por los primeros; por ello los actores biológicos, entre otros materiales de ofrenda, reflejan en cierta manera, el pensamiento religioso y la concepción del mundo de los grupos culturales indígenas que han trascendido el tiempo y ahora se exhiben de forma sincretizada. El objetivo de este trabajo es describir el ritual de petición de lluvias en Temalacatzingo, Guerrero que se realiza, año con año, los días 25 de abril para celebrar a la Santa Cruz, advocación de la Madre Tierra y pedirle la pronta manifestación del temporal para empezar la siembra de maíz; asimismo, constatar la continuidad de la tradición cultural mesoamericana y la influencia de la liturgia cristiana sobre la misma. Se trata de una ceremonia organizada por un grupo de campesinos de habla náhuatl, que en un acto de reciprocidad, entregan a la entidad divina la “promesa” u ofrenda de materiales muy diversos y abundantes, como parte de un compromiso que se tiene para merecer la lluvia, bajo el código ideológico “doy para recibir”. Se enfatiza la relevancia de esos dones, en especial aquellos elaborados a base de masa de semillas de alegría; esta planta que de acuerdo con la etnografía (Neff, 2001; Villela, 2001), los datos arqueológicos (Montúfar, 1998; 1999a, 2007) y la información etnohistórica de la Nueva España (Durán, 1984; Sahagún, 2006; Ponce, 1987; Ruiz de Alarcón, 1987; Serna, 1987) goza, como vamos a documentar, de probada importancia ritual arqueológica, histórica y contemporánea, y es testimonio de la pervivencia de la reproducción cultural mesoamericana. En este estudio se hace referencia a importantes aspectos de la ritualidad indígena en México, se destaca la realización de las ceremonias de petición de lluvias en la cima de los cerros, el día de San Marcos (25 de abril) y de la Santa Cruz (3 de mayo) de cada año, siempre al final del lapso de sequía que contrasta con la temporada de lluvias en nuestro país. En Temalacatzingo, Guerrero se realizó el estudio 4

Aurora Montúfar López

del ritual de propiciación de lluvia, en los años 2007 y 2008; los datos recabados muestran los hechos sobresalientes de su ejecución, desde los preparativos hasta la entrega de la ofrenda, en la madrugada del 25 de abril, frente al altar de la Santa Cruz. Como parte del evento y de la ofrenda está la manufactura de figuras de masa de amaranto (angelitos, una gran serpiente y otros animales alusivos al agua, volcanes, estrellas y granizo), imágenes que guardan un gran simbolismo vinculado con el agua desde tiempos prehispánicos. La información histórica, arqueológica y etnográfica recabada es comparada y analizada, junto con los datos etnobotánicos de A. hypochondriacus L. (alegría o amaranto) y probablemente Amaranthus hybridus L., esta última especie responde a los nombres de huauhtli, quilitl, quelite, amaranto y bledo. El conocimiento recuperado plantea el uso ritual del amaranto como una tradición cultural de raigambre Mesoamericana. METODOLOGÍA El estudio etnográfico consistió en recabar información, entre los asistentes al ritual y los mayordomos, por medio de encuestas espontáneas y realizar las observaciones de campo pertinentes. Los datos obtenidos son la base para entender la relación de la comunidad campesina y sus entidades divinas, mismas que ante los ostentosos festejos y ofrendas que reciben, “abren el temporal para la siembra”. Como parte de la ofrenda hallamos materiales de masa de amaranto, la interpretación simbólica y ritual de estos se complementa con los datos arqueológicos del Templo Mayor de Tenochtitlan (Montúfar, 1998, 1999a, 1999b, 2007), en los etnohistóricos de los Cronistas de la Nueva España (Durán, 1984, Sahagún, 2006), y de los siglos XVI y XVII (Ponce, 1987, Ruiz de Alarcón, 1987, Serna, 1987). RITUALES DE PETICIÓN DE LLUVIAS, CERROS Y MILPA Los rituales de propiciación del agua se realizan en tiempo y forma con motivo de la siembra del maíz de temporal; el inicio de esta actividad depende del establecimiento de la estación anual de lluvias, ya que la siembra necesita de las

Capítulo I. Amaranto (Amaranthus), planta ritual mesoamericana

primeras precipitaciones pluviales. Los últimos días de abril y los primeros de mayo son los más calurosos del año y marcan el fin de la etapa anual de sequía; en este lapso las comunidades indígenas efectúan sus rituales por la lluvia. Dichas ceremonias están dedicadas a ciertos santos o vírgenes de la liturgia católica, pues esos númenes al parecer han tomado el lugar de las antiguas deidades autóctonas, entidades divinas que están relacionadas estrechamente con la naturaleza y el calendario agrícola. La expresión ritual propiciatoria del agua, entre otras, se remonta a la época prehispánica, cuando las fiestas por el temporal se hacían para honrar a Tláloc, la deidad telúrica de las tormentas, los rayos y el agua (Broda, 1971, 2004, 2008, 2009). Después de la conquista, los rituales a los dioses de la lluvia fueron combinándose con elementos de la iglesia católica y han sido objeto de profundos estudios de campo desde hace varias décadas, particularmente en el Altiplano Central y en el estado de Guerrero. Por ejemplo, al ritual de petición de lluvias, el tres de mayo, en Ameyaltepec (pueblo nahua del Alto Balsas, en Guerrero) lo llaman yalo tepetl, “la ida al cerro”, este concepto refleja la cosmovisión ancestral mesoamericana que imagina a los cerros como deidades atmosféricas que influyen en el ciclo meteorológico, pero también como los lugares donde se almacena el agua y los mantenimientos (Broda, 2001, Good, 2001a). Los mexicas hacían sacrificios de infantes, en los rituales de culto a los cerros, en analogía a los pequeños ayudantes del dios Tláloc, los tlaloques. La percepción de los infantes como propiciadores y vectores de la precipitación se reelabora y a la luz del catolicismo, se les imagina como “angelitos”, entidades que se encargan de continuar la labor de los tlaloques, es decir, los que acarrean las nubes cargadas de agua y que ayudan al crecimiento del maíz (Broda, 2004, 2008). Bajo esta perspectiva, en esta investigación se destacan los materiales de ofrenda elaborados con masa de semillas de alegría que son ofrendados a la Santa Cruz, por que empiece el temporal y se inicie la siembra de maíz. Para entender el uso de materiales de oblación de masa de amaranto en estos rituales, se necesita comprender algunos aspectos del

pensamiento religioso del grupo de campesinos nahuas que realizan esta práctica cada año y preparan y entregan la “promesa” a la Santa Cruz o Madre Tierra en su hábitat, la cima del cerro. En este sentido, a continuación se emiten algunas de las principales actividades y productos para esa ceremonia, incluyendo el amaranto. PREPARACIÓN DEL RITUAL DE PETICIÓN DE LLUVIAS EN TEMALACATZINGO La ceremonia de petición de lluvias o fiesta del copal, del barrio de Santiago en Temalacatzingo, Guerrero, se efectúa a las primeras horas de la mañana del 25 de abril, día de San Marcos, la organiza un grupo de agricultores de la localidad encabezados por un mayordomo (electo por ellos mismos), que con la participación de su esposa e hijos, coordina la preparación de la promesa y su entrega a la Santa Cruz, en el cerro Teopan o Quiauhtépetl. El 24 de abril de los años 2007 y 2008 tuve la oportunidad de presenciar este festejo y hacer las anotaciones pertinentes; ese día, por la tarde, la gente se dio cita en el domicilio del mayordomo (señores Juan Máximo Flores en 2007 y Santiago Rosendo Almazán Reynosa en 2008) para comenzar los arreglos y preparación de la promesa. Previamente los responsables del ritual habían recabado, entre los interesados, una cooperación económica o en especie, voluntaria. A esta casa llegaron los participantes trayendo consigo copal, velas, veladoras, aguardiente, cigarros, cerillos y flores para la ofrenda; también traían parte de los materiales para cocinar los alimentos (tamales, tortillas, guisados, etc.) y pan, entre otras cosas. Hombres, mujeres, jóvenes y niños permanecieron toda la tarde y noche conviviendo armoniosamente mientras preparaban los distintos ingredientes para la comida ritual y demás quehaceres culinarios; se veía a unas mujeres tostando los chiles secos y moliéndolos en el metate para el mole rojo y de manera simultánea otras limpiaban, asaban y molían las pepitas de calabaza para el pipián. En el patio de la casa, un grupo de hombres se encargó de matar, sangrar y quitarle la piel y las vísceras a un chivo y a un par de guajolotes. La sangre, corazón, plumas y piel de los animales sacrificados fueron recuperados en recipientes individuales y guardados en el altar Aurora Montúfar López

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

familiar, pues eran parte esencial de la promesa. Destazaron el cuerpo del chivo y lo cocieron en barbacoa, sin sal y con muchas hojas de aguacate (Persea americana L.). De los guajolotes recuperaron sus plumas, corazones y sangre, pero además les retiraron cuidadosamente su buche; cada buche fue inflado lo más posible a manera de “globo”, anudado, sellado y colocado también en el altar. La gente, durante la tarde y la noche, seguía llegando y traía consigo cosas para enriquecer la promesa (cadenas de flores, velas, veladoras y/o copal), pero, sobre todo se integraba a la labor comunitaria del momento, se sumaba con los que estaban configurando las cadenas de coloridas, aromáticas y vistosas flores de cacaloxóchitl (Plumeria rubra), ensartándolas con hilo y aguja, o bien con los que estaban adornando dos pares de varas, con flores de bugambilia, gladiola, malvón y plúmbago, a manera de “bastón florido”. También hubo quienes atendían el nixtamal con ceniza del fogón, para luego hacer tamales nejos envueltos en hojas verdes de maíz o preparaban las tortillas o el chocolate. Había mucho movimiento, la gente desempeñaba variadas actividades para un bien común, contar con los materiales de ofrenda en tiempo y forma. El trabajo para la oblación fue salvado con entusiasmo, mientras velaban al calor de la lumbre del fogón, de la luz tenue e intermitente de un foco y con gran consumo de mezcal, por parte de los hombres. Es importante destacar la forma del uso ceremonial de la alegría, para ello tostaron en el comal 3 ó 4 kg de sus semillas, las molieron en el metate y las hicieron harina; después, al amparo del humo aromático del

copal, amasaron esa harina con agua y azúcar. La masa fue trabajada por una señora y varios niños e hicieron un conjunto de figuras miniatura, de casi 7 cm de largo, y una gran serpiente. Las pequeñas esculturas eran objetos antropomorfos de infantes (a los que llamaban “angelitos”), animales alusivos al agua (ranas, tortugas, camaleones, arañas, milpiés, etc.) y ciertos elementos geográficos (cerros y volcanes) y meteorológicos (granizo) y estrellas. Cada tipo de figuras estuvo representada por 12 piezas, todas tenían sus ojos de frijol negro y su boca era un grano de maíz. La enorme víbora pesaba aproximadamente dos kilos y medía 60 cm de largo (su cabeza tenía 10-12 cm de diámetro y su cascabel, 2-3 cm de grosor), su apariencia era intimidante, tenía sus ojos de frijol, su lengua de fuera y sus fauces estaban abiertas mostrando sus grandes y amenazadores dientes de maíz (Figuras 1 y 2). Al terminarse la masa, apagaron el sahumerio, colocaron las figuras de amaranto dentro de dos palanganas y las resguardaron en el altar doméstico. Cabe mencionar, que a algunos de los pequeños cerros de masa les hicieron una cavidad en su cima, a manera de cráter, y con carbonato y unas gotas de agua emularon la erupción volcánica; el carbonato también les imprimió la cualidad nevada de los volcanes de nuestro país. Santiago Rosendo Almazán, el mayordomo del ritual en 2008, comentó que los jóvenes y los niños son los encargados de modelar las figuras de amaranto, “pues se trata de seres inocentes y esos objetos evocan a las entidades divinas de la lluvia y la naturaleza” y que está tarea la realizan entre el humo de copal “en un acto de vestir (con nuevos ropajes) a los angelitos que se

Figura 1. “Angelitos” de masa de amaranto.

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Aurora Montúfar López

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Figura 2. Serpiente de cascabel de masa de amaranto.

encargan de traernos la lluvia, pues sus prendas se deterioran por la acción violenta de los vientos, estos meteoros están representados en la gran serpiente, quien arrastra enérgicamente a los angelitos mientras laboran para nosotros”. El trabajo y la convivencia armoniosa y de ayuda comunitaria trascendió la noche, todos los materiales de la promesa quedaron listos: pan, chocolate, pollo, mole rojo, pipían, guajolotes, chivo en barbacoa, tamales nejos, tortillas, figuras de amaranto, aguardiente, cigarros, cerillos, veladoras, velas, cadenas de flores de cacaloxóchitl, varas enfloradas y dos estructuras pirotécnicas, “toritos”, entre otros elementos. A las tres de la mañana, del día 25, comenzó el ascenso de los ritualistas a la cima del cerro Quiauhtépetl; los materiales de la promesa fueron transportados en camioneta a ese lugar y luego los pusieron al pie del altar de la Santa Cruz. Ésta es una pieza cruciforme de madera, de aproximadamente 4 m de altura y de color azul y está orientada al Este; ésta desplanta de la parte media del margen Oeste de un pedestal rectangular de mampostería (de 3 x 4 m de ancho y largo, respectivamente y 1.20 m de alto), a manera de recinto, el cual está orientado de E a W y tiene una pequeña entrada en el centro de su lado E. CEREMONIA DE PETICIÓN DE LLUVIAS EN EL QUIAUHTÉPETL La actividad ritual inició en plena oscuridad, prendieron el carbón con copal del sahumador y entre el humo aromático de esa resina adornaron a la Santa Cruz con las cadenas de flores y las varas

enfloradas; estos dones de ornato y uno a uno de los materiales de ofrenda fueron entregados a la Santa Cruz, a través del especialista ritual, entre sahumaciones de copal dirigidas hacia los cuatro rumbos del universo, presentando cada unidad de oblación al sol, ofreciéndola a la Santa Cruz y, junto con la emisión de una plegaria en náhuatl, era acomodada sobre su altar. Esa rogativa, según el señor Santiago Rosendo Almazán decía: “Señor Jesucristo, Señor Santa Cruz, San Marcos, Madre Guadalupana, Madre Tierra, aquí venimos este día de las Cruces y del Quiauhtépetl, aquí mismo en el Teopan, a entregarte la promesa para ti y para los angelitos y la serpiente de la lluvia, para que los que trabajamos la tierra, los que estamos presentes, los que no pudieron venir y todos tengamos la lluvia, porque ya es tiempo de que ésta llegue”. De esta forma, cada uno de los dones fueron depositados en el altar (corazones, sangre, buches, plumas, sal, un recipiente con agua, un paño y todos los contenedores con los elementos de oblación (cacerolas y ollas con alimentos, botes o cazos con los animales de sacrificio cocidos y de tamales, petacas de tortillas, palanganas con las figuras de masa de amaranto, etc.). Luego sirvieron la comida ritual de la entidad divina: tazas con chocolate y dos piezas de pan, los platos con mole rojo y pipián, todos en número de doce y dispuestos en hileras paralelas y en forma radial, desde la base de la Santa Cruz hasta las esquinas Noreste y Sureste del altar. Las botellas de aguardiente, cigarros y cerillos, entre algunos ramos de flores, fueron puestos al pie de las esquinas del altar. La Aurora Montúfar López

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sesión de los dones de la promesa se enriqueció porque la gente que iba llegando traía también flores, velas o veladoras y copal, que colmaron la superficie del altar. Conviene señalar que los olores y esencias de los materiales de oblación (comida, copal, flores, cigarro, etc.), según el pensamiento religioso de las comunidades indígenas de habla náhuatl de Guerrero, constituyen el alimento de las entidades divinas (Good, 2001b). Es importante destacar que antes de que saliera el Sol ya se habían depositado la promesa completa y el último de los elementos cedidos fueron bolsas de copal, entre emanaciones aromáticas del sahumerio. Luego, esas bolsas fueron amontonadas a unos cuantos metros de la esquina Noroeste del altar y les prendieron fuego al amparo del humo odorífero del sahumerio. El momento de ofrendar el copal estuvo marcado por el instante en que el sol inició su emergencia en el firmamento, en ese lapso se quemaba el copal y al cundir el fuego los efluvios de su humo, que al principio formaron una nube tenue de color gris, pronto se transformaron en una nube negra que crecía rápidamente y era llevada por el viento apacible hacia los confines del Sol que apenas se asomaba en el cielo; luego la gran nube se expandió y envolvió el entorno del ritual, proveyéndolo de un olor perfumado y relajante. Este humo se constituyó en una inmensa nube, densa y negra que contrastaba con el tenue claro de la mañana y la esfera solar amarillo-rojiza. Ésta emulaba a los imponentes nubarrones que anuncian tormenta y que se aprecian en el cielo, en pleno temporal, junto con estrepitosos rayos y relámpagos que engendran temor y presagian lluvia torrencial. En este ambiente, mágico y simbólico, se rezó el rosario dirigido por un rezandero, para reforzar la plegaria por la propiciación de las lluvias y al concluirlo, aun entre aroma de copal, el mayordomo y su esposa, repartieron entre los ritualistas, como desayuno, la comida ritual. FIGURAS DE AMARANTO EN LA DANZA DEL TEPONAZTLE Después del desayuno, los organizadores del ritual, distribuyeron entre los niños y jóvenes todas las figuras de amaranto ofrendadas y también les dotaron de un ramo de hojas de ahuehuete (Taxodium mucronatum) y de 8

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una corona del mismo árbol. Todos lucían engalanados con la corona de ahuehuete en sus cabezas y portando sobre las palmas de sus manos, una figura de amaranto, en una y en la otra un ramo de ahuehuete, la serpiente la cargaba un adulto también ataviado con su corona y se distinguía un muchacho que iba “armado” con una pequeña vara aguda “punzón”, con la que debía pinchar y “matar” a cada una de las piezas de amaranto. Así organizados se prepararon para ejecutar la danza del Teponaztle, la cual consiste en una especie de carrera alrededor del altar de la Santa Cruz, encabezada por una niña que cargaba el sahumerio ardiendo con copal, cuya función era sahumar hacia los cuatro rumbos del mundo, a la Santa Cruz y al Sol. El grupo comenzó a “bailar” (correr) en semicírculo en torno al altar de la Santa Cruz, corrieron desde la esquina Sureste, hacia el Oeste y hasta la esquina Noreste y viceversa, por seis veces, para luego hacer el recorrido en círculo completo, por tres ocasiones. Durante la realización de esta danza quemaron dos estructuras pirotécnicas (“toritos”) y en medio de esas detonaciones, el muchacho que traía el punzón, correteó a los bailarines con el fin de “matar” a cada una de las imágenes de amaranto (angelitos, ranas, serpiente, volcanes, etc.), al pincharlas. Esta danza culminó con la “muerte” de las figuras de alegría y luego cada quien pudo ingerir la suya, tras atestiguar su deceso al quitarle los ojos y la boca o dientes (de semillas de frijol y de maíz). Lo mismo sucedió con la serpiente, la cual fue repartida entre los oferentes que no danzaron. Así, todos consumimos la “carne” de los representantes sagrados y símbolos del agua. Cabe destacar que las semillas de frijol y de maíz de las imágenes, fueron recuperadas y se guardaron para mezclarlas con las otras semillas que servirían para la siembra, pues el carácter sacralizado de las primeras, favorecería a las demás para una siembra exitosa. Después de la danza se nos invitó a fumar un cigarro y a tomar unos tragos de mezcal, materiales que también fueron sujetos de oblación y adquirieron un carácter sagrado. Antes de concluir el ritual, excavaron un antiguo agujero cercano al altar de la Santa Cruz y lo limpiaron, para luego depositar y enterrar los corazones, buches, sangre, plumas,

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piel, restos óseos de los animales sacrificados, desechos de la comida ritual, etc. y, como cada año, este hoyo es tapado con su propia tierra y lo sellan con piedras. Este proceso de inhumación de los materiales mencionados, lo realizan al abrigo del humo del copal y fue un acto de ofrenda a la Madre Tierra, que es honrada, después de haber sido reverenciada en su advocación de la Santa Cruz. Al final, los ritualistas procuran allegarse algunas de las flores que adornaron a la Santa Cruz, como símbolo de buenaventura, por las lluvias y el desarrollo exitoso de su milpa. Estas flores fueron retiradas por el especialista ritual, a petición de la gente, quien las aventaba, a manera de ramos de novia, entre los oferentes; los niños, jóvenes y adultos pugnaban por atrapar y adquirir algunas, pues al tenerlas consigo aseguran a su familia y a la milpa, salud y prosperidad, ya que fueron el vestido y ornamento de la Santa Cruz y se conciben como objetos sagrados garantes del temporal y la buena cosecha de maíz.

AMARANTO EN LAS OFRENDAS PREHISPÁNICAS Los datos arqueobotánicos de las ofrendas del Templo Mayor de Tenochtitlan revelan la presencia de semillas del género Amaranthus (Montúfar, 1996, 1998, 1999a, 1999b, 2002), la cual obedece a una intencionalidad y a una concepción cultural. De manera especial se cuenta con el registro de innumerables propágulos de Amaranthus cfr. hybridus al interior de las ollas Tláloc de varios depósitos de oblación (ofrendas 102, 120, 126, 141, etc.). Se trata de recipientes de cerámica con la efigie del dios de la lluvia; también se han encontrado al interior de un tecomate (Lagenaria siceraria) (Figuras 3 y 4). Estas semillas, por lo general, se acompañan de varios miles de semillas de chía (Salvia hispanica L.), epazote (Chenopodium sp.), y de algunos decenas de chía de Colima (Hyptis suaveolens Poit.) (Montúfar, 2007). En varias ocasiones han sido halladas junto con numerosas cuentas de piedra verde, las cuales simbolizan a las gotas de agua y se les asocia al culto de los dioses mexicas de la lluvia y de la fertilidad (López Luján, 2009).

Figura 3. Olla Tláloc, Ofrenda 102 del Templo Mayor de Tenochtitlan.

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Figura 4. Semillas de amaranto halladas en el interior de la olla Tláloc de la ofrenda 141.

LA MASA DE AMARANTO Tzoalli EN LOS DOCUMENTOS HISTÓRICOS De acuerdo con la información etnohistórica de la Nueva España se conoce de la importancia ritual del quelite, quilitl o quintonil, entre otras de sus nominaciones (Martínez, 1979), estas plantas corresponden con varias especies del género Amaranthus y que se les menciona especialmente como bledo. Existen numerosos testimonios históricos del uso de las semillas de bledo, principalmente para preparar harina y hacer una masa llamada tzoalli y con ella configuraban las estatuas de importantes entidades divinas (de la guerra, el fuego, el agua y los cerros, etc.). Este material era ofrendado por los mexicas en varias de sus fiestas mensuales que realizaban en torno a su calendario solar y particularmente en relación con el ciclo agrícola del maíz y de otros cultígenos. Por ejemplo Durán (1984: 156) sostiene que el tzoalli era una especie de pan hecho, por los naturales, con semillas de bledo y maíz molidas y amasadas con miel. Se usaba para hacer las imágenes de los dioses y después de haberlos festejado, honrado y sacrificado los repartían a pedazos y “lo recibían en nombre de carne del dios y comulgaban con ello…”. También se menciona que celebraban a Tocí, la Madre de los dioses, en el mes Tozoztontli, con tamales elaborados a base de harina de semillas de bledo tostadas y de maíz frangollado amasados con miel y que festejaban en el mes 10

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Etzalqualistli a la diosa fluvial Chalchiucíhuatl, a quien debían el agua y sus bondades y por eso todo el pueblo iba a lavarse muy de mañana y después “…a comer la carne de dios, que era tzoalli” (Durán, 1984: 172, 251). De igual modo, el dominicano indica que en las ceremonias del mes Xocotl Huetzi, hacían sacrificios humanos y ofrendas en honor de Huitzilopochtli, en esa fiesta reproducían la imagen del dios en masa de tzoalli y la colocaban en la punta del árbol Xocotl. La estatua era del tamaño de un hombre y la vestían a semejanza de la divinidad, tenía la forma de un pájaro y a sus pies ponían cuatro piñas muy pintadas, hechas también de masa de tzoalli. Estatua y piñas iban fijas en el extremo superior del gran madero y los oferentes bailaban alrededor de él, toda la tarde, al son de un tambor y “… llevaban en la mano, en lugar de rosas, unos idolillos y ramos hechos de la mesma masa de que era el ídolo”, luego derribaban el árbol, lo hacían pedazos y los restos de masa de las piñas y del dios de tzoalli eran levantados, “Y así pugnando todos por llevar algo, así de la masa del ídolo, como de las cuatro piñas, que alcanzando algo de ello se tenían por dichosos…” (Durán, 1984: 123). Sahagún (2006: 106, 126, 127) indica que en el mes Toxcal, para honrar a Huitzilopochtli, configuraban su imagen de masa de bledo (tzoalli), ésta consistía de unos palos de mizquitl que eran revestidos de aquella

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masa hasta hacer el bulto de un hombre, luego lo vestían con los atavíos del dios y a sus pies colocaban una especie de huesos también de tzoalli, al final después de sacrificarlo, consumían esa masa, como alimento divino. En la ceremonia de culto a los cerros, en el mes Tepeilhuitl, disponían de unos palos hechos como culebras y de otros a manera de niños que representaban a los grandes montes y todos eran revestidos con masa de bledo. A las figuras de infantes las llamaban hecatotonti, delante de éstas ponían unos como huesos configurados con la misma masa (momios). Estos materiales de tzoalli servían de ofrenda a los difuntos, a los montes y a los dioses de los montes y después los consumían como alimento, cada día, poco a poco. Durante los festejos del mes Panquetzaliztli los ritualistas configuraban una estatua de Huitzilopochtli con masa de semillas de bledo y después de honrarla, la sacrificaban con un dardo en el corazón, luego su cuerpo era repartido, una mitad era para los ministros del dios y los mexicas, la otra mitad era para los Tlatelolco y el corazón se destinaba al rey, así los que “…recibían y comían el cuerpo de Huitzilopochtli se llamaban ministros de dios” (Sahagún, 2006: 134, 135, 187). En las ceremonias del mes Atemoztli festejaban al dios de la lluvia y a sus ministros (Tláloc y Tlaloques), para ello reproducían las imágenes de los montes en masa de tzoalli, sus dientes eran de pepitas de calabaza y sus ojos de frijol ayocote. Estos cerros de tzoalli eran ataviados a semejanza de los dioses del agua, se colocaban ordenadamente en el oratorio familiar, se les ofrendaba comida y pulque y se les velaba, eran “…las imágenes de los montes, sobre que las nubes se arman, como es el Volcán, la Sierra Nevada y la Sierra de Tlaxcala …”, los tepeme. Por la mañana los sacerdotes o ministros los mataban clavándoles un tzotzopaztli (aguja de tejer). Estas estatuas muertas eran despojadas de todos sus atributos y luego ingeridas como alimento (Sahagún, 2006: 144). Durante el siglo XVII y principios del XVIII, Pedro Ponce (1987), Juan Ruiz de Alarcón (1987) y Jacinto de la Serna (1987) describen las ceremonias mensuales del calendario solar de varias poblaciones del territorio mesoamericano e informan de las fiestas dedicadas a los dioses Tláloc, Chalchiuhtlicue, Xiuhtecuhtli,

Huitzilopochtli, etc., a través del año, en relación con la agricultura del maíz, entre otras actividades económicas. En esas fiestas de honra a las entidades divinas que rigen la naturaleza, hacían uso de la masa de semillas de amaranto, como antes de la llegada de los españoles, para reproducir la figura de sus dioses, honrarlos y después consumirlos como alimento sagrado. CONCLUSIONES El trabajo etnográfico que hemos planteado, bajo la perspectiva arqueológica y etnohistórica del uso de amaranto para la elaboración de figuras relacionadas con el agua (que representan a los angelitos, a diversos animales, cerros y estrellas) para la ofrenda de petición de lluvias en Temalacatzingo, Guerrero y su trascendencia simbólica y cultural en el tiempo, obedecen a un pensamiento religioso autóctono, ahora reelaborado por la influencia católica. Se trata de un ritual de propiciación de la lluvia, justo en la época extrema de sequía del año y al considerar los objetos que intervienen en la ceremonia se percibe la continuidad ritual de varios de los actores, a las figuras de masa de amaranto se les concibe como entidades divinas del temporal, las cuales sin duda son ofrendadas, veneradas y sacrificadas, como antaño, para luego ser consumidas como alimento sagrado. Esta manifestación ceremonial marca uno de los rasgos culturales que perviven y sus raíces se hunden en la antigua Mesoamérica, como queda constatado en las fuentes históricas del México antiguo. LITERATURA CITADA Broda J (2009). Las fiestas del Posclásico a los dioses de la lluvia. Arqueología Mexicana XVI (96):58-63. Broda J (2008). Las ollas de nubes entre los indios pueblo y los mexicas: una comparación. In: Las Vías del Noroeste II: Propuesta para una Perspectiva Sistémica e Interdisciplinaria. C Bonfiglioli, A Gutiérrez, M-A Hers y M E Olavaria (eds). Instituto de Investigaciones Antropológicas-UNAM. México. pp.31-63.

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Broda J (2004) Ciclos agrícolas en la cosmovisión prehispánica: el ritual mexica. In: Historia y Vida Ceremonial en las Comunidades Mesoamericanas: los Ritos Agrícolas. J Broda y C Good Eshelman (coords). Colección Etnografía de los Pueblos Indígenas de México. Serie Estudios Monográficos. Instituto Nacional de Antropología e Historia e Instituto de Investigaciones Históricas-UNAM. México. pp. 35-60. Broda J (2001) La etnografía de la fiesta de la Santa Cruz: una perspectiva histórica. In: Cosmovisión, Ritual e Identidad de los Pueblos Indígenas de México. J Broda y F Báez-Jorge (coords). Biblioteca Mexicana. Consejo Nacional para la Cultura y las Artes y Fondo de Cultura Económica. México. pp.165-238. Broda J (1971) Las fiestas aztecas de los dioses de la lluvia. Revista Española de Antropología Americana, Separata 6:245-327. Durán D (1984) Historia de las Indias de Nueva España e Islas de la Tierra Firme. Tomo I. Editorial Porrúa. México. 341 p. Good Eshelman C (2001a) Oztotempan: el ombligo del mundo. In: La Montaña en el Paisaje Ritual. J Broda, S Iwaniszewski y A Montero (coords). Escuela Nacional de Antropología e Historia-INAH. México. pp.375-393. Good Eshelman C (2001b) El ritual y la reproducción de la cultura: ceremonias agrícolas, los muertos y la expresión estética entre los nahuas de Guerrero. In: Cosmovisión, Ritual e Identidad de los Pueblos Indígenas de México, J Broda y F Báez-Jorge (coords). Consejo Nacional para la Cultura y las Artes y Fondo de Cultura Económica. México. pp.239-297. López Luján L (2009) Aguas petrificadas. Las ofrendas a Tláloc enterradas en el Templo Mayor de Tenochtitlan. Arqueología Mexicana XVI (96):52-56. Martínez M (1979) Catálogo de Nombres Vulgares y Científicos de Plantas Mexicanas. Fondo de Cultura Económica, México. 1220 p. 12

Aurora Montúfar López

Montúfar López A (2007) Las chías sagradas del Templo Mayor de Tenochtitlan. Arqueología Mexicana XIV (84):82-85. Montúfar López A (2002) Flora in the offerings of the Great Temple. In: 67th Annual Meeting of Society for American Archaeology. Denver, Colorado, USA. Montúfar López A (1999a) Archaeobotany of Mexico-Tenochtitlan, 1500 AD. In: Perspectives in Human Biology 4 (1), Is Human Evolution a Closed Chapter ?. M Henneberg, Ch Oxnard (eds). Centre for Human Biology-The University of Adelaide, Australia, Australia. pp:115-120. Montúfar López A (1999b) Estudio arqueobotánico del subsuelo. In: Excavaciones en la Catedral y el Sagrario Metropolitanos: Programa de Arqueología Urbana. Eduardo Matos Moctezuma (coord). Instituto Nacional de Antropología e Historia. México. pp.111115. Montúfar López A (1998) Arqueobotánica del centro ceremonial de Tenochtitlan. Arqueología Mexicana VI (31):34-41. Montúfar López A (1996) Archaeobotanical study of three religious offerings from Templo Mayor of Mexico Tenochtitlan, Mexico, D.F.. In: XIII International Congress of Prehistoric and Protohistoric Sciences, Forli, Italia. pp: Neff Neuixa F (2001) La Lucerna y el Volcán Negro. In: La Montaña en el Paisaje Ritual. J Broda, S Iwaniszewski y A Montero (coords). Escuela Nacional de Antropología e HistoriaINAH. México. pp.353-373. Ponce P (1987) Breve relación de los dioses y ritos de la gentilidad. In: El Alma Encantada. Fernando Benítez (presentación). Fondo de Cultura Económica. México. pp.3-11. Ruiz de Alarcón H (1987) Tratado de las supersticiones y costumbres gentilicas que oy viuen entre los indios naturales desta Nueua España. In: El Alma Encantada. Fernando Benítez (presentación). Fondo de Cultura Económica. México. pp.125-223.

Capítulo I. Amaranto (Amaranthus), planta ritual mesoamericana

Sahagún B (2006) Historia General de las Cosas de Nueva España. Editorial Porrúa. México. 1061 p. Serna J (1987) Manual de ministros de indios para el conocimiento de sus idolatrías, y extirpación de ellas. In: El Alma Encantada. Fernando Benítez (presentación). Fondo de Cultura Económica. México. pp.263-475. Villela F S L (2001) El culto a los cerros en la Montaña de Guerrero. In: La Montaña en el Paisaje Ritual. J Broda, S Iwaniszewski y A Montero (coords). Escuela Nacional de Antropología e Historia-Instituto Nacional de Antropología e Historia. México. pp.331-351.

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Capítulo II

Tzoalli, de cuerpo de dioses a alegría de mortales Tzoalli, FROM BODY OF GODS TO “ALEGRÍA” OF MORTALS

Sara Hirán Morán-Bañuelos1, Lorena Cortés Espinoza2, Eduardo Espitia Rangel3, Dora María Sangerman-Jarquín2 1Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Zacatepec, Zacatepec, Morelos. 2Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Campo Experimental Valle de México. 3Campo Experimental Bajío. km 0.5 carretera Zacatepec – Galena Zacatepec Morelos, MX. C.P. 62780 Tel. (734) 343 0230 Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN

ABSTRACT

El amaranto (Amaranthus spp.) o huauhtli, en lengua náhuatl, se cultiva desde la época prehispánica, entonces tenía gran importancia como alimento y como elemento simbólico en la cosmovisión mesoamericana. Estuvo presente, junto con el maíz (Zea mays) en las ceremonias relacionadas con la fertilidad y el ciclo agrícola. Imágenes de la planta completa, de sus coloridas inflorescencias y semillas, son capturadas en los códices prehispánicos y coloniales, como parte de las escenas de la vida diaria, como tributo y en piezas ceremoniales denominadas “tzoalli”. Hay poca información sobre la manera en que a partir de la semilla se elaboró el tzoalli para representar a sus dioses y luego era consumido por quienes asistían a las ceremonias. Probablemente se elaboraban de una manera similar a como en la actualidad se preparan los dulces de amaranto, tradicionalmente consumidos y conocidos como “alegría”. A pesar de que el amaranto ha perdido gran parte de su valor religioso, ahora sabemos que su valor nutricional único, contribuye a reubicarlo como recurso alimenticio.

Amaranth (Amaranthus spp.) or huauhtli, in Nahuatl language, grown since pre-Hispanic times, then was very important as food and as a symbolic element in the Mesoamerican worldview. Was present, along with maize (Zea mays) in ceremonies related with fertility and the agricultural cycle. Images of the complete plant, colorful inflorescences and seed are captured in prehispanic and colonial codices as part of scenes of daily life, like tribute and ceremonial pieces named “tzoalli”. There are limited available information about how with seed was elaborated the tzoalli to represent their gods and then were consumed by the assistants to ceremonia, probably were made in a similar way like at present are elaborated candy of amaranth, typically known and consumed as “alegría”. Even though amaranth has lost most of its religious value, we now know that their unique nutritional value contributes to reposition it as a food resource.

Palabras clave: Amaranto, Amaranthus spp., Tulyehualco.

Key words: Amaranth, Amaranthus spp., Tulyehualco.

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INTRODUCCIÓN Los hallazgos arqueológicos efectuados en Tehuacán, Puebla y Tlapacoyan, Estado de México muestran que el amaranto se cultivó en Mesoamérica desde hace 5500 y 7 000 años, respectivamente (Rojas, 1991). Entonces, entre los mexicas los amarantos eran nombrados huauhtli, aunque el término no se utilizaba de manera exclusiva para las plantas ubicadas taxonómicamente dentro del género Amaranthus, ya que el estudio de los dibujos plasmados en el Libro Undécimo del Códice Florentino (Sahagún, 1979) (Figura 1) señala que en combinación con otros vocablos pudo hacer referencia tanto a amarantos como a algunos quenopodios (Chenopodium spp.), identificados todos ellos por Sahagún como “bledos” o “cenizos”. Algunos ejemplos son: xochihuauhtli, nexhuauhtli, tlapalhuauhtli, michihuauhtli,

tezcahuauhtli (Figura 2) (Martínez, 1979; Espitia, 1994; Velasco, 2001; Espitia et al., 2010). Velasco (2001) detalla también que los mayas lo nombraban tez o xtes y los purépechas ahparie. Los registros de finales del siglo pasado señalan que en otras regiones es llamado “chía de chapata”, guaute o huaute, ziimy huajaquilitl, bledo; en las lenguas totonaca y tarasca la especie A. hybridus se nombra saua-shalsoco, tsaua, saua-sacaca y shacua ochacua, respectivamente (Martínez, 1979). Los indios del noroeste de México, jovas y tarahumaras, lo nombraban con algunas variantes de la palabra guegui (Alejandre y Gómez, 1986). La semilla de muchos de esos bledos no era muy apetecible y se consumían solo las hojas de la planta, como era el caso del petzicatl, que aparece en el Códice Florentino (Figura 3) y actualmente se identifica con el quintonilli,

Figura 1. De las semillas de los cenizos (Códice Florentino, III, f.282v).

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S. H. Morán Bañuelos et al.

Capítulo II. Tzoalli, de cuerpo de dioses a alegría de mortales

Figura 2. Michihuauhtli o amaranto pescado (arriba a la derecha) y tezcahuauhtli o amaranto espejo (abajo) (Códice Florentino, III, f. 404v)

una planta de semilla negra, cuyo grano no era muy demandado pero la parte vegetal aún es consumida cuando está tierna, como verdura cocida o en alguna sopa; Bravo (2009) menciona que en ambas preparaciones su sabor es más agradable que el sabor del huahtli, que es más fuerte cuando se consume en forma semejante. Al respecto Barros y Buenrostro (1997) y Velasco (2001) describen ampliamente los diferentes patillos que se preparaban con hojas de huauhtli, entre ellos los tamales de maíz con huauhtli y los potajes. Barrales y colaboradores (2010) enumeran diversas fuentes documentales de la época colonial que hacen alusión a la importancia de la semilla como alimento, tributo y uso

ritual, entre ellos los de Alva Núñez Cabeza de Vaca en 1536, los Códices Mendocino (1541) y Florentino (1550), Fray Hernández Ruíz de Alarcón (1629), Fray Jacinto de la Serna (1659), Fray Agustín de Betancurt (1698) y habrá que agregar a Juan Bautista Pomar (1582). Velasco (2001) menciona que esta semilla era parte del sustento habitual de la población en Tenochtitlan y formaba parte del tributo de 17 de las provincias conquistadas. En adelante trataremos sobre el papel del huauhtli en los rituales mesoamericanos, su prevalencia dentro de las ceremonias que persisten en comunidades indígenas y grupos promotores de la cultura mexica, así como su posición actual como alimento.

Figura 3. Quintonil, una planta de semilla negra (Códice Florentino, III, f. 285r). S. H. Morán Bañuelos et al.

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EL MODELADO DE LAS FUERZAS DIVINAS La importancia alimenticia del huauhtli fue ensombrecida por lo sorprendente que pareció a los españoles su uso dentro de los rituales locales. Dentro de las referencias de aquella época se menciona con frecuencia el carácter “diabólico” del tzoalli elaborado con huauhtli. A partir de entonces su cultivo disminuyó al verse desplazado por aquellos que preferían los españoles; aunque hay autores que señalan que fue prohibido por Fray Bernardino de Sahagún, en 1570, y por Ruiz de Alarcón, en 1626 (Iturbide y Gispert, 2012), a la fecha no existen indicios históricos documentales que apoyen dicha idea (Velasco, 2012). Al mismo tiempo, el proceso de evangelización limitó la continuidad de las ceremonias y la presencia del amaranto en la vida cotidiana. El huauhtli era tostado y molido para después mezclarse con un ingrediente adhesivo o pegajoso que permitiera el modelado de formas y figuras, el tzoalli. Aún persiste la controversia sobre la naturaleza de dicho material adhesivo; diversas fuentes señalan que era sangre humana de los cuerpos de los sacrificados o de niños, sin embargo por su naturaleza, éste fluido no daría la consistencia necesaria a la pasta. Curiel (2007) citando a Fray Bernardino de Sahagún menciona que se mezclaba con sangre de codornices durante la fiesta de Xiotecuhtli. También se ha señalado que consistía en pulpa de tuna roja o pitaya, de ahí que se creyera que era sangre humana, otras

fuentes mencionan que era mezclado con miel de maguey o de abeja silvestre (EL UNIVERSAL, 2008; Curiel, 2007), incluso existe la idea de que se preparaba con la miel de las hormigas melíferas (Myrmecocystus sp.) (Morales, 2012). Otro de los aspectos que sorprendieron a los españoles fue el hecho de que al final de las ceremonias o al día siguiente, el tzoalli era fragmentado y repartido entre la comunidad para consumirlo. Velasco (2001) presenta un amplio estudio sobre el calendario ritual donde estaba presente el tzoalli y las deidades que representaban, sugerimos su revisión para ampliar la información al respecto y de ahí retomamos, las principales ceremonias. El calendario mexica estaba dividido en 18 veintenas, dentro de cada una de ellas se llevaba a cabo una ceremonia para venerar a distintos dioses y es probable que en cada una de ellas hayan estado presentes las figuras elaboradas con huauhtli. En la cuarta veintena, cuyo inicio corresponde al 30 de abril, la diosa dadora de los mantenimientos llamada Chicomecóatl era modelada con tzoalli y colocada en un adoratorio adornado con plantas de maíz y huauhtli (Figura 4). La quinta veintena, cuyo inicio corresponde al 20 de mayo, llamada del Tóxcatl, se hacía la imagen de Huitzilopochtli de tzoalli, “tan alta como un hombre hasta la cinta”, forrando con la masa un pedazo de madera de mezquite, los ojos eran cuentas verdes, azules o blancas y por dientes le ponían granos de maíz; la figura era llevada al templo de Huitznáhuac,

Figura 4. Durante la veintena Hueytozozti se elaboraba un adoratorio para Chicomecoátl, diosa de los mantenimientos, adornado con plantas de maíz, tules y huauhtli de panoja roja y amarilla (Códice Borbónico, f. 29).

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donde le hacían ofrendas de tamales y otras comidas. Posteriormente se le vestía con el resto de los ornamentos que complementaban sus atributos. La décima veintena, cuyo inicio corresponde al 28 de agosto, se dedicaba a las festividades del Xócotl, un gran tronco pulido y colocado en el centro de la plaza para su adoración. En la cima de dicho tronco se colocaba una pieza de tzoalli en forma de pájaro o dios, que los mancebos debían alcanzar para demostrar su valentía, al final de la ceremonia la figura se repartía entre los presentes (Figura 5).

Alejandre y Gómez (1986) mencionan que a los cerritos les hacían caras con ojos, los adornaban y colocaban en cada casa. La décima sexta veintena, cuyo inicio corresponde al 26 de diciembre, se dedicaba a las deidades asociadas con el agua, la lluvia y la fertilidad, donde los cerros tenían un papel importante y por ello se modelaban con el tzoalli la Sierra Nevada, la Sierra de Tlaxcala, Popocatzin, Tláloc, Matlalcueye, Chalchiuhcueye, Iztactepetl y Cihuacoatl (Figura 6).

Figura 5. Escena de la décima veintena del calendario azteca, que era cuando se levantaba el tronco Xócotl y los mancebos subían a él para alcanzar la figura de tzoalli colocada a lo alto del tronco (Códice Magliabechiano, CL. XIII. 3, f. 38v.).

En la décima tercera veintena, cuyo inicio corresponde al 27 de octubre, se celebraba la fiesta de los montes o Tepeilhuitl, durante la cual se elaboraban figuras de tzoalli que representaban como figura principal y de mayor tamaño al volcán Popocatepetl, junto con figuras más pequeñas que correspondían a cerros.

Para la ceremonia del décimo quinto mes o veintena dedicada a Huitzilopochtli, se guardaba un ayuno de cuatro días, durante los cuales sólo se tomaba a la media noche tzoalli con miel y agua (Alejandre y Gómez op cit.) Con aquella masa también se modelaban otras figuras como huesos, plumas,

Figura 6. Imágenes de cerros modelados con huauhtli, representando cada uno al dios del viento, Ehécatl y al dios de la lluvia, Tláloc (Códice Florentino, I, f. 52v.). S. H. Morán Bañuelos et al.

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saetas, mariposas y elementos simbólicos, como la figura del rayo que cae del cielo (Sahagún, 1969; Velasco, 2001). Además de la cultura nahuatl, otras muchas hicieron del huautli su alimento ritual en ofrendas o en la confirmación de sus dioses, como los tepehuanos, mayas, tarahumaras, yaquies. Los coras lo denominan bé-be y los huicholes wa-ve. Los huicholes y los purepechas manufacturaban galletas con figuras de animales, llamadas tuycen (Iturbide y Gispert, 2012). Las masas de huauhtli representaron entonces las fuerzas naturales en forma de dioses y al ser comidas por aquellos pobladores los proveían de esa energía revitalizante o incluso pudieron considerarse curativas, como señala Velasco (2001). A principios de la década de los

medía 80 centímetros. Consistía en una estructura de metal sobre la cual se colocó la pasta de tzoalli (que había sido elaborada con huauhtli y miel de piloncillo) y se dio forma a una figura antropomorfa muy sencilla (Figura 7). Antes de que se elaborara con huauhtli, ya conocido como amaranto, se utilizaban ingredientes de panificación y se realizaba una figura bidimensional. Tanto el Huitzilopochtli de pan como el de huauhtli fueron repartidos entre los presentes para su consumo, como lo hacían en la época prehispánica. Dos años después de aquel primer Huitzilopochtli “moderno”, su estructura metálica se reemplazó con ramas de árbol de tepozán (Buddleja spp.), que es común en la zona cerril de Tulyehualco, también conocida

Figura 7. Figura de Huitzilopochtli elaborada de huauhtli y miel de piloncillo, para la fiesta de Tóxcatl celebrada en 1997 en México, Distrito Federal. (Con autorización de Jaime Morales Olivos).

setentas, del siglo pasado, un grupo promotor de la cultura mexica en el Distrito Federal rescató la Fiesta de Tóxcatl, citada párrafos arriba. El grupo Cemánahuac-Tlamachiloyan organiza la ceremonia en honor a Huitzilopochtli cada año el segundo o tercer sábado del mes de mayo, coincidiendo con la veintena correspondiente en el calendario mexica. Fue hasta el año 1997 cuando se utilizó el tzoalli para elaborar una figura de Huitzilopochtli. Los directivos del grupo se dirigieron a Tulyehualco, en particular con la familia del señor Jaime Morales Olivos, productor y comercializador nativo de este lugar. La primera figura que elaboró el señor Morales o Jaimito, como lo llaman respetuosamente, 20

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como el Teuhtli. A partir de entonces el tamaño de la figura fue aumentando y su diseño ahora es más detallado. La figura en la que basaron su modelado y vestimenta es aquella que aparece en el Códice Borbónico, donde resalta el color azul turquesa. Actualmente el tzoalli mide dos metros de alto hasta la cabeza del dios y 50 centímetros más hasta al nivel más alto de la serpiente que sujeta con la mano derecha (Figura 8). Parte de la ceremonia consiste en vestir al dios el sábado por la tarde, para que el domingo por la mañana empiece el resto del ritual que concluye a las siete de la noche de este día. Las primeras celebraciones se llevaban a cabo en el Zócalo de la ciudad, sin embargo desde hace

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siete años se realiza en la Plaza Tolsá del centro histórico y ahora son los hijos del señor Jaime, Camilo y Bolívar, los encargados del modelado de Huitzilopochtli, lo cual les toma alrededor de dos semanas de trabajo. LOS CERROS VENERADOS Y LOS IDOLITOS QUE TRASCIENDEN Durante el siglo pasado diversos autores realizaron estudios antropológicos respecto a las ceremonias y elementos rituales presentes en diversas comunidades de la montaña de Guerrero. En la reseña de Villela (1998) resalta la ceremonia de petición de lluvias en Chiepetepec,

y frijoles negros como ojos, representaban a los llamados tlaloques, ayudantes de Tláloc y encargados de repartir la lluvia. Actualmente se les identifica con los “angelitos”, como los “trabajantes” que ayudan a San Marcos y San Miguel para traer las lluvias y alejar los vientos nocivos (Villela, 2012). De igual manera en Petlacala, otro de los pueblos de la montaña, cada 25 de abril, en sincretismo con la Fiesta de San Marcos, se realiza la petición de lluvias en la cima del cerro Petlacaltépetl (Figura 9), en el paraje conocido como Coapotzaltzin (Oettinger y Horcasitas, 1982; Jiménez y Villela, 2003). La ceremonia

Figura 8. Figura de Huitzilopochtli elaborada de huauhtli y miel de piloncillo, para la fiesta de Tóxcatl celebrada 2011 en México, Distrito Federal. (Con autorización de Jaime Morales Olivos).

donde la pareja de fundadores míticos: María Antonia y Chiepetzin, son modelados como tamales de tzoalli, “…reciben la ofrenda de los pobladores de ese lugar”. Al lado de estas figuras se encuentran los “idolitos” otros tamales de tzoalli, modelados en formas rectangulares elaborados a base de amaranto, maíz tostado y calabaza con un par de frijoles a manera de ojos y un grano de maíz como boca. En la época prehispánica los idolitos de tzoalli tenían pepitas de calabaza como dientes

incluye un arreglo de piedras ceremoniales que simbolizan gotas de lluvia (Schultze-Jena, 1938 citado por Broda, 2008), sobre cada una de estas piedras se coloca una pieza de tzoalli en forma de cerro, figurando de esta forma las elevaciones que rodean el sitio ceremonial y a quienes se dirigirán los llamados y plegarias de los tlahmaquetl o huehuetl, los sabios de mayor edad (Villela, 1998). Piezas de tzoalli con forma de culebra o idolitos son sacrificados de manera simbólica al finalizar las acciones rituales en el S. H. Morán Bañuelos et al.

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cerro, “…los ritualistas se dirigen a la casa del comisario municipal, donde el oficiante realiza una acción simbólica de sacrificio, al pinchar con un palillo a los tamales de tzoalli”, rememorando los tiempos en que eran sacrificadas realmente las personas (Villeda op cit.). En Coachimalco también se siguen elaborando las figuras de tzoalli en forma de animalitos y plagas del campo; en Coatlaco, municipio de Cualác, tienen figura de cuervo: “La semilla de alegría significa el granizo y las figuras en forma de cuervo dicen que representan el animal que trajo el maíz desde lugares muy lejanos” (González, 1992 citado por Villela, 2012). CERCA DE LOS TULES INICIÓ LA ALEGRÍA Tulyehualco o lugar “cerca de los tules” o “cercado de tules” es uno de los pueblos originarios de la Delegación Xochimilco, se ubica en el sureste del Distrito Federal y en la época prehispánica representaba la zona de transición entre la zona lacustre y la zona cerril del volcán Teuhtli. La fertilidad del suelo en las terrazas y faldas del volcán permitió el establecimiento de grupos nómadas y el inició de su tradición agrícola.

la cuenca y la expansión imperial de la Triple Alianza, formada por Tenochtitlan, Texcoco y Tlacopan, que les demandaba mayor suministro de productos agrícolas, entre ellos el huauhtli. Después de la llegada de los españoles, esta región fue una de las primeras que se ocuparon y utilizaron para la introducción de nuevos cultivos y ganado. Bravo (2009) señala que el pueblo de Santiago Tulyehualco fue fundado “el 25 de julio de 1525. A escasos 13 meses después de la llegada de los 12 frailes misioneros que vinieron a estas tierras a sistematizar la evangelización de los pueblos recién conquistados”. El fraile que encabezó aquel primer grupo de misioneros fue Fray Martín de Valencia, quien además de realizar sus labores propias de evangelización, enseñó artes y oficios a los habitantes originarios; algunos como el tallado de madera, tapicería de plumas, confección de telas de lana y algodón, fabricación de esteras de tule y palma, alfarería, cerámica, cantos y pintura, entre otros (González, 2003 citado por Ramírez, 2007). A Fray Martín de Valencia se le atribuye la transición del tzoalli a “alegría”, al instruir tanto a pobladores nativos de Tulyehualco como

Figura 9. Durante la ceremonia de petición de lluvias en Petlacala, se coloca el Lienzo de los Fundadores en el altar de la cruz del cerro y se ofrendan tamales de tzoalli (Jiménez y Villela, 2003).

De igual manera, con la construcción de las chinampas entre 1300 y 800 años a.C. tuvieron un suministro seguro de alimentos; incluso junto con los otros pueblos de Xochimilco se constituyeron como una de las fuentes de alimento y tributo para la Gran Tenochtitlan. Rojas (1991) menciona que en esta zona las chinampas llegaron a ocupar 120 kilómetros cuadrados, debido al crecimiento geográfico de 22

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a españoles, a mezclar el huauhtli reventado con miel de abeja. Aunque también en la región de Huiramangaro y Opopeo en Michoacán persiste la costumbre de elaborar alegrías redondas (Carrillo et al., 2010). En distintas fuentes documentales y en la tradición oral se menciona que al probar los indígenas esta nueva preparación “empezaron a bailar y cantar de alegría” (Ortíz, 1997) y de ahí

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provino el nombre de esa nueva preparación; al respecto coincidimos con los productores que tal afirmación es deshonrosa para la comunidad indígena, quienes poseían una tradición de uso y apropiación del huauhtli desde hacía ya cientos o miles de años, de modo que también coincidimos que tal versión no debe promoverse. Otro relato popular menciona que al tostar las semillas, parece que éstas “saltan de alegría”, de ahí el nombre del dulce; sin embargo, recientemente Curiel (2007) en su reseña de la dulcería mexicana hace mención al hecho de que en España ya elaboraban un dulce con el mismo nombre a base de ajonjolí y que los españoles lo asignaron también al dulce elaborado con huauhtli, habrá que investigar más al respecto. Es probable que a partir de la época colonial la elaboración de alegrías se haya establecido como una actividad artesanal familiar en la región de Tulyehualco y las nacientes “alegrías” pudieron difundirse, junto con los productos agrícolas de la chinampa, hasta el centro de la Nueva España con las canoas prehispánicas que ya transitaban a través de los canales distribuidos en los antiguos lagos. Las referencias de aquellos tiempos son escasas, es hasta años recientes que la historia oral de los habitantes de mayor edad da testimonio del proceso de transformación y venta después de la Revolución Mexicana. De dichos relatos se desprende que para 1930 había familias que se dedicaban a la comercialización de las alegrías; las mujeres y niños iban a los barrios más cercanos a ofrecer su producto, en tanto que los hombres se trasladaban al centro de la ciudad usando el tranvía (Mundo, 2012). La ruta inaugurada por

Porfirio Díaz el 12 de julio de 1910 viajaba de Tulyehualco al Zócalo pasando por los pueblos de San Gregorio, Nativitas, Xochimilco, Huipulco, Tasqueña, Churubusco y Tetepilco. El tranvía contaba con un carro para pasajeros y un segundo carro que era una especie de góndola, sin techo ni puerta alguna (Figura 10), y era un servicio especial para los agricultores que llevaban sus productos al mercado de la Merced (Morrison, 2003; Aguirre, 2000). El dulce que preparaban lo acomodaban en una base de madera, reconocida localmente como la típica “tablita” (Alejandre y Gómez, 1986) e iban calle por calle, en los atrios de las iglesias, plazas populares, durante fiestas patronales o reuniones familiares. En 1970, varios vecinos del pueblo, con el apoyo de las autoridades delegacionales tuvieron la iniciativa de organizar una Feria de la Alegría y el Olivo, con el fin de dar a conocer y promover los productos locales, ampliar los espacios para su comercialización, atraer visitantes y dar a conocer la cultura y tradiciones de Tulyehualco. También en esta década aumentó la demanda de materia prima para elaborar las alegrías, como la producción en el Teuhtli no fue suficiente, los transformadores empezaron a comprar semilla producida en otros estados, principalmente Morelos y Puebla. El proceso tradicional para elaborar las alegrías fue descrito detalladamente por Alejandre y Gómez (1983). En la actualidad, se ha dejado de lado el comal de barro con el que por la noche se tostaba el amaranto de “a puñitos”, para usar hoy en día maquinas reventadoras que con aire caliente tuestan en una hora lo que uno

Figura 10. Tranvía que transportaba campesinos y sus productos agrícolas a lo largo de la ruta que viajaba Tulyehualco hacia el Zócalo inaugurada en 1910. (Bill Volkmer collection, http://davesrailpix.com/odds/mx/htm/ mxc16.htm). S. H. Morán Bañuelos et al.

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necesita para toda la semana (López y Manzo, 2010) también se utilizan moldes de diferentes formas y tamaños, así como nuevos ingredientes para ampliar las posibilidades de venta. Durante los 41 años que lleva la Feria de la Alegría se han experimentado nuevas formas de uso de la semilla y su harina, actualmente se pueden enumerar algunos de ellos: a) Diferentes tipos de alegrías: Con miel, con piloncillo, con otros granos (piñón, semilla de calabaza, cacahuate), sabor chocolate, sabor nuez, sabor cajeta, sabor yogurt, sabor fresa; b) A base de harina de amaranto: complemento alimenticio, panes y pays, atoles, tamales, hot cakes y churros, frituras extrudidas (charritos, totopos), galletas, hojuelas, tortillas enriquecidas, mazapanes, agua, pulque; c) Grano reventado adicionado a: frutas, yogurt, licuados, leche, palomitas de maíz, enjambres, bombones, mezcla para empanizar; d) Grano reventado como granola con mascabado, con oleaginosas (girasol, linaza,

COMENTARIOS FINALES La historia del tzoalli puede dividirse en diversos capítulos, el primero de ellos es el enigmático uso prehispánico que culmina con la llegada de los españoles y la satanización de aquellas figuras que parecían estar elaboradas con sangre de sacrificados, de doncellas o de niños. Un nuevo capítulo marca la sobrevivencia del tzoalli en la tradición ceremonial de comunidades indígenas, como aquellas de la sierra de Guerrero, que las siguen utilizando junto con el maíz para comunicarse con las fuerzas divinas. El capítulo mestizo del tzoalli corresponde a la conversión a “alegría”, ahora patrimonio biológico y cultural del Pueblo de Santiago Tulyehualco; donde el huauhtli y la miel toman nuevas y diversas formas contemporáneas, sin la carga simbólica y ceremonial de otros tiempos.

Figura 11. Figuras hechas a base de amaranto comercializadas en Tulyehualco, Distrito Federal, con motivo de días festivos.

ajonjolí), con frutas secas (nuez, pasas, coco, ciruela). La tradición de elaborar “alegrías” forma parte del patrimonio cultural del pueblo de Santiago Tulyehualco, y el oficio de “alegrillero” es un elemento de identidad (Tristán, 1994; Ramírez et al., 2010) que en la actualidad permite a diversas familias establecer microempresas donde se moldea la alegría en múltiples formas asociadas al calendario de festividades populares contemporáneas (Figura 11).

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Tiempo después, el huauhtli comenzaría a transformarse en amaranto. En los siglos XVI y XVII en Europa ya existían diversas plantas asociadas a la palabra griega “Amaranthus”, que significa “inmarcesible” o “que no se marchita”, Costea y Tardif (2003) presentan una amplia revisión al respecto. Es después de la conquista y debido al intercambio que se dio entre los continentes, que las plantas de huauhtli fueron descritas y clasificadas taxonómicamente por Carlos Lineo en 1753 dentro del género Amaranthus, donde se incluyen hasta la fecha plantas asiáticas, australianas, europeas, africanas y americanas. A partir de entonces, la comunidad científica nombra al huauhtli como Amaranthus

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hypochondriacus, A. cruentus y A. hybridus (Feine et al., 1979; Costea, 2003; Iturbide y Gispert, 2012). El capítulo que estamos viviendo en este nuevo siglo es el del aprovechamiento del tzoalli disociado hasta el nivel molecular, para utilizar sus ácidos nucleicos (fragmentos de ADN o genes completos) en el mejoramiento de cultivos (Valdés-Rodríguez et al., 2007) y como materia prima para alimentos y bebidas procesadas (Reyna, 1988; Bejosano y Corke, 1998a,1998b; Morales et al., 2009); Desde 1986, Alejandre y Gómez resaltaron el aporte nutricional y en 2009, Morales y colaboradores retoman el estudio con mayor profundidad; de éste último se desprende el papel del amaranto como alimento funcional para el estilo de vida contemporáneo, donde el cambio de dieta ha generado la epidemia que combina desnutrición con obesidad, tanto en poblaciones urbanas como rurales. Ante ello el huauhtli, ahora amaranto tiene un amplio potencial como fuente de elementos nutricionales y compuestos bioactivos para enfrentar la crisis actual. LITERATURA CITADA Aguirre B M (2000) [En línea]. Los tranvías de la Ciudad de México, 1850-1971. Mejor cuéntame uno de tranvías... Dirección URL: http://www.mexicomaxico.org/Tranvias/ TRANVIAS.htm [Consulta: Agosto de 2012] Alejandre I G, Gómez L F (1986) Cultivo del amaranto en México. Colección Cuadernos Universitarios. Serie Agronomía No.12. Universidad Autónoma Chapingo. 245 p. Barrales D J S, Barrales B E, Barrales B E (2010) Amaranto. Recomendaciones para su producción. Fundación Produce Tlaxcala A.C., Plaza y Valdés. México, D.F. 166 p.

Bejosano F P, Corke H (1998b) Protein quality evaluation of Amaranthus wholemeal flours and protein concentrates. Journal of the Science of Food and Agriculture 76(1): 100-106. Bravo V C (2009) Huauhtli …la alegría de Tulyehualco. Programa de Apoyo a los Pueblos Originarios/SEDEREC/GDF. México, D.F. 134 p. Broda J (2008) Leonard Schultze-Jena y sus investigaciones sobre la ritualidad en la montaña de Guerrero. Anales de Antropología 42:117145. Carrillo O A, Cedillo P E, Mapes S C, de la Cruz T E, García A J M, Cuevas S J A (2010) La chía colorada (Chenopodium berlandieri ssp. nuttalliae cv Chía roja) Un cultivo prehispánico ¿En peligro de extinción? Universidad Autónoma Chapingo. Chapingo, Texcoco, Estado de México. 17 p. Códice Borbónico (1979) Manuscrito mexicano de la Biblioteca de Palais Bourbon, ed. Facs. De 1899 (de Ernest Leroux, París), Siglo XXI, México. Códice Magliabechiano (1970) Libro de la vida; libro explicativo del llamado Códice Magliabechiano, CL.XIII.3 (B.R. 232), Biblioteca Nazionale Centrale di Firenze. Akademische Druck- und Verlagsanstalt; GrazAustria. Costea M, Tardif F J (2003) The name of the Amaranth: histories of meaning. Sida 20: 10731083. Curiel M J L (2007) La dulcería mexicana: Historia, Ciencia y Tecnología. Ed. LIMUSA. México, D.F. pp: 195-197.

Barros C, Buenrostro M (1997) Amaranto. Fuente maravillosa de sabor y salud. Grijalbo. México, D.F. 158 p.

EL UNIVERSAL (2008) [En línea]. Consumían toltecas amaranto hace más de 2 mil años. Diciembre 21, 2008.

Bejosano F P, Corke H (1998a) Effect of Amaranthus and Buckwheat Proteins on Wheat Dough Properties and Noodle Quality. Cereal Chemistry 75(2): 171-176.

Dirección URL: http://www.eluniversal.com. mx/notas/564238.html [Consulta Diciembre 2008].

S. H. Morán Bañuelos et al.

25

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Espitia R E (1994) Breeding of Grain Amaranth. In: Paredes-López O. (ed.) Amaranth Biology, chemistry and technology. CRC Press, Boca Raton USA pp: 23-38. Espitia R E, Mapes S C, Escobedo L D, De la O O M, Rivas V P, Martínez T G, Cortés E L, Hernández C J M (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. SINAREFI-INIFAP-UNAM, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. 201 p. Feine L B, Harwood R R, Kauffman S C, Senft J P (1979) Amaranth: Gentle giant of the past and future. In: Ritchie, G. A. (ed.) New Agricultural Crops. Boulder: West view Boulder, C. O. pp: 41-63. Iturbide G A, Gispert M (2012) [En línea] Amarantos de grano (Amaranthus spp.). Dirección URL: http://www.rlc.fao.org/es/ agricultura/produ/cdrom/contenido/libro09/ Cap2_6.htm#36 [Consulta: Agosto de 2012] Jiménez P B, Villela F S (2003) Rituales y Protocolos de Posesión Territorial en Documentos Pictográficos y Títulos del Actual Estado de Guerrero. Relaciones 95. Vol. XXIV. DEAS-INAH. México, D.F. pp: 95-116. Kirchhoff P, Odena L, Reyes G L (1976) Historia tolteca-chichimeca Instituto Nacional de Antropología e Historia, México. 287 p. López O G y Manzo R F (2010) [En línea] El sabor de la alegría. Amaranto de Tulyehualco. La Jornada del Campo. Número 29. 13 de febrero de 2010. Dirección URL: http://www.jornada. unam.mx/2010/02/13/sabor.html [Consulta: Agosto de 2012] Martínez M (1979) Catálogo de nombres vulgares y científicos de plantas mexicanas. Fondo de Cultura Económica. México. 1220 p. Morales O J (2012) Comunicación personal.

26

S. H. Morán Bañuelos et al.

Morales G J C, Vázquez M N, Bressani C R (2009) El amaranto: Características físicas, químicas, toxicológicas y funcionales y aporte nutricio. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán. 1era. edición México, D.F. Morrison A (2003) [En línea] The Tramways of Mexico. Dirección URL: http://www.tramz. com/mx/mc/mc00.html [Consulta: Agosto de 2012] Mundo M J (2012) Comunicación personal. Ortíz R (1997) Amaranto, historia perspectivas. YUG. México, D.F. 112 p.

y

Oettinger M, Horcasitas F (1982) The Lienzo of Petlacala. A Pictorical Document from Guerrero, Mexico. The American Philosophical Society, Philadelphia, USA. pp: 61-64. Ramírez M B (2007) Los procesos socioculturales de los productores de Tulyehualco, D.F. y la tecnología agrícola tradicional del amaranto, en la perspectiva de la sustentabilidad. Tesis de Maestría en Ciencias. Chapingo, Estado de México. 326 p. Ramírez M B, Torres C G, Muro B P, Muruaga M J, López M D (2010) Los productores de amaranto en la Zona de Conservación Ecológica Teuhtli. Revista de Geografía Agrícola 44:57-69. Rojas R T (1991) La agricultura en la época prehispánica. In: La agricultura en tierras mexicanas desde sus orígenes hasta nuestros días. T Rojas R (Coordinadora). Grijalbo. México, D.F. pp: 15-138. Reyna T T (1988) Investigaciones recientes sobre amaranto. Universidad Nacional Autónoma de México. México, D.F. 101 p. Sahagún F B (1969) Historia general de las cosas de la Nueva España. Edición preparada por Ángel Ma. Garibay K., 4 vol., Porrúa, México.

Capítulo II. Tzoalli, de cuerpo de dioses a alegría de mortales

Sahagún F B (1979) Códice Florentino de la Colección Palatina de la Biblioteca Palatina de la Biblioteca Medicea Laurenziana, 3 vols., AGN/ Secretaría de Gobernación, México, 1979. Tristán de la C M E (1994) Producción, Transformación y Comercialización del Amaranto (Amaranthus hypochondriacus) en Tulyehualco, D. F. Tesis de Ingeniero Agrónomo. Chapingo México. 44p. Valdés-Rodríguez S, Guerrero-Rangel A, Mendoza-Villagómez C, Chagolla-López A, Delgado-Vargas F, Martínez-Gallardo N, Sánchez-Hernández C, Délano-Frier J (2007) Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress. Plant Physiology and Biochemistry 45: 790-798. Velasco L A M L (2001) Los cuerpos divinos: la utilización del amaranto en el ritual mexica. In: Animales y plantas en la cosmovisión mesoamericana. Y González T (Coordinadora). CONACULTA-INAH. Plaza y Valdés. México, D.F. pp: 39-63. Velasco L A M L (2009) El maíz en la comida y la cosmovisión prehispánica. Diario de Campo 52:86-97. Velasco L A M L (2012) Comunicación personal. Villela F S L (1998) [En línea] Simbolismo y ritual en la Montaña de Guerrero. TRACE 33: 30-38. Dirección URL: http://horizon. documentation.ird.fr/exl-doc/pleins_textes/ doc34-05/010022495.pdf [Consulta: Agosto de 2012] Villela F S L (2012) [En línea] Cosmovisión indígena. Dirección URL: http://www. nacionmulticultural.unam.mx/Edespig/ diagnostico_y_perspectivas/diversidad_ etnica/1%20DIVERSIDAD%20 ETNICA%20Y%20LINGUISTICA/4%20 COSMOVISION%20INDIGENA/ Estado%20del%20desarrollo%20(Cap%2013). pdf [Consulta: Agosto de 2012] S. H. Morán Bañuelos et al.

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Genética Molecular

Capítulo III

El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus L.: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento THE TRANSCRIPTOME OF Amaranthus hypochondriacus L.: A POWERFUL TOOL FOR ITS DEEPER UNDERSTANDING AND UTILIZATION

John P. Délano-Frier1§ y Norma A. Martínez-Gallardo1 1Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato) Km 9.6 del Libramiento Norte. Carretera Irapuato-León. Apartado Postal 629, C.P. 36821, Irapuato, Gto., México. §Autor de correspondencia: [email protected] Teléfono: (52) 462 39636 ó 462 39600 FAX: (52) 462 45996 ó 462 39611

RESUMEN Se realizó un análisis transcriptómico en Amaranthus hypochondriacus para identificar genes expresados en tallos pigmentados y en condiciones de estrés (a)biótico. De un total de 2,700,168 lecturas, se ensamblaron 21,207 secuencias de alta calidad agrupadas en 799 contigs y 20,408 isotigs. Los contigs, que son grupos de secuencias individuales que se superponen al compartir segmentos de su secuencia, tuvieron una longitud promedio de 930 pb. Los isotigs, que son variantes de un mismo contig generadas por splicing alternativo, tuvieron una longitud promedio de 1064 pb. Los isotigs se agruparon en 15,667 isogrupos, que representan transcritos únicos. Se registraron 5113 singletons éstas son secuencias únicas que no se alinearon con ninguna otra. El proceso de anotación y funcionalidad, se hizo consultando varias bases de datos, incluyendo una dedicada exclusivamente a las amarantáceas. Una análisis in silico identificó 1971 genes, muchos de función desconocida, que se expresaron diferencialmente en respuesta a estrés. Algunos de ellos son ahora parte de un análisis funcional para evaluar su capacidad de conferir resistencia a múltiples condiciones de estrés en plantas modelo.

Paralelamente, este transcriptoma se está usando como base para el estudio de sus respuestas de defensa inducibles contra insectos y patógenos y de los mecanismos que permiten su excepcional tolerancia a la defoliación. También se emplea para conocer de qué manera se promueve el crecimiento y el rendimiento al ser inoculado con microorganismos benéficos del suelo. Además, genes asociados con pigmentación se están estudiando para evaluar su función en la resistencia a estrés. Así, el transcriptoma del amaranto es la base de una intensa investigación enfocada hacia un mejor entendimiento de los factores que hacen del amaranto una planta de tan excepcionales características. Esta información será de utilidad para la selección asistida en el mejoramiento genético del amaranto y otros cultivos comerciales mucho más susceptibles a condiciones medio-ambientales adversas. Palabras clave: amaranto, transcriptoma, resistencia al estrés, defensa, tolerancia, mejoramiento agronómico. ABSTRACT A large scale transcriptome analysis was performed to generate pigmented stem and (a) 31-48

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biotic stress-responsive gene expression profiles in grain amaranth. A total of 2,700,168 raw reads were obtained, which were assembled into 21,207 high quality sequences grouped into 799 contigs, which are groups of independent reads with segments of overlapping sequence and 20,408 isotigs, which are alternative splicing variants of a given transcript. The average sequence length was 1,064 bp and 930 bp for isotigs and contigs, respectively. Contigs/isotigs were further incorporated into 15,667 isogroups, representing a collection of isotigs containing reads that imply connections between them. Only 5,113 singletons were recovered after quality control; these are individual sequences unable to be grouped into a contig. All unique sequences were queried against several databases for annotation and functionality. Digital expression analysis identified 1,971 differentially expressed genes, many of unknown function, in response to the stress treatments tested. The functional characterization of some of these genes is now in progress to test for multiple stress resistance in model plants. Parallel investigations using the information provided by the transcriptome are being performed to study inducible defense responses against pests and pathogens. It is also being utilized to determine the mechanisms underlying its exceptional tolerance to defoliation, which is based on an active mobilization of its carbohydrate reserves. It´s use will also help to determine how beneficial soil bacteria promote growth and increase yields in amaranth, and the possible role of pigmentrelated genes in stress resistance. Thus, the amaranth transcriptome has become the basis of a research program aimed to gain a better understanding of the factors that contribute to the exceptional qualities of amaranth. The information gained will surely find application in programs designed to increase the agronomic performance of amaranth and also of much more susceptible commercial crops, particularly under stress. Key words: amaranth, transcriptome, stress resistance, defense, tolerance, agronomic improvement.

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INTRODUCCIÓN El amaranto pertenece a la familia de las amarantáceas compuesta por 70 géneros. El género Amaranthus (Caryophyllales: Amaranthaceae) comprende alrededor de 60 especies. Es una planta dicotiledónea no gramínea que produce semillas tipo granos, por lo que se le ha denominado como pseudocereal (Belton y Taylor, 2002). Por el tipo de usos que tiene, el amaranto se clasifica también en amaranto de grano y foliáceo, aunque también se usa con fines ornamentales. Los primeros se reconocen como originarios de América y comprenden tres especies: A. cruentus, A. hypochondriacus y A. caudatus, mientras que entre los amarantos productores de hoja, se encuentran A. cruentus, A. dubius, A. hybridus y A. tricolor, todos ellos cultivados principalmente en Asia y África (Shukla et al., 2006; Morales Guerrero et al., 2009). Otras especies son malezas agresivas que afectan muchas zonas de producción agrícola en el mundo (Steckel, 2007). Las semillas contienen niveles elevados de proteína total, así como del aminoácido lisina (Belton y Taylor, 2002) generalmente deficiente en otros cereales. Además, estas proteínas generan, al hidrolizarse, péptidos biológicamente activos, mientras que los lípidos son una rica fuente de fitoesteroles, incluyendo escualeno. Por ello, se sugiere que su consumo puede ser benéfico en personas con problemas de hipertensión, enfermedades cardiovasculares asociadas a hiperlipidemias, diabetes y ofrece, además, el potencial de prevenir algunos tipos de cáncer (Marcone et al., 2004; Martirosyan et al., 2007; HuertaOcampo y Barba de la Rosa, 2011). Las hojas también contienen altos niveles de proteína, minerales como calcio, magnesio y fósforo, así como vitaminas, principalmente ácido ascórbico (Akubugwo et al., 2007). El interés por el amaranto a nivel mundial, como fuente de grano y verdura, ha ido gradualmente en aumento ya que además de su alto contenido nutricional, posee numerosas características agronómicas deseables, como una alta tolerancia a suelos pobres y/o salinos, climas semiáridos y/o condiciones desfavorables del medio ambiente, así como la producción de grandes volúmenes de biomasa. Además, el amaranto de grano es considerado una excelente

Capítulo III. El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento

alternativa para regiones con dificultades para la siembra de cereales (Brenner et al., 2000; Kadereit et al., 2003; Omami et al., 2006; Huerta-Ocampo et al., 2009). La habilidad de crecer en condiciones de sequía que caracteriza al amaranto está relacionada directamente con una sobresaliente eficiencia del uso del agua (EUA). Varios estudios han señalado que la EUA en amaranto es superior al de la mayoría de cultivos C3 y C4, entre los que se incluyen trigo, maíz, algodón y sorgo (Weber, 1990). La eficiente EUA del amaranto también se ha asociado a su alta tolerancia a la salinidad (Omami et al., 2006). La tolerancia a la sequía del amaranto se atribuye, también, a su fisiología C4, a un hábito de floración no determinado y a la capacidad de generar largas raíces principales, así como de un extenso sistema de raíces laterales, en respuesta a la falta de agua en el suelo (Putnam, 1990; Johnson y Henderson, 2002). Asimismo, los resultados de un reciente estudio basado en el uso combinado de estrategias proteómicas y genómicas sugieren que la resistencia a sequía en amaranto se debe a una respuesta coordinada que incluye la acumulación de solutos compatibles y la expresión de genes diseñados para evitar el estrés oxidativo causado por la inevitable formación de especies reactivas de oxígeno durante condiciones de estrés (Takahashi y Murata, 2008; Chaves et al. 2009), y para conferir estabilidad a las proteínas y regular el crecimiento (Huerta-Ocampo et al., 2009, 2010). La actual revolución genómica ha facilitado la identificación y entendimiento del mecanismo de acción de un gran número de genes, especialmente en plantas modelo como Arabidopsis thaliana. Sin embargo, el progreso en este sentido ha sido limitado cuando se trata de especies vegetales marginalmente estudiadas, entre las cuales está el amaranto. Éstas son usualmente de interés para grupos de investigación pequeños, con recursos económicos que raramente permiten invertir en programas de secuenciación genómicos/transcriptómicos masivos que aún son costosos y, que además, usualmente carecen de las herramientas bioinformáticas necesarias para analizar el alud de información generado por los secuenciadores actuales o de “nueva generación”. Otro factor limitante, es que normalmente estas plantas

marginadas o poco estudiadas carecen del valioso apoyo que representa tener como referencia el genoma totalmente secuenciado de una especie relativamente cercana, el cual normalmente se utiliza para organización de datos genómicos en una especie recién secuenciada (Wheat et al., 2010). A pesar de ello, se han podido usar herramientas moleculares para realizar un reducido número de estudios genómicos/ transcriptómicos avanzados en amaranto: en 2008, se generó una biblioteca de los llamados BACs (de Bacterial Artificial Chromosomes) conteniendo el genoma completo de A. hypochondriacus, con una cobertura aproximada de 10.6 veces (Maughan et al., 2008). Ésta fue empleada un poco más adelante para identificar ADN satélite en amaranto de grano, el cual fue usado posteriormente para clarificar relaciones taxonómicas dentro del complejo de A. hybridus, del cual se cree provienen las especies modernas de amaranto usadas para la producción de grano (Mallory et al., 2008). Inclusive, se empleó la pirosecuenciación 454 para obtener datos genómicos de un amaranto silvestre (A. tuberculatus), que es una de las malezas más agresivas de los cultivos de maíz y soya en los Estados Unidos (Lee et al., 2009). Esto se hizo con la intención de obtener información relevante acerca de su capacidad de generar una rápida tolerancia a herbicidas con el propósito de emplearla para el diseño de mejores estrategias de control de malezas (Lee et al., 2009). También se generó el transcriptoma de esta especie, del cual se generaron cerca de 50,000 secuencias únicas, muchas de ellas similares a las presentes en A. thaliana, y se identificaron genes nuevos, potencialmente asociados a la resistencia a herbicidas (Riggins et al., 2010). Finalmente, la pirosecuenciación 454 fue empleada para detectar polimorfismos en poblaciones de A. caudatus (Maughan et al., 2009). En este capítulo se describirán inicialmente los resultados del primer análisis transcriptómico de novo de A. hypochondriacus, el cual fue realizado para identificar genes relacionados con estrés (a)biótico y pigmentación. Posteriormente, se hará mención de la utilización que se le está dando actualmente a la vasta información generada por el transcriptoma para conocer aspectos importantes y poco conocidos del amaranto de grano, como los siguientes: J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

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resistencia a insectos, patógenos bacterianos y fitoplasmas; resistencia a estrés por sequía y salinidad; tolerancia a la defoliación, basada en la movilización activa de sus reservas de carbohidratos; posible función de los pigmentos en defensa y quizá protección al estrés, y mecanismos de promoción del crecimiento por microorganismos del suelo. Además, se ha usado para dar los primeros pasos en el descubrimiento de nuevos genes que pudieran tener el potencial de aplicarse para el mejoramiento agronómico del amaranto y otros cultivos de importancia. MATERIALES Y MÉTODOS El transcriptoma de A. hypochondriacus se obtuvo de acuerdo a las metodología descrita en Délano-Frier et al. (2011). Para ello se empleó la pirosecuenciación 454, una de las tecnologías de secuenciación masiva, llamadas de la “nueva generación”, surgidas en 2005 y ahora ampliamente disponibles. Antes de su irrupción en los laboratorios, el análisis transcriptómico involucraba la generación de extensas bibliotecas de ADN complementario (ADNc), en los cuales fragmentos de ADNc de diversa longitud y casi nunca completos, producidos de transcritos o ARN mensajeros (ARNm) por una reacción llamada de transcripción reversa, eran subsiguientemente insertados en plásmidos. Éstos son pequeños fragmentos de ADN circular que pueden ser fácilmente clonados en bacterias para su manipulación y almacenamiento (Bouck y Vision, 2007). Esta es una labor muy intensa y costosa. Además, adolece de cuatro debilidades experimentales: 1) dificultad para detectar genes raros cuya expresión es normalmente baja, ya que se diluyen dramáticamente ante una mayoría de genes, llamados de house keeping o mantenimiento celular básico, que pueden llegar a constituir hasta 50% de los transcritos presentes en la biblioteca, dependiendo del tejido del cual fueron aislados y/o de las condiciones experimentales; 2) la pérdida irreversible de ciertos transcritos debido al efecto letal que producen al expresarse, en las bacterias que los contienen (aunque este problema ha sido resuelto mediante el uso de vectores en los cuales los ADNc insertados no se expresan; Weber et al., 2007); 3) la tendencia a que los ADNc pequeños e incompletos predominen, en 34

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detrimento de ADNc largos e incluso completos, que es el resultado deseado, simplemente debido a que la eficiencia de transformación bacteriana favorece a los plásmidos más pequeños, y 4) el uso de la clásica técnica de Sanger, lenta, lineal y limitada a ≈ 700 pb, para determinar la secuencia de estos ADNc (Sanger et al., 1975). La pirosecuenciación 454 masiva y en paralelo evita todos estos problemas, ya que utiliza ADN no clonado que es inicialmente cortado al azar. Luego, los múltiples fragmentos individuales son subsiguientemente secuenciados masiva y simultáneamente en nano placas (¡de 1.59 × 106 pozos!). Esto es posible gracias a avances tecnológicos que permiten tanto la micro amplificación de ADN en cada pozo así como la detección diferencial de la incorporación de nucleótidos a cada secuencia en crecimiento. Ésta se logra detectando los pulsos de luz generados por la liberación de pirofosfato producida durante la extensión de la cadena de ADN catalizada por la ADN polimerasa (Margulies et al., 2005). De este modo, una corrida de 4 h, realizada en los primeros modelos de estos secuenciadores generaba aproximadamente 300,000 lecturas de una extensión promedio de 110 pb cada una, equivalente a un total ≈ 33 Mpb. Modelos posteriores de mucho mayor eficiencia, como los empleados para obtener el transcriptoma del amaranto (e.g. Roche-454 GS FLX y Roche-454 GS FLX; 454 Life Sciences, Branford, CT, USA) permiten un número similar de lecturas por corrida pero de una longitud aproximada de 500 pb. En nuestro estudio, se hicieron un total de seis corridas, con ADNc generado de plantas de A. hypochondriacus var. Revancha y A. hypochondriacus, accesión India 38040. Ésta última fue elegida por su intensa pigmentación, y fue usada exclusivamente para el estudio del transcriptoma de tallo. Las semillas fueron donadas por los Dres. Eduardo Espitia (Inifap) y David Brenner (Iowa State University, EUA), respectivamente. Se generaron plántulas a partir de semilleros en mezcla de germinación, las cuales se transfirieron posteriormente a macetas de 1.3L conteniendo un substrato estéril compuesto por tres partes de mezcla Sunshine 3TM (SunGro Horticulture, Bellevue, WA), una parte de greda rica en humus, dos partes de turba, una parte de vermiculita (SunGro Hort) y una parte de perlita (Termolita S.A., Nuevo León, México).

Capítulo III. El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento

Una vez que alcanzaron seis hojas expandidas, las plantas se separaron en diferentes grupos para ser sometidas a cuatro diferentes tratamientos: 1) estrés salino agudo, producido al regar las macetas con una solución de 400 mM de NaCl por tres días consecutivos (equivalente a una concentración de sal en el suelo sólo tolerada por especies halófilas y extremófilas; fact sheet No. 66/00, http://www.pir.sa.gov.au/factsheets); 2) estrés por sequía, producido por la falta de riego por tres días consecutivos, lo que provocó una marchitez evidente en las plantas al término del tratamiento, quizás por su incapacidad de buscar fuentes de agua mediante el crecimiento de su raíz principal y proliferación de sus raíces laterales; 3) herbivoría continua hasta por 24 h por larvas de Estigmene acrea, un insecto masticador generalista colectado de plantaciones experimentales de amaranto en Irapuato, Gto., y 4) infección con Pseudomonas sp., clasificada tentativamente como P. argentinensis, que resultó tener una interacción virulenta con amaranto y que fue aislada también de plantíos experimentales de amaranto. Se generaron bibliotecas normalizadas de ADNc, es decir, tratadas de un modo tal que favorecieron que cada transcrito, por más raro que este fuera, estuviera representado más o menos equitativamente en la población total de transcritos a partir de ARN total. Éste fue extraído de plantas intactas, de plantas sometidas a cada uno de los tratamientos descritos, y del tallo pigmentado, y se usó para realizar cuatro corridas de pirosecuenciación independientes; en la quinta y sexta corridas, el ADNc de del control y cada uno de los tratamientos/ tejidos (estrés salino, sequía, herbivoría, infección bacteriana y tallo pigmentado) se distribuyó uniformemente en una de las cuatro secciones de la placa de secuenciación. Los resultados de estas dos últimas corridas fueron empleados para realizar el análisis de expresión digital (ver más adelante). La pirosecuenciación se realizó como un servicio externo en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad, en el Cinvestav, Unidad Irapuato. Las secuencias obtenidas de estas corridas se ensamblaron de novo (es decir, sin la ayuda de un genoma de referencia) usando la versión 2.3 del programa Newbler, el cual tiene

una opción para el ensamblado de transcriptomas. Ésta permite la formación de isogrupos a partir de isotigs, como se describió anteriormente. La anotación de las secuencias ensambladas se hizo usando las siguientes herramientas bioinformáticas: Basic Local Alignment Search (BLASTX) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1990), la base de datos de secuencias no redundantes (nr) del Gene Bank y The Arabidopsis Information Resource (TAIR) para Arabidopsis thaliana (http://arabidopsis.org/ index.jsp). También, se usaron las bases de datos UniRef50 and UniRef100 (UniProt Reference Clusters; European Bioinformatics Institute) y todos los ADNc de plantas pertenecientes a la familia Amaranthaceae depositadas en el GenBank (básicamente betabel, espinaca y varias halófitas). Las secuencias que no dieron un hit significativo (E ≥ 1×10-10) con estas bases de datos se compararon con la base de datos PFAM para intentar anotarlas en base a la presencia de ciertos dominios conservados en sus proteínas (Sonnhammer et al., 1997). Los resultados que resultaron significativos después un búsqueda BLAST contra la base de datos TAIR se usaron para obtener la anotación funcional de las secuencias (Ashburner et al., 2000). El análisis de expresión digital se realizó para cuantificar los cambios de expresión de cada uno de los transcritos detectados en amaranto en las diferentes condiciones de estrés estudiadas y expresados diferencialmente en el tallo. Básicamente, este análisis consistió en contar el número de secuencias de transcritos de un gen en particular en cada uno de los tratamientos y compararlo, después de un proceso de normalización, con el número de secuencias del mismo gen obtenido en plantas control y en tallo. En este análisis, los transcritos con lecturas ≤ 5 fueron descartados. Los transcritos expresados diferencialmente en uno o más tratamientos y/o tallo se detectaron usando técnicas estadísticas (R y X2) (http://telethon. bio.unipd.it/bioinfo/IDEG6_form/) (Romualdi et al., 2003). Se consideró que la expresión de un transcrito era diferencial cuando al menos una de las dos pruebas estadísticas generó un valor de significancia ≤ 0.0001.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS DE SECUENCIACIÓN, ENSAMBLADO Y ANOTACIÓN DEL TRANSCRIPTOMA Se generaron ≈ 910 Mpb, equivalentes a 2, 913, 966 secuencias crudas. Éstas se depositaron en el Sequence Read Archive (SRA) del NCBI. El proceso de ensamblado generó

21,207 secuencias de alta calidad (20,408 isotigs + 799 contigs). El tamaño de estas secuencias se distribuyó dentro de un rango de tamaño de 80 a 3,379 pb con un tamaño promedio de 1,014 pb (para isotigs) y 930 bp (para contigs) (Figura 1). Además, se obtuvieron 5,113 singletons. Los isotigs se incorporaron, a su vez, en 15,667 isogrupos. Un resumen del proceso de secuenciación y ensamblado se presenta en el Cuadro 1.

3000

No. de Contigs

2500 2000 1500 1000

0

0-100 101-200 201-300 301-400 401-500 501-600 601-700 701-800 801-900 901-1000 1001-1100 1101-1200 1201-1300 1301-1400 1401-1500 1501-1600 1601-1700 1701-1800 1801-1900 1901-2000 2001-2100 2101-2200 2201-2300 2301-2400 2401-2500 >2500

500

Longitud de los contigs/isotigs (pb)

Figura 1. Distribución de acuerdo a su longitud de los contigs/ isotigs obtenidos después del ensamblado de los reads. Cuadro 1. Resumen del análisis transcriptómico de A. hypochondriacus (Modificado de Delano et al., BMC Genomics 2011).

INFORMACIÓN INICIAL Total de nucleótidos (nt) Número de secuencias crudas (reads) Número de secuencias limpias Total de nucleótidos usados en el ensamblado ENSAMBLADO Nucleótidos alineados Secuencias (reads) alineadas Secuencias ensambladas Total de singletons Singletons de buena calidad Secuencias desechadas (muy cortas, repetidas, incongruentes, etc.) ENSAMBLADO EN CONTIGS Nucleótidos ensamblados en contigs Total de contigs Contigs: Tamaño promedio Contigs: Tamaño máximo ENSAMBLADO EN ISOTIGS Nucleótidos ensamblados en isotigs No. promedio de contigs por isotig Máximo No. de contigs por isotig Isotigs: tamaño promedio Isotigs: tamaño máximo 36

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909, 631, 600 2, 913,966 2, 700, 168 877, 153, 000 803, 229, 499 2, 417, 008 1, 886, 081 178, 636 5, 900 171, 819 15, 170, 717 15, 608 971 3, 379 20, 710, 069 1.7 17 1, 014 4, 762

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ENSAMBLADO EN ISOGRUPOS No. total de isogrupos No. promedio de isotigs por isogrupo No. promedio de contigs por isogrupo No. máximo de contigs por isogrupo No. máximo de isotigs por isogrupo No. de isogrupos con un solo isotig ANOTACIÓN No. de secuencias anotadas con la base de datos nr No. de secuencias anotadas con la base de datos TAIR No. de secuencias anotadas con la base de datos UniRef 50 y 100 No. de secuencias anotadas con la base de datos Amaranthaceae No. de singletons anotados con la base de datos TAIR

Aproximadamente 82% de las secuencias agrupadas en contigs/isotigs y cerca de 1000 singletons produjeron hits significativos (E ≤ 1×10-10) al ser comparadas con las bases de datos empleadas para su anotación. La anotación funcional se determinó dentro de de las categorías de Proceso Biológico, Proceso Molecular y Componente Celular. Los resultados se muestran en la Figura 2. En la primera categoría, se encontró que 3% de los contigs/ isotigs pudieron agruparse dentro de genes estimulados por estrés, 2% en procesos de desarrollo y un 4% adicional en otros procesos biológicos y metabólicos. Estas categorías eran de particular interés para nosotros considerando que uno de los objetivos primordiales de este análisis transcriptómico fue la identificación de genes asociados con respuestas a estrés (a)biótico (ver más adelante). De entre los transcritos con una posible función defensiva, los cuales representaron aproximadamente 1% del total 1%

A)

3%

1%

1%

15, 667 1.3 3.0 22, 172 52 12, 950 22, 105 11, 499 17, 440 10, 846 1000

de transcritos anotados funcionalmente, más de la mitad se relacionó con genes asociados con respuesta a infección bacteriana (41%) y/o regulados por ácido jasmónico (AJ) (24%), incluyendo muchos genes involucrados en la síntesis o rutas de señalización controladas por AJ (Figura 3). Muchos de estos genes se están estudiando con más detalle en un proyecto cuyo objetivo es estudiar las respuestas de defensa que se inducen en amaranto, y el costo fisiológico en términos de crecimiento y rendimiento que esto involucra, al aplicar diferentes estímulos. Para ello se eligió la aplicación exógena de AJ o de un compuesto análogo al ácido salicílico, llamado BTH (conocido comercialmente como BION® o Actigard™), que es usado en ciertos cultivos agrícolas para protegerlos contra la infección de patógenos. También se incluyó la respuesta de defensa inducida por la interacción con una bacteria avirulenta (Ver Capítulo X de Casarrubias-Castillo).

2% 8%

3%

8%

46%

1% 3% 2%

1%

Organización celular y biogénesis Procesos de desarrollo Metabolismo de ADN o ARN Transporte de electrones y energía Otros procesos biológicos Otros procesos celulares Otros procesos metabólicos Metabolismo de proteínas Respuesta a estrés (a)biótico Respuesta a estrés Transducción de señales Transcripción Transporte Procesos biológicos desconocidos Función desconocida

4%

16%

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1%

B)

8%

1% 1% 1% 1% 2% 4% 4%

46%

3% 2% 4%

6%

Pared celular Cloroplasto Citoplasma Retículo endoplásmico Apoplasma Aparato de Golgi Mitocondria Núcleo Otros componentes celulares Otros componentes citoplásmicos Otros componentes intracelulares Otros componentes membranales Membrana plasmática Plastidios Ribosomas Componente celular desconocido Función desconocida

2% 12%

0.3%

3% 6% 3%

C)

1% 3% 5%

45%

7%

1% 5% 0.2% 2% 3%

1%

Unión a ADN o ARN Actividad hidrlítica Actividad tipo cinasa Unión a ácido nucléicos Unión a nucleótidos Otro tipo de unión Otro tipo de actividad enzimática Otro tipo de función molecular Unión a proteínas Receptor o unión a receptor Moléculas estructurales Factores de transcripción Transferasas Transportadores Funciones moleculares desconocidas Función desconocida

3% 12%

Figura 2. Resumen de la anotación de los isotigs/contigs obtenidos del transcriptoma de novo de A. hypochondriacus. Las secuencias se anotaron de acuerdo a 3 grupos: (A) ‘Procesos Biológicos’, (B) ‘Función Molecular’ y (C) ‘Componente Celular” y 45 subgrupos. 1% Otros procesos Defensa

6%

12% Hongos Bacterias Interacción incompatible Ácido Jasmónico Ácido Salicílico

24%

99% 41%

17%

Figura 3. Número de isotigs/contigs de of A. hypochondriacus categorizados dentro de la respuesta a estrés biótico.

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Capítulo III. El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento

En general, el análisis transcriptómico del amaranto permitió la identificación de una gran variedad de genes involucrados en defensa, muchos de ellos reportados en esta especie por primera vez, como por ejemplo genes que muy posiblemente contribuyan a la síntesis de fitoecdisteroides y oxalatos, que se cree son utilizados por el amaranto y otras especies con propósitos defensivos, principalmente contra insectos herbívoros (Schmelz et al., 2002; Korth et al., 2006; Bakrim et al., 2008). También se detectaron numerosos tipos de genes defensivos, incluyendo numerosas lectinas, proteasas e inhibidores de proteasas, proteínas asociadas con patogénesis, cinasas similares a receptores que son indispensables en respuestas de defensa innata y enzimas involucradas en la generación de la respuesta hipersensible y de las especies reactivas de oxígeno asociadas con ella, y su posterior detoxificación, entre otras. Una lista de estos genes de naturaleza defensiva se presenta en los Cuadros 2 y 3. Resulta hasta cierto punto paradójico encontrar tan rico arsenal de genes defensivos en una especie considerada como altamente tolerante a la defoliación, ya que usualmente tolerancia y resistencia son dos características mutuamente excluyentes, aunque no es raro encontrar excepciones en situaciones naturales (Nuñez-Farfan et al., 2007; Schmidt y Baldwin, 2009). En relación al posible mecanismo de tolerancia a defoliación, resultó importante identificar genes potencialmente

asociados con mecanismos de compensación de fotosíntesis, síntesis y degradación de almidón, síntesis e hidrólisis de sacarosa, movilización de carbohidratos y señalización por azúcares, entre otros (Figura 4). Su estudio podría mejorar el entendimiento de los mecanismos sobre los cuales se basa la excepcional tolerancia a la defoliación en amaranto, causada mecánicamente o por insectos masticadores. Ésta se basa, al parecer, en una eficiente utilización, movilización y recuperación de las reservas de carbohidratos. La participación de muchos de estos genes en el proceso de tolerancia a la defoliación está empezando a ser analizada en nuestro laboratorio, y el panorama que se tiene de su importancia en este proceso, hasta el momento, se describe con más detalle por CastrillónArbeláez en el capítulo 7 de este libro. Aspectos adicionales y complementarios de la tolerancia a la defoliación por insectos, que i) involucran utilización de reservas de carbohidratos almacenadas en raíz y tallo para amortiguar eventos de defoliación completa sin afectar significativamente la productividad en cuanto a producción de semilla, y ii) que demuestran que el amaranto puede tolerar y resistir (i.e. mediante la inducción de genes de defensa, como inhibidores de proteasa) simultáneamente la perdida de tejido foliar por herbivoría o daño mecánico, se describen a profundidad por Vargas-Ortiz en el Capítulo VIII de este libro. Asimismo, se identificaron varios genes

Cuadro 2. Algunos genes representativos, relacionados con defensa y estrés abiótico identificados en el análisis transcriptómico del amaranto (Parte 1).

FUNCIÓN Y NOMBRE DEL GEN TOTAL1 6 3 2 35 17 8 26 6 2 5 2 5 6

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Amaranto: Ciencia y Tecnología Continúa Cuadro 2...

FUNCIÓN Y NOMBRE DEL GEN TOTAL1 3 6 9 6 1 6 5 20 4 2 1 3 14 21 6 6 5 10 15 2 2 1 4 3 1Isotigs y/o contigs Cuadro 3. Algunos genes representativos, relacionados con defensa y estrés abiótico identificados en el análisis transcriptómico del amaranto (Parte 2).

FUNCIÓN Y NOMBRE DEL GEN TOTAL1 10 2 1 2 5 9 15 18 30 11 9 3

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Capítulo III. El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento Continúa Cuadro 3...

FUNCIÓN Y NOMBRE DEL GEN TOTAL1 16 14 5 27 6 2 22 2 6 18 7 2 12 4 4 2 2 18 Isotigs y/o contigs

1

21 33

Metabolismo de sacarosa (síntesis y degradación) Metabolismo de almidón (síntesis y degradación) Señalización por azúcares

2

Transportadores: glucosa, sacarosa, triosas fosfato, fosfato, fotoenolpiruvato

46

Figura 4. Número de isotigs/contigs de of A. hypochondriacus genes relacionados con la síntesis, metabolismo, almacenamiento y movilización de carbohidratos.

relacionados con síntesis o señalización por fitohormonas y con el proceso de floración (Figura 5). Algunos de estos pudieran estar relacionados, por ejemplo, con el incremento en el número de ramificaciones que se observa en plantas de amaranto defoliadas severamente, quizás por la pérdida de dominancia apical causada por la alteración en los niveles endógenos de auxinas y citocininas (Leyser, 2005) y con el rápido rebrotar de tejido foliar después de defoliación, quizás estimulado por una combinación de giberelinas, brasinoesteroides y posiblemente citocininas (Achard et al.,

2009; Clouse y Sasse, 1998; Werner et al., 2001; Dayan et al., 2012). Genes asociados con fitohormonas, principalmente auxinas, además de genes clave en fotosíntesis C4 y en otros procesos, como transporte de azúcares y aminoácidos y regulación de la relación tejido fuente-consumidor, también se están estudiando para tener un mejor entendimiento de los mecanismos mediante los cuales la inoculación con bacterias del suelo benéficas promueven el crecimiento y, posiblemente, el rendimiento de grano, en amaranto. Este tema se describe con más detalle en el capítulo sobre promoción de crecimiento en amaranto escrito por Parra-Cota J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

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119

A)

Floración Auxinas Citocininas Giberelinas Ácido Abscísico Etileno 0.57% 2.73%

166

B)

199

55

41

Contigs Relacionados a Floración Contigs Relacionados a Hormonas Resto

96.69%

Figura 5. (A) Número de isotigs/contigs de of A. hypochondriacus categorizados dentro de función hormonal y floración. En (B) se muestra la abundancia relativa de estos genes en el transcriptoma.

en el Capítulo IX de este libro. Además, el análisis de genes relacionados con fitohormonas con aquellos que pudieran ser similares a los que controlan el proceso de floración en otras especies, como el gen CONSTANS o APETALA (Putterill et al., 2004; Jaeger et al., 2006), podrían dar un indicio de los cambios morfológicos severos que se producen en plantas de amaranto infectadas con fitoplasmas, como la filodia y el desperfecto llamado “escoba de bruja”, entre otros (OchoaSánchez et al., 2009). El ensayo de expresión digital en hojas de amaranto permitió la identificación de 1971 genes diferencialmente expresados en respuesta a al menos uno de los cuatro tratamientos de estrés aplicados. Muchos genes de función desconocida aparecieron en este análisis, algunos de ellos inducidos por múltiples condiciones de estrés. Esto permite pensar en la posibilidad de descubrir nuevos genes que pudieran tener aplicaciones agro-biotecnológicas importantes. El estudio de uno de ellos, llamado Ah24, que no fue identificado en ninguna de las bases de datos existentes y carece de dominios conservados evidentes es, al parecer, un nuevo modulador de la respuesta a daño mecánico y herbivoría 42

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mediada por AJ (Massange-Sánchez, 2011). La identificación del gen Ah24 coincidió con los resultados del análisis proteómico de hojas de amaranto tratadas con AJ o sometidas a daño mecánico o herbivoría por insectos masticadores. Los detalles de este trabajo se describen en el Capítulo VI de este libro, escrito por Navarro Meléndez. En estos momentos la caracterización funcional de este gen se está realizando en plantas transgénicas de tabaco (Nicotiana tabacum) y A. thaliana. El análisis in silico también permitió la identificación de numerosos factores de transcripción, muchos de ellos capaces de regular respuestas de estrés en otras especies de plantas, y de genes que se han identificado como parte del arsenal de genes que permite a plantas xerófitas, halófitas o extremófilas sobrevivir en hábitats inaccesibles para la gran mayoría de las plantas, como licopeno sintasa (Han et al., 2008) acuaporinas o canales de agua (Johansson et al., 2000), Mio-inositol-1-fosfato sintasa, (Baisakh et al., 2008) cistationina gamasintasa (Tabuchi et al., 2005) fosfoenolpiruvato carboxilasa (Cushman et al., 1989), canales de Na+/H+ y Ca2+/H+ (Li et L., 2011; Han et al., 2011), fosfatasa-2C (Senadheera y Maathuis,

Capítulo III. El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento

2009), proteína similar a calcineurina B (Chen et al., 2011), inositol monofosfatasa (Sahu y Shaw, 2009), y numerosas proteínas inducidas ya sea por sal o por condiciones generales de estrés (Guan et al., 2010). De estos genes se hizo una selección de aquellos que presentaron altos niveles de expresión en al menos tres de las condiciones de estrés analizadas. Se incluyeron, además, factores de transcripción poco estudiados y genes de función desconocida. La intención es introducirlos en plantas modelo, como Arabidopsis y tabaco, y en el propio amaranto una vez que se establezcan las condiciones para su transformación genética, para determinar si son capaces de conferir resistencia a múltiples condiciones de estrés (a)biótico, al sobreexpresarse por medio de un promotor fuerte y constitutivo. Los detalles de esta línea de investigación se describen con mucho más detalles en el Capítulo V de este libro, escrito por Palmeros-Suárez y Masssange-Sánchez. El análisis transcriptómico del tallo pigmentado permitió la identificación de transcritos que aparentemente son exclusivos de este tejido. Muchos de ellos tienen que ver con genes involucrados en la síntesis de la pared celular (e.g. pectinas, celulosa y hemicelulosa) y de las enzimas requeridas para su expansión, así como ceras, cutícula y lignina. Se detectaron también numerosos factores de transcripción (básicamente del tipo MYB, AP2-EREBP, GRAS, dominio bHLH y de reconocimiento de cajas homeóticas, como WOX4; Ji et al., 2010) cuya función es controlar la diferenciación de los tejidos vasculares, la síntesis de fibras, así como de regular la ruta de síntesis de fenilpropanoides, básicos para la síntesis de ligninas, sobre todo. Curiosamente, muchos transcritos asociados con respuestas a estrés abiótico mostraron una mayor expresión en tallo que en hojas sometidas a estrés. También se detectó una alta expresión de numerosos genes asociados comúnmente con defensa, muchos de ellos poco comunes. Entre estos sobresalen una metil transferasa de AJ y un CXE carboxilesterasa, ambos posiblemente asociados a señalización por AJ (Sasaki et al., 2001; Islam et al., 2010), una epóxido hidrolasa 2 (Wijekoon et al., 2008) y una proteína de procesamiento vacuolar VPE-1B, también asociada con resistencia estrés abiótico (Zhang

et al., 2010): Las dos últimas están involucradas en cierta medida en respuestas de defensa contra patógenos microbianos, como cierre de estomas, síntesis de compuestos antimicrobianos y generación de la respuesta hipersensible. Pero en general, el perfil trancriptómico no fue muy diferente al reportado para tallos en desarrollo de Arabidopsis (Ehlting et al., 2005; Minic et al., 2009) y Populus trichocarpa, una especie leñosa (Dharmawardhana et al., 2010). Por último, resultó importante el hallazgo de transcritos de genes como el de DOPA dioxigenasa (DODA), ciclo-DOPA glucosil transferasa (cDOPA-GT) y otros, como el que codifica a una 5-glucosiltransferasa similar a la de Phytolacca americana (Strack et al., 2003). Su importancia radica en que todos ellos están involucrados en la síntesis de pigmentos en amaranto. También se detectó un transcrito de un gen similar al gen DODA, o DODA-like gene, sólo detectado hasta ahora en plantas que producen antocianinas y cuya función es aún desconocida, aunque podría estar involucrado en defensa (Bahramnejad et al., 2010). El hallazgo de estos genes resultó consistente con el hecho de que fueron detectados predominantemente en tallo pigmentado. Actualmente, se está estudiando activamente el patrón de expresión de estos genes en diferentes tejidos, como raíz, tallo y hoja y en respuesta a diferentes tipos de estrés, como salinidad, sequía y herbivoría por insectos masticadores. Los resultados de este enfoque permitirán definir el papel que juegan estos genes en la resistencia a estrés (Casique-Arroyo G, datos no publicados). CONCLUSIONES Este estudio representa el primer análisis transcriptómico a profundidad de A. hypochondriacus. Este estudio se ha convertido en la plataforma para el estudio de diversos aspectos fisiológicos importantes, pero prácticamente desconocidos del amaranto de grano, como los mecanismos que le permiten tolerar altos niveles de defoliación sin afectar la producción de semilla y la naturaleza de la resistencia inducible contra patógenos bacterianos y/o insectos inducida por evocadores químicos o bacterias avirulentas. También se está usando para incrementar el entendimiento de la función de los pigmentos en amaranto y su J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

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posible contribución a la resistencia a estrés (a) biótico y de los mecanismos de promoción de crecimiento, que pudieran establecer la base para incrementar los rendimientos de grano, que en amaranto son relativamente bajos, en general. Además, reveló la presencia de numerosos genes con el potencial de conferir protección a agobios ambientales en amaranto, y quizás en otros cultivos, por medio de manipulación genética. Es importante resaltar que muchos de estos genes tienen una función desconocida, lo que abre las puertas para el descubrimiento de nuevos genes que pudieran tener aplicaciones agronómicas y/o biotecnológicas importantes en un futuro no muy lejano. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó gracias al apoyo brindado por el Dr. Alberto Cárdenas Jiménez, en ese entonces Secretario de SAGARPA, México Tierra de Amaranto A.C. y la Fundación Deborah Presser-Velder. BIBLIOGRAFÍA Achard P, A Gusti, S Cheminant, M Alioua, S Dhondt, F Coppens, T S Gerrit Beemster, P Genschik (2009) Gibberellin signaling controls cell proliferation rate in Arabidopsis. Current Biology 19: 1188-1193. Akubugwo IE, N A Obasi, G C Chinyere, A E Ugbogu (2007) Nutritional and chemical value of Amaranthus hybridus L. leaves from Afikpo, Nigeria. African Journal of Biotechnology 6: 2833-2839. Altschul S F, W Gish, W Miller, E W Myers, D J Lipman (1990) Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403410. Ashburner M, C A Ball, J A Blake, D Botstein, H Butler, J M Cherry, A P Davis, K Dolinski, S S Dwight, J T Eppig, M A Harris, D P Hill, L Issel-Tarver, A Kasarskis, S Lewis, J C Matese, J E Richardson, M Ringwald, G M Rubin, G Sherlock (2000) Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics 25: 2529. 44

J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

Bahramnejad B, L R Erickson, P H Goodwin (2010) Induction of expression and increased susceptibility due to silencing a 4,5-DOPA dioxygenase extradiol-like gene of Nicotiana benthamiana in the interaction with the hemibiotrophic pathogens, Colletotrichum destructivum, Colletotrichum orbiculare or Pseudomonas syringae pv. tabaci. Plant Science 178: 147-157. Baisakh N, P K Subudhi, P Varadwaj (2008) Primary responses to salt stress in a halophyte, smooth cordgrass (Spartina alterniflora Loisel.). Functional & Integrative Genomics 8: 287-300. Bakrim A, A Maria, F Sayah, R Lafont, N Takvorian (2008) Ecdysteroids in spinach (Spinacia oleracea L.): Biosynthesis, transport and regulation of levels. Plant Physiology and Biochemistry 46: 844-854. Belton P, J R N Taylor (2002) Pseudocereals and less common cereals. Springer-Verlag. Berlin, Heideberg, Alemania. 261 p. Bouck A, T Vision (2007) The molecular ecologist’s guide to expressed sequence tags. Molecular Ecology 16: 907-924. Brenner D, D Baltensperger, P Kulakow, J Lehmann, R Myers, M Slabbert, B Sleugh (2000) Genetic resources and breeding of Amaranthus. Plant Breeding Reviews 19: 227285. Chaves M M, J Flexas, C Pinheiro (2009) Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany 103: 551-560. Chen J H, Y Sun, F Sun, X L Xia, W L Yin (2011) Tobacco plants ectopically expressing the Ammopiptanthus mongolicus AmCBL1 gene display enhanced tolerance to multiple abiotic stresses. Plant Growth Regulation 63: 259-269. Clouse S D, J M Sasse (1998) BRASSINOSTEROIDS: Essential regulators of plant growth and development. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49: 427-451.

Capítulo III. El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento

Cushman J C, G Meyer, C B Michalowski, J M Schmitt, H J Bohnert (1989) Salt stress leads to differential expression of 2 isogenes of phosphoenolpyruvate carboxylase during Crassulacean Acid Metabolism induction in the common ice plant. The Plant Cell 1: 715-725.

Han H P, Y X Li, S F Zhou (2008) Overexpression of phytoene synthase gene from Salicornia europaea alters response to reactive oxygen species under salt stress in transgenic Arabidopsis. Biotechnology Letters 30: 15011507.

Dharmawardhana P, A M Brunner, S H Strauss (2010) Genome-wide transcriptome analysis of the transition from primary to secondary stem development in Populus trichocarpa. BMC Genomics 11: 150.

Han N, Q Shan, H Bao, B Wang (2011) Cloning and characterization of a Ca2+/H+ antiporter from halophyte Suaeda salsa L. Plant Molecular Biology Reporter 29: 449-457.

Dayan J, N Voronin, F Gong, T Sun, P Hedden, H Fromm, R Alonia (2012) Leafinduced gibberellin signaling is essential for internode elongation, cambial activity, and fiber differentiation in tobacco stems. The Plant Cell 24: 66-79. Délano-Frier J P, H Avilés-Arnaut, K Casarrubias-Castillo, G Casique-Arroyo, P A Castrillón-Arbeláez, L Herrera-Estrella, J Massange-Sánchez, N A Martínez-Gallardo, F I Parra-Cota, E Vargas-Ortiz, M G EstradaHernández (2011) Transcriptomic analysis of grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) using 454 pyrosequencing: comparison with A. tuberculatus, expression profiling in stems and in response to biotic and abiotic stress. BMC Genomics 12: 363. Ehlting J, N Mattheus, D S Aeschliman, E Li, B Hamberger, I F Cullis, J Zhuang, M Kaneda, S D Mansfield, L Samuels, K Ritland, B E Ellis, J Bohlmann, C J Douglas (2005) Global transcript profiling of primary stems from Arabidopsis thaliana identifies candidate genes for missing links in lignin biosynthesis and transcriptional regulators of fiber differentiation. The Plant Journal 42: 618-640. Guan B, G Q Jiang, Y X Wang, Z C Wang, Y Haxim, Q A Bao, Y Z Hu, F C Zhang, Y Wang (2010) Identification of differentially expressed transcripts involved in the salt-stress response of Salsola ferganica by suppression subtractive hybridization. Plant Cell Tissue and Organ Culture 103: 343-352.

Huerta-Ocampo JA, E P Briones-Cerecero, G Mendoza-Hernandez, A De Leon-Rodriguez, A P Barba de la Rosa (2009) Proteomic analysis of amaranth (Amaranthus hypochondriacus L.) leaves under drought stress. International Journal of Plant Sciences 170: 990-998. Huerta-Ocampo J, M Leon-Galvan, L Ortega-Cruz, A Barrera-Pacheco, A De LeónRodríguez, G Mendoza-Hernández, A P Barba de la Rosa (2010) Water stress induces up-regulation of DOF1 and MIF1 transcription factors and down-regulation of proteins involved in secondary metabolism in amaranth roots (Amaranthus hypochondriacus L.). Plant Biology 13: 472-482. Huerta-Ocampo J, A P Barba de la Rosa (2011) Amaranth: a pseudo-cereal with nutraceutical properties. Current Nutrition & Food Science 7: 1-9. Islam M M, M A Hossain, R Jannat, S Munemasa, Y Nakamura, I C Mori, Y Murata (2010) Cytosolic alkalization and cytosolic calcium oscillation in Arabidopsis guard cells response to ABA and MeJA. Plant Cell & Physiology 51: 1721-1730. Jaeger KE, A Graf, P A Wigge (2006) The control of flowering in time and space. Journal of Experimental Botany 57: 3415-3418. Ji J B, J Strable, R Shimizu, D Koenig, N Sinha, M J Scanlon (2010) WOX4 promotes procambial development. Plant Physiology 152: 1346-1356.

J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

45

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Johansson I, M Karlsson, U Johanson, C Larsson, P Kjellbom (2000) The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance. BiochimIca et Biophysica ActaBiomembranes 1465: 324-342. Johnson B L, T L Henderson (2002) Water use patterns of grain amaranth in the northern Great Plains. Agronomy Journal 94: 1437-1443. Kadereit G, T Borsch, K Weising, H Freitag (2003) Phylogeny of Amaranthaceae and Chenopodiaceae and the evolution of C-4 photosynthesis. International Journal of Plant Sciences 164: 959-986. Korth K L, S J Doege, S H Park, F L Goggin, Q Wang, S K Gomez, G Liu, L Jia, P A Nakata (2006) Medicago truncatula mutants demonstrate the role of plant calcium oxalate crystals as an effective defense against chewing insects. Plant Physiology 141: 188-195. Lee R M, J Thimmapuram, K A Thinglum, G Gong, A G Hernandez, C L Wright, R W Kim, M A Mikel, P J Tranel (2009) Sampling the waterhemp (Amaranthus tuberculatus) genome using pyrosequencing technology. Weed Science 57: 463-469. Leyser O (2005) The fall and rise of apical dominance. Current Opinion in Genetics & Development 15; 468-471. Li W, D Wang, T Jin, Q Chang, D Yin, S Xu, B Liu, L Liu (2011) The vacuolar Na+/H+ antiporter gene SsNHX1 from the halophyte Salsola soda confers salt tolerance in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Molecular Biology Reporter 29: 278-290. Mallory M A, R V Hall, A P McNabb, D B Pratt, E N Jellen, P J Maughan (2008) Development and characterization of microsatellite markers for the grain amaranths. Crop Science 48:10981106. Marcone MF, Y Kakuda, RY Yada (2004) Amaranth as a rich dietary source of β-sitosterol and other phytosterols. Plant Foods for Human Nutrition 58: 207-211. 46

J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

Margulies M, M Egholm , W E Altman, S Attiya, J S Bader, L A Bemben, J Berka, M S Braverman1, Y Chen, Z Chen, S B Dewell, L Du, J M Fierro, X V Gomes, B C Goodwin, W He, S Helgesen, C H Ho, G P Irzyk, S C Jando, M L I Alenquer, T P Jarvie, K B Jirage, J B Kim, J R Knight, J R Lanza, J H Leamon, S M Lefkowitz, M Lei, J Li, K L Lohman, H Lu, V B Makhijani, K E McDade, M P McKenna, E W Myers, E Nickerson, J R Nobile, R Plant, B P Puc, M T Ronan, G T Roth, G J Sarkis, J F Simons, J W Simpson, M Srinivasan, K R Tartaro, A Tomasz, K A Vogt, G A Volkmer, S H Wang, Y Wang, M P Weiner, P Yu, R F Begley, J M Rothberg (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380. Martirosyan DM, L A Miroshnichenko, S N Kulakova, A V Pogojeva, V I Zoloedov (2007) Amaranth oil application for coronary heart disease and hypertension. Lipids in Health and Disease 6: 1-12. Massange-Sánchez J (2011) Análisis de la expresión y caracterización molecular del gen Ah24 inducido por daño mecánico, herbivoría y adición exógena de MeJA en plantas de Amaranthus hypochondriacus. Tesis de Maestría. Departamento de Biotecnología y Bioquímica Cinvestav-Unidad Irapuato, Irapuato, Gto., México. Maughan P J, N Sisneros, M Z Luo, D Kudrna, J S S Ammiraju, R A Wing (2008) Construction of an Amaranthus hypochondriacus bacterial artificial chromosome library and genomic sequencing of herbicide target genes. Crop Science 48: 85-94. Maughan P, S Yourstone, E Jellen, J Udall (2009) SNP discovery via genomic reduction, bar coding, and 454-pyrosequencing in amaranth. Plant Genome 2: 260-270. Minic Z, E Jamet, H San-Clemente, S Pelletier, J P Renou, C Rihouey, D P Okinyo, C Proux, P Lerouge, L Jouanin (2009) Transcriptomic analysis of Arabidopsis developing stems: a closeup on cell wall genes. BMC Plant Biology 9: 6.

Capítulo III. El transcriptoma de Amaranthus hypochondriacus: una poderosa herramienta para profundizar en su conocimiento y aprovechamiento

Morales-Guerrero J C, N Vázquez-Mata, R Bressani-Castignoli (2009) El amaranto, características físicas, químicas, toxicológicas y funcionales y aporte nutricio. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán. México, D.F. 269 p.

Sahu B B, B P Shaw (2009) Isolation, identification and expression analysis of saltinduced genes in Suaeda maritima, a natural halophyte, using PCR-based suppression subtractive hybridization. BMC Plant Biology 9: 69.

Núñez-Farfán J, J Fornoni, P L Valverde (2007) The evolution of resistance and tolerance to herbivores. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 38: 541-566.

Sanger F, A R Coulson (1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology 94: 441–448.

Ochoa-Sanchez J C, F I Parra-Cota, K Avina-Padilla, J Delano-Frier, J P MartinezSoriano (2009) Amaranthus spp.: a new host of “Candidatus Phytoplasma aurantifolia”. Phytoparasitica 37: 381-384.

Sasaki Y, E Asamizu, D Shibata, Y Nakamura, T Kaneko, K Awai, M Amagai, C Kuwata, T Tsugane, T Masuda, H Shimada, K Takamiya, H Ohta, S Tabata (2001) Monitoring of methyl jasmonate-responsive genes in Arabidopsis by cDNA macroarray: self-activation of jasmonic acid biosynthesis and crosstalk with other phytohormone signaling pathways. DNA Research 8: 153-161.

Omami E N, P S Hammes, P J Robbertse (2006) Differences in salinity tolerance for growth and water-use efficiency in some amaranth (Amaranthus spp.) genotypes. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 34: 11-22. Putnam D H (1990) Agronomic practices for grain amaranth. In: Proceedings of the National Amaranth Symposium 4th. Minneapolis, MN. 23–25 Aug. 1990. Minnesota Extension Service, University of Minnesota, St Paul, MN. USA. pp. 151–162 Putterill J, R Laurie, R Macknight (2004) It’s time to flower: the genetic control of flowering time. BioEssays 26: 363-373. Riggins C W, Y H Peng, C N Stewart, P J Tranel (2010) Characterization of de novo transcriptome for waterhemp (Amaranthus tuberculatus) using GS-FLX 454 pyrosequencing and its application for studies of herbicide targetsite genes. Pest Management Science 66:10421052. Romualdi C, S Bortoluzzi, F D’Alessi, G A Danieli (2003) IDEG6: a web tool for detection of differentially expressed genes in multiple tag sampling experiments. Physiological Genomics 12: 159-162.

Schmelz E A, R J Grebenok, T E Ohnmeiss, W S Bowers (2002) Interactions between Spinacia oleracea and Bradysia impatiens: A role for phytoecdysteroids. Archives of Insect Biochemistry and Physiology 51: 204-221. Schmidt S, I T Baldwin (2009) Downregulation of systemin after herbivory is associated with increased root allocation and competitive ability in Solanum nigrum. Oecologia 159: 473-482. Senadheera P, F J Maathuis (2009) Differentially regulated kinases and phosphatases in roots may contribute to inter-cultivar difference in rice salinity tolerance. Plant Signaling & Behavior 4: 1163-1165. Shukla S, A Bhargava, A Chatterjee, J Srivastava, N Singh, S P Singh (2006) Mineral profile and variability in vegetable amaranth (Amaranthus tricolor) Plant Foods for Human Nutrition 61: 23-28. Sonnhammer E L L, S R Eddy, R Durbin (1997) Pfam: A comprehensive database of protein domain families based on seed alignments. Proteins 28: 405-420.

J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

47

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Steckel L E (2007) The dioecious Amaranthus spp.: Here to stay. Weed Technology 21: 567-570. Strack D, T Vogt, W Schliemann (2003) Recent advances in betalain research. Phytochemistry 62: 247-269. Tabuchi T, Y Kawaguchi, T Azuma, T Nanmori, T Yasuda (2005) Similar regulation patterns of choline monooxygenase, phosphoethanolamine N-methyltransferase and S-adenosyl-L-methionine synthetase in leaves of the halophyte Atriplex nummularia L. Plant & Cell Physiology 46: 505-513. Takahashi S, N Murata (2008) How do environmental stres accelerate photoinhibition? Trends in Plant Science 13: 178-182. Weber LE (1990) Amaranth grain production guide. Rodale Press, Emmaus, PA, USA. 36 p. Weber A P M, K L Weber, K Carr, C Wilkerson, J B Ohlrogge (2007) Sampling the arabidopsis transcriptome with massively parallel pyrosequencing. Plant Physiology 144: 32-42. Werner T, V Motyka, M Strnad, T Schmulling (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proceedings of the National Academy of Science of the Unites States of America 98: 1048710492. Wheat CW (2010) Rapidly developing functional genomics in ecological model systems via 454 transcriptome sequencing. Genetica 138: 433-451. Wijekoon C P, P H Goodwin PH, T Hsiang (2008) The involvement of two epoxide hydrolase genes, NbEH1.1 and NbEH1.2, of Nicotiana benthamiana in the interaction with Colletotrichum destructivum, Colletotrichum orbiculare or Pseudomonas syringae pv. tabaci. Functional Plant Biology 35: 1112-1122.

48

J. P. Délano-Frier y N. Martínez-Gallardo

Zhang H J, S M Dong, M F Wang, W Wang, W W Song, X Y Dou, X B Zheng, Z G Zhang (2010) The role of vacuolar processing enzyme (VPE) from Nicotiana benthamiana in the elicitor-triggered hypersensitive response and stomatal closure. Journal of Experimental Botany 61: 3799-3812.

Capítulo IV

Identificación de genes de respuesta a estrés por calcio y sequía en amaranto IDENTIFICATION OF CALCIUM AND DROUGHT STRESS-RESPONSIVE GENES IN AMARANTH

Hugo S. Aguilar-Hernández1, Ana P. Barba de la Rosa1, Eduardo Espitia-Rangel2, José Ángel Huerta-Ocampo1 1IPICyT, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C., Camino a la Presa San José No. 2055, Lomas 4ª sección, 78216, San Luis Potosí, S.L.P., México. 2INIFAP, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Bajío, Carretera Celaya-San Miguel de Allende Km 6.5, Celaya, Gto., México. Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El calcio es un ión indispensable para el crecimiento y desarrollo de las plantas, tiene además un papel importante en la transducción de señales en respuesta a condiciones de estrés biótico y abiótico. La sequía es el principal factor abiótico que limita la productividad agrícola a nivel mundial. La sobrevivencia y productividad de las plantas depende en gran medida de su capacidad de adaptación y respuesta a condiciones ambientales desfavorables como el exceso de sales de sodio, magnesio o calcio y la sequía. Mediante la técnica de hibridación supresiva sustractiva (SSH) se analizó la respuesta a estrés por cloruro de calcio en hojas y sequía en raíces de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.). Los transcritos diferencialmente expresados en hojas en respuesta al estrés por calcio están relacionados con la transducción de señales y la respuesta a estrés, además de factores de transcripción y en algunos casos transcritos con función hasta ahora desconocida. Entre los transcritos sobre-expresados en raíces sometidas a sequía encontramos genes de defensa y de respuesta a estrés, genes relacionados con rutas de señalización y con el transporte de agua en la planta. Además de factores transcripcionales

como DOF1 y MIF1 que se han relacionado con procesos biológicos únicos de plantas. Entre los genes reprimidos se encontraron genes relacionados con la diferenciación celular y el metabolismo secundario. Mediante el empleo de SSH hemos identificado interesantes y novedosos genes de respuesta a estrés abiótico. La caracterización funcional de estos genes permitirá conocer el papel que juegan en la respuesta a estrés en amaranto. Palabras clave: Amaranthus hypochondriacus L., Estrés abiótico, Calcio, Sequía, Hibridación supresiva sustractiva. ABSTRACT Calcium is an essential ion for growth and development of plants, also plays an important role in signal transduction in response to biotic and abiotic stress. Drought is the major abiotic factor limiting crop productivity worldwide. Plant survival and productivity depend largely on its ability to adapt and respond to unfavorable environmental conditions such as excess of sodium, potassium or calcium and drought. We used the suppressive subtractive hybridization (SSH) to analyze the response to 49-58

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calcium chloride stress in leaves and drought stress in roots of amaranth (A. hypochondriacus L.) Differentially expressed transcripts in amaranth leaves subjected to calcium stress were related to signal transduction and stress response as well as transcription factors and in some instances transcripts with unknown function. Among the over-expressed genes in amaranth roots were those related to defense, signaling, stress response, water movement and transcription factors such as DOF1 and MIF 1 which have been related to biological processes unique to plants. Repressed genes are related to cellular differentiation and secondary metabolism. By using SSH we have identified interesting and novel abiotic stress responsive genes in amaranth. However functional characterization of these genes will allow us to know the role played by these genes in response to stress. Amaranth is an excellent model for studying the response to abiotic stress. Key words: Abiotic Stress, A. hypochondriacus L., Calcium, Drought, Suppression subtractive hybridization.

sequía, están mediados por una señalización química (Mahajan et al., 2008), donde la perturbación en los niveles de Ca2+ citosólico activa la respuesta al estrés (Matsumoto et al., 2002). Estudios moleculares, genéticos y bioquímicos han demostrado que la vía SOS (Sal-Overly-Sensitive) es una ruta involucrada en la percepción y transducción de señales, en donde el calcio es un ión crítico que actúa como segundo mensajero en respuesta a diferentes tipos de estrés en las plantas (Turkan y Demiral, 2009). El amaranto es un cultivo alternativo que produce semillas con alto valor nutricional y propiedades nutracéuticas (Barba de la Rosa et al., 2009). Su valor energético es mayor al de los cereales y su grano es rico en proteína (13 a 18%), calcio, fósforo y potasio. Sus hojas que también son comestibles contienen altos niveles de calcio, potasio y vitaminas A y C (Saunders y Becker, 1984). El amaranto es un cultivo capaz de crecer en regiones semiáridas muy proclives a la sequía y el estrés salino (Omami et al., 2006), por lo que es un buen modelo para el estudio de la tolerancia al estrés abiótico.

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

El exceso de sales de sodio, magnesio o calcio y la sequía son algunos de los factores abióticos que limitan el crecimiento y productividad en plantas. Para hacer frente a las diferentes condiciones de estrés abiótico, las plantas han desarrollado sofisticados mecanismos de tolerancia, que incluyen la exclusión/captación selectiva de iones y su acumulación en vacuolas, la síntesis de solutos compatibles, el ajuste de la fotosíntesis y el metabolismo energético, la acumulación de enzimas antioxidantes, la regulación de hormonas y la modificación de la estructura celular (Zhang et al., 2012). Las plantas dependen en gran medida de los mecanismos de percepción del estrés y de la transducción de señales que les permiten encender los mecanismos de respuesta para lograr su supervivencia y reproducción en ambientes adversos (Chinnusamy et al., 2004). Sin embargo, los sensores de estrés salino y la mayoría de los intermediarios de señalización en respuesta a estrés abiótico no se han caracterizados hasta ahora (Agarwal y Zhu, 2005). Aspectos como el crecimiento, desarrollo y la respuesta a condiciones de estrés como la

CULTIVO DE PLANTAS DE AMARANTO (A. Hypochondriacus L.) Y TRATAMIENTO PARA GENERAR ESTRÉS POR CaCl2 Se germinaron semillas de amaranto (A. hypochondriacus L.) variedad Nutrisol en sustrato comercial estéril (Sunshine Premix 3, Sun Gro Hoticulture Inc. Washington. USA). Plántulas con cuatro hojas verdaderas se trasplantaron a macetas con el mismo sustrato estéril y se cultivaron durante 45 días en una cámara de crecimiento iluminada (300µmol.m-2s-1) durante ciclos de 12 h/12 h en luz/oscuridad. Las plantas se regaron cada tercer día con 100 mL de solución de CaCl2 a diferentes concentraciones. Tras 45 días de cultivo se colectaron las hojas, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Tres experimentos independientes se prepararon para cada tratamiento. Con base en la observación, se determinó que la concentración óptima de CaCl2 para el crecimiento del amaranto fue de 20 mM (control), mientras que a concentraciones de 50 mM las hojas presentaron síntomas de estrés (Figura 1).

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H. S. Aguilar-Hernández et al.

Capítulo IV. Identificación de genes de respuesta a estrés por calcio y sequía en amaranto

EXTRACCIÓN DE RNA DE HOJAS DE AMARANTO SOMETIDO A ESTRÉS POR CaCl2 Y GENERACIÓN DE GENOTECAS SUSTRACTIVAS Las hojas de amaranto sometidas a estrés por CaCl2 se molieron en nitrógeno líquido y se extrajo el RNA total utilizando el kit RNeasy® Plus Mini Kit System (Qiagen, GMBH, Hilden Germany) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A partir de este RNA se sintetizó cDNA utilizando el kit SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA) este

presencia de X-gal e IPTG. La presencia de los insertos de los transcritos sustraídos se confirmó mediante ensayo con enzimas de restricción del DNA plasmídico de las clonas obtenidas. Las clonas con insertos mayores a 250 pb se secuenciaron (MCLab, Molecular Cloning Laboratory, San Francisco, CA, USA). Las secuencias se editaron para remover las secuencias del vector y se analizaron contra diferentes bases de datos (GenBank, TIGR Arabidopsis thaliana y TIGR Rice) utilizando el algoritmo BLAST.

Figura 1. Plantas de A. hypochondriacus L. regadas con diferentes concentraciones de CaCl2 durante 45 días. 1) 10 mM, 2) 20 mM , 3) 30 mM, y 4) 50 mM. Las condiciones seleccionadas como control y problema se señalan con flechas.

cDNA se purificó en un primer paso mediante el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y enseguida se purificó mediante columnas cromatográficas (SMART, Clontech). La hibridación sustractiva se llevó a cabo utilizando el sistema PCR-Select™ Subtraction Kit (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cDNAs sustraídos (transcritos sobre-expresados y reprimidos en respuesta al tratamiento) se clonaron en el plásmido pGEM®-T Easy Vector (Promega, San Luis Obispo, CA) y se usaron para transformar células químicamente competentes de Escherichia coli Top10 (Invitrogen, Carlsbad, CA), mismas que se cultivaron toda la noche a 37°C en placas de medio LB con Ampicilina (100 µg/mL) en

CULTIVO DE PLANTAS DE AMARANTO (A. Hypochondriacus L.) Y TRATAMIENTO PARA GENERAR ESTRÉS POR SEQUÍA Se germinaron semillas de A. hypochondriacus L. variedad Nutrisol en una mezcla de sustrato comercial (Sunshine Premix 3, Sun Gro Horticulture Inc. Bellevue, Washington. USA). Una vez germinadas, las plántulas se trasplantaron el día 11 a bolsas de plástico de 15 x 25 cm que contenían el mismo sustrato en donde se germinaron y fueron cultivadas 22 días más en invernadero, se determinó el contenido de agua del suelo (Hydrosense, Campbell Scientific, INC.) y se mantuvo entre un 30-35%. A partir de un lote de 60 plantas se formaron 3 grupos de 20 plantas. Para provocar el estrés por sequía se dejó de suministrar agua a dos de los tres grupos H. S. Aguilar-Hernández et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

a partir del día 22 en invernadero. Al llegar al día 29 un grupo de plantas sometidas a sequía se rehidrató. Se realizaron tres experimentos independientes para cada tratamiento. Se recolectaron muestras de raíz, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Se determinó el contenido relativo de agua (CRA) en hojas de los diferentes grupos de plantas de acuerdo con el método reportado por Barrs y Weatherly (1962). Para lo cual se determinaron los pesos: fresco (PF), turgente (PT) y seco (PS) en hojas de 4 plantas de cada grupo seleccionadas al azar y finalmente se calculó el contenido relativo de agua (CRA) utilizando la siguiente fórmula: CRA= [(PF-PS)/ (PT-PS)] x 100. EXTRACCIÓN DE RNA Y GENERACIÓN DE GENOTECAS SUSTRACTIVAS EN RAÍCES DE AMARANTO SOMETIDO A SEQUÍA Las raíces de amarantos sometidos a estrés por sequía se molieron en nitrógeno líquido y se extrajo el RNA total utilizando reactivo de TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A partir de este RNA se sintetizó cDNA utilizando el kit SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA). La hibridación sustractiva se llevó a cabo utilizando el sistema PCR-Select™ Subtraction Kit (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cDNAs sustraídos (transcritos sobre-expresados y reprimidos en respuesta al tratamiento) se clonaron en el plásmido pGEM®-T Easy Vector (Promega, San Luis Obispo, CA) y se transformaron células químicamente competentes de Escherichia coli Top10 (Invitrogen, Carlsbad, Ca), mismas que se cultivaron toda la noche a 37°C en placas de medio LB con ampicilina (100 µg/mL) en presencia de X-gal e IPTG. La presencia de los insertos de los transcritos sustraídos se confirmó mediante ensayo con enzimas de restricción del DNA plasmídico de las clonas obtenidas. Las clonas con inserto se secuenciaron (MCLab, Molecular Cloning Laboratory, San Francisco, CA, USA). Las secuencias se editaron para remover las secuencias del vector y se analizaron en contra de la base de datos no redundante del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gob/blast/ Blast.cgi). Utilizando el algoritmo BLAST. 52

H. S. Aguilar-Hernández et al.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESPUESTA DE LAS PLANTAS DE AMARANTO AL ESTRÉS POR CaCl2 La exposición de las plantas de amaranto a altas concentraciones de CaCl2 afectó el crecimiento de las plantas problema y además se pudieron observar signos de clorosis en las hojas a causa del exceso de esta sal. El exceso de sales como el sodio y el calcio afecta el crecimiento de la planta en dos fases. En la primera fase denominada “fase osmótica” el crecimiento de la planta se inhibe por efecto de la alta concentración de iones en el suelo y que alteran la homeostasis del agua, afectado la turgencia, inhibiendo la división celular, el crecimiento de las hojas y en menor medida el de la raíz (Munns, 1993; Munns et al., 2000; Munns, 2002). En la segunda fase denominada “fase iónica” la capacidad de acumular iones Ca2+, Na+, Cl- en vacuolas, se ve sobrepasada. Las sales se acumulan en el citoplasma y se generan especies reactivas de oxígeno, que inhiben la actividad enzimática, causan daño a los lípidos de la membrana y ácidos nucléicos (Munns, 2005). PERFIL DE LA RESPUESTA TRANSCRIPTÓMICA EN AMARANTO POR ESTRÉS INDUCIDO POR ALTAS CONCENCTRACIONES DE CaCl2 El 48% de los genes sobre-expresados en respuesta a estrés por CaCl2 están relacionados con respuesta a estrés, transducción de señales, factores de transcripción y regulación de la expresión génica. El 30% tiene una función desconocida y el 22% no presenta homología con ningún otro gen reportado en las bases de datos empleadas (Figura 2A). Estos nuevos genes sin caracterizar podrían tener una función clave en la respuesta y tolerancia a estrés en amaranto. El 57% de los genes reprimidos se agruparon en diferentes categorías de acuerdo con su función reportada, mientras que el 36% tienen una función desconocida y el 7% no presentan homología con ningún otro gen reportado en las bases de datos (Figura 2B). En la Tabla 1, se muestran algunos de estos genes diferencialmente expresados. Entre las proteínas más interesantes que se inducen en respuesta a estrés por CaCl2 en hojas de amaranto se identificaron dos

Capítulo IV. Identificación de genes de respuesta a estrés por calcio y sequía en amaranto

factores transcripcionales (CID 9 y proteína de dedos de zinc). Se obtuvo la secuencia completa del transcrito que codifica para la proteína de dedos de zinc y su análisis muestra que contiene motivos estructurales novedosos. Estos motivos podrían interactuar con elementos en cis y activar la expresión de genes de respuesta a estrés en amaranto (Aguilar-Hernández et al., 2011). RESPUESTA DE LAS PLANTAS DE AMARANTO AL ESTRÉS POR SEQUÍA Al llegar al día 29 el contenido de agua del suelo de los 2 grupos sometidos a sequía fue del 3% y A)

en condiciones adversas, o bien son capaces de recuperarse completamente de los efectos de la sequía al ser rehidratadas (Cabuslay et al., 1999). Las plantas de amaranto sometidas a sequía se mantuvieron turgentes aún con niveles de contenido de agua del suelo del 5-7%. En el último día del tratamiento el contenido de agua del suelo de las plantas sometidas a sequía fue del 3% y las plantas mostraban pérdida de la turgencia y enrollamiento de las hojas. Un grupo de plantas sometidas a sequía se rehidrató y se observó que al transcurrir dos y media horas, las hojas se desenrollaban y las plantas recuperaban

Factores de Transcripción 7% Traducción de señales 7%

Regulación de genes 4%

Sin homología 22%

Estrés 30%

Función desconocida 30%

Defensa contra patogenos 7% Sin homología 7%

B)

Metabolismo 7%

Funsión desconocida 36%

Plegamiento de proteínas 7% Fotosintesis 29% Unión de metales pesados 7%

Figura 2. Clasificación de los transcritos identificados mediante hibridación supresiva sustractiva bajo estrés por CaCl2 en hojas de amaranto. A) genes sobre-expresados, B) genes reprimidos. La función de los transcritos se asignó con base en la homología de su secuencia o la función de los dominios encontrados de acuerdo con información disponible en la literatura y en Gene Ontology (http://www.geneontology.com).

las plantas mostraban pérdida de la turgencia y enrollamiento de las hojas (Figura 3). Se considera que las plantas tolerantes a sequía son aquellas capaces de mantener constante el contenido de agua de sus tejidos o de sobrevivir a la reducción drástica de esta

la turgencia, mientras que a las cinco horas las plantas se observaban recuperadas por completo (Figura 4). El contenido relativo de agua (CRA) se ha considerado como un indicador de la tolerancia a la desecación en cultivos como H. S. Aguilar-Hernández et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología Tabla 1. Identificación de genes diferencialmente expresados en respuesta a estrés por CaCl2 en hojas de A. hypochondriacus L. (algunos ejemplos) Categoría

Número de accesoa

Respuesta a estrés

AF268027.1 AB221009.1 CN782050.1 NP_565864.1 CAA46150.1 Os03g44050 NM_112305.1 NP_567926 Os02g21009

Señalización Transcripción Exclusión de iones Metabolismo Chaperonas Fotosíntesis Defensa

Os02g22100 NP_179378.1 At3g54890.2 X05511.1 P82010

Anotación Fuente E-value Genes sobre-expresados Metalotioneina-2A (MT2A) Amaranthus cruentus 0.0 S-adenosilmetionina sintetasa (SAMS) Beta vulgaris 0.0 Proteína universal de estrés(UspA) Chenopodium quinoa 1e-112 Proteína de tolerancia a litio y sodio 1 (SLT-1) Arabidopsis thaliana 3e-58 Calmodulina (CaM) Oryza sativa 2e-76 Cinasa asociada a pared celular (WAK) Oryza sativa 8.7e-6 CID9 Arabidopsis thaliana 8e-65 Proteína de dedos de zinc Arabidopsis thaliana 6e-15 Intercambiador vacuolar de cationes/protones Oryza sativa 7.4e-4 (CaX) Genes reprimidos Proteína romboide Oryza sativa 1.1e-3 Proteína de choque térmico (DNAJ) Arabidopsis thalinana 1e-16 Proteína LHC tipo-1 Arabidopsis thaliana 9.4e-9 Proteína del Oxygen Evolving Complex (OEC) Spinacia oleracea 0.0 Precursor de la Subunidad XI del fotosistema I Arabidopsis thaliana 3e-32 Proteína antifúngica rica en cisteína Beta vulgaris 8e-7

aLos números de acceso corresponden a las bases de datos de GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), TIGR Arabidopsis thaliana (http://jcvi.org/arabidopsis/qpcr/genelist.php) y TIGR Rice (http://blast.jcvi.org/euk-blast/ index.cgi?project=osa1/)

Figura 3. Fotografías en donde se muestra la apariencia de la parte aérea y raíces de las plantas control (a, b, c) y aquellas sometidas a sequía (d, e, f ) al día 29 en invernadero.

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Capítulo IV. Identificación de genes de respuesta a estrés por calcio y sequía en amaranto

la soya y el trigo. Se estima que el CRA es un determinante principal de la actividad metabólica y de la sobrevivencia foliar y se considera este parámetro como una perspectiva más confiable que las mediciones termodinámicas por ejemplo el potencial hídrico, para analizar las respuestas fisiológicas a la desecación (Villalobos et al., 1990). Al determinar el CRA en hojas de amaranto (Figura 5); se observó que las plantas sometidas a sequía presentaron un CRA de 45.39 (± 7.12), esto es indicativo de que el grado de estrés al que se sometieron fue severo. Mientras que las plantas control presentaron un CRA de 95.14% (± 0.43) indicativo de su buen estado de hidratación. En el caso de las plantas rehidratadas tras someterse a sequía, su

CRA se incrementó a niveles del 90.20% (± 2.0) adquiriendo una apariencia indistinguible de las plantas control. Al comparar la respuesta a sequía en una variedad de frijol susceptible y una tolerante, Montalvo-Hernández et al. (2008) observaron que al someter ambas variedades a sequía severa (CRA menor del 50%), la variedad susceptible alcanzaba su punto de marchitez permanente ya que al ser rehidratadas estas plantas no eran capaces de recuperarse, mientras que la variedad tolerante sí lo hizo. La capacidad de rápida recuperación observada en las plantas de amaranto es importante ya que es distintiva de plantas tolerantes a sequía (Huerta Ocampo et al., 2011).

Figura 4. Recuperación de plantas de amaranto al ser rehidratadas tras someterse a estrés por sequía.

Contenido Relativo de Agua %

120 100 80 60 40 20 0

ControlS

equíaR

ehidratación

Figura 5. Determinación del contenido relativo de agua en hojas de amaranto. H. S. Aguilar-Hernández et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES EN RAÍCES DE AMARANTOS SOMETIDOS A SEQUÍA Los transcritos sobre-expresados en respuesta a sequía en raíces de amaranto (Tabla 2) están relacionados principalmente con la señalización (cinasas y fosfatasas), defensa (GST), estrés (SLT-1) y el transporte de agua (acuaporinas, nodulinas), entre otros. Entre los transcritos sobre expresados también se identificaron los factores transcripcionales DOF1 (DNA binding with one finger 1) y MIF1 (mini zinc finger 1). Los transcritos reprimidos están relacionados con el metabolismo secundario (SAMS e IFR) y con la diferenciación celular (WOX5A). CONCLUSIONES El generar el estrés con CaCl2 nos permitió obtener datos para entender el mecanismo de percepción y traducción del estrés en el cual se ve involucrado el Ca2+. Se identificó una interesante proteína con dedos de zinc además de cinasas y fosfatasas importantes para la transducción de señales en respuesta a estrés por CaCl2 en hojas de amaranto. Nuestros resultados abren la puerta a futuros estudios de caracterización del papel que tienen estas proteínas en la respuesta a estrés abiótico. En respuesta a estrés por sequía en raíces de amaranto, la sobre-expresión de transcritos de varias cinasas y fosfatasas indica que los cambios

en la fosforilación de proteínas juegan un papel importante en la respuesta a estrés. La sobreexpresión de factores transcripcionales como DOF1 y MIF1 acoplada con la represión de genes de desarrollo como WOX5A y enzimas del metabolismo secundario involucradas en la síntesis de flavonoides y lignina tales como SAMS e IFR sugiere la detención del crecimiento, que junto con la disminución en la lignificación son respuestas adaptativas al estrés severo en raíces y esto permite una rápida recuperación una vez que las condiciones estresantes se revierten. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó bajo el apoyo del 6th Framework Programme, AMARANTH:FUTURE-FOOD, Contract No. 032263. Agradecemos al IPICyT por la beca otorgada durante la realización de este trabajo a H.S. Aguilar-Hernández. También agradecemos a la Fundación Produce San Luis Potosí por el apoyo otorgado. LITERATURA CITADA Agarwal M, J K Zhu (2005) Integration of abiotic stress signaling pathways. In: Plant Abiotic Stress. M A Jenks, P M Hasegawa (eds). Blackwell Publishing Ltd. pp:214–247.

Tabla 2. Identificación de genes diferencialmente expresados en respuesta a sequía en raíces de A. hypochondriacus (algunos ejemplos)

Categoría

Número de accesoa

Fuente

Cinasas/Fosfatasas

DQ459385.1 NM_113139.2 T51846 NM_179350 NM_111189 NP_172219.1 DQ_490965.1 NM_106124 AF323101 AB219525

Nicotiana tabacum Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Zea mays Arabidopsis thaliana Pisum sativum Hordeum vulgare

1e-8 3e-9 2e-19 12e-6 1e-17 1e-52 2e-104 3e-9 1e-8 1e-8

AM490238

Zea mays

2e-4

NM_001112229.1 EU399630

Zea mays Triticum aestivum

1e-8 1e-7

Defensa Factores de transcripción Transporte de agua Factores de transcripción Metabolismo secundario

E-value

aLos números de acceso corresponden a la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gob/blast/Blast.cgi)

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Capítulo IV. Identificación de genes de respuesta a estrés por calcio y sequía en amaranto

Aguilar-Hernández H S, L Santos, F LeónGalván, A Barrera-Pacheco, E Espitia-Rangel, A De León-Rodríguez, RG Guevara-González, AP Barba de la Rosa (2011) Identification of calcium stress induced genes in amaranth leaves through suppression subtractive hybridization. Journal of Plant Physiology 168:2102-2109.

Matsumoto T K, A J Ellsmore, S G Cessna, P S Low, J M Pardo, R A Bressan, P M Hasegawa (2002) An osmotically induced cytosolic Ca2+ transient activates calcineurin signaling to mediate ion homeostasis and salt tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry 277:33075-33080.

Barrs H D, P E Weattherley (1962) A reexamination of the relative turgidity technique for estimating water deficits in leaves. Australian Journal of Biological Sciences 15:413-428.

Munns R (1993) Physiological processes limiting plant growth in saline soils: some dogmas and hypotheses. Plant, Cell & Environment 16:1524.

Barba de la Rosa A P, I S Fomsgaard, B Laursen, A G Mortensen, J L Olvera-Martínez, C SilvaSánchez, A Mendoza-Herrera, A De LeónRodríguez, J González-Castañeda (2009) Amaranth (Amaranthus hypochondriacus) as an alternative crop for sustainble food production: phenolic acids and flavonoids with potential impact on its nutraceutical quality. Journal of Cereal Science 49:117-121.

Munns R (2002) Comparative physiology of salt and water stress. Plant, Cell & Environment 25:239-250.

Cabuslay G, O Ito, A Alejar (1999) Genotypic differences in physiological responses to water deficit in rice. En: Genetic Improvement of Rice for Water-Limited Environments. J O’Toole, O Ito, B Hardy (eds). International Rice Research Institute. Los Baños, Filipinas. pp:99-116. Chinnusamy V, K Schumaker, JK Zhu (2004) Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signaling in plants. Journal of Experimental Botany 55:225-236. Huerta-Ocampo J A, M F León-Galván, L B Ortega-Cruz, A Barrera-Pacheco, A De León-Rodríguez, G Mendoza-Hernández, A P Barba de la Rosa (2011) Water stress induces up-regulation of DOF1 and MIF1 transcription factors and down-regulation of proteins involved in secondary metabolism in amaranth roots (Amaranthus hypochondriacus L.). Plant Biology 13:472-482. Mahajan S, GK Pandey, N Tuteja (2008) Calcium and salt stress signaling in plants: shedding light on SOS pathway. Archives of Biochemistry and Biophysics 471:146-158.

Munns R (2005) Genes and salt tolerance: bringing them together. New Phytologist 167:645-663. Munns R, R A Hare, R A James, G J Rebetzke (2000) Genetic variation for improving the salt tolerance of durum wheat. Australian Journal of Agricultural Research 51:69-74. Montalvo-Hernandez L, E Piedra-Ibarra, L Gomez-Silva, R Lira-Carmona, J A AcostaGallegos, J Vazquez-Medrano, B XoconostleCazares, R Ruiz-Medrano (2008) Differential accumulation of mRNAs in drought-tolerant and susceptible common bean cultivars in response to water deficit. New Phytologist 177:102-113. Omami E N, P S Hammes, P J Robbertse (2006) Differences in salinity tolerance for growth and water-use efficiency in some amaranth (Amaranthus spp.) genotypes. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 34:11-22. Saunders R M, R Becker (1984) Amaranthus: a potential food and feed resource. In: Advances in Cereal Science and Technology. Volume VI. Y. Pometanz (ed). American Association of Cereal Chemists Inc. MN, USA. pp:357-396.

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Turkan I, T Demiral (2009) Recent developments in understanding salinity tolerance. Environmental and Experimental Botany 67:2-9. Villalobos-Rodríguez E, C H Umaña, F Sterling-Rodríguez (1990) Determinación del contenido relativo de agua en progenies de palma aceitera Elaeis guineensis, durante la época seca, en Quepos, Costa Rica. Agronomía Costarricense 14:73-77. Zhang H, B Han, T Wang, S Chen, Li H, Y Zhang, S Dai (2012) Mechanisms of Plant salt response: insights from proteomics. Journal of Proteome Research 11:49-67.

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Capítulo V

Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus L.: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF NOVEL Amaranthus hypochondriacus L. GENES: EXPLORING THEIR APPLICATION IN THE GENERATION OF STRESS-RESISTANT CROPS

Paola A. Palmeros-Suárez1, Julio A.Massange-Sánchez1 y John P. Délano-Frier1§ 1Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato) Km 9.6 del Libramiento Norte Carretera Irapuato-León. Apartado Postal 629, C.P. 36821, Irapuato, Gto., México. §Autor de correspondencia: [email protected] Teléfono: (52) 462 39636 o 462 39600 FAX: (52) 462 45996 o 462 39611

RESUMEN El incremento de la población humana, la pérdida de grandes extensiones de tierra cultivable por causa de la urbanización, la desertificación, industrialización y cambio climático, han ocasionado cambios severos en la agricultura mundial. Esto ha ocasionado una creciente falta de alimentos para poder satisfacer las necesidades de millones de personas que habitan el planeta. Debido a ello, se ha intensificado la generación de cultivos que puedan resistir condiciones ambientales adversas sin reducir el rendimiento. Como punto de partida, se ha usado la flexibilidad fisiológica de las plantas para adaptarse a cambios ambientales adversos, con el fin de identificar los genes responsables de la resistencia a diferentes tipos de estrés (a)biótico. En este aspecto, el amaranto presenta un gran potencial para descubrir genes nuevos y funcionales de respuesta a estrés debido a su alta tolerancia a estreses bióticos y abióticos. Los nuevos avances en las ciencias ómicas, han tenido una gran influencia en la mejor comprensión de los mecanismos transcripcionales, postranscripcionales y traduccionales que regulan la respuesta de la planta al estrés. Tomando como herramienta

el transcriptoma de novo de Amaranthus hypochondriacus, dirigido hacia la identificación de genes inducidos en condiciones de estrés, ha sido posible detectar un grupo de genes, que incluye genes de respuesta temprana, factores de transcripción y numerosos genes de función desconocida, como posibles candidatos para ser expresados en plantas modelo, como arabidopsis y tabaco. Esto para realizar una caracterización funcional que permita evaluar el potencial de estos genes para resistir múltiples condiciones ambientales adversas. En este capítulo se describirá la estrategia experimental que se utilizará para explorar la posibilidad de utilizar estos genes de amaranto para aumentar significativamente la resistencia a múltiples tipos de estrés no sólo en el amaranto, sino en cultivos mucho menos tolerantes a éstos como el maíz. Palabras clave: Amaranto, caracterización funcional, estrés biótico, estrés abiótico, transcriptoma. ABSTRACT The increase of human population, coupled with the loss of large tracts of agricultural land due to urbanization, industrialization and desertification associated with climatic changes, 59-74

Amaranto: Ciencia y Tecnología

have affected world agriculture. This has led to an increased food deficit to satisfy the requirements of millions of people living on this planet. A possible solution is the creation of crops able to resist adverse environmental conditions without significant losses in yield. The physiological flexibility of the plants that enables their adaptation to adverse environmental changes, together with the identification of stressresponsive genes established the starting point. Next, the new advances of the omics sciences were instrumental for a better understanding of the transcriptional, posttranscriptional and traslational mechanisms that regulate the response of the plant to adverse stress conditions. In this respect, the high tolerance to biotic and abiotic stress that characterizes amaranth suggests an enormous potential as a source of new and functional genes capable of responding effectively to stress. This potential is starting to be explored using the wealth of information contained in the recently reported de novo transcriptome of Amaranthus hypochondriacus, which was aimed at the identification of stress-related genes. Thanks to this approach, our group has been able detect new groups of stress-induced genes, such as early responsive genes, little-known transcription factors and many genes with an unknown function. This was followed by a selection procedure to choose those that will be functionally characterized in model plant like Arabidoposis and tobacco. The main purpose is to assess if the selected genes can confer resistance to multiple stress conditions. In this chapter, we describe the experimental strategy we are using to fulfill these objectives in order to improve the resistance to multiple stresses, not only in amaranth, but also in stressintolerant crops such as maize. Key words: Amaranth, biotic stress, abiotic stress, functional characterization transcriptome. INTRODUCCIÓN El género Amaranthus sp. está constituido por plantas herbáceas dicotiledóneas anuales de tipo fotosintético C4, las cuales se distribuyen en todo el mundo, aunque predominan en lugares con climas cálidos y regiones tropicales. Muchas especies de amaranto se consideran malezas 60

P. A. Palmeros-Suárez et al.

agresivas, otras son ornamentales y algunas otras se consumen como verdura. También hay especies utilizadas para la producción de semillas de un elevado valor nutricional; entre éstas están A. cruentus, A. caudatus y A. hypochondriacus (Délano-Frier et al., 2010). En la actualidad se ha incrementado el interés del cultivo de amaranto de grano, debido al alto contenido proteico en la semilla. Además, presenta características agronómicas deseables, como la alta tolerancia a sequía y salinidad, que le permiten crecer en suelos pobres no aptos para el cultivo de cereales, por ejemplo (Omami et al., 2006). Debido a ello, el amaranto representa una de las principales alternativas para la producción de alimentos de buena calidad en zonas con suelos salinos, prolongados periodos de sequía y/o lluvias irregulares (Espitia-Rangel et al., 2010). Son varios los mecanismos capaces de contribuir a una mayor tolerancia a condiciones de sequía que se han identificado en amaranto. Entre éstos están el cierre estomático, la presencia de barreras cuticulares, acumulación de ceras en las hojas y reducción del área foliar; además, el metabolismo de asimilación de CO2 tipo C4 que presenta, le permite tener una alta tasa fotosintética en temperaturas elevadas, sin que se pierda el agua por transpiración ni se reduzca la eficiencia de asimilación por fotorrespiración, mientras mantiene un ajuste osmótico adecuado (Espitia-Rangel et al., 2010). Presenta una rápida recuperación después de periodos de sequía prolongados, debido a la longitud y extensión de su sistema radicular, lo que le facilita la pronta recuperación (HuertaOcampo et al., 2010). De aquí, el interés por la búsqueda de genes de amaranto que se encienden en condiciones de sequía y salinidad, con el fin de obtener plantas mejoradas que puedan resistir periodos prolongados de estrés. Debido a ello, el estudio de los componentes a nivel molecular que permiten al amaranto sobrevivir a condiciones ambientales adversas, ha ido en aumento en varios grupos de investigación. Por ejemplo, los trabajos de Huerta-Ocampo (2009, 2010), quienes mediante análisis proteómicos y genómicos encontraron que parte de la resistencia a estrés hídrico en amaranto puede explicarse por una respuesta coordinada en raíz que incluye la acumulación de solutos compatibles y la activación de genes asociados con estrés, como los

Capítulo V. Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés

relacionados con la reducción de ROS (especies reactivas de oxígeno, por sus siglas en inglés), la estabilización de proteínas y la regulación transcriptómica del crecimiento vegetal. Esta información se reforzó con reciente publicación del transcriptoma de novo de A. hypochondriacus en cuatro diferentes condiciones de estrés reportado por Délano-Frier et al. (2010), a partir del cual se identificaron numerosos genes que se inducen en las condiciones de estrés analizadas. El estrés se define como un cambio repentino en el ambiente que excede el estado óptimo del organismo y ocasiona una alteración en el balance homeostático, el cual debe ser compensado. Se sabe poco acerca de los receptores que perciben el estrés, aunque se han estudiado muchas vías de señalización, identificándose diversos genes ortólogos en diferentes especies que responden de la misma manera. Esta similitud sugiere que las vías de respuesta a estrés en plantas generalmente están conservadas (Kilian et al., 2012). El estrés ambiental es uno de los principales factores que limitan la productividad en las plantas, causando grandes pérdidas en la producción agrícola a nivel mundial. Bajo condiciones de campo, las plantas se enfrentan con diversas combinaciones de estrés en diferentes estados de desarrollo y con una variedad de duración. Los tipos de estrés abiótico como sequía, calor, salinidad, frío, falta de nutrientes, alta intensidad de luz, ozono y estrés anaerobio, ocasionan que la respuesta fisiológica y bioquímica sea muy variable, existiendo una alteración en el equilibrio iónico y homeostasis celular, observándose la inducción de cientos de genes y sus productos que responden a estos tipos de estrés a nivel transcriptómico y traduccional (Mittler y Blumwald, 2010). Éstos a su vez están regulados por múltiples vías de señalización, y existe un gran número de genes que se expresan no sólo en un tipo de estrés, sino en varios (Shing et al., 2002). Como la inducción de genes de respuesta a estrés ocurre principalmente a nivel transcriptómico, es importante la selección adecuada de los genes que se desean expresar en plantas modelo, debido a que la regulación de la expresión temporal y/o espacial de genes que responden a estrés es una parte importante para identificar la respuesta por parte de la planta a un estímulo (Shing et al., 2002).

Sreenivasulu et al., (2007), clasifican los genes que están asociados con la tolerancia a estrés abiótico en cuatro grupos, los cuales están relacionados con la biosíntesis de osmolitos, antioxidantes, protectores de la pared celular y homeostasis iónica. El Cuadro 1 muestra algunos de estos genes que se inducen en condiciones de estrés y codifican para proteínas que protegen tanto directa como indirectamente a la planta contra cambios ambientales. La mayoría de ellos han sido utilizados para llevar a cabo su sobreexpresión en plantas modelo, introduciendo principalmente enzimas que permiten la síntesis de solutos compatibles osmoprotectores, eliminadores de ROS, así como proteínas que se inducen por estrés (Le Martret et al., 2011). A su vez, Bhatnagar-Mathur et al. (2008) clasifican a los genes que se inducen bajo condiciones de estrés en tres grupos: 1) genes que codifican para proteínas con función enzimática o funciones estructurales conocidas, 2) proteínas de función desconocida y 3) proteínas reguladoras. Las investigaciones más recientes, se han enfocado en la utilización de los genes pertenecientes al tipo dos y tres, ya que la búsqueda de genes de función desconocida, ha permitido identificar nuevas vías de señalización que se inducen en condiciones ambientales adversas y, por otro lado, el uso de proteínas reguladoras, particularmente los factores de transcripción es también de gran interés debido a su papel de inducción multigénica. Usando este criterio como base de partida, diversas investigaciones lograron descubrir que algunos tipos de factores de transcripción son reguladores clave de la respuesta de las plantas a diferentes tipos de estrés ambiental. Un par de características que repetidamente se manifestó de estos estudios fue, primero, la gran complejidad de las redes de señalización, y segundo, que muchas de ellas compartían vías de comunicación en respuestas a diferentes tipos de estrés (Singh et al., 2002). Estos hallazgos representaron un importante logro en pos del objetivo de obtener cultivos más tolerantes a enfermedades y condiciones ambientales adversas, las cuales son cada vez más frecuentes y severas por causa del cambio climático que sufre el planeta (Mittler, 2010). En los últimos años, se han caracterizado diversos genes que están involucrados en la respuesta a condiciones de estrés ambiental. Además, hay numerosos ejemplos de proyectos P. A. Palmeros-Suárez et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología Cuadro 1. Principales blancos para la ingeniería de cultivos tolerantes. (Tomado de Cushman y Bohnert, 2000). ELEMENTOS DE RESISTENCIA Osmoprotectores

Eliminadores de especies reactivas de oxígeno

Proteínas de estrés Proteínas de choque térmico

Transportadores ion/protón Fluidez de la membrana

Estatus del agua

Componentes de señalización Control de la transcripción Reguladores de crecimiento

exitosos que reportan la obtención de cultivos tolerantes a diferentes tipos de estrés a través de ingeniería genética. Sin embargo, sólo un número limitado de ellos ha trascendido los límites del laboratorio para realizar pruebas a nivel de campo (Nelson et al., 2007). Esto se refleja en el relativamente bajo porcentaje de cultivos modificados que han sido lanzados al mercado (Reguera et al., 2012). Aspectos fisiológicos, como sobrevivencia y recuperación, son las principales características que representan la tolerancia a estrés en plantas. Desde un punto de vista agrícola, el rendimiento del cultivo es el aspecto principal de éxito en plantas tolerantes a estrés. 62

P. A. Palmeros-Suárez et al.

Por ello, es importante, tomar en cuenta tanto características fisiológicas como agronómicas para determinar un cultivo o variedad como resistente o tolerante y de esta manera asegurar su integración al mercado (Reguera et al., 2012). Como se mencionó anteriormente, muchas veces resulta poco útil la modificación de un sólo gen con el fin de obtener plantas tolerantes a estrés, debido a la existencia de múltiples vías regulatorias que podrían impedir un cambio fisiológico significativo, o visible, en la planta. Sin embargo, el uso de factores de transcripción, los cuales son genes maestros que regulan diversas vías metabólicas, permite restaurar la homeostasis en las plantas

Capítulo V. Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés

durante episodios de estrés, incrementando la probabilidad de éxito. Estas características los hacen ser buenos candidatos para la obtención de plantas genéticamente modificadas (Reguera et al., 2012). Recientemente se ha dado un progreso considerable en la caracterización de los factores de transcripción que están relacionados en la expresión de genes que se inducen en condiciones de estrés. Con frecuencia, factores de transcripción que están íntimamente relacionados, tienen el potencial de activar o reprimir genes a través de secuencias en cis que corresponden a diferentes tipos de estrés específicos. Desafortunadamente, en muchas ocasiones estos factores pueden tener funciones superpuestas, lo cual impide o dificulta su análisis genético, o la determinación de su rol respectivo (Shing et al., 2002). Como ya se mencionó, los patrones de expresión de estos factores de transcripción son muy complejos, y sugiere que la tolerancia a estrés y resistencia está controlada a nivel transcriptómico por una vía regulatoria génica extremadamente complicada. Chen et al. (2002), identificaron grupos de factores de transcripción que se clasifican en: a) factores de transcripción regulados específicamente por estrés abiótico y b) factores de transcripción regulados por estrés biótico y abiótico. Dentro de los factores de transcripción que se activan en condiciones de estrés se encuentran los siguientes: DREB, EREBP, ERF/AP2, HSF, bZIP, MYB, MYC, NAC, WRKY, Cys2His2, MADS-box, dedos de zinc y NFY. Este último, es un factor de transcripción nuclear constituido por tres subunidades, NFYA, NF-YB y NF-YC, y se ha observado que confiere tolerancia a estrés abiótico cuando se sobreexpresa en plantas de arabidopsis y maíz (Nelson et al., 2007), sin que éstas sufran pérdidas en el rendimiento. De manera interesante, se ha observado que el gen que codifica para la subunidad NF-YC se induce en plantas de amaranto en condiciones de sequía, y se mantiene inducido después de ocho días sin riego (Palmeros-Suárez PA., datos no publicados). Por otra parte, Huerta-Ocampo et al. (2010) describieron la expresión de los factores DOF1 (unión a DNA con un solo dedo) y MIF1

(mini dedo de zinc 1) en raíces de amaranto bajo condiciones de sequía. El primero, es un factor de transcripción relacionado con factores biológicos únicos de plantas, como la expresión de genes relacionados con la luz, genes de respuesta a fitohormonas y/o estrés y expresión de genes fotosintéticos, mientras que el segundo está involucrado en la interacción de señales provenientes de diversas hormonas. Las plantas son miembros de comunidades complejas, e interactúan con organismos benéficos, como micorrizas, microorganismos fijadores de nitrógeno, insectos y mamíferos polinizadores, bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCVs), entre otros. La contra parte la representan los antagonistas o atacantes, como herbívoros, nemátodos y patógenos microbianos. Un ejemplo de interacción benéfica en amaranto, es el uso de la bacteria promotora de crecimiento vegetal Burkhordelia sp., la cual incrementa el crecimiento y peso seco de plantas de A. cruentus en condiciones de invernadero (véase el capítulo IX). Por otra parte, la interacción con organismos patógenos también se ha presentado en campo, siendo éstos de origen bacteriano, como Pseudomonas spp. (véase capítulo X) y Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Espitia et al., 2010), o fúngico, como Alternaria tenuis, Fusarium spp., Phoma longissima, Sclerotinia sclerotiorum y Thecaphora iresine, entre otros. Además, existe una gran variedad de virus, fitoplasmas, nemátodos e insectos plaga, capaces de afectar significativamente el cultivo de amaranto (Rojas-Martínez et al., 2009; AragónGarcía et al., 2011). Con referencia a lo anterior, una pregunta importante relacionada con los mecanismos de defensa de las plantas es la siguiente: ¿cómo pueden las plantas integrar las señales inducidas por patógenos, microorganismos benéficos e insectos, para generar una respuesta adaptativa apropiada? (Pieterse y Dicke, 2007). Las investigaciones realizadas coadyuvan a dar respuesta a esta pregunta al demostrar que las plantas desarrollan estrategias sofisticadas para percibir o reconocer un ataque por patógenos y traducir esta percepción en una respuesta adaptativa apropiada. Este sistema inmune de las plantas es

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

sorprendentemente complejo y altamente flexible en su capacidad de reconocimiento y respuesta a diferentes invasores de manera efectiva mediante diversos mecanismos y vías de señalización (Pozo et al., 2005; De Vos et al., 2006; Jones y Dangl, 2006; McHale et al., 2006; Srinivasa et al., 2007; Hann et al., 2010; Dodds y Rathjen, 2010). Los mecanismos incluyen barreras físicas y químicas preexistentes, además de respuestas de defensa inducibles que se activan debido al ataque. Por tanto, la identificación de los mecanismos de defensa de las plantas, y el tipo de genes involucrados en esta comunicación ha permitido descubrir la manera en la que se integran señales inducidas por microorganismos patógenos o herbívoros para activar específicamente una respuesta contra el invasor adecuado (De Vos et al., 2006). La respuesta de defensa es vital, pero costosa para la planta; es por ello que, en lugar de mantenerla continuamente encendida, se activan diferentes mecanismos inducibles en la planta, dependiendo del ambiente en el que ésta se encuentre. Esta defensa inducible está sujeta a una estricta regulación debido a que su activación rápida es la clave del éxito de la misma (Felton y Korth, 2000; Pozo et al., 2005). Las hormonas vegetales como ácido salicílico (AS), ácido jasmónico (AJ) y etileno (ET) son los principales reguladores del sistema inmune de las plantas, las cuales responden en diversas combinaciones al ataque de un patógeno. Además, se ha observado que el ácido abscísico (ABA), brasinoesteroides y auxinas, también son hormonas involucradas en la defensa de plantas contra patógenos, y se ha propuesto que las vías de señalización que se inducen por el ataque de patógenos están influenciadas por su particular estilo de vida; por ejemplo biotrófico vs, necrotrófico (Pozo et al., 2005; Bari y Jones, 2009). En este capítulo se hará una descripción de las estrategias experimentales que se están empleando actualmente en nuestro laboratorio para obtener plantas transgénicas de arabidopsis (Arabidopsis thaliana) y/o tabaco (Nicotiana tabacum) capaces de resistir varios tipos de estrés, tanto biótico como abiótico. Para ello se realizó una selección inicial de genes de amaranto con una ó más de las siguientes características: i) altos niveles de expresión, 64

P. A. Palmeros-Suárez et al.

obtenidos de un análisis in silico basado en los datos del transcriptoma de novo de amaranto; ii) ser un factor de transcripción poco estudiado; iii) ser una gen con características atractivas, presente también en otras especies, pero sin haber sido caracterizado funcionalmente, y/o iv) ser un gen novedoso, de función desconocida. El capítulo cerrará con los avances obtenidos hasta el momento en este proyecto, que es la base de al menos dos proyectos de Doctorado en Ciencias, y los retos que enfrenta para lograr su cometido de generar plantas con resistencia a múltiples condiciones de estrés. MATERIALES Y MÉTODOS Los esfuerzos realizados para aumentar la tolerancia en los cultivos a estrés como sequía, alta salinidad y cambios de temperatura a través del mejoramiento de la ingeniería genética, han tenido un éxito limitado. Sin embargo, gracias a las nuevas técnicas moleculares, el descubrimiento de genes desconocidos, la determinación de su expresión bajo condiciones de estrés, y una visión más clara de su papel en la adaptación a condiciones ambientales adversas, ha establecido las bases de una estrategia de ingeniería genética actualmente mucho más efectiva. El trabajo desarrollado en nuestro grupo de investigación, ha permitido la identificación de diversos genes que se inducen en una o varias condiciones de estrés, obtenidos a partir del transcriptoma de amaranto publicado por Délano-Frier et al. (2010). Sobre la base de estos resultados, se seleccionaron inicialmente 50 genes, involucrados en diversas vías de señalización, funciones fisiológicas y adaptación a cuatro tipos de estrés utilizados: para las condiciones de sequía, la planta se dejó de regar por cuatro días, alcanzando una pérdida de humedad del 55%, equivalente a -2.6 MPa (considerado como un estrés hídrico severo para la mayoría de las plantas; Figura 1). El estrés por salinidad se realizó adicionando 100 mL de una solución de NaCl 400 mM por cuatro días, alcanzando una conductividad en suelo de 12 dS/m (considerada como alta salinidad, no apta para cereales, ni betabel; Figura 2). Por otra parte, las condiciones de estrés biótico fueron la herbivoría, por un máximo de

Capítulo V. Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés

Figura 1. Efectos fisiológicos en las plantas causados por una disminución del potencial hídrico del suelo. (Modificado de Root intake en: http://plantphys.info/plant_physiology). >16: Salinidad severa. Sólo sobreviven plantas halófitas como: Puccinella spp. Casuarina glauca, Eucalyptus ssp., Atriplex ssp., Melaleuca ssp., Spartina ssp., Saueda ssp., Thellungiella halophila, manglares (e.g. Bruguiera ssp.), etc. Cristales de sal observados sobre la superficie del suelo seco. 8-16: Salinidad alta. Afecta plantas tolerantes. Ausencia de leguminosas anuales. Afecta a cebada y centeno. Predominan especies marcadoras de suelos salinos o perturbados (e.g. Hordeum marinum) y otras (e.g. Eucalyptus camaldulensis). Áreas pequeñas desprovistas de cobertura vegetal. Muerte de algunas especies arbóreas tolerantes a sal (e.g. maple, álamo, roble: 3-4*). 4-8: Salinidad moderada. Afecta la mayoría de las plantas incluyendo leguminosas anuales. Afecta las leguminosas de grano, triticale (6.1*), trigo (4.7*), avena (5.2*), sorgo (4*), betabel (6.7*) y pastos perenes (6 a 8*). Crecimiento irregular. 2-4: Salinidad baja. Afecta a plantas sensibles. Menor vigor en leguminosas anuales. Afecta a algunas leguminosas de grano. (e.g. frijol, 1.0*) y la mayoría de las hortalizas. No afecta a cereales, excepto maíz (2.7*). 0-2: No salino. No afecta a la mayoría de las plantas. Crecimiento uniforme. Umbral de tolerancia en dS/m

Adaptada de www.pir.sa.gov.au/factsheet

Figura 2. Indicadores de varios rangos de salinidad en suelos. (Adaptada de www.pir.sa.gov.au/pirsa/more/factsheets/fact_sheets/salinity) P. A. Palmeros-Suárez et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

24 h, por larvas de Spoladea recurvalis del tercer estadio larval; y por otro lado la infección con patógenos bacterianos mediante la aspersión de un cultivo de P. syringae pv. tabacci a una densidad óptica de 0.2 a 600 nm. Con el fin de validar la expresión de los genes seleccionados, se realizó la técnica denominada qRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa), utilizando el equipo C1000Touch Thermal Cycler de Bio-Rad. Una vez obtenidos los resultados (ver más adelante), se seleccionaron aquellos genes inducidos en más de un tipo de estrés con un umbral de expresión mínimo 1.5 veces más alto con respecto a los controles no tratados. Además, deberían ser genes poco estudiados y/o no caracterizados, con el fin de innovar o descubrir genes desconocidos con alto potencial agronómico. El estudio incluyó también al menos un factor de transcripción y algunos genes desconocidos que se nombraron con base al número de isotig utilizados en el transcriptoma: 01684, 06719 y 01736 (datos no mostrados). La siguiente etapa después de la selección de los genes está actualmente en proceso. En primer lugar se está trabajando para obtener la secuencia completa de las regiones codificantes de los genes elegidos, mediante la técnica denominada RACE (de Rapid Amplification of cDNA Ends) la cual permite conocer las secuencia que codifica para la proteína de interés, junto con las dos regiones reguladoras UTR (del inglés untranslated region o untranslated trailer), las cuales son elementos que tienen gran importancia en la regulación de la expresión génica. Con el fin de introducir estas secuencias en otras plantas modelo como tabaco y Arabidopsis, se están empleando técnicas de transformación genética, dentro de las cuales la transformación indirecta mediada por una bacteria denominada Agrobacterium tumefaciens es la más utilizada y fácil de desarrollar (Martínez-Trujillo et al., 2004; Burow et al., 1990). Esta técnica, permite la introducción del gen de interés mediante la infección de la planta por A. tumefasciens, la cual introduce el DNA hasta el núcleo de las células vegetales y lo inserta en el material genético de la plantas; una vez hecho esto, la planta expresará el gen que se ha introducido como si fuera propio y comenzará a 66

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sintetizar, en teoría, las proteínas que le permitan resistir a factores ambientales adversos. Las plantas como tabaco y Arabidopsis se conocen como modelos debido a que son fáciles de transformar, ya que se infectan fácilmente con Agrobacterium y poseen recursos genéticos muy amplios, como un gran número de mutantes y genomas completamente secuenciados. Además, Arabidopsis es una planta que se utiliza mucho en el área biotecnológica debido a que su ciclo de vida es corto (6 a 8 semanas) y es de fácil manipulación. Más aún, es la planta superior con el genoma más pequeño (125 Mpb) el cual está contenido en cinco cromosomas y puede transformarse por diversos métodos. Por otra parte, el tabaco también se considera una planta modelo por su fácil transformación, y se asemeja más a otras plantas con potencial agronómico; sin embargo, su ciclo de vida es mayor y puede transcurrir hasta el triple de tiempo para observar los resultados esperados, comparado con Arabidopsis. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los primeros resultados de nuestro grupo de investigación se muestran en los cuadros 2 y 3. Éstos presentan los niveles de expresión de numerosos genes de amaranto en las cuatro condiciones de estrés mencionadas, determinados mediante PCR en tiempo real. Con ellos se validaron parcialmente los resultados obtenidos del análisis de expresión in silico usado inicialmente para su selección (Délano-Frier et al., 2011) y permitieron reducir el número de opciones de genes para su caracterización futura en Arabidopsis y tabaco. Al analizar con más cuidado los patrones de expresión en las dos condiciones de estrés abiótico, i.e. salinidad y sequía, se observó que existe un mayor número y variabilidad de genes que se inducen en condiciones de estrés hídrico comparados con estrés salino y que pocos de ellos se inducen de manera considerable en ambos tipos de estrés. Un ejemplo de ellos es el gen que codifica para una fosfolipasa D, que hidroliza fosfolípidos en una región muy específica, el cual se expresó de tres a cuatro veces más que el control en ambos tipos de estrés. Reportes de otros autores, como Peng et al. (2010), mostraron que la inducción de un

Capítulo V. Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés Cuadro 2. Expresión relativa evaluada mediante qRT-PCR de 50 genes de A. hypochondriacus var. Revancha, bajo cuatro condiciones de estrés (Parte 1).

SALINO

SEQUÍAH

ERBIVORÍAB ACTERIANO

GENES INVOLUCRADOS EN RESPUESTA A ESTRÉS BIÓTICO quitinasa arginasa Hfr proteína de respuesta a herida lectina cisteína proteasa proteinasa aspártica inhibidor de cisteína proteasa interactor con la cinasa Pto

0.0071 4.44 3.23 1.27 0.17 0.63 0.87 0.20 1.09

3.31 0.79 0.23 0.84 136.6 0.71 1.44 0.07 1.00

1.27 17.8 3.77 1.18 0.35 1.34 0.93 0.28 1.48

1.42 0.18 0.19 4.08 0.044 4.88 8.72 0.32 3.68

GENES INVOLUCRADOS EN RESPUESTA A ESTRÉS ABIÓTICO proteína de respuesta a estrés lipocalina inducida por temperatura precursor de calreticulina antiportador Na+/H+ esterol delta 7-reductasa desaturasa de ácidos grasos fosfolipasa D

1.2 1.47 2.56 0.7 2.85 0.056 3.95

1.21 0.67 1.42 1.12 1.07 0.55 1.07

0.82 0.94 2.00 0.65 1.4 0.28 1.51

1.79 1.3 2.07 0.27 10.91 1.23

0.19 4.47 1.19 0.22 0.017 5.29

2.58 1.99 1.35 1.16 19.64 0.79

1.19 5.76 1.47 1.04 1476.8 1.27

0.08 0.19 0.03 0.47

11.97 24.32 0.02 6.27

1.66 1.5 0.56 0.96

3.45 10.62 0.34 0.85

0.99 1.08 1.29 0.54 0.82 0.15 2.62

GENES DE RESPUESTA A ESTRÉS OXIDATIVO peroxidasa ascorbato peroxidasa superóxido dismutasa catalasa de raíz lipoxigenasa fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa glutatión S-transferasa isocitrato deshidrogenasa dioxigenasa de carotenoides oxidasa alternativa

1En negritas, genes inducidos (≥ 1.5 veces el control); en naranja, genes reprimidos (≤ 0.5 veces el control). Cuadro 3. Expresión relativa evaluada mediante qRT-PCR de 50 genes de A. hypochondriacus var. Revancha, bajo cuatro condiciones de estrés (Parte 2).

SALINO

SEQUÍAH

ERBIVORO

BACTERIA

GENES INVOLUCRADOS EN EL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS 1.23 0.81 0.20 2.26 0.24 0.03 0.38 0.25 0.58

3.17 0.06 0.05 0.82 0.03 0.46 0.68 8.3 1.15

1.66 1.32 1.42 2.9 0.9 0.37 0.06 1.13 0.92 P. A. Palmeros-Suárez et al.

1.59 0.85 0.78 6.00 0.63 0.88 0.22 2.33 1.29

67

Amaranto: Ciencia y Tecnología Continúa Cuadro 3...

SALINO

SEQUÍAH

ERBIVORO

BACTERIA

0.46 0.13 1.16 0.51 1.11 0.2

0.54 0.46 2.29 0.29 5.73 1.23

1.62 1.17 2.03 0.82 0.66 0.8

0.88 1.34 3.16 4.23 0.71 2.9

1.18 5.4 1.11 0.29 1.96 0.68 1.10 1.3

0.06 0.04 3.13 0.23 0.37 0.03 13.13 2.06

0.74 1.6 0.99 0.88 0.92 1.17 0.93 2.02

0.99 4.57 0.84 2.87 0.41 0.74 2.04 264.33

FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN CONSTANS RAV Proteína de unión a RNA Proteína de repetidos ricos en leucina Histona H3.2 NF-YC OTROS proteína de respuesta a auxinas alfa expansina transportador de oligopéptidos YSL WAX sintasa proteín fosfatasa serin hidroximetil transferasa Glutamina sintetasa Oxygen-evolving enhancer protein 3

1En negritas, genes inducidos (≥ 1.5 veces el control); en naranja, genes reprimidos (≤ 0.5 veces el control).

gen similar bajo múltiples condiciones de estrés abiótico en plantas de Setaria itálica, el segundo cereal más cultivado de Asia, incrementó la tolerancia a sequía al ser sobeexpresado en plantas de Arabidopsis. De la misma manera, Zhang et al. (2008) reportaron que la sobreexpresión de este gen en plantas de álamo (Populus tomentosa) fue capaz de conferirles alta tolerancia a salinidad y sequía. Por otra parte, nuestros resultados también muestran, de acuerdo a una gran número de reportes, la inducción de genes relacionados con estrés oxidativo, que codifican enzimas que permiten la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales ocasionan daño celular en la planta, alteraciones en membrana, DNA, y otras moléculas biológicas, como lípidos y proteínas. Entre este tipo de genes destacan aquellos que codifican para superóxido dismutasas, ascorbato peroxidasas, isocitrato deshidrogenasas dependientes de NADP, fosfolípido hidroperóxidoglutatión peroxidasas y glutatión S-transferasas, entre otras. No es sorprendente entonces que algunas de ellas se induzcan más de diez veces en condiciones de sequía, una condición que se caracteriza por la gran acumulación de ROS. Así también algunos genes involucrados en el metabolismo de carbohidratos se indujeron en condiciones 68

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de estrés hídrico y/o salino, como la celulosa sintasa y la β-amilasa. Esta última, es una enzima involucrada en la degradación de almidón (exoamilasa) que produce maltosa. Hay 9 genes de β-amilasa en Arabidopsis (BMY1-BMY9), pero solamente BMY1 posee el 90% de la actividad total de las β-amilasas en esta planta. Se induce por estrés abiótico y tiene una regulación compleja debido a que la expresión y actividad está influenciada por frío, calor, luz, salinidad, fitohormonas, azúcares y estrés osmótico. La inducción de β-amilasa y la acumulación resultante de maltosa puede funcionar como un factor estabilizante en el estroma del cloroplasto en respuesta a estrés por altas temperaturas. También se le ha dado un papel de proteína de almacenamiento vegetativo (Kaplan y Guy, 2004) y podría inclusive funcionar para reducir el estrés por deshidratación que normalmente es causado por la herbivoría de larvas de insectos masticadores (Tang et al., 2009). Algunos de los genes de amaranto anteriormente mencionados, aunque de gran interés e importancia, no satisfacen uno de los criterios de selección antes mencionados. Por ejemplo, ortólogos de la mayoría de los genes de amaranto relacionados con la eliminación de ROS provenientes de otras especies, muchas

Capítulo V. Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés

de ellas extremófilas, ya han sido clonados, secuenciados y sobreexpresados en plantas modelos como tabaco y Arabidopsis (Allen et al., 1997; Seltmann et al., 2010; Yu et al., 2003; Yadav et al., 2005; Liu et al., 2010). Incluso, ha habido reportes en donde se introducen dos o hasta tres genes en plantas de tabaco que están relacionados en la respuesta a estrés oxidativo (Kwon et al., 2002; Lee et al., 2007; Le Martret et al., 2011). Siguiendo este criterio se han tenido que descartar numerosos genes que en el papel parecían ser muy interesantes. Es por ello que el estudio se ha enfocado al estudio de genes de amaranto con función desconocida (que comprenden una buena parte del total) o que hayan sido poco estudiados y caracterizados en otras especies. Debemos tomar en cuenta que los estudios en los que se llevará a cabo la sobreexpresión de un gen determinado en plantas modelo, será predominantemente bajo condiciones de invernadero, y se medirá su comportamiento ante el reto de un solo tipo de estrés a la vez. Es por ello que los resultados iniciales obtenidos deberán tomarse con cierto grado de cautela y las conclusiones sobre su impacto fisiológico y agronómico tendrán que ser validadas, ya sea aplicando dos o más tipos de estrés de manera simultánea y en periodos de tiempo indeterminados, o bien realizando ensayos directamente en campo, donde todas las variable posibles que podrían afectar a la planta están presentes, ya sea simultáneamente o en ciertos períodos de su desarrollo. Esto permitirá obtener una visión más clara del potencial que puede tener la expresión del gen de interés en condiciones reales y quizás en otras plantas de interés comercial, como cereales u hortalizas. Por otro lado, algunos de los genes que se indujeron en condiciones de estrés biótico, son proteínas que están involucradas en una respuesta inmediata, y los genes que codifican para algunas de ellas como quitinasa o lectina, genes relacionados con el mecanismo de explosión oxidativa, como ascorbato peroxidasa, lipooxigenasa, glutatión S-transferasa y peroxidasas, así como otros genes involucrados en la transducción de señales, como calreticulina y aquellos que pueden fungir como factores de transcripción como una proteína de unión a RNA o RBP (de RNA Binding Protein). Estas son

proteínas que normalmente se acumulan cuando la planta sufre un ataque por patógenos, como se ha observado en amaranto (Tabla 2; ver también, Casarrubias-Castillo, 2009 y Fomsgaard et al., 2010). Un gen por el cual se ha tenido el interés particular de ser estudiado con mayor profundidad es el denominado OEE3 (de Oxygen Evolving Enhancer protein subunidad 3), debido a que sólo se conoce su función biológica en las plantas como parte del complejo proteico constituido por elementos de tres diferentes pesos moleculares, OEE1 de 33 kDa, OEE2 de 23 kDa y finalmente, OEE3 de 16 kDa. Éstos estabilizan el fotosistema II, sin que existan reportes que mencionen su papel como un gen que se induce en condiciones de estrés biótico y abiótico. Nuestros resultados han mostrado que duplica su expresión al doble cuando se somete a la agresión por insectos herbívoros (i.e. S. recurvalis) y que se induce más de 200 veces ante una ataque por bacterias que causan infección sistémica como P. syrigae var. tabacci. Pocos reportes, como el de Sugihara et al., (2000) han mostrado un aumento en la concentración de la proteína al ser sometida a estrés salino después de cinco días en plantas de un especie que habita manglares, sin que esta observación se repitiera en estudios desarrollados por Momonoki et al. (2009) en otra planta halófita. En contraste, nosotros observamos que el gen OEE3 presenta un aumento significativo en su expresión en condiciones de salinidad y sequía comparada con las plantas control. Por lo anterior, es uno de los genes candidatos para ser estudiados con mayor profundidad, y así conocer el papel que desempeñan en condiciones de estrés biótico y abiótico y su posible mecanismo en la respuesta de resistencia multiestrés en plantas. De igual manera, el gen que codifica para una proteína tipo RBP, que se detectó inicialmente como una proteína de resistencia a salinidad o Salt Tolerance Protein en el transcriptoma de amaranto, media el procesamiento del pre-rRNA, el transporte de mRNA y la traducción. Además, forma parte de una familia de genes que funciona como factores regulatorios en la transición floral, patrones florales, señalización por ABA, respuesta a estrés, ritmo circadiano y modificación de la cromatina. En un reporte reciente se detectaron altos niveles de expresión de este gen bajo condiciones de P. A. Palmeros-Suárez et al.

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estrés biótico (Lorkovíc, 2009). De igual manera, su expresión se duplicó en condiciones de sequía en el estudio que presentamos. De acuerdo con los resultados propuestos por Ayarpadikannan, et al. (2012), la sobreexpresión en levaduras de una RBP de Suaeda asparagoides, una planta halófita originaria de Korea, indicó un aumento en su tolerancia a estrés osmótico, frío y choque térmico. Otro gen de interés es el gen de función desconocida que hemos denominado Ah24. Éste codifica para una proteína totalmente nueva que se induce por herbivoría por insectos masticadores, daño mecánico y adición exógena de AJ, lo que sugiere que puede estar participando en el mecanismo de defensa de amaranto. Además, la región promotora del gen Ah24 contiene una sobre-representación de cajas reguladoras implicadas en procesos de desarrollo, indicando que podría estar participando en procesos tanto de desarrollo como de defensa (Massange-Sánchez J, datos no publicados). Dentro de esta línea también resultó de interés el gen Hfr-2 el cual es sobre regulado por el ataque de la mosca de Hess (Mayetiola destructor) en trigo (Triticum aestivum). El Hfr-2 (de Hessian fly responsive gene-2), contiene dos regiones similares a genes que codifican para una proteína aglutinina especifica de semilla de Amaranthus y para una proteína hemolítica que es capaz de formar poros en las membranas celulares. La expresión de Hfr-2 aumenta cuando plantas de trigo son atacadas por el herbívoro Spodoptera frugiperda y el áfido Rhopalosiphum padi. También se sabe que hay un ligero aumento en la expresión del gen cuando las plantas son tratadas con AS y ABA, por lo cual la proteína ha sido propuesta para tener una función en la defensa contra ciertos insectos y patógenos. Por otra parte, se ha propuesto que la proteína puede ayudar al desarrollo de las larvas de la mosca de Hess (Puthoff et al., 2005). Sin embargo, se cree que el gen Hfr-2 puede estar involucrado en la resistencia de amaranto a suelos salinos, ya que permite el fácil intercambio de agua, iones, azúcares solubles y osmolitos para la estabilidad de la turgencia celular. Lo anterior es sustentado en el hecho de que la expresión del gen aumenta cuando las plantas son tratadas con solución salina (Cuadro 2). 70

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Otro factor de transcripción que pareció digno de estudio debido a los criterios aplicados es el conocido GRF8 (de Growth-Regulating Factor 8), que es un factor que se ha descrito regula la expansión de la célula. Existen trabajos que demuestran la participación de GRF8 en la regulación del crecimiento de la célula; por ejemplo, triples mutantes en Arabidopsis de GRF1-GRF3 dieron como resultado que hojas y cotiledones fueran más cortos, mientras que, la sobreexpresión de AtGRF1 y AtGRF2 resultó en plantas con hojas y cotiledones más largos (Jeong et al., 2003). Sin embargo, se desconoce si GRF8 esté implicado en el mecanismo de defensa en plantas. Délano Frier et al. (2011) encontraron un aumento en la expresión de éste factor de transcripción bajo diferentes tipos de estrés, abriendo una nueva ventana para la función de GRF8, ya que podría estar participando en la respuesta de la planta a condiciones estresantes. (Cuadro 2). Por último, las lipoxigenasas (LOX) son una familia de dioxigenasas de ácidos grasos que contienen hierro no acomplejado en un grupo hemo. En plantas catalizan principalmente la dioxigenación de α-ácido linolénico (α-LeA). Se clasifican de acuerdo a su especificidad posicional en 9-LOX y 13-LOX o a su estructura primaria en LOX tipo1 y LOX tipo 2. Análisis de expresión de una LOX2 de arabidopsis (AtLOX2) indicaron que se expresa en hojas y flores, se activa por MeJA, y volátiles de hoja verde (que son un producto secundario de LOX) y es desregulada en la senescencia. En hojas de papas una LOX-H3 (13-LOX tipo 2) es diferencialmente inducida por daño, y las mutantes en LOX-H3 reducen la acumulación del inhibidor de proteasas (Pin2) que es una proteína clásica de defensa contra insectos masticadores y algunos otros (Feussner y Wasternack, 2002). CONCLUSIONES Los enfoques biotecnológicos de este trabajo enfatizan el desarrollo de cultivos biotecnológicamente modificados bajo condiciones similares a las del campo y se enfocan en evitar un daño significativo al estado reproductivo de la planta para asegurar buenos rendimientos, impulsarán notablemente las oportunidades para desarrollar cultivos tolerantes a estrés.

Capítulo V. Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés

El estudio de genes desconocidos o poco estudiados que se inducen en condiciones adversas en amaranto permitirá comprender las funciones que desempeñan estos genes, así como el posible mecanismo de tolerancia a diversos ambientes adversos. Además, la sobreexpresión de genes de amaranto en plantas modelo como tabaco y Arabidopsis, permitirá conocer con mayor profundidad el papel fisiológico que estos genes desempeñan en plantas. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó gracias al apoyo brindado por Conacyt (Proyecto SEP-Ciencia Básica No. 156912), México Tierra de Amaranto A.C. y la Fundación Deborah Presser-Velder. Agradecemos el apoyo económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Conacyt con las becas otorgadas a PAPS (No. 232807) y a JAMS (No. 234771). BIBLIOGRAFÍA Allen R D, R P Webb, S A Schake (1997) Use of transgenic plants to study antioxidant defenses. Free Radical Biology & Medicine 23: 473-479. Aragón-García A, M A D Huato, M HuertaLara, F J Sáenz-de-Cabezón, I PérezMoreno, V Marco-Mancebón, J F LópezOlguín (2011) Insect occurrence and losses due to phytophagous species in the amaranth Amaranthus hypocondriacus L. crop in Puebla, Mexico. African Journal of Agricultural Research 6: 5924-5929. Ayarpadikannan S, E Chung, C W Cho, H A So, S O Kim, J M Jeon, M H Kwak, S W Lee, J H Lee (2012) Exploration for the salt stress tolerance genes from a salt-treated halophyte, Suaeda asparagoides Plant Cell Reports 31: 3548. Bari R, J D G Jones (2009) Role of plant hormones in plant defence responses. Plant Molecular Biology 69: 473-488.

Bhatnagar-Mathur P, V Vadez, K K Sharma (2008) Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects. Plant Cell Reports 27: 411-424. Burow M D, C A Chlan , P Sen , A Lisca , N Murai (1990) High-frequency generation of transgenic tobacco plants after modified leaf disk co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology 8: 124-139. Casarrubias-Castillo K (2009) Resistencia a bacteriosis en genotipos de amaranto (Amaranthus spp.) de interés agronómico. Tesis de Maestría. Departamento de Biotecnología y Bioquímica. Cinvestav-Unidad Irapuato. Irapuato, Gto, México. p.118. Chen W, N J Provart, J Glazebrook, F Katagiri, H SChang, T Eulgem, F Mauch, S Luan, G Zou, S A Whitham, P R Budworth, Y Tao, Z Xie, X Chen, Lam S, Kreps J A, Harper J F, Si-Ammour A, B Mauch-Mani, M Heinlein, K Kobayashi, T Hohn, J L Dangl, X Wang, T Zhu (2002) Expression profile matrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses. The Plant Cell 14: 559-574. Cushman J C, J Hans H J Bohnert (2000) Genomic approaches to plant stress tolerance. Current Opinion in Plant Biology 3: 117-124. Délano-Frier J P, H Avilés-Arnaut, K Casarrubias-Castillo, G Casique-Arroyo, P A Castrillón-Arbeláez, L Herrera-Estrella, J Massange-Sánchez, N A Martínez-Gallardo, F I Parra-Cota, E Vargas-Ortiz, M G EstradaHernández (2010) Transcriptomic analysis of grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) using 454 pyrosequencing: comparison with A. tuberculatus, expression profiling in stems and in response to biotic and abiotic stress. BMC Genomics 12: 363. De Vos M, W Van Zaanen, A Koornneef, J P Korzelius, M Dicke, L C Van Loon, C M J Pieterse (2006) Herbivore-Induced Resistance against Microbial Pathogens in Arabidopsis. Plant Physiology 142: 352-363.

P. A. Palmeros-Suárez et al.

71

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Dodds P N, J P Rathjen (2010) Plant immunity: towards an integrated view of plantpathogen interactions. Nature Reviews Genetics 11: 539-548. Espitia-Rangel E, C Mapes-Sánchez, D Escobedo López, M De la O-Olán, P RivasValencia, G Martínez-Trejo, L CortésEspinoza, J M Hernández-Casillas (2010). Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. SINAREFI-INIFAPUNAM, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. 201pp. Felton G W, K L Korth (2000) Trade-offs between pathogen and herbivore resistance. Current Opinion in Plant Biology 3: 309-314. Fomsgaard I, M Añon, A P Barba de la Rosa, C Christophersen, K Dusek, J P Délano-Frier, J Espinoza-Pérez, A Fonseca, D Janovská, P Kudsk, R Labouriau, M Lacayo-Romero, N Martínez, F Matus, K Matusová, S Mathiassen, E Noellemeyer, H Pedersen, H Stavelikova, S Steffensen, R de Troiani, A Taberner (2010) Adding Value to Holy Grain: Providing the Key Tools for the Exploitation of Amaranth – the Protein-rich Grain of the Aztecs. In: Results from a Joint European - Latin American Research Project. Denmark: Department of Integrated Pest Management, Aarhus University, Faculty of Agricultural Sciences. Feussner I, C Wasternack (2002) The lipoxygenase pathway. Annual Review of Plant Biology 53: 275-297. Hann D R, S Gimenez-Ibanez, J P Rathjen (2010) Bacterial virulence effectors and their activities. Current Opinion in Plant Biology 13: 388-393. Huerta-Ocampo J A, E P Briones-Cerecero, G Mendoza-Hernandez, A De Leon-Rodríguez, A P Barba de la Rosa (2009) Proteomic analysis of amaranth (Amaranthus hypochondriacus L.) leaves under drought stress. International Journal of Plant Science 170: 990-998.

72

P. A. Palmeros-Suárez et al.

Huerta-Ocampo J A, M F León-Galván, L B Ortega-Cruz, A Barrera-Pacheco, A De León-Rodríguez, G Mendoza-Hernández, A P Barba de la Rosa. (2010). Water stress induces up-regulation of DOF1 and MIF1 transcription factors and down-regulation of proteins involved in secondary metabolism in amaranth roots (Amaranthus hypochondriacus L.) Plant Biology 13: 472-482. Jeong H K, C Dongsu, K Hans (2003) The AtGFR family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis. The Plant Journal 36: 94-104. Jones J D G, J L Dangl (2006) The plant immune system. Nature 444: 323-329. Kaplan F, C L Guy (2004) β-Amylase induction and the protective role of maltose during temperature shock. Plant Physiology 135: 16741684. Kilian J, F Peschke, K W Berendzen, K Harter, D Wanke (2012) Prerequisites, performance and profits of transcriptional pro fi ling the abiotic stress response. Biochimica et Biophysica Acta 1819: 166-175. Kwon S Y, Y J Jeong, H S Lee, J S Kim, K Y Cho, R D Allen, S S Kwak (2002) Enhanced tolerances of transgenic tobacco plants expressing both superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in chloroplasts against methyl viologen-mediated oxidative stress. Plant, Cell & Environment 25: 873-882. Le Martret B, M Poage, K Shiel, G D Nugent, P J Dix (2011) Tobacco chloroplast transformants expressing genes encoding dehydroascorbate reductase, glutathione reductase, and glutathione-S-transferase, exhibit altered anti-oxidant metabolism and improved abiotic stress tolerance. Plant Biotechnology Journal 9: 661–673. Lee Y P, S H Kim, J W Bang, H S Lee, S S Kwak, S Y Kwon (2007) Enhanced tolerance to oxidative stress in transgenic tobacco plants expressing three antioxidant enzymes in chloroplasts Plant Cell Reports 26: 591-598.

Capítulo V. Caracterización funcional de genes novedosos de Amaranthus hypochondriacus: explorando su aplicación en la generación de cultivos resistentes al estrés

Liu Y, Y Shi, Y Song, T Wang, Y Li (2010) Characterization of a stress-induced NADPisocitrate dehydrogenase gene in maize confers salt tolerance in Arabidopsis. Journal of Plant Biology 53: 107-112. Lorkovic Z J (2009) Role of plant RNA-binding proteins in development, stress response and genome organization. Trends in Plant Science 14: 1360-1385. Martinez-Trujillo M, V Limones-Briones, J L Cabrera-Ponce, L Herrera-Estrella (2004). Improving transformation efficiency of Arabidopsis thaliana by modifying the floral dip method. Plant Molecular Biology Reporter 22: 63-70. McHale L, X P Tan, P Koehl , R W Michelmore (2006) Plant NBS-LRR proteins: adaptable guards. Genome Biology 7: 212. Mittler R, E Blumwald (2010) Genetic engineering for modern agriculture: challenges and perspectives. Annual Review of Plant Biology 61:443-62. Momonoki Y S, K Yamamoto, S Oguri (2009) Molecular cloning of Oxygen-Evolving Enhancer genes induced by salt treatment in a halophyte, Salicornia europaea L. Plant Production Science 12: 193-198. Nelson DE, P P Repetti, T R Adams, R A Creelman, J Wu, D C Warner, D C Anstrom, R J Bensen, P P Castiglioni, M G Donnarummo, B S Hinchey, R W Kumimoto, D R Maszle, R D Canales, K A Krolikowski, S B Dotson, N Gutterson, O J Ratcliffe, J E Heard (2007) Plant nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104: 16450-16455. Omami E N, P S Hammes, P J Robbertse (2006) Differences in salinity tolerance for growth and water‐use efficiency in some amaranth (Amaranthus spp.) genotypes. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 34: 11-22.

Peng Y, J Zhang, G Cao, Y Xie, X Liu, M Lu, G Wang (2010) Overexpression of a PLDa1 gene from Setaria italica enhances the sensitivity of Arabidopsis to abscisic acid and improves its drought tolerance. Plant Cell Reports 29: 793– 802. Pieterse C M J, M Dicke (2007) Plant interactions with microbes and insects: from molecular mechanisms to ecology. Trends in Plant Science 12:1360-1385. Pozo M J, L C Van Loon, C M J Pieterse (2005) Jasmonates - signals in plant-microbe interactions. Journal of Plant Growth Regulation 23: 211222. Puthoff D P, N Sardesai, S Subramanyam, J A Nemacheck, C E Williams (2005) Hfr-2, a wheat cytolytic toxin-like gene, is up-regulated by virulent Hessian fly larval feeding. Molecular Plant Pathology 6: 411-423. Reguera M, Z Peleg, E Blumwald (2012) Targeting metabolic pathways for genetic engineering abiotic stress-tolerance in crops Biochimica et Biophysica Acta 1819: 186–194. Rojas-Martínez R, E Zavaleta-Mejía, I M Lee, A Aragón-García (2009). Identification of an isolate from group 16SRIII, Candidatus Phytoplasma pruni in plants and seeds of amaranth (Amaranthus hypochondriacus l.) in México. Agrociencia 43: 851-860. Seltmann M A, N E Stingl, J K Lautenschlaeger, M Krischke, M J Mueller, S Berger (2010) Differential impact of lipoxygenase and jasmonates on natural and stress-induced senescence in Arabidopsis. Plant Physiology 152: 1940-1950. Singh K B, R C Foley, L Oñate-Sánchez (2002) Transcription factors in plant defense and stress responses. Current Opinion in Plant Biology 5: 430-436. Sreenivasulu N, S K Sopory, P B Kavi Kishor (2007) Deciphering the regulatory mechanisms of abiotic stress tolerance in plants by genomic approaches. Gene 388:1-13. P. A. Palmeros-Suárez et al.

73

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Sugihara K, N Hanagata, Z Dubinsky, S Baba, I Karube (2000) Molecular Characterization of cDNA encoding Oxygen Evolving Enhancer protein 1 increased by salt treatment in the mangrove Bruguiera gymnorrhiza. Plant & Cell Physiology 41: 1279–1285. Tang J, R Zielinskia, M Aldea, E DeLucia (2009) Spatial association of photosynthesis and chemical defense in Arabidopsis thaliana following herbivory by Trichoplusia ni. Physiologia Plantarum 137: 115-124. Torsethaugen G, L H Pitcher, B A Zilinskas, E J Pell (1997) Overproduction of ascorbate peroxidase in the tobacco chloroplast does not provide protection against ozone. Plant Physiology 114: 529-537. Uppalapati SR, Y Ishiga, T Wangdi, BN Kunkel, A Anand, KS Mysore, CL Bender (2007) The phytotoxin Coronatine contributes to pathogen fitness and is required for suppression of salicylic acid accumulation in tomato inoculated with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions 20: 955-965. Yadav SK, S L Singla-Pareek, M K Reddy, S K Sopory (2005) Transgenic tobacco plants overexpressing glyoxalase enzymes resist an increase in methylglyoxal and maintain higher reduced glutathione levels under salinity stress. Federation of European Biochemical Societies. Letters 579:6265-6271. Yu T, Y S Li, X F Chen, J Hu, X Chang, Y G Zhu (2003) Transgenic tobacco plants overexpressing cotton glutathione S-transferase (GST) show enhanced resistance to methyl viologen. Journal of Plant Physiology 160: 1305-1311. Zhang T T, Y Z Song, Y D Liu, X Q Guo, C X Zhu, F J Wen (2008) Overexpression of phospholipase Dα gene enhances drought and salt tolerance of Populus tomentosa. Chinese Science Bulletin 53:3653-3665.

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Capítulo VI

Análisis proteómico del amaranto, sometido a herbivoría y evocadores de resistencia a insectos PROTEOMIC ANALYSIS OF AMARANTH SUBJECTED TO HERBIVORY AND ELICITORS OF INSECT RESISTANCE

Ariana Navarro-Meléndez1, Silvia Edith ValdésRodríguez1 y John Paul Délano Frier1§ 1Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato) Km 9.6 del Libramiento Norte Carretera Irapuato-León. Apartado Postal 629, C.P. 36821, Irapuato, Gto., México. §Autor de correspondencia: [email protected] Teléfono: (52) 462 39636 o 462 39600 FAX: (52) 462 45996 o 462 39611

RESUMEN El daño causado por insectos herbívoros induce en las plantas diversas respuestas morfológicas y fisiológicas que son utilizadas para su defensa. El ácido jasmónico (AJ) es, en muchas especies de plantas, la principal señal para la inducción local y sistémica de las respuestas de defensa contra insectos. La planta de amaranto es apreciada por su adaptabilidad climática, tolerancia a la herbivoría y la calidad de proteína en semilla. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante proteómica comparativa la expresión diferencial de las proteínas de hojas de amaranto que pudieran estar involucradas en la defensa contra insectos. Una vez seleccionado el protocolo adecuado para la extracción de proteínas, se analizaron los perfiles proteómicos después de los tratamientos de herbivoría por larvas de Spodoptera exigua y de la aplicación de metil jasmonato (MeJA). Se detectaron 513 manchas en el tratamiento de herbivoría y 343 manchas en el de MeJA, muchas de las cuales mostraron alteraciones en su patrón de acumulación después del tratamiento. Algunas de las proteínas diferenciales fueron secuenciadas por ESIQTOF-MS/MS o MALDI-TOF. En general, se observó que las proteínas cuya expresión se alteró están involucradas en el metabolismo

primario de la planta, regulación transcripcional y traduccional, y defensa. Por ejemplo, la inducción de la subunidad-γ de la ATP sintasa cloroplástica sugiere que ésta pudiera estar involucrada en la liberación de péptidos similares a inceptinas involucrados en la percepción de la herbivoría por la planta, tal y como ocurre en garbanzo. En contraste, la Amarandina-1, que fue reprimida por el tratamiento con MeJA, es una proteína anti-microbiana inducible por la aplicación de ácido salicílico (AS), antagonista de AJ, y peróxido de hidrógeno. Además, esta técnica permitió identificar proteínas desconocidas, demostrando su capacidad para el descubrimiento de proteínas novedosas de función desconocida y con potencial aplicación biotecnológica en la agricultura. Palabras clave: ácido jasmónico, defensa, herbivoría, proteómica. ABSTRACT Insect herbivory damage causes diverse morphological and physiological responses in plants that have a defensive function. In many plant species, jasmonic acid (JA) is the signal responsible for triggering the above events, both locally and systemically. Grain amaranths are 75-84

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valued for their climatic adaptability, tolerance to herbivore attack and high protein quality. The aim of this study was to apply a comparative proteomics approach to assess the differential expression of grain amaranth leaf proteins that could be involved in defense against insect herbivores. After selection of a suitable protocol for protein extraction, the leaf protein profiles obtained after exogenous methyl jasmonate (MeJA) application or herbivory by Spodoptera exigua larvae, were compared. Both treatments showed the accumulation of differential proteins of low molecular weight, in the acidic and basic range. Approximately 513 protein spots were detected in hervibory-treated plants, whereas MeJA yielded approximately 343 spots, many of which showed a differential accumulation in response to the treatments. Some of these differential proteins were sequenced by ESIQTOF-MS/MS or MALDI-TOF. In general, induced proteins were involved in primary metabolism, transcriptional and translational regulation and defense. For instance, the induced expression of the chloroplastic ATP synthase γ-subunit, which is the source of biologically active inceptin peptides that are involved in the plant’s perception of herbivory in cowpea, suggests that a similar mechanism could be operating in amaranth. On the other hand, the MeJA treatment repressed the expression of amarandin-1, an antimicrobial protein that is inducible by salicylic acid, an antagonist of JA, and hydroxide peroxide. This technique also yielded unknown proteins, thereby indicating that a proteomic approach has the capacity of discovering novel proteins in amaranth with potential biotechnological applications in agriculture. Key words: defense, herbivory, jasmonic acid, extraction, proteomics. INTRODUCCIÓN Las plantas han desarrollado sistemas sofisticados de defensa para contrarrestar el ataque de los insectos. Estos sistemas están integrados por moléculas que funcionan como defensas directas como los glucósidos cianogénicos, alcaloides, fenoles, inhibidores de proteasas (IP), etc. Además, las plantas emiten compuestos volátiles o 76

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producen néctar extrafloral como un mecanismo de defensa indirecto, los cuales permiten a la planta reforzar su sistema de defensa para futuros ataques (Kessler y Baldwin, 2001; Heil, 2008). El ácido jasmónico (AJ) es la principal molécula de señalización involucrada en la activación de las respuestas de defensa contra insectos herbívoros (Howe, 2004; Reymond et al., 1998). La mayoría de los estudios que examinan las respuestas de defensa de las plantas después del ataque por insectos se han enfocado en la dinámica de genes, proteínas y metabolitos específicos responsables de los cambios en la resistencia por el ataque recibido. Recientemente la proteómica ha surgido como una poderosa herramienta para el estudio de los cambios en los patrones de expresión de proteínas, especialmente en cultivos de importancia agronómica como arroz, maíz, tomate y trigo, en respuesta a diversos tipos de estrés (Casati et al., 2005; Agrawal y Rakwal, 2006; Fan et al., 2012). El amaranto (Amaranthus cruentus, A. hypochondriacus y A. caudatus) es de interés agronómico debido su alta tolerancia al estrés abiótico. Además, en los últimos años se ha incrementado el interés hacia este cultivo ya que se caracteriza por producir semillas con alta calidad de proteína y almidón. Las proteínas de la semilla de amaranto son también, fuente de biopéptidos con actividad antidepresiva, anticarcinogénica e hipotensa (Silva-Sánchez et al., 2008; Barba de la Rosa et al., 2010) y de escualeno que reduce los niveles de colesterol y triglicéridos en pacientes con hipertensión (Martirosyan et al., 2007). A su vez, en semillas y hojas de amaranto se han encontrado inhibidores de proteasas (IP) tipo tripsina y de α-amilasa como mecanismos de defensa contra insectos plaga (Valdés-Rodríguez et al., 1993; Sánchez-Hernández et al., 2004). Además, experimentos en campo mostraron que la aplicación exógena de AJ induce la actividad de inhibidores de proteasas en hojas, así como de otras enzimas involucradas en la resistencia a insectos como la polifenol oxidasa (PPO), leucina aminopeptidasa (LAP) (Délano-Frier et al., 2004). A la fecha son pocos los reportes sobre los mecanismos de defensa que el amaranto erige contra diferentes tipos de estrés y que involucran cambios en la expresión global de proteínas. El

Capítulo VI. Análisis proteómico del amaranto, sometido a herbivoría y evocadores de resistencia a insectos

objetivo de este trabajo fue conocer mediante un análisis proteómico, la respuesta local (RL) y sistémica (RS) en las hojas de plantas de amaranto dañadas por larvas de Spodoptera exigua, un insecto generalista, y por la aplicación de metiljasmonato (MeJA), un derivado parcialmente volátil del AJ pero igualmente activo. Se evaluaron tres protocolos para la extracción inicial de proteínas para hojas de amaranto para realizar la subsiguiente separación en geles de dos dimensiones. Se compararon los patrones de proteínas de hojas de plantas sin daño (control), contra las hojas dañadas (respuesta local o RL), y hojas intactas (respuesta sistémica o RS) en plantas sujetas a herbivoría. Para el tratamiento con MeJA, se compararon los perfiles entre plantas tratadas, o inducidas, y no tratadas, o controles. Además, se logró la identificación de un número de proteínas diferenciales, algunas de ellas de función desconocida, con posible participación en la defensa contra insectos. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO Y SU MANEJO Semillas maduras de A. hypochondriacus var. Nutrisol fueron germinadas con mezcla de germinación (pasta de coco: mezcla general en relación 1:1) en un cuarto de crecimiento con fotoperíodo de 16 h luz a 28ºC y 8 h de oscuridad a 16ºC. Las plántulas fueron trasplantadas dos semanas después a macetas de plástico de 1.3 l en mezcla general (tierra de hoja, limo, “Sunshine Mix 3”, vermiculita y perlita en relación 2: 1: 3: 1: 1). Se realizaron tres réplicas con plantas de amaranto de cinco semanas de edad, seis plantas control y seis plantas tratadas para cada uno de los tratamientos de herbivoría y aplicación de MeJA Para el ensayo de herbivoría, se estableció una colonia del insecto Spodoptera exigua colectado en un campo experimental de amaranto establecido en Valencianita, Irapuato, Guanajuato, durante los años 2007-2009. Las larvas fueron alimentadas con una dieta a base de hojas de amaranto y los adultos con una solución de sacarosa. TRATAMIENTO CON METIL JASMONATO Se preparó una solución al 5 μM de MeJA (Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis, MO.

USA) en etanol justo antes de su aplicación. Cada planta fue asperjada con 1 mL de esta solución y cubierta con una bolsa de plástico, para ser luego colocada en una cámara de crecimiento durante 24 h a 28ºC con luz constante. Las plantas control se asperjaron con 1 mL de una solución de etanol-agua y se manejaron de igual forma que las plantas tratadas. Una vez finalizado el tiempo de exposición, se colectaron las hojas y se molieron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a - 80 °C hasta su uso. TRATAMIENTO DE HERBIVORÍA Se colocaron dos larvas de Spodoptera exigua de 3º a 4º instar por planta durante 3 h para que se alimentaran, durante este periodo se cubrieron las plantas con una malla para evitar su dispersión. Después de 24 h de iniciado el ensayo, se colectaron y molieron con nitrógeno líquido las hojas con pérdida de tejido foliar para evaluar la RL y hojas intactas para evaluar la RS. Los controles fueron expuestos a las mismas condiciones pero en ausencia de larvas. Todos los ensayos se llevaron a cabo en un cuarto de crecimiento en las condiciones de luz y temperatura antes mencionadas. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS La extracción de proteínas de hojas de A. hypochondriacus, se realizó por varios métodos con el objetivo de seleccionar el más adecuado para nuestro modelo con base al rendimiento, la calidad y la pureza del extracto. Éstos fueron los siguientes: 1. Extracción con TCA/acetona. Se siguió el protocolo reportado por Carpentier et al. (2005) con algunas modificaciones. A 200 mg de tejido congelado se agregó 1 ml de buffer de lisis (0.5 M Sacarosa; 0.075 M KCl; 0.375 M Tris-HCl, pH 7.5; 38 mM EDTA; 2 M Urea; 0.5 M tiourea, 1% v/v del coctel de inhibidores de proteasas 25 × Complete de Roche, Alemania, y 2% v/v de β-mercaptoetanol). Se agitó (700 rpm) durante 15 min a 4ºC, seguido de una centrifugación a 13000 rpm en una centrífuga de mesa (SORVALL Biofugue Pico, Kendro; Alemania) por 30 min a 4ºC, de la cual se recuperó el sobrenadante en otro tubo. Se precipitaron las proteínas con 1 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 10% en acetona por cada 1 ml de sobrenadante, se dejó a -20ºC toda A. Navarro-Meléndez1 et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

la noche. Se centrifugó, se lavó la pastilla 2 veces con acetona con 0.1% de DTT y se dejo secar la pastilla, finalmente se resuspendió en un buffer de 7 M urea y 2 M tiourea. 2. Extracción con Fenol. Se siguió el protocolo reportado por Isaacson et al. (2006) con algunas modificaciones. A 200 mg de tejido congelado se agregaron 700 μl de Buffer de lisis (0.7 M Sacarosa; 0.1 M KCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM EDTA, 1% v/v del coctel de inhibidores de proteasas 25 × Complete y 2% v/v de β-mercaptoetanol y 1 ml de fenol saturado con Tris pH 8). Se agitó (700 rpm) a 4ºC por 15 min y se centrifugó a 12000 rpm por 25 min a 4°C. Se colectó la fase superior (fase fenólica) y se le adicionaron 1.5 ml de acetato de amonio 0.1 M en metanol y se dejó en reposo a -20ºC por 2 h para precipitar las proteínas. Se centrifugó por 20 min a 12000 rpm y se desechó el sobrenadante, se lavó la pastilla con 1 ml de metanol frío, centrifugando en cada lavado por 5 min a 12000 rpm a 4°C. Finalmente, se lavaron la pastillas con 1 ml de acetona al 80%, se centrifugó 5 min a 4°C, y se dejó secar a temperatura ambiente 3 min y enseguida se resuspendió en un buffer de 7 M urea y 2 M tiourea. 3. Método con Tris 40 mM. A 400 mg de tejido congelado se agregaron 800 μl de una solución de Tris 40 mM y 1% v/v del coctel de inhibidores de proteasas 25 × Complete. Se agitó (700 rpm) por 15 min y se centrifugó a 12000 rpm por 15 min a 4ºC. Al sobrenadante se le determinó la concentración de proteína con el método Bradford. Posteriormente, para limpiar el sobrenadante se utilizó el Kit 2-D Clean Up (Amersham Biosciences, NY, EUA) siguiendo el protocolo del proveedor y por último, se re suspendió la pastilla en un buffer de 7 M urea y 2 M tiourea. La determinación de concentración de proteína de los diferentes extractos se realizó por el método de Bradford empleando el Bio Rad Protein Assay Kit (Bio Rad, CA, EUA) siguiendo el protocolo para el micrométodo en placas de 96 pozos que marca el proveedor. ELECTROFORESIS DE DOS DIMENSIONES Las proteínas obtenidas de los diferentes protocolos anteriormente descritos, se resuspendieron en una solución de rehidratación 78

A. Navarro-Meléndez1 et al.

(7 M urea; 2 M tiourea; 0.2% de anfolitos; 4% CHAPS; 18 mM DTT). Se tomó una alícuota de cada muestra correspondiente a 600 μg de proteína y se cargaron en tiras de poliacrilamida de gradiente de pH inmovilizado de 18 cm (IPG, Immobiline DryStrip) de pH 3-10 (Amersham Biosciences, EUA). Las tiras fueron rehidratadas de forma pasiva durante 12 h a 22°C. El isoelectroenfoque (IEF) se realizó en el equipo IPGphor II (Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing Unit; Amersham), bajo el programa para proteínas solubles con el modo de incremento lineal de voltaje, para las tiras de 18 cm: (1) 250 V por 30 min, (2) 500 V por 1 h, (3) 1000 V por 1h, (4) 8000 V hasta alcanzar 90 000 Vh totales. Después del IEF, las tiras fueron inmediatamente equilibradas por 15 min con la solución de equilibrio I (50 mM Tris-HCl, pH 8.8; 6 M urea; 30% glicerol, 2% SDS; 1% DTT) y posteriormente con 5 ml de buffer de equilibrio II (50 mM Tris-HCl, pH 8.8; 6 M urea; 30% glicerol, 2% SDS; 2.5% iodoacetamida). Posteriormente para la electroforesis de segunda dimensión bajo el sistema SDS-PAGE, las tiras fueron colocadas en la parte superior de un gel al 12% de poliarcrilamida en la cámara vertical PROTEAN II XL Cell (Bio Rad). Los geles bidimensionales fueron teñidos con una solución del colorante PhastGel Blue R-350 al 0.1% (PlusOne Coomassie tablets, GE Healthcare Bio-Sciences). Para su análisis los geles teñidos fueron escaneados con el densitómetro Image Scanner II, (Amersham Biosciences) con un rango de 150 a 300 dpi en formato MEL y TIF. El análisis de imagen se realizó con el software MELANIE 2D Gel Analysis versión 7.0 (GeneBio, Geneva Bioinformatics, Suiza), siguiendo las indicaciones generales que marca el proveedor. Para análisis diferencial del proteoma de las hojas de amaranto bajo dos diferentes tratamientos, para cada respuesta de los tratamientos de herviboría y aplicación de MeJA fue necesario realizar tres réplicas de muestras procedentes de extracciones independientes. El análisis general de cada imagen consistió en la detección, y cuantificación de la expresión de cada mancha en cada gel; posteriormente se realizó el traslape (match) entre los geles de las respuestas a cada tratamiento, y con los datos generados, se procedió a identificar los cambios en los niveles de expresión de las proteínas.

Capítulo VI. Análisis proteómico del amaranto, sometido a herbivoría y evocadores de resistencia a insectos

Las proteínas seleccionadas se cortaron del gel y mandaron secuenciar a la unidad de Espectrometría de masas del CinvestavUnidad Irapuato. Para esto, las proteínas de interés fueron digeridas con tripsina, la mezcla de péptidos resultante fueron analizados por ESI-QTOF-MS/MS o por MALDI-TOF. Las secuencias fueron comparadas mediante BLAST en la base de datos del National Center for Biotecnology Information (Bethesda, EUA). La identificación de las proteínas secuenciadas por MALDI-TOF se realizó en la interface de MASCOT. También se realizaron búsquedas de secuencias de proteínas en Swissprot y Protein Data Bank (PDB) mediante el algoritmo blastp (Blast proteína-proteína). RESULTADOS Y DISCUSIÓN EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES DE HOJAS DE AMARANTO Se evaluaron tres protocolos de extracción de proteína, de los cuales se seleccionó el más adecuado tomando en consideración el patrón de bandeo y el rendimiento de proteína (Figura 1). Con los métodos de fenol y TCA/acetona, se obtuvo un bandeo claro e intenso, además de un mayor rendimiento de proteína para el método de fenol (4.15 ± 0.124 y 2.90 ± 0.422 mg de proteína/g de tejido fresco, respectivamente). Por su parte, el método de Tris presentó una menor

intensidad de bandeo lo cual correlacionó con los bajos rendimientos de proteína (0.15 ± 0.014 mg de proteína/g de tejido fresco). Para realizar la comparación de los perfiles proteómicos de los tratamientos de herbivoría y MeJA, se seleccionó el método de extracción con fenol. Este método ha sido de utilidad para la obtención de proteínas totales de tejidos vegetales recalcitrantes de Arabidopsis thaliana, tomate, arroz, plátano, mango, aguacate, etc., las cuales contienen un gran número de metabolitos como polifenoles, carbohidratos, pigmentos, lípidos, etc., que interfieren con la separación por electroforesis de dos dimensiones (Wang et al., 2003; Saravanan et al., 2004). ANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS PROTEÍNAS DE HOJAS DE AMARANTO SOMETIDAS A ESTRÉS POR HERBIVORÍA Y APLICACIÓN DE MeJA Para estudiar la respuesta de las plantas de amaranto a la herbivoría, se realizó el análisis proteómico de las hojas de amaranto bajo dos tratamientos diferentes: herbivoría y aplicación de MeJA (Figura 2A). En la Figura 2B se muestra la distribución de las proteínas en los tejidos tomadas en el tratamiento de herbivoría, en el cual se detectó un promedio 513 manchas, de las cuales 271 se comparten en las tres condiciones, y 28, 51 y 83 proteínas se acumularon en los hojas provenientes de plantas control, de la RL

Figura 1. Comparación del patrón de bandeo de proteínas de hoja de amaranto obtenidas de tres diferentes métodos de extracción fenol (F), TCA/acetona (TCA) y Tris 40 mM (Tris). A. Navarro-Meléndez1 et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

y de la RS, respectivamente. Del análisis de los geles derivados del tratamiento con MeJA, se detectaron 343 manchas, siendo 28 manchas exclusivas de los geles de hojas control y 58 de hojas tratadas con MeJA (Figura 2C). IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CON EXPRESIÓN DIFERENCIAL Todas las proteínas consideradas diferenciales estuvieron presentes en al menos dos geles y presentaron una razón de cambio ≥ 2 entre el tratamiento y el control con valor de P ≤ 0.05. Estos son los parámetros comúnmente reportados en otros estudios de proteómica comparativa (Giri et al., 2006; Dueckershoff et al., 2008). Para el tratamiento de herbivoría (Figura 3) las manchas 298, 299 y 433 se inducen en respuesta a herbivoría tanto en la RL como en la RS; las manchas 80 y 226 aumentan su expresión en la RL al daño por el insecto con una razón de cambio respecto al control de 3.46 y 2.08 respectivamente. Por el contrario, las manchas 145 y 151 aparecen sub-reguladas, con valores de 0.483 y 0.446, respectivamente. En (A) se muestran los mapas proteómicos representativos de cada tratamiento. En (B) y (C), se muestran diagramas de Venn con la distribución de proteínas detectadas los tratamientos de herbivoría, y MeJA, respectivamente.

Se eligieron 20 proteínas de ambos tratamientos para secuenciar por ESI-QTOFMS/MS o MALDI-TOF dando prioridad a aquellas proteínas que se inducen exclusivamente por el estímulo aplicado y aquellas que presentaron una fuerte expresión o represión con respecto al control. La identificación de algunas proteínas (Tablas 1 y 2) se realizó comparando las secuencias de los péptidos obtenidos por espectrometría de masas en bases de datos de proteínas disponibles. Las zonas amplificadas muestran algunas manchas de proteínas con diferentes cambios de expresión entre el control (C), la respuesta local (L) y la respuesta sistémica (S). De las proteínas inducidas involucradas en la fotosíntesis, se detectaron la mancha 512, que corresponde a la proteína A-B de unión a clorofila (CAB) en la respuesta sistémica al tratamiento de herbivoría, y la anhidrasa carbónica (AC), detectada en las manchas 342 y 298, inducida en respuesta local al tratamiento de herbivoría y MeJA, respectivamente (Tabla 1). La AC es una metaloenzima que en las plantas está involucrada en numerosos procesos biológicos, que incluyen la regulación del pH, transferencia de CO2, intercambio de iones, respiración, biosíntesis y fijación de CO2. Su patrón de expresión responde al estrés ambiental y está relacionado con la tolerancia al estrés salino

Figura 2. Comparación de los patrones de acumulación de proteínas de hojas de amaranto en respuesta al tratamiento de herbivoría y MeJA.

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Capítulo VI. Análisis proteómico del amaranto, sometido a herbivoría y evocadores de resistencia a insectos

Figura 3. Cambios en los patrones de expresión de proteínas en hojas de plantas de amaranto sometidas a herbivoría. Tabla 1. Identidad de proteínas diferenciales secuenciadas por ESI-QTOF-MS/MS.

Mancha No.

Masa (kDa)1

pI2

284

16.00

5.12

292

23.7/ 23.96

9.22

342 298

56.5/34.51

7.79

346

17.00

5.62

359

36.0/ 33.33

6.12

304

13.0/ 24.46

4.56

512

56.5/ 20.83

7.08

359

26.0/ 28.08

9.45

Péptidos secuenciados Tratamientos AELDGLNAWATFR TEVVDPLLNK AYAEAGPTGPLDWNVVEVK AVTVLPALAPSVTGV WGVAYADGPAGVFR WVVAFDTAAQK TQNSAYTEVR TSNPFGVNAGLAR FLVFACSDSR LSVEFSDQCVYAFAK FLVFAFNPR ETVEDPLLNK VALVVVTGDR YLEGSTLPTAK SLGQYTVVSVGK ALQESLASELAAR QTQLEVEAK DSQLAALSDSDLGVR ELVEELDEENGAR AFYLGVVGALAPAAGVGGK WLAYGELLDGR LALFVLTTLALNAR LLFPDVTDSAANR FTYLGELVGK

MeJA (I)3

MeJA (I) MeJA (I) y HRL(I)4 MeJA (I) y HRL(I) MeJA (I) y HRL(I)

HRS (I)5

HRS (I)

MeJA (R)6

1= Experimental/teórico, 2= Punto isoeléctrico experimental, 3= Metil jasmonato (Inducida), 4= Herbivoría, respuesta local (Inducida), 5= Herbivoría, respuesta sistémica (Inducida); 6= Metil jasmonato (Reprimida), 7= Biblioteca substractiva, tratamiento por herbivoría, 8= Identificación de en la base de datos de NCBI. A. Navarro-Meléndez1 et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología Tabla 2. Identidad de algunas proteínas diferenciales secuenciadas por MALDI-TOF.

Mancha No. 363

Puntaje en Cobertura de Masa MASCOT1 secuencia (kDa)2 136 81.8/ 88.54 21%

pI3 6.6

422

101

21%

56.3/ 55.4

5.0

363

107

23%

81.8/84.48

6.1

1= Puntaje >53 indica homología (P < 0:05), 2= Experimental/teórico, 3= Punto isoeléctrico teórico, 4= Herbivoría, respuesta local (Inducida), 5= Identificación de en la base de datos de NCBI. 6= Número de acceso de la base de datos SwissProt.

en plantas de arroz (Yu et al., 2007). También se encontró inducida en el tratamiento de herbivoría la mancha 359 (Tabla 1) identificada como la subunidad γ de la ATP sintasa cloroplástica. El reconocimiento de herbivoría en ciertas las plantas, como el garbanzo, se puede dar mediante la percepción de ciertos péptidos, llamados inceptinas, que son el producto de la degradación proteolítica de la subunidad γ de la ATP sintasa del cloroplasto, que tiene lugar en el tracto digestivo del insecto agresor. De esta forma, se observó que las inceptinas, presentes en las secreciones orales de las larvas de Spodoptera frugiperda que se alimentaban de plantas de Vigna unguiculata, fueron capaces de promover la producción de fitohormonas relacionadas con defensa, como etileno, AJ y AS así como la liberación de compuestos volátiles que se sabe son parte de las defensas indirectas de las plantas (Schmelz et al., 2006; 2007). La Amarandina-1 se encontró dentro de las proteínas reprimidas en el tratamiento con MeJA. Esta es una proteína RIP (de ribosome inactivating protein) con actividad antiviral y de N-glucosidasa, la cual rompe el enlace N-glucosídico de la adenina presente en secuencias específicas de RNA ribosomales (Kim et al., 1997). En hojas de Beta vulgaris L., se indujo la expresión de una proteína RIP (beetin) por virus y por aplicación exógena de AS y peróxido de hidrógeno (antagonistas de la ruta del AJ) (Iglesias, 2008). 82

A. Navarro-Meléndez1 et al.

Algunas proteínas no pudieron ser identificadas, debido a la falta de secuencias en las bases de datos disponibles. La mancha 284 no pudo ser identificada. Sin embargo, la proteína presentó homología con la secuencia traducida de una clona de la biblioteca de cDNA de hojas de amaranto generada en respuesta a herbivoría en nuestro laboratorio. La fuerte inducción de esta proteína por MeJA sugiere que podría desempeña una función importante en la regulación de la resistencia a insectos herbívoros dependiente de AJ. La caracterización del gen codificante de esta proteína de función desconocida está en progreso (MassangeSánchez, 2011; ver capítulo V). CONCLUSIONES El método basado en el uso de fenol fue el más eficiente para la extracción de proteínas de hojas de amaranto. Además, mostró una disminución de moléculas contaminantes propias del tejido utilizado. Los patrones de acumulación de proteínas fueron menores en plantas tratadas con MeJA que en las sujetas a herbivoría por insectos masticadores. Este dato refleja diferencias en la respuesta de las hojas de amaranto al estímulo aplicado. La diferencia podría explicarse por la gran variedad de compuestos capaces de inducir o reprimir respuestas de defensa en plantas, que se encuentran en las secreciones orales y/o saliva de los insectos herbívoros (Walling, 2000). Un aspecto interesante fue la fuerte inducción de la proteína 284 presente solo en el tratamiento con

Capítulo VI. Análisis proteómico del amaranto, sometido a herbivoría y evocadores de resistencia a insectos

MeJA, la cual mostró homología con la clona jjdfahbpa001_d08 proveniente de una biblioteca de cDNA de amaranto sometido a diferentes tipos de estrés, incluida la herbivoría por insectos. Este trabajo deja abiertas nuevas preguntas acerca de la función en amaranto de las proteínas no identificadas, así como la comprobación de la participación de algunas otras proteínas, como la subunidad γ de la ATPasa, la metionina sintasa, etc. en las respuestas de defensa contra herbívoros. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó gracias al apoyo brindado por la Unión Europea (Proyecto AMARANTH: FUTURE-FOOD, Contrato No. 032263), México Tierra de Amaranto A.C. y la Fundación Deborah Presser-Velder. Agradecemos el apoyo económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACyT por la beca otorgada a ANM (No. 203157). También se reconoce la atinada asesoría técnica prestada por la Dra. Silvia Valdés-Rodríguez y por el préstamo del equipo de proteómica, y a la M. C. Alicia Chagolla, por el trabajo de secuenciación de proteínas. BIBLIOGRAFÍA Agrawal G K, M Yonekura, Y Iwahashi, H Iwahashi, R Rakwal (2005) System, trends and perspectives of proteomics in dicot plants Part I: technologies in proteome establishment. Journal of Chromatography B 815: 109-123. Barba de la Rosa A P, A Barba-Montoya., P Martínez-Cuevas, B Hernández-Ledesma, M F León-Galván, A De León-Rodríguez, C González (2010) Tryptic amaranth glutelin digests induce endothelial nitric oxide production through inhibition of ACE: antihypertensive role of amaranth peptides. Nitric Oxide-Biology and Chemistry 23: 106–111. Carpentier S C, E Witters, K Laukens, P Deckers, R Swennen, B Panis (2005) Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: an evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics 5: 2497-2507.

Casati P, X Zhang, A L Burlingame, V Walbot (2005) Analysis of leaf proteome after UV-B irradiation in maize lines differing in sensitivity. Molecular and Cell Proteomics. 11: 1673-1685. Délano-Frier J P, N Martínez-Gallardo, O Martínez-de la Vega, M Salas-Araiza, E R Barbosa-Jaramillo, A Torres, P Vargas, A Borodanenko (2004) The effect of exogenous jasmonic acid on induced resistance and productivity in amaranth (Amaranthus hypochondriacus) is influenced by environmental conditions. Journal of Chemical Ecology 30: 1001-1034. Dueckershoff K, S Mueller, M J Mueller, J Reinders (2008) Impact of cyclopentenoneoxylipins on the proteome of Arabidopsis thaliana. Biochiquimica et Biophysica Acta 1784: 1975-1985. Fan R, H Wang, Y Wang, D Yu (2012) Proteomic analysis of soybean defense response induced by cotton worm (Prodenia litura, fabricius) feeding.Proteome Science 10: 16. Giri A P, H Wünsche, S Mitra, J A Zavala, A Muco, A Svatoš, I T Baldwin (2006) Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuata. VII. Changes in the plant’s proteome. Plant Physiology 142: 1621-1641. Heil M (2008) Indirect defence via tritrophic interactions. New Phytologist 178: 41-61. Howe G A (2004) Jasmonates as signals in the wound response. Plant Growth Regulation 23: 223-237. Iglesias R, Y Perez, L Citores, J M Ferreras, E Mendez, T Girbes (2008) Elicitor dependent expression of the ribosome-inactivating protein beetin is developmentally regulated. Journal of Experimental Botany 59: 1215-1223.

A. Navarro-Meléndez1 et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

Isaacson T, C M Damasceno, R S Saravanan, Y He, C Catalá, M Saladié, J K Rose (2006) Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nature Protocols 1: 769-774. Kessler A, I T Baldwin (2001) Defensive function of herbivore-induced plant volatile emissions in nature. Science 2001, 291: 21412144. Kim Y, S Park, S Oh, C Chung, J Cho (1997) EMBL/GenBank/DDBJ databases. Kumho Life & Environmental Science Laboratory, 572 Sangamdong Kwangsanku, Kwangju 506-712, Korea. Martirosyan D M, L A Miroshnichenko, S N Kulakova,A V Pogojeva, V I Zoloedov (2007) Amaranth oil application for coronary heart disease and hypertension. Lipids in Health and Disease 6: 1-12. Massange-Sánchez J (2011) Análisis de la expresión y caracterización molecular del gen Ah24 inducido por daño mecánico, herbivoría y adición exógena de MeJA en plantas de Amaranthus hypochondriacus. Tesis de Maestría. Departamento de Biotecnología y Bioquímica Cinvestav-Unidad Irapuato, Irapuato, Gto., México. Reymond P, E E Farmer (1998) Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression. Current Opinion in Plant Biology 1: 404-411. Sánchez-Hernández C, A GuerreroRangel, S Valdés-Rodríguez, J Délano-Frier (2004) Trypsin and α-amilase inhibitors are differentially induced in leaves of amaranth (A.hypochondriacus) in response to biotic and abiotic stress. Physiologia Plantarum 122: 254264. Saravanan S R, J C Rose (2004) A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics 4: 2522-2532. 84

A. Navarro-Meléndez1 et al.

Schmelz E A, M J Carroll, S LeClere, S M Phipps, J Meredith, P S Chourey, H T Alborn, P E Teal (2006) Fragments of ATP synthase mediate plant perception of insect attack. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 8894-8899. Schmelz E A, S LeClere, M J Carroll, H T Alborn, P E Teal (2007) Cowpea chloroplastic ATP synthase is the source of multiple plant defense elicitors during insect herbivory. Plant Physiology 144: 793-805. Silva-Sánchez C, A P Barba de la Rosa, M F León-Galván, B O de Lumen, A De LeónRodríguez, E González de Mejía (2008) Bioactive peptides in amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seed. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56: 1233-1240. Valdés-Rodríguez S, M Segura-Nieto, A Chagolla-López,Y Verver, A Vargas-Cortina, N Martínez-Gallardo, A Blanco-Labra (1993) Purification, characterization and complete amino acid sequence of a trypsin inhibitor from amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seeds. Plant Physiology 103: 1407-1412. Walling L L (2000) The myriad plant responses to herbivores. Journal of Plant Growth Regulation 19: 195-216. Wang W, M Scali, R Vignani, A Spadafora, E Sensi, S Mazzuca, M Cresta (2003) Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf, a plant tissue containing high levels of interfering compounds. Electrophoresis 24: 2369-2375. Yu S, X Zhang, Q Guan, T Takano, S Liu (2007) Expression of a carbonic anhydrase gene is induced by environmental stresses in Rice (Oryza sativa L.). Biotechnology Letters 29: 8994.

Capítulo VII

Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus L. en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros MOLECULAR AND BIOCHEMICAL RESPONSES ELICITED IN Amaranthus cruentus L. IN RESPONSE TO DEFOLIATION BY HERBIVORE INSECTS

Paula A. Castrillón-Arbeláez1 y John P. Délano-Frier1§ 1Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas (Cinvestav-Irapuato), Km 9.6 del Libramiento Norte Carretera Irapuato-León. Apartado Postal 629, C.P. 36821, Irapuato, Gto., México §Autor de correspondencia: [email protected] Teléfono: (52) 462 39636 ó 462 39600 FAX: (52) 462 45996 ó 462 39611

RESUMEN Las plantas de amaranto son especies que tienen la capacidad de crecer en suelos pobres y bajo condiciones poco favorables. Presentan una notable capacidad de desarrollarse bajo ambientes salinos no aptos para otros cultivos, como cereales, con una baja disponibilidad hídrica y una alta intensidad luminosa. Se ha reportado, también, que algunas especies de Amaranthus spp. soportan altas tasas de infestación por insectos herbívoros en condiciones de campo con diferentes efectos sobre la productividad. De modo que, además de sus características nutricionales, se ha observado que el amaranto de grano es una especie tolerante a la herbivoría. En especies como el tabaco o álamo, se ha encontrado el daño mecánico seguido de la aplicación de saliva de insectos herbívoros, o simplemente de ácido jasmónico, una hormona que regula las respuestas a daño, los niveles de las enzimas responsables de hidrolizar la sacarosa incrementan (e. g. sacarosa sintasas e invertasas) la distribución de carbohidratos desde las hojas hacia los tallos y raíces. El almacenamiento de carbohidratos almacenados en estos tejidos, podrá ser usado para la futura producción de metabolitos o proteínas de defensa, o para

la regeneración del tejido dañado y/o para la reproducción. Se postula que en amaranto la tolerancia a la defoliación, puede estar relacionada con un mecanismo similar, en el cual las reservas de carbono son rápidamente movilizadas ya sea a tejidos de almacenamiento para uso posterior, o para ser empleadas en la rápida regeneración de tejidos dañados que caracteriza al amaranto. Por esta razón, en este trabajo surge el interés por estudiar algunos genes representativos del metabolismo de carbohidratos para tener un mejor entendimiento de los mecanismos bioquímicos y moleculares de la tolerancia a la defoliación en ésta especie. Parte de los resultados obtenidos hasta el momento se describirán en este capítulo. Palabras clave: amaranto, defoliación, herbivoría, carbohidratos, movilización, tolerancia. ABSTRACT Grain amaranths are hardy plants with the ability to grow in poor soils under unfavorable environmental conditions, surviving low water availability, high light intensity and relatively extreme temperatures. Vegetable and grain 85-97

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Amaranthus species have been also reported to sustain high rates of infestation by herbivorous insects under field conditions, with different effects on productivity. In addition to their exceptional nutrimental qualities, grain amaranths are also considered as being tolerant to herbivory. In wild tobacco and poplar, it has been found that herbivory on the foliage or the application of jasmonic acid, a wound-response phytohormone, lead to the mobilization of carbon stores to less vulnerable tissues, mostly roots, to safeguard them for future re-growth, reproduction or even defense, when herbivory pressure has subsided. Sucrose cleaving enzymes, such as invertases and sucrose synthases are also activated, mostly to release hexoses to sustain the plant when photosynthesis levels are greatly reduced due to the loss of leaf area. Our group has postulated that tolerance to defoliation in amaranth is tightly associated with the capacity to mobilize C reserves from leaves to stems and roots and also to the ability to rapidly replenish depleted C reserves. For this reason, we analyzed several representative genes involved in carbohydrate metabolism in order to obtain a better understanding of the biochemical and molecular mechanisms underlying amaranth´s exceptional tolerance to defoliation, by insect herbivores or mechanical wounding. A description of part of the progress obtained in this line of research is described in this chapter. Key words: amaranth, defoliation, herbivory, carbohydrates, mobilization, tolerance. INTRODUCCIÓN El género Amaranthus comprende más de 70 especies. Pertenece a la familia Amaranthaceae que incluye el betabel, espinaca, Chenopodium spp. y muchas halófitas. La familia Amaranthaceae ha evolucionado en regiones cálidas, secas y con suelos salinos, lo que da como resultado adaptaciones anatómicas y fisiológicas especiales, como la presencia de tricomas que actúan como estructuras de secreción externa para eliminar las sales que se presentan en exceso en el suelo, cutícula gruesa, en algunas especies presencia de espinas y la fijación de carbono atmosférico mediante un mecanismo tipo C4. Es importante señalar que no existe una clara 86

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separación entre las especies de amaranto que se usan como verdura y las de grano, ya que las hojas tiernas de estas últimas (A. hypochondriacus y A. cruentus) se consumen como verdura. En México las especies más frecuentemente consumidas son: A. hybridus, A. retroflexus, A. dubius, A. fimbriatus, A. powelli, A. spinosus, A. blitoides, A. palmerii y A. watsonii. Las semillas de las especies empleadas para la producción de grano, tienen un alto contenido de proteínas de excelente calidad, razones que le confieren un gran potencial dentro de la industria alimenticia. En México, el cultivo del amaranto se concentra en el centro del país, pero la producción no es suficiente para la demanda creciente del grano (Délano-Frier et al., 2011; Espitia-Rangel et al., 2010). Las plantas de amaranto son especies que tienen la capacidad de crecer en suelos pobres y bajo circunstancias desfavorables. Presentan, además, una notable capacidad de desarrollarse bajo ambientes altamente salinos, con una baja disponibilidad de agua y una fuerte intensidad luminosa (Brenner et al., 2000; Johnson y Henderson, 2002; Omami et al., 2006). Se ha reportado que las especies de Amaranthus spp. tienen la capacidad de soportar altas tasas de infestación por insectos herbívoros en condiciones de campo con diferentes efectos en la productividad (Aragón-García et al., 2011; Délano-Frier et al., 2004; Grubben, 1976). Existen diversos reportes que indican que ciertas plagas de insectos pueden reducir la producción en amarantos de granos o incrementar el riesgo de infección por patógenos fúngicos en tallos y raíz si estos no son controlados apropiadamente (Aragón-García et al., 2011; Espitia-Rangel et al., 2010; Wilson, 1989; Wilson y Olson, 1990) y que la infestación por insectos puede ser deletérea bajo condiciones de sequía (DélanoFrier et al., 2004). La defoliación de amaranto por larvas de lepidópteros en estadios tempranos de desarrollo ha resultado en una reducción a largo plazo de tamaño y la producción; aunque experimentos realizados con daño mecánico indican que éstas especies pueden recuperarse completamente con pequeños o despreciables costos en su producción (Fomsgaard et al., 2010; Vargas-Ortiz, 2009; 2012). Además, la remoción o poda de alrededor de 10 a 40% de tejido vegetativo en plantas de amaranto de grano es

Capítulo VII. Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros.

practicado en algunas regiones de México para incrementar las ramificaciones secundarias y la productividad en biomasa e incluso semilla (Martínez-Moreno et al., 1999). Las plantas responden al daño, incluida la defoliación, con el despliegue de una gran cantidad de defensas directas e indirectas (Bruce y Pickett, 2007; Howe y Jander, 2008). Por ejemplo, las plantas pueden emplear dos estrategias: producción de defensas químicas o morfológicas para disuadir a los herbívoros (resistencia), y la movilización de reservas de almacenamiento para re-brotar y reproducirse después de la pérdida de tejido foliar (tolerancia). Dos características que podrían contribuir a incrementar la tolerancia son: el incremento en la tasa fotosintética en el tejido foliar remanente (fotosíntesis compensatoria), y una inversión mayor de las plantas en la biomasa radicular relativa a la biomasa foliar como se ha visto ocurre en A. hybridus (Gassmann, 2004; Karban y Myers, 1989) La sacarosa es el principal carbohidrato de transporte y para que éste sea utilizado como fuente de carbono y energía, requiere el rompimiento del enlace glucosídico, el cual puede ser catalizado por sacarosas sintasas e invertasas (Arnold et al., 2004; Koch, 2004; Tymowska-Lalanne y Kreis, 1998). Las sacarosas sintasas están muy relacionadas con los órganos consumidores y en presencia de uridina 5’ difosfato (UDP) hidrolizan reversiblemente la sacarosa a UDP-glucosa y fructosa. A su vez, la invertasa rompe la sacarosa produciendo de una manera irreversible glucosa y fructosa. Muchas isoformas de invertasas están presentes en la planta, y pueden ser clasificadas en dos principales grupos de acuerdo a su pH óptimo. Un grupo lo conforman las invertasas ácidas, las cuales usualmente existen en forma glicosilada y su pH óptimo es ácido. Éstas están asociadas con el crecimiento y desarrollo de los tejidos (Gonzalez et al., 2005; Roitsch et al., 1995; Roitsch y Gonzalez, 2004), son inducidas por heridas (Sturm y Chrispeels, 1990; Zhang et al., 1996), y tienen un rol importante en regular la relación órgano productor/consumidor y la descarga del floema (Roitsch et al., 1995). El segundo grupo lo conforman las invertasas alcalinas/neutras, que en contraste con las invertasas ácidas, no están glucosiladas y

muestran pH óptimos ligeramente alcalinos o neutros. Éstas han sido las menos estudiadas; en general, se han considerado como enzimas de mantenimiento, activas cuando la degradación de la sacarosa por parte de sacarosa sintasas o de las invertasas es baja, lo cual ocurre en órganos maduros (González y Cejudo, 2007). A partir del año 2008, a las invertasas neutras/alcalinas se les empezó a atribuir funciones importantes durante el desarrollo de la planta (Barratt et al., 2009; Jia et al., 2008; Welham et al., 2009). Hasta el momento los trabajos relacionados con defoliación en amaranto de grano se han enfatizado principalmente en un contexto fisiológico y ecológico. Aunque las investigaciones a nivel molecular, respecto a la caracterización de estas enzimas en especies de interés económico han venido en aumento, en el amaranto, una planta con un potencial agronómico que ha sido por muchos años subvalorada, este esfuerzo apenas comienza. Por tal razón, en este capítulo se describirá la caracterización de genes clave en el metabolismo de carbohidratos, como paso inicial para comprender algunos de los aspectos relacionados con la capacidad del amaranto de tolerar el daño por defoliación. Se postula que algunos de estos genes podrían desempeñar una función primordial en la redistribución de carbohidratos que ocurre en respuesta a la defoliación del amaranto por insectos o daño mecánico. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO Semillas de los dos genotipos empleados en este estudio, A. cruentus cultivar “Tarasca” y A. hypochondriacus cultivar “Revancha”, fueron donadas por Eduardo Espitia (INIFAP, México). Las semillas fueron germinadas como se describe en Délano-Frier et al. (2011). Las larvas de Spoladea recurvalis, una plaga común del amaranto y de algunas especies relacionadas, fueron criadas y mantenidas en una colonia establecida a partir de ejemplares colectados en los campos baldíos de los alrededores de Irapuato, Guanajuato, México. Las plántulas fueron subsecuentemente trasplantadas a bolsas plásticas de 14 L, conteniendo una mezcla de sustrato estéril, 21 días después de la germinación, para ser luego transportadas a un invernadero,un P. A. Castrillón-Arbeláez y J. P. Délano-Frier

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invernadero, donde fueron conducidos los experimentos. Las plántulas fueron fertilizadas una vez, una semana después del trasplante, con una solución 20:10:20 (N: P: K) según las indicaciones del fabricante (Peters Professional; Scotts-Sierra Horticultural Products, Marysville, OH, USA). Todos los experimentos de herbivoría se realizaron con plantas de A. cruentus de 30 días de edad bajo condiciones naturales de luz y temperatura. La elección de A. cruentus para los experimentos de defoliación se realizó sobre la base de su insensibilidad al fotoperiodo, característica que permitió realizar todos los ensayos de invernadero durante la mayor parte del año (Espitia-Rangel et al., 2010). La defoliación por herbivoría fue llevada a cabo durante cuatro días, empleando cuatro larvas por planta, resultando en una pérdida de tejido foliar de alrededor del 30%. Las muestras del tejido de hoja dañada (3 por planta), el tallo (segmentos de 15 cm, partiendo desde la base) y raíces fueron colectadas de tres plantas a los 0, 1, 5 y 30 días después del tratamiento. Los experimentos controles con plantas sin daño fueron realizados simultáneamente. El tejido de cada tres grupos de plantas fueron mezclados y congelados e nitrógeno líquido y almacenado a -80°C hasta su uso. Estas muestras fueron usadas para los análisis de carbohidratos no estructurales, y expresión génica. Cada experimento fue repetido tres veces. EXTRACCIÓN DE RNA TOTAL Y SÍNTESIS DEL cDNA El RNA total fue extraído a partir de 100-200 mg de tejido congelado empleando TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. Éstas consistieron de la adición de una solución salina (citrato de sodio 0.8 M + 1.2 M de cloruro de sodio) durante la precipitación en una proporción 1:1 v/v con isopropanol. Posteriormente, se llevó a cabo una purificación adicional con LiCl (8 M) por una hora a 4°C. Todas las muestras de RNA fueron analizadas por electroforesis en geles de agarosaformaldehido, confirmándose su integridad a través de las bandas ribosomales. Un total de 1 μg de RNA fue usado para la síntesis del cDNA empleando un oligo dT20 y 200 unidades de la transcriptasa reversa, SuperScript II (Invitrogen). 88

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AMPLIFICACIÓN DE LA SECUENCIA COMPLETA DEL cDNA Con el objetivo de amplificar de forma completa los cDNAs de AhSuS-1, AhSuS-2 (sacarosa sintasasas), AhAGPS-1 (subunidad pequeña de las ADP-glucosa pirofosforilasa), AhA/NI-1 y AhVI-1 (invertasas; alcalina/neutra o citosólica y vacuolar), 1 µg de RNA total de las muestras de hojas de plántulas de amaranto de grano fue empleado. Una alícuota de 2 µl fue usada como templado en todas las reacciones posteriores de PCR en presencia de 100 pM de cada uno de los oligonucleótidos específicos diseñados con base en las secuencias obtenidas en el transcriptoma de A. hypochondriacus. Los fragmentos obtenidos fueron clonados y secuenciados para confirmar la identidad del gen de interés. La amplificación de los extremos 5’ y 3’ de los cDNA es realizada con la técnica RACE (de Rapid Amplification of cDNA Ends) con el kit SMARTer™ RACE cDNA Amplification (Clontech, Laboratories, Mountain View, CA). SECUENCIACIÓN DEL DNA Y ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS El plásmido recombinante obtenido después de la clonación y posterior transformación de E. coli fue preparado y secuenciado. La secuenciación fue realizada como un servicio por el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (Langebio) y el Instituto de Biotecnología de la UNAM (IBT-UNAM, México). La edición de las secuencias fue hecha usando los programas FastPCR 6.0, AnnHyb 4.944 and Chromas-Lite 2.01. Las homologías de las secuencias fueron verificadas contra la base de datos del GenBank usando programas de BLAST. POSIBLE LOCALIZACIÓN SUBCELULAR La probable localización sub-celular de las proteínas fue realizada in silico siguiendo los programas, disponibles on-line: PSORT (psort. hgc.jp/form.html), SignalP (www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/), TargetP (www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/), Protein Prowler (pprowler. imb.uq.edu.au/) y MitoProt. (ihg.gsf.de/ihg/ mitoprot.html).

Capítulo VII. Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros.

DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE ALMIDÓN Y HEXOSAS Todos los tejidos (hojas, tallos, raíces y panojas) fueron colectadas al comienzo del período de oscuridad (6:30 p.m.) y congelados en nitrógeno líquido. La extracción se realizó a partir de 200 mg de tejido molido con 500 μl de etanol al 80% (v/v) e incubado a 4ºC por 10 min en agitación constante. Después de la centrifugación a 10,000 rpm (4ºC por 10 min), el sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo y concentrado por centrifugación (Heto Maxi Dry Lyo, HetoHolten, Denmark). El residuo fue re-disuelto en 500 µl de 100 mM buffer Hepes, pH 7.4, y 5 mM MgCl2, y usado para la determinación de azúcares solubles. El pellet derivado de la centrifugación se empleó para la determinación de almidón. Al final, éste fue homogenizado con 500 µl de 10 mM KOH e incubado a 99ºC por 2 horas. El contenido de sacarosa, glucosa,

fructosa y almidón fueron medidos usando métodos enzimáticos (Boehringer Mannheim/RBiopharm, Darmstadt, Germany). RESULTADOS Y DISCUSIÓN IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS GENES DE INTERÉS La información generada por el análisis de transcriptoma de Ah (Délano-Frier et al., 2011), proporcionó la base para el aislamiento y análisis detallado de los genes de amaranto de grano involucrados en el rompimiento, movilidad, degradación y síntesis de los carbohidratos solubles no estructurales. Un total de 31 genes fueron identificados como candidatos (Cuadro 1). El interés fue determinar cuales podrían ser clasificados como genes sensibles a estrés involucrados en la tolerancia a defoliación en amaranto de grano.

Cuadro 1. Genes involucrados en metabolismo de carbohidratos, identificados durante el análisis transcriptómico de A. hypochondriacus. No. Isoformas 4 7 14 1 2 1 3 1 7 13 7 8 1 8 5 3 7 1 1 1 2 10 5 1 1 4 7 1 2 1 1

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Con el objetivo de conocer el sitio de inicio y terminación de la síntesis de las proteínas, y además de esto, identificar las regiones UTR (regiones sin traducir) que le dan especificidad a cada uno de los genes se empleó la técnica RACE. DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA COMPLETA DE LOS cDNA DE LOS GENES DE SACAROSA SINTASA, AHSUSY-1 Y AHSUSY-2 Las sacarosa sintasas o SuSy (EC 2.4.1.13) catalizan el rompimiento de la sacarosa a UDPglucosa y fructosa. Aunque la sacarosa sintasa es encontrada en todos los órganos de la planta, es más abundante en los órganos consumidores. Ellas están principalmente involucradas en apoyar el crecimiento, proveer los requerimientos energéticos a la célula y asistir en funciones de almacenamiento creando sustratos para la síntesis de la pared celular, la respiración y la síntesis de almidón (Klotz y Haagenson, 2008; Koch, 2004). Las sacarosa sintasas conforman una pequeña familia multigénica en plantas, y, el amaranto de grano, no es la excepción. En el análisis transcriptómico se identificaron por lo menos 7 diferentes isoformas, las cuales, 5’ UTR

como en otras plantas estudiadas, pueden tener funciones específicas. En este trabajo fueron elegidas, AhSuSy-1 y AhSuSy-2, por presentar alta homología con isoformas encontradas en Beta vulgaris, las cuales, han sido caracterizadas como isoformas con una expresión tejido específica y con funciones importantes durante la respuestas a estrés por anoxia, frío y daño (Klotz y Haagenson, 2008). Las características del cDNAs y de la proteína codificada por los genes, AhSuSy-1 y AhSuSy-2, se encuentran señalados en la Figura 1. Las sacarosa sintasas han sido clasificadas en cuatro grupos de acuerdo a su estructura génica y los patrones de expresión (Komatsu et al., 2002). Con base en ésta clasificación, AhSuSy-1 y AhSuSy-2 fueron identificadas como miembros del grupo SUS-1 y SUS-A, respectivamente. El análisis in silico de las proteínas permite predecir que, además, de presentarse una localización citoplásmica de AhSuSy-1, existe la probabilidad de que AhSuSy-2 tenga un localización plastidial. Esto resulta interesante porque esta isoforma de sacarosa sintasa podría estar implicada en otros procesos diferentes de la degradación de sacarosa, como la regulación de flujos de solutos hacia los organelos durante una situación de estrés (Subbaiah et al., 2006).

REGIÓN CODIFICANTE (ORF)

ATG

3’ UTR TGA

PROTEÍNA

AhAGPS-1

• AhSuSy-1: ORF: 2412 pb; Proteína: 92.1 kDa y 811 aa • AhSuSy-2: ORF: 2436 pb; Proteína: 93.3 kDa y 803 aa AhSuSy-1 AhSuSy-2

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Sacarosa sintasas. Distribución de s acarosa entre órganos p roductores y c onsumidores; participa durante las respuesta a estrés por frío y anaerobiosis; y está involucrada en la síntesis celulosa y almidón.

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Capítulo VII. Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros.

AhIN/A-1 AhIN/A-2*

• AhIV-1: ORF: 1977 pb; Proteína: 73.8 kDa y 658 aa

AhIV-1

Invertasa vacuolar. Controla la composición azúcares en órganos de almacenamiento. Participa en procesos de osmoregulación y alargamiento celular y, está involucrada en respuestas a estrés por frío (Koch, 2004).

AhIP*

Figura 1. Características de los cDNAs y de las proteínas codificadas por los genes de amaranto de grano involucrados en el metabolismo de sacarosa y almidón. (ORF = marco de lectura abierta [del inglés, Open Reading Frame]; pb = pares de bases; aa = aminoácidos; * secuencias parciales).

DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA COMPLETA DE LOS CDNA DE LOS GENES DE INVERTASAS Las invertasas (EC 3.2.1.26, β-fructosidase, β-fructofuranosidase) catalizan la hidrólisis irreversible de la sacarosa a sus dos monómeros, glucosa y fructosa. Éstas cumplen diversas funciones en las plantas, incluyendo descarga del floema y distribución de carbohidratos, participan durante la diferenciación celular y desarrollo de la plantas y, tienen funciones específicas durante la respuesta a patógenos, heridas y/o diversos estímulos ambientales (Essmann et al., 2008; Roitsch y Gonzalez, 2004; Ruan et al., 2010). Estas enzimas están agrupadas en dos subfamilias: 1) las invertasas ácidas que incluyen las invertasas de pared celular (IP) y las invertasas vacuolares (IV) y, 2) las invertasas neutras/alcalinas (IN/A), las cuales se predice están localizadas en el citosol, mitocondria o plastidios.

Teniendo en cuenta la importancia de esta familia de enzimas en las respuestas de la planta a heridas, infecciones por patógenos y herbivoría por insectos, en este estudio de un total de 19 isoformas encontradas en el análisis transcriptómico (Délano-Frier et al., 2011), se obtuvo el cDNA completo de una IV (AhIV-1) y una IN/A (AhIN/A-1), junto con el cDNA parcial de una IP (AhIP) y una segunda IN/A (AhIN/A-2) (Figura 1). La selección de éstas isoformas se realizó teniendo en cuenta el resultado del análisis in silico del transcriptoma de amaranto (Délano-Frier et al., 2011) y, la similitud de algunas de las secuencias con ortólogos ya caracterizados como sensibles a diversos tipos de estrés biótico y/o abiótico. Los términos empleados como “pared celular”, “vacuolar”, y “citosólica” son usados para describir la localización de las invertasas. El análisis in silico predice que la isoforma IP, la cual presenta un dominio WECPDF es una proteína P. A. Castrillón-Arbeláez y J. P. Délano-Frier

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secretoria con un secuencia de 25 aminoácidos cuyos aminoácidos son predominantemente hidrófobicos y forman un péptido señal. Este péptido señal es requerido para la inserción hacia el retículo endoplasmático y la secreción a membrana. Por otro lado, el análisis de la isoforma AhIV-1, evidenció la presencia de una señal de anclaje a membrana, la cual, en otras especies de plantas, se ha pensado podría permitir un control más preciso del destino y actividad de la proteína (Rae et al., 2011). DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA COMPLETA DEL CDNA DEL GEN DE LA SUBUNIDAD PEQUEÑA DE LA ADP-GLUCOSA PIROFOSFORILASA (AHAGPS-1) La ADP-glucosa pirofosforilasa plastidial (AGP) cataliza la conversión de Glucosa-1-fosfato y ATP a pirofosfato inorgánico y ADP-glucosa, el sustrato para la almidón sintasa, y es una enzima regulatoria clave de la biosíntesis de almidón. La AGP está compuesta de una subunidad grande y una subunidad pequeña que son codificadas por diferentes genes. La proteína activa es un tetrámero de 2 subunidades pequeñas y 2 subunidades grandes. En amaranto hemos identificado el gen que codifica para la subunidad pequeña (AhAGPS-1, ver Tabla 1) y 3 secuencias parciales para las subunidades grandes (AhAGPL1, L2, and L3). Además de la sacarosa sintasa e invertasas, el análisis de la AGP es de interés en este estudio considerando que la redistribución de carbohidratos en respuesta a la defoliación involucra cambios drásticos en la movilización y acumulación de carbohidratos, incluido el almidón (Chen et al., 2009; Schwachtje et al., 2006). IDENTIFICACIÓN DE OTROS GENES PROBABLEMENTE RELACIONADOS CON LA TOLERANCIA DEL AMARANTO DE GRANO A LA PÉRDIDA DE TEJIDO FOLIAR Aunque en un principio en este proyecto sólo se pretendía identificar y relacionar los genes descritos anteriormente con la tolerancia del amaranto a la herbivoría, la obtención del transcriptoma brindó la posibilidad de ampliar el espectro de búsqueda. Es decir, se pudo 92

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identificar otros genes relacionados con la síntesis, movilidad, degradación y señalización de carbohidratos que estarían influenciando las respuestas de tolerancia del amaranto al daño ocasionado por insectos masticadores. Dentro de este grupo de genes se puede citar algunos relacionados con la síntesis de almidón. En él se identificaron un total de 6 clases de almidón sintasas (AhSSI-VI). En este estudio se determinará la expresión de dos isoformas pertenecientes a la clase III y IV, ya que, tanto la SSIII como SSIV tienen un rol clave en la acumulación de almidón en Arabidopsis (Ezquer et al., 2010). La almidón sintasa unida al gránulo (AhGBSSI), enzima responsable de la síntesis de amilosa en muchas especies de planta, se encuentra representada en el transcriptoma por dos isoformas; la isoforma elegida para su futuro estudio se encuentra inducida en el análisis in silico realizado en A. hypochondriacus (DélanoFrier et al., 2011). Para estudiar la movilización de carbohidratos se identificaron de las 5 isoformas del transportador anti portador de glucosa-6-fosfato/fosfato inorgánico (AhG6PT), responsable de proporcionar glucosa-6-fosfato (G6P) desde el citosol a los plastidios no fotosintéticos para la síntesis de almidón y ácidos grasos; la isoforma elegida además de encontrarse inducida en el análisis transcriptómico, presenta una alta homología (80%) con su ortólogo de papa, el cual es sobre-expresado por emisión de volátiles de Alternaria alternata (Ezquer et al., 2010). Otro transportador interesante que resultó fuertemente inducido por diferentes tipos de estrés (Délano-Frier et al., 2011), es el intercambiador de fosfoenolpiruvato/ fosfato inorgánico (AhPPT). Éste acarrea el fosfoenolpiruvato (PEP) desde el citosol hacia el cloroplasto y plastidios de tejidos no fotosintéticos, para la biosíntesis de ácidos grasos y otros metabolitos. Un tercer gen, el transportador de sacarosa (AhSUT1) fue elegido por su inducción tanto por herbivoría como por estrés hídrico y salino (Délano-Frier et al., 2011). El tercer grupo incluye un gen encargado de la degradación de almidón (AhBMY1), β-amilasa, el cual llega estar inducido hasta dos veces por el tratamiento de herbivoría descrito en el trabajo realizado por Délano-Frier et al. (2011). Como gen de señalización, se trabajará con una posible proteína cinasa del tipo serina/

Capítulo VII. Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros.

treonina, AhSnRK1, encargada de regular la expresión de genes y el metabolismo en respuesta a disponibilidad de carbono (Halford y Hardie, 1998; Tiessen et al., 2003). ANÁLISIS DE EXPRESIÓN Y NIVELES DE CARBOHIDRATOS Con el objetivo de confirmar que los genes seleccionados son parte de la respuesta de tolerancia a la defoliación en A. cruentus, se inició el análisis de expresión génica por medio de PCR semi-cuantitativo para posteriormente llevar a cabo un PCR de confirmación por tiempo real. Considerando además, que las proteínas pueden sufrir modificaciones post transduccionales, será necesario determinar las actividades enzimáticas tanto de las invertasas como de las sacarosas sintasas. De igual forma, será indispensable conocer los niveles de carbohidratos no estructurales para de esta forma confirmar una posible redistribución de carbohidratos como un efecto del ataque del herbívoro. Estos análisis están en proceso y sólo se presentarán en este capítulo los avances más representativos. En un experimento realizado durante el otoño del año 2009 en plantas de 30 días de edad de A. cruentus se observó que existe una inducción de los transcritos de AhAGPS, AhSuSy-2 y AhIV-1 por la acción del herbívoro masticador, S. recurvalis (Figura 2). Además de observarse un incremento en la expresión del transcrito, AhAGPS, a los 5 y 30 días después de haber transcurrido el daño (dpd), también es evidente una

represión a tiempos más tempranos (0.5 y 1 dpd); indicándonos probablemente que la planta en lugar de sintetizar almidón de forma temprana, está produciendo hexosas adicionales para aumentar la producción de compuestos defensivos o para exportarlas hacia otros tejidos como fuente de energía para los procesos de recuperación a la defoliación, como el rebrote de follaje. Esta propuesta coincide con en el incremento de expresión de AhIV-1 a un 1 y 5 dpd. Las otras isoformas de invertasas analizadas no cambian su expresión ni por desarrollo ni en respuesta al daño. Otro candidato interesante a formar parte de las respuestas defensivas en amaranto es la sacarosa sintasa 2, AhSuSy-2. Esta isoforma se ve inducida por herbivoría a los 30 dpd (figura 2), posiblemente proporcionando la glucosa extra para la acumulación de carbohidratos. Estos resultados nos llevan a postular que una de las formas de tolerancia en amaranto podría ser la acumulación transitoria de almidón en tejidos de reserva menos vulnerables, como se observa en tallos de plantas sometidas a herbivoría (Figura 3). Este proceso podría estar mediado por la acción conjunta de la invertasa vacuolar y la sacarosa sintasa 2. Para confirmar la posible acumulación transitoria de almidón como mecanismo de tolerancia será necesario concluir la evaluación de todos los parámetros mencionados anteriormente, incluidos los análisis enzimáticos y los niveles de azúcares como glucosa, fructosa y sacarosa.

Figura 2. Análisis de expresión realizado en tallo por PCR semi-cuantitativo. C, control; H, herbivoría; dpd, días posteriores a la defoliación. Actina es empleado como control de carga.

P. A. Castrillón-Arbeláez y J. P. Délano-Frier

93

Amaranto: Ciencia y Tecnología

CONCLUSIONES El análisis transcriptómico ha sido una herramienta útil para el entendimiento de muchos de los mecanismos involucrados en respuestas de defensa y tolerancia en amaranto. Gracias a esta información, se ha podido

de grano, que según ha quedado demostrado por una abundante evidencia experimental, es sumamente eficiente (ver capítulo VIII).

10

Control

umol/gPF

Hervivoría

*

8 6 4 2 0

0.5

30

dpd

Figura 3. Niveles de almidón detectados en tallo de plantas de A. cruentus después de diferentes post herbivoría con larvas de S. recurvalis. * P < 0.001

identificar toda una gama de genes interesantes que probablemente están participando dentro del mecanismo de tolerancia a la pérdida de tejido foliar. Tomando en consideración que las respuestas de defensiva/tolerancia son procesos multigénicos y bioquímicos complejos, con los datos obtenidos hasta ahora no ha sido posible aclarar la estrategia de tolerancia del amaranto. Sin embargo, la inducción de AhIV-1 y de SuSy2, junto a la acumulación de almidón en tallo observada en los experimentos aquí reportados, nos ha dado un indicio de que, en efecto, estos genes están involucrados en el proceso de tolerancia a la defoliación en A. cruentus, el cual podría basarse en la acumulación transitoria de reservas de C en tejidos no expuestos al insecto, como tallo (Figura 3) y raíz (CastrillónArbeláez P, resultados no mostrados). El análisis de expresión del resto de los genes propuestos anteriormente, así como datos bioquímicos sobre la cambios en actividad enzimática de proteínas sucrolíticas y en los niveles de carbohidratos no estructurales nos darán una idea más clara del proceso de tolerancia a la defoliación en amaranto 94

P. A. Castrillón-Arbeláez y J. P. Délano-Frier

AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó gracias al apoyo brindado por la Unión Europea (Proyecto AMARANTH: FUTURE-FOOD, Contrato No. 032263), México Tierra de Amaranto A.C. y la Fundación Deborah Presser-Velder. Se agradece también al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico otorgado a PACA para la realización de este proyecto (Beca No. 228820). BIBLIOGRAFÍA Aragón-García A, M A D Huato, M H Lara, F Sáenz-de-Cabezón, I Pérez-Moreno, V Marco-Mancebón, J F López-Olguín (2011) Insect occurrence and losses due to phytophagous species in the amaranth Amaranthus hypocondriacus L. crop in Puebla, Mexico. African Journal of Agricultural Research 6: 5924-5929.

Capítulo VII. Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros.

Arnold T, H Appel, V Patel, E Stocum, A Kavalier, J Schultz (2004) Carbohydrate translocation determines the phenolic content of Populus foliage: a test of the sink-source model of plant defense. New Phytologist 164: 157-164. Barratt D H, P Derbyshire, K Findlay, M Pike, N Wellner, J Lunn, R Feil, C Simpson, A J Maule, A M Smith (2009) Normal growth of Arabidopsis requires cytosolic invertase but not sucrose synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106: 13124-13129. Brenner D, Baltensperger D, Kulakow P, Lehmann J, Myers R, Slabbert M, S B (2000) Genetic resources and breeding of Amaranthus. Plant Breeding Reviews 19: 227-285. Bruce T J, J A Pickett (2007) Plant defence signalling induced by biotic attacks. Current Opinion in Plant Biology 10: 387-392. Chen S, X Q Li, A Zhao, L Wang, X Li, Q Shi, M Chen, J Guo, J Zhang, D Qi, G Liu (2009) Genes and pathways induced in early response to defoliation in rice seedlings. Current Issues in Molecular Biology 11: 81-100. Délano-Frier J P, H Avilés-Arnaut, K Casarrubias-Castillo, G Casique-Arroyo, P A Castrillón-Arbeláez, L Herrera-Estrella, J Massange-Sánchez, N A Martínez-Gallardo, F I Parra-Cota, E Vargas-Ortiz, M G EstradaHernández (2011) Transcriptomic analysis of grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) using 454 pyrosequencing: comparison with A. tuberculatus, expression profiling in stems and in response to biotic and abiotic stress. BMC Genomics 12: 363. Délano-Frier J P, N A Martínez-Gallardo, O Martínez-de la Verga, M D Salas-Araiza, E R Barbosa-Jaramillo, A Torres, P Vargas, A Borodanenko (2004) The effect of exogenous jasmonic acid on induced resistance and productivity in amaranth (Amaranthus hypochondriacus) is influenced by environmental conditions. Journal of Chemical Ecology 30: 1001-1034.

Espitia-Rangel E, C Mapes-Sánchez, D Escobedo-López, M de la O-Olán, P RivasValencia, G Martínez-Trejo, L CortésEspinosa, J M Hernández-Casillas (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de amaranto en México, SINAREFI-INIFAPUNAM, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. Essmann J, I Schmitz-Thom, H Schon, S Sonnewald, E Weis, J Scharte (2008) RNA interference-mediated repression of cell wall invertase impairs defense in source leaves of tobacco. Plant Physiology 147: 1288-1299. Ezquer I, J Li, M Ovecka, E Baroja-Fernandez, F J Munoz, M Montero, J Diaz de Cerio, M Hidalgo, M T Sesma, A Bahaji, E Etxeberria, J Pozueta-Romero (2010) Microbial volatile emissions promote accumulation of exceptionally high levels of starch in leaves in mono- and dicotyledonous plants. Plant & Cell Physiology 51: 1674-1693. Fomsgaard I, M Añon, A Barba de la Rosa, C Christophersen, K Dusek, J Délano- Frier, J Espinoza Pérez, A Fonseca, D Janovská, P Kudsk, R Labouriau, M Lacayo-Romero, N Martínez, F Matus, K Matusová, S Mathiassen, E Noellemeyer, H Pedersen, H Stavelikova, S Steffensen, R de Troiani, A Taberner (2010) Adding Value to Holy Grain: Providing the Key Tools for the Exploitation of Amaranth – the Protein-rich Grain of the Aztecs. Results from a Joint European - Latin American Research Project. Department of Integrated Pest Management, Aarhus University, Faculty of Agricultural Sciences, Denmark. Gassmann A J (2004) Effect of photosynthetic efficiency and water availability on tolerance of leaf removal in Amaranthus hybridus. Journal of Ecology 92: 882-892. González M-C, F J Cejudo (2007) Gibberellinregulated expression of neutral and vacuolar invertase genes in petioles of sugar beet plants. Plant Science 172: 839-846.

P. A. Castrillón-Arbeláez y J. P. Délano-Frier

95

Amaranto: Ciencia y Tecnología

González M C, T Roitsch, F J Cejudo (2005) Circadian and developmental regulation of vacuolar invertase expression in petioles of sugar beet plants. Planta 222: 386-395. Grubben G J H (1976) The cultivation of amaranth as a tropical leaf vegetable with special reference to South Dahomey. Department of Agricultural Research, Royal Tropical Institute, Amsterdam. Halford N G, D G Hardie (1998) SNF1related protein kinases: global regulators of carbon metabolism in plants? Plant Molecular Biology 37: 735-748. Howe G A, G Jander (2008) Plant immunity to insect herbivores. Annual Review of Plant Biology 59: 41-66. Jia L, B Zhang, C Mao, J Li, Y Wu, P Wu, Z Wu (2008) OsCYT-INV1 for alkaline/neutral invertase is involved in root cell development and reproductivity in rice (Oryza sativa L.). Planta 228: 51-59. Johnson B L, T L Henderson (2002) Water use patterns of grain amaranth in the northern Great Plains. Agronomy Journal 94: 1437-1443. Karban R, J H Myers (1989) Induced plantresponses to herbivory. Annual Review of Ecology and Systematics 20: 331-348. Klotz K L, D M Haagenson (2008) Wounding, anoxia and cold induce sugarbeet sucrose synthase transcriptional changes that are unrelated to protein expression and activity. Journal of Plant Physiology 165: 423-434. Koch K (2004) Sucrose metabolism: regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development. Current Opinion in Plant Biology 7: 235-246. Komatsu A, T Moriguchi, K Koyama, M Omura, T Akihama (2002) Analysis of sucrose synthase genes in citrus suggests different roles and phylogenetic relationships. Journal of Experimental Botany 53: 61-71. 96

P. A. Castrillón-Arbeláez y J. P. Délano-Frier

Martínez-Moreno D, J Nuñez-Farfán, T Terrazas, L D Muiz, A Trinidad-Santos, C Trejo, A Larque-Saavedra (1999) Plastic responses to clipping in two species of Amaranthus from the Sierra Norte de Puebla, Mexico. Genetic Resources and Crop Evolution 46: 225-234. Müller-Rober B, G Nast, L Willmitzer (1995) Isolation and expression analysis of cDNA clones encoding a small and a large subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase from sugar beet. Plant Molecular Biology 27: 191-197. Omami E N, P S Hammes, P J Robbertse (2006) Differences in salinity tolerance for growth and water-use efficiency in some amaranth (Amaranthus spp.) genotypes. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 34: 11-22. Rae A L, R E Casu, J M Perroux, M A Jackson, C P L Grof (2011) A soluble acid invertase is directed to the vacuole by a signal anchor mechanism. Journal of Plant Physiology 168: 983-989. Roitsch T, M Bittner, D E Godt (1995) Induction of apoplastic invertase of Chenopodium rubrum by D-glucose and a glucose analog and tissue-specific expression suggest a role in sinksource regulation. Plant Physiology 108: 285294. Roitsch T, M C Gonzalez (2004) Function and regulation of plant invertases: sweet sensations. Trends in Plant Science 9: 606-613. Ruan Y L, Y Jin, Y J Yang, G J Li, J S Boyer (2010) Sugar input, metabolism, and signaling mediated by invertase: roles in development, yield potential, and response to drought and heat. Molecular Plant 3: 942-955. Schwachtje J, P E H Minchin, S Jahnke, J T van Dongen, U Schittko, I T Baldwin (2006) SNF1-related kinases allow plants to tolerate herbivory by allocating carbon to roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 12935-12940.

Capítulo VII. Respuestas moleculares y bioquímicas inducidas en Amaranthus cruentus en respuesta a la defoliación por insectos herbívoros.

Sturm A, M J Chrispeels (1990) cDNA cloning of carrot extracellular beta-fructosidase and Its expression in response to wounding and bacterial-infection. The Plant Cell 2: 11071119. Subbaiah C C, A Palaniappan, K Duncan, D M Rhoads, S C Huber, M M Sachs (2006) Mitochondrial localization and putative signaling function of sucrose synthase in maize. Journal of Biological Chemistry 281: 1562515635.

Wilson R L, D L Olson (1990) Tarnished plant bug, Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) (Hemiptera, Miridae) oviposition site preference on three growth stages of a grain amaranth, Amaranthus cruentus L. Journal of the Kansas Entomological Society 63: 88-91. Zhang L, N S Cohn, J P Mitchell (1996) Induction of a pea cell-wall invertase gene by wounding and its localized expression in phloem. Plant Physiology 112: 1111-1117.

Tiessen A, K Prescha, A Branscheid, N Palacios, R McKibbin, N G Halford, P Geigenberger (2003) Evidence that SNF1related kinase and hexokinase are involved in separate sugar-signalling pathways modulating post-translational redox activation of ADPglucose pyrophosphorylase in potato tubers. The Plant Journal 35: 490-500. Tymowska-Lalanne Z, M Kreis (1998) The plant invertases: physiology, biochemistry and molecular biology. Advances in Botanical Research 28 28: 71-117. Vargas-Ortiz E (2009) Estudio de la redistribución de carbohidratos y nitrógeno como posible mecanismo de tolerancia a pérdida de tejido foliar por herbivoría y/o daño mecánico en amaranto. Tesis de Maestría. Cinvestav-Unidad Irapuato, Departamento de Biotecnología y Bioquímica. Irapuato, Gto., México. 81 p. Welham T, J Pike, I Horst, E Flemetakis, P Katinakis, T Kaneko, S Sato, S Tabata, J Perry, M Parniske, T L Wang (2009) A cytosolic invertase is required for normal growth and cell development in the model legume, Lotus japonicus. Journal of Experimental Botany 60: 3353-3365. Wilson R L (1989) Studies of insects feeding on grain amaranth in the Midwest. Journal of the Kansas Entomological Society 62: 440-448.

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Capítulo VIII

La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus L. induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia DEFOLIATION BY HERBIVORY AND MECHANICAL DAMAGE TRIGGERS SIMULTANEOUS RESISTANCE AND TOLERANCE RESPONSES IN Amaranthus cruentus L.

Erandi Vargas-Ortiz1, Axel Tiessen1, John Délano-Frier1§ 1Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas (Cinvestav- Irapuato), Km 9.6 del Libramiento Norte Carretera Irapuato-León. Apartado Postal 629, C.P. 36821, Irapuato, Gto., México §Autor de correspondencia: [email protected] Teléfono: (52) 462 39636 o 462 39600 FAX: (52) 462 45996 or 462 39611

RESUMEN El amaranto es una planta considerada tolerante a la herbivoría, aunque la evidencia al respecto es escasa. Datos experimentales indican que en amaranto se presentan respuestas tanto de tolerancia como de resistencia a la herbivoría, pero no hay información sobre los efectos de estas respuestas sobre la productividad. Con la finalidad de analizar estos efectos, se realizaron experimentos de defoliación causada tanto por herbivoría como por daño mecánico (H + D) en plantas de A. cruentus, en invernadero, durante dos años consecutivos. Se tomaron datos de rendimiento, altura, peso fresco aéreo y de raíz. Los efectos de los tratamientos sobre la calidad y viabilidad de semilla se analizaron determinando su composición y porcentaje de germinación. El tratamiento H + D afectó negativamente todos los parámetros medidos. Particularmente, el rendimiento de semilla disminuyó un 30% respecto a las plantas control, aunque no se encontraron diferencias en su composición. Durante estos experimentos se observaron características típicas de plantas tolerantes, como cambios en la arquitectura de la planta. En un experimento adicional realizado posteriormente, se analizaron los cambios inducidos a corto y

mediano plazo en los niveles de carbohidratos en hoja, tallo y raíz por en plantas sometidas a herbivoría. También se cuantificaron los niveles de expresión y de actividad de un inhibidor de tripsina tipo Kunitz, en hojas. La herbivoría, causó cambios significativos en los niveles de carbohidratos desde tiempos tempranos, principalmente en hoja, coincidiendo con la expresión y actividad de los inhibidores de tripsina. Los datos de sugieren que en A. cruentus se presentan tanto mecanismos de resistencia como de tolerancia a la herbivoría. Los primeros representan costos metabólicos que se reflejan en una menor producción de semilla y biomasa, mientras los segundos permiten a la planta generar semillas viables a pesar de los efectos negativos de la defoliación. Palabras clave: A. cruentus, daño mecánico, defoliación, herbivoría, resistencia, tolerancia. ABSTRACT Amaranth is considered to be an herbivorytolerant plant, but evidence to support this claim is scant. Previous experimental data suggest that grain amaranth uses both resistance and tolerance mechanisms to cope with herbivory, 99-111

Amaranto: Ciencia y Tecnología

but there are no studies showing the fitness penalties that this double mechanism might impose on the damaged plants. In order to gain a better understanding of this particular strategy, plants of A. cruentus were subjected to mechanical defoliation combined with herbivory. Experiments were done under greenhouse conditions during two consecutive years, in which yield, plant height, and root and shoot fresh weight data were collected. The effects of the treatments on seed quality and viability were assessed via germination assays and analysis of its composition. When mechanical damage was combined with herbivory, amaranth plants showed tolerance traits manifested as changes in plant architecture. In an additional experiment, short- and mid-term changes in sugars levels induced by insect herbivory alone were enzymatically assayed in leaf, stem and root. Also, the expression of a Kunitz inhibitor and total in vitro trypsin inhibitor activity were measured in leaves. Insect herbivory, rapidly modified carbohydrate composition, as changes were detected just a few hours after the beginning of the treatment, mainly in leaf tissue. These changes coincided with the kinetics of expression and activity of trypsin inhibitors. This data suggest that A. cruentus uses both resistance and tolerance mechanisms to cope with herbivory. The former could involve metabolic costs which were probably reflected in reduced biomass and seed yield, whereas the latter may help the plant to ensure reproductive success by producing viable seeds showing no alteration in their composition. Key words: A. cruentus, defoliation, herbivory, mechanical damage, resistance, tolerance. INTRODUCCIÓN Las plantas que están continuamente expuestas a los herbívoros han desarrollado toda una serie de estrategias para sobrevivir a la herbivoría. Una de estas estrategias es la resistencia inducida, en la cual la planta produce una variedad de compuestos de defensa que afectan al herbívoro ya sea de manera directa (e.g. toxinas, compuestos disuasivos, proteínas inhibitorias, etc.) o indirecta (e.g. compuestos volátiles 100

E.Vargas-Ortiz et al.

capaces de atraer a depredadores o parasitoides del insecto agresor) (Felton y Tumilson, 2008; Howe y Jander, 2008). Otra estrategia utilizada es la tolerancia, que se define como la habilidad que presenta la planta para disminuir los efectos negativos sobre su desarrollo y reproducción después de la herbivoría (Strauss y Agrawal, 1999). En general se considera que la tolerancia es una estrategia menos costosa para la planta, pues no invierte recursos en la producción de defensas (Stowe et al., 2000). Los mecanismos de tolerancia incluyen cambios fisiológicos como la activación de meristemos, modificación en la arquitectura de la planta, cambios en la actividad fotosintética y redistribución de reservas de carbono (C) y en ocasiones de nitrógeno (N), entre otros (Leimu y Koricheva, 2006; Schwachtje y Baldwin, 2008) El amaranto es una planta que se considera tolerante a la herbivoría, aunque hay pocos datos experimentales al respecto. En campo se ha observado que la defoliación mecánica de Amaranthus hypochondriacus incrementa la producción de semilla (Moreno et al., 1999). En A. cruentus y A. hypochondriacus se ha visto que defoliación del 50% en la etapa de floración no disminuye el rendimiento e incluso en algunas variedades lo mejora (Vargas-Ortiz E., datos no publicados) Estudios realizados con A. hybridus sugieren que la distribución de recursos a la raíz antes de la floración es el principal mecanismo por el que esta especie tolera la herbivoría (Gassman, 2004; Weaver y McWilliams, 1980). Sin embargo, también en A. hypochondriacus se han encontrado respuestas de defensa en condiciones de herbivoría y mediante la aplicación de jasmonatos (Délano-Frier et al., 2004; Sánchez-Hernández et al., 2004) Con base en la información anterior, se plantea que en amaranto ocurren mecanismos tanto de resistencia como de tolerancia, afectando de forma diferente la producción de semilla. Los objetivos de este estudio consistieron en identificar los mecanismos de resistencia y tolerancia a corto y mediano plazo en plantas de amaranto sometidas defoliación por herbivoría y por combinación de esta con daño mecánico. También, se analizó el efecto de dichas respuestas en la producción y composición de la semilla.

Capítulo VIII. La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus L. induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia

MATERIALES Y MÉTODOS

los parámetros fenológicos de seis plantas control y de seis plantas tratadas. Los datos tomados fueron altura, pesos frescos de la raíz, la parte aérea y cuando era correspondiente, de la inflorescencia. En la última fecha de muestreo se cortó la panoja y se dejó secar en condiciones de invernadero. Las semillas de cada panoja se separaron y se limpiaron para determinar el rendimiento. El experimento se repitió en el año 2008, con la misma temporalidad y con resultados similares.

MATERIAL BIOLÓGICO Para cada uno de los experimentos descritos más adelante, se utilizaron plantas de A. cruentus var. “Tarasca”. Las semillas se sembraron en charolas de germinación de 100 pozos en mezcla de germinación (pasta de coco: mezcla general en relación 1:1), las cuales se mantuvieron inicialmente en un cuarto de crecimiento con una humedad relativa del 75% y una temperatura de 26°C. A los 20 días de crecimiento las plántulas se trasplantaron a macetas de 18 L en mezcla general (tierra de hoja, limo, “Sunshine Mix 3”, vermiculita y perlita en relación 2:1:3:1:1).y se fertilizaron con 400 mL del fertilizante 20-1020 “Florida Special” (Scotts Company, EUA) siguiendo las especificaciones del fabricante. Las plantas se mantuvieron en un invernadero comercial (modelo baticenital, ACEA, México) en condiciones de temperatura de 10-35 °C (mínima nocturna y máxima diurna, respectivamente) y humedad relativa promedio de 55%, hasta el final de cada experimento. Para el experimento de daño mecánico y herbivoría las larvas utilizadas fueron Spodoptera ssp., Pholisora catullus, Spoladea recurvalis y Estigmene acrea colectadas en el campo experimental de amaranto establecido en Valencianita, Irapuato, Guanajuato, del año 2007 al 2009.

EXPERIMENTO DE HERBIVORÍA Plantas de 30 días fueron sometidas a herbivoría por S. recurvalis. Se permitió que tres larvas por planta se alimentaran por tres días (26 a 29 noviembre 2010). Durante este tiempo las plantas dañadas y control permanecieron cubiertas con mallas. Para revisar respuestas tempranas, se realizaron muestreos a las 3, 6, 12, 24 y 48 horas de haber colocado las larvas sobre las plantas. En estos tiempos las larvas se retiraron de la planta y se colectaron hojas dañadas, tallo y raíz de cinco plantas dañadas y cinco plantas control. Los tejidos se congelaron inmediatamente en N2 líquido y se mantuvieron a -80°C para su uso posterior. En el resto de las plantas las larvas se retiraron al tercer día y se realizaron tres muestreos más a los 2, 12 y 27 días de haber retirado las larvas y equivalentes a 5, 15 y 30 días después de iniciado el experimento.

EXPERIMENTO DE HERBIVORIA Y DAÑO MECÁNICO Plantas de 30 días fueron sometidas a herbivoría por larvas comunes al cultivo de amaranto (Spodoptera ssp, P. catullus, S. recurvalis y E. acrea). Se permitió que tres larvas por planta se alimentaran libremente durante tres días (28 a 30 agosto 2007). Las plantas se cubrieron con mallas para evitar que las larvas dañaran otras plantas. Durante este tiempo, las plantas control también estuvieron cubiertas con el mismo tipo de malla. Transcurridos los tres días, se retiraron las mallas y las larvas. Con un sacabocados se terminó de dañar la planta, hasta la eliminación de un tercio de área foliar total (30 de agosto de 2007). Los muestreos se realizaron a 1, 30, 60 y 110 días después de terminar el tratamiento de defoliación (31 de agosto, 29 de septiembre y 18 de diciembre 2007). En estas fechas se midieron

ANÁLISIS BIOQUÍMICO Actividad y expresión de inhibidores de tripsina La extracción y actividad de inhibidores de tripsina se realizó como se describe en Sánchez-Hernández et al. (2004), con algunas modificaciones. La extracción se realizó a partir de 50 mg de tejido liofilizado en 1ml de solución de extracción (50 mM Tris-HCl pH 7.8, 1.7 mM tiourea, 0.3 M KCl 4 mM ácido ascórbico y 7% PVP). El tejido re-suspendido se mantuvo en agitación 15 min a 1200 rpm y 4°C. Las muestras se centrifugaron a 13000 rpm, 15 min a 4°C, el sobrenadante se separó en un tubo nuevo y se mantuvo en hielo para su uso inmediato. La actividad de inhibidores de tripsina se realizó como se describe en Erlanger et al. (1961), utilizando N-α-benzoil-L-arginina-pnitroanilida (BApNA; Sigma-Aldrich Chemical) E.Vargas-Ortiz et al.

101

Amaranto: Ciencia y Tecnología

como sustrato y tripsina extraída de larvas de Prostephanus truncatus, un insecto coleóptero conocido como una de las plagas más severas de grano almacenado en ciertas regiones del mundo, incluyendo México. La técnica se adaptó a formato de microplaca. También se evaluó la expresión de un inhibidor de tripsina tipo Kunitz por ensayos tipo Northern blot. La sonda empleada para su detección por este método sonda se obtuvo de bibliotecas sustractivas de plantas sometidas a herbivoría por insectos masticadores (Fomsgaard et al., 2010). Determinación de azúcares solubles y almidón. La extracción de azúcares solubles (sacarosa, glucosa y fructosa) se realizó como se describe en Wright et al. (1998), con algunas modificaciones. Brevemente, 20 mg de muestra liofilizada se extrajeron en 50 mM Hepes KOH (pH 7.4); 5 mM MgCl2 en 80% etanol a 80°C. La extracción se repitió tres veces y al final se combinaron los extractos. Se tomó una alícuota del extracto final para la determinación enzimática de glucosa, fructosa y sacarosa en formato de microplaca de acuerdo a ÁngelesNuñez y Tiessen (2010). El almidón se determinó adaptando la metodología de Geingerbeger et al. (1998). De forma breve, la pastilla que quedó después de la extracción de azúcares se resuspendió en 0.5 ml 10 mM KOH y se llevó a autoclave (120°C y 1.5 atm) por 30 min. El almidón se hidrolizó con 10 unidades de α−amilasa (EC, 3.2.1.1; Tipo VI-B de páncreas porcino, Sigma) y 10 unidades de amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3; de Aspergillus niger, Sigma) en solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM pH 5.5, a 37°C durante toda la noche. La muestra se centrifugó a 4500 rpm por 5 min para recuperar el sobrenadante. La pastilla se hidrolizó nuevamente durante 30 min y se centrifugó. Ambos sobrenadantes se combinaron y se tomó una alícuota para la determinación enzimática de almidón, en forma de glucosa, en formato de microplaca. Determinación de metabolitos en semilla. Para determinar la calidad de la semilla producida se tomó el peso de 100 semillas por triplicado de cinco plantas de cada tratamiento. Estas mismas semillas se desinfectaron y 102

E.Vargas-Ortiz et al.

se germinaron en papel filtro estéril para determinar el porcentaje de germinación. Para la determinación de la composición de semilla, muestras de semilla de cada planta se molieron y la harina se utilizó para la determinación de almidón, proteína y lípidos totales. La determinación de almidón se realizó como se describe anteriormente, eliminando los azúcares solubles con una extracción etanólica. La extracción de lípidos se realizó vía hexano. Para ello, 500 mg de harina se extrajeron en 1 mL de hexano a 1000 rpm y 90°C por 10 min, usando un mezclador térmico. La muestra se centrifugó a 13200 rpm y se recuperó el sobrenadante en un vial previamente pesado. La extracción se realizó dos veces más con 0.75 mL de hexano, combinando al final los tres sobrenadantes. El hexano se evaporó y el vial se pesó nuevamente, para obtener la diferencia entre el vial vacío y con los lípidos recién extraídos. La cuantificación de proteína se realizó por la técnica de Bradford (Protein assay, Bio-Rad) de acuerdo a las especificaciones del fabricante, a partir de un extracto de proteína total de harina libre de lípidos, tal y como se describe en Silva-Sánchez et al. (2008). ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis de las diferencias entre tratamientos se realizó mediante ANOVA. En aquellos análisis donde el valor de F fue significativo a P ≤ 0.5 se aplicó la prueba de Tukey. El análisis se realizó con el programa R, versión 2.14.1 (R Development Core Team, 2011). RESULTADOS Y DISCUSIÓN EFECTO DE LA DEFOLIACIÓN SOBRE EL DESARROLLO DE LA PLANTA Los resultados muestran que se encontraron diferencias significativas en el rendimiento, altura de planta, peso fresco aéreo, de raíz y de panoja como efectos de la defoliación por herbivoría y daño mecánico (H+D). Como se observa en la Figura 1, la defoliación de ~30% por herbivoría en combinación con daño mecánico, provocó una disminución significativa en todos los parámetros medidos, especialmente en los pesos frescos de la parte aérea, la raíz y la panoja. Este efecto se mantiene durante todo el desarrollo de la planta y culmina con una reducción

Capítulo VIII. La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus L. induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia

significativa del 12% de altura de planta y 44, 46 y 40% del peso de tejido aéreo, raíz y panoja, respectivamente. Los efectos de la defoliación también se observaron en la fenología y arquitectura de Parte Aérea

350

100

***

**

300

Raíz

***

80

250

**

Peso fresco (g)

Peso fresco (g)

la planta. La emergencia de la panoja se retardó en las plantas tratadas con H+D. A los 30 días de tratamiento, todas las plantas control tenían una panoja con un peso promedio de 18 g, en contraste con las plantas tratadas, en las cuales

200 150

60 40

100 20

50 0

13

06

175

01

Panoja

13

06

150

*

150

0

Altura

100 75

110

*

*

125

Altura (cm)

Peso fresco (g)

0

10

100

** 50

50 25 0

* 13

06 Control

01

0

10

13

06 Control

H+D

01

10

H+D

Figura 1.Efecto de la defoliación causada por una combinación de herbivoría y daño mecánico sobre el crecimiento de A. cruentus. Se muestran los pesos frescos de la parte aérea (a), raíz (b) y panoja (c), así como la altura de las plantas (d). Cada barra representa el promedio de 12 plantas con su error estándar. * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001.

a)

b)

Control

H+D

c)

Figura 2. Comparación del desarrollo en plantas control y plantas defoliadas por herbivoría en combinación con daño mecánico (H+D). Se muestran plantas a 30 días post tratamiento (a) y 60 días post tratamiento (b y c). E.Vargas-Ortiz et al.

103

Amaranto: Ciencia y Tecnología

la panoja apenas emergía y su peso promedio fue de 6 g (Figura 2a). Además del retraso en el crecimiento de la panoja, también se observó ramificación en algunas de las plantas tratadas (Figura 2c). En estas plantas cada ramificación generó una panoja, posiblemente por pérdida de dominancia apical o como una respuesta de la planta para recuperar el área foliar perdida, en contraste con las plantas control, que generaron una panoja única (Figura 2b y 2c). La disminución de las características fisiológicas medidas como efecto del tratamiento es una consecuencia ampliamente observada en plantas que presentan resistencia a la herbivoría. Esta disminución del estado fisiológico óptimo de la planta se explica por el la inversión de recursos destinados a crecimiento a la producción de compuestos de defensa (Kessler y Baldwin, 2002; Kaplan et al., 2009). Sin embargo, en las plantas dañadas también se observaron efectos, que son comunes a plantas tolerantes a la herbivoría, como son la generación de ramificaciones y el retraso en la floración ocasionados por la respuesta de la planta a fin de recuperar el área foliar perdida, los brotes laterales producen hojas nuevas y evidentemente florecen y maduran más tarde; estos resultados concuerdan con los

EFECTO DE LA DEFOLIACIÓN SOBRE LA PRODUCCIÓN DE SEMILLA Una característica importante para considerar tolerante un genotipo, es el efecto que produce el daño sobre la producción de semillas y su viabilidad en comparación con plantas no dañadas (Stowe et al., 2000). En el presente estudio a pesar de la disminución en el peso fresco y seco de la panoja en ~46% por la defoliación, el decremento de la producción de semilla por planta fue sólo en ~30%. Como se muestra en el Cuadro 1, no se encontraron diferencias significativas en los niveles de almidón, proteína y lípidos en las semillas de plantas control y defoliadas. El porcentaje de germinación tampoco fue diferente entre semillas producidas en plantas controles y tratadas (77% ± 2.5 y 79% ± 2.5, control y tratada, respectivamente), por lo que se puede establecer que al menos en las condiciones de este experimento la calidad del grano se mantiene a pesar del daño por herviboría y defoliación. Puesto que la calidad y viabilidad de la semilla no fue modificada por la exposición al daño, se puede sugerir que el amaranto fue capaz de tolerar el daño por H+D impuesto en el experimento.

Cuadro 1. Producción, peso y composición de semillas. Se determinó la producción de semilla por planta, el peso de 100 semillas y los niveles de almidón, proteína y lípidos de plantas control y defoliadas (H+D). Los promedios se realizaron con una n = 12. Letras diferentes representan diferencia significativa a P ≤ 0.05.

Tratamiento Semilla / 100 Semillas planta (g) (mg) a Control 19.8 ± 2.2 79.4 ± 0.6a 13.6 ± 1.8 b 79.0 ± 2.5a H+D reportados anteriormente, donde se señala que el incremento de las tasa fotosintética después del daño, altas tasas de crecimiento para compensar la pérdida de área foliar, acumulación de reservas de C y la capacidad de movilizarlas después del daño, re-absorción de N y fósforo de hojas senescentes o dañadas e incremento en la eficiencia reproductiva a través de mayor rendimiento de semilla o número de frutos son algunas otras respuestas encontradas en plantas que presentan tolerancia hacia la herbivoría (Strauss y Agrawal, 1999; Délano- Frier et al., 2012).

104

E.Vargas-Ortiz et al.

Proteína Lípidos % % a 7.6 ± 3.8 a 12.9 ± 0.7 13.9 ± 0.3 a 6.7 ± 4 a En conjunto, los resultados obtenidos indican que si bien el tratamiento de H+D tuvo efectos negativos sobre las plantas de amaranto, la planta fue capaz de responder al tratamiento de tal manera que la pérdida en producción no fuera total y que la semilla producida presentara la misma calidad y viabilidad que la semilla generada por una planta sin daño. Por lo anterior, se sugiere que la respuesta observada puede estar dirigida por mecanismos de tolerancia tales como la activación de meristemos, observado en la generación de ramificaciones y hojas e inflorescencias nuevas, así como modificación en la distribución de nutrientes que permiten mantener la semilla viable.

Capítulo VIII. La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus L. induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia

REDISTRIBUCIÓN DE AZÚCARES EN RESPUESTA A LA HERBIVORÍA Con la finalidad de establecer si la herbivoría genera cambios en la distribución de carbohidratos en amaranto, se analizaron los niveles de los principales carbohidratos solubles (sacarosa, glucosa y fructosa) y almidón. Plantas de ~45 días fueron sometidas a herbivoría con tres larvas de S. recurvalis durante tres días. Se analizó tejido de hoja, raíz y tallo a diferentes tiempos tras colocar el herbívoro en la planta. Como se observa en las Figuras 3, 4 y 5, los niveles de almidón son los más altos en todos los tejidos analizados. Además de esto, en cada tejido varió la abundancia de azúcares solubles. En hoja y raíz principalmente se detectó sacarosa (Figura 3 y 5), mientras que en tallo el principal azúcar soluble fue glucosa (Figura 4). La herbivoría modificó la distribución de azúcares en varios tejidos de la planta, incluso a tiempos cortos. En hojas, se presentó una disminución en los niveles de hexosas principalmente de glucosa, a partir de las 6 hrs después del inicio de la herbivoría, y permaneció así hasta 48 hrs después. En los tiempos posteriores, cuando las larvas ya habían

sido retiradas de las planta, no se encontraron cambios en los niveles de glucosa (Figura 3a). De igual manera, la herbivoría disminuyó los niveles de almidón en hoja a las 6 y a las 12 hrs de iniciar la herbivoría. Al igual que en glucosa, no se detectaron cambios en los niveles de almidón después de haber retirado las larvas de la planta, excepto por la disminución observada 120 hrs después de iniciado el tratamiento (Figura 3d). Al igual que en hoja, en tallo los niveles de hexosas y almidón disminuyeron por la herbivoría, pero los cambios fueron observados después de tiempos más largos. Para glucosa los cambios fueron evidentes a 120 y 360 hrs después de haber iniciado la herbivoría; es decir, cuando las larvas ya no se encontraban en la planta (Figura 4a). Los niveles de fructosa disminuyeron al tiempo de retirar las larvas y se mantuvieron así hasta 360 hrs después del inicio de la herbivoría. Por su parte, los niveles de almidón presentaron una tendencia a aumentar después de una evidente disminución 48 hrs después de iniciado el tratamiento. Inclusive, al final de éste (720 hrs), los niveles de almidón resultaron ser significativamente más altos en tallos de plantas tratadas. Fructosa

30

Glucosa

40 35

25

µmol/gPS

µmol/gPS

30 25

**

20 15

*

10

*

*

15 10

*

36

12

24

48

1203

60

0

720

**

*

5

5 0

20

36

12

Sacarosa 70

*

40

360

720

60

720

500

300

20

200

10

100 12

Control

24

48

1203

Herbivoría

60

720

***

400

30

36

120

600

50

0

48

Almidón

700

µmol/gPS

µmol/gPS

60

24

0

*

*

36

12

24

Control

48

1203

Herbivoría

Figura 3. Cambios en los niveles de azúcares solubles y almidón en hojas de plantas defoliadas por insectos herbívoros. Se midieron los niveles de glucosa (a), fructosa (b), sacarosa (c) y almidón (d) en hojas de amaranto a tiempos tempranos (3 a 24 hrs después de iniciar la herbivoría) y mediano plazo (48 a 720 hrs después de iniciar la herbivoría) en plantas control y con herbivoría. Las barras representan el promedio de cinco plantas con error estándar. * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001.

E.Vargas-Ortiz et al.

105

Amaranto: Ciencia y Tecnología Glucosa

180 160

*

*

80

*

120

µmol/gPS

µmol/gPS

140

Fructosa

100

100 80

60

*

***

40

60 40

20

20 0

12

24

48

1203

60

0

7201

Sacarosa

100

44

81

20

3607

*

350 µmol/gPS

60 40

20

Almidón

400

80 µmol/gPS

22

300

*

250 200 150 100

20

50 0

12

24

48

Control

120

360

720

Herbivoría

0

12

24

48

Control

120

360

720

Herbivoría

Figura 4. Cambios en los niveles de azúcares solubles y almidón en tallos de plantas defoliadas por insectos herbívoros. Se midieron los niveles de glucosa (a), fructosa (b), sacarosa (c) y almidón (d) en tallos de amaranto a tiempos tempranos (3 a 24 hrs después de iniciar la herbivoría) y mediano plazo (48 a 720 hrs después de iniciar la herbivoría) en plantas control y con herbivoría. Las barras representan el promedio de cinco plantas con error estándar. * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001.

A diferencia del resto de los tejidos, en raíz sólo se modificaron los niveles de sacarosa, con tendencia a disminuir en plantas tratadas a partir de tiempos cortos, aunque la caída en sacarosa sólo resultó significativa a mediano plazo (Figura 5b). A su vez, los niveles de almidón presentaron tendencia similar hacia una disminución en sus niveles, aunque está fue más tardía y sólo alcanzó se hizo significativa hasta las 720 h (Figura 5d). Los cambios en los niveles de azúcares indican que en amaranto existe una importante reserva de C, en forma de almidón, en todos los tejidos de la planta, que ante estímulos determinados, como defoliación por herbivoría, es capaz de movilizarse para ser utilizada en procesos de recuperación de área foliar y de formación y mantenimiento de estructuras reproductivas. Esto constituiría un mecanismo clásico de tolerancia hacia la defoliación por insectos herbívoros. En general, la herbivoría por S. recurvalis en amaranto provocó la disminución de los niveles de azúcares, principalmente de hexosas. El tejido principalmente afectado fue la hoja, en donde los cambios se observaron desde tiempo tempranos (Figura 3). En álamo y tabaco silvestre se ha observado que los cambios 106

E.Vargas-Ortiz et al.

en los niveles de azúcares en hojas después de tiempos cortos pueden estar relacionados con una redistribución de éstos, no sólo para privar al herbívoro de nutrientes carbonados, sino para movilizarlos hacia tejidos menos vulnerables a un insecto folívoro, como tallo y raíz (Babst et al., 2005; Schwachtje et al., 2006). En contraste directo, se ha observado también que en álamo la herbivoría puede influir sobre el metabolismo primario y las reservas de C, desviándolos hacia la síntesis de compuestos de defensa, como compuestos fenólicos tóxicos para el insecto (Arnold et al., 2004). En comparación con el daño por herbivoría, la defoliación por daño mecánico de menos de 50% del tejido foliar no provocó modificación alguna en los niveles de azúcares en ninguno de los tejidos analizados (VargasOrtiz E, datos no publicados). Varios estudios han demostrado que la defoliación mecánica es en muchas ocasiones una imitación pobre de la pérdida de tejido foliar causada por insectos herbívoros, principalmente masticadores (Baldwin, 1990). Ésta modifica la expresión génica, la actividad enzimática y los niveles de metabolitos similares, de una manera que es propia de la herbivoría (Reymond et al., 2000). Esta diferencia fundamental se debe

Capítulo VIII. La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus L. induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia Glucosa 100

14 µmol/gPS

µmol/gPS

80 60 40

12 10 8 6 4

20 0

2 12

24

48

1203

60

7201

0

Sacarosa

250

4

48

1203

60

720

Almidón

*

250

*

150

µmol/gPS

µmol/gPS

22 300

200

*

100

200 150 100

50 0

Fructosa

16

50 12

24

48

Control

1203

60

720

Herbivoría

0

12

24

48

Control

120

360

720

Herbivoría

Figura 5. Cambios en los niveles de azúcares solubles y almidón en raíz de plantas defoliadas por insectos herbívoros. Se midieron los niveles de glucosa (a), fructosa (b), sacarosa (c) y almidón (d) en tallos de amaranto a tiempos tempranos (3 a 24 hrs después de iniciar la herbivoría) y mediano plazo (48 a 720 hrs después de iniciar la herbivoría) en plantas control y con herbivoría. Las barras representan el promedio de cinco plantas con error estándar. * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001

principalmente a los compuestos presentes en la saliva del herbívoro, aunque otros factores que se generan durante la interacción de éstos con la planta, como daño sobre la superficie al moverse, la deposición de heces u orina del y/o la dispersión de patógenos también podrían tener influencia sobre la respuesta (McCloud y Baldwin, 1997; Walling, 2000; Halitschke et al., 2003; Weech et al., 2008). Estas diferencias pueden ser la causa de que en hojas dañadas con D+H se afecten los niveles de azúcares desde tiempos tempranos y en muchas ocasiones, sólo durante el tiempo que la larva permanece en la planta. EXPRESIÓN Y ACTIVIDAD DE INHIBIDORES DE TRIPSINA Una de las respuestas más comunes de resistencia hacia la herbivoría por insectos masticadores es el incremento en la actividad e inhibidores de proteasas. Estas proteínas proveen una efectiva protección a la planta ya que tienen fuertes efectos negativos en la nutrición de varios insectos y otras plagas, como ácaros, con la consecuente disrupción de sus procesos normales de desarrollo (Habib y Fazili, 2007; Haq et al., 2004). En A. hypochondriacus se ha observado el

incremento de actividad inhibitoria mediante la aplicación de ácido jásmonico (Délano-Frier et al., 2004), metil-jasmonato y herbivoría (Sánchez-Hernández et al., 2004). Con la finalidad de analizar las respuestas de defensa hacia la herbivoría en amaranto, se midieron los niveles de expresión de un inhibidor de tripsina tipo Kunitz (Figura 6), así como la actividad total de inhibidores de tripsina en hojas (Figura 7). La expresión del inhibidor tipo Kunitz de amaranto, se analizó mediante un ensayo tipo Northern blot a partir de muestras hoja de las plantas sometidas a herbivoría por S. recurvalis durante tres días. Como se muestra en la Figura 6, la expresión del inhibidor se incrementó desde 6 hrs de iniciada la herbivoría, encontrando su máxima expresión a 120 hrs después de iniciar el tratamiento (dos días después de retirar las larvas de la planta). La actividad de inhibidores de tripsina se muestra en la Figura 7. Como se puede observar, la actividad se incrementó 6 horas después de iniciar el tratamiento y alcanzó su máximo 120 hrs después, dos días después de haber retirado a los herbívoros de la planta. Cabe hacer notar que la actividad inhibitoria de E.Vargas-Ortiz et al.

107

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Figura 6. Cambios en la expresión de inhibidores de tripsina tipo Kunitz en hojas de plantas defoliadas por insectos herbívoros. El ensayo de expresión tipo Northern blot se realizó a partir de muestras de hoja tomadas a diferentes tiempos después de iniciar la herbivoría (3 a 48 hrs) y después de retirar las larvas tras 3 días de herbivoría continua (120 y 360 hrs).

tripsina coincide con la expresión del inhibidor de tripsina tipo Kunitz. En plántulas de A. hypochondriacus se ha observado que la actividad inhibitoria de tripsina y α-amilasa incrementa con aplicación de metil jasmonato y con la exposición de las plantas a herbivoría con Tricoplusia ni, un insecto masticador. Sin embargo la actividad de estos inhibidores no aumentó mediante la aplicación de daño mecánico o herbivoría con Manduca sexta, otro insecto masticador (Sánchez-Hernández et al., 2004). Esto sugiere Actividad Inhibitoria de Tripsina

40

Actividad Inhibitoria de Tripsina

300

**

30

200

20

Ui /mgPS

Ui /mgPS

Además de las respuestas de defensa temprana y sus costos, se encontraron respuestas relacionadas con la tolerancia a la defoliación, como incremento de la ramificación y producción de semilla con la misma calidad y viabilidad que plantas sin daño (Figura 2 y Cuadro 1). Esto no es poco habitual, ya que hay evidencias experimentales que muestran que algunas especie de plantas tienen el potencial de expresar simultáneamente respuestas de resistencia y de tolerancia al ser dañadas por sus enemigos naturales (Rausher, 2001). Esto suele

100 10

* 0

3

61

2

Control

Herbivoría

24

48

120

Control

360

0

Herbivoría

Figura 7. Cambios en la actividad inhibitoria contra tripsina en hojas de plantas de amaranto sometidas a herbivoría por insectos masticadores. La Inhibición de tripsina de larvas de Prostephanus truncatus, o gran barrenador de los granos, se realizó con extractos de hoja de amaranto de plantas control y sometidas a herbivoría. La actividad se reporta como unidades de inhibición por miligramo de peso seco. Las barras representan el promedio de tres plantas con error estándar. Significancia para Prueba T, * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001

fuertemente que la inducción de actividad inhibitoria también es dependiente del tipo de herbívoro. En algunos cultivos se ha demostrado que la inducción de las respuestas de defensa representa un costo metabólico muy alto, el cual se ve reflejado en la disminución de muchos parámetros fisiológicos (Kaplan, 2009). En amaranto, la inducción de respuestas de defensa temprana como el incremento en la actividad de inhibidores de tripsina (Figura 7) podría estar incurriendo en costos metabólicos para la planta al utilizar C y N para su síntesis. Ésto explica en cierta manera que en el experimento de H+D ocurriera la pérdida de biomasa y productividad (Figura 1) y que se modificaran los niveles de hexosas en hoja (Figura 3), los cuales no se observaron cuando sólo se aplicó la defoliación mecánica. 108

E.Vargas-Ortiz et al.

ocurrir cuando los recursos disponibles para las respuestas de defensa son limitados, o bien, cuando ambas estrategias son fisiológicamente costosas (Leimu & Koricheva, 2006), tal y como sucedió en el presente estudio. En experimentos de defoliación total se ha observado una disminución de almidón de hasta del 70% con respecto a plantas control, a tan solo 24 hrs de terminar el tratamiento. Es muy probable que los altos niveles de este carbohidrato en todos los tejidos de la planta y su rápida movilización permitan que las plantas defoliadas no se vean afectadas en parámetros como altura o biomasa total, y que la producción y calidad de semilla sea la misma que la encontrada en las plantas control (VargasOrtiz E, datos no publicados).

Capítulo VIII. La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus L. induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia

CONCLUSIONES En amaranto, se presentan simultáneamente procesos tanto de resistencia como de tolerancia hacia la defoliación por daño mecánico y/ o herbivoría. Los procesos de resistencia se presentan desde tiempos cortos (i.e. en cuestión de horas) y muy posiblemente involucren costos metabólicos que se reflejan en la disminución de parámetros fisiológicos como biomasa total y producción de semilla. Sin embargo los procesos de tolerancia probablemente permitan compensar estos costos, al reducir el impacto sobre la productividad, lo que asegura que a pesar de que la producción de semilla sea menor, su calidad se mantenga inalterada para así asegurar su reproducción en generaciones posteriores. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó gracias al apoyo brindado por la Unión Europea (Proyecto AMARANTH: FUTURE-FOOD, Contrato No. 032263), México Tierra de Amaranto A.C. y la Fundación Deborah Presser-Velder. Agradecemos el apoyo económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnoogía, CONACyT con la beca otorgada a EVO (No. 205326). BIBLIOGRAFÍA Angeles-Nuñez J G, A Tiessen (2010) Arabidopsis sucrose synthase 2 and 3 modulate metabolic homeostasis and direct carbon towards starch synthesis in developing seeds. Planta 232: 701-718. Arnold T, H Appel, V Patel, E Stocum, A Kavalier, J Schultz (2004) Carbohydrate translocation determines the phenolic content of Populus foliage: A test of the sink-source model of plant defense. New Phytologist 164: 157-164. Babst B A, R A Ferrieri, D W Gray, M Lerdau, D J Schlyer, M Schueller, M R Thorpe, C M Orians (2005) Jasmonic acid induces rapid changes in carbon transport and partitioning in populus. New Phytologist 167: 63-72 Baldwin I T (1990) Herbivory simulations in ecological research. Trends in Ecology and Evolution 5: 91-93.

Erlanger B, N Kokowsky, W Cohen (1961) The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Archives of Biochemistry and Biophysics. 95: 271-278. Délano-Frier J P, N A Martínez-Gallardo, O Martínez-de la Vega, M de Salas-Araiza, E R Barbosa-Jaramillo, A Torres, P Vargas A Borodanenko (2004) The effect of exogenous jasmonic acid on induced resistance and productivity in amaranth (Amaranthus Hypochondriacus) is influenced by environmental conditions. Journal of Chemical Ecology. 30: 1001-1034. Délano Frier J P, C V Sánchez Hernández, A Tiessen (2012) Friend or foe? Exploring the factors that determine the difference between positive and negative effects on photosynthesis in response to insect herbivory: In: Artificial Photosynthesis. M M Najafpour (ed). InTech, Croacia. pp: 155-206. Fomsgaard I, M Añon, A Barba de la Rosa, C Christophersen, K Dusek, J Délano- Frier J, J Espinoza Pérez, A Fonseca, D Janovská, P Kudsk, R Labouriau, M Lacayo-Romero, N Martínez, F Matus, K Matusová, S Mathiassen, E Noellemeyer, H Pedersen, H Stavelikova, S Steffensen, R de Troiani, A Taberner (2010) Adding Value to Holy Grain: Providing the Key Tools for the Exploitation of Amaranth – the Protein-rich Grain of the Aztecs. In: Results from a Joint European - Latin American Research Project. Denmark: Department of Integrated Pest Management, Aarhus University, Faculty of Agricultural Sciences. Gassman A (2004) Effect of photosynthetic efficiency and water availability on tolerance of leaf removal in Amaranthus hybridus. Journal of Ecology 92: 882-892. Geigenberger P, M Hajirezaei, M Geiger, U Deiting, U Sonnewald, M Stitt (1998) Overexpression of pyrophosphatase leads to increased sucrose degradation and starch synthesis, increased activities of enzymes for sucrose-starch interconversions, and increased levels of nucleotides in growing potato tubers. Planta 205: 428-437. E.Vargas-Ortiz et al.

109

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Habib H, K M Fazili (2007) Plant protease inhibitors: a defense strategy in plants. Biotechnology and Molecular Biology Review 2: 068-085. Haq S K, S M Atif, R H Khan (2004) Protein proteinase inhibitor genes in combat against insects, pests, and pathogens: natural and engineered phytoprotection. Archives of Biochemistry and Biophysics 431: 145-159. Halitschke R, K Gase , D Q Hui, D D Schmidt, I T Baldwin (2003) Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuata. VI. Microarray analysis reveals that most herbivore-specific transcriptional changes are mediated by fatty acid-amino acid conjugates. Plant Physiology 131: 1894-1902. Howe G, G Jander (2008) Plant immunity to insect herbivores. Annual Review of Plant Biology 59: 41-66. Kaplan I, G P Dively, R F Denno (2009) The costs of anti-herbivore defense traits in agricultural crop plants: a case study involving leaf-hoppers and trichomes. Ecological Applications 19: 864-872. Kessler A, I T Baldwin (2002) Plant responses to insect herbivory: the emerging molecular analysis. Annual Review of Plant Biology 53: 299-328. Leimu R, J Koricheva (2006). A meta-analysis of tradeoffs between plant tolerance and resistance to herbivores: combining the evidence from ecological and agricultural studies Oikos 112: 1-9. McCloud E S, I T Baldwin (1997) Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the woundinduced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta 203: 430435.

110

E.Vargas-Ortiz et al.

Moreno D M, J Nuñez-Farfán, T Terrazas, P L del Mar Ruiz, A Trinidad-Santos, L C Trejo, A Larque-Saavedra (1999) Plastic responses to clipping in two species of Amaranthus from the Sierra Norte de Puebla, Mexico. Genetic Resources and Crop Evolution 46: 225-234. R Development Core Team (2011) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-90005107-0, URL http://www.R-project.org/. Rausher M D (2001) Co evolution and plant resistance to natural enemies. Nature 411: 857864. Reymond P, H Weber, M Damond, E E Farmer (2000) Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. The Plant Cell 12: 707-719. Sánchez-Hernández C, N Martínez-Gallardo, A Guerrero-Rangel, S Valdés-Rodríguez, J Délano-Frier (2004) Trypsin and α-amylase inhibitors are differentially induced in leaves of amaranth (Amaranthus hypochondriacus) in response to biotic and abiotic stress. Physiologia Plantarum 122: 254-264. Schwachtje J, I T Baldwin (2008) Why does herbivore attack reconfigure primary metabolism? Plant Physiology 146: 845-851. Schwachtje J, P E H Minchin, S Jahnke, J T van Dongen, U Schittko, I T Baldwin (2006) Snf1-related kinases allow plants to tolerate herbivory by allocating carbon to roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 12935-12940. Strauss S Y, A A Agrawal (1999) The ecology and evolution of plant tolerance to herbivory. Tree 14: 179-185. Stowe K A, R J Marquis, C G Hochwender, E L Simms (2000) The evolutionary ecology of tolerance to consumer damage. Annual Review of Ecology and Systematics 31: 565-595.

Capítulo VIII. La defoliación por daño mecánico y herbivoría en Amaranthus cruentus L. induce simultáneamente respuestas de tolerancia y resistencia

Walling L L (2000) The myriad plant responses to herbivores. Journal of Plant Growth & Regulation 19: 195-216. Weaver S E, E L McWilliams (1980) The biology of Canadian weeds. 44. Amaranthus retroflexus l., A. powellii s. Wats. and A. hybridus l. Canadian Journal of Plant Science 60: 12151234. Weech M H, M Chapleau, L Pan, I de C, J C Bede (2008) Caterpillar saliva interferes with induced Arabidopsis thaliana defence responses via the systemic acquired resistance pathway. Journal of Experimental Botany 59: 2437-2448. Wrigth D P, D J Read, J D Scholes (1998) Mycorrhizal sink strength influences whole plant carbon balance of Trifolium repens L. Plant Cell & Environment 21: 881-891.

E.Vargas-Ortiz et al.

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Capítulo IX

Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano USE OF PLANT GROWTH PROMOTING RHIZOBACTERIA TO INCREASE PRODUCTIVITY OF GRAIN AMARANTH

Fannie Isela Parra Cota1 y John Paul Délano Frier1§ 1Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato) Km 9.6 del Libramiento Norte Carretera Irapuato-León. Apartado Postal 629, C.P. 36821, Irapuato, Gto., México. §Autor de correspondencia: [email protected] Teléfono: (52) 462 39636 o 462 39600 FAX: (52) 462 45996 or 462 39611

RESUMEN El género Amaranthus comprende aproximadamente 70 especies con una amplia variabilidad genética entre éstas. Dichas especies se pueden cultivar para la producción de grano, como verdura o forraje, aunque también pueden ser malezas agresivas. Las tres principales especies cultivadas para la producción de grano son Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus cruentus y Amaranthus caudatus. Una de las características más importantes del amaranto es, sin duda, su alto valor nutritivo. Tanto la hoja como el grano poseen una interesante composición química y un valor nutricional superior comparado con otros granos. Desafortunadamente, el rendimiento de grano es relativamente bajo, con una producción promedio de 1 a 3 ton/ha, lo cual está relacionado con la falta de recursos para un apropiado manejo agronómico. Un factor adicional es la escasa información respecto a la presencia y control de plagas y enfermedades, las cuales pueden causar grandes pérdidas económicas a los productores de amaranto. Por tal motivo, es necesario encontrar soluciones de producción adecuadas. Una alternativa que proponemos es el uso de bacterias promotoras del crecimiento

vegetal (BPCV) que al crecer en asociación con las plantas estimulan su crecimiento y pueden ayudar al control de enfermedades y plagas. Se están realizando investigaciones para el uso de rizobacterias, no sólo para promover su crecimiento, sino también para el biocontrol de enfermedades en especies de amaranto productoras de grano. En el presente capítulo se describen las características generales de las BPCV, las investigaciones de su aplicación en amarantáceas y por último, el posible uso de la información generada por el transcriptoma de novo de A. hypochondriacus para entender las bases moleculares de la interacción BPCVamaranto. Palabras clave: Biocontrol, bioinoculantes, biofertilizantes, Burkholderia, transcriptoma. ABSTRACT The genus Amaranthus includes about 70 species with a wide genetic variability among them. These species can be cultivated for the production of grain, vegetables and forage, but can also be aggressive weeds. The three main cultivated species for grain production are A. hypochondriacus, A. cruentus and A. caudatus. 113-127

Amaranto: Ciencia y Tecnología

One of the most important characteristics of amaranth is undoubtedly the high nutritional value of its leaves and seeds. They both have an interesting chemical composition and the seeds have a higher nutritional value compared with other grains. But, unfortunately, the grain yield is relatively low, with an average production from 1 to 3 ton/ha. This is related to the lack of resources for proper agricultural management as well as to the limited information regarding the presence and control pests and diseases. These can eventually cause great economic losses to amaranth producers. For this reason, it is necessary to find suitable production solutions. A proposed alternative is the use of plant growth promoting bacteria (PGPB) that by growing in association with plants can stimulate growth and help control diseases and pests. Research is presently conducted on the use of PGPB not only for growth promotion but also for biological control of disease-producing pathogens of amaranth grain. In this chapter, we will describe the general information regarding PGPB, the work we have done to explore its application in grain amaranth and the way the wealth of information generated by the de novo transcriptome of A. hypochondriacus will be used to understand the molecular basis of the interaction PGPB-amaranth. Key words: Biocontrol, Burkholderia, Plant growth promoting rhizobacteria, transcriptome. INTRODUCCIÓN El amaranto es una planta dicotiledónea que pertenece a la familia Amaranthaceae y al género Amaranthus que comprende aproximadamente 70 especies, existiendo una amplia variabilidad genética entre éstas. Dichas especies se pueden cultivar tanto para la producción de grano de alto valor nutritivo como de forraje, o pueden también crecer como malezas agresivas (Brenner et al., 2000). Las tres principales especies que son cultivadas para la producción de grano son A. hypochondriacus, originario de México, A. cruentus, originario de Guatemala y el sureste de México y A. caudatus, cuyo origen es América del Sur (Brenner et al., 2000; Paredes et al., 1990). Una de las características más importantes del amaranto es, sin duda, su alto 114

F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

valor nutritivo. Las hojas poseen una buena textura, sabor y calidad nutricional (contiene altos valores de calcio, hierro, fósforo y magnesio, así como ácido ascórbico, niacina, vitamina A y fibra). A su vez, la semilla tiene una interesante composición química y un valor nutrimental superior comparado con otros granos (Paredes et al., 1990; Paredes, 1994). Al igual que los cereales, contiene altas cantidades de almidón, representando del 50 al 60% de su peso seco. El contenido de lípidos va de 7 a 8%, de los cuales el escualeno, que es un potente antioxidante y fortalecedor del sistema inmune, es un componente abundante. El alto porcentaje de proteínas (14-19%) es uno de los atractivos del grano de amaranto, ya que es superior al de la mayoría de los cereales comerciales. Además, el 14-18% de las proteínas en las semillas corresponden a globulinas (principalmente 11S) ricas en lisina y aminoácidos azufrados (Paredes, 1994), los cuales son esenciales para una óptima nutrición. Por otro parte, los rendimientos de grano son relativamente bajos, con una producción promedio que oscila entre 1 a 3 ton/ha, lo cual está relacionado con la falta de recursos para un manejo agronómico óptimo así como con la escasa información que se tiene respecto a la presencia, identificación, biología, daños y control de plagas y enfermedades que afectan al cultivo. Las plagas y/o enfermedades pueden llegar a causar grandes pérdidas económicas. Por tal motivo, es necesario encontrar soluciones de producción adecuadas. Las nuevas tecnologías deben estar orientadas a mantener la sostenibilidad del sistema agrícola mediante explotación racional de los recursos naturales y la aplicación de medidas adecuadas para preservar el ambiente (Shankar Singh et al., 2011). Una de estas tecnologías es la aplicación de biofertilizantes, los cuales presentan beneficios como su capacidad de fijar N2, supresión de enfermedades, solubilización y aporte de nutrimentos, producción de compuestos activos como vitaminas y reguladores del crecimiento así como descomposición de contaminantes. (AllTaweil et al., 2009; Pooja et al., 2007). Dentro de la gran variedad de fertilizantes microbianos estudiados, las bacterias promotoras del crecimiento vegetal, BPCV (también conocidas como PGPR, del

Capítulo IX. Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano

inglés Plant Growth Promoting Rhizobacteria), representan una amplia variedad de bacterias no patógenas del suelo, las cuales cuando crecen en asociación con las plantas estimulan su crecimiento (Nihorimbere et al., 2011). Muchas BPCV estimulan el crecimiento vegetal al controlar organismos patógenos por lo que se consideran como bio-pesticidas (Glare et al., 2012). La información del uso de BPCV en amarantáceas es muy escasa. Existen pocas publicaciones sobre este tipo de investigación y la mayoría se han desarrollado en especies de amaranto no cultivadas (Adesemoye et al., 2008; Nair et al., 2007; Nair y Anith, 2009; Vrbnicanin et al., 2008). A continuación se describen algunos aspectos del cultivo, principales mecanismos de acción de las BPCV, así como los avances en la aplicación de BPCV al amaranto de grano logrados hasta el momento por nuestro grupo de trabajo. Por último, se presenta un apartado donde se describe la posibilidad de utilizar la información generada de la secuenciación del transcriptoma de A. hypochondriacus (Délano-Frier et al., 2011) para entender las bases moleculares de la promoción de crecimiento en amaranto de grano. EL CULTIVO DEL AMARANTO En las últimas décadas, el cultivo del amaranto se ha difundido a nivel mundial, cultivándose en los cinco continentes. Entre los principales países productores se encuentran la India, México, Perú, China, Bolivia, Pakistán, Nepal, Argentina y Estados Unidos (Morales Guerrero et al., 2009). En México, la producción se concentra principalmente en los Estados de Puebla, Morelos, Tlaxcala y el Distrito Federal (SIAPSAGARPA, 2010), aunque en algunos años también se ha llegado a cultivar en los estados de Guanajuato, Estado de México, Oaxaca y Querétaro, donde las principales especies que se cultivan son A. hypochondriacus y A. cruentus (Espitia Rangel et al., 2010; Morales Guerrero et al., 2009). En el año 2010, se sembraron en nuestro país poco más de 3000 ha, con una producción total de 3870 ton y un rendimiento promedio de 1.23 ton/ha, que está dentro del nivel mundial reportado, el cual oscila entre 1 a 3 ton/ha. Dentro de los estados productores,

Puebla ocupa el primer lugar aportando más del 60% del total nacional, aunque la superficie sembrada y producción fluctúa ampliamente cada año (SIAP-SAGARPA, 2010; Espitia Rangel et al., 2010). PLAGAS Y ENFERMEDADES Existe poca información sobre las plagas y patógenos que afectan al amaranto, principalmente en lo que respecta a la etiología de las enfermedades y su control. En el caso de las plagas, éstas se pueden agrupar en cuatro grupos de acuerdo a la forma de daño y comportamiento del insecto (Mujica y Berti, 1997; Espitia Rangel et al., 2010; Morales Guerrero et al., 2009 y Aragón García et al., 2011), los cuales se muestran a continuación en el Cuadro 1. Las enfermedades más comunes del amaranto son aquellas ocasionadas por hongos (Mujica y Berti, 1997; Espitia Rangel et al., 2010; Morales Guerrero et al., 2009) y se resumen en el cuadro 2. Existen otros agentes causales de enfermedades en amaranto. Éstos son, nemátodos, virus, bacterias y fitoplasmas. Entre los nemátodos que atacan al amaranto se encuentran Nacobbus aberrans y Meloidogyne incognita, los cuáles producen nódulos en las raíces causando daños significativos a la producción del orden del 10-14% del rendimiento de grano (Espitia Rangel et al., 2010; Morales Guerrero et al., 2009). Las principales sintomatologías en plantas con virosis son enanismo, clorosis, enrollamiento y deformación de las hojas. En Argentina, Asia y Oceanía se ha encontrado que el Amaranthus Leaf Mottle Virus afecta a diversas especies de amaranto, entre ellas, A. hypochondriacus y A. cruentus (Espita Rangel et al., 2010). Entre las enfermedades causadas por bacterias, se han reportado plantas de amaranto con la enfermedad conocida como “Mancha bacteriana” que ocasiona lesiones en las hojas, siendo Xantomonas spp. el agente causal. En México se han encontrado Pseudomonas spp. y Xanthomonas campestris infectando diversas especies de amaranto (Casarrubias Castillo, 2009; Espita Rangel et al., 2010). También se han detectado plantas con proliferación excesiva de brotes, acortamiento de entrenudos, amarillamiento y filodia o crecimiento F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

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Amaranto: Ciencia y Tecnología Cuadro 1. Principales plagas del amaranto.

Especie Nombre común Agrotis spp. Gusanos cortadores Feltia spp. Gusanos cortadores Peridroma spp. Gusanos cortadores Eurysacca Polilla de la hoja melanocampta Herpetogramm Polilla de la kiwicha a bipunctalis Spodoptera Gusano soldado eridiana Pseudoplusia Falso medidor includens Diabrotica spp. Escarabajo de la hoja Schistocerca Saltamontes piceifrons Spoladea Gusano hawaiano de recurvalis la remolacha Aphis spp. Pulgones Myzus persicae Pulgones Lygus lineolaris Chinche Conotrachelus seniculis Lixus truncatulus Hypolixus truncatulus Amauromyza abnormalis

Barrenador del tallo (o gorgojo) Barrenador del tallo Barrenador del tallo Mosca barrenadora

Cuadro 2. Enfermedades fúngicas que afectan al amaranto.

Agente Causal Alternaria spp. Macrophoma spp. Sclerotinia sclerotiorium Thecaphora spp. Phytium spp. Fusarium spp. Rhizoctonia spp.

secundario. Diversas investigaciones realizadas indican que estas sintomatologías están asociadas a la infección por fitoplasmas, los cuales mediante caracterización molecular se ha determinado que corresponden a Candidatus Phytoplasma Pruni y Candidatus Phytoplasma aurantifolia (Ochoa Sánchez et al., 2010; Rojas Martínez et al., 2009). 116

F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

Cuando no hay un control y manejo adecuado tanto de las plagas como de los distintos patógenos que estén afectando el cultivo se pueden producir cuantiosas pérdidas, como se demostró en un estudio realizado por Aragón García y López Olguín (2001) donde se compararon parcelas experimentales con y sin control de los insectos perjudiciales, encontrando que la falta

Capítulo IX. Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano

del control de plagas ocasionó pérdidas hasta del 65% de la producción. Para el control de las plagas y enfermedades se recomiendan acciones preventivas para evitar el uso de químicos que afecten o disminuyan la población de insectos y microorganismos benéficos y lleven al desarrollo de resistencia por parte de los patógenos, además de contribuir a la contaminación ambiental. Una de estas medidas preventivas es el uso de microorganismos benéficos, entre los que están ciertos hongos, como Trichoderma y micorrizas, y las bacterias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV). Las BPCV pueden ser utilizadas en el cultivo de amaranto, no solamente como agentes biocontroladores, sino como biofertilizantes que contribuyan a mejorar su producción. BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL (BPCV) Las BPCV son bacterias de vida libre de importancia agrícola, debido a que presentan efectos benéficos sobre el crecimiento y la salud de las plantas eliminando los microorganismos causantes de enfermedades e incrementando la disponibilidad y asimilación de nutrimentos. Por lo tanto, para mejorar la fertilidad del suelo, aumentar el rendimiento de los cultivos y reducir los impactos negativos de los fertilizantes químicos en el medio ambiente, es muy recomendable explotar el uso de las BPCV (Babalola, 2010). A diferencia de los efectos adversos del continuo uso de fertilizantes químicos, cuando las BPCV son aplicadas al suelo mejoran su estructura sin dejar residuos tóxicos. De esta manera, los inoculantes microbianos o biofertlizantes son un componente importante en la agricultura sustentable (Shankar Singh et al., 2011). Sin embargo, problemas de variabilidad en la eficiencia de colonización, desempeño en el campo y competencia en la rizósfera pueden ser temas controversiales. Por ello, para el uso de BPCV como biofertilizantes se requiere la selección de microorganismos competentes en la rizósfera con atributos de promoción de crecimiento (Babalola, 2010). Algunas de las especies de BPCV más estudiadas pertenecen a los géneros Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligens, Arthobacter, Burkholderia, Bacillus y Serratia (Ahmad et al., 2006). Todas ellas mejoran el

crecimiento y salud de la plantas por medio de diversos mecanismos, los cuales se explican a continuación. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LAS BPCV Las BPCV pueden facilitar el crecimiento y desarrollo de las plantas por medio de mecanismos directos e indirectos. La estimulación directa puede involucrar el suministro de sustancias sintetizadas por la propia bacteria y la ayuda para la toma de nutrientes del ambiente, los cuales pueden ser nitrógeno, fitohormonas, hierro y fósforo (Sarabia Ochoa et al., 2010; Verma et al., 2010), mientras que la estimulación indirecta incluye la prevención o eliminación de fitopatógenos por la producción de sustancias inhibitorias o por el incremento de la resistencia de la planta (Saleem et al., 2007). Entre los mecanismos directos está la fijación biológica de nitrógeno (FBN). Esta característica es importante ya que el nitrógeno es uno de los nutrimentos más comunes requeridos para el crecimiento y productividad de las plantas al formar parte integral de proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas esenciales. Alrededor del 78% del nitrógeno está presente en la atmósfera pero no está disponible para las plantas. La FBN involucra la conversión de nitrógeno a amoniaco por microorganismos usando un complejo enzimático identificado como nitrogenasa. La FBN fija alrededor del 60% del nitrógeno disponible en el planeta y representa una alternativa económica y ambientalmente benéfica. Algunas especies de BPCV que fijan nitrógeno son Azotobacter, Azospirullum, Pseudomonas, Burkholderia, Rhizobium, Klebsiella y Erwinia (Verma et al., 2010). Otro efecto directo involucra un incremento en la disponibilidad de nutrientes, principalmente el fósforo y el hierro, que son nutrientes esenciales para las plantas. El fósforo es el segundo nutriente mineral limitante del crecimiento de las plantas; el suelo posee grandes reservas de fósforo total pero solo una pequeña cantidad es disponible para las plantas. La baja disponibilidad del P para las plantas se debe a que la mayoría del P del suelo se encuentra en formas insolubles y las plantas solo pueden absorber P en dos formas solubles, ión monobásico y dibásico. Existen BPCV capaces de solubilizar P incrementando su disponibilidad F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

para las plantas. Por otra parte, la disponibilidad de hierro puede incrementarse con el uso de BPCV sintetizadoras de sideróforos, que son biomoléculas de bajo peso molecular que atraen y se unen al hierro de la rizósfera (Verma et al., 2010). La producción de fitohormonas o moléculas estructuralmente similares a éstas también contribuye directamente a la promoción de crecimiento. Las fitohormonas son reguladores producidos por las plantas que a bajas concentraciones regulan sus procesos fisiológicos. Las respuestas a estos compuestos están determinadas por factores como la edad de la planta, el estadio fisiológico y las condiciones ambientales, entre otras. Algunas especies de los géneros Pseudomonas, Azotobacter y Bacillus liberan auxinas, giberelinas o citoquininas en la rizósfera de las plantas, ejerciendo un efecto estimulador del crecimiento especialmente marcado cuando éstas están en estado de plántula (Lugtenberg y Kamilova, 2009; Verma et al., 2010). Además, las BPCV que contienen la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa facilitan el crecimiento y desarrollo de la planta al disminuir los niveles de etileno. Estas bacterias toman el ACC, precursor del etileno, y lo convierten en 2-oxobutanoato y NH3. Formas de estrés ocasionadas por metales pesados, salinidad, sequía e infección por bacterias patógenas son mitigadas por las BPCV sintetizadoras de dicha enzima (Lugtenberg y Kamilova, 2009). Entre los mecanismos indirectos se encuentra la producción de antibióticos. Las especies de BPCV productoras de antibióticos más estudiadas pertenecen al género Pseudomonas. Fue en una de éstas en las cuales se describió el primer antibiótico implicado en el biocontrol, la fenazina, el cual ha demostrado su efectividad contra diversas enfermedades en las plantas producidas por hongos (Fusarium spp. y Pythium spp.) causantes de podredumbres de tallo y raíz (Pierson y Pierson, 2010). La producción de sideróforos también es parte de los mecanismos indirectos de promoción del crecimiento. Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular que presentan alta afinidad por el hierro. Estas sustancias son sintetizadas en condiciones de escasez de este elemento, atrayendo al hierro y convirtiéndolo en factor limitante para el crecimiento de los patógenos. 118

F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

La capacidad de los sideróforos para actuar como supresores de enfermedades depende de la planta, del fitopatógeno a eliminar, la composición del suelo, el tipo de BPCV y la afinidad del sideróforo por el hierro (Sarabia Ochoa et al., 2010; Verma et al., 2010). Además, las BPCV pueden activar un mecanismo de defensa de la planta conocido como resistencia sistémica inducida (RSI), la cual confiere a la planta una mayor capacidad defensiva. Tras la infección con un patógeno esta infección se manifiesta como la reducción de la tasa del desarrollo de la enfermedad, resultando en menos plantas enfermas o una menor severidad de la enfermedad (Van Loon et al., 2007). Diversos componentes bacterianos pueden inducir la RSI, tales como, lipopolisacáridos, fragmentos de los flagelos, ácido salicílico, sideróforos, lipopétidos cíclicos, factores antifúngicos y hasta compuestos orgánicos volátiles (Lugtenberg y Kamilova, 2009). Asimismo, las BPCV pueden producir enzimas antimicrobianas, como quitinasas, glucanasas y proteasas que hidrolizan o degradan la pared de algunos hongos patógenos. Todas estas enzimas muestran actividad antifúngica individualmente, pero a menudo actúan sinérgicamente con antibióticos. (Babalola, 2010). La figura 1 nos presenta un esquema general de las interacciones BPCV-Planta, que resultan en la promoción de crecimiento y la inducción de resistencia en la planta. APLICACIONES DE LAS BPCV Entre las bacterias promotoras de crecimiento vegetal más estudiadas y utilizadas en campo se encuentran principalmente Bacillus, Pseudomonas y Azospirillum; siendo éste último uno de los primeros microorganismos utilizados como biofertilizantes en México. Se ha reportado que la inoculación de Azospirillum en maíz puede reducir hasta en un 50% la aplicación de fertilización química, sin disminuir el rendimiento. Incluso se pudo obtener un incremento del 10% respecto a cultivos con el 100% de la fertilización química (Onofre Lemus et al., 2009a). Del mismo modo, el uso de esta BPCV en sorgo en el estado de Tamaulipas, logró incrementos del 10 al 27% de la productividad en plantas inoculadas respecto a las plantas control (García Olivares et al., 2006). Azospirillum

Capítulo IX. Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano

Figura 1. Interacciones BPCV-Plantas (modificado de Barret et al., 2011). Pasos importantes en la interacción son la motilidad (1), la adherencia (2) y el crecimiento de las BPCV (3), siendo también importante la afinidad por los exudados radiculares para promover el aporte de nutrientes, hormonas o la inhibición de patógenos. Esto último pudiendo ser indirectamente través la inducción de la RSI en la planta o directamente (4) a través de metabolitos secundarios.

también se ha utilizado para apoyar programas de reforestación, ya que se ha demostrado que plantas inoculadas tienen mayor sobrevivencia y rápido desarrollo comparado con las plantas a las cuales no se les aplica esta BPCV (Bashan et al., 1999; Villegas Espinoza et al., 2010). El género Pseudomonas también ha sido muy estudiado en nuestro país. Por ejemplo, se han realizado investigaciones en plantas de tomate (Solanum lycopersicum) y se ha encontrado que acelera su desarrollo, adelanta la floración 6 días e incrementa su tamaño, así como su producción, hasta 45% comparada con las plantas que no fueron inoculadas (Carrillo Castañeda et al., 2000). En el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) se han desarrollado diversos biofertilizantes. Uno de ellos, el Biofertilizante Bacteriano 2709, demostró su efectividad para incrementar la producción hasta un 50% de cultivos como papa, frijol, maíz, tomate y chile ancho. A su vez, se han realizado diversas investigación con especies del género Bacillus. En chile y calabacita se ha encontrado que, además de incrementar el crecimiento y productividad, su uso proporciona protección contra enfermedades

fúngicas y virales (Maldonado Cruz et al., 2008; Guillén Cruz et al., 2006). También existen reportes de BPCV que protegen contra el ataque de plagas, como se reportó en plantas de jitomate, donde la inoculación con Bacillus subtilis BEB-DN protegió contra la infestación por mosquita blanca (Bemisia tabaci), al retardar significativamente su desarrollo (Valenzuela Soto et al., 2010). Otro grupo de BPCV que se ha estudiado más recientemente es Burkholderia, el cual es probablemente el género de bacterias asociadas a plantas más diverso y adaptable al ambiente (Compant et al., 2008). Dada esta gran diversidad, son bacterias que pueden usarse tanto para promover el crecimiento de las plantas y biocontrolar algunas enfermedades como para biorremediar ambientes contaminados. Se han estudiado cepas aisladas y asociadas a diversos cultivos como maíz, tomate, mango, caña de azúcar y arroz entro otras, obteniendo resultados prometedores en su uso como biofertilizantes y agentes de biocontrol (Caballero Mellado et al., 2007; De los Santos Villalobos et al., 2012; Estrada de los Santos et al., 2001; Onofre Lemus et al., 2009; Reis et al., 2004).

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USO DE BPCV EN AMARANTO La información de estudios sobre el uso de BPCV en amaranto es escasa, y la mayoría se han realizado en especies de amaranto que no son cultivadas para la producción de grano, sino en amarantos silvestres o amarantos para consumo como vegetal de hoja. Estos estudios se han realizados en países del continente Asiático y Africano, donde las hojas de amaranto son consumidas más que el grano. En 2007, se evaluó la capacidad de diversas BPCV para mitigar el retraso en el crecimiento ocasionado por el fungicida Acibenzolar-S-Metil, un activador de las defensa de la planta, mejorando el crecimiento de A. tricolor con Pseudomonas putida 89B61 y Pseudomnas fluorescens PN026R (Nair et al., 2007). Posteriormente, el mismo grupo de investigación evaluó la capacidad de biocontrol de Rhizotocnia solani por distintas BPCV, encontrando que la cepa nativa P. fluorescens PN026R, que a pesar de no demostrar una fuerte capacidad antagónica in vitro, fue la más efectiva en controlar la enfermedad (Nair y Anith, 2009). En otro estudio se comparó el efecto de Pseudomonas aeruginosa y Bacillus subtilis en A. viridis, observándose que el efecto fue positivo en la tasa de germinación al aumentar en un 40% y la biomasa también incrementó considerablemente, entre 40-80%, con inoculación de ambas BPCV. Al comparar todos los factores evaluados, no hubo diferencias significativas entre ambas cepas (Adesemoye et al., 2008). En A. retroflexus se reportó un aumento en la tasa de germinación al inocular la semilla con Bacillus circulans (Vrbnicanin et al., 2008), mientras que el único estudio del que tenemos conocimiento donde se ha evaluado el uso de BPCV en una especie de amaranto productora de grano fue realizada en A. paniculatus. En éste, se evaluaron dos aislados de Pseudomonas corrugata, logrando obtener un aumento en el crecimiento y contenido de nitrógeno en las plantas inoculadas con las BPCV (Pandey et al., 1999). EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE BPCV EN AMARANTO DE GRANO En nuestro grupo de trabajo se están realizando estudios para la evaluación de la capacidad de promoción de crecimiento vegetal, potencial de capacidad de biocontrol y efecto en la 120

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productividad de plantas de amaranto con la inoculación de diversas cepas de BPCV. La bacterias que están siendo evaluadas son Burkholderia caribensis XV, Burkholderia ambifaria Mex5, Burkholderia cepacia XXVI y Rhizobium spp. XXV, las cuales fueron aisladas y caracterizadas en el laboratorio de Microbiología Ambiental y Bacillus subtilis BEB-DN aislada en el Laboratorio de Bioquímica Ecológica, ambos laboratorios del Cinvestav, Unidad Irapuato. Las cepas fueron evaluadas en su capacidad de promoción de crecimiento en dos especies de amaranto, A. hypochondriacus var. Nutrisol y A. cruentus var. Candil por su importancia tanto en México como en Argentina, respectivamente. A su vez, los parámetros morfométricos que están siendo evaluados son altura, diámetro de tallo, área foliar, biomasa área, radicular y total. Además, se están evaluando dos métodos para la aplicación de las BPCV: inoculación de semilla e inoculación de plántula. Todos los ensayos se están realizando en invernadero y la promoción de crecimiento está siendo evaluada 7 semanas después de la germinación. Hasta este momento, las cepas que se observan más promisorias son B. caribensis XV y B. ambifaria Mex5, ya que las plantas inoculadas presentan mayor crecimiento y biomasa (Figura 2), principalmente las inoculadas desde semilla. Se observaron resultados similares en ambas especies de amaranto. La mayoría de las variables morfométricas medidas en las plantas inoculadas con estas cepas resultaron con importantes incrementos respecto al control no inoculado, teniendo incrementos en biomasa total de 50 hasta 100%. También se están llevando a cabo otros ensayos para determinar el efecto de dichas BPCV en plantas de amaranto simultáneamente tratadas con fertilización química. Dichos experimentos también se están realizando a nivel de invernadero. Con las bacterias seleccionadas sobre la base de su capacidad de promover el crecimiento, se realizarán ensayos adicionales para determinar si tienen un efecto en el contenido de nitrógeno y carbohidratos en los distintos tejidos de la planta. También se evaluará su posible efecto sobre la productividad de grano a nivel de invernadero. En caso de que el efecto sobre la productividad resultase positivo, se realizarán entonces experimentos en campo, a partir de marzo de 2013.

Capítulo IX. Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano

Figura 2. Promoción de crecimiento en amaranto de grano inoculado con BPCV. Se muestran plantas de A. cruentus var. Candil inoculadas con (A) Burkholderia ambifaria Mex5 y (B) B. caribensis XV, respectivamente. Las plantas inoculadas se muestran a la izquierda de cada panel mientras que a la derecha están los controles no inoculados.

Otro aspecto que se analizará es la capacidad de biocontrol de las BPCV. Para ello, se realizarán ensayos de reto con bacterias patógenas del amaranto de grano (e.g. P. syringae pv. tabaci) en las plantas inoculadas y se evaluará la mitigación de los síntomas, la disminución de la población del patógeno, así como también el efecto sobre el crecimiento. BASES MOLECULARES DE LA PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN AMARANTO A pesar de que la promoción de crecimiento por BPCV es un hecho conocido en muchas especies de plantas, es poco el conocimiento que se tiene sobre las bases moleculares de dicho fenómeno. Es decir, excepto por el caso aislado de Arabidopsis thaliana, no se tiene claro el efecto de la inoculación de estas bacterias en los patrones de expresión génica en la mayoría de las plantas donde se ha observado su efecto promotor de crecimiento y/o de biocontrol. Por ejemplo, Wang et al. (2005) realizaron un perfil de expresión génica por medio de microarreglos en plantas de A. thaliana inoculadas con el endófito Pseudomonas fluorescens FPT9601-T5. Este grupo encontró que genes regulados por auxinas y genes tipo nodulina fueron inducidos mientras que genes responsivos a etileno fueron reprimidos. También descubrieron que

algunos genes que podrían estar relacionados con la promoción de crecimiento, son genes inducidos por auxinas, genes tipo NAM y genes relacionados a metabolismo de carbohidratos, mientras que la elevada resistencia a enfermedades podría relacionarse con proteínas PR, factores de transcripción tipo WRKY, genes relacionados con metabolismo secundario y proteínas de respuesta a estrés como peroxidasa y glutatión-S transferasa. Se han realizado otros estudios adicionales en A. thaliana donde los microarreglos también han sido la herramienta experimental usada para estudiar cambios en los patrones de expresión génica. La mayoría se enfocaron a entender las bases moleculares de su capacidad de biocontrol (Cartieaux et al., 2003; Verhagen et al., 2004), a excepción de dos estudios muy recientes donde el objetivo fue determinar solamente los mecanismos moleculares de la promoción de crecimiento vegetal inducida por cepas del género Pseudomonas. Entre los genes sobre regulados se encontraron genes relacionados al metabolismo celular, metabolismo de nitrógeno, transporte de azúcares, toma de nutrientes y señalización por auxinas (Schwachtje et al., 2011; Srivastava et al., 2012). Otra estrategia que se ha utilizado para entender las respuestas moleculares de las plantas a la inoculación de BPCV es el establecimiento F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

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de perfiles proteómicos. Esta herramienta se usó en plantas de arroz inoculadas con Pseudomonas fluorescens KH1 para detectar proteínas expresadas diferencialmente, las cuales fueron identificadas por medio de espectrometría de masas. Entre las proteínas detectadas se encontraron algunas proteínas diferenciales como un precursor de Ribulosa bifosfato carboxilasa o Rubisco, una tiorredoxina, la subunidad alfa del proteosoma y glutatión-S- tranferasa, las tres últimas relacionadas con respuestas de defensa o estrés (Kandasamy et al., 2009). En nuestro laboratorio estamos interesados en contribuir al entendimiento de la promoción de crecimiento vegetal. Por ello se pretende utilizar la información generada de la secuenciación y análisis del transcriptoma del amaranto (Délano Frier et al., 2011). Con base a los resultados del análisis digital de expresión basado en los datos del transcriptoma, referencias bibliográficas y otros estudios realizados en nuestro grupo de trabajo, se han seleccionado genes relacionados a diversos aspectos del metabolismo de la planta como: i) metabolismo de carbohidratos, ii) metabolismo de nitrógeno, iii) síntesis de pared celular, iv) fotosíntesis, v) señalización y síntesis de auxinas. En el cuadro 3 se presentan algunos de los genes candidatos a ser estudiados. Consideramos que el estudio de genes relacionados a metabolismo de carbohidratos es importante para comparar nuestros resultados con lo que se ha reportado en A. thaliana, donde

se han encontrado perfiles transcriptómicos que semejan a aquellos que se disparan cuando la planta está en un estado de escasez de azúcares, generando de manera aún desconocida, una alteración en la expresión génica acompañada de un incremento de sacarosa en las raíces. Se especula que estos cambios pueden resultar benéficos tanto para la planta como para las BPCV, al servir como fuente de energía para la síntesis de componentes de la pared celular que son requeridos durante el crecimiento así como para las producción de una mayor cantidad de exudados radiculares que pueden servir como nutrientes para la bacteria (Schwachtje et al., 2011). El estudio de genes relacionados con metabolismo de nitrógeno y síntesis y señalización de auxinas se ha considerado debido a que en otro estudios se ha encontrado que genes relacionado auxinas, y en ocasiones los relacionados al metabolismo nitrogenado, se ven inducidos, por lo que se sugiere que las BPCV de alguna manera manipulan la expresión de estos genes, aunque por un mecanismo que todavía no ha sido identificado. Por ello consideramos que es importante estudiar si la promoción en amaranto se produce utilizando mecanismos similares a los detectados en plantas modelos como A. thaliana (Schwachtje et al., 2011). De igual manera, proponemos que los genes relacionados a fotosíntesis y síntesis de pared celular, seleccionados sobre la base de un estudio diseñado para aumentar la productividad de

Cuadro 3. Genes candidatos para estudiar la promoción de crecimiento vegetal en amaranto.

Gen Transportador de azúcares Transportador de triosas fosfato Invertasa citosólica Sacarosa Sintasa Metabolismo de Transportador de nitrato nitrógeno Glutamato deshidrogenasa Asparagina sintasa Síntesis y señalización Factor de respuesta a auxinas de auxinas Proteína asociada a dormancia Síntesis de pared celular Expansina Xiloglucano endotransglicolasa Xilosidasa Fotosíntesis PEP Carboxilasa Enzima málica Rubisco activasa Ruta Metabólica Metabolismo de carbohidratos

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sacarosa en caña de azúcar (McCormick et al., 2008) deberían estar más activos, al generar mayores esqueletos carbonados para apoyar la promoción de crecimiento, que requiere necesariamente de un proceso de expansión de la pared celular, en plantas de amaranto. La herramienta experimental que se utilizará para el análisis de la expresión de los genes seleccionados será la PCR cuantitativa en tiempo real, que es una de las técnicas más avanzadas y confiables hoy en día para el análisis de expresión génica. CONCLUSIONES El amaranto en nuestro país es un cultivo muy importante histórica y culturalmente, aunque su importancia alimenticia y económica se ha incrementado considerablemente debido al creciente interés por la alimentación saludable basada en una buena nutrición y en una dieta balanceada. Mientras que el uso de las BPCV ha sido ampliamente estudiado en varios cultivos de interés comercial, como maíz, sorgo, tomate, chile, papa y caña de azúcar, para los cuales ya existen biofertilizantes muy eficientes, en amaranto es un aspecto que apenas se ha empezado a explorar. Por ello, consideramos que es necesario realizar investigaciones enfocadas a identificar cepas de BPCV que tengan la capacidad, no sólo de promover el crecimiento de la planta sino de incrementar su productividad. No menos importante será la evaluación de cepas que muestren capacidad de biocontrol de enfermedades que afectan al amaranto. Tanto la promoción del crecimiento como el bio-control contribuirán al disminuir el uso de fertilizantes y plaguicidas químicos, lo que seguramente contribuirá al desarrollo de una agricultura más sustentable. Otro aspecto de importancia y que deberá ser considerado también, será el aislamiento y estudio de cepas nativas de amarantos silvestres que puedan ser utilizadas como BPCV en amarantos cultivados. Por último, es importante resaltar que la investigación básica es un campo esencial en todos los aspectos del quehacer científico. Por tal motivo, consideramos que será de gran relevancia incrementar el entendimiento de las

bases moleculares que conducen a la promoción de crecimiento, no sólo en plantas modelo como A. thaliana, sino en cultivos de interés, como es el amaranto, para que posteriormente este conocimiento pueda ser utilizado en otras investigaciones que cristalicen en aplicaciones prácticas en el campo. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó gracias al apoyo brindado por la Unión Europea (Proyecto AMARANTH: FUTURE-FOOD, Contrato No. 032263), México Tierra de Amaranto A.C. y la Fundación Deborah Presser-Velder. Se agradece también al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico otorgado a FIPC para la realización de este proyecto (Beca No. 210295). BIBLIOGRAFÍA Adesemoye A O, M Obini, E O Ugoji (2008) Comparison of plant growth promotion with Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis in three vegetables. Brazilian Journal of Microbiology. 39: 423-426. Ahmad F, I Ahmad, M S Khan (2006) Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological Research. 36:1-9. All-Taweil H I, M B Osman, A A Hamid, W M W Yusoff (2009) Development of microbial inoculants and the impact of soil application on rice seedlings growth. American Journal of Agricultural and Biological Science. 4: 79-82. Anónimo (2010) Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y alimentación. Servicio de información Agroalimentaria y Pesquera. (http://www.siap. gob.mx). Aragón García A, J F López Olguín (2001) Descripción y control de las plagas del amaranto. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México. 32 p.

F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

123

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Aragón-García A, M A D Huato, M H Lara, F Sáenz-de-Cabezón, I Pérez-Moreno, V Marco-Mancebón , J F López-Olguín (2011) Insect occurrence and losses due to phytophagous species in the amaranth Amaranthus hypocondriacus L. crop in Puebla, Mexico. African Journal of Agricultural Research 6: 5924-5929 Babalola O O (2010) Beneficial bacteria of agricultural importance. Biotechnology Letters. 32:1559-1570. Barret M, J P Morrissey, F O’Gara (2011) Functional genomics analysis of plant growthpromoting rhizobacterial traits involved in rhizosphere competence. Biology and Fertility of Soils. 47: 729-743. Bashan Y, A Rojas, M E Puente (1999) Improved establishment and development of three cactus species inoculated with Azospirillum brasilense transplanted into disturbed urban desert soil. Canadian Journal of Microbiology. 45: 441–451. Brenner D M, D D Baltensperger, P A Kulakow, J W Lehmann, R L Myers, M M Slabbert, B B Sleugh (2000) Genetic resources and breeding of Amaranthus. Plant Breeding Reviews. 19: 227–285 Caballero Mellado J, J Onofre Lemus, P Estrada de los Santos, L MartínezAguilar (2007) The tomato rhizosphere, an environment rich in nitrogen-fixing Burkholderia species with capabilities of interest for agriculture and bioremediation. Applied and Environmental Microbiology. 73: 5308–5319. Carrillo Castañeda G, J Juárez Muñoz, D Ruiz Landa, R Müller García (2010) Aumento del rendimiento de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) cuando la raíz se desarrolla colonizada por microorganismos. Biotecnología Aplicada. 17: 171-176.

124

F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

Cartieaux F, M C Thibaud, L Zimmerli, P Lessard, C Sarrobert, P David, A Gerbaud, C Robaglia, S Somerville, L Nussaume (2003) Transcriptome analysis of Arabidopsis colonized by a plant-growth promoting rhizobacterium reveals a general effect on disease resistance. The Plant Journal. 36: 77–188. Casarrubias Castillo K (2009) Resistencia a bacteriosis en genotipos de amaranto (Amaranthus spp.) de interés agronómico. Tesis de Maestría.: Departamento de Biotecnología y Bioquímica. Cinvestav-Unidad Irapuato. Irapuato, Gto, México.p.118 Compant S, J Nowak, T Coenye, C Clement, E A Barka EA (2008) Diversity and occurrence of Burkholderia spp. in the natural environment. FEMS Microbiology Reviews. 32: 607–626 De los Santos Villalobos S, G C Barrera Galicia, M A Miranda Salcedo, J J Peña Cabriales (2012) Burkholderia cepacia XXVI siderophore with biocontrol capacity against Colletotrichum gloeosporioides. World Journal of Microbiology and Biotechnology 28: 26152623. Délano Frier J P, H Aviles Arnaut, K Casarrubias Castillo, G Casique Arroyo, P A Castrillón Arbeláez, L Herrera Estrella, J Massange Sánchez, N A Martínez Gallardo, F I Parra Cota, E Vargas Ortiz, M G Estrada Hernández (2011) Transcriptomic analysis of grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) using 454 pyrosequencing: comparison with A. tuberculatus, expression profiling in stems and in response to biotic and abiotic stress. BMC Genomics 12: 363. Espitia Rangel E, C Mapes Sánchez, D Escobedo López, M de la O Olán, P Rivas Valencia, G Martínez Trejo, L Cortés Espinoza, J M Hernández Casillas (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos del amaranto en México. SINAREFI-INIFAP-UNAM, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. 201 p.

Capítulo IX. Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano

Estrada de los Santos P, R Bustilios Cristales, J Caballero Mellado (2001) Burkholderia, a genus rich in plant-associated nitrogen fixers with wide environmental and geographic distribution. Applied & Environmental Microbiology. 67: 2790–2798. García Olivares J G, Moreno Medina V R, Rodríguez Luna I C, Mendoza Herrera A y Mayek-Pérez N (2006) Biofertilización con Azospirillum brasilense en sorgo, en el norte de México. Agricultura Técnica en México. 32: 135-141. Glare T, J Caradus, W Gelernter, T Jackson, N Keyhani, J Kohl, P Marrone, L Morin, A Stewart (2012) Have biopesticides come of age? Trends in Biotechnology. 30: 250-258. Guillén Cruz R, F D Hernández Castillo, G Gallegos Morales, R Rodríguez Herrera, C N Aguilar González, E Padrón Corral, M H Reyes Valdés (2006) Bacillus spp. como biocontrol en un suelo infestado con Fusarium spp., Rhizoctonia solani Kühn y Phytophthora capsici Leonina y su efecto en el desarrollo y rendimiento del cultivo de chile (Capsicum annuum L.). Revista Mexicana de Fitopatología. 24: 105–114. Kandasamy S, K Loganathan, R Muthuraj, S Duraisamy, S Seetharaman, R Thiruvengadam, B Ponnusamy, S Ramasamy (2009) Understanding the molecular basis of plant growth promotional effect of Pseudomonas fluorescens on rice through protein profiling. Proteome Science. 7: 47. Lugtenberg B , F Kamilova (2009) Plantgrowth promoting rhizobacteria. Annual Review of Microbiology. 63: 541–556. Maldonado Cruz E, D L Ochoa Martínez, B Tlapal Bolaños (2008) Efecto del ácido acetil salicílico y Bacillus subtilis en la infección causada por Cucumber mosaic virus en calabacita. Revista Chapingo Serie Horticultura. 14: 55-59.

McCormick A J, M D Cramer, D A Watt (2008) Changes in photosynthetic rates and gene expression of leaves during a source-sink perturbation in sugarcane. Annals of Botany 101: 89-102. Morales Guerrero J C, N Vázquez Mata N, R Bressani Castignoli (2009) El amaranto. Características físicas, químicas, toxicológicas y funcionales y aporte nutricio. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Social, Pesca y Alimentación. Mexico, D. F. 269 p. Mujica Sánchez A, M Berti Díaz (1997) El cultivo del amaranto (Amaranthus spp.): producción, mejoramiento genético y utilización. Organización De Las Naciones Unidas Para La Agricultura Y La Alimentación (FAO). Puno, Perú. 145 p. Nair C B, K N Anith (2009) Efficacy of acibenzolar-S-methyl and rhizobacteria for the management of foliar blight disease of amaranth. Journal of Tropical Agriculture. 47: 43-47. Nair C B, K N Anith, J Sreekumar (2007) Mitigation of growth retardation effect of plant defense activator, acibenzolar-S-methyl, in Amaranthus plants by plant growth-promoting rhizobacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 23: 1183-1187. Nihorimbere V, M Ongena, M Smargiassi, P Thonart (2011) Beneficial effect of the rhizosphere microbial community for plant growth and health. Biotechnology, Agronomy, Society & Environment. 15: 327-337. Ochoa Sánchez J C, F I Parra Cota, K Avina Padilla, J P Delano Frier, J P Martinez Soriano (2010) Amaranthus spp.: a new host of “Candidatus Phytoplasma aurantifolia”. Phytoparasitica. 37: 381-384.

F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

125

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Onofre Lemus J, A Wong Villarreal, R Castro González, P Estrada-de los Santos, J Rodríguez Salazar, R Suárez, G Iturriaga, L Martínez Aguilar, J Caballero Mellado (2009a) Uso de Azospirillum en México como biofertilizante y potencial de nuevas especies bacterianas como biofertilizantes, agentes de biorremediación y biocontrol de fitopatógenos. XIII Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería. Acapulco Guerrero. Onofre Lemus J, I Hernández Lucas, L Girard, J Caballero Mellado (2009) ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) deaminase activity, a widespread trait in Burkholderia species, and its growth promoting effect on tomato plants. Applied & Environmental Microbiology. 75: 6581–6590. Pandey A, A Durgapal, M Joshi, L M S Palni (1999) Influence of Pseudomonas corrugata inoculation on root colonization and growth promotion of two important hill crops. Microbiological Research.154: 259-266. Paredes López O (1994) Amaranth: Biology, Chemistry and Technology. CRC Press. Boca Raton. 234 p. Paredes López O, A P Barba de la Rosa, D Hernández López, A Carabez Trejo (1990) Amaranto: Características alimentarias y aprovechamiento agroindustrial. Secretaria General de la Organización de los Estados Americanos. Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico. Washington, D.C. 97 p. Pierson L S III, E A Pierson (2010) Metabolism and function of phenazines in bacteria: impacts on the behavior of bacteria in the environment and biotechnological processes Applied Microbiology & Biotechnology. 86: 1659–1670. Pooja S, S Dudeja, N Neeru (2007) Development of multiple co-inoculants of different biofertilizers and their interaction with plants. Archives of Agronomy and Soil Science. 53: 221-230.

126

F. I. Parra Cota y J. P. Délano Frier

Reis V M, P Estrada de los Santos, S Tenorio Salgado, J Vogel, M Stoffels, S Guyon, P. Mavingui, V L D Baldani, M Schmid, J I Baldani, J Balandreau, A Hartmann, J Caballero Mellado (2004) Burkholderia tropica sp nov., a novel nitrogen-fixing plant-associated bacterium, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54: 2155-2162. Rojas Martinez R I, E Zavaleta Mejia, I M Lee, A Aragon Garcia (2009) Identificación de un aislamiento del grupo 16SrIII, Candidatus Phytoplasma pruni en plantas y semillas de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) en México. Agrociencia. 43: 851-860. Saleem M, M Arshad, S Hussain, A S Bhatti (2007) Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34: 635-648. Sarabia Ochoa M, R Madrigal Pedraza, M Martínez Trujillo, Y Carreón Abud (2010) Plantas, hongos micorrízicos y bacterias: su compleja red de interacciones. Biológicas. 12: 65-71. Schwachtje J, S Karojet, I Thormählen, C Bernholz, S Kunz, S Brouwer, M Schwochow, K Kohl, J T Van Dongen (2011) A Naturally associated rhizobacterium of Arabidopsis thaliana induces a starvation-like transcriptional response while promoting growth. PLoS ONE. 6: e29382. Shankar Singh J, V C Pandey, D P Singh (2011) Efficient soil microorganisms: A new dimension for sustainable agriculture and environmental development. Agriculture, Ecosystems and Environment 140: 339-353. Srivastava S, V Chaudhry, A Mishra, P Singh Chauhan, A Rehman, A Yadav, N Tuteja, C S Nautiyal (2012) Gene expression profiling through microarray analysis in Arabidopsis thaliana colonized by Pseudomonas putida MTCC5279,a plant growth promoting rhizobacterium. Plant Signaling & Behavior 7: 1–11.

Capítulo IX. Uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal para aumentar la productividad de amaranto de grano

Valenzuela Soto J H, M G Estrada Hernández, E Ibarra Laclette, J P Délano Frier (2010) Inoculation of tomato plants (Solanum lycopersicum) with growth-promoting Bacillus subtilis retards whitefly Bemisia tabaci development. Planta. 231: 397-410. Van Loon L C (2007) Plant responses to plant growth-promoting rhizobacteria. European Journal of Plant Pathology 119: 243-254 Verhagen B W M, J Glazebrook, T Zhu, H S Chang, L C Van Loon, C M J Pieterse (2004) The transcriptome of rhizobacteria-induced systemic resistance in Arabidopsis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17: 895–908. Verma J P, J Yadav, K N Tiwari, Lavakush, V Singh (2010) Impact of plant growth promoting rhizobacteria on crop production. International Journal of Agricultural Research. 5: 954-983. Villegas Espinoza J A, E O Rueda Puente, B Murillo Amador, M E Puente, O Grimaldo Juárez, S M Avilés Marín, J F Ponce Medina (2010) Efecto de la inoculación de Azospirillum halopraeferens y Bacillus amyloliquefaciens en la germinación de Prosopis chilensis. Tropical and Subtropical Agroecosystems. 12: 19-32. Vrbnicanin S, L J Jovanovic, D Bozic, V Raicevic, D Pavlovic (2008) Germination of Iva xanthifolia, Amaranthus retroflexus and Sorghum halepense under media with microorganisms. Journal of Plant Diseases and Protection. XXI: 297-302 Wang Y Q, Y Ohara, H Nakayashiki, Y Tosa, S Mayama (2005) Microarray analysis of the gene expression profile induced by the endophytic plant growth-promoting rhizobacteria, Pseudomonas fluorescens FPT9601-T5 in Arabidopsis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18: 385-396.

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Capítulo X

Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus spp.) INDUCED RESISTANCE AGAINST BACTERIAL PATHOGENS IN GRAIN AMARANTH (Amaranthus spp.)

Kena Casarrubias Castillo1 y John P. Délano Frier1§ 1Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas, (Cinvestav-Unidad Irapuato) Km 9.6 del Libramiento norte carretera Irapuato-León. Apartado Postal 629, C.P. 36821, Irapuato, Gto., México. §Autor de correspondencia: [email protected]

RESUMEN Para identificar bacterias patógenas en amaranto, se tomaron muestras de hoja de 25 genotipos de amaranto con síntomas de infección, que representaban cuatro especies diferentes y un híbrido, los cuales se cultivaron durante tres años consecutivos (2007-2009) en un campo experimental situado en el municipio de Irapuato, Guanajuato. Se identificó a Amaranthus cruentus cv. Tarasca como genotipo resistente y a A. hypochondriacus cv. Revancha como genotipo susceptible a la infección por una cepa virulenta de Pseudomonas sp. Así mismo, se exploró el uso de tratamientos con benzotiadiazol, un análogo del ácido salicílico, metil jasmonato y el contacto con una cepa avirulenta de P. syringae, como estrategias de control contra infecciones con cepas virulentas de la misma especie. Además, para poder definir el posible origen de la resistencia inducida contra bacterias patógenas en cada tratamiento, se eligieron 63 genes candidatos, seleccionados a partir de bibliotecas substractivas o del análisis de expresión in silico derivado del transcriptoma de A. hypochondriacus. Después de un tamizado por Northern blots reversos, se eligieron un total de ocho genes por tratamiento, incluyendo lipoxigenasa 2, aglutinina, catalasa y se validaron

por ensayos de expresión tipo Northern Blot. En un futuro mediante PCR cuantitativo, se evaluará la resistencia a la infección contra patógenos bacterianos en plantas de amaranto naturalmente resistentes y en plantas susceptibles previamente sensibilizadas o inmunizadas por los tratamientos mencionados anteriormente. Palabras clave: Amaranto, benzotiadiazol, defensa, metil jasmonato, patógenos bacterianos, resistencia inducida, sensibilización. ABSTRACT Symptoms of bacterial disease were observed in leaves of amaranth plants in an experimental field located in Irapuato, Guanajuato, Mexico. In order to understand the mechanisms by which amaranth might cope with the disease, we isolated a number of bacterial pathogens, including Pseudomonas sp. We also identified resistant and susceptible genotypes to infection by a virulent Pseudomonas strain. A total of 25 genotypes of amaranth, comprising 4 different species and a hybrid, were tested in a three-year field study (2007-2009). We identified Amaranthus cruentus cv. Tarasca and A. hypochondriacus cv. Revancha as resistant and susceptible genotypes to infection with a virulent strain of P. syringae, 129-144

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respectively. In addition, plants treated with benzothiadiazole, an analog of salicylic acid, or methyl jasmonate and exposed to an avirulent strain of Pseudomonas were tested as a means for the control of a virulent strain of the same bacteria. The expression of 63 genes, selected from subtractive libraries and from an in silico analysis of expression based on transcriptomic data generated in A. hypochondriacus, was tested to determine the possible origin of induced bacterial resistance in each treatment. Eight genes per treatment were selected after a reverse Northern Blot (NB) screening, including a lipoxygenase 2, catalase, agglutinin and pathogenesis-related proteins. These were validated by a NB analysis The expression patterns of these genes will be determined in the near future by qPCR in untreated resistant and treated susceptible amaranth genotypes challenged with a bacterial pathogen. This will be done in order to test their contribution to natural and/or induced resistance. Key words: Amaranth, bacterial pathogens, benzothiadiazole, defense, induced resistance, methyl jasmonate, priming. INTRODUCCIÓN Las plantas están continuamente expuestas al ataque de diferentes microorganismos patógenos. La mayoría de los patógenos invade solo una parte específica de la planta y produce una serie de síntomas característicos como necrosis, manchas, putrefacciones, entre otros. Para evitar el ataque de estos patógenos, la planta debe ser capaz de detectarlos rápidamente, con el objeto de evitar su proliferación (Abramovitch et al., 2006) Las plantas pueden perder porciones de su estructura sin que ello traiga consigo problemas de supervivencia, pudiendo inducir la muerte de órganos invadidos por el patógeno para evitar la propagación de éste al resto de la planta. Este mecanismo de defensa es conocido como respuesta hipersensible (RH), y es uno de los mecanismos más utilizados por las plantas para evitar la invasión de los organismos patógenos (Hammond-Kossack y Jones, 1996). Algunos patógenos potenciales activan en la planta huésped una rápida respuesta de defensa, que 130

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es muy específica. El modelo original postulaba que esto ocurre cuando el patógeno porta un gen de avirulencia (Avr) que interacciona específicamente con el correspondiente gen de resistencia del huésped (R). Este mecanismo se conoce con el nombre de interacción “gen por gen” (Flor, 1971). Hoy en día, se ha modificado este concepto de manera que no es solamente el reconocimiento directo del producto del gen de avirulencia del patógeno, o efector, por los genes de resistencia de la planta (que en su mayoría son receptores polimórficos del tipo NB-LRR), sino también cambios (e.g. fosforilación, proteólisis parcial, cambios de configuración, interacciones proteína-proteína, etc.) producidos por el efector en una o varias proteínas clave de la planta huésped. Este reconocimiento inicia la cascada de señalización y una re-programación transcripcional que da lugar a la respuesta inmune generada por efectores o ETI, por sus siglas en inglés, cuya característica distintiva es la muerte celular localizada conocida como la reacción hipersensible o HR que impedirá la invasión de la planta por el patógeno, (Jones y Dangl, 2006; McHale et al., 2006; Hann et al., 2010; Dodds y Rathjen, 2010). Entre las respuestas controladas por una rápida activación transcripcional está la de los llamados “genes de defensa o de respuesta a patógenos, que dan lugar a la resistencia sistémica adquirida (RSA), la cual es efectiva contra un amplio espectro de patógenos (Ryals y col., 1996; Jones y Dangl, 2006). La RSA es dependiente de la acumulación endógena de ácido salicílico (AS) y está asociada con la expresión coordinada de un grupo de genes específicos (Ward et al., 1991). Estos genes RSA-específicos incluyen a los conocidos como proteínas relacionadas a patogénesis o PR (del inglés Pathogenesis-Related proteins) (Van Loon, 1985) y ésta última es reportada para muchas interacciones planta-patógeno, de hábito más bien biotrófico o hemi-biotrófico, que resultan en una resistencia de amplio espectro. El ácido jasmónico (AJ) medía las respuestas de defensa contra insectos herbívoros y patógenos necrotróficos, conlleva en último lugar a la expresión de genes involucrados en defensa, como por ejemplo defensinas (PDF1.2) o proteínas antifúngicas, como osmotina y tionina, inhibidores de proteinasas (IP), lectinas y otro tipo de genes PR.

Capítulo X. Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus sp.)

El amaranto es una planta dicotiledónea C4, perteneciente a la familia de las amarantáceas. Sólo tres especies de amaranto se utilizan actualmente para la producción de grano: A. cruentus, A. caudatus y A. hypochondriacus. Se han reportado algunos casos de bacteriosis en amarantos de grano y silvestres. Costea et al. (2003) indicaron que A. retroflexus, un amaranto silvestre considerado como maleza agresiva en muchos cultivos comerciales por su resistencia a herbicidas que inhiben el fotosistema II (http:// www.weedscience.org/In.asp), también es hospedante alterno asintomático de numerosos patógenos bacterianos que pueden llegar a infectarlos, como Clavibactacter michoganensis, Xanthomonas phaseoli, X. campestris, P. viridiflaba y P. syringae patovares tomato y syringae. Así mismo, en México A. hybridus se ha reportado como hospedante de X. campestris pv. phaseoli (Huerta y Rodríguez, 1994). Sin embargo, los patógenos que afectan el amaranto son principalmente de origen fungoso u oomiceto, entre las que sobresalen la roya blanca causada por Albugo bliti y podredumbres de hojas, inflorescencias y tallo causadas por Choanephora cucurbitarum (“pudrición húmeda del tallo”) Pythium aphanidermatun (“secadera”), Macrophoma spp. (“mancha negra del tallo”) y Thecaphora amaranthi (“carbón del amaranto”) (Rojas-Martínez et al., 2009). Otros estudios indican que las heridas o insectos vectores barrenadores de tallo son necesarios para las infecciones fungosas en plantas de amaranto (Blodgett et al., 2002; 2004). La principal enfermedad viral es Amaranthus Mottle Virus, que reduce el crecimiento, retarda la floración y afecta negativamente la producción de grano (Sánchez et al., 1990), mientras que la fitoplasmosis ha sido recientemente identificada como una enfermedad de amaranto, causando síntomas como la “escoba de bruja”, que se manifiesta con la prolilferación de brotes y reducción de entrenudos, clorosis, deformación en el meristemo apical y filodia (Ochoa-Sanchez et al., 2009; Rojas-Martínez et al., 2009. Poco se sabe acerca de los genes que se expresan como parte de las respuestas defensivas contra patógenos en amaranto. Sin embargo, se han realizado algunos esfuerzos para generar conocimiento sobre las proteínas y genes que están involucrados en la defensa.

Entre éstos sobresalen los inhibidores dobles de alfa amilasa y tripsina, las cistatinas, una lectina tipo aglutinina, péptidos antimicrobianos (de unión a quitina clase I) y proteínas inactivadoras de ribosomas como las Amarandinas 1 y 2 (Broekaert et al., 1992; Valdés-Rodríguez et al., 2007; Chagolla-López et al., 1994; Wu et al., 2006; Roy et al., 2006). Recientemente, se generaron bancos sustractivos y bibliotecas de ADNc a partir de plantas de A. hypochondriacus y A. cruentus sometidos a distintas condiciones de estrés (Casarrubias-Castillo 2009, Navarro Meléndez, 2009. Con los resultados de esta primera estrategia experimental se incrementó significativamente la identificación del número de genes defensivos identificados en amaranto (Fomsgaard et al., 2010). El posterior análisis transcriptómico del amaranto de grano, permitió la identificación de miles de genes inducidos en respuesta a infección bacteriana, herbivoría por insectos masticadores, salinidad y/o sequía (Délano-Frier et al., 2011). Esta información sirvió como base para la selección de los genes de defensa contra bacterias patógenas inducidos por diferentes evocadores químicos, por una interacción planta-patógeno avirulenta o presentes en genotipos de amaranto naturalmente resistentes, que se describirán con más detalle en el resto de este capítulo. MATERIALES Y MÉTODOS Este estudio tuvo como objetivos principales identificar genotipos de amaranto susceptibles y resistentes a infección por patógenos bacterianos e identificar aquellos genes responsables de la resistencia natural o inducida a estos patógenos. Para la inducción de resistencia se exploraron tres opciones: i) la aplicación de benzotiadiazol (BTH), un análogo del ácido salicílico capaz de inducir la RSA contra patógenos biotróficos y hemi-biotróficos; ii) la aplicación de metil jasmonato, para la inducción de respuestas de defensa contra insectos masticadores, algunos insectos chupadores y patógenos de hábito necrotrófico, y iii) el contacto con una bacteria avirulenta para la inducción de una RSA similar a la inducida por BTH. Para la identificación y selección de genes de resistencia inducidos en cada uno de los tratamientos, se utilizó la información generada por bibliotecas substractivas derivadas K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

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de plantas sometidas a varias condiciones de estrés (a)biótico (Fosmsgaard et al., 2010) y por el transcriptoma de novo de A. hypochondriacus (Délano-Frier et al., 2011). Por otro lado, el aislamiento de posibles patógenos bacterianos de amaranto se realizó en plantas de 25 diferentes genotipos de amaranto que mostraban síntomas de infección bacteriana, como clorosis, necrosis extendida o localizada, manchado, etc. Las plantas se colectaron de un campo experimental, ubicado en la localidad de “Valencianita” municipio de Irapuato Guanajuato (24° 44´ 44´´ LN y 101° 19´ 19´´ LO) a 1745 msnm, durante tres años consecutivos (2007-2009). Los especímenes con síntomas se llevaron al laboratorio para determinar por técnicas convencionales la presencia de bacterias patógenas. Se obtuvieron varios aislados de bacterias, los cuales posteriormente fueron analizados de forma individual para verificar su virulencia en plantas de amaranto identificadas previamente como susceptibles. Dentro de los 25 genotipos de amaranto analizados, se encontraban varios cultivares de especies productoras de grano y follaje, como A. caudatus, A. cruentus y A. hypochondriacus, y A. pumilus y A. mantegazzianus, respectivamente. En el estudio también se incluyó un híbrido de A. cruentus y A. hypochondriacus y A. hybridus, está última es una especie silvestre utilizada en ocasiones para consumo humano (Tabla 1). Para los experimentos en invernadero y cuarto de crecimiento, las semillas de amaranto se colocaron a una profundidad de 1 cm en tierra de germinación estéril compuesta por pasta de coco y sustrato de uso general en partes iguales. Se mantuvieron en cuarto de crecimiento con fotoperiodo 16 h luz y 8 h de oscuridad, a una temperatura de 25 ± 2°C y 80% de humedad relativa. A los 10 días de crecimiento se trasplantaron a macetas con capacidad del 1.3 L con un sustrato compuesto por la mezcla de SunShine Mix 3, tierra de hoja, tierra lama, vermiculita y perlita en relación 3:2:1:1:1 y se mantuvieron bajo las mismas condiciones. Las plantas fueron regadas diariamente con agua y se fertilizaron 15 días después del trasplante. Se usaron 10 plantas de cada variedad para los pruebas de patogenicidad para ello se empleó un aislado de Pseudomonas sp., identificada bioquímica y molecularmente 132

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como P. argentinensis. También se usaron cepas de colección de P. syringae pv. syringae 3525 y P. syringae pv. tabaci PTBR2004 (donadas por el Departamento de Entomología y Patología de Plantas de la Universidad Estatal de Oklahoma), cuya caracterización en el laboratorio indicó que las cepas establecieron una interacción avirulenta y virulenta con amaranto, respectivamente. Los ensayos de infección se hicieron con cultivos de estas especies incubados por 24 h a 28°C en medio KB para Pseudomonas, se empleo la tecnología descrita por ValenzuelaSoto et al. (2011). Resumiendo, se tomó inoculo bacteriano y se disolvió en buffer de fosfatos estéril 0.5 M pH 7.0, hasta ajustarlo 1 x 106 Unidades Formadoras de Colonia/mL (UFC/ mL). El ensayo de infección se realizó en plantas de 40 días, los 25 genotipos se inocularon por inflitración con 40 µL de la solución bacteriana utilizando una jeringa de 1 mL. También se hicieron inoculaciones por aspersión uniforme de 2 mL de inóculo bacteriano sobre el follaje de las plantas; las plantas control fueron infiltradas o asperjadas sólo con buffer de fosfatos estéril. A los 10 días después de la inoculación se tomaron fotografías a cada una de las hojas que fueron infiltradas. Posteriormente, las fotografías se analizaron con el programa Assess 1.4: Image Analysis Software for Plant Disease Quantification (Lamari, American Phytopathological Society), que cuantifica el porcentaje de área afectada. Para graficar el área afectada de cada genotipo se dividió el valor del área afectada por la bacteria entre el área del control no infectado. Para los diferentes tratamientos de inducción de resistencia se utilizaron plantas de 5 semanas de edad y se les aplicó S-methil benzo [1, 2, 3] thiadiazole-7-carbothiate (acibenzolarS -metil o BTH), un análogo del AS producido por Syngenta, comercializado con el nombre de BION® en Europa o ACTIGARDTM en los Estados Unidos (Kuĉ, 1982; Riveros-Angarita, 2011) o metil jasmonato (MeJA; SigmaAldrich Chemical). El ensayo de resistencia por interacción planta-patógeno se hizo siguiendo el protocolo de infección bacteriana mencionado anteriormente. El BION® se asperjó como solución a 1.5 mM disuelto en agua, mientras que las plantas control fueron asperjadas con agua estéril. El MeJA se aplicó en forma localizada con 16 gotas distribuidas uniformemente sobre

Capítulo X. Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus sp.)

la hoja (dos por hoja); en total, se aplicaron 250 µg de MeJA disuelto en Triton a 0.01% y etanol por planta; las plantas control sólo recibieron etanol y Triton a 0.01%. Para el análisis estadístico de los datos se usó el programa “Vassar Stats” disponible en línea: http://vassarstats.net/. Se usó la prueba “t de student” para dos muestras independientes con P ≤ 0.01. Los genes se seleccionaron a partir de las bibliotecas sustractivas de ADNc (Casarrubias-Castillo, 2009) y del análisis de expresión in silico del transcriptoma de novo de A. hypochondriacus (Délano-Frier et al., 2011). De éstos últimos, se seleccionaron aquellos genes inducidos en el tratamiento de infección con bacteria, y algunos otros que también se seleccionaron para hervivoría por insectos, ya que los genes expresados en ese tratamiento probablemente estén mediados por AJ. También se seleccionaron genes que codifican a proteínas de respuesta a patogénesis y otros genes relacionados con defensa (Délano-Frier et al., 2011). Además, se seleccionaron tres genes de expresión constitutiva o de mantenimiento celular (usados como referencia en todos los ensayos de expresión), genes involucrados con la generación de especies reactivas de oxígeno y otros relacionados con la síntesis del ácido jasmónico e inducidos por jasmónico (e.g. inhibidores de proteasas y jacalinas) y otros involucrados en la RSA (e.g. un gen relacionado con la respuesta hipersensible). La lista completa de genes se presenta en la Tabla 2. De estos 63 genes se hizo una selección adicional para cada uno de los tratamientos mediante un tamizado realizado mediante ensayos de expresión tipo Northern blot reverso, seguidos por ensayos de confirmación por ensayos tipo Northern blot. Para el análisis de expresión tipo Northern blot se colectaron hojas a las 12 y 24 h post inoculación. Se utilizaron 10 μg de ARN en un gel desnaturalizante. El ARN se trasfirió a una membrana de nylon (Hidrobond-N+); una vez transferido el ARN, se fijó a una la membrana de nylon durante cuatro minutos en un Crosslinker de luz UV. Posteriormente, se llevó acabo la pre-hibridacion de la membrana a 65°C con buffer de hibridación. Para la obtención de las sondas, se partió de la síntesis del DNAc de 1 μg de ARN total, 1 μL de Oligo dT, 1μL de la

mezcla de dNTPs y se llevó a un volumen final de 12 μL con agua destilada estéril. Se dejó a una temperatura de 65°C durante 5 min. Después se le agregaron 4 μL de buffer 5 ×, 2 μL de DTT 0.1 M y 1 μL de la enzima transcriptasa reversa. Se dejó incubar 50 min a 42°C y posteriormente 15 min a 70°C. Para las reacciones de PCR, se tomó 4 μL del ADNc y se le agregó la mezcla de reacción (agua destilada estéril, buffer, dNTPs. MgCl, Taq polimerasa y los oligonucleótidos correspondientes). Para todos los genes, se utilizó el siguiente programa: 94°C, tres minutos; 40 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 94°C, por 30 s, temperatura de alineamiento correspondiente para cada gen por 30 s, y temperatura final 72°C de 30 a 45 s, seguidos por una extensión final a 72°C de diez minutos. La reacción de marcaje de las sondas se realizó de acuerdo a las indicaciones del proveedor (RediPrime II DNA Labeling System, INVITROGEN). Se partió de 100 ng de ADNc, se desnaturalizó a 95°C por 5 min y se agregó 1 µL de dATP, dGTP, dTTP y dCTPα32; 20 µL de cebadores de secuencia aleatoria; 1 µL de la enzima Klenow y 5 µL de agua estéril. Esta mezcla se dejó incubar a 37°C por diez min. Para los lavados y exposición, las membranas se colocaron en una solución con SSC 2×/ SDS 0.1% por 20 min a temperatura ambiente con agitación suave, seguido de SSC 1×/ SDS 0.1 % por 15 min a 65ºC y posteriormente con SSC 0.1×/ SDS 0.1% a 65°C el tiempo necesario para eliminar fondos en la membrana. Las membranas se colocaron dentro de un plástico evitando burbujas y retirando el exceso de solución con papel absorbente. En el cuarto oscuro se expuso una película de rayos X (Kodak XOMATL LS; Eastman Kodak Co.) por encima del plástico que contenía la membrana; ésta se colocó dentro de un “cassette” de exposición y se guardó a -80 ºC el tiempo necesario. Finalmente, se descongeló el “cassette” y se reveló la película en cuarto oscuro. Para los ensayos de Northern blot reverso se utilizó como sonda el ADNc total obtenido de cada tratamiento (i.e. BTH, MeJA e interacción avirulenta) a partir de 5 µg de ARN. Del ADNc se marcó con dCTPα32 como se mencionó anteriormente y en las membranas se hizo una reacción de PCR para cada gen y se fijaron en una membrana 5 μL del producto de PCR. Se llevó a cabo la hibridación por 18 h a K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

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65°C. Los lavados de la membrana se realizaron con una solución de SSC 2×/ SDS 0.1% por 20 min a temperatura ambiente con agitación suave y se expusieron por 24 h como se mencionó anteriormente. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En los ensayos de infección de los 25 genotipos de amaranto se logró reproducir síntomas de clorosis y necrosis observados en campo en etapas tempranas de desarrollo de las plantas, aunque la severidad fue menor. Se identificó a tres genotipos de A. cruentus, R-127, Amont y Tarasca, como resistentes a la infección bacteriana (Figura 1). En comparación con A. cruentus, los genotipos de A. hypochondriacus presentaron lesiones necróticas; mientras que, los cultivares Nepal 2071, Nepal 2255 e India 38040, presentaron lesiones cloróticas (Figura 2). El único genotipo resistente a la infección por P. argentinensis fue el cultivar 280 FK-FH1, una planta de estatura corta y precoz. En los cultivares Nepal 2071, Nepal 2255 e India 38040 se observó infección en las hojas infiltradas, motivo por el cual no se consideraron cultivares resistentes, además, de acuerdo al análisis estadístico no se encontró diferencia significativa de la susceptibilidad a la infección por el patógeno entre dichos cultivares; la explicación radica en que la media del área dañada resultó muy alta debido a la alta susceptibilidad al daño mecánico generado al momento de infiltrar mostrado por estos genotipos. En las otras especies de amaranto como A. pumilus, A. caudatus y A. hybridus se presentaron lesiones cloróticas, mientras que en A. mantegazzianus y el amaranto híbrido se presentó necrosis (Figura 3). De estos genotipos, el único resistente fue A. caudatus cv. C48A. En la Figura 4 se observa el porcentaje de daño en los 25 genotipos de amaranto. Los cultivares de A. hypochondriacus muestran un mayor porcentaje de área afectada, mientras que en los genotipos de A. cruentus el porcentaje es menor en 4.5%. Según estos datos se puede inferir con cierto grado de certeza que A. cruentus es más resistente que A. hypochondriacus a la bacteriosis. Para evaluar las vías de defensa dependientes del ácido salicílico y ácido jasmónico se aplicaron tratamientos como BTH un producto en el mercado análogo al ácido 134

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salicílico y metil jasmonato, el éster metílico del ácido jasmónico. Adicionalmente se infectaron plantas de amaranto con P. syringae pv. syringae 3525 para evaluar genes durante una interacción incompatible (ver Figura 5B). El BTH ha mostrado ser un inductor de la SAR y de la expresión de proteínas de respuesta a patogénesis (Gorlach et al., 1996). En amaranto, los genes inducidos con BTH se muestran en la Figura 6. Se observó un incremento en la expresión de genes involucrados en la organización de la pared celular como una extensina. Al mismo tiempo se observó la expresión de un inhibidor de pectin metilesterasas, que podría tener una función relacionada con la pared celular, aunque algunos autores atribuyen este mecanismo a la función de regulación de respuestas defensivas, sobre todo las que involucran daño, por la inhibición de la generación de oligogalacturónidos biológicamente activos, capaces de iniciar una cascada de señalización (Doares et al., 1995; An et al., 2008; 2009). En el 2010, Maffi et al. encontraron un reforzamiento de la pared celular de plantas de frijol tratadas con BTH bajo la infección con Uromyces appendiculatus. En este estudio se observó la penetración de hifas sólo a través de los estomas y una acumulación de compuestos fenólicos y deposición de callosa en los sitios de daño por el patógeno. Por otro lado, en otro estudio en plantas de cacao tratadas con BTH se observó un incremento en el porcentaje de genes involucrados en la organización de la pared celular, síntesis de proteínas y un decremento en los genes involucrados en defensa y transporte (Verica, 2004), mientras que plantas de chile silenciadas en el gen CaPMEI1, el cual codifica para un inhibidor de pectin metilesterasas, mostraron un aumento en la susceptibilidad al ser inoculadas con X. campestris pv. vesicatoria, y la sobreexpresión de éste mismo gen aumentó la resistencia contra P. syringae pv. tomato (An et al., 2008). En la Figura 6, se observa también un incremento en la expresión de un gen que codifica para una proteína de transporte vesicular SNARE. Estudios recientes han revelado la existencia de una maquinaria secretora comprometida con la ejecución de las respuestas inmunes extracelulares. Como resultado de diferentes investigaciones se han descrito una compuesta

Capítulo X. Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus sp.)

por asociados de vesículas y una red de proteínas SNARE mediada por las vías de exocitosis, que al parecer impulsan la secreción de cócteles antimicrobianos que contienen proteínas, moléculas pequeñas, células y módulos de pared en el espacio apoplástico (Collins et al., 2003; An et al., 2006; Lipka et al., 2008). Adicionalmente, se indujo en este tratamiento un gen que codifica para una arginasa. En arabidopsis, la arginasa se acumula a nivel proteico al interactuar con P. syringae pv. tomato DC3000 (Jones et al., 2006), mientras que en plantas de jitomate se ha observado su inducción por daño mecánico y metil jasmonato. Además, este gen sobre regula su expresión en plantas retadas con este patógeno virulento (Chen, 2004). Alternativamente, la arginasa juega un rol importante en la regulación del metabolismo de la L-arginina a óxido nítrico (NO) y se cree que desempeña un papel en la señalización en interacciones compatibles e incompatibles y podría estar también involucrada en la re-movilización de nitrógeno durante las respuestas de defensa en plantas (Jones et al., 2006). En el tratamiento con BTH se indujo igualmente un gen que codifica para una proteasa aspártica, una clase de endopeptidasa que se activa a pH ácido y que se ha comprobado que tiene actividad antimicrobiana Esta enzima se acumula en grandes cantidades en cultivares de papa infectados con P. infestans (Guevara, 2002). Por otro parte, la jacalina se expresó en todos los tratamientos (Figuras 6, 7 y 8). Estos compuestos son un subgrupo de proteínas con uno o más dominios de lectinas asociados con estímulos, ya sean bióticos o abióticos, y su relación con la resistencia es poco entendida. Sin embargo, se ha observado su inducción en trigo bajo infecciones patogénicas y después del tratamiento con fitohormonas como AJ y AS (Xiang et al., 2011). En el tratamiento con metil jasmonato (Figura 7) se indujo la expresión de genes involucrados en la explosión oxidativa, como la catalasa, la glutatión-S-transferasa y una de las dos ascorbato peroxidasas analizadas. La inducción de éste tipo de proteínas en arroz fue documentada por Rakwa (1999), y sustentada por el trabajo de Miché (2005), que indica que AJ posiblemente esté involucrado en la mediación de la respuesta hipersensible. Al contrario, en el tratamiento con P. syringae

pv. syrinage (interacción avirulenta, Figura 8), se observa una represión de las dos ascorbato peroxidasas, y de otros genes involucrados ya sea en la síntesis o respuesta a AJ, como la aleno oxido ciclasa, una cisteina proteasa, y lipoxigenasas. Interesantemente, algunos de éstos genes son inducidos por los tratamientos con MeJA. Lo que sugiere que la interacción avirulenta puede estar reprimiendo los genes de respuesta a AJ para potenciar la señalización por AS. Esto contrasta con lo que sucede con la infección con ciertos patovares virulentos de Pseudomonas que producen coronatina como factor de virulencia para activar las ruta de señalización del AJ y promover la infección (Block et al., 2005; Zheng et al., 2012). Es importante recalcar que este tamizado se realizó solamente a las 24 horas pos-tratamiento. Pronto se reforzará y validará esta información haciendo análisis a diferentes tiempos después de la aplicación de los diferentes tratamientos. También se tiene pensado evaluar el efecto que estos tratamientos pudieran tener sobre el crecimiento y productividad de amaranto. Datos preliminares indican que el BTH afecta negativamente ambos parámetros, por lo que su posible aplicación para inducir resistencia a patógenos en amaranto podría verse comprometida. En los ensayos de infección con Pseudomonas sp., tanto en A. cruentus cv. Tarasca, considerada como resistente a este patógeno, como en A. hypochondriacus cv. Revancha, que resultó medianamente susceptible (Figura 4), se evaluó la expresión la lipoxigenasa, aglutinina y catalasa a las 12 y 24 h post inoculación. Los resultados mostrados en la Figura 9, indican que la expresión de los tres genes fue más rápida e intensa en A. cruentus que en A. hypochondriacus, lo que sugiere que pueden estar contribuiyendo a la resistencia en esta especie. Como apoyo a lo anterior está la función clave de las lipoxigenasas en la síntesis de hidroperóxidos, que son utilizados no sólo para la síntesis de AJ, sino otras oxilipinas, volátiles y metabolitos antimicrobianos que funcionan como señales y/o en la defensa de plantas (Allmann et al., 2010). Ejemplo de esto es la acumulación de POTLX-3 (un gen que codifica para una lipoxigenasa) en plantas de papa tras la aplicación de etileno, MeJA y el reto con cepas virulentas y avirulentas de Phytophthora infestans, un oomiceto causante K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

del tizón tardío de la papa (Kolomiets et al., 2000). De acuerdo a estos autores, la expresión de este gen fue indicativa de que las defensas mediadas por AJ habían sido activadas. Así mismo, la aglutinina de amaranto es una lectina, de la cual se ha documentado su papel defensivo en contra áfidos (Wu et al., 2006), Mientras que la expresión de catalasa sugirió la activación de un proceso de regulación de un posible exceso de especies reactivas de oxígeno causado en respuesta a la infección, ya que esta enzima puede catalizar la descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, aunque también puede promover la oxidación con H2O2 de varios metabolitos, incluyendo aldehídos, alcoholes y compuestos fenólicos (Mhamdi et al., 2010). Esta función está en aparentemente contradicción con la conocida función del peróxido de hidrógeno en la inhibición del crecimiento de patógenos y en la activación de ciertas vías de transducción de señales que inducen respuestas de defensa. Por ello, la importancia de la inducción/ inhibición de catalasas durante la patogénesis ha sido centro de debate. La inhibición de catalasa por AS fue propuesta en un principio como uno de

los mecanismos por medio de los cuales el AS mediaba respuestas en tabaco. Sin embargo, se ha cuestionado la habilidad del AS para inhibir específicamente a la catalasa in vivo, ya que las concentraciones requeridas para la inhibición in vitro son muy elevadas, además de que estos mecanismos pueden llevarse a cabo únicamente en compartimentos celulares específicos. Además, plantas transgénicas de tabaco deficientes en Cat1 y Cat2 no se vieron afectadas en su respuesta relacionada a patogénesis (PR) bajo condiciones normales de crecimiento, lo que implicaba que la inhibición de catalasa no es suficiente para generar una señal de activación de respuestas PR. Incluso se encontró que plantas de tabaco deficientes en Cat1 fueron más susceptibles a infección (Dat et al., 2000). CONCLUSIONES Hasta el momento todo indica que el tipo de síntomas y magnitud de las infecciones producidas por patógenos bacterianos biotróficos en amaranto es altamente dependiente de la especie, ya que A. cruentus resultó ser mucho

Cuadro 1. Genotipos de Amaranto incluidos en el presente estudio.

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 * Obtenidas del banco de germoplasma conservado en la Universidad Estatal de Iowa (Iowa State University, ISU)

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K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

Capítulo X. Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus sp.)

Cuadro 2. Genes seleccionados para evaluar la expresión en plantas de amaranto con diferentes tratamientos.

1Tomado de las bibliotecas substractivas; el resto, del transcriptoma. 2Genes constitutivos de referencia

Amaranthus cruentus CV MEXICANO CONTROL INFECTADA

CV R127 CONTROL INFECTADA

CV TARASCA CONTROL

INFECTADA

CV AMONT CONTROL INFECTADA

CV DON LEÓN CONTROL

INFECTADA

CV GUIEM CONTROL INFECTADA

CV CANDIL CONTROL

INFECTADA

Figura 1. Ensayo de infección en A. cruentus con Pseudomonas sp.

K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

137

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Amaranthus hypochondriacus CV REVANCHA

CV NUTRISOL

CONTROL INFECTADA

CONTROL INFECTADA

CV ROSITA

CV MORELOS CONTROL INFECTADA

CV ARTASA

CONTROL INFECTADA

CONTROL

CV TULYEHUALCO

INFECTADA CONTROL

CV NEPAL 2071 CONTROL

CV 280-FK CONTROL

INFECTADA

CV SAN ANTONIO CONTROL INFECTADA

CV HUIXCAZDHÁ

INFECTADA CONTROL

CV NEPAL 255 CONTROL INFECTADA

INFECTADA

INFECTADA

CV TEHUACÁN CONTROL INFECTADA

CV INDIA CONTROL INFECTADA

Figura 2. Reacción de infección en A. hypochondriacus con Pseudomonas sp.

Otras especies de Amaranthus A. pumilus

A. caudatus

CV RAFIN CONTROL

Híbrido

CV 48A

INFECTADA

CONTROL

A. mantegazzianus CV DON JUAN CONTROL

INFECTADA

CV K535

INFECTADA

CONTROL

INFECTADA

A. hybridus CV ECUADOR CONTROL

INFECTADA

Figura 3. Reacción de infección en A. pumilus, A. caudatus, amaranto híbrido, A. mantegazzianus y A. hybridus con Pseudomonas sp.

138

K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

Capítulo X. Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus sp.) Ensayo de infección con Pseudomonas argentinensis

40.00

25.00 20.00 15.00

11.96

10.10

10.00 5.00 0.00

8.12 4.35

V1

2.68 2.34

V2

V4

3.82 1.64 V6

V9

V13

V14

4.75 1.97

V7

V8

5.85

6.54

6.17

4.13

1.74

1.46

V10 V12V V15 16 V18 V19 Genotipos A. hypochondriacusA

V20V V21

22

2.44

V23

1.31 V24

5.86

2.39 2.92

V3

V5

. caudatus

V11

V17

V25

A.

ma nte

A. cruentus

3.25 3.10

6.39 6.96

H íb rid o ga zzi an us A. hy bri du s

Proporción de área afectada

35.00 30.00

Figura 4. Gráfica del porcentaje de daño en diferentes genotipos de Amaranto infectados con Pseudomonas sp.

A)

B)

C)

Figura 5. G. Interacción avirulenta y virulenta en amaranto. A) Plantas control B) Interacción avirulenta con P. syringae pv. syringae 3525. C) Interacción virulenta con P. siringae pv tabaci PTBR2004. K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

139

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Figura 6. Ensayo tipo Northern blot reverso de plantas tratadas con BTH. T= tratamiento, Ct= controles. El ensayo se realizó 24 h pos tratamiento. Para la identidad de los genes, referirse al cuadro No. 2.

Figura 7. Ensayo tipo Northern blot reverso de plantas tratadas con metil jasmonato. T = tratamiento, Ct = controles. El ensayo se realizó 24 h pos tratamiento.

Figura 8. Ensayo tipo Northern blot reverso de plantas tratadas con Pseudomonas syringae pv. syringae 3525. T = tratamiento, Ct = controles. El ensayo se realizó 24 h pos tratamiento.

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Capítulo X. Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus sp.)

Figura 9. Ensayos tipo Northern blot en plantas de A. cruentus cv. Tarasca y A. hypochondriacus cv. Revancha, infectadas con Pseudomonas sp.

más resistente que A. hypochondriacus y otras especies, incluyendo A. hybridus, una especie silvestre considerada por algunos estudiosos del amaranto como portador sano de bacterias patógenas, al igual que A. retroflexus. Los resultados también sugieren que muchas de las bacterias identificadas en amarantos enfermos son patógenos oportunistas, que podrían penetrar en la planta a través de heridas o por la acción de algún insecto vector. Además, se inició el análisis de todo un arsenal de genes de defensa provenientes del análisis transcriptómico de amaranto y de bibliotecas substractivas de ADNc con el fin de definir los mecanismos que utiliza esta planta para defenderse contra estos patógenos, ya sea naturalmente o mediante la inducción de respuestas defensivas por evocadores químicos o patógenos avirulentos. El posible costo fisiológico de la inducción de resistencia en cuanto a crecimiento y rendimiento de grano también está en proceso de evaluación para determinar la factibilidad de emplearlos en programas de agricultura sostenible, tal y como se ha hecho algunos cultivos comerciales, como trigo y arroz. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó gracias al apoyo brindado por la Unión Europea (Proyecto AMARANTH: FUTURE-FOOD, Contrato No. 032263), México Tierra de Amaranto A.C. y la Fundación Deborah Presser-Velder. Se agradece también

al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico otorgado a KCC para la realización de este proyecto (Beca No. 210116). BIBLIOGRAFÍA Abramovitch R B, J C Anderson, G B Martin (2006) Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7: 601-611. Allmann S, R Halitschke, R C Schuurink, I T Baldwin (2010) Oxylipin channelling in Nicotiana attenuata: lipoxygenase 2 supplies substrates for green leaf volatile production. Plant Cell & Environment 33: 2028-2040. An S H, H W Choi, J K Hong, B K Hwang (2009) Regulation and function of the pepper pectin methylesterase inhibitor (CaPMEI1) gene promoter in defense and ethylene and methyl jasmonate signaling in plants. Planta 230: 12231237. An S H, K H Soh, H W Choi, I S Hwang, S C Lee, B K Hwang (2008) Pepper pectin methylesterase inhibitor protein CaPMEI1 is required for antifungal activity, basal disease resistance and abiotic stress tolerance. Planta 228: 61-78.

K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

141

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Block A, E Schmelz, J B Jones, H J Klee (2005) Coronatine and salicylic acid: the battle between Arabidopsis and Pseudomonas for phytohormone control. Molecular plant pathology 6: 79-83. Blodgett J T, S V Louw (2004) Identification of fungi and fungal pathogens associated with Hypolixus haerens and decayed and cankered stems of Amaranthus hybridus. Plant Disease 88: 333-337. Blodgett J T, W J Swart (2002) Infection, colonization, and disease of Amaranthus hybridus leaves by the Alternaria tenuissima group. Plant Disease 86: 1199-1205. Broekaert W F, W Marien, F R G Terras, M F C Debolle, P Proost, J Vandamme, L Dillen, M Claeys, S B Rees, J Vanderleyden, B P A Cammue (1992) Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine glycine-rich domain of chitin-binding proteins. biochemistry 31: 43084314. Carlos Ochoa-Sánchez J, F I Parra-Cota, K Aviña-Padilla, J P Délano-Frier, J P MartínezSoriano (2009) Amaranthus spp.: a new host of “Candidatus Phytoplasma aurantifolia”. Phytoparasitica 37: 381-384. Casarrubias-Castillo K (2009) Resistencia a bacteriosis en genotipos de amaranto (Amaranthus spp.) de interés agronómico. Tesis de Maestría. Cinvestav Unidad Irapuato. Irapuato, Gto., México. 181p. Chagolla-Lopez A, A Blanco-Labra, P A, Sanchez, S Pongor (1994) A novel alphaamylase inhibitor from amaranth (Amaranthus hypocondriacus) seeds. The Journal of Biological Chemistry 269: 23675-23680. Chen H, B C McCaig, M Melotto, S Y He, G A Howe (2004) Regulation of plant arginase by wounding, jasmonate, and the phytotoxin coronatine. The Journal of Biological Chemistry 279: 45998-46007.

142

K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

Collins N C, H Thordal-Christensen, V Lipka, S Bau, E Kombrink, J L Qiu, R Huckelhoven, M Stein, A Freialdenhoven, S C Somerville, P Schulze-Lefert (2003) SNARE-proteinmediated disease resistance at the plant cell wall. Nature 425: 973-977. Costea M, S E Weaver, F J Tardif (2003) The biology of Canadian weeds. 130. Amaranthus retroflexus L., A. powellii S.Watson and A. hybridus L. Canadian Journal Plant Science. 84: 631-668. Dat J, S Vandenabeele, E Vranova, M Van Montagu, D Inze, F Van Breusegem (2000) Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cellular and Molecular Life Sciences 57: 779-795. Delano-Frier J P, H Aviles-Arnaut, K Casarrubias-Castillo, G Casique-Arroyo , P A Castrillon-Arbelaez, L Herrera-Estrella, J A Massange-Sanchez, N A Martinez-Gallardo, F I Parra-Cota, E Vargas-Ortiz, M G EstradaHernandez (2011) Transcriptomic analysis of grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) using 454 pyrosequencing: comparison with A. tuberculatus, expression profiling in stems and in response to biotic and abiotic stress. BMC Genomics 12: 363. Doares S H, T Syrovets, E W Weiler, C A Ryan (1995) Oligogalacturonides and chitosan activate plant defensive genes through the octadecanoid pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 4095-4098. Dodds P N, J P Rathjen (2010) Plant immunity: towards an integrated view of plantpathogen interactions. Nature Reviews. Genetics 11: 539-548. Flor H H (1971) Current status of gene-forgene concept. Annual Review of Phytopathology 9: 275-296.

Capítulo X. Inducción de resistencia contra patógenos bacterianos en amaranto (Amaranthus sp.)

Fomsgaard I, M Añon, A Barba de la Rosa, C Christophersen, K Dusek, J P Délano- Frier, J Espinoza Pérez, A Fonseca, D Janovská, P Kudsk, R Labouriau, M Lacayo-Romero, N Martínez, F Matus, K Matusová, S Mathiassen, E Noellemeyer, H, Pedersen, H Stavelikova, S Steffensen, R de Troiani, A Taberner (2010) Adding Value to Holy Grain: Providing the Key Tools for the Exploitation of Amaranth – the Protein-rich Grain of the Aztecs. In: Results from a Joint European - Latin American Research Project. Denmark: Department of Integrated Pest Management, Aarhus University, Faculty of Agricultural Sciences. Gorlach J, S Volrath, G Knauf-Beiter, G Hengy, U Beckhove, K H Kogel, M Oostendorp, T Staub, E Ward, H Kessmann, J Ryals (1996) Benzothiadiazole, a novel class of inducers of systemic acquired resistance, activates gene expression and disease resistance in wheat. The Plant Cell 8: 629-643. Guevara M G, C R Oliva, M Huarte, G R Daleo (2002) An aspartic protease with antimicrobial activity is induced after infection and wounding in intercellular fluids of potato tubers. European Journal Plant Pathology 108: 131-137. Hammond-Kosack K E, J D G Jones (1996) Resistance gene-dependent plant defense responses. The Plant Cell 8: 1773-1791. Hann D R, S Gimenez-Ibanez, J P Rathjen (2010) Bacterial virulence effectors and their activities. Current Opinion in Plant Biology 13: 388-393. Huerta, L M, M L Rodríguez (1994) Survival of the causal agent of common bean blight, Xanthomonas campestris pv. phaseoli (E.F.Sm.) in soil and in the rhizosphere of some weeds at Chapingo, Mexico State. Revista Chapingo 1: 29-33. Jones A M E, V Thomas, M H Bennett, J Mansfield, M Grant (2006) Modifications to the arabidopsis defense proteome occur prior to significant transcriptional change in response to inoculation with Pseudomonas syringae. Plant Physiology 142: 1603-1620.

Jones J D G, J L Dangl (2006) The plant immune system. Nature 444: 323-329 Kolomiets M V, H Chen, R J Gladon, E J Braun, D J Hannapel (2000) A leaf lipoxygenase of potato induced specifically by pathogen infection. Plant Physiology 124: 1121-1130. Kuĉ, J (1982) Induced immunity to plant disease. BioScience 32: 854-860. Lipka V, C Kwon, R Panstruga (2007) SNARE-Ware: The role of SNARE-Domain proteins in plant biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology 23: 147-174. Maffi D, M Iriti, M Pigni, C Vannini, F Faoro (2011) Uromyces appendiculatus infection in BTH-treated bean plants: ultrastructural details of a lost fight. Mycopathologia 171: 209-221. McHale L, X P Tan, I P Koehl, R W Michelmore (2006) Plant NBS-LRR proteins: adaptable guards. Genome Biology 7: 212. Mhamdi A, G Queval, S Chaouch, S Vanderauwera, F Van Breusegem, G Noctor (2010) Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. Journal of Experimental Botany 61: 4197-4220. Miche L, F Battistoni, S Gemmer, M Belghazi, B Reinhold-Hurek (2006) Upregulation of jasmonate-inducible defense proteins and differential colonization of roots of Oryza sativa cultivars with the endophyte Azoarcus sp. Molecular Plant-Microbe Interactions 19: 502511. Navarro-Meléndez A L (2009) Análisis Proteómico del Amaranto, sometido a herbivoría (Spodoptera exigua) y/o evocadores relacionados con la resistencia a insectos, MeJA. Tesis de Maestría. Cinvestav Unidad Irapuato. Irapuato Gto., México. 109p.

K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

143

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Rakwal R, G K Agrawal, M Yonekura (1999) Separation of proteins from stressed rice (Oryza sativa L.) leaf tissues by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: induction of pathogenesis-related and cellular protectant proteins by jasmonic acid, UV irradiation and copper chloride. Electrophoresis 20: 3472-3478. Riveros-Angarita A S (2001) Moléculas activadoras de la inducción de resistencia, incorporadas en programas de agricultura sostenible. Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica) 61: 4-11. Rojas-Martínez R, E Zavaleta-Mejía, I M Lee, A Aragón-García (2009) Identification of an isolate from group 16SRIII, Candidatus Phytoplasma pruni in plants and seeds of amaranth (Amaranthus hypochondriacus l.) in México. Agrociencia 43: 851-860.

Van Loon L C (1985) Pathogenesis-Related Proteins. Plant Molecular Biology 4: 111-116 Verica J A, S N Maximova, M D Strem, J E Carlson, B A Bailey, M J Guiltinan (2004) Isolation of ESTs from cacao (Theobroma cacao L.) leaves treated with inducers of the defense response. Plant Cell Reports 23: 404-413. Ward E R, S J Uknes, S C Williams, S S Dincher, D L Wiederhold, D C Alexander, P Ahlgoy, J P Metraux, J A Ryals (1991) Coordinate Gene Activity in Response to Agents That Induce Systemic Acquired-Resistance. The Plant Cell 3: 1085-1094. Wu J, X Luo, H Guo, J Xiao, Y Tian (2006) Transgenic cotton, expressing Amaranthus caudatus agglutinin, confers enhanced resistance to aphids. Plant Breeding 125: 390-394.

Roy S, P Sadhana, M Begum, S Kumar, M L Lodha, H C Kapoor (2006) Purification, characterization and cloning of antiviral/ ribosome inactivating protein from Amaranthus tricolor leaves. Phytochemistry 67: 1865-1873.

Xiang Y, M Song, Z Y Wei, J H Tong, L X Zhang, L T Xiao, Z Q Ma, Y Wang (2011) A jacalin-related lectin-like gene in wheat is a component of the plant defence system. Journal of Experimental Botany 62: 5471-5483.

Sánchez, E, M C, S K Osada, D Téliz, E Espitia, S Rendón. (1990) Etiología e incidencia de la mancha negra del tallo en Amaranthus sp. y otras enfermedades. Revista Mexicana de Fitopatología 8: 102-106.

Zheng X Y, N W Spivey, W Zeng, P P Liu, Z Q Fu, D F Klessig, S Y He, X Dong (2012) Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid Accumulation. Cell Host & Microbe 11: 587-596.

Valdes-Rodriguez S, A Guerrero-Rangel, C Melgoza-Villagomez, A Chagolla-Lopez, F Delgado-Vargas, N A Martinez-Gallardo, C Sanchez-Hernandez, J P Delano-Frier (2007) Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress. Plant Physiology and Biochemistry 45: 790-798. Valenzuela-Soto J H, F Iruegas, N A Martínez-Gallardo, J Molina, M A GomezLim, J P Délano-Frier (2011) Transformed tobacco (Nicotiana tabacum) plants overexpressing a peroxisome proliferator-activated receptor gene from Xenopus laevis (xPPARa) show increased susceptibility to infection by virulent Pseudomonas syringae pathogens. Planta 233:507–521. 144

K. Casarrubias Castillo y J. P. Délano Frier

Recursos Genéticos

Capítulo XI

Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México CONSERVATION OF AMARANTH (Amaranthus spp.) GENETIC RESOURCES IN MEXICO Eduardo Espitia Rangel1, Diana Escobedo Lopez1, Cristina Mapes Sánchez2, Micaela de la O Olán3, Miriam Aguilar Delgado1, Juan Manuel Hernández Casillas3, Alma Velia Ayala Garay3, Patricia Rivas Valencia3, Guillermina Martínez Trejo3, María de la Luz Ramírez Vázquez3 y Sara Hirán Morán Bañuelos4 1INIFAP Campo Experimental Bajío km 6.5 Carr Celaya San Miguel de Allende, (461)6177108 2Jardín Botánico UNAM [email protected] 3INIFAP Campo Experimental Valle de México km 13.5 Carr los Reyes-Texcoco. 4INIFAP Campo Experimental Zacatepec. Km 0.5 Carr Zacatepec-Galeana, Morelos Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El amaranto es un recurso puede ayudar a solucionar los problemas alimentación, de desnutrición y salud en la población. Sin embargo, falta realizar mejoramiento genético para la obtención de variedades más productivas y con mejores características nutricionales. El primer paso es la recolección, estudio y conservación de la variabilidad genética disponible. Por lo que el objetivo del presente estudio fue colectar, conservar y caracterizar el germoplasma de amaranto en México. Dentro de los resultados más relevantes en las cuatro áreas estratégicas. Conservación in situ: en esta área se cuenta con la información etnobotánica reunida en las zonas productoras tanto de grano como de verdura, en relación al mejoramiento participativo se ha avanzado en la selección de variedades desde el punto de vista de productores e industriales. En conservación ex situ se logró colectar 550 colectas para grano, 150 de verdura y 75 de materiales silvestres. Así mismo en uso y potenciación se realizó la caracterización de 552 accesiones de la colección que el INIFAP reunió en la década de los ochentas, de igual manera se está rescatando mucho de ese germoplasma que estaba en riesgo de perderse. Se encontró una amplia diversidad genética de materiales

cultivados en los estados de Tlaxcala (San Miguel del Milagro y Santa Apolonia Teacalco), Estado de México (Amecameca, Cuijingo, Juchitepec y Ozumba), Puebla (Cohuecan, San Juan Amecac y Tochimilco), Morelos (Huazulco), Guanajuato (Ciudad Manuel Doblado), y Distrito Federal (Delegación Xochimilco), principalmente de las especies Amaranthus hypochondriacus y A. cruentus, así como cruzamientos entre especies silvestres y cultivadas. Debido a la amplia distribución del germoplasma silvestre se colectó en lugares desde climas templados hasta climas cálidos, principalmente en los estados de Puebla, Estado de México, Guanajuato, San Luis Potosí, Coahuila, Distrito Federal, Tlaxcala y Oaxaca. Se colectaron accesiones de las especies A. hybridus, A. powellii, A. retroflexus, A. palmeri y A. spinosus en climas templados, y A. spinosus, A. hybridus y A. dubius en climas cálidos. Dentro de la colección estudiada se encuentran cultivares criollos y mejorados; en estos últimos hay predominancia de grano blanco, así como un mayor número de razas primarias. Es importante continuar con las exploraciones del género Amaranthus ya que la pérdida de variabilidad ha continuado de manera acelerada, y existen especies que son fuentes importantes de germoplasma en el mejoramiento genético. Dentro del material colectado se identificaron 147-163

Amaranto: Ciencia y Tecnología

materiales con características valiosas como el crecimiento indeterminado y materiales preponderantemente machos. Palabras clave: Amaranto, alegría, Amaranthus, colectas, germoplasma, diversidad genética, recursos fitogenéticos y especies nativas. ABSTRACT Amaranth is a resource that can help to solve problems of feeding, undernourishment and health in the population. Nevertheless, genetic improvement is needed to obtain more productive varieties and with better nutritional characteristics. The first step is the collection, study and conservation of the genetic variability available. The objective available genetic variability was to collect, to conserve and to characterize germplasm of amaranth in Mexico. Advances of results in the four strategic areas have been done. Conservation in situ: most of ethnobotanical information on this strategic area has been collected in the producing grain and vegetable zones. In relation to the participative improvement we advanced in the selection of varieties from the point of view of producers and industrials. In ex situ conservation 550 grain accessions, 150 vegetable and 75 of wild materials have been collected so far. A wide range of genetic diversity of cultivated materials was detected in the states of Tlaxcala (San Miguel del Milagro and Santa Apolonia Teacalco), State of Mexico (Amecameca, Cuijingo, Juchitepec and Ozumba), Puebla (Cohuecan, San Juan Amecac and Tochimilco), Morelos (Huazulco), Guanajuato (Ciudad Manuel Doblado), and Federel District (Xochimilco demarcation), mainly of the species Amaranthus hypochondriacus and A. cruentus, as well as crosses among wild and cultivated species. Due to the wide distribution of wild germplasm collections were carried out in places from temperate to warm climates, mainly in the states of Puebla, State of Mexico, Guanajuato, San Luis Potosi, Coahuila, Distrito Federal, Tlaxcala y Oaxaca. Accessions of the species A. hybridus, A. powelli, A. retroflexus, A. palmeri and A. spinosus were collected in temperate climates, and A. spinosus, A. hybridus and A. dubius were collected in warm climates. Both cultivated landraces and improved varieties 148

E. Espitia-Rangel et al.

are present within the studied collection, with predominance of creamy-white grain color as well as a larger number of primary races in improved varieties. It is important to continue explorations of the genus Amaranthus as the loss of variability has continued at an accelerated pace, and there are species which are important sources of germplasm in plant breeding. Key words: Amaranth, Amaranthus, genetic diversity, plant genetic resources, gene pool, native species. INTRODUCCIÓN El amaranto es una planta herbácea anual que pertenece al género Amaranthus, es predominantemente tropical, incluye cerca de 70 especies nativas de los trópicos y de las regiones templadas de todo el mundo (Costea et al., 2001); de las cuales 40 son de las Américas y el resto pertenece a Australia, África, Asia y Europa. Dentro del género se encuentran las especies A. cruentus, A. hypochondriacus y A. caudatus que son las más importantes para la producción de grano de amaranto. Las dos primeras ampliamente distribuidas en México, conformando el centro de diversidad más importante. El amaranto tiene su centro de origen y diversidad más importante a nivel mundial en nuestro país, por lo que es necesario colectar, conservar, estudiar y utilizar racionalmente este valioso recurso genético. En el presente documento la Red Amaranto presenta los avances en la estrategia para la conservación, estudio y utilización de los recursos genéticos en México agrupando las acciones por cada una de las cuatro áreas prioritarias: conservación y mejoramiento in situ, conservación ex situ, utilización de los recursos fitogenéticos para la alimentación y la agricultura e instituciones y creación de capacidades. Se presentan propuestas sobre las acciones que hay que realizar en el corto mediano y largo plazo en las cuatro áreas estratégicas. Se presenta información detallada sobre el germoplasma que se ha colectado y conservado en el banco de germoplasma. LA RED AMARANTO La Red Amaranto del Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos (SINAREFI) es una de las redes jóvenes ya que tiene tres años de haber

Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México

iniciado actividades. Los integrantes de la misma son Cristina Mapes Sánchez y Francisco Basurto del Jardín Botánico de la UNAM, Roberto Bernal de Instituto Tecnológico del Altiplano, Ana Paulina Barba de la Rosa del IPICYT, John Délano Frier del CINVESTAV-Irapuato, Gabriel Alejandre Iturbide del CIDIR-Durango, Benito Manrique de Lara Soria de San Miguel de Proyectos Agropecuarios y María de la Luz Ramírez Vázquez, Sara Hirán Morán Bañuelos, Patricia Rivas Valencia, Guillermina Martínez Trejo, Erica Muñiz Reyes, Alama Velia Ayala Garay, Leticia Tavitas Fuentes, Lorena Cortés Espinoza, Micaela de la O Olán, Juan Manuel Hernández Casillas y Eduardo Espitia Rangel del INIFAP. Recientemente se integró Ivonne Sánchez del Pino del CICY y desde luego se considera miembros de la Red a todos los productores que han conservado el germoplasma de amaranto a través del tiempo. El propósito fundamental de la Red Amaranto es colectar, estudiar, conservar y caracterizar el germoplasma de amaranto. Se pretende formar una colección nacional única de germoplasma de amaranto que incluya las colecciones institucionales y personales con fines de conservación y uso de la variabilidad genética de Amaranthus; otro compromiso importante de la Red es posicionar el recurso ante la sociedad en general ya que la mejor forma de conservarlo será utilizándolo.

campos en los cuales el agricultor las cultiva o en las comunidades tradicionales (Collins y Hawtin, 1999). El mantenimiento in situ tiene ventajas ya que conserva tanto el material genético como los procesos que originan la diversidad. Permite también la conservación de un gran número de especies en un solo sitio. Bajo ciertas condiciones, dependiendo del cultivo o del tipo de recursos genéticos, puede ser más barato y efectivo al hacer intervenciones para mantener la evolución en las fincas que en el almacenamiento ex situ (Jarvis et al., 2000). En el caso de amaranto es importante la conservación in situ de las poblaciones nativas de las zonas convencionales de cultivo mediante custodios, dado que debido al reducido número de superficie y productores es fácil que se pierda variabilidad genética. En aspectos etnobotánicos se logró recopilar la información del cultivo del amaranto para grano y verdura. Se tiene información sobre el cultivo, sistemas de producción, variedades, siembra, cultivo, fertilización, aspectos fitosanitarios, cosecha, trilla, limpieza y manejo de postcosecha. Así mismo se reunió información sobre la transformación y uso del amaranto. Se inició también un proceso de mejoramiento participativo en Cd. Manuel Doblado, Gto., que es una nueva zona para el cultivo en el cual participan productores, industriales e investigadores.

AVANCES EN LAS CUATRO ÁREAS ESTRATÉGICAS Conservación in situ La variación genética puede ser mantenida bajo diferentes sistemas y metodologías (Vilela et al., 1997). La conservación de recursos genéticos es esencial, tanto para asegurar que los mejoradores continúen teniendo acceso a los genes y complejos de genes que se necesitan para el mejoramiento. Entre las metodologías más destacadas para recursos genéticos están las reservas para la conservación de la diversidad in situ y las colecciones de germoplasma para mantenimiento de la variabilidad ex situ. La conservación in situ se logra protegiendo el material vegetal en el sitio que ocurre naturalmente. Para muchos parientes silvestres, esto significa reservas naturales o poblaciones silvestres. Para las variedades nativas o tradicionales de los agricultores, se da en los

Conservación ex situ La conservación ex situ involucra la remoción de recursos fitogenéticos de su medio natural para mantenerlo en bancos de germoplasma (semillas), invernaderos, almacenes, laboratorios, cultivo de tejidos o plantaciones, bajo condiciones controladas para su buen desarrollo. Para el buen manejo de las especies de amaranto en la conservación ex situ (bancos de germoplasma) se tienen que seguir los siguientes pasos: recolección, conservación, caracterización y evaluación, documentación y regeneración. Los sistemas de conservación ex situ surgen como una medida complementaria a los mecanismos de conservación in situ, orientados principalmente a resguardar el material genético de las especies de importancia para el mejoramiento genético (Collins y Hawtin, 1999; Brenner et al., 2000). E. Espitia-Rangel et al.

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En las actividades de recolección de germoplasma se han hecho recorridos de campo en la región de Cuetzalan y en sus alrededores. En los primeros tres años se realizaron más de 150 colectas para verdura de las especies A. cruentus, A. hybridus y A. hypochondriacus. En cuanto a la colecta de amaranto para grano en estos tres años se colectó principalmente en las zonas productoras de Tlaxcala y del Distrito Federal, un poco en Guanajuato, Puebla y Morelos se logró colectar 550 poblaciones nativas de A. hypochondriacus y en menor cantidad A. cruentus. En relación a la colecta de parientes silvestres se tienen a la fecha 75 accesiones de las especies A. hybridus, A. powellii, A. palmeri, y A. retroflexus en los estados de Tlaxcala, Distrito Federal, Estado de México, Guanajuato, San Luis Potosí y Coahuila. En la colección nacional se han incluido hasta ahora más de 800 accesiones las cuales están debidamente documentadas en la base de datos. Uso y Potenciación Dentro del área estratégica de uso y potenciación de los recursos genéticos la caracterización y evaluación preliminar juegan un papel fundamental, la cual es realizada generalmente por los conservadores de recursos genéticos y utilizada por los mejoradores para elegir materiales de trabajo. La caracterización de las accesiones, es una actividad que siempre se ha considerado responsabilidad del curador del banco de germoplasma, aunque puede ser realizada por otras instituciones. La caracterización es el registro de los caracteres altamente heredables de una planta, que pueden ser distinguidos a simple vista y que se expresan en todos los ambientes. Comúnmente junto con la caracterización se efectúa una evaluación preliminar, la cual consiste en el registro de un conjunto de características adicionales deseables en un cultivo en particular (Grubben y Sloten, 1981). Espitia en 1986, 1992 y 1994 llevó a cabo caracterizaciones de diferentes colectas de amaranto bajo las condiciones de Chapingo. En la actividad de caracterización de germoplasma se logró caracterizar 352 accesiones, con morfológicas y agronómicas. Además, se identificaron las colectas por especie y por raza. Dentro del material que se está caracterizando se identificaron materiales con características agronómicas sobresalientes 150

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tanto de la especie A. cruentus como de A. hypochondriacus, estos materiales sobresalen por su uniformidad, precocidad, color de semilla entre otros caracteres. En los viajes de colecta se identificaron materiales de A. hypochondriacus de crecimiento determinado, carácter que solo se encuentra en A. caudatus, la importancia de estos es que podrían resultar de importancia en mejoramiento genético para uniformizar madurez, tamaño de semilla y cosecha mecánica. En lo relativo a rejuvenecimiento (rescate) de germoplasma en peligro de perderse se inició con 155 colectas que estaban disponibles las cuales se sembraron para su regeneración y caracterización al mismo tiempo. De estas colectas sólo germinaron 153, de las cuales ya se tienen la semilla que se va a entregar al banco designado. En lo relacionado con la integración de la Colección Nacional se lograron avances muy importantes, se han integrado los 153 materiales rejuvenecidos, las más de 550 accesiones que se colectaron y materiales que se recibieron de otras colecciones como San Miguel de Proyectos Agropecuarios, IPICYT y CINVESTAV; se tiene la promesa de otros investigadores para entregar el germoplasma que tienen en sus colecciones. Creación de Capacidades En el desarrollo de las actividades propias del proyecto se está formando personal experto en el estudio y manejo del cultivo, caracterización y aprovechamiento. Otro aspecto importante en esta área es el posicionamiento del recurso ante la sociedad, el cual se debe hacer con medios masivos de comunicación. El fortalecimiento de la propia red es un aspecto de gran importancia en esta área. En el caso del sistema amaranto es necesario trabajar mucho en esta área ya que el posicionamiento del cultivo ante la sociedad en general será la mejor estrategia para conservarlo. En lo referente a las reuniones de la Red se han realizado dos por año y en la última se incluyó a productores de los Consejos Estatales de Productores y Sistemas Producto de Distrito Federal, Morelos, Oaxaca, Puebla, Tlaxcala y San Luis Potosí. Se han publicado hasta ahora un libro, dos folletos y se tiene listo para impresión un segundo libro. Se participó también en la elaboración de cuatro videos producidos por

Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México

el CUAED y el Jardín Botánico de la UNAM, estos fueron trasmitidos en red nacional por canal 22 y por la RED Edusat. Por parte de la Red se ha participado en la impartición de cursos a productores en Morelos, San Luís Potosí y Oaxaca.

Formar colecciones núcleo para facilitar el entendimiento y utilización de la variabilidad existente. Mantener la información de los materiales de la colección nacional de manera accesible para todo el público interesado.

PROPUESTA DE TRABAJO A CORTO, MEDIANO Y LARGO PLAZO Conservación in situ Es necesario identificar también áreas adecuadas para la conservación de germoplasma in situ. Es conveniente definir custodios para algunas razas en peligro de extinción por ejemplo las razas Guatemalteca, Africana, Picos y Mercado, por lo se deberá procurar su conservación por los productores que las poseen. Se deberá realizar mejoramiento participativo a fin de mejorar por un lado las poblaciones nativas que tienen los productores y poblaciones introducidas que puedan ser una opción más productiva para los productores. En este mejoramiento participativo se deberá tener la participación directa de los productores y de industriales para asegurar que las poblaciones mejoradas respondan a los intereses de los involucrados en la cadena productiva de amaranto. En lo que respecta a la protección de especies subutilizadas, en Michoacán se tienen poblaciones nativas que están en serio peligro de perderse, por lo que se debe asegurar su conservación y promover su uso. Para poblaciones nativas en peligro en caso necesario se deberá buscar la manera de pagar a los productores a fin de que la conserven y promuevan su uso.

Uso y potenciación En lo que se refiere al uso de herramientas biotecnológicas, en amaranto se han utilizado marcadores genéticos con propósito de establecer relaciones filogenéticas de especies cultivadas y sus ancestros. Hasta ahora se han reportado resultados controversiales debido a que se han utilizado materiales originarios de otros países que no son centro de origen. Es necesario que en este respecto se utilicen materiales originarios de México en el caso de A. cruentus, A. hypochondriacus, A. hybridus y A. powellii para establecer relaciones filogenéticas o evolutivas del amaranto. Conjuntamente o de manera complementaria se deberá promover un esquema de abastecimiento de semilla de variedades nativas y mejoradas ya que la producción de la misma en México no existe. Esto aseguraría la conservación de la pureza varietal y la conservación de la variabilidad al promover el uso y mantenimiento de variedades nativas sobresalientes.

Conservación ex situ La conservación ex situ es una de las líneas de acción donde mayor esfuerzo se requiere, ya que el mantenimiento de colecciones, su regeneración, rescate de muestras en peligro y la recolección son aspectos fundamentales en la conservación, estudio y uso del germoplasma. Integración de una colección nacional donde se incluyan la mayoría de las colecciones institucionales, colecciones de trabajo de investigadores y colecciones de productores. Con el principal fin de que sea conservada en el Centro Nacional de Germoplasma, estudiada y utilizada de manera racional.

Creación de Capacidades En los diferentes proyectos se deberá capacitar personal en el área de estudio y manejo de germoplasma de amaranto. Se deberá promover la alianza entre instituciones para el estudio y aprovechamiento de los recursos genéticos del género Amaranthus, esto promovido por la propia Red. Otra actividad importante será participar en la sensibilidad de la opinión pública a través de la participación en diferentes medios de comunicación página web del SINAREFI, participación en videos, programas de radio y televisión y la elaboración tanto de folletos como trípticos para el público en general. Finalmente pero no menos importante será el fortalecimiento de la Red Amaranto que consideramos puede ser la instancia que vincule investigadores, instituciones, productores y transformadores para la creación de sinergias y alianzas estratégicas que coadyuven en E. Espitia-Rangel et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

la conservación, estudio y utilización del germoplasma del amaranto en México. GERMOPLASMA COLECTADO La variación genética puede ser mantenida bajo diferentes sistemas y metodologías (Vilela et al., 1997). La conservación de recursos genéticos es esencial, tanto para asegurar que los mejoradores profesionales continúen teniendo acceso a los genes y complejos de genes que se necesitan para el mejoramiento actual y futuro de los cultivos, como para permitir que los agricultores continúen seleccionando y modificando sus cultivos en los ambientes actuales y circunstancias cambiantes. Las colectas de germoplasma de amaranto para la conservación “ex situ” han sido con el propósito de enriquecer la base genética de la colección de semilla, de donde posteriormente se podrán liberar nuevas variedades con características específicas para las diversas zonas productoras del país. Para el mejoramiento genético se dispone de especies cultivadas, semidomesticadas, y silvestres; desde el punto de vista de la diversidad genética podemos definir al amaranto como una especie con diferentes centros de domesticación y diversidad, dependiendo de las especies, estando ampliamente difundidas en el mundo; sin embargo las especies para grano están mayormente difundidas en Centro América (México y Guatemala) y los Andes (Perú, Bolivia, Ecuador, Argentina); encontrando en estos lugares la mayor variación genética (Brenner et al., 2000; Espitia et al., 2010). Dentro del género Amaranthus se encuentran las especies A. cruentus, A. hypochondriacus y A. caudatus que son las más importantes para la producción de grano de amaranto (Costea et al., 2001). Las dos primeras ampliamente distribuidas en México, conformando el centro de diversidad más importante. Históricamente, las colectas de germoplasma tenían como objetivo conocer la taxonomía y las relaciones evolutivas entre las especies colectadas y las cultivadas. Actualmente, el objetivo principal de la colecta y conservación de germoplasma es su utilización en fitomejoramiento. La disminución del cultivo del amaranto en México se debió a motivos religiosos (Burenhult, 1993). Esto se debe a que originalmente las semillas estaban ligadas a 152

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numerosas festejos religiosos sin embargo debido al carácter violento y pagano de estas ceremonias, la iglesia española suprimió casi por completo su cultivo, durante la conquista. Por lo tanto, mucha de la gran diversidad de los materiales ha desaparecido. Es por ello que el objetivo del presente estudio ubicado en el área estratégica de conservación ex situ en la línea de recolección, fue realizar colectas de germoplasma para verdura, grano y silvestres, así como la identificación de las mismas en cuanto a especies y zonas donde actualmente se encuentran produciendo el amaranto. Los avances en la recolección de germoplasma muestran una enorme variación en las variedades criollas de los agricultores (Figura 1) utilizadas para la producción tanto de grano como verdura. En el Cuadro 1 se muestran las colectas por especie que se han realizado de 2009 a 2011; la variedad A. hypochondriacus es por mucho la especie de la cual se han colectado mayor cantidad materiales. Debido a la amplia distribución del germoplasma silvestre, se colectó en lugares desde climas templados hasta climas cálidos, principalmente en los estados de Morelos (Amilcingo y Huazulco), Tlaxcala (San Miguel del Milagro y Santa Apolonia Teacalco), Puebla (Cohuecan, San Juan Amecac, Tochimilco, Tochimizolco), Estado de México (Texcoco), Guanajuato (Ciudad Manuel Doblado, San Felipe, San Miguel de Allende y Celaya), Distrito Federal (Tulyehualco, Mixquic, Tecomitl, Tlaxialmanalco y Tetelco), San Luis Potosí (Ébano, Matehuala y San Luis Potosí), Coahuila (Saltillo y Matamoros). Se encontraron híbridos interespecíficos (Figura 3) de A. cruentus con A. hybridus reportados anteriormente (Gupta y Gudu 1991). La frecuencia de las principales especies tanto materiales silvestres como cultivadas se encuentran descritas en el Cuadro 1. Dentro del germoplasma colectado se encuentran variedades nativas, predominando las de grano blanco; mientras que dentro de los materiales silvestres colectados se encuentra la predominancia de semillas negras. La gran mayoría del germoplasma colectado se concentra en el centro del país, principalmente en los estados de Puebla, Tlaxcala, Morelos, Distrito Federal y Estado de México el de materiales cultivados y los

Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México

Figura 1. Variabilidad de amarantos cultivados, para verdura y silvestres.

Figura 2. Variabilidad genética en materiales cultivados de amaranto.

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Figura 3. Parientes silvestres y especies relacionadas. De izquierda a derecha y en orden descendiente. A. hybridus, A. Powellii, A. hybridus tropical, introgresión de A. hybridus en A. cruentus, supermaleza en Tlaxcala y A. palmeri.

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Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México Cuadro 1. Frecuencia de las accesiones y especies encontradas en amaranto colectadas en 2009-2011.

Colectas Proporción 615 76.97 92 11.51 26 3.25 1.75 14 1.00 8 7 0.88 4 0.50 3 0.38 30 3.75 799 100.00 silvestres además de los estados anteriores en Coahuila, San Luis Potosí, Oaxaca, Nuevo León y Querétaro (Figura 4). En el estado de Puebla se encontró principalmente A. hypochondriacus raza Azteca en las partes altas como Tochimilco, Tochimizolco y Amecac; mientras que en las partes bajas como Huaquechula, Santa Clara y Santiago Tecla se encontró principalmente A. cruentus raza Mexicana debido a que estas localidades se encuentran a menor altitud; de hecho hay localidades donde ambas especies se mezclan (Figura 5). En Huazulco y Amilcingo Morelos se encontró A. cruentus raza Mexicana, es aquí donde probablemente se tenga la mayor variabilidad de materiales cultivados de esta especie (Figura 6). En las localidades del Distrito Federal como Tulyehualco, Tetelco, Tecomitl y Atlapulco se encontró A. hypochondriacus raza

Azteca. De igual Manera en las localidades de Amecameca, Cuijingo, Juchitepec y Ozumba del Estado de México (Figura 7); y en San Miguel del Milagro y Santa Apolonia Teacalco en el estado de Tlaxcala (Figura 8). Dentro del germoplasma colectado se encontraron materiales con características especiales como variantes de crecimiento determinado en la zona productora Tlaxcala. También se colectaron materiales predominantemente machos, materiales con gran producción de polen, en este caso se colectaron las plantas vecinas ya que estas plantas no producen semilla. Se encontraron también lo que parece ser fuentes de androesterilidad ya que son plantas que no producen polen (Figura 9).

Figura 4. Distribución de colectas del germoplasma colectado (Hijmans et al., 2004).

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Figura 5. Siembras de productores en lomeríos de las faldas del volcán en el estado de Puebla .

Distribución de las especies colectadas La especie A. cruentus está principalmente distribuida en el centro sur de la República Mexicana, principalmente en la zona biogeográfica del eje volcánico transmexicano (Espitia et al., 2010) en los estados de Puebla, Morelos (Figura 10); concretamente en Huazulco y Amilzingo, Morelos y en Huaquechula y Sierra Norte de Puebla. Esta concentración de colectas

en estos dos estados se debe principalmente a que se ha colectado hasta ahora en las zonas productoras tradicionales. En este sentido, A. hybridus, que es el posible ancestro de A. cruentus, presentó una mayor distribución geográfica, ya que se encuentra en prácticamente todo México (Espitia et al., 2010). Sin embargo en el área donde A. cruentus se ha colectado coincide con la distribución de A. hybridus.

Figura 6. Siembras de amaranto de productores de Morelos.

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Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México

Figura 7. Siembras de amaranto de productores de Tlaxcala.

Figura 8. Siembras de amaranto de productores del Estado de México.

Por otro lado, A. hypochondriacus se distribuye principalmente en las regiones biogeográficas eje volcánico transmexicano y Sierra Madre del Sur en los estados de México, Puebla, Tlaxcala, Oaxaca y Distrito Federal (Figura 11). Aunque también hay especímenes reportados en los estados de Sonora, Chihuahua, Coahuila, Guanajuato, Michoacán y Veracruz. En este sentido, A. powellii presentó una distribución en las zonas biogeográficas de California, Sierra Madre Occidental, Sierra Madre Oriental y el Eje Volcánico Transmexicano (Morrone, 2004; Espitia et al., 2010a). Por lo

que a pesar de los pocos datos de pasaporte, esta especie presentó una mayor distribución que su relativo cultivado, sin embargo si se traslapan. Patrones de variación de las especies cultivadas colectadas A. cruentus presentó un patrón de variación latitudinal estrecho, concentrándose principalmente entre los paralelos 18 y 20, aunque se distribuye desde los 16° hasta los 29° de latitud Norte (Figura 12). La media geográfica de esta especie es 18.83º de latitud Norte y a una altitud de 1530 msnm, lo que coincide con el área donde se ha colectado mayor cantidad E. Espitia-Rangel et al.

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Figura 9. Arriba materiales con crecimiento determinado y abajo a la izquierda material predominantemente masculino y derecha material con androesterilidad.

de germoplasma. Por el contrario, el patrón de variación altitudinal es amplio en esta especie, distribuyéndose principalmente entre los 724 y 2198 msnm. En el caso de A. hypochondriacus también presenta una variación latitudinal estrecha, aunque más amplia que A. cruentus, concentrándose principalmente entre los paralelos 16 y 20, aunque esta especie se distribuye desde menos de 16° hasta los 30° de latitud norte. En el caso del patrón de variación altitudinal es alta por que las colectas de esta especie desde 111 hasta 2,675 msnm. La media geográfica de esta especie esta ubicada a 19.07º de latitud Norte y a 2138.5 msnm (Figura 13). 158

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Las especies cultivadas de amaranto fueron domesticadas en las tierras altas de las regiones tropicales y subtropicales de América (Espitia-Rangel, 1994). Las dos especies cultivadas de las cuales se ha colectado germoplasma hasta ahora tienen una mayor distribución en la zona central de México muy cerca del Valle de México y regiones aledañas, donde se establecieron las antiguas culturas mesoamericanas del centro de México y donde también de distribuyen los posibles progenitores de estas especies, por lo que las hipótesis del origen de las especies cultivadas de amaranto de Sauer (1993) pudieran ser ciertas. A. hypochondriacus está más distribuida al sur, latitudinalmente,

Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México

Figura 10. Distribución de las colectas de A. cruentus (Hijmans et al., 2004)

Figura 11. Distribución de las colectas de A. hypochondriacus (Hijmans et al., 2004)

que A. cruentus, por lo que la hipótesis de que A. cruentus tiene un origen más centroamericano (Grubben, 1976; Grubben y Sloten, 1981), no sería correcta según nuestros datos, sino más bien mesoamericana cerca de las culturas prehispánicas mexicanas de la llamada región biogeográfica del Eje Volcánico Transmexicano al igual que su posible hijo A. hypochondriacus.

En contraste, Williams y Brenner (1995) mencionan que la hipótesis centroamericana, es por la gran variedad de usos que tiene en Guatemala y el sur de México, donde estos autores creen que fue domesticado, y que de ahí se movió hacia el norte, hasta el suroeste de Estados Unidos de América y al sur de los Andes, esto explicaría porque A. cruentus E. Espitia-Rangel et al.

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es considerado ancestro de A. hypochondriacus (Sauer, 1950; 1967, 1993), que se cree que fue domesticado en el centro de México al formar un híbrido de A. cruentus con A. powellii, y de A. caudatus (Coons, 1982), que fue domesticado en los Andes y se cree que es un híbrido entre A. cruentus con A. hybridus (en su variante A. quitensis Kunth). Por otro lado, la hipótesis que A. cruentus es descendiente de A. hybridus puede ser cierta, porque los patrones de distribución de este trabajo así como los de Costea et al. (2001), manifiestan que A. hybridus es ampliamente distribuida y también está presente en las regiones donde está distribuida A. cruentus, entonces esta especie podría ser un material seleccionado a partir de A. hybridus y después fue domesticado en alguna de las regiones de Centroamérica, hasta llegar a áreas que ahora conocemos.

Germoplasma rescatado La disponibilidad de diversidad genética es requisito fundamental en el mejoramiento de un cultivo, la cual se puede concentrar en un banco que además sirva para la conservación de los recursos fitogenéticos. En nuestro país se impulsó la recolección de germoplasma de amaranto hasta que llegaron misiones extranjeras en busca de estos recursos; de manera conjunta con estos grupos exploratorios, a principios de la década pasada, se inició la recolección de la variabilidad genética existente. Hasta ahora se han colectado casi exclusivamente materiales cultivados de las especies A. hypochondricus y A. cruentus, que son las especies productoras de grano más ampliamente distribuidas en México. Es precisamente de estas dos especies el mayor número de colectas que se tienen en la colección del INIFAP. De las especies silvestres, sólo se han realizado algunas colectas de A. hybridus con el

Figura 12. Distribución latitudinal y altitudinal de germoplasma colectado de A. cruentus. El punto rojo indica el centro geográfico.

Figura 13. Distribución Latitudinal y altitudinal de germoplasma colectado de A. hypochondriacus. El punto rojo indica el centro geográfico.

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Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México

propósito de aprovechar algunas características ventajosas en mejoramiento genético. En las misiones de colecta se logró reunir 642 accesiones en el Banco de germoplasma del INIFAP, sin embargo como este trabajo se realizó por el programa de mejoramiento genético, nunca se conservaron en condiciones controladas. De manera tal que una gran mayoría de estas colectas se perdieron o están a punto de perderse, pues se han conservado en una bodega de láminas de asbesto. Por lo que el objetivo fundamental de esta fue rescatar las colectas que aún están viables. En muchos de los materiales se encontraron solamente unas pocas semillas, por lo que se procedió a germinarlas en laboratorio posteriormente pasarlas a macetas a fin de asegurar su regeneración. En el caso de los materiales en los que se encontró mayor cantidad de semillas se sembró un surco de un metro de cada colecta de esta manera se tiene semilla rejuvenecida de 150 colectas de las cuales se tiene desde un gramo hasta más de 200 g en algunas colectas. Sin embargo de la gran mayoría se requiere hacer un incremento de semilla para entregar al Banco de Germoplasma. En un 20% de las colectas no se logró germinación por lo que se deberá buscar otra opción para su posible rescate. Dentro de las colectas rescatadas se tiene germoplasma muy interesante, por ejemplo se rescataron colectas de la Raza Nepal y Picos de la de A. hypochondriacus de baja estatura y precocidad que pueden ser fuente de genes a fin de obtener variedades de menor altura y mayor precocidad.

COMENTARIOS FINALES Es importante hacer colectas y depositar en los herbarios especies de amaranto cultivadas ya que existen pocos ejemplares. Es también necesario colectar especies silvestres, sobre todo materiales que puedan tener algún valor en los programas de mejoramiento; sobre todo de aquellas que puedan tener un valor especial como A. albus y A. watsonii, para resistencia a sequía, A. australis para producción de biomasa y tamaño de semilla, A. pumilus también para tamaño de semilla. Algunos materiales en peligro de perderse como la chía prieta (Amaranthus sp.) en Michoacán, algunas poblaciones de A. hypochondriacus razas Mixteca, Picos. Las colectas que se realizan son útiles para llenar vacíos en la colección, dirigir la colecta a genotipos específicos, o reducir las pérdidas de variabilidad debidas a la erosión genética. La colecta de materiales silvestres es una fuente importante de germoplasma ya que tienen el propósito de aprovechar algunas características que les dan ventajas en el mejoramiento genético, para contar con materiales importantes que tengan genes de resistencia a plagas, enfermedades, sequía, heladas, salinidad u otras condiciones climatológicas adversas. Es importante continuar con las exploraciones del género Amaranthus (cultivado o silvestre) para evitar la erosión genética; ya que la pérdida de diferentes materiales ha continuado con pasos muy marcados, y existen especies o colectas que son fuentes importantes de germoplasma en el mejoramiento genético.

Figura 14. Colectas de razas Nepal y Picos fuentes de precocidad y baja estatura de planta.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

La Sierra Norte de Puebla resulta ser una región muy importante para el estudio del conocimiento, uso y manejo del amaranto usado a manera de verdura. De ahí que sea prioritario establecer una programa de conservación in situ y al mismo tiempo lograr la caracterización de los materiales presentes en la zona. Mientras que para los materiales para grano las zonas tradicionales son clave para la conservación in situ de los materiales que ahí se siembran. Otra manera importante de conservar una especie o su germoplasma es que la población en general utilice y consuma todos los productos que tanto de manera tradicional o moderna se deriven de éste. Por lo que es necesario posicionar el amaranto con toda la población en general. LITERATURA CITADA Brenner D M, Baltensperger D D, Kulakow, P A, Lehmann J W, Myers R L, Slabbert M M, Sleugh B B (2000) Genetic resources and breeding of Amaranthus. Plant Breed. Rev. 19:227-285. Burenhult, G (1993) People of the stone age: the ilustrated history of humankind Vol. 2. Harper San Francisco. New York 240 p. Cárdenas R F (1983) Logros y aportaciones de la investigación Agrícola en Recursos Genéticos. Publicación Especial No. 106. INIA-SARH. Collins W W, G C Hawtin (1999) Conserving and Using Crop Plant Biodiversity in Agroecosystems. Pp. 267-281 in Biodiversity in Agroecosystems (W.W. Collins and C.O. Qualset, eds). CRC Press, Boca Raton, Washington. Coons M P (1982) Species and varieties. Relationships of Amaranthus caudatus. Econ. Bot. 36:119-146. Costea M, G Sanders, G Waines (2001) Preliminary results toward a revision of the Amaranthus hybridus species complex (Amaranthaceae) Sida 19:931-934.

162

E. Espitia-Rangel et al.

Espitia R E (1986) Caracterización y evaluación preliminar de germoplasma de Amaranthus. Tesis Profesional en Agronomía. UAAN. Saltillo, Coah. México. Espitia R E (1992) Amaranth germplasm development and agronomic studies in Mexico. Food Reviews International 8(1): 71-86. Espitia R E (1994) Breeding of grain Amaranth. In: Paredes-López,O. (ed.). Amaranth biology, chemistry and technology. CRC Press, Boca Raton, FI. pp. 23-38. Espitia R E, Mapes S C, Escobedo L D, De la O O M, Rivas V P, Martínez T G, Cortés E L, Hernández C J M (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. INIFAP, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. 200 pp. Espitia-Rangel E (1994) Breeding of grain amaranth. In: Paredes-López, O. (ed). Amaranth: biology, chemistry, and technology. CRC press, Boca Raton, USA. 23-38 pp. Espitia-Rangel E, E C Mapes-Sánchez, C Alberto Núñez-Colín, D Escobedo-López (2010a) Distribución geográfica de especies cultivadas de Amaranthus y sus parientes silvestres en México. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 1 (3): 427-437. Grubben G J H (1976) The cultivation of amaranth as a tropical leaf vegetable, with special reference to South-Dahomey. Communications No. 67. Royal Tropical Institute. Amsterdam, Netherlands. 207 p. Grubben G J H, Sloten D H (1981) Genetic resources of amaranths: a global plan of action. AGP: IBPGR 80/2. IBPGR. FAO. Roma, Italia. 57 p. Gupta V K, Gudu S (1991) Interspecific hybrids and possible phylogenetic relations in grain amaranths. Euphytica. 52:33-38.

Capítulo XI. Conservación de los recursos genéticos de amaranto (Amaranthus spp.) en México

Hijmans R J, Guarino L; Bussink C, Mathur P, Cruz M, Barrantes I, Rojas E (2004) DIVAGIS, version 7.1. A geographic information system for the analysis of biodiversity data. URL: http://www.diva-gis.org. Jarvis D I, Myer L, Klemick H, Guarino L, Smale M, Brown A H D, Sadik M, Sthapit B, Hodgkin T (2000) A Training Guide for in situ Conservation On-farm. Version 1. Morrone J J (2005) Hacia una síntesis biogeográfica de México. Revista Mexicana de Biodiversidad 76:207-252. Sauer J D (1950) The grain amaranths: a survey of their history and classification. Annals of the Missouri Botanical Garden. 37:561-632. Sauer J D (1967) The grain amaranths and their relatives: a revised taxonomic and geographic survey. Annals of the Missouri Botanical Garden. 54:103-137. Sauer J D (1993) Historical geography of crop plants: a select roster. CRC press. Los Angeles, USA. 320 p. Vilela M E A, Valois A C C, Nass L L (1997) Recursos genéticos vegetales. Brasilia: Embrapa, SPI; Embrapa, Cenargen. 78 p. Williams J T, Brenner D (1995) Grain amaranth (Amaranthus spp.). In: Williams, J. T. (ed). Cereals and pseudocereals. Chapman & Hall. London, UK. 129-185 p.

E. Espitia-Rangel et al.

163

Capítulo XII

Caracterización morfológica de germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp.) MORPHOLOGICAL CHARACTERIZATION OF GRAIN AMARANTH (Amaranthus spp.) GERMPLASM

Micaela de la O Olán1*, Eduardo Espitia Rangel2, Alma Velia Ayala Garay1, Juan Manuel Hernández Casillas1, José Luis Arellano Vázquez1, Víctor Cuauhtémoc Ruiz Hernández1 1Campo Experimental Valle de México. INIFAP. Carretera Los Reyes-Texcoco, Coatlinchán, Texcoco, Estado de México. C.P. 56250. A.P. 307 y 10. Tel. 595 9212738, ext. 180, 2Campo Experimental Bajío. INIFAP. Carretera Celaya-San Miguel de Allende km 6.5, Celaya, Gto. *Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El germoplasma de amaranto disponible en la actualidad muestra una gran diversidad morfológica, producto de un alto grado de cruzamiento y de múltiples criterios de selección por parte de los agricultores. La clasificación dentro del género Amaranthus ha sido difícil, debido a que se han considerado para tal efecto caracteres con alta segregación dentro de las poblaciones. El objetivo del presente estudio fue caracterizar morfológicamente el germoplasma de Amaranthus spp., incluyendo colectas recientes y las ya existentes en el banco de germoplasma del INIFAP. Se establecieron 560 accesiones en el ciclo agrícola Primavera-Verano 2009, 2010 y 2011 en el INIFAP-Campo Experimental Valle de México, Santa Lucía de Prías, Texcoco, Edo. de México. La caracterización morfológica se realizó con base en una lista de descriptores tanto cualitativos como cuantitativos propuestos por Grubben y Van Sloten (1981). Todas las variables cuantitativas estudiadas presentaron alta variabilidad. La longitud de inflorescencia fue la característica con mayor variabilidad con un coeficiente de variación de 17.8%. La especie A. hypochondriacus fue la de mayor frecuencia con un 83.8% del germoplasma estudiado, otras

especies encontradas fueron A. cruentus y A. caudatus. Para caracteres cualitativos existió una enorme variación de colores, tamaños y formas en tallo, inflorescencia y hojas dentro de cada especie. La especie A. hypochondriacus es la de mayores valores de tamaños de inflorescencia, tamaño de semilla y altura de planta. Existe una enorme variación fenotípica entre y dentro de especies del género Amaranthus, que puede ser aprovechada en el mejoramiento genético, así como para conocer la diversidad de este cultivo en México. Palabras clave: recursos fitogenéticos, “caracterización” y “Amaranthus spp.”, variabilidad. ABSTRACT Currently available Amaranth germplasm shows large morphological diversity, as a result of a high degree of crossing and multiple selection criteria by farmers. Classification within the genus Amaranthus has been difficult, because characters with high segregation within populations have been considered for this purpose. The aim of this study was to characterize morphologically germplasm of Amaranthus 165-181

Amaranto: Ciencia y Tecnología

spp., including recently collected accesions existing at the INIFAP genebank. During the 2009, 2010 and 2011 Spring-Summer growing cycles 560 accessions were planted at the INIFAP-Valley of Mexico Experimental Station in Santa Lucía de Prías, Texcoco, State of Mexico. Morphological characterization was performed based on a list of both qualitative and quantitative descriptors as proposed by Grubben and Van Sloten (1981). All quantitative traits studied showed large variability. Inflorescence length was the trait with the largest variability, with a coefficient of variation of 17.8%. The species A. hypochondriacus was the most frequent with 83.8% of the studied germplasm, other species found were A. cruentus and A. caudatus. High variation was observed for qualitative characters as colors, sizes and shapes in stem, inflorescence and leaves within species. Species A. hypochondriacus showed the largest values of inflorescence size, seed size and plant height. There is high phenotypic variation among and within the Amaranthus species, which can be exploited in breeding and to understand the diversity of this crop in Mexico. Key words: Plant Genetic Resources, Amaranthus spp., Characterization, Variability. INTRODUCCIÓN El amaranto se distribuye ampliamente en América, donde presenta gran variabilidad genética, que se aprecia en la diversidad de características de la planta, tipo de inflorescencia, color de la semilla, precocidad, contenido proteínico de la semilla y resistencia a plagas y enfermedades (Jacobsen y Sherwood, 2002). En México se cultiva mucho las variedades criollas, que son altamente variables en altura, color de panoja, rendimiento de planta, duración del ciclo vegetativo y contenido de proteína. México es uno de los centros de origen de amaranto para grano, es un cultivo tradicional en los valles altos centrales de México, que por su gran valor nutritivo ha ganado importancia en la actualidad. Los cultivos pertenecientes a la familia Amaranthaceae están aún prácticamente sin explotar y poseen características agronómicas, alimentarias y funcionales para mejorar la salud humana. El género Amaranthus es un grupo 166

M. de la O Olán et al.

difícil taxonómicamente. Ha existido mucha confusión en la nomenclatura y clasificación de estas plantas debido a su gran semejanza y amplia distribución geográfica (Alejandre y Gómez, 1999). Todos los amarantos exhiben fenotipos muy variados y se adaptan a una enorme variedad de condiciones climáticas (Espitia et al., 2010). El germoplasma es un recurso biológico muy importante para la población y para el país. Cuando se tiene una colección es preciso describirla, porque lo que no se conoce no se utiliza y lo que no se utiliza se pierde. En la actividad de conservar y mantener los recursos fitogenéticos, se incluye mantener la integridad de las colecciones así como la identificación de duplicados (Karp et al., 1997). En primer lugar, esto usualmente implica la descripción de la variación de los caracteres morfológicos, particularmente de características agromorfológicas de interés directo para los usuarios. Para que los materiales conservados en algún banco de germoplasma sean de utilidad, se deben conocer sus características, es decir deben estar caracterizados. Caracterizar una especie es estimar la variabilidad existente en la población de individuos que lo conforman (Hidalgo, 2003). La clasificación dentro del mismo género de Amaranthus ha sido difícil, debido a que se han considerado para tal efecto caracteres que segregan demasiado dentro de las poblaciones. Las accesiones dentro de un grupo morfológico pueden ser consideradas como variedades nativas; estos son individuos domesticados de reproducción sexual con características que les permiten ser distinguidos de otros grupos. Para Grubben y Sloten, (1981) la caracterización es el registro de los caracteres altamente heredables de una planta, que pueden ser distinguidos a simple vista y que se expresan en todos los ambientes. Comúnmente junto con la caracterización se efectúa una evaluación preliminar, la cual consiste en el registro de un conjunto de características adicionales deseables en un cultivo en particular. El germoplasma de amaranto disponible en la actualidad muestra una gran diversidad morfológica, producto de un alto grado de cruzamiento; por otra parte, las colecciones son pobres, y la caracterización del germoplasma está incompleta. Es por ello que en la línea estratégica de uso y potenciación, se

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp)

incluyó la caracterización de germoplasma para grano de amaranto en colectas recientes, así como materiales conservados desde hace 20 años en el banco de germoplasma del INIFAP. MATERIALES Y MÉTODOS El estudio se realizó en el ciclo Primavera-Verano del 2009, 2010 y 2011 con la caracterización morfológica de 560 accesiones de Amaranthus, sembradas en el Campo Experimental Valle de México del INIFAP, ubicado en Santa Lucía de Prías, municipio de Texcoco, Méx., bajo condiciones de temporal. Se caracterizaron 153 poblaciones en 2009, 207 accesiones en 2010 y 200 en 2011. La parcela experimental fue de tres surcos de 5 m de largo, de cada una de las poblaciones se dejaron en promedio 150 plantas por unidad experimental, aplicando el paquete de recomendaciones generado por el INIFAP. La información de campo se registró en diez plantas por accesión, en las cuales se anotó por material y por planta cada una de las variables cualitativas y cuantitativas. La caracterización morfológica se realizó en base a Grubben y Van Sloten (1981) quienes proponen una lista de descriptores para la caracterización y evaluación de germoplasma de amaranto, debido a que ellos consideran la producción tanto de grano como de verdura. Primero se realizó una clasificación por especie y raza, posteriormente se registraron los siguientes caracteres: Durante la floración: Color de tallo (COTA), Forma de las hojas (FOHO), Color de las hojas (COHO), Color de la inflorescencia (COIN), Forma de la inflorescencia (FOIN), Densidad de la inflorescencia (DEIN), Color de semilla (COSE), Tipos de cubierta de semilla (TIPSE), Ramificación lateral (RALAT). Después de la floración: Acame (ACAM), Diámetro del tallo (DITA), Longitud de la hoja (LOIN), Ancho de la hoja (ANHO). Durante la madurez: Longitud de la inflorescencia (LOIN), Diámetro de la inflorescencia (DIIN), Altura de planta (ALT). La información de campo se registró en formatos preestablecidos, con un listado de las variables en las hileras y columnas individuales para registrar el dato en cada una de las diez plantas. Con esta información se conformó una base de datos en hoja electrónica (Excel 97) y

posteriormente se clasificaron las variables en cuantitativas y cualitativas. Se realizó un análisis de frecuencias de las clases a características de cada una de las variables cualitativas por especie, de acuerdo al total del germoplasma estudiado. Así como las colectas sobresalientes en cada uno de los caracteres. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ESTADÍSTICAS BÁSICAS DE LA CARACTERIZACIÓN La caracterización es el registro de los atributos altamente heredables de una planta, que pueden ser distinguidos a simple vista y que se expresan en todos los ambientes. El amaranto mostró una amplia diversidad y variabilidad genética, mostrando diversidad en el color del grano, precocidad, altura de planta, diversidad en forma de inflorescencia, tallos y hojas, etc. En el Cuadro 1 se presentan los resultados de la caracterización donde se muestra el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los caracteres cuantitativos del germoplasma en estudio. Se ilustra la variabilidad existente en el germoplasma estudiado por medio de estadísticas básicas a nivel poblacional donde se puede apreciar que el germoplasma analizado presenta cierta homogeneidad para algunos caracteres y alta variación para otros, lo que coincide con Joshi (1981) quién al estudiar la variabilidad genética del cultivo encontró una enorme variación en caracteres de la inflorescencia, en ancho y largo de hoja, ancho y largo del tallo y muchos otros caracteres cuantitativos. Las características cuantitativas corresponden a poligenes, genes con efectos mayores acumulativos muy afectados por el ambiente (Jacobsen y Shewood, 2002). Todas las variables cuantitativas estudiadas, presentaron variabilidad, lo que significa que en realidad son caracteres cuantitativos determinados por muchos genes e interaccionan con el ambiente. Los valores máximos y mínimos marcan un amplio intervalo de variabilidad corroborado por el coeficiente de variación. Una amplia variabilidad en características cuantitativas indica que existen diferentes grados de adaptación. Son colectas de los agricultores de diferentes estados de México con intervalos de adaptación muy amplios. Se M. de la O Olán et al.

167

Amaranto: Ciencia y Tecnología Cuadro 1. Parámetros estadísticos de variables cuantitativas de la caracterización de amaranto P/V-2009, 2010 y 2011. Santa Lucía de Prías, Méx.

Media

Valor

Valor

máximo mínimo 54.6

87.5

18.04

34.8

8.3

3.57

1.87

2.98

0.74

0.316

9.75

2.04

4.36

0.73

0.411

17.77

33.26

5.66

2.28

9.06

19.27

5.69

1.18

0.944

1.94

0.46

0.099

CLASIFICACIÓN POR ESPECIE La clasificación por especie de las colectas estudiadas se presenta en el Cuadro 2, donde puede apreciarse la especie A. hypochondriacus fue la que se presentó mayor frecuencia con 469 accesiones que corresponden al 83.8% M. de la O Olán et al.

Estándar

24.4

puede ver que la variabilidad es muy marcada por caracteres, lo cual es lógico porque variables cuantitativas están relacionadas con factores de adaptación (Molina, 1992). La longitud de inflorescencia es la característica que presentó mayor variabilidad ya que tiene una desviación estándar mayor que los demás caracteres 9.75, un valor máximo y mínimo de 87.5 y 24.4 respectivamente, así como un coeficiente de variación de 17.85, lo cual quiere decir que hay poblaciones cuya longitud de inflorescencia en amaranto rebasan los 80 cm, así como inflorescencias pequeñas, es por ello la enorme variación en dicha variable. El diámetro de inflorescencia fue otro carácter que presentó variación con una desviación estándar de 3.57, lo que significa que hay poblaciones cuyo diámetro en amaranto con inflorescencias totalmente cerradas, así como completamente abiertas, es por ello la variación en dicha variable. La se presentó variabilidad en caracteres como altura de planta, diámetro de tallo, ancho y largo de hoja es media, por lo que existe una gran cantidad de materiales totalmente contrastantes que pueden ser aprovechados en mejoramiento genético de acuerdo al propósito del mejorador. El peso de la semilla es la característica que presentó una mayor homogeneidad (desviación estándar 0.099) dentro de los materiales estudiados.

168

Desviación

del germoplasma estudiado lo que concuerda con Espitia et al. (2010) quienes mencionan que A. hypochondriacus es la especie de mayor superficie cultivada en México; la segunda especie encontrada en las accesiones fue A. cruentus especie a la que pertenecieron 55 colectas, que corresponden al 9.8% del total del germoplasma, seguida por A. caudatus con 13 accesiones que representó el 2.3% de las accesiones caracterizadas. En menor escala se encontraron cruzamientos entre las especies y una sola accesión de A. hybridus, ya que las accesiones caracterizadas fueron de grano y no silvestres. Para el mejoramiento genético se dispone de especies cultivadas, semidomesticadas y silvestres, y desde el punto de vista de la diversidad genética podemos definir al amaranto como una especie con diferentes centros de domesticación y origen, dependiendo de las especies, estando ampliamente difundidas en el mundo; sin embargo las especies para grano están mayormente difundidas en Centro América (México y Guatemala), y los Andes (Perú, Bolivia, Ecuador, Argentina); encontrando en estos lugares la mayor variación genética, pudiendo diferenciarse dentro del género Amaranthus más de 60 especies (Espitia et al., 2010); siendo este grupo difícil en su taxonomía, debido a su gran semejanza y amplia distribución geográfica, por ello la confusión en su nomenclatura y clasificación. De la especie que más introducciones se tienen es de A. hypochondriacus, proveniente principalmente de Nepal y la India; de A. caudatus todas las colectas caracterizadas fueron introducidas de Sudamérica, resultados que

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp) Cuadro 2. Frecuencia de las especies en accesiones de amaranto caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

Especie

No. accesiones Frecuencia (%)

Amaranthus hypochondriacus

469

83.8

Amaranthus cruentus

55

9.8

Amaranthus caudatus

13

2.3

Amaranthus hybridus

1

0.19

A. hypochondriacus x A. hybridus

8

1.41

A. cruentus x A. hybridus

5

0.9

A. hypochondriacus x A. cruentus

8

1.41

A. hypochondriacus x A. caudatus

1

0.19

560

100 %

Total

concuerdan con Espitia et al. (2010) quiénes mencionan que esta especie se originó para producción de grano en la región andina. CARACTERÍSTICAS CUALITATIVAS Para analizar las variables cualitativas por especies los resultados del presente análisis se dan en una serie de figuras, en las cuales se pueden encontrar la frecuencia de cada especie de cada una de las características con respecto al total de germoplasma. Para ello se analizaron las especies más importantes dentro de la clasificación por especie con mayor frecuencia en las accesiones caracterizadas, ya que dentro de especie también existe una enorme variación en los caracteres cualitativos. Color de tallo En la Figura 2 se presentan los colores de tallo más comunes en cada una de las especies más importantes de amaranto cultivado en México. Del total del germoplasma estudiado para la especie A. hypochondriacus (83.8%) el 82.9% correspondió a tallos verdes con estrías, el 12% a tallos verdes y solo el 5.1% a mezclas de colores (ya que los materiales criollos presentan una enorme variabilidad de colores de tallo). Para la especie A. cruentus (9.8%), se presentó más variación de color de tallo que en A. hypochondriacus, ya que el 53.7% de las accesiones correspondió a tallos de color verde, 14.8% a verde con estrías de color rojo o púrpura, 13 % a color dorado (característica de los criollos de Huazulco y Amilcingo, Mor., Espitia et al. (2010), 11.1% a colores rojo o púrpura y por último el 7.4% a mezcla de colores.

En A. caudatus aunque no es una especie muy abundante en México, se tenían bajo resguardo ciertas colectas, dicha especie también presentó variabilidad de colores predominando el color verde (38.5%), seguida por mezcla de colores diferentes (30.8%) y el verde con estrías de color rojo o púrpura (23.1%) y en menor escala rojo o púrpura (7.7%). Para las especies que se encontraron en menor escala como A. hybridus, se encontró el color de tallo verde, y en el caso de los cruzamientos A. hypochondriacus x A. hybridus, A. hypochondriacus x A. cruentus, el color de tallo encontrado fue verde con estrías rojas o púrpuras, por lo que se puede apreciar que ese color es dominante sobre los otros colores de tallo. Forma de las hojas En la Figura 2, se muestra los resultados de la variación de forma de las hojas en ésta características no se muestra mucha variación en las especies de A. hypochondriacus y A. cruentus, predominando en las dos la forma elíptica con 89.5 y 68.5%, respectivamente. En A. cruentus también predominó con un 20.4% la forma rómbica. Para A. caudatus encontramos con mayor proporción la forma ovatinada (53.8%) y elíptica (46.2%). En A. hybridus, y cruzamientos entre las especies solo se encontraron las formas elípticas y rómbicas. Color de las hojas En esta característica se presentó mucha variación (Figura 3). En A. hypochondriacus se presentó variabilidad, pero más del 50% de las M. de la O Olán et al.

169

Amaranto: Ciencia y Tecnología Amaranthus hypochondriacus 82.9

90

Amaranthus cruentus

60

53.7

80

50

70 60

40

50

30

40 30

20

20

12.0

10

10

5.1

0

Verde

Verde con estrias rojas o púrpuras

14.8

13.0 7.4

0

Mezcla de diferentes colores

11.1

Verde

Roja o Dorada púrpura

Mezcla

Amaranthus caudatus

45 40

Verde con estrias

38.5

35

30.8

30 23.1

25 20 15

7.7

10

Verde con estrías

Verde

Rojo o púrpura

Dorado

0

Figura 1. Representación gráfica de las frecuencias del color de tallo de las especies de Amaranthus sp., caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

accesiones fueron de color verde normal, seguidas por el verde obscuro (38.8%), y en menor escala el color de hoja verde con una mancha central y hoja con área basal pigmentada. En A. cruentus el 68.6% de las accesiones correspondieron al verde normal, y con menor frecuencia una variedad de colores (verde obscuro, hoja con margen y venas pigmentadas, etc.). Para A. caudatus solamente se encontraron 4 colores de hojas, pero aún así se encontró predominando el color verde normal con 61.5% del total de las accesiones pertenecientes a la especie. Color de la inflorescencia En todas las especies de amaranto se presenta una enorme variabilidad en color de inflorescencia, es uno de los caracteres con mayor variación. Para A. hypochondriacus el 50.4% 170

M. de la O Olán et al.

5 Verde

Verde con Mezcla de estrias rojas diferentes o púrpuras colores

Rojo o púrpura

fueron de color verde, un 25.1% con mezcla de inflorescencia de colores, 16.4% roja o púrpura, 7.3% color rosa y solamente un 0.7% de otro color. En A. cruentus el 38.8% fue de color verde, el 20.4% con mezclas de colores, 24.5% rojo o púrpura, 10.2% de otros colores, y 6.1% color amarillo, cabe mencionar que ésta especie es la única que presenta colores de inflorescencia amarillos (Espitia et al., 2010). En la especie de A. caudatus predominó el color rojo o púrpura con un 61.5% de las accesiones, seguidas por mezclas de colores, así como el color verde (15.4%). En las otras especies como A. hybridus se encontró el color verde, así como en los cruzamientos entre las especies.

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp) Amaranthus cruentus

Amaranthus hypochondriacus

80

100 89.5

90

68.5

70

80

60

70

50

60

40

50 40

30

30

20

20 10 0

Elíptica

Lanceolada

9.3

10

4.1

3.4

20.4

1.9

3.0

Ovalinada

Rómbica

0

Lanceolada

Elíptica

Ovalinada

Rómbica

Amaranthus caudatus

56

53.8

54 52 50

Rómbica

48 46.2 46 44 42 Elíptica

Elíptica

Ovatinada

Figura 2. Representación gráfica de las frecuencias de la forma de la hojas de las especies de Amaranthus sp., caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

60

Amaranthus hypochondriacus

56.1

50 38.8

40 30 20 10 0

1.3

3.3

0.2

0.2

Hoja con área Hoja con una Hoja con una Verde normal Verde obscuro basal mancha franja en forma pigmentada central de V

Otro

M. de la O Olán et al.

171

Amaranto: Ciencia y Tecnología 60

Amaranthus hypochondriacus

56.1

50 38.8

40 30 20 10 0

1.3 Hoja con área basal pigmentada

3.3

0.2

Hoja con una mancha central

70

Hoja con una franja en forma de V

0.2 Verde normal

Verde obscuro

Otro

Amaranthus caudatus

61.5

60 50 40 30 20

15.4

15.4 7.7

10 0 Hoja con área basal pigmentada

Verde normal

Verde obscuro

Hoja con margen y venas pigmentados

Figura 3. Representación gráfica de la variación del color de las hojas de las especies de Amaranthus sp., caracterizadas en P/V-2009, Santa Lucías de Prías, Méx.

Forma de la inflorescencia En la Figura 5 se presenta la frecuencia de la forma de la inflorescencia de las accesiones caracterizadas en 2009, 2010 y 2011. A. hypochondriacus fue la especie que más variación presentó en la forma de la inflorescencia, donde el 44.7% de los materiales fueron de inflorescencia con agrupación en el ápice, 28.4% en forma de panícula con ramificaciones cortas y 26.7% con panícula con ramificaciones largas. Para A. cruentus el 88.7% fueron en forma de panícula con ramificaciones cortas y solo un 172

M. de la O Olán et al.

9.4% en forma de panícula con ramificaciones largas. En A. caudatus se encontraron solamente dos formas: panícula con ramificaciones largas (61.5%) y panícula con ramificaciones largas (38.5%). Densidad de la inflorescencia En la Figura 6 se presenta el porcentaje de las accesiones de la variación de la densidad de la inflorescencia del género Amaranthus. En A. hypochondriacus se presentaron una densidad de inflorescencia en la mayoría (63%) de tipo intermedio, luego densa (22.9%) y en menor

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp)

60

Amaranthus hypochondriacus

50.4

50 40 30

25.1 16.4

20 7.3

10 0

Verde

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

0.7

Rosa

Roja o púrpura

Otra

Amaranthus cruentus

38.8

24.5

20.4 10.2

6.1 Amarillo

70

Roja o púrpura

Verde

Amaranthus caudatus

60

Otros 61.5

50 40 30 20

15.4

10 0

15.4 7.7

Verde

Rosa

Roja o púrpura

Verde Roja o púrpura Dorada Payasita Figura 4. Representación gráfica del color de las inflorescencias de Amaranthus sp., caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx. M. de la O Olán et al.

173

Amaranto: Ciencia y Tecnología

50

Amaranthus hypochondriacus

45

44.7

40 35 28.4

30

26.7

25 20 15 10 5

0.2

0

Otras formas

70

Amaranthus cruentus

100 90

Amaranthus caudatus 61.5

88.7

60

80 50

70 60

40

38.5

50 30

40 30

20

20

9.4

10

1.9

0

10 0

Figura 5. Representación gráfica de la forma de la inflorescencia de amaranto, caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

proporción (14.1%) laxas, A. cruenthus presentó algo similar al caso anterior. Para A. caudatus el 53.8% densidad intermedia, 30.8% laxa y 15.4 compacta. Color de semilla En la Figura 7 se presenta el porcentaje del color de la semilla en cada uno de los materiales caracterizados para las especies de amaranto. Para las especies cultivadas como A. cruentus y A. hypochondriacus casi en su totalidad la semilla fue de color amarillo pálido, con 76.1 % y 81.2 %, respectivamente. En A. caudatus, existe una enorme variación en colores de semilla donde el 30.8% correspondió a color café y otro 30.8% a mezcla de colores, un 23.1% color rosa y 15.4% amarillo pálido. Se obtuvo que en A. hybridus, y los cruzamientos donde participó ésta especie el color característico de la semilla es negro típico 174

M. de la O Olán et al.

de las especies silvestres, también es un carácter dominante sobre los otros colores de semilla. Tipo de cubierta de semilla En la Figura 8 se presenta el porcentaje del tipo de cubierta de la semilla en cada uno de los materiales caracterizados para las especies de amaranto. Se observa que éste carácter es de menor variación que otros. En la especie cultivada como A. hypochondriacus casi en su totalidad fueron opacas (90.2%), en A. cruentus el 77.8% fueron opacas, 13% cristalina y 9.3% mezcla. En A. caudatus el 76.9% fueron opacas, 15.4% mezclas y 7.7% cristalinas. Cabe mencionar que en los cruzamientos entre especies cuando eran con A. hybridus como la semilla era de color negro, el tipo de cubierta fue cristalina. En A. hybridus en su totalidad fueron cristalinas.

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp) Amaranthus hypochondriacus

70

80

Amaranthus cruentus

63.0

68.6

70

60

60

50

50 40

40 30

30

22.9 20

17.6

20

14.1

10

13.7

10 0

0

Laxa

Laxa

Densa o compacta

Intermedia

Intermedia

Densa o compacta

Amaranthus caudatus 53.8

60 50 40 30.8

30 20

15.4

10 0

Laxa

Densa o compacta

Intermedia

Figura 6. Representación gráfica de la densidad de inflorescencia en Amaranthus spp., caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

90

81.2

80

Amaranthus hypochondriacus

76.1

Amaranthus cruentus

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30 15.8

20 10 0

80

Amarillo pálido

1.9

1.1

Café

Negra

21.7

20 10

Mezcla

2.2

0

Amarillo pálido

Rosa

M. de la O Olán et al.

Café

175

Amaranto: Ciencia y Tecnología

35

Amaranthus caudatus

30.8

30.8

Café

Mezcla

30 25

23.1

20

15.4

15 10 5 0

Amarillo pálido

Rosa

Figura 7. Representación gráfica del color de semilla en amaranto, caracterizada en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

Ramificación lateral En la Figura 9 se presenta la ramificación lateral en porcentaje en cada uno de los materiales caracterizados para las especies de Amarathus spp. En A. hypochondriacus se observa que el 62.2% de los materiales caracterizados no presentaron ramificación, el 23.6% con ramas cortas a lo largo del tallo y el resto con muchas ramas y pocas ramas en la base del tallo, sin embargo A. cruenthus se caracterizó por que el 44.4% de los materiales tuvieron muchas ramas largas a lo largo del tallo, 38.8 con ramas cortas a lo largo del tallo, 9.3% con pocas ramas en la base del tallo y 7.4% con muchas ramas en la base del tallo. Amaranthus hypochondriacus

100

CARACTERES CUANTITATIVOS Días a floración La duración del ciclo de vida de la planta del amaranto puede variar de una región a otra, de una especie a otra, de una raza a otra, de tal manera que la clasificación de precoz, Amaranthus cruentus

90

90.2

90

En A. caudatus, el 38.5% presentó muchas ramas en la base del tallo, 30.8% muchas ramas a lo largo del tallo y 30.8% ramas cortas a lo largo del tallo. Dentro de los materiales caracterizados solamente las accesiones de A. hypochondriacus no ramifican, es una de las ventajas que se tiene para mejoramiento genético principalmente en la cosecha mecanizada (Espitia et al., 2010).

77.8

80

80

70

70

60

60 50

50

40

40

30

30

20

8.8

10

1.1

20

13.0

0

Cristalina

Opaca

Mezcla

0

Cristalina

176

9.3

10

M. de la O Olán et al.

Opaca

Mezcla

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp) Amaranthus caudatus

90

76.9

80 70 60 50 40 30

10

Opaca

15.4

20 7.7

0

Opaca

Cristalina

Mezcla

Figura 8. Representación gráfica del tipo de cubierta de semilla en amaranto, caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

intermedio y tardío no se puede aplicar sin la referencia de las condiciones ambientales (Espitia et al., 2010). Se tomó el número de días de la emergencia hasta que el 50% de las plantas presentaron floración (antesis). Dentro de las 70

62.2

60

Cristalina

Amaranthus hypochondriacus

50 40 30

23.6

20

13.5

10 0.6

0

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Ramas cortas a Pocas ramas en Muchas ramas a lo largo del tallo la base del tallo lo largo del tallo

Amaranthus cruentus

44.4

38.9

9.3

Ramas cortas a lo largo del tallo

Pocas ramas en la base del tallo

7.4

Muchas ramas en la base del tallo

Muchas ramas a lo largo del tallo M. de la O Olán et al.

177

Amaranto: Ciencia y Tecnología

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Amaranthus caudatus 38.5 30.8

Ramas cortas a lo largo del tallo

30.8

Muchas ramas en la base del tallo

Muchas ramas a lo largo del tallo

Figura 9. Representación gráfica de la ramificación lateral de amaranto, caracterizada en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

características que se están buscando en los programas de mejoramiento son la precocidad, es por ello que en el germoplasma evaluado se encontró una gran variabilidad de materiales con 67 a 97 días a floración, lo que permite seleccionar de acuerdo a nuestro interés. En el Cuadro 6 se presentan los valores promedio para los días a floración en las diferentes especies de Amaranthus. La especie de ciclo más corto de acuerdo al promedio resultó ser cruzamiento de A. cruentus x A. hybridus con 69 días a floración, principalmente por colectas de GTO-099 y GTO-095 que obtuvieron 67 días a floración. En general todas las especies que tengan A. cruentus son de ciclo más corto ya que es la especie cultivada más precoz. Es importante considerar ésta parte en mejoramiento genético ya que se requieren de variedades precoces para regiones donde la estación de crecimiento es corta y para regiones donde la sequía es frecuente (Kulakow y Jain, 1987). La especie A. hypochondriacus resultó ser la más tardía con un promedio de 96.7 días a floración, esa es una de las desventajas que presenta dicha especie. A. caudatus es una especie que presenta un ciclo intermedio con 90.1 días a floración. Altura de planta La altura de planta también es un carácter cuantitativo por lo tanto es influenciada por el genotipo y el ambiente (Espitia et al., 2010). En el Cuadro 6 se presentan los valores promedio de la altura de planta las especies de Amaranthus spp. En A. hypochondriacus se cuenta 178

M. de la O Olán et al.

con alturas de planta mucho mayor que A. cruentus, lo que provoca que A. hypochondriacus sea más susceptible a sufrir acame. Accesiones de A. cauadatus fueron los materiales más altos encontrados en promedio, pero al momento de realizar el análisis de los valores máximos se encontró que la accesión COL-125 perteneciente a la especie A. hypochondriacus resultó con una altura máxima de hasta 2.98 m. La accesión con menor porte fue GTO-080 perteneciente a A. cruentus. Es interesante la variación con que se cuenta en lo materiales para la altura de planta en las especies, ya que ésta característica puede ser aprovechada en el mejoramiento genético para resistencia al acame. Uno de los problemas que enfrenta el cultivo de amaranto nativo es la gran variación de altura en los materiales. Weber y Kauffman (1990) mencionan que las plantas más altas tienen una gran susceptibilidad al acame, así como la dificultad de la cosecha. Ancho y Longitud de la Hoja En el Cuadro 6 se presenta el ancho y longitud de la hoja, medida en cm con una regla de madera de 30 cm, de la sexta a la octava hoja de diez plantas de cada colecta, con 3 hojas cada planta, al final se obtuvo el promedio, el cuál se tomó después de la floración cuando las hojas habían terminado su desarrollo. Se observó que las hojas más largas se encuentran en la especies cultivadas como Amaranthus hypochondriacus, A. cruentus y A. caudatus, en cuanto al ancho de hojas la especie A. cruentus presentó los mayores valores. De manera

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp)

individual la colecta GTO-072 perteneciente a un cruzamiento de A. hypochondriacus x A. hybridus presentó los menores valores de longitud de hoja, y el mayor valor correspondió a la colecta DF-011 de A. hypochondriacus con longitudes de hasta 33.26 cm, material que puede ser aprovechado para rendimiento de forraje. En ancho de hoja el mayor valor fue para la accesión PSM-0092GA de A. hypochondriacus con 19.27 cm. Las hojas de menor longitud y diámetro se localizan en especies silvestres principalmente donde participa A. hybridus. Diámetro del tallo En el Cuadro 6 se presenta el promedio del diámetro de tallo de cada una de las especies de Amaranthus. Esta característica fue tomada después de la floración la medición se realizó con un vernier digital en la base del tallo de diez plantas de cada colecta. A nivel de especie A. caudatus presentó los mayores diámetros de tallo con valores hasta de 2.9 cm, siguiendo en orden de magnitud A. cruentus con 1.9 cm y A. hypochondriacus 1.3 cm, lo que explica con mayor claridad el acame que presenta A. hypochondriacus además de poseer mayor altura de planta. Esas desventajas que presenta A. hypochondriacus se ponen en manifiesto en la dificultad para la cosecha mecanizada (Espitia et al., 2010). En al análisis individual de las accesiones, el mayor diámetro de tallo (4.3 cm) se encontró en la colecta COL-A-034 perteneciente a A. caudatus, y el menor valor en GTO-099 de A. cruentus x A. hybridus con 0.74 cm. El diámetro de tallo es una característica fundamental de las accesiones ya que podemos seleccionar para resistencia al acame (Weber y Kauffman, 1990). Longitud y diámetro de la inflorescencia La longitud de la inflorescencia (cm) se tomó desde la base hasta el ápice de la inflorescencia, cuando la planta había llegado a madurez. El diámetro (cm) también se tomó a la madurez midiéndose el diámetro a la mitad de la inflorescencia, con una regla de madera de 1 m. La longitud y el diámetro de la inflorescencia a nivel de especie se observa en el Cuadro 6. Se observó que las panojas más largas (62.3 y 56.5 cm) se encontraron en la especie A. caudatus y A. hypochondriacus, respectivamente. De la

misma manera las panojas más anchas (18.5 cm) se encontraron en A. hypochondriacus lo que repercute en el rendimiento de grano de acuerdo a lo que menciona Weber y Kauffman (1990). A nivel individual de acuerdo a los valores máximos y mínimos se encontró que la colecta COL-AG-73 fue la de mayor longitud de inflorescencia (87.5 cm) y el mayor diámetro correspondió a la COL-59 que pertenecen a la especie A. hypochondriacus. Peso de 1000 semillas Esta variable fue tomada de manera adicional para tener una idea del rendimiento de cada una de las accesiones. Frecuentemente se menciona el incremento del peso o tamaño de semilla como un objetivo de un programa de mejoramiento genético de amaranto (Weber y Kauffman, 1990; Espitia, 1992). En el Cuadro 6 se presentan los promedios de cada una de las especies de Amaranthus spp. La especie con mayor tamaño de semilla fue A. hypochondriacus con valor de 1.1 g en 1000 semillas, seguida de A. cruentus con 0.9 g. De manera individual el mayor peso de semilla fue para PSM-0020GA de la especie A. hypochondriacus con una valor máximo de 1.94 g en 1000 semillas. La ventaja de las especies de A. hypochondriacus es su peso y rendimiento de semilla, el inconveniente es la altura de la planta (altas) y diámetro de tallo reducido lo que provoca que las plantas se acamen, y al mismo tiempo dificulta la cosecha mecanizada. CONCLUSIONES Existe una enorme variación dentro del género Amaranthus y no solo en el género también entre especies, que puede ser aprovechada en el mejoramiento genético, así como para conocer la diversidad de materiales en México que puede ser aprovechada para muchos propósitos. En amaranto existe un amplio campo de exploración para caracteres morfológicos, los caracteres cualitativos y cuantitativos representan una parte del espectro de la variación genética dentro de las especies. Sin embargo, faltan todavía por realizarse más estudios genéticos y de biología molecular con muchos materiales mexicanos para distinguir las diferentes razas cultivadas de grano. En la actualidad se tiene M. de la O Olán et al.

179

Amaranto: Ciencia y Tecnología Cuadro 3. Clasificación por especie y valores promedio de variables cuantitativas en accesiones de amaranto caracterizadas en P/V-2009, 2010 y 2011, Santa Lucía de Prías, Méx.

DF

ALP DIIN LOIN DITA LOHO ANHO

A. hypochondriacus

96.7

1.9

18.5 56.5

1.3

17.7

8.9

1.1

A. cruentus

86.0

1.4

15.8 47.3

1.9

17.4

14.2

0.9

A. caudatus

90.1

2.3

16.5 62.3 2.93

17.6

9.2

0.7

A. hybridus

92.0 0.95 12.0 34.0

3.0

16.5

9.8

0.65

A. hypochondriacus x A. hybridus

84.0

14.7 36.9

1.3

14.9

8.3

0.83

Especie

1.5

PSEM

A. cruentus x A. hybridus

69.0

1.2

14.6 33.7

1.1

13.0

7.4

0.84

A. hypochondriacus x A. cruentus

72.0

1.0

14.3 34.5

1.2

15.1

7.7

0.99

A. hypochondriacus x A. caudatus 93.0

2.2

16.9 58.1

1.8

17.0

8.8

0.87

LOIN= Longitud de inflorescencia (cm); DIIN: Diámetro de inflorescencia (cm); ALP = Altura de la planta (m); DITA: Diámetro de tallo (cm); LOHO: Longitud de hoja (cm); ANHO: Ancho de hoja (cm); PSEM= Peso de 1000 semillas.

una gran cantidad de colectas que necesitan ser caracterizadas, para tener una base completa de la diversidad de materiales a usar en los programas de mejoramiento genético. La diversidad de materiales en el banco de germoplasma lo hace característico para tener germoplasma en todos los programas de mejoramiento genético para enfrentar los cambios climáticos que hoy en día se presentan. La caracterización amplia de especies, locales e introducidas es una herramienta poderosa e importante para identificar caracteres de gran valor en el mejoramiento genético. LITERATURA CITADA Alejandre I G, L F Gómez (1999) Cultivo de Amaranto en México. Dirección de Difusión Cultural. Universidad Autónoma Chapingo. Departamento de Zonas Áridas. Méx. 245p. Espitia R E (1986) Caracterización y evaluación preliminar de germoplasma de Amaranthus. Tesis Profesional en Agronomía. UAAN. Saltillo, Coah. México. Espitia R E (1992) Amaranth germplasm development and agronomic studies in Mexico. Food Reviews International. 8(1): 71-86. Espitia R E, C Mapes S, D Escobedo L, M De la O O, P Rivas V, G Martínez T, L Cortés E, JM Hernández C (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. INIFAP, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. 200 pp. 180

M. de la O Olán et al.

Grubben G JH, D H Van Sloten (1981) Genetics resources of amaranths International Board for Plant Genetic Resources, Rome. Italy. 57 pp. Hidalgo R (2003) Variabilidad Genética y Caracterización de Especies Vegetales. In: Franco T L, Hidalgo R (eds.). 2003. Análisis Estadístico de Datos de Caracterización Morfológica de Recursos Fitogenéticos. Boletín técnico no. 8, Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI), Cali, Colombia. 89 p. Jacobsen S E, S Shewood (2002) Cultivo de granos andinos en Ecuador: informe sobre los rubros quinua, chocho y amaranto. Quito, Ecuador, FAO-Centro Internacional de la PapaCatholic Relief Service, p.14. Joshi B D (1981) Exploration for amaranth in Northwest India. Plant Genetic Resources. Newsletter no. 48. FAO, Rome. Karp A, S Kresovich, K V Bhat, W G Ayad, T Hodgkin (1997) Molecular tools in plant genetic resources conservation. A guide to the technologies. IPGRI Technical Bulletin No. 2. Rome, Italy. Kulakow P A, S K Jain (1987) Genetics of grain amaranths. Variation and early response to selection in Amaranthus cruentus L. Theor. Appl. Genet. 74:113-120.

Capítulo XII. Caracterización morfológica en germoplasma para grano de amaranto (Amaranthus spp)

Molina G JD (1992) Introducción a la Genética de Poblaciones y Cuantitativa (algunas implicaciones en Genotecnia). AGT Editor, México, D.F. 370 p. Weber L E, C S Kauffman (1990) Plant breeding and seed production. Proceedings of the Fourth National Amaranth Symposium. Amaranth Institute, Minneapolis MN. Pp. 115128.

M. de la O Olán et al.

181

Capítulo XIII

Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura GERMPLASM CHARACTERIZATION OF GREEN AMARANTH (Amaranthus spp.)

Cristina Mapes Sánchez1*, Araceli Díaz Ortega1 y José Blancas2 1Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito Exterior s/n. Ciudad Universitaria. Delegación Coyoacán. C.P. 04510. México Distrito Federal. Tél. 01 55 56 22 89 84 2 Centro de Investigaciones en Ecosistemas. Universidad Nacional Autónoma de México. Campus Morelia. Antigua Carretera a Pátzcuaro No. 8701. Col. ExHacienda San José de la Huerta. C.P. 58190. Morelia, Michoacán. *Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El germoplasma de amaranto disponible en la actualidad muestra una gran diversidad morfológica. La región de la Sierra Norte de Puebla ha sido una de las regiones donde el uso del amaranto como verdura ha tenido un papel muy importante y son denominados genéricamente “quintoniles”, son todos comestibles aunque preferidos en distinto grado por la población local con base en su sabor, color y palatabilidad. La clasificación dentro del género Amaranthus ha sido difícil, debido a que se han considerado para tal efecto caracteres con alta segregación dentro de las poblaciones. El objetivo del presente estudio fue caracterizar morfológicamente el germoplasma de Amaranthus spp. utilizado como verdura, dentro del área estratégica de Uso y Potenciación de acuerdo al Plan de Acción del SINAREFI. El material evaluado fue colectado en diferentes regiones de la Sierra Norte de Puebla. Se caracterizaron un total de 86 colectas en el ciclo agrícola Primavera-Verano 2011, las cuales fueron evaluadas en dos métodos de siembra: por trasplante (30 colectas) y por siembra directa (56 colectas). La caracterización morfológica se realizó con base en la clasificación de Grubben y Van Sloten (1981). Los caracteres

considerados se evaluaron durante la floración, después de la floración y durante la madurez. Los datos se analizaron mediante análisis estadístico multivariado. Los resultados muestran que existe una enorme variabilidad en el germoplasma presente en la región de estudio. Se agrupan las colectas por especie y raza. Los caracteres importantes se encuentran relacionados con diferentes aspectos de la hoja, ramificación lateral y forma de la inflorescencia. Palabras clave: Amaranthus, verdura, caracterización morfológica, Sierra Norte de Puebla. ABSTRACT The available germplasm of amaranth (Amaranthus spp.) displays an ample morphological variation. The Sierra Norte de Puebla is one of the regions where the use of amaranths as greens is relevant, called quintoniles, greens from all species of amaranth are edible, although local people prefer some species in terms of their taste, color and palatability. Classification of species in the genus Amaranthus has been difficult because it is based on characters that segregate amply within populations. The present work had the objective 183-201

Amaranto: Ciencia y Tecnología

of morphologically characterize the germplasm of Amaranthus spp. used as edible greens within the strategic area 3 of Use and Potentiation according to the Action Plan of SINAREFI. The material for evaluation was collected in different regions of the Sierra Norte de Puebla. A total of 86 samples from the 2011 spring-summer agricultural cycle were characterized, derived from two stages: transplant (30 specimens) and direct sowing (56 specimens). Morphological characterization was based on the classification of Grubben and Van Sloten (1981). Characters were evaluated during and after flowering and at maturity. Data were analyzed by means of a multivariate statistical analysis. Results showed a large variation of the germplasm in the studied region. Samples were grouped by species and race. The most important characters were related to different aspects of leafs, lateral branching and form of inflorescence. Key words: Amaranthus; edible greens; morphological characterization; Sierra Norte de Puebla. INTRODUCCIÓN El valor de las colecciones de recursos fitogenéticos reside en la utilización que de ellas se haga para producir nuevos cultivares, domesticar nuevas especies y desarrollar nuevos productos, para el beneficio de las actividades productivas. Las colecciones deben proveer a los mejoradores de variantes genéticas, genes o genotipos, que les permitan responder a los nuevos desafíos planteados por los sistemas productivos, siendo para ello imprescindible conocer las características del germoplasma conservado (Abadie y Berretta, 2001). Tradicionalmente la comunidad científica ha enfatizado el problema de la falta de caracterización y evaluación y la importancia de que las colecciones de germoplasma cuenten con suficientes datos de este tipo (Frankel y Brown, 1984). Sin embargo, existe una considerable brecha entre el número de materiales conservados y el de aquellos de los que se tienen datos de caracterización y evaluación, estimándose a nivel mundial un 80% de muestras sin datos de caracterización y un 95% sin datos de evaluación agronómica (Peters y Galway, 1988). La colecta 184

C. Mapes Sánchez et al.

y conservación de recursos fitogenéticos sin que esté acompañada de la información sobre sus características convierte a las colecciones en simples depósitos de materiales, sin mayor utilidad. En el informe sobre el estado de los recursos fitogenéticos en el mundo (FAO, 1996), resalta que los recursos genéticos son de escasa utilidad a menos que vayan acompañados de información adecuada. En los informes de los países se cita este punto como uno de los obstáculos más importantes para utilizar los recursos fitogenéticos en los programas de mejoramiento. Todo esto resalta la importancia que tiene esta temática en las estrategias destinadas a incrementar un uso adecuado de la diversidad genética. Se entiende por caracterización a la descripción de la variación que existe en una colección de germoplasma, en términos de características morfológicas y fenológicas de alta heredabilidad, es decir características cuya expresión es poco influenciada por el ambiente (Hinthum Van, 1995). La caracterización debe permitir diferenciar a las accesiones de una especie. El germoplasma de amaranto disponible en la actualidad muestra una gran diversidad morfológica, producto de un alto grado de cruzamiento y de múltiples criterios de selección por parte de los agricultores. La clasificación dentro del género Amaranthus ha sido difícil, debido a que se han considerado para tal efecto caracteres con alta segregación dentro de las poblaciones (Espitia et al., 2010). El objetivo del presente estudio fue caracterizar morfológicamente el germoplasma de Amaranthus spp. utilizado como verdura, dentro del área estratégica 3 de Uso y Potenciación de acuerdo al Plan de Acción del SINAREFI. La caracterización morfológica se realizó con base en la clasificación de Grubben y Van Sloten (1981), donde se propone una lista de descriptores para la caracterización y evaluación de germoplasma de amaranto; considerando la producción tanto de grano como de verdura. Para Grubben y Van Sloten (1981), la caracterización es el registro de los caracteres altamente heredables de una planta, que pueden ser distinguidos a simple vista y que se expresan en todos los ambientes. Comúnmente junto

Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura

con la caracterización se efectúa una evaluación preliminar, la cual consiste en el registro de un conjunto de características adicionales deseables en un cultivo en particular. La región de la Sierra Norte de Puebla ha sido una de las regiones donde el uso del amaranto como verdura ha tenido un papel muy importante y son denominados genéricamente “quintoniles”, son todos comestibles aunque preferidos en distinto grado por la población local con base en su sabor, color y palatabilidad. Las especies que se encuentran en la región son Amaranthus hybridus L., A. hypochondriacus L. raza Mixteca, A. hypochondriacus L. raza Azteca, A. cruentus L. raza Mexicana y A. spinosus L., además de todo un complejo de híbridos entre las cuatro primeras especies mencionadas. MATERIALES Y MÉTODOS El material evaluado fue colectado en diferentes regiones de la Sierra Norte de Puebla. Se caracterizaron un total de 86 colectas en el ciclo agrícola Primavera-Verano 2011 (P/V-2011), las cuales fueron evaluadas bajo trasplante (30 colectas) y otra, por siembra directa (56 colectas),

Cuadro 1. El presente estudio se realizó en dos etapas: una por trasplante con 30 colectas y otra, por siembra directa 56 colectas (Tabla 1), teniendo un total de 86 colectas caracterizadas en el ciclo P/V 2011. En el primer caso, las colectas fueron sembradas en condiciones de invernadero (11 de mayo, 2011) en el Jardín Botánico del Instituto de Biología de la UNAM y posteriormente trasplantadas (4-junio-2011) en el INIFAP-Campo Experimental Valle de México, Santa Lucía de Prías, Texcoco, México. En la segunda etapa, la siembra directa se realizó el 2 de junio del 2011, en ambos casos bajo condiciones de temporal en el mismo sitio. Durante el ciclo del cultivo se realizaron las siguientes labores de campo: aclareos (6-8 de julio, 2011) 2 deshierbes (12 de julio y 4 de agosto), riegos de auxilio (3 y 11 de junio) durante el periodo de sequía, así como dos aplicaciones de insecticidas: 1° Lucamet 600 (1 L ha-1) el 9 de julio, 2° Sevin 80PH (1 kg ha-1), así como la aplicación de TODOMIN (yodo) que actúa como viricida, alguicida y bactericida (1 L ha-1) dada la incidencia de algunas enfermedades en el cultivo.

Cuadro 1. Accesiones de Amaranthus spp. utilizado como verdura en la Sierra Norte de Puebla, caracterizadas en el ciclo P/V 2011 bajo los métodos: siembra directa (1-56) y de trasplante (57-86). Especie

Raza

Estado

1

996

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Hueyapan

Hueyapan

2

1198

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

S.J. Tahitic.

Zacapoaxtla

3

1169

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Zoatecpan

Xochitlan

4

1172

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Ecatlán

Jonotla

5

1167

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Ecatlán

Jonotla

6

1166

A.hypochondriacus

Azteca

Puebla

Ecatlán

Jonotla

7

1300

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Ecatlán

Jonotla

8

1210

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Tecuicuilco

Tetela de Ocampo

9

1203

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Comaltepec

Zacapoaxtla

10

1165

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Yohualichan

Cuetzalan

11

1156

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Tetelilla de Islas

Tuzamapan

12

1199

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Xochitepec

Zacapoaxtla

Xalticpac

Zacapoaxtla

No. No. Colecta

Localidad

Municipio

13

1206

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

14

1005

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Huahuaxtla

Xochitlan

15

1202

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Comaltepec

Zacapoaxtla

16

1207

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Cuaximaloyan

Xochiapulco

17

1209

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Cuaximaloyan

Xochiapulco

18

1170

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Zoatecpan

Xochitlan

19

1211

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Huahuaxtla

Xochitlan

20

1184

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Xalcuauta

Cuetzalan

C. Mapes Sánchez et al.

185

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Localidad

Municipio

Especie

Raza

Estado

21

1185

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Xalcuauta

Cuetzalan

22

1200

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Xochitepec

Zacapoaxtla

23

999

A. hybridus

Puebla

Huahuaxtla

Xochitlan

24

1192

A. hybridus

Puebla

S.M.Tenextatiloyan

Zautla

25

1183

A. hybridus

Puebla

Zoatecpan

Xochitlan

26

1201

A. hybridus

Puebla

Comaltepec

Zacapoaxtla

27

1192

A. hybridus

Puebla

S,M.Temextatiloyan

Zautla

28

1171

A. cruentus

Mexicano

Puebla

Zoatecpan

Xochitlan

29

1289

A. cruentus

Mexicano

Puebla

Tuxtla

Zapotitlán

30

1213

A. spinosus

Puebla

Gachupinate

Ayotoxco

31

1196

A. cruentus x hybridus

Puebla

Xochiateno

Zacapoaxtla

32

1197

A. cruentus x hybridus

Puebla

Xochiateno

Zacapoaxtla

33

1177

Amaranthus sp.

Puebla

Amatlán

Zoquiapan

34

1174

Amaranthus sp.

Puebla

Tepetitlan

Cuetzalan

35

1188

Amaranthus sp.

Puebla

Yohualichan

Cuetzalan

36

1186

Amaranthus sp.

Puebla

Reyeshogpan

Cuetzalan

37

1162

Amaranthus sp.

Puebla

Ayotzinapan

Cuetzalan

38

1041

Amaranthus sp.

Puebla

Zapotitlán

Zapotitlán Cuetzalan

No. No. Colecta

39

1164a

Amaranthus sp.

Puebla

Yohualichan

40

1189

Amaranthus sp.

Puebla

Yohualichan

Cuetzalan

41

1215

Amaranthus sp.

Puebla

Tenampulco

Tenampulco

42

1161

Amaranthus sp.

Puebla

Ayotzinapan

Cuetzalan

43

1220

Amaranthus sp.

Puebla

Limontitlán

Hueytamalco

44

1219

Amaranthus sp.

Puebla

Limontitlán

Hueytamalco

45

1190

Amaranthus sp.

Puebla

Yohualichan

Cuetzalan

46

1182

Amaranthus sp.

Puebla

Huiziltepec

Cuetzalan

47

1235

Amaranthus sp.

Puebla

Xalcuauta

Cuetzalan

48

1163

Amaranthus sp.

Puebla

Ayotzinapan

Cuetzalan

49

1176

Amaranthus sp.

Puebla

Amatlán

Zoquiapan

50

1178

Amaranthus sp.

Puebla

Amatlán

Zoquiapan

51

1180

Amaranthus sp.

Puebla

Amatlán

Zoquiapan

52

1181

Amaranthus sp.

Puebla

Huiziltepec

Cuetzalan

53

1187

Amaranthus sp.

Puebla

Reyeshogpan

Cuetzalan

54

1158

Amaranthus sp.

Puebla

Ayotzinapan

Cuetzalan

55

1179

Amaranthus sp.

Puebla

Amatlán

Zoquiapan

56

1205

Amaranthus sp.

Puebla

Comaltepec

Zacapoaxtla

57

1169

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Zoatecpan

Xochitlán

58

1166

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Ecatlán

Jonotla

59

1298

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Caxhuacan

Caxhuacan

60

996

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Hueyapan

Hueyapan

61

1198

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

S.J. Tahitic

Zacapoaxtla

62

1204

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Comaltepec

Zacapoaxtla

63

1172

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Ecatlán

Jonotla

186

C. Mapes Sánchez et al.

Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura Especie

Raza

Estado

64

1300

A. hypochondriacus

Azteca

Puebla

Ecatlán

Jonotla

65

1167

A. hypochondriacus

Puebla

Ecatlán

Jonotla

66

1005

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Huahuaxtla

Xochitlán

67

1202

A. hypochondriacus

Mixteco

Puebla

Comaltepec

Zacapoaxtla

68

1221

A. hybridus

Puebla

San José Acateno

San José Acateno

69

1213

A. spinosus

Puebla

Gachupinate

Ayotoxco

70

1193

A. hybridus x cruentus

Puebla

Tahitic

Zacapoaxtla

71

1298

A. hybridus x cruentus

Puebla

Caxhuacan

Caxhuacan

72

1193

A. hybridus x cruentus

Puebla

S.J. Tahitic

Zacapoaxtla

73

1171

A. cruentus x hybridus

Puebla

Zoatecpan

Xochitlán

74

1041

Amaranthus sp.

Puebla

Zapotitlán

Zapotitlán

75

1010

Amaranthus sp.

Puebla

Huapalecan

Xochitlan

76

1010

Amaranthus sp.

Puebla

Huapalecan

Xochitlán

77

1164a

Amaranthus sp.

Puebla

Yohualichan

Cuetzalan

78

1162

Amaranthus sp.

Puebla

Ayotzinapan

Cuetzalan

79

1161

Amaranthus sp.

Puebla

Ayotzinapan

Cuetzalan

80

1215

Amaranthus sp.

Puebla

Tenampulco

Tenampulco

81

1173

Amaranthus sp.

Puebla

Xiloxochico

Cuetzalan

82

1174

Amaranthus sp.

Puebla

Tepetitlan

Cuetzalan

83

1177

Amaranthus sp.

Puebla

Amatlán

Zoquiapan

84

1186

Amaranthus sp.

Puebla

Reyeshogpan

Cuetzalan

85

1188

Amaranthus sp.

Puebla

Yohualichan

Cuetzalan

86

1189

Amaranthus sp.

Puebla

Yohualichan

Cuetzalan

No. No. Colecta

La unidad experimental fue de tres surcos de 5 m de largo, de cada población, dejando en promedio 150 plantas con una distancia de 15-25 cm entre cada una. Los registros de campo, se realizaron en diez plantas marcadas de cada unidad experimental, en las cuales se realizaron observaciones de variables cualitativas y cuantitativas, principalmente en las etapas de floración y de madurez fisiológica. Los caracteres considerados fueron los siguientes (ver apéndice): DURANTE LA FLORACIÓN Color de Tallo (COTA), de hojas (COHO) y de la inflorescencia (COIN), así como la forma de hojas (FOHO), de inflorescencia (FOIN) y la densidad de la inflorescencia (DEIN) y ramificación lateral (RALAT). DESPUÉS DE LA FLORACIÓN Diámetro del tallo (DITA), longitud (LOHO) y ancho de la hoja (ANHO). DURANTE LA MADUREZ Longitud de la inflorescencia (LOIN), diámetro de la inflorescencia (DIIN), color de semilla (COSE) y altura de planta (ALT), entre otras.

Localidad

Municipio

La información generada de este estudio, considerando los parámetros anteriormente descritos, fue procesada en una base de datos en hoja electrónica (Excel 97) clasificando las variables en cuantitativas y cualitativas. ANÁLISIS DE LOS DATOS Para determinar el parecido en forma cuantitativa de las diferentes colectas de amaranto se construyeron dos matrices de datos, mismas que se analizaron por separado mediante el programa NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, versión 2.2. Exeter Software). Una contenía los datos de las variables cuantitativas y cualitativas multiestado, tanto para siembra directa como para trasplante. La segunda sólo contenía datos de variables cualitativas binarias o dos estados. ANÁLISIS DE CONGLOMERADOS (CLUSTER ANALISYS) Con las variables cuantitativas y cualitativas multiestado se obtuvo un fenograma el cual se construyó mediante una matriz de similitud usando el coeficiente de correlación momentoproducto de Pearson y la técnica de ligamiento media aritmética no ponderada (UPGMA, C. Mapes Sánchez et al.

187

Amaranto: Ciencia y Tecnología

“unweighted pair-group method using arithmetic averages”). Para el caso de las variables cualitativas binarias, se construyó el fenograma mediante una matriz de similitud usando el coeficiente de asociación de Jaccard y la técnica de ligamiento media aritmética no ponderada (UPGMA, “unweighted pair-group method using arithmetic averages”). ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA). Adicionalmente y para complementar el análisis de agrupamiento se hizo un análisis de componentes principales (PCA) en ambos tratamientos mediante el programa NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, versión 2.2. Exeter Software). Se realizó este análisis sólo para los datos cuantitativos y cualitativos multiestado. Este análisis permite encontrar un patrón de relaciones en la totalidad de las colectas y al mismo tiempo permite representar las afinidades entre las colectas por la relación que guardan en un espacio bidimensional. A partir de una matriz de similitud usando el coeficiente Varianza-Covarianza y el análisis Eigen, se construyó la representación gráfica en los dos primeros componentes de las afinidades entre las colectas. ANÁLISIS DE COORDENADAS PRINCIPALES (PCO). Para el caso de los datos cualitativos binarios se hizo mediante el programa NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, versión 2.2. Exeter Software) un Análisis de Coordenadas Principales (PCO), utilizando una matriz de similitud con el coeficiente de Jaccard. Se realizó el análisis Eigen y se construyó

la representación gráfica en las dos primeras coordenadas principales. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se presentan los resultados obtenidos solo de las colectas evaluadas que concluyeron su ciclo biológico durante el ciclo Primavera-Verano 2011 en el INIFAP, ya que desafortunadamente varios de los materiales para verdura son de ciclo tardío y no alcanzaron la etapa reproductiva. Cabe mencionar que de las colectas de siembra directa (56) se evaluaron 27 es decir, el 48% de lo propuesto inicialmente, mientras que de trasplante (30) fueron 15 ó el 50% de colectas evaluadas. A continuación en el Cuadro 2 se muestran los valores obtenidos en la evaluación de los caracteres cualitativos en las diferentes especies de amaranto y bajo siembra directa. En el Cuadro 3 se muestran los valores obtenidos en la evaluación de los valores obtenidos en la evaluación de caracteres cualitativos en las diferentes especies bajo trasplante. En el Cuadro 4 se presentan los resultados promedio de los caracteres cuantitativos en diferentes especies de amaranto bajo siembra directa y en el Cuadro 5 bajo trasplante. Cabe mencionar, que el cultivo de amaranto para verdura (P/V-2011), fue fuertemente afectado por las bajas temperaturas o heladas, presentadas desde el mes de septiembre (8 y 9) y posteriormente los días del 23 al 25 de octubre de 2011 (Figura 1), donde se dañó la parte vegetativa (hojas y tallo) y reproductiva en el crecimiento y desarrollo de la inflorescencia o panoja lo cual afectó de manera importante el rendimiento de semilla. Esto debido a que estos materiales para producción de verdura se caracterizan por presentar ciclo biológico muy

Cuadro 2. Evaluación de los caracteres cualitativos (*) en Amaranthus spp. para verdura, bajo siembra directa. Ciclo P/V 2011, CEVAMEX, Santa Lucía, INIFAP. Especie A. hypochondriacus L.

Raza Azteca Mixteco

A. hybridus L. Mexicano A. cruentus L. A. spinosus L. A. hybridus x cruentus Amaranthus spp.

COTA 2, 1 2 1 1 3 1 1

FOHO 1 2 2 5 6 5 1

* Clasificación de Grubben y Van Sloten (1981).

188

C. Mapes Sánchez et al.

COHO 3 4 6, 8 8 7 8 8

COIN 4, 3 3, 4 2 2 3 2 2

FOIN 2 2 2 2 2 2 2

DEIN 2 2 2, 5 2, 1 2 3 2

RALAT 4,1 4 4 4 4 4 1

POIN 1 1 1, 2 1, 2 2 1 1

MAHO 1, 3 2, 3 1 1 1 1 3

COSE 5 5 5 5 5 5 5

Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura Cuadro 3. Evaluación de los caracteres cualitativos (*) en Amaranthus spp. para verdura, bajo trasplante. Ciclo P/V 2011, CEVAMEX, Santa Lucía, INIFAP. Especie A. hypochondriacus L.

Raza Azteca Mixteco

A. hybridus L. A. spinosus L. A. hybridus x cruentus A. cruentus x hybridus Amaranthus spp.

COTA 1 2 2 3 1 1 5, 1

FOHO 1 2 6 6 5 5 1,2

COHO 3 4 8 7 8 8 10

COIN 4 4 3 3 2 2 4

DEIN 2 2 3 2 3 2 2

FOIN 2 2 2 3 2 2 2

RALAT 4 4 4 4 4 4 4

POIN 1 1 1 2 1 1 2

MAHO 1 3 1 1 1 3 1

COSE 5 5 5 5 5 5 5

* Clasificación de Grubben y Van Sloten (1981).

Cuadro 4. Resultados promedio de los caracteres cuantitativos (*) en Amaranthus spp. para verdura, bajo siembra directa. Ciclo P/V 2011, CEVAMEX, Santa Lucía, INIFAP. LOIN (cm) DIIN (cm) ALT (cm) DITA (cm) LOHO (cm) ANHO (cm) LOPE (cm) 14.7 10.4 20.7 3.1 203.4 16.6 64.6 16.5 11.9 22.6 3.9 227.0 8.5 34.0 11.0 10.4 18.3 2.8 217.4 14.6 87.5 A. hybridus L. 8.3 7.4 12.8 2.5 175.0 11.5 75.8 Mexicano A. cruentus L. 5.1 3.7 6.0 1.7 106.7 7.8 36.7 A. spinosus L. 16.5 12.6 19.4 3.5 212.5 12.0 80.3 A. hybridus x cruentus 14.9 9.3 18.4 3.7 236.9 21.8 47.0 Amaranthus spp. Especie A. hypochondriacus L.

Raza Azteca Mixteco

* Clasificación de Grubben y Van Sloten (1981). Cuadro 5. Resultados promedio de los caracteres cuantitativos (*) en Amaranthus spp. para verdura, bajo trasplante. Ciclo P/V 2011, CEVAMEX, Santa Lucía, INIFAP. Especie A. hypochondriacus L.

Raza Azteca Mixteco

A. hybridus L. A. spinosus L. A. hybridus x cruentus A. cruentus x hybridus Amaranthus spp.

LOIN (cm) DIIN (cm) ALT (cm) DITA (cm) LOHO (cm) ANHO (cm) LOPE (cm) 13.8 10.6 21.1 3.3 180.9 21.4 72.9 15.8 11.2 21.8 4.2 196.2 22.4 45.8 6.1 4.4 8.7 1.5 107.3 9.0 51.5 5.8 4.3 6.9 2.2 90.4 0.0 0.0 17.5 14.0 22.6 3.5 232.0 14.8 92.6 14.5 11.6 18.0 4.0 206.8 13.0 53.3 14.2 11.0 20.0 2.9 121.7 11.5 45.9

* Clasificación de Grubben y Van Sloten (1981).

35

a) Temperatura (ºC)

30 25 20 15 10 5 0 -5

1

35

79

11

13

15

17

19

21

23

25

27 29

Tiempo (días) C. Mapes Sánchez et al.

189

Amaranto: Ciencia y Tecnología

T. máxima

b)

T. mínimaT

. media

Temperatura (ºC)

35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10

1

35

79

11

13

15

17

19

21

23

25

27 29

Tiempo (días)

Figura1. Comportamiento de la temperatura: máxima, mínima y media, durante los meses de septiembre (a) y octubre (b) de 2011 con mayor incidencia de bajas temperaturas o heladas. Datos obtenidos de la Estación Agrometeorológica del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Texcoco, Estado de México.

largo y muchas de las colectas no alcanzaron a terminar su ciclo biológico. Por otra parte y como resultado de la visita del M. en C. Bonifacio Don Juan (Fitopatólogo de la UNAM) a la parcela experimental, se generó la siguiente problemática: principalmente se detectó la falta de fertilizante en el terreno donde se estableció

a)

b)

c)

d)

el cultivo (Figura 2), así como problemas de hongos e insectos para esos últimos se tomaron muestras en bolsas de plástico para su análisis en laboratorio. Se detectó la presencia de hongos del género Fusarium en raíz, Cylindrocladium, Alternaria y Phoma en partes vegetativas de plantas, de igual manera se detectaron problemas

Figura 2. Representación de algunos problemas detectadas en la parcela experimental de amaranto: A decoloración de hojas, B marchites de planta, C manchas foliares y D hojas minadas.

190

C. Mapes Sánchez et al.

Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura

de larvas de orden lepidóptera y de la familia: Artidae, Geometridae. De los defoliadores encontrados (Figura 3), sólo se identificó al gusano peludo Stigmene sp., el minador y la larva de lepidóptero de la familia Piedidae. Otro problema el cual se pudo notar fue la caída de varias plantas esto debido a la poca cantidad de raíces que presenta el cultivo (Figura 4). ANÁLISIS DE CONGLOMERADOS Siembra directa En el fenograma (Figura 5), se pueden apreciar dos grandes grupos. El primero contiene a las colectas: 1198, 1202, 1199, 1211, 1200, 1207, 1209, 1170, 1185, 1184 y 1005 que corresponden la mayoría a A. hypochondriacus raza Mixteca con excepción de

las colectas 1199 y 1198 que corresponden a la raza Azteca. A su vez este se subdivide y muestra a la colecta 1005 aparte del resto del grupo este material corresponde a A. hypochondriacus raza Mixteca colectada en Huahuaxtla, Municipio de Xochitlán. El segundo grupo contiene a las colectas (996, 1192, 1192, 1289, 1205, 1193, 1171, 999, 1201, 1213, 1169, 1166, 1300, 1210, 1203 y 1206). Este grupo se subdivide y forma dos grupos el primer subgrupo contiene a (996, 1192, 1192, 1289, 1205, 1193, 1171, 999, 1201 y 1213) que corresponden la mayoría a A. hybridus y A. cruentus x A. hybridus y el segundo subgrupo a (1169, 1166, 1300, 1210, 1203 y 1206) que corresponden la mayoría a A. hypochondriacus raza Azteca.

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figura 3. Daños por defoliadores: galería y larva de minador afectando a hojas de amaranto de variedad clara y purpura (A, B y C); gusano peludo Stigmene sp alimentándose de hojas de amaranto (D); daño en brote de amaranto (E) y larva de lepidóptero que ataca a variedades verdes y purpura de amaranto (F).

Figura 4. Se observa deficiencia en el crecimiento de la raíz en el cultivo de amaranto.

C. Mapes Sánchez et al.

191

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Figura 5. Fenograma de relaciones genéticas entre los materiales de Amaranthus spp., obtenido a partir de una matriz construida con el coeficiente de correlación entre los materiales caracterizados en el ciclo P/V 2012 (bajo siembra directa), Santa Lucía de Prías, Texcoco, México.

ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA) De acuerdo con Cuadro 5, el modelo que se elaboró para representar las afinidades de las colectas y la relación que guardan en un arreglo bidimensional (Figura 6). Se puede apreciar que como parte del componente principal 1 se forma un grupo que corresponde a A. hypochondriacus raza Mixteca que se separa de A. spinosus (1213), de A. cruentus raza Mexicana (1289,1193 y 1171) y de A. hybridus (1192,1201 y 999). Mientras que para el componente 2 se forman dos grandes grupos: las colectas que

corresponden a A. hypochondriacus raza Mixteca y de A. hypochondriacus raza Mixteca. Se observa que hasta el componente principal 3 representa casi el 70 % de la variación explicada. El restante 30% se debe al azar. En el Cuadro 6 podemos apreciar el peso que poseen las variables y la relación que guardan con el arreglo bidimensional (Figura 6). Las variables más importantes (en negritas) en el CP1 de mayor a menor son largo de la hoja (LOHO), largo del pecíolo (LOPE), diámetro del tallo (DITA) y ancho de la hoja (ANHO). Todas tienen una correlación negativa.

Cuadro 6. Resultados del análisis Eigen, generado a partir de una matriz de similitud usando el coeficiente Varianza-Covarianza.

Componente 1 2 3 4 5 6

192

C. Mapes Sánchez et al.

Eigen Valor 8.4105 4.6204 3.8501 2.4012 2.0258 1.3229

Porcentaje % Acumulado 33.62 33.62 52.10 18.47 67.49 15.39 77.09 9.60 85.19 8.09 90.48 5.28

Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura

Figura 6. Representación gráfica en los dos primeros componentes de las afinidades entre las colectas a partir del análisis Eigen. Cuadro 7. Resultados del análisis, generado a partir de una matriz de similitud usando el coeficiente VarianzaCovarianza, donde se aprecia el peso que poseen las variables.

Variables LOIN DIIN ALT DITA LOHO ANHO LOPE REND COTA FOHO COHO COIN DEIN MAHO

CP1 0.0909 0.2913 -0.6908 -0.8486 -0.9358 -0.8054 -0.8811 -0.3545 0.3515 0.461 0.4872 -0.3062 0.2405 -0.6034

CP2 0.0452 -0.4105 0.4438 0.3837 0.083 0.2555 -0.0923 -0.7299 -0.2395 0.5529 0.7397 -0.674 0.204 0.1584

CP3 0.8877 0.6635 0.3088 -0.1115 0.2021 0.0529 -0.1268 0.3198 -0.5091 -0.3016 0.2468 -0.1819 0.4746 -0.1756 C. Mapes Sánchez et al.

193

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Figura 7. Representación de la relación que guardan las variables en un arreglo bidimensional.

Las colectas de A. hypochondriacus raza Mixteca presenta los valores promedio más altos de las variables anteriormente mencionadas (22.6 cm; 16.5 cm; 3.9 cm y 11.9 cm) comparada por ejemplo con A. spinosus (6.0 cm; 5.1 cm; 1.7 cm y 3.7 cm). En el CP2 las que son eficaces para formar grupos son de mayor a menor color de la hoja (COHO) (correlación positiva), rendimiento (REND), color de la inflorescencia (COIN) (correlación negativa) y forma de la hoja (FOHO) (correlación positiva). De esta manera las colectas que pertenecen a A. hypochondriacus raza Mixteca se diferencian de la raza Azteca en la forma de las hojas en etapa de floración siendo elípticas; en el color de hojas durante la etapa de floración presentando hojas con dos franjas en forma de V y en el color de la inflorescencia siendo rosa o roja. TRASPLANTE De acuerdo con el fenograma de la Figura 8, se aprecian dos grandes grupos. El primero incluye a las colectas (1169, 1166, 1202, 1198, 1005, 1189 y 1300) que corresponden a A. hypochondriacus raza Azteca. El segundo grupo contiene a las colectas (1298, 1204, 1193, 1171, 194

C. Mapes Sánchez et al.

996, 1186, 1173, 1177, 1221, 1213, 1010 y 1161), que corresponden a A. hybridus, A. cruentus x A. hybridus y Amaranthus sp. En el caso del primer grupo se presenta una subdivisión en donde 1300 sale del resto del grupo, colecta originaria de Ecatlán, Municipio de Jonotla. El segundo grupo a su vez se subdivide y quedan en un subgrupo (1298, 1204, 1193, 1171, 996, 1186, 1173 y 1177) que corresponde a A. hybridus y A. cruentus x hybridus y en otro (1221, 1213, 1010 y 1161) que corresponden a Amaranthus sp. Del subgrupo (1298, 1204, 1193, 1171, 996, 1186, 1173 y 1177) que corresponden la mayoría a A. hypochondriacus raza Azteca; se vuelven a separar 1298, 1204, 1193 y 1171 del resto materiales colectados en diferentes lugares de la región de estudio. De acuerdo con Cuadro 7, el modelo que elaboramos para representar las afinidades de las colectas y la relación que guardan en un arreglo bidimensional (Figura 9), se aprecia que hasta el componente principal tres representa casi el 80% de la variación explicada. El restante 20% se debe al azar.

Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura

En el Cuadro 9, podemos apreciar el peso que poseen las variables y la relación que guardan con el arreglo bidimensional (Figura 10).

RESULTADOS DEL ANÁLISIS BINARIO O DOS ESTADOS. En la Figura 11, se aprecian dos grandes grupos. El primero incluye dos subgrupos: el primero con las colectas: 1298, 1166, 1204, 1193, 1210, 1221 y 1300 en donde predomina A. hypochondriacus

Figura 8. Fenograma de relaciones genéticas entre los materiales de Amaranthus spp., obtenido a partir de una matriz construida con el coeficiente de correlación entre los materiales caracterizados en el ciclo P/V 2012 (bajo trasplante), Santa Lucía de Prías, Texcoco, México. Cuadro 8. Resultados del análisis Eigen, generado a partir de una matriz de similitud usando el coeficiente Varianza-Covarianza.

Componente 1 2 3 4 5 6

Eigen Valor 5.631 5.077 2.729 1.828 1.229 0.829

Las más importantes (en negritas) en el CP1 de mayor a menor son largo de la hoja (LOHO), largo del pecíolo (LOPE), ancho de la hoja (ANHO) y diámetro del tallo (DITA) (todas con correlación positiva). En el segundo componente principal (CP2) las variables más importantes son de mayor a menor son forma de la hoja (FOHO) (correlación negativa), largo de la inflorescencia (LOIN), color de la inflorescencia (COIN) y altura (ALT) (correlación positiva).

Porcentaje % Acumulado 32.702 32.702 62.190 29.488 78.039 15.849 88.655 10.615 95.794 7.139 > 100% 4.819 raza Azteca; y el segundo de la 1161, 1010 y 1213 que corresponde a Amaranthus sp. El segundo grupo está formado por varios subgrupos como se aprecia en el fenograma. Las colectas 1005 y 996 corresponden a A. hypochondriacus raza Mixteco; la 1192 y 1289 corresponden a A. hybridus y A. cruentus x hybridus; lo mismo las colectas 999 y 1193. Finalmente las colectas 1203, 1169,1166 corresponden a A. hypochondriacus raza Azteca.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

Cuadro 9. Resultados del análisis, generado a partir de una matriz de similitud usando el coeficiente VarianzaCovarianza, donde se aprecia el peso que poseen las variables.

Variables LOIN DIIN ALT DITA LOHO ANHO LOPE REND COTA FOHO COHO COIN

CP1 0.2377 0.6156 0.6788 0.831 0.9463 0.8695 0.9013 0.5326 -0.3528 0.2457 -0.2606 -0.1982

CP2 0.7355 -0.3219 0.6737 0.0918 -0.1246 -0.0204 -0.0045 0.0861 0.4072 -0.8127 -0.2801 0.7101

CP3 0.3741 0.6115 -0.1076 -0.1704 -0.1089 -0.3289 -0.3483 0.4712 -0.4766 0.1088 0.6339 0.073

Figura 9. Representación gráfica en los dos primeros componentes de las afinidades entre las colectas a partir del análisis Eigen.

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Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura

Figura 10. Representación de la relación que guardan las variables en un arreglo bidimensional.

ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA) De acuerdo con Cuadro 10, el modelo que elaboramos para representar las afinidades de las colectas y la relación que guardan en un arreglo

bidimensional (Figura 12), se observa que hasta el componente principal 3 representa casi el 76% de la variación explicada. El restante 24% se debe al azar.

Figura 11. Fenograma de relaciones genéticas entre los materiales de Amaranthus spp., obtenido a partir de una matriz construida con el coeficiente de Jaccard, solo para las variables cualitativas de dos estados, de los materiales caracterizados en el ciclo P/V 2012. Santa Lucía de Prías, Texcoco, México.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

De acuerdo con Cuadro 9, el modelo que se elaboró para representar las afinidades de las colectas y la relación que guardan en un arreglo bidimensional (Figura 12), se observa que hasta el componente principal 3 representa casi el 76% de la variación explicada. El restante 24% se debe al azar. En el Cuadro 11, podemos apreciar el peso que poseen las variables y la relación que guardan con el arreglo bidimensional (Figura 13).

Las más importantes (en negritas) en el CP1 de mayor a menor son: prominencia de venas foliares (PVEN), ramificación lateral en época de floración (RALAT) y porte de inflorescencia terminal (POIN) (todas con una correlación positiva). En el segundo componente principal (CP2) las variables más importantes son de mayor a menor son forma de la inflorescencia (FOIN) (correlación positiva) y porte de la inflorescencia terminal (POIN) (correlación negativa).

Cuadro 10. Resultados del análisis Eigen, generado a partir de una matriz de similitud usando el coeficiente de Jaccard.

Componente 1 2 3 4 5 6 7 8

Eigen Valor 5.07149012 2.61869883 1.59631756 1.42521804 0.64893402 0.44804997 0.25846760 0.11108472

Porcentaje 41.6438 21.5031 13.1079 11.7030 5.3286 3.6791 2.1224 0.9122

% Acumulado 41.6438 63.1469 76.2548 87.9578 93.2864 96.9655 99.0878 100.0000

Figura 12. Representación gráfica en los dos primeros componentes de las afinidades entre las colectas a partir del análisis Eigen, para los caracteres cualitativos binarios.

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Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura

Cuadro 11. Resultados del análisis, generado a partir de una matriz de similitud usando el coeficiente de Jaccard, donde se aprecia el peso que poseen las variables.

Variables FOIN RALAT POIN PVEN MAHO

CP1 0.0771 0.7416 0.5779 0.7565 0.5409

CP2 0.9495 - 0.1355 - 0.2442 0.1580 0.0904

CP3 0.2724 0.2688 0.5259 - 0.1959 - 0.6952

Figura 13. Representación de la relación que guardan las variables en un arreglo bidimensional de las variables cualitativas binarias.

CONCLUSIONES El Campo Experimental Valle de México Santa Lucía de Prías, Texcoco, Estado de México no es un sitio adecuado para la evaluación de materiales usados a manera de verdura provenientes de la Sierra Norte de Puebla ya que en este campo se presentan heladas muy tempranas que terminan con las plantas, las cuales presentan un ciclo de vida muy largo y no alcanzan a madurar. Es importante considerar la posibilidad de realizar más estudios sobre la caracterización del germoplasma de Amaranthus spp. para verdura, ya que es el material menos estudiado, a pesar del impacto que tiene en la economía de la

población local de la Sierra Norte de Puebla. En el próximo ciclo agrícola se establecerán cultivos en esta región con el objeto de obtener datos más completos. El germoplasma de amaranto usado a manera de verdura y presente en la Sierra Norte de Puebla presenta una gran diversidad morfológica y una fuerte hibridación con A. hybridus. Los descriptores establecidos por Grubben y Van Sloten (1981) usados en este estudio permitieron en términos generales mostrar algunas tendencias al separar las especies y razas presentes en la región de estudio. C. Mapes Sánchez et al.

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Los caracteres más importantes fueron entre otros: largo, ancho y forma de la hoja, largo del pecíolo, prominencia de las venas foliares, altura, ramificación lateral en etapa de floración, porte y largo de la inflorescencia terminal. Todas estas diferencias han sido claramente observadas en campo y son caracteres que se encuentran fuertemente relacionados con el uso de las hojas como verdura. La caracterización como cualquier actividad tiene sus herramientas y procesos, en este caso la herramienta de trabajo es el descriptor. Hasta ahora diferenciamos la caracterización ex situ de la in situ por el uso del descriptor; mientras uno es universal y técnico, el otro es local y responde la necesidad utilitaria del agricultor, sin embargo, ambos tratan de diferenciar variedades y utilizan caracteres morfológicas y lo que es más importante, los dos con científicos. Se han realizado estudios de caracterización y evaluación del germoplasma de amaranto usado como verdura disponible en el Instituto Indio de Investigación Hortícola de Bangalore y se concluye que para la explotación comercial del amaranto se puede utilizar ventajosamente la variabilidad de las características del tallo, hojas e inflorescencias y algunos caracteres cuantitativos como altura de la planta, cantidad de hojas y período de floración (Varalakshmi, 2004). En el futuro se deben de agregar los siguientes parámetros con el objeto de poder caracterizar con mayor precisión los materiales usados a manera de verdura: 1) biomasa asignada a hojas, tallos, raíz e inflorescencia; 2) área foliar; 3) cociente (área foliar máxima/ biomasa total máxima); 4) cociente (biomasa hojas/biomasa tallos), 5) contenido de vitamina A; 6) contenido de vitamina C; 7) contenido de calcio; 8 ) capacidad de rebrote. AGRADECIMIENTOS Al Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos para la Agricultura y la Alimentación (SINAREFI) y al Jardín Botánico, Instituto de Biología de la UNAM por el apoyo y financiamiento de estas investigaciones.

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A la Dra. Patricia Rivas Valencia Jefa del Campo Experimental Valle de México por todo su apoyo para la realización de este estudio. A la Dra. Micaela de la O Olán Investigadora del INIFAP (CEVAMEX) por todo el apoyo logístico brindado durante este trabajo así como al Ing. Agr. Víctor Ruíz. Al Sr. Miguel Trejo y al Sr. José Antonio Sandoval García por toda su ayuda en diversas labores técnicas para el establecimiento del cultivo. LITERATURA CITADA Abadie T, A Berretta (2001) Caracterización y evaluación de recursos fitogenéticos. En: Estrategia en recursos fitogenéticos para los países de Cono Sur. Procisur. INIA. Uruguay. Espitia R E, Mapes S C, Escobedo L D, De la O Olán M, Rivas V P, Martínez T G, Cortés E L, Hernández C J M (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. INIFAP, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. 200 pp. FAO (1996) The state of the world’s plant genetic resources for food and agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 510 p. Frankel O H, Brown A H D (1984) Plant genetic resources today: a critical appraisal. In: Holden J. H. W., Williams J. T. (eds). Crop genetic resources: conservation and evaluation. Allen and Unwin, London, UK. pp 249-257. Grubben G J H, Van Sloten D H (1981) Genetics resources of amaranths International Board for Plant Genetic Resources, Rome. Italy. 57 pp. Hintum Van T J L (1995) Hierarchical approaches to the analysis of genetic diversity in crop plants In: Hodgkin, T. A. H. D., Brown, T. J. L. Hintum Van, E. A. V. Morales (eds). Core Collections of plant genetic resources John Wiley and sons, New York. pp. 23-34.

Capítulo XIII. Caracterización de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) para verdura

Peters J P, Galgway N W (1988) Germplasm collections and breeding needs in Europe. Economic Botany 42:503-521. Varalakshmi B (2005) Caracterización preliminar del germoplasma de la hortaliza amaranto (Amaranthus spp.). Amarantos. No. 23. Marzo 2005. República Argentina.

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Capítulo XIV

Distribución del amaranto cultivado y sus parientes silvestres y posibles zonas de adaptación en México DISTRIBUTION AND POTENTIAL ZONES OF ADAPTATION OF CULTIVATED AMARANTH AND ITS WILD RELATIVES IN MEXICO

Diana Escobedo-López1, Carlos A. Núñez-Colín1* y Eduardo Espitia-Rangel1 1Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Campo Experimental Bajío. Km. 6.5 Carretera Celaya-San Miguel de Allende, Apartado Postal 112, Celaya, Guanajuato, 38110, México. * Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN La presente investigación tuvo como objetivo generar mapas de zonas de adaptabilidad climática de las dos principales especies cultivadas de amaranto en México y de sus posibles ancestros silvestres con el fin de elucidar las hipótesis de sus posibles regiones de origen y domesticación. A. cruentus tiene una excelente adaptación en el occidente del Eje Volcánico Transmexicano. A. hypochondriacus está más restringido que A. cruentus y presenta una excelente adaptación en el centro y oriente del Eje Volcánico Transmexicano. A. hybridus presenta una distribución mucho más amplia que las especies cultivadas y presenta una excelente adaptación en el occidente del Eje Volcánico Transmexicano, que corresponden con las de A. cruentus por lo que podría ser su ancestro. A. powellii presenta una distribución más restringida que las otras especies estudiadas, y presenta una mejor adaptación en el Altiplano Mexicano. Sin embargo, las zonas con excelente adaptación de A. powellii al sur del Altiplano Mexicano en frontera con el Eje Volcánico Transmexicano es donde también presentan zonas de excelente adaptación tanto A. cruentus como A. hypochondriacus por lo que la hipótesis sobre la hibridación entre A. powellii y A.

cruentus para generar A. hypochondriacus pudiera haberse dado en esta región donde las tres especies convergen. Palabras clave: Amaranthus cruentus, A. hypochondriacus, A. hybridus, A. powellii, zonas de adaptabilidad climática. ABSTRACT The present research aims to make maps for regions of climatic adaptation of the two main cultivated species of amaranth in Mexico and their wild relatives ancestors to elucidate the hypothesis of their possible regions of origin and domestication. A. cruentus had an excellent adaptation in the west of Trans-Mexican volcanic axis. A. hypochondriacus had more restricted distribution than A. cruentus and it showed an excellent adaptation in centre and east of Trans-Mexican volcanic axis. A. hybridus had a distribution to much wider than the cultivated species and it showed an excellent adaptation in west of Trans-Mexican volcanic axis, which corresponded with the A. cruentus distribution thus A. hybridus could be the ancestor of A. cruentus. A. powellii had a distribution more restricted than the other studied species and it showed a better adaptation in the Mexican 203-211

Amaranto: Ciencia y Tecnología

plateau. Nevertheless, the regions with excellent adaptation of A. powellii in the southern Mexican plateau in limits to Trans-Mexican volcanic axis was where both A. cruentus and A. hypochondriacus also showed regions with excellent adaptation; that is why the hypothesis about the hybridization between A. powellii and A. cruentus to generate A. hypochondriacus could have occurred in this region where these three species converge. Key words: Amaranthus cruentus, A. hypochondriacus, A. hybridus, A. powellii, regions of climatic adaptability. INTRODUCCIÓN El género Amaranthus L. consiste de alrededor de 70 especies, de las cuales 40 son nativas del continente Americano y el resto de Australia, África, Asia y Europa (Costea et al., 2001). A. caudatus L., A. hypochondriacus L. y A. cruentus L. son las especies de amaranto que han creado un gran interés durante los años recientes como cultivos agrícolas en muchas regiones del mundo, debido al alto valor nutrimental de sus semillas y hojas (Costea et al., 2001). Las semillas de amaranto contienen diversos compuestos como péptidos antimicrobianos, inhibidores de las proteasas, lectinas y compuestos antioxidantes (ValdésRodríguez et al., 1993; Broekaert et al., 1992; Sánchez-Hernández et al., 2004; Sani et al., 2004). Además, recientemente algunos autores han detectado que proteínas del amaranto contienen diversos péptidos con actividades antihipertensivas y anticancerígenas (Sani et al., 2004; Edwards et al., 2007; Barba de la Rosa et al., 2007). En este sentido, existen cientos de artículos científicos que documentan el valor nutricional del amaranto además de su potencial agronómico, el manejo de sus recursos genéticos y los programas de mejoramiento de amaranto; sin embargo, una buena revisión sobre aspectos nutricionales se pueden encontrar en Kauffman y Weber (1990) y Kauffman (1992) y para una revisión sobre recursos genéticos y mejoramiento a nivel mundial en Brenner et al. (2000) y a nivel nacional en Espitia-Rangel (1994). 204

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De acuerdo con Grubben (1976) y Grubben y Van Sloten (1981) la especie A. cruentus L. es originaria de América Central, probablemente de Guatemala y sureste de México, donde se cultiva hasta hoy en día y donde también se encuentra ampliamente distribuida de manera natural. Sauer (1993) propuso que el progenitor más probable de A. cruentus es A. hybridus L. que actualmente se encuentra distribuida en una amplia gama de llanuras y montañas en norte, centro y sur del continente Americano. Por otro lado, Sauer (1950; 1967) indicó que A. hypochondriacus L. es originaria del centro de México, debido a que en esta zona se cultiva desde el tiempo de los aztecas y donde actualmente se sigue cultivando, además de que se encuentra ampliamente distribuida en todo México. Esta especie también se cultiva en los Himalayas en Nepal y en el sur de la India, donde se han formado centros secundarios de diversificación. Sauer (1993) mencionó que A. hypochondriacus presenta características tanto de A. cruentus como de la especie silvestre A. powelli Watson, y que incluso A. hypochondriacus pudiera ser un híbrido entre ambas especies. A. caudatus L. es otra especie cultivada para la producción de grano; es de día corto y se adapta mejor que las otras especies a las bajas temperaturas. Esta especie es originaria de los Andes (Sudamérica) y de aquí se distribuyó a otras zonas templadas y subtropicales (Grubben, 1976; Grubben y Van Sloten, 1981 y Hunziker, 1952). Las especies del género Amaranthus tienen una amplia distribución. De esta manera tenemos que el amaranto ha sido cultivado en ambientes que van desde los tropicales, hasta los semiáridos (Costea et al., 2001). Aún cuando el amaranto ha sido cultivado tradicionalmente en regiones comprendidas entre el ecuador y los 30º de latitud, este puede ser cultivado en latitudes mayores si se utilizan materiales que puedan florecer aún cuando no cuenten con el fotoperiodo de los trópicos (National Research Council, 1984). En México, la producción comercial de amaranto se concentra en cuatro regiones: el oriente del estado de Morelos principalmente en Huazulco y Amilcingo; San Miguel del

Capítulo XIV. Distribución del amaranto cultivado y sus parientes silvestres y posibles zonas de adapatación en México

Milagro en Tlaxcala; Amecac, Tochimilco, Tochimzolco y Santa Clara Tetla en Puebla, y Tulyehualco, Mixquic, Tetelco y Tecómitl en el Distrito Federal. Esporádicamente también se encuentran algunas parcelas en los estados de México, Oaxaca, Guerrero, Durango y más recientemente en Chihuahua, Guanajuato, Jalisco, San Luis Potosí y Michoacán (Espitia, 1992; Espitia-Rangel, 1994; Espitia-Rangel et al., 2010a). Espitia-Rangel et al. (2011b) hicieron un acercamiento a los patrones latitudinales y altitudinales de las dos especies cultivadas de México (A. cruentus y A. hypochondriacus) y sus posibles ancestros silvestres (A. hybridus y A. powellii). Estos autores encontraron que A. hybridus es el que presenta un rango mayor de adaptabilidad mientras que las otras tres especies presentan un rango más estrecho de adaptación, aunque no todas en el mismo sentido. Sin embargo, para complementar los datos de distribución es necesario hacer mapas de adaptabilidad de estas cuatro especies para compararlas y así elucidar las diferencias entre las zonas de adaptación de cada una de estas especies así como la frecuencia en diferentes condiciones de temperatura y precipitación (Hijmans et al, 2004; Guarino et al., 2002). Por lo que la presente investigación tiene como objetivo generar mapas de las zonas de adaptación potenciales de las dos especies cultivadas de amaranto en México y sus dos relativos silvestres para así elucidar las hipótesis de sus posibles regiones de origen y domesticación.

MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron 1994 datos de pasaporte tanto de materiales de herbario registrados en la Red Mundial de Información sobre Biodiversidad (CONABIO, 2009) como de la colección nacional de germoplasma de amaranto (Amaranthus spp.) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), de los cuales 626 datos son de A. cruentus; 771, de A. hybridus; 555, de A. hypochondriacus, y 42 de A. powellii. Dichos datos fueron corroborados taxonómicamente en el Herbario Nacional (MEXU) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Se realizó un análisis de los mapas de zonas de adaptación climática, calculados mediante el uso del procedimiento Bioclim del programa DIVA-GIS versión 7.1 (Hijmans et al., 2004) y la base de datos climáticos Worldclim (Hijmans et al., 2005) con una resolución de una cuadrícula de 2.5 minutos tanto de latitud como de longitud. El procedimiento Bioclim se utiliza para obtener zonas de adaptación climática basados en patrones climáticos a partir de localizaciones de especímenes de herbario y de germoplasma (Hijmans et al., 2004) y se emplearon las regiones biogeográficas propuestas por Morrone (2005) para ubicar las zonas de adaptación (Figura 1). Morrone (2005) dividió a México en 14 regiones biogeográficas de acuerdo a la climatología y condiciones ecológicas similares

Figura 1. Mapa de la división de México en sus 14 regiones biogeográficas de acuerdo a Morrone (2005). (1=California, 2=Baja California, 3=Sonora, 4=Altiplano Mexicano, 5=Tamaulipas, 6= Península de Yucatán, 7=Sierra Madre Occidental, 8=Sierra Madre Oriental, 9=Eje Volcánico Transmexicano, 10=Cuenca del Balsas, 11=Sierra Madre del Sur, 12=Costa Pacífica Mexicana, 13=Golfo de México y 14=Chiapas) D. Escobedo-López et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

sin tener en cuenta límites políticos, esto hace que se tenga una mejor perspectiva sobre la adaptación de las especies. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La mayor distribución de todas las especies cultivadas fue en el Centro Sur de México, en las regiones del Eje Volcánico Transmexicano y Sierra Madre del Sur, donde se ubican la mayor parte de las zonas de producción actuales (Espitia, 1992; Espitia-Rangel, 1994; EspitiaRangel et al., 2010a) así como en las regiones del Altiplano Mexicano, Sierra Madre Oriental y Sierra Madre Occidental, que es donde se ubican las nuevas zonas de cultivo (Espitia-Rangel et al., 2010a).

y Van Sloten (1981) que marcan que esta especie tiene un origen centroamericano. Williams y Brenner (1995) mencionan que la hipótesis centroamericana es por la gran variedad de usos que se le da en Guatemala y el sur de México, donde estos autores creen que fue domesticado, y que de ahí se movió hacia el norte, hasta el suroeste de Estados Unidos y al sur a los Andes, lo que explicaría porque A. cruentus es considerado ancestro de A. hypochondriacus (Sauer, 1993), que se cree que fue domesticado en el centro de México al formar un híbrido entre A. cruentus y A. powellii, y de A. caudatus (Coons, 1982), que fue domesticado en los Andes y se cree que es un híbrido entre A. cruentus y A. hybridus (en su variante de lo designado como A. quitensis Kunth).

Figura 2. Mapa de las zonas adecuadas de adaptación de A. cruentus.

A. cruentus mostró una mejor adaptación en el Eje Volcánico Transmexicano, Sierra Madre Oriental y Sierra Madre del Sur (Figura 2). Aunque presenta de buena a muy buena adaptación en partes del Altiplano Mexicano, la Sierra Madre Occidental, La Cuenca del Balsas y algunos puntos aislados en la parte sur de la Costa Pacífica Mexicana y el norte del Golfo de México. Las zonas con excelente adaptación están ubicadas en mayor medida en el Occidente del Eje Volcánico Transmexicano (Figura 2) aunque tiene una excelente adaptación a casi toda esta región biogeográfica. Al no encontrar zonas con excelente adaptación en el Sur de México, contrapone la hipótesis hecha por Grubben (1976) y Grubben 206

D. Escobedo-López et al.

Mientras que A. hypochondriacus está más restringido que A. cruentus y presenta una mejor adaptación al Eje Volcánico Transmexicano y Sierra Madre del Sur (Figura 3). Aunque presenta de buena a muy buena adaptación en partes del Altiplano Mexicano, la Sierra Madre Occidental y Sierra Madre Oriental. Las zonas con excelente adaptación están ubicadas en mayor medida en el centro y oriente del Eje Volcánico Transmexicano (Figura 2), que es donde se localizan muchas de las actuales zonas de cultivo (Espitia, 1992; Espitia-Rangel, 1994; Espitia-Rangel et al., 2010a). En este sentido, la hipótesis hecha por Sauer (1950; 1967) pudiera ser cierta porque esta especie tiene zonas con excelente

Capítulo XIV. Distribución del amaranto cultivado y sus parientes silvestres y posibles zonas de adapatación en México

Figura 3. Mapa de las zonas adecuadas de adaptación de A. hypochondriacus.

adaptabilidad en la zona de influencia de las culturas mesoamericanas. Por otro lado, A. hybridus presenta una distribución mucho más amplia que las especies cultivadas y presenta una mejor adaptación en el Eje Volcánico Transmexicano, Sierra Madre Oriental, Sierra Madre del Sur, Sierra Madre Occidental, sur del Altiplano Mexicano y en la Península de Yucatán (Figura 4). Las zonas con excelente adaptación en esta especie están principalmente en el occidente del Eje Volcánico Transmexicano, que corresponden con las de A. cruentus por lo que está de acuerdo con la hipótesis de Grubben (1976) y Grubben y Van Sloten (1981); por lo

tanto, A. hybridus puede ser el probable ancestro de A. cruentus al desarrollarse en ambientes similares, lo que antes había reportado también Costea et al. (2001). Sin embargo, A. hybridus está más ampliamente distribuida que las especies cultivadas pero también está presente en la mayoría de las regiones donde está distribuida A. cruentus. Por lo tanto puede generarse la hipótesis de que A. cruentus podría ser un material seleccionado de A. hybridus y que después fue domesticado en el occidente del Eje Volcánico Transmexicano, que es donde ambas especies tiene una excelente adaptación, hasta llegar a lo que ahora conocemos como la especie A. cruentus. Más aún, Xu y Sun (2001)

Figura 4. Mapa de las zonas adecuadas de adaptación de A. hybridus.

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encontraron que una accesión de A. hybridus estaba filogenéticamente relacionada con A. cruentus y que los grupos de estas dos especies estaban estrechamente relacionados usando marcadores moleculares. Caso similar reporta Costea y Tardif (2003) al comparar estructuras florales de estas dos especies encontrándolas muy emparentadas. Asimismo, hoy en día los beneficios económicos por la mejora de la producción y la calidad de los cultivos así como reducir el riesgo de pérdidas en las cosechas son muy significativos; por lo tanto los parientes silvestres como ancestros de los cultivos modernos proveen muchos genes útiles a las plantas de interés antropocéntrico (Zagaja, 1988). Por lo que A. hybridus puede ser una importante fuente de genes de adaptación para A. cruentus ya que presenta algunas características ventajosas descritas por Costea et al. (2001), debido a que aprovechando estas características se podría expandir la adaptabilidad de A. cruentus a zonas donde actualmente no se adapta de buena manera pero que si lo hace A. hybridus. A. powellii presenta una distribución más restringida que las otras especies estudiadas, y presenta una mejor adaptación en el Altiplano Mexicano, principalmente, aunque también tiene adaptación en la Sierra Madre Occidental y algunos fragmentos del Eje Volcánico Transmexicano y Sierra Madre Oriental (Figura 5).

Las zonas con buena adaptación de A. powellii al sur del Altiplano Mexicano en frontera con el Eje Volcánico Transmexicano es donde también presentan zonas de excelente adaptación tanto A. cruentus como A. hypochondriacus por lo que la hipótesis de Sauer (1993) sobre la hibridación entre A. cruentus y A. powellii para generar A. hypochondriacus pudiera haberse dado en esta región que es donde las tres especies convergen con zonas de excelente adaptación (Figuras 2, 3 y 5), que políticamente está al norte del Estado de México entre los estados de Querétaro e Hidalgo, y no hay ningún otra región en México donde converjan zonas con excelente adaptación de estas tres especies y que además es de las zonas con mayor riqueza específica reportada por Espitia-Rangel et al. (2010c). Aunque su posible domesticación pudiera ser más al sur en el Eje Volcánico Transmexicano, como lo mencionan Williams y Brenner (1995), muy cerca del Valle de México, que es donde A. hypochondriacus presenta la mejor adaptación (Figura 3) y donde A. cruentus también presenta buena adaptación pero no así A. powellii que tiene un patrón de distribución más hacia el norte. Por otro lado, estas cuatro especies, que pertenecen al mismo subgénero, pueden generar híbridos entre sí con cierta facilidad (Gupta y Gudu, 1991) por lo que la contaminación genética de los materiales cultivados por sus parientes silvestres puede ser alta, al igual que posibles genes transgénicos o de resistencia

Figura 5. . Mapa de las zonas adecuadas de adaptación de A. powellii.

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Capítulo XIV. Distribución del amaranto cultivado y sus parientes silvestres y posibles zonas de adapatación en México

pueden ser transferidos de los materiales cultivados a sus parientes silvestres. No obstante, la disponibilidad de diversidad genética es requisito fundamental en el mejoramiento de un cultivo, la cual se puede concentrar en un banco de germoplasma que además puede servir para la conservación de los recursos fitogenéticos (Zagaja, 1988). En nuestro país se impulsó la recolección de germoplasma de amaranto hasta que llegaron misiones extranjeras en busca de estos recursos; de manera conjunta con estos grupos exploratorios, a principios de la década de los noventa, se inició la recolección de la variabilidad genética existente. Hasta ahora se han colectado casi exclusivamente materiales cultivados de las especies A. hypochondriacus y A. cruentus (Espitia-Rangel, 1990) por lo que es precisamente de estas dos especies el mayor número de colectas que se tienen en la colección del INIFAP (Espitia-Rangel et al., 2010a). Sin embargo, también se han colectado materiales silvestres pero sólo se han realizado algunas colectas principalmente de A. hybridus con el propósito de aprovechar algunas características ventajosas (Costea et al., 2001) en mejoramiento genético, y por los resultados de este trabajo puede ser viable utilizar genes, principalmente de adaptación al ambiente, de A. hybridus para mejorar las especies cultivadas, principalmente A. cruentus. CONCLUSIONES A. hybridus presenta una distribución más amplia que las especies cultivadas y presenta una excelente adaptación en el occidente del Eje Volcánico Transmexicano, que corresponden con las de A. cruentus por lo que podría ser su ancestro. La especie A. cruentus tiene una excelente adaptación en el occidente del Eje Volcánico Transmexicano. A. hypochondriacus está más restringido que A. cruentus y presenta una excelente adaptación en el centro y oriente del Eje Volcánico Transmexicano. A. powellii presenta una distribución más restringida que las otras especies estudiadas, y presenta una mejor adaptación en el Altiplano Mexicano. Sin embargo, las zonas con excelente adaptación de A. powellii al sur del Altiplano Mexicano en frontera con el Eje Volcánico

Transmexicano es donde también presentan zonas de excelente adaptación tanto A. cruentus como A. hypochondriacus por lo que la hipótesis sobre la hibridación entre A. powellii y A. cruentus para generar A. hypochondriacus pudiera haberse dado en esta región donde las tres especies convergen. LITERATURA CITADA. Barba De La Rosa A P, C Silva Sánchez, E González De Mejía (2007) Chapter 9: Amaranth: an ancient crop for modern technology. In: TUNIK, M.H.; GONZÁLEZ DE MEJÍA, E. (eds.) Hispanic foods: Chemistry and flavor. American Chemical Society, Washington. pp. 103-116. Brenner D M, D D Baltensperger, P A Kulakow, J W Lehmann, R L Myers, M M Slabbert, B B Sleugh (2000) Genetic resources and breeding of Amaranthus. Plant Breeding Reviews 19: 227-285. Broekaert W F, W Marien, F R G Terras, M F C De Bolle, P Proost, J Van Damme, L Dillen, M Claeys, S B Rees (1992) Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins. Biochemistry 31: 4308-4314. Comisión Nacional Para El Conocimiento y Uso De La Biodiversidad (Conabio) (2009) Red Mundial de Información sobre la Biodiversidad-Especímenes (REMIB). In: website of the Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad de México. Available to: http://www.conabio.gob. mx/remib/doctos/remib_esp.htlm, Consulted October, 1st, 2009. COONS M P (1982) Species and varieties. Relationships of Amaranthus caudatus. Economic Botany 36:119-146. Costea M, A Sanders, G Waines (2001) Preliminary results toward a revision of the Amaranthus hybridus species complex (Amaranthaceae). SIDA 19:931-974.

D. Escobedo-López et al.

209

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Costea M, F J Tardif (2003) The bracteoles in Amaranthus (Amaranthaceae): their morphology, structure, function and taxonomic significance. SIDA. 20:969-985. Edwards R J, N Moran, M Devocelle, A Kiernan, G Meade, F M Signac, S D E Park, E Dunne, D D C Kenny Shields (2007) Bioinformatic discovery of novel bioactive peptides. Nature Chemical Biology 3: 108-112. Espitia E (1992) Amaranth germplasm development and agronomic studies in México. Food Reviews International 8: 71-86. Espitia E (1990) Situación actual y problemática del cultivo de amaranto en México. In: TRINIDAD-SANTOS, A.; GÓMEZLORENTE, F. Y SUAREZ-RAMOS, G. (eds.) El amaranto (Amaranthus spp.). su cultivo y su aprovechamiento. Colegio de Postgraduados, Montecillos, México. pp. 101-109 Espitia R E (1994) Breeding of grain amaranth. In: PAREDES-LÓPEZ, O. (ed.) Amaranth: biology, chemistry, and technology. CRC press, Boca Raton, USA. p. 23-38. Espitia R E, L D Escobedo, S E C Mapes, C C A Núñez (2010c) Áreas prioritarias para colectar germoplasma de Amaranthus en México con base en la diversidad y riqueza de especies. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 1: 609-617 Espitia R E, S E C Mapes, L D Escobedo, O O M De La, V P Rivas, T G Martínez, E L Cortés, C J M Hernández (2010a) Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. Centro de Investigación Regional Centro-INIFAP, Celaya. 203 p. Espitia R E, E C Mapes, C C A Núñez, L D Escobedo (2010b) Geographical distribution of cultivated species of Amaranthus and their wild relatives in Mexico. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 1: 427-437.

210

D. Escobedo-López et al.

Grubben G J H (1976) The cultivation of amaranth as a tropical leaf vegetable, with special reference to South-Dahomey. Communications No. 67, Royal Tropical Institute, Amsterdam, Netherlands. 207 p. Grubben G J H, D H V Sloten (1981) Genetic resources of amaranths: a global plan of action. AGP: IBPGR 80/2. IBPGR, FAO, Roma, Italia. 57 p. Guarino L, A Jarvis, R J Hijmans, N Maxted (2002) (36) Geographic Information Systems (GIS) and the Conservation and Use of Plant Genetic Resources. In: ENGELS, J.M.M.; RAMANATHA RAO, V.; BROWN, A.H.D.; JACKSON, M.T. (eds.) Managing Plant Genetic Diversity. International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), Rome. pp. 387-404. Gupta V K, S Gudu (1991) Interspecific hybrids and possible phylogenetic relations in grain amaranths. Euphytica 52: 33-38. Hijmans R J, S E Cameron, J L Parra, P G Jones, A Jarvis (2005) Very high resolution interpolated climate surfaces for global land areas. International Journal of Climatology 25: 1965-1978. Hijmans R J, L Guarino, C Bussink, P Mathur, M Cruz, I Barrantes, E Rojas (2004) DIVA-GIS Versión 4. Sistema de información geográfica para el análisis de datos de distribución de especies. International Potato Center, Lima. 83 p. Hunziker A T (1952) Pseudocereales de la agricultura indígena de América. ACME, Buenos Aires, Argentina. 104 p. Kauffman C S (1992) Realizing the potential of grain amaranth. Food Reviews International 8: 5-21. Kauffman C S, L F Weber (1990) Grain amaranth. In: JANICK, J; SIMON, J. E. (ed.) Advanced in new crops. Timber Press, Portland, USA. p. 127-139.

Capítulo XIV. Distribución del amaranto cultivado y sus parientes silvestres y posibles zonas de adapatación en México

Morrone J J (2005) Hacia una síntesis biogeográfica de México. Revista Mexicana de Biodiversidad 76: 207-252 NATIONAL RESEARCH COUNCIL (1984) Amaranth Modern Prospects for an Ancient Crop. National Academy Press, Washington, USA. 83 p. Sánchez H C, G N Martínez, R A Guerrero, R S Valdés, F J Délano (2004) Trypsin and a-amylase inhibitors are differentially induced in leaves of amaranth (Amaranthus hypochondriacus) in response to biotic and abiotic stress. Physiologia Plantarum 122: 254-264.

Xu F, M Sun (2001) Comparative Analysis of Phylogenetic Relationships of Grain Amaranths and Their Wild Relatives (Amaranthus; Amaranthaceae) Using Internal Transcribed Spacer, Amplified Fragment Length Polymorphism, and Double-Primer Fluorescent Intersimple Sequence Repeat Markers. Molecular Phylogenetics and Evolution 21: 272-287. Zagaja S W (1988) Exploración de recursos genéticos. In: MOORE, J.N.; JANICK, J. (eds.) Métodos genotécnicos en frutales. AGT Editor, Ciudad de México. pp. 3

Sani H A, A Rahmat, M Ismail, R Rosli, S Endrini (2004) Potential anticancer effect of red spinach (Amaranthus gangengitus) extract. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition 13: 396-400. Sauer J D (1950) The grain amaranths: a survey of their history and classification. Annals of the Missouri Botanical Garden 37: 561-632. Sauer J D (1967) The grain amaranths and their relatives: a revised taxonomic and geographic survey. Annals of the Missouri Botanical Garden 54: 103-137. Sauer J D (1993) Historical geography of crop plants: a select roster. CRC press, Los Angeles, USA. 320 p. Valdés R S, N M Segura, L A Chagolla, Y Verver, C A Vargas, G N Martínez, L A Blanco (1993) Purification, characterization, and complete amino acid sequence of a trypsin inhibitor from amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seeds. Plant Physiology 103: 1407-1412. Williams J T, D Brenner (1995) Grain amaranth (Amaranthus species). In: WILLIAMS J T (ed). Cereals and pseudocereals. Chapman & Hall, London, UK. P 129-185.

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Citogenética y Mejoramiento Genético

Capítulo XV

Número cromosómico (2n) y cariotipo en especies de grano y verdura de Amaranthus spp. de México CHROMOSOME NUMBER (2N) AND KARYOTYPE OF GRAIN AND GREEN Amaranthus SPECIES IN MEXICO

Guadalupe Palomino1*, Reyes Rubí V.1, Javier Martínez1 y Cristina Mapes Sánchez2 1Laboratorio de Citogenética, Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito Exterior s/n. Ciudad Universitaria. Delegación Coyoacán. C.P. 04510 México Distrito Federal, México. Tel. 01 55 56 22 90 45 2Colección de Etnobotánica, Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán. C.P. 04510 México D.F., México. *Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN Se reporta el número cromosómico (2n) y el cariotipo de cinco especies y razas de Amaranthus utilizadas como grano o verdura y que forman parte del germoplasma existente en México. En Amaranthus hypochondriacus L. raza Azteca cultivado y utilizado como grano, se observó 2n = 34 y un cariotipo formado por 6m+3sm+3st+5t; Amaranthus cruentus L. raza Mexicana cultivado y usado como grano presentó 2n = 34 y un cariotipo de 6m+3sm+2st+6t; Amaranthus hybridus x Amaranthus hypochondriacus raza Mixteca, plantas arvenses, empleadas como verdura se observó un 2n = 34 y un cariotipo de 5m+2sm+3st+7t; Amaranthus hybridus L., corresponden a plantas ruderales y mostró 2n = 34 y un cariotipo formado por 5m+3sm+3st+6t. En esta especie se observó en todas las plantas analizadas, variación en el número cromosómico: 76% de las células con 2n = 34; 16% mostró 2n = 32 y 16% con 2n = 33 cromosomas. Este comportamiento ha sido observado en planta híbridas por otros autores. Amaranthus hypochondriacus L. raza Mixteca, corresponden a plantas fomentadas o inducidas en la milpa o en los cultivos, son utilizadas como verdura y mostraron 2n = 32 y un

cariotipo de 8m+1sm+3st+4t. En todas las razas y especies de Amaranthus estudiadas, se observó un par de cromosomas con satélite. Las especies y razas de Amaranthus estudiadas, mostraron tener dos de los números básicos (x = 16 y 17) reportados para el género. Los cromosomas de estas plantas son pequeños y miden 0.6 - 1.8 µm. La presencia de cromosomas metacéntricos, submetacéntrico, subtelocéntricos y telocéntricos sugiere que en la evolución de los cariotipos de estas plantas, se han involucrado cambios estructurales en sus cromosomas, como son deleciones, translocaciones o inversiones que ya han sido observados por otros autores en híbridos de especies del género. Palabras clave: Amaranthus spp.; números cromosómicos (2n), cariotipos. ABSTRACT The chromosome number 2n and karyotype of five species and races of Amaranthus consumed as pseudocereal or edible greens is reported. These species are part of the extant germplasm in Mexico. Amaranthus hypochondriacus L. Aztec race, cultivated for its grain, presented 2n = 34 and a karyotype of 6m+3sm+3st+5t; 215-226

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Amaranthus cruentus L. Mexican race, cultivated for its grain, presented 2n = 34 and a karyotype of 6m+3sm+2st+6t; Amaranthus hybridus × A. hypochondriacus Mixtec race, a weed used as a vegetable, presented 2n = 34 and a karyotype of 5m+2sm+3st+7t; Amaranthus hybridus L., a ruderal, showed 3n = 34 and a karyotype of 5m+3sm+3st+6t. In all observed plants of these species, variation in the chromosome number (2n) was found: 76% of the cells showed 2n = 34; 16% showed 2n = 32 and 16% showed 2n = 33 chromosomes. This behavior has been observed in hybrid plants by other authors. Amaranthus hypochondriacus L. Mixtec race, is a plant tolerated in the milpa or in crops, and used as a vegetable; presented 2n = 32 and a karyotype of 8m+1sm+3st+4t. All the races and species of Amaranthus studied proved to possess two basic numbers, reported for the genus, x = 16 and 17. The chromosomes of these plants are small, measuring 0.6 – 1.8 μm. The presence of metacentric, submetacentric, subtelocentric and telocentric chromosomes suggests that structural chromosomal changes, such as deletions, translocations, and inversions, have been involved in the karyotypic evolution of these plants. These chromosomal rearrangements have also been observed by other authors in interspecific hybrids in the genus. Key words: Amaranthus spp., chromosome number (2n), karyotype. INTRODUCCIÓN El GÉNERO Amaranthus Amaranthus es un género de plantas herbáceas, se encuentra compuesto por aproximadamente 60-70 especies, 40 de las cuales son de América y el resto se encuentran en Australia, África, Asia y Europa (Sauer, 1967; Espitia et al., 2010). Sus principales centros de distribución son las áreas tropicales de América y la India, aun cuando en los trópicos de África y Australia se encuentra un gran número de especies (Feine et al., 1979; Sauer, 1967, 1976; Pal et al., 2000). Tres de las especies de Amaranthus son económicamente importantes por la producción de semilla comestible: A. caudatus L., A. cruentus L. y A. hypochondriacus L. Las semillas de amaranto han sido empleadas en 216

G. Palomino et al.

la elaboración de dulces, granolas y hojuelas. Además la harina obtenida de estas semillas se utiliza para la elaboración de galletas, cremas, pastas etc. (Mapes-Sánchez, 2010). Las semillas de amaranto son ricas en lisina (Becker et al., 1981). El alto contenido de proteínas en estas semillas, las hacen económicamente redituables. El contenido de proteína varía entre 12.5 a 22.5 % del peso seco de la semilla (Breener, 1991). Las hojas de varias especies de amaranto son consumidas como verdura, particularmente en algunos poblados de la Sierra Norte de Puebla (Mapes-Sánchez et al., 1998) y en el Estado de México. Desde el punto de vista nutricional, también son especies importantes ya que contienen altas concentraciones de vitaminas y minerales (Spillari et al., 1989). ORIGEN Y NÚMERO BÁSICO (x) EN ESPECIES DE Amaranthus El género se consideraba dibásico con x= 16 y x= 17. Pal et al. (2000), reporta un nuevo número básico para el género de x = 14, observado en Amaranthus tenuifolius con 2n = 28, distribuido en el norte y sur de la India. Con esta información, el género Amaranthus se puede considerar tribásico con x = 14, 16 y 17. En algunos casos se reportan los x = 16 y 17 para una misma especie (Grant, 1959; Khoshoo y Pal, 1972; Pal y Khoshoo, 1973; Pal et al., 1982; Sheidai y Mohammadzadeh 2008). Los números básicos del género (x = 14, 16 y 17) se presentan tanto en la sección Amaranthus como en la sección Blitopsis, aunque en la última se presenta principalmente x=17. Pal y Khoshoo (1973) y Pal et al. (1982), plantearon que x=17 derivó de x=8 y x=9 (números básicos comunes en Amaranthaceae). Una relación entre los dos números básicos fue planteada por Pal et al. (1982) estudiando un híbrido entre A. hypochondriacus (n=16) y A. hybridus (n=17). En las plantas híbridas, estos autores encontraron 2n= 32, 33 y 34 cromosomas; estos autores postulan que x=17 surgió del x=16 por trisomía primaria. Con esta información se plantea el origen paleotetraploide del género con 2n=4x=32. Todos los granos de Amaranthus son diploides con 2n= 32 y 34. La aneuploidía ha sido un factor que favorece la variación y ocurre naturalmente por hibridación, especialmente

Capítulo XV. Número cromosómico (2n) y cariotipo en especies de grano y verdura de Amaranthus spp. de México

cuando las especies de grano y las especies silvestres crecen juntas (Williams y Brenner 1995). En relación al origen de las especies cultivadas, Sauer (1967) considera que A. hybridus (n=16) originó a A. cruentus (n=17) en América Central; esta especie emigró al norte y se cruzó con A. powelli (n = 17) dando origen, luego de repetidas hibridaciones a A. hypochondriacus (n = 16). La migración de A. cruentus hacia el sur y después de repetidos cruzamientos con A. quitensis (n = 16) originó a A. caudatus (n = 16). Esta hipótesis postula un antecesor común en estas especies que permitiría explicar la presencia de caracteres compartidos por todas las especies cultivadas y silvestres de amaranto. Khoshoo y Pal (1972) proponen que cualquiera que sea su origen, las especies de grano tuvieron su origen en uno o varios progenitores silvestres por domesticación. Mallory et al. (2008) consideran que las especies de grano A. hypochondriacus, A. cruentus y A. caudatus se clasifican de acuerdo a sus progenitores putativos: A. hybridus L. A. quitensis H.B.K. y A. powelli S. Wats, que se originaron a través del complejo de A. hybridus, considerado como un paleo-alotetraploiode (2n = 4x = 32), aunque han sido reportados 2n = 32 y 34 para A. cruentus. (Pal et al., 1982; Greizerstein y Poggio 1994,1995; Greizerstein et al., 1997). Pal et al. (1982) sugiere que el número gamético n = 17 se originó del n= 16 a través de trisomía primaria. Greizerstein y Poggio (1994; 1995), en base a análisis citogenético en híbridos interespecíficos apoyan esta hipótesis y proponen que las especies con 2n = 32 son poliploides con un x = 8 y que el x = 16 corresponde a un número cromosómico básico derivado. El x = 17 podría haber aparecido después por trisomía primaria. CROMOSOMAS DE Amaranthus El género Amaranthus se caracteriza por presentar la mayor homogeneidad en número cromosómico y los cromosomas más pequeños de la familia Amaranthaceae (Behera y Patnaik, 1974; Song et al., 2002). Varios autores mencionan que A. caudatus, A. hypochondriacus y A. hybridus presentan 2n = 32, mientras que A. cruentus 2n = 34 (Pal y Koshoo, 1973; Pal et al. 1982). Sin embargo, Auquier y Renard (1975) y Dimitrieva (1986) encuentran para A.

cruentus var. cruentus 2n=32. Pal. et al. (1982), Greizerstein y Poggio (1995) reportan 2n = 32 y 34 para A. cruentus. Así mismo Tandon y Tawakley (1970) reportan 2n = 34 para A. hypochondriacus. Pal et al. (1982) reportan para A. hybridus proveniente de África 2n = 34. Los estudios sobre la genética del género se han centrado en la hibridación interespecífica, la expresión del sexo, la poliploidía (Feine et al., 1979), sobre la herencia de algunos caracteres y más recientemente en estudios moleculares (Ranade et al., 1997; Lee et al., 2008; Mallory et al., 2008; Maughan et al., 2008; Maughan et al., 2009). Los resultados de numerosos trabajos muestran que en general las especies presentan una meiosis normal (Pal et al., 1982; Sheidai y Mohammadzadeh, 2008), sin embargo los híbridos interespecíficos entre especies domesticadas y malezas muestran algunas alteraciones como son irregularidades en paquíteno, zonas no apareadas en algunos bivalentes heteromórficos, duplicaciones y evidencia de heterocigosis para inversiones pericéntricas; en general estos híbridos muestran valores bajos de viabilidad en el polen. Algunos híbridos han sido exitosos y presentan frecuencias quiasmáticas intermedias a la que poseen sus progenitores, obteniéndose a veces plantas normales en la generación F2. En otros casos los híbridos son plantas débiles y presentan malformaciones fenotípìcas y en algunos casos son inviables (Pal, 1972; Pal y Koshoo, 1973; Greizerstein y Poggio, 1995). Se ha observado que al menos en la mitad de las especies de Amaranthus está involucrada la hibridación interespecífica natural y es un factor que ha causado la gran variación dentro de las especies y la complejidad en la taxonomía del género (Sauer, 1957). Se han realizado estudios citogenéticos en materiales de Norte y Sur América, Asia y la India, incluyendo especies cultivadas, algunas domesticadas y las malezas consideradas ancestros de ellas, también se han incluido en estos estudios híbridos interespecíficos y poliploides artificiales. En México existen varias especies de Amaranthus en distintas etapas de domesticación, encontrándose plantas cultivadas, arvenses, ruderales y fomentadas (Bye, 1998; Mapes et al., 1998). Las especies cultivadas generalmente son utilizadas G. Palomino et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

como grano como A. hypochondriacus raza Azteca y A. cruentus raza Mexicana y presentan semilla blanca. Las especies utilizadas como verdura generalmente son arvenses o ruderales y presentan semilla negra. En la Sierra Norte de Puebla, se utilizan las hojas tiernas de A. hybridus, A. hypochondriacus y A. cruentus, consideradas como plantas fomentadas o inducidas en la milpa mediante dispersión intencional de la semilla, cuando una nueva parcela se abre al cultivo (Mapes et al., 1998). Estas especies no han sido incluidas en estudios citogenéticos, aunque nuestro país es considerado como uno de los centros de origen y diversificación del género (Espitia et al., 2010). OBJETIVOS Obtener el número cromosómico somático 2n, cariotipo y niveles de poliploidía en poblaciones de: A. hypochondriacus raza Azteca, A. cruentus raza Mexicana, utilizados como grano; Amaranthus hybridus x Amaranthus hypochondriacus raza Mixteca; A. hybridus y A. hypochondriacus raza Mixteca, empleados como verdura. Estas especies y razas de Amaranthus representan parte del gradiente de germoplasma existente en México. La finalidad de estos análisis es evaluar la variación inter e intraespecífica en los genomas de estas plantas; esta información es básica para plantear estrategias de mejoramiento, biotecnología y conservación in situ y ex situ en estas especies. MATERIALES Y MÉTODOS PLANTAS UTILIZADAS Se analizaron siete poblaciones de cinco taxa de Amaranthus, tres de las cuales correspondieron a A. hypochondriacus L. raza Azteca, cultivada y empleada por su semilla (Mapes et al., 1998), colectadas en Tulyehualco, D. F.; A. cruentus

L. raza Mexicana, también cultivada y utilizada por su semilla (Mapes et al., 1998) colectada en Huazulco, Mor.; Amaranthus hybridus x Amaranthus hypochondriacus raza Mixteca, son consideradas plantas arvenses y consumidas como verdura (Mapes et al., 1998), se colectaron en San Miguel Tianguisalco, Pue.; Amaranthus hybridus L., corresponden a plantas ruderales, utilizadas como verdura y aparecen en los márgenes de los cultivos de maíz (Mapes et al., 1998), colectadas en Chalco, Estado de México y A. hypochondriacus L. raza Mixteca consideradas plantas fomentadas o inducidas, en las cuales se realiza la dispersión de sus semillas en la nueva parcela, son utilizadas como verdura (Mapes et al., 1997, 1998), fueron colectadas en Hueyapan, Pue. (Cuadro 1). Los ejemplares herborizados de cada colección, se depositaron en el Herbario Nacional MEXU. Las semillas que se utilizaron en este trabajo fueron colectadas directamente de las plantas. Estos materiales fueron identificadas por los doctores C. Mapes, R. Bye y E. Espitia (Cuadro 1). Se germinaron 20 semillas de cada colecta, colocando cada individuo en una mezcla de tierra negra y de hoja en proporción de 1 a 1. Una vez obtenidas las plantas, se colocaron en macetas y se mantuvieron en los invernaderos del Jardín Botánico, Instituto de Biología, UNAM. CONTEOS CROMOSÓMICOS, CARIOTIPOS E IDIOGRAMAS Para la observación del número cromosómico 2n y elaboración del cariotipo en plantas de Amaranthus, se utilizaron 20 células en metafase mitótica de diez individuos de cada población. Los ápices de raíces secundarias se colocaron en una solución de 8-hidroxiquilnoleína 0.002 M por 5 h a 18° C en obscuridad. Posteriormente se fijaron las puntas de raíz en una solución Farmer

Cuadro 1. Localidades y datos de colecta de poblaciones, especies y razas de Amaranthus Especie y raza A. hypochondriacus raza Azteca A. hypochondriacus raza Azteca A. hypochondriacus raza Azteca A. cruentus raza Mexicana A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca A. hybridus. A. hypochondriacus raza Mixteca

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Colector Uso No. de Colecta R. Bye y E. Linares 14855 A., 1987 grano R. Bye y E. Linares 14855 C., 1987 grano R. Bye y E. Linares 14855 , 1987 grano E. Espitia grano 1018c-3 R. Bye y E. Linares 15187, 1987 verdura C. Mapes C. Mapes

742, 1987 739, 1987

verdura verdura

Color de la semilla blanca blanca blanca blanca negra negra negra

Localidad Tulyehualco, D.F. Tulyehualco, D.F. Tulyehualco, D.F. Huazulco, Morelos. San Miguel Tianguisalco, Puebla. Chalco, Estado de México. Hueyapan, Puebla.

Capítulo XV. Número cromosómico (2n) y cariotipo en especies de grano y verdura de Amaranthus spp. de México

(tres partes de alcohol absoluto: una parte de ácido acético glacial) por 24 h. Las puntas de raíz se hidrolizaron con HCl (1N) 15 min a 60° C y los cromosomas se tiñeron con reactivo de Schiff por una hora, después se colocaron en orceína acética al 1.8%. Las preparaciones se congelaron en hielo seco (Conger y Fairchield, 1953) y se montaron en bálsamo de Canadá. Las mejores células se fotografiaron en un fotomicroscopio Zeiss modelo II, utilizando una cámara Axio Vision de Carl Zeiss, utilizando el programa Axio Vision Rel. 4.7. Las imágenes se almacenaron en un programa de imágenes Tif.y en JPG, después se utilizó un programa Adobe Photoshop para la edición de las imágenes. Las fotografías se utilizaron para medir los brazos cromosómicos y la longitud total del genoma. La posición del centrómero se obtuvo siguiendo a Levan et al. (1964), el cociente de los brazos cromosómicos (r = brazo largo/corto; p/q) se calculó para cada cromosoma. La homología cromosómica se estableció de acuerdo con las similitudes en longitud y posición centromérica. Adicionalmente la constricción secundaria fue utilizada para distinguir pares de cromosomas homólogos entre poblaciones. Los idiogramas se construyeron de acuerdo con los valores promedio de nueve

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los números cromosómicos 2n y el cariotipo de especies y razas de Amaranthus se presentan en el Cuadro 2. Las fotografías de los cromosomas somáticos (2n) y los idiogramas, se muestran en el Cuadro 2 y las Figuras 1A- B - 5A- B. En estas investigaciones observamos 2 números cromosómicos 2n = 2x =32 (x = 16) y 2n = 2x = 34 (x = 17) para cinco especies y razas de Amaranthus, utilizados como semilla o como verdura (Cuadro 2). Estos resultados son congruentes con los números cromosómicos básicos x = 16 y x= 17 ya informados para el género por varios autores (Grant, 1959; Khoshoo y Pal, 1972; Pal et al., 1982; Greizerstein y Poggio, 1994, 1995; Song et al., 2002; Sheidai y Mohammadzadeh, 2008). Pal et al. (2000) reportan el 2n = 28; x = 14, encontrado en Amaranthus tenuifolius distribuído en el norte y sur de la India. Con esta información se puede considerar al género Amaranthus como tribásico con x = 14, 16 y 17. En algunos casos, ambos números cromosómicos (n = 16 y 17) han sido reportados para la misma especie, como en A. hypochondriacus 2n = 32 (Pal y Khoshoo, 1973; Pal et al., 1982) y 2n = 34 (Tandon y Tawakley, 1970).

Cuadro 2. Números cromosómicos 2n y cariotipos de especies y razas de Amaranthus

2n Especie y raza 34 A. hypochondriacus raza Azteca 34 A. cruentus raza Mexicana 34 A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca 32, 33, 34 A. hybridus 32 A. hypochondriacus raza Mixteca

Longitud de la cromatina haploide (µm) Índice de Constricciones Fórmula Intervalo de longitud X± EE asimetría TF (%) secundarias cariotípica de los cromosomas 16.20 ± 0.43 27.04 1sm 6m+3sm+3st+5t 0.6-1.6 16.80 ± 0.41 28.72 1m 6m+3sm+2st+6t 0.5-1.8 16.10 ± 0.42 23.36 1m 5m+2sm+3st+7t 0.5-1.4 0.6-1.6 0.6-1.6

5m+3sm+3st+6t 8m+1sm+3st+4t

células, utilizando el valor del brazo largo y corto en cada par de cromosomas y se agruparon en cromosomas metacéntricos (m), submetacéntricos (sm), subtelocéntricos (st) y telocéntricos (t). El número de los cromosomas homólogos se asignó siguiendo la reducción en la longitud de los cromosomas, para un total de 16 ó 17 pares, dependiendo de la especie y raza de amaranto. El índice de asimetría (TF%) se obtuvo conforme a Sharma y Sharma (1959); Sinha y Roy (1979).

1m 1sm

17.40 ± 0.43 16.60 ± 0.42

25.16 33.49

En las tres poblaciones de A. hypochondriacus raza Azteca, especie utilizada como grano que crece en Tulyehualco, Estado de México, se observó un 2n = 34 coincidiendo con lo observado por Tandon y Tawakley (1970). En contraste A. hypochondricus raza Mixteca presentó 2n = 32. Esta especie crece en Hueyapan, en la región montañosa en el norte del estado de Puebla, donde es mantenida en el campo de maíz bajo condiciones ecológicas diferentes a donde crece A. hypochondriacus raza Azteca. El 2n = 32 concuerda con el observado por Pal y Khoshoo (1973), Pal et al. (1982) G. Palomino et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

y Greizerstein y Poggio (1994, 1995). Sin embargo es diferente al 2n = 34 encontrado para las poblaciones de A. hypochondriacus raza Azteca localizado en Tulyehualco, D. F., coincidiendo con el 2n = 34 encontrado para esta especie por Tandon y Tawakley (1970). A. cruentus raza Mexicana, también una especie cultivada para grano que crece en Huazulco, Mor., presentó 2n=34. Este resultado es acorde con los 2n informados por Tandon y Tawakley (1970), Pal et al. (1982) y Greizerstein y Poggio (1994; 1995). Sin embargo Auquier y Renard (1975) y Dimitrieva (1986) encontraron 2n=32 para esta especie. Para A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca, plantas arvenses de San Miguel Tianguisalco, Pue. y para A. hybridus, población ruderal de Chalco en el Estado de México, se observó 2n = 34. Las plantas de estas dos poblaciones son utilizadas como verdura. El 2n = 34 es igual al reportado para poblaciones de A. hybridus de África estudiadas por Pal et al. (1982). Sin embargo, los resultados encontrados en este estudio contrastan con la mayoría de los informes de la literatura donde observaron un 2n = 32 para Amaranthus hybridus (Grant 1959, Pal y Koshoo 1973; Greizerstein et al., 1997). En la población de A. hybridus analizada en estas investigaciones, se observó una variación significativa en el número cromosómico. En una muestra de diez plantas, se observó que el 76% de las células presentaron 2n = 34, 16% con 2n = 32 y 8% con 2n = 33. Estos porcentajes de variación fueron semejantes en cada planta analizada. Estas variantes en el 2n pueden deberse a translocaciones recíprocas o aneuploidías, como las reportadas por Pal et al. (1982) para híbridos obtenidos entre cruzas dibásicas de A. dubius (n = 16) y A. spinosus (n = 17), donde estos autores observaron los tres números cromosómicos (2n = 32, 33 y 34). En las plantas de A. hybridus investigadas en este trabajo, el 2n = 34 fue el más frecuente, sin embargo en nuestros análisis y en los realizados por Pal (1972); Pal et al. (1982); Behera y Patnik (1974, 1982), observaron variaciones en el número cromosómico de híbridos entre A. dubius (2n = 32) y A. spinosus (2n = 34). Los resultados obtenidos en este trabajo, también son similares a los obtenidos por Pal et al. (1982), al realizar cruzas inter 220

G. Palomino et al.

específicas entre A. hypochondriacus (n=16) y A. hybridus (n=17). Estos autores observaron en los híbridos porcentajes altos (98%) de 15 bivalentes + 1 univalente y solo el 2% con 16 bivalentes+ 1 univalente, originando gametos con n = 16 y n = 17. En la A1 del híbrido, estos autores observaron bajo porcentaje de segregación anormal, originando gametos con n = 16 y n = 17. En las plantas de la generación F2, obtuvieron 2n= 32, 33 y 34 en una proporción de 1:2:1, siendo el 2n=33 el más frecuente. En A. hypochondriacus raza Mixteca de Hueyapan, Pue., se observó un 2n = 32 (Cuadro 2). Estas plantas son consideradas como fomentadas o inducidas, y también son usadas como verdura (Mapes et al., 1998). En las especies y razas de Amaranthus analizadas, el tamaño de los cromosomas fue muy pequeño y varió de 0.5 a 1.8 µm, (Cuadro 2), coincidiendo con lo observado por Greizerstein y Poggio, (1994; 1995; Greizerstein et al., 1997 y Song et al., 2002). En estas investigaciones observamos para las tres poblaciones analizadas de A. hypochondriacus raza Azteca (2n = 34) un cariotipo formado por seis pares de cromosomas metacéntricos, tres de submetacéntricos, tres de subtelocéntricos y cinco de telocéntricos (6m+3sm+3st+5t); se observó una constricción secundaria en un par de cromosomas submetacéntricos (Cuadro 2; Figuras 1A y 1B). Greizerstein y Poggio (1994) analizaron una población de A. hypochondriacus con 2n=32 y un cariotipo formado por 5m+4sm+1st+6t, con un par de cromosomas con satélite. La población de A. hypochondriacus (2n = 32) varió de la estudiada en estas investigaciones en el 2n, ya que A. hypochondriacus raza Azteca mostró 2n = 34 y en la proporción de cromosomas metacéntricos, submetacéntricos, subtelocéntricos y telocéntricos. Los números indican el par cromosómico correspondiente y el asterisco señala el par de cromosomas con satélite. La escala 1A equivale a 10 µm, y la 1B a 5 µm. Las plantas de A. cruentus raza Mixteca analizadas, presentaron 2n=34 y un cariotipo formado de: 6m+3sm+2st+6t; también se observó una constricción secundaria en 1 par de cromosomas metacéntricos, Figuras 2A, 2B. Los cariotipos de A. hypochondriacus raza Azteca y de

Capítulo XV. Número cromosómico (2n) y cariotipo en especies de grano y verdura de Amaranthus spp. de México

Figura1. A. hypochondriacus raza Azteca. (A) Célula somática con 2n= 34. Las flechas y números indican el par de cromosomas submetacéntrico con satélite. (B) Idiograma que muestra el cariotipo de A. hypochondriacus raza Azteca con 6m + 3sm + 3st + 5t.

A. cruentus raza Mexicana fueron muy similares, variando solo en un par de cromosomas subtelocéntricos y otro de telocéntricos (Cuadro 2; Figuras 2A y 2B). Greizerstein y Poggio (1994) reportan para A. cruentus un 2n = 34 y un cariotipo de 3m+7sm+7t, con un par cromosómico con satélite. Los resultados obtenidos por estos autores para A. cruentus, varían de los obtenidos para esta especie en estas investigaciones en la proporción de cromosomas metacéntricos, submetacéntricos, subtelocéntricos y telocéntricos. Para A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca, se observó un 2n=34, un cariotipo de 5m+2sm+3st+7t y la presencia de un satélite en un par de cromosomas metacéntricos (Cuadro 2; Figuras 3A y 3B). Estos valores son muy parecidos a los observados en A. hybridus con 2n = 34 y un cariotipo de 5m+3sm+3st+6t (Cuadro 2; Figuras 4A y 4B) y al observado en A. hypochondriacus raza Mixteca con (2n =32) y un

cariotipo formado de 8m+1sm+3st+4t (Cuadro 2; Figuras 5A y 5B). Ambas especies con un par de cromosomas con satélite, respectivamente. Las plantas de A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca y las de la población de A. hypochondriacus raza Mixteca son similares en diversas características morfológicas, tales como la arquitectura de la planta y la forma de las hojas y ambas poblaciones se utilizan como verdura. En la población de A. hybridus (2n = 34) analizada en nuestras investigaciones, se encontró una variación significativa del número cromosómico. En la muestra analizada de diez plantas, el 76% de las células mostró 2n =34, 8% con 2n = 33 y 16% con 2n = 32. Estos porcentajes se mantuvieron en los diez individuos analizados. Estas observaciones parecen ser el resultado de cruzas interespecíficas que suceden de forma natural en diferentes especies del género, como lo han observado Pal et al. (1982), al realizar una cruza entre especies con diferente G. Palomino et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

Figura 2. A. cruentus raza Mexicana. (A) Célula somática con 2n=34. Las flechas y números indican el par de cromosomas metacéntricos con satélite. (B) Idiograma que muestra un cariotipo con 6m + 3sm + 2st + 6t. Los números indican el par cromosómico correspondiente y el asterisco señala el par de cromosomas con satélite. La escala 2A equivale a 10 µm, y la 2B a 5 µm.

Figura 3. A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca. (A) Célula somática con 2n=34. Las flechas y números indican el par de cromosomas metacéntricos con satélite. (B) Idiograma que muestra el cariotipo de A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca con 5m + 2sm + 3st + 7t. Los números indican el par de cromosomas correspondiente y el asterisco el par de cromosomas con satélite. La escala 3A equivale a 10 µm, y la 3B a 5 µm.

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G. Palomino et al.

Capítulo XV. Número cromosómico (2n) y cariotipo en especies de grano y verdura de Amaranthus spp. de México

Figura 4. A. hybridus. (A) Célula somática con 2n=34. Las flechas y números indican el par de cromosomas metacéntricos con satélite. (B) Idiograma que muestra el cariotipo de A. hybridus con 5m + 3sm + 3st + 6t. Los números indican el par de cromosomas correspondiente y el asterisco señala el par de cromosomas con satélite. La escala 4A equivale a 10 µm, y la 4B a 5 µm.

Figura 5. A. hypochondriacus raza Mixteca. (A) Célula somática con 2n= 32. Las flechas y números indican el par de cromosomas submetacéntricos con satélite. (B) Idiograma que muestra el cariotipo de A. hypochondriacus raza Mixteca con 8m + 2sm + 2st + 4t. Los números indican el par de cromosomas correspondiente y el asterisco señala el par de cromosomas con satélite. La escala 5A equivale a 10 µm, y la 5B a 5 µm. G. Palomino et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

número básico y donde observaron variaciones similares en el 2n de las plantas híbridas entre A. hypochondriacus (n = 16) y A. hybridus (n = 17). Los cariotipos observados en este trabajo para especies y razas de Amaranthus fueron homogéneos y asimétricos y todos ellos mostraron 1 par de cromosomas con satélite, que se presentó en cromosomas submetacéntricos o metacéntricos (Cuadro 2). Los cariotipos de las especies y razas de Amaranthus estudiadas mostraron cariotipos homogéneos entre ellas y asimétricos con valores de mayor asimetría de TF= 23.36% en A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca, a valores de TF= 33.49 % en A. hypochondriacus raza Mixteca (Cuadro 2). En todas las especies se observaron cromosomas metacéntricos (m), submetacéntricos (sm) subtelocéntricos (st) y telocéntricos (t), pero en los valores mayores de TF% (33. 49%), se observó la presencia de un mayor número de cromosomas subtelocéntrico (st) o telocentricos (t). Estos resultados sugieren que en la evolución de los cariotipos de estas plantas, se han involucrado cambios estructurales en sus cromosomas, debidos a deleciones, translocaciones e inversiones pericéntricas, que han causado pérdidas de fragmentos cromosómicos, como se ha evidenciado en los híbridos de estas especies por varios autores (Pal, 1972; Pal y Koshoo, 1973 y Pal et al., 1982). CONCLUSIONES A. hypochondriacus raza Azteca, A. cruentus raza Mexicana, utilizados como grano y A. hybridus x A. hypochondriacus raza Mixteca y A. hybridus usados como verdura presentaron los números cromosómicos 2n = 34. A. hypochondriacus raza Mixteca consumido como verdura mostró 2n = 32. Estos números cromosómicos son congruentes con otros autores en la presencia de los números básicos x= 16 y x = 17 en la mayoría de las especies del género. A. hybridus presentó una variación en el número cromosómico de 2n = 34 en 76%, 2n = 33 en 8% y 2n = 32 en 16% en todas las plantas analizadas. Este resultado puede deberse a posibles cruzas interespecíficas que suceden de manera natural en algunas especies; resultados similares en variación cromosómica en la misma planta han sido informados por otros autores en híbridos interespecíficos de Amaranthus. 224

G. Palomino et al.

Los cariotipos fueron similares entre las especies estudiadas y presentaron proporciones diferentes de cromosomas metacéntricos, submetacéntricos, subtelocéntricos y telocéntricos y todos ellos un par de cromosomas con satélite. Estas características en sus cromosomas sugieren que en la evolución de los cariotipos de estas especies han estado involucrados cambios estructurales en sus cromosomas como son deleciones, translocaciones e inversiones pericéntricas como se ha observado en híbridos de especies de Amaranthus. Estos estudios tienen la finalidad de evaluar la variación inter e intraespecífica en los genomas de especies y razas de Amaranthus, que forman parte del gradiente de germoplasma existente en México, como una información básica para plantear estrategias de mejoramiento, biotecnología y conservación in situ y ex situ en estas especies. AGRADECIMIENTOS Al Programa Universitario de Alimentos (PUAL-UNAM) y al Jardín Botánico, Instituto de Biología de la UNAM por el financiamiento de estas investigaciones. A los Doctores C. Mapes S., R. Bye B. y E. Espitia R. por haber proporcionado las semillas utilizadas en este trabajo y haber realizado la descripción taxonómica de las especies y razas de Amaranthus estudiadas. Al Dr. F. Chiang por la revisión del manuscrito. LITERATURA CITADA Auquier P y R Renard (1975) Nombres chromosomiques des quelques angiospermes du Ruanda, Burundi et Kivu (Zaire). I. Bull. Jard. Bot. Nat. Belg. 45: 421-445. Becker R, E L Wheeler, K Lorenz, A E Stafford, O K Grosjean, A A Betchard, R M Saunders (1981) A compositional study of amaranth grain. Journal Food Science 46:1175-1180. Behera B y S N Patnik (1974) Cytotaxonomic studies in the family Amaranthaceae. Cytologia 39: 121-131.

Capítulo XV. Número cromosómico (2n) y cariotipo en especies de grano y verdura de Amaranthus spp. de México

Behera B y S N Patnaik 1982 Genome analysis of Amaranthus dubuis Mart. Ex Thell. Through the study of Amaranthus spinosus x Amaranthus dubius hybris. Cytologia 47: 379-389. Breener W M (1991) Food uses of grain amaranth. Cereal Foods World 36: 426-430. Bye R (1998) La intervención del hombre en la diversificación de las plantas en México: En: Diversidad biológica de México: orígenes y distribución. T P Ramamoorthy, R Bye, A Lot, y J Fa (Compiladores). Instituto de Biología. Universidad Nacional Autónoma de México. pp 689-713. Conger A D, y L M Farichit (1953) A quick freeze method for making smear slides permanent stain. Tech 28: 281-283. Dmitrieva S (1986) Chromosome numbers in some species of vascular plants from Byelorussia. Bot. Zurn. 71: 1145-1147. Espitia R E, S C Mapes, L D Escobedo, De la O O M, V P Rivas, T G Martínez, E L Cortés, y C J M Hernández. (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. Celaya, Guanajuato, México: SINAREFIINIFAP-UNAM. Centro de Investigación Regional del Centro, 201 p. Feine L B, R Harwood, S C Kauffman, y J.P Senft (1979) Amaranth: gentle giant of the past and future. In: G A Ritchie (Ed.). New Agricultural Crops. AAA Selected Symposium 38. Westview Pess, Boulder Co, pp: 41-63. Grant W F (1959) Cytogenetic studies in Amaranthus III. Chromosome numbers and phylogenetic aspects. Can. J. Genet. Cytol. 1: 313-328. Grant W F (1967) Cytogenetic factors associated with the evolution of weeds. Taxon 16: 283-393. Greizerstein E J y L Poggio (1994) Karyological studies in grain amaranths. Cytologia 59: 25-30. Greizerstein E J y L Poggio (1995) Meiotic studies of spontaneous hybrids of Amaranthus: Genome analysis. Plant Breed 114: 448-450.

Greizerstein E J C A Naranjo and L Poggio (1997) Karyological studies in five wild species of Amaranths. Cytologia 62: 115-120. Koshoo T N and M Pal (1972) Cytogenetic patterns in Amaranthus. Chromosomes Today 3: 259-267. Lee J R, G Y Hong, A Dixit, J W Chung, K H Ma, J H Lee, H K Kang, Cho, Y H, Gwag J G y J Park (2008) Characterization of microsatellite loci developed for Amaranthus hypochondriacus and their cross-amplifications in wild species. Conserv Genet. 9: 243-246. Levan A, K Fredga, and A A Sandberg (1964) Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas: 201-220. Mallory M A, R V Hall, A R McNabb, D B Pratt, E N Jellen, y P J Maughan (2008) Development and characterization of microsatellite markers for the grain amaranths. Crop Sci. 48: 1098-1106. Maughan P J, N Sisneros, M Luo, D Kudrna, J S S Ammiraju, and R A Wing (2008) Construction of an Amaranthus hypochondriacus bacterial artificial chromosome library and genomic sequencing of herbicide target genes. The plant genome [A supplement to Crop Sci.]: S85-S94. Maughan P J, S M Yourstone, E N Jellen y J A Udall (2009) SNP discovery via genomic reduction, barcoding, and 454-Pyrosequencing in Amaranth. The plant genome Vol. 2: 260270. Mapes-Sánchez C, F Basurto y R Bye (1997) Ethnobotany of Quintonil: knowledge, use and management of edible greens Amaranthus ssp. (Amaranthaceae) in the Sierra Norte de Puebla, México. Economic Botany 51 (3): 293-306. Mapes-Sánchez C, F Basurto, J Caballero y R. Bye (1998) Tendencias evolutivas (Amaranthus spp.) bajo selección humana en México. Bol. Soc. Bot. México 62: 91-107.

G. Palomino et al.

225

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Mapes-Sánchez C (2010) El amaranto (Amaranthus spp.) planta originaria de México. AAPAUNAM Academia, Ciencia y Cultura 2(4): 217-222. Pal M (1972) Evolution and improvement of cultivated Amaranths. III Genetica 43: 106-118. Pal M and T N Koshoo (1973) Evolution and improvement of cultivated amaranths. VI. Cytogenetic relationships in grain types. Theoretical and Applied Genetics 43: 242-251. Pal M, R M Pandey and T N Koshoo (1982) Evolution and improvement of cultivated amaranths. IX Cytogenetic relationships between the two basic chromosome number. Journal of Heredity 73: 353-356. Pal M, D. Ohri and G V Subrahmanyam (2000) A new basic chromosome number for Amaranthus (Amaranthaceae). Cytologia 65: 1316. Ranade S A, A Kumar, M Goswami, N Farooqui y P V Sane (1997) Genome analysis of amaranths: Determination of inter- and intraspecies variations. J. Biosci., Vol. 22. Number 4: 457-464. Sauer J D (1957) Recent migration and evolution of the dioecious amaranths. Evolution 11: 11-31. Sauer J D (1967) The grain amaranths and their relatives. Arevised taxonomic and geographic survey. Ann Missouri Bot. Gard. 54 (2): 103137. Sauer J D (1976) Grain amaranth. In: Evolution in crop plants. N.W. Simmonds (Ed.). London, Longman. 4-7. Sharma A K and A Sharma (1959) Recent advances in the study of chromosomal alteration with relation to speciation. Bot. Rev. 25: 514544. Sheidai M, Z Mohammadzadeh (2008) Cytogenetic study of Amaranthus L. species in Iran. Cytologia: 73: 1-7. 226

G. Palomino et al.

Sinha S S N y H Roy (1979) Citological studies in the genus Phaseolus I mitotic analysis in fourteen species. Cytologia 44: 191-199. Song B H, X J Zhang, F Z Li, and P Wan (2002) Chomosome numbers of 14 species in Amaranthus from China. Acta Phytotaxonomica Sinica. 428-432. Spillari M M, A García-Soto y R Bressani (1989) Cambios químicos, bioquímicos y nutricionales en las hojas de amaranto (Amaranthus spp.) durante diferentes etapas de su desarrollo fisiológico. El amaranto y su potencial, Guatemala: Oficina editorial de archivos latinoamericanos de nutrición 5-8 p. Tandon S L y M Tawakley (1970) En: IOPB Chromosome number reports. XXVI. Taxon 19: 264-269. Williams J T y T Brenner (1995) Grains amaranths (Amaranthus species). En: Williams J.T. (ed.) Cereals and psedocereales. Chapman & Hall, London, 129-186.

Capítulo XVI

Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto STRATEGY AND METHODOLOGY FOR GENETIC IMPROVEMENT OF GRAIN AMARANTH

Eduardo Espitia Rangel, Diana Escobedo López y Miriam Aguilar Delgado Campo Experimental Bajío CIRCE-INIFAP. Km 6.5 Carretera Celaya-San Miguel de Allende, Celaya Gto. Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El mejoramiento genético de amaranto hasta ahora se han realizando mediante la evaluación de variedades nativas y selección masal dentro de las más sobresalientes. De esta manera se han obtenido variedades mejoradas que han permitido mejores rendimientos y características agronómicas. Hasta ahora se ha realizado muy poco mejoramiento genético basado en la hibridación de progenitores con características ventajosas con el fin de que estas converjan en genotipos que permitan hacer aún más sustentable el cultivo del amaranto. Uno de los factores que ha limitado lo anterior es el desconocimiento de la metodología para la realización de cruzamientos artificiales en este cultivo. En este trabajo se presenta paso a paso la metodología para este propósito; además se presenta y discute una serie de recomendaciones para el establecimiento de una estrategia para el mejoramiento genético del amaranto basado en la hibridación de genotipos. De igual manera se mencionan cuales serían los objetivos fundamentales de mejoramiento genético actual y se puntualiza sobre la fuente de germoplasma en la cual se pueden encontrar genes que faciliten el cumplimiento de los objetivos planteados en el programa de mejoramiento genético.

Palabras clave: hibridación, método de pedigree, método masivo, cruzamientos artificiales. ABSTRACT Genetic improvement of grain amaranth has been done evaluating landraces and masal selection within the outstanding native varieties; using this methodologies improved varieties with better grain yields and agronomical characteristics have been obtained. Until now little genetic improvement based on the hybridization of genotypes with advantageous characteristics has been made in order to converge in improved varieties that enable a more sustainable grain amaranth crop. Lack of knowledge of the artificial crossing techniques has limited the genetic improvement based on hybridization. In this chapter the methodology for artificial crossing is presented step by step. Besides a series of recommendations for the establishment of a strategy for the genetic improvement of the grain amaranth based on the hybridization is also presented and discussed. Likewise it is mentioned what the main objectives of genetic improvement program would be at the present times; it is emphasized on the sources of germ plasm in which genes can 227-247

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be found in order to facilitate the fulfillment of the objectives raised in a grain amaranth genetic improvement program. Key words: hybridization, pedigree method, bulk method, artificial crosses technique. INTRODUCCIÓN La hibridación en amaranto ofrece buenas perspectivas para lograr objetivos importantes en la producción, mayor tamaño de grano, resistencia a enfermedades, entre otros, más aún para reunir en una sola variedad varios caracteres favorables. Si deseamos obtener una variedad de grano grande y hábito de crecimiento erecto, forzosamente tenemos que recurrir a la hibridación, ya que estos caracteres se encuentran en diferentes especies, cultivares o razas y de diferentes ambientes. Se ha demostrado la existencia de heterosis en híbridos interespecíficos entre Amaranthus cruentus y Amaranthus hypochondriacus, sin embargo al parecer no existe heterosis intraespecífica (Lehmann et al., 1990). Por el tamaño de las flores y de la inflorescencia se recomienda hacer los cruzamientos artificiales en condiciones de invernadero en miniplantas cultivadas en recipientes pequeños, esto facilita la emasculación ya que solo habrá una flor estaminada en cada glomérulo. Es conveniente emplear marcadores morfológicos para diferenciar la progenie productos de la cruza de la autofecundación indeseada, entre estos marcadores tenemos al color de planta, color de fruto, forma de la inflorescencia característica de la panoja y otras caracteres dominantes (Kulakow et al., 1985; Kulakow y Jain, 1985b; Kulakow y Jain, 1987). Se recomienda seleccionar adecuadamente el material que servirá como progenitor para asegurar el éxito de los cruzamientos, puesto que es difícil encontrar los caracteres que se desean combinar en el material que se usará como progenitor; para ello es necesario conocer la heredabilidad de los principales caracteres y correlaciones de los caracteres de los padres. En la hibridación se puede aplicar cualquiera de los siguientes procedimientos: selección masiva, método de pedegree, selección genealógica o cruzas regresivas. 228

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Sin duda un aspecto que ha frenado el mejoramiento por recombinación de progenitores es el desconocimiento de la técnica para la polinización artificial. La técnica para realizar cruzamientos artificiales se basa en la plasticidad fenotípica del amaranto (Espitia 1994); esta consiste en el cultivo de plantas en contenedores muy pequeños, lo que da por resultado plantas diminutas que son relativamente fáciles de manipular para su emasculación. Esta metodología fue desarrollada en la época de los ochentas por el grupo de investigadores de Rodale Research Center. Una recomendación es que se seleccionen progenitores contrastantes en alguna característica que pueda ser útil en la identificación de las plantas cruzadas; características como color del hipocotilo, de la inflorescencia, de los cotiledones pueden servir como marcadores. Desde luego también se debe tener presente la compatibilidad entre las diferentes especies del género Amaranthus. La intención de este capítulo es dar a conocer la metodología de mejoramiento genético de amaranto con el fin de que si alguien está interesado en realizar mejoramiento pueda obtener resultados en un tiempo corto. Esta metodología se basa principalmente en el trabajo realizado por varios investigadores de Rodale Research Center en Kutztown, Pa. y en experiencias del autor principal. Este programa fue liderado por Charles S. Kauffman y Leon Weber en la década de los ochentas en el proyecto de amaranto apoyado por la Academia Nacional de Ciencias. MANEJO DE PLANTAS CON PROPÓSITOS DE MEJORAMIENTO El amaranto produce su semilla en una inflorescencia de crecimiento indeterminado, lo cual significa que mientras la planta tenga condiciones de humedad y temperatura puede seguir creciendo, es decir produciendo flores nuevas. Todas las especies que se utilizan en la producción de grano son monoicas y predominantemente autógamas; aunque pueden ocurrir diferentes niveles de cruzamiento en presencia de insectos, aire o de contacto físico entre plantas (Tucker y Sauer, 1958; Grant, 1959; Hauptli, 1977). El amaranto presenta el fenómeno conocido como plasticidad fenotípica el cual consiste en modificar la morfología y la

Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

fenología de la planta en respuesta a las diferentes condiciones ambientales (Espitia, 1994). Entonces el tamaño de la planta y la duración de las diferentes fases fenológicas se puede modificar al restringir la disponibilidad de temperatura, luz, agua, suelo, etc. Si la planta de amaranto es sembrada en una maceta pequeña produce una planta miniatura totalmente funcional, es decir florece, madura y produce semilla viable; es fácil de mantener en invernadero con los requerimientos de temperatura de la planta. Esta característica de la planta de amaranto ha sido aprovechada para realizar los cruzamientos necesarios en un programa de mejoramiento, pues la estructura de la inflorescencia se simplifica en plantas miniatura; ya que los glomérulos que nacen directamente del raquis, presentan menos dicasios que las plantas normales, esto facilita enormemente la emasculación. Es conveniente que las plantas con fines de cruzamientos se cultiven en invernadero con el fin de controlar las condiciones ambientales. Las plantas se deben de sembrar en pequeños macetas; por ejemplo en un contenedor de 3.7 x 3.7 cm y 5.8 cm de fondo produce plantas de 15 a 45 cm dependiendo del genotipo comparadas con plantas de 2 m ó más en campo.

de excepciones al patrón monoico: las especies dioicas (Sauer 1955 y Mosyakin y Robertson, 1981) y las especies A. spinosus y A. dubius con glomérulos estaminados y pistilados en la inflorescencia (Brenner, 1990 y Pal, 1972a). La unidad básica de la inflorescencia es una cima dicásica que produce flores estaminadas y pistiladas o ambas; la estructura de cima de los glomérulos es básicamente la misma en las dos secciones del género en especies monoicas y dioicas. En las especies monoicas se tienen dos tipos de arreglos de flores: a) La primera flor de cada glomérulo es estaminada y las siguientes flores en cada dicasio son pistiladas. Cada glomérulo solo presenta una flor estaminada; este arreglo es típico de las especies para producción de grano. b) Las flores del glomérulo superior son todas estaminadas; mientras que las flores de los glomérulos inferiores son pistiladas (A. spinosus y A. dubius). Hay variaciones en la estructura de los glomérulos ocasionada por la hibridación entre genotipos cultivados y silvestres o por las condiciones ambientales, esto último reduce sobretodo el número de cimas dicásicas del glomérulo (Figura 2). La flor es muy pequeña con organización trímera (Sección Blitopsis) y pentámera (Sección

Figura 1. Izquierda plasticidad fenotípica en plantas de amaranto; derecha inflorescencia sin ramificaciones y glomérulos naciendo directamente del raquis.

BIOLOGÍA FLORAL Y SU RELACIÓN CON EL MEJORAMIENTO Todas las especies utilizadas para la producción de grano son monoicas. Las flores pueden ser terminales o axiales y organizadas en glomérulos en una inflorescencia (Tirso). La primera flor es generalmente estaminada y las posteriores pistiladas (Pal, 1972a) Figura 2. Hay dos tipos

Amaranthus); cada flor presenta una bráctea y tres ó cinco tépalos escariosos y cada flor estaminada produce tres ó cinco estambres y abren poco después de que se libera el polen de las anteras. Las flores pistiladas tienen solamente un ovario con un estilo corto y un estigma glandular con dos ó tres ramificaciones. Si la planta tiene condiciones para seguir creciendo

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Figura 2. Arriba izquierda representación diagramática de un glomérulo; arriba derecha glomérulo típico, abajo izquierda glomérulo con dos flores estaminadas, abajo derecha glomérulo simplificado de miniplanta.

se producen dicasios sucesivos y por lo tanto se producen más flores pistiladas y potenciales semillas, hasta que la planta madura. Esto es lo que da el carácter de crecimiento indeterminado al amaranto. En ocasiones en el último dicasio una de las flores es estéril y no se desarrolla, en otros casos no se desarrolla ninguna y ahí cesa el crecimiento. La semilla de los últimos dicasios es de menor tamaño dando esto como resultado que se tengan en una planta semillas de diferente tamaño y madurez. En cada glomérulo las flores pistiladas abren exponiendo sus estigmas receptivos antes de que la flor estaminada madurez (Sauer, 1950). El polen disponible no proviene de la flor

estaminada del mismo glomérulo, sino de flores estaminadas de otros glomérulos. La madurez progresa hacia arriba de la inflorescencia de crecimiento indeterminado, por lo que en la misma inflorescencia se tienen diferentes grados de madurez (Figura 4). En general se dice que amaranto es una planta predominantemente autógama; sin embargo, los amarantos cultivados tienen un sistema de reproducción mixto, con niveles variables de polinización cruzada. Estos niveles varían significativamente dependiendo del genotipo y del ambiente (Kulakow y Jain, 1990 y Espitia, 1991). Un experimento de selección disruptiva basado en la proporción de flores

Figura 3. Representación diagramática de una flor individual y sus estructuras: utrículo, bráctea, tépalo externo, tépalo interno.

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Figura 4. La floración progresa de la base al ápice de las ramificaciones de la inflorescencia.

masculinas sobre flores femeninas indicó que el sistema de reproducción en amaranto está bajo control genético (Sauer, 1967). Los niveles de polinización cruzada para una población nativa de varió de 5.8 a 28.8% para A. caudatus y de 3.5 a 14% para A. hypochondriacus; la polinización cruzada para A. cruentus fue de 31%. Utilizando como marcador el color verde y rojo Espitia (1994), encontró que los niveles de cruzamiento varían entre razas de 7.6 a 41.1%; los niveles de cruzamiento fueron de 7.6, 12.9, 15.6 y 41.1% para las razas Azteca, Mercado, Nepal y Mexicana, respectivamente. Dentro de una población los niveles de polinización cruzada de plantas individuales varía de completamente autógama a completamente alógama. Con el fin de demostrar que existe variación en la forma de reproducción, se realizó un estudio de selección masal bidireccional para líneas de niveles altos y bajos de polinización cruzada en A. cruentus; en la generación S1 las tasas de polinización cruzada fueron significativamente diferentes entre las líneas. Las líneas de baja polinización cruzada produjeron mayor cantidad de polen que las de alta polinización cruzada (Jain et al., 1982). Esta respuesta indica el control cuantitativo de la expresión sexual y consecuentemente del

potencial de polinización cruzada. El sistema de reproducción en amaranto puede ser modificado para poder utilizar métodos de mejoramiento para plantas autógamas como alógamas (Sauer, 1967). TÉCNICAS DE POLINIZACIÓN ARTIFICIAL Sincronización de la floración La iniciación de la floración está estrechamente relacionada con el tamaño de la planta, ramificación y desarrollo de la inflorescencia y es además una de las variables más relacionadas con la determinación del rendimiento. La gran mayoría de las especies de Amaranthus se comportan como plantas obligatorias o facultativas para días cortos (Kigel, 1994). Morfológicamente, la mayor manifestación de la inducción de la floración por días cortos es la disminución del número de hojas en el tallo principal y en la disminución de la longitud del tallo debida a menor número de entrenudos o entrenudos más cortos. Se ha reportado variabilidad en floración entre las diferentes especies en condiciones de campo (Kaufman, 1992). En México el orden de floración en ensayos realizados bajo condiciones de campo fue A. hybridus-Prima, A. E. Espitia Rangel et al.

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hypochondriacus-Mercado y Nepal, A. cruentusMexicana, A. hypochondriacus-Azteca y A. caudatus-Sudamericana (Espitia, 1992). De acuerdo a lo anterior la duración del día es un factor clave en la iniciación floral en amaranto, lo que dispara la iniciación floral son los días cortos. En algunos casos la iniciación floral es cuando el día tiene una duración aproximada de 12 horas. En siembras de invernadero materiales de A. hypochondriacus florecen cuando tienen cuatro hojas; mientras que materiales de A. cruentus florecen cuando presentan de 8 a 12 hojas; si las dos especies crecen a la misma tasa entonces es necesario realizar siembras escalonadas con el fin de tener plantas que se puedan polinizar con polen proveniente de plantas que pertenezcan al otro progenitor (Kaufman, 1981). No hay conocimiento exacto para dar una recomendación específica, dependiendo de la localidad y de la época de año se deberá buscar la mejor opción en el escalonamiento de la siembra de los diferentes materiales con propósitos de cruzamiento.

lo cual es una limitante para realizar las cruzas planeadas. Las temperaturas óptimas para realizar este trabajo son de 26 ºC en la noche y 38 ºC en el día. Es conveniente llevar un registro de las variedades individualmente para conocer su propensión a producir polen en el invernadero. En general se recomienda un mínimo de 50 plantas de cada progenitor masculino para asegurar la producción de polen necesario para polinizar dos ó tres plantas del progenitor femenino. Ahora si se tiene poca semilla se puede sembrar en macetas más grandes; sin embargo esto tomará más tiempo para llegar a floración (producción de polen) pero habrá mayor cantidad de polen en una planta de mayor tamaño. Las charolas para producción de plántula de hortalizas proporciona suficiente espacio para producir 338 ó 200 plántulas en un espacio muy pequeño (Kauffman, 1981). Si se quiere iniciar un programa de mejoramiento se deberá invertir cuando menos un ciclo para conocer el comportamiento de los materiales en el invernadero.

Relación de plantas machos y hembras Es más conveniente realizar los cruzamientos en los meses de invierno ya que en este tiempo los días cortos inducen la floración en menor tiempo. Esto parece más importante aun cuando se quiere utilizar materiales de día corto en los cruzamientos. Hay que tener presente también que cuando hay días nublados la producción de polen se reduce drásticamente,

Separación física de plantas machos y hembras Para realizar la emasculación de las plantas del progenitor femenino lo más conveniente es sacar la plantita de la cavidad de la charola o de su macetita; esto es posible ya que el contenedor obliga a la planta a producir una masa compacta de raíces y esto facilita sacarla de su cavidad o maceta. Después de la emasculación

Figura 5. Debido a su plasticidad es posible cultivar un alto número de miniplantas de amaranto en un espacio reducido.

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las plantas se colocan en macetitas individuales y son separadas de las plantas masculinas. Para facilitar el trabajo se sugiere realizar la emasculación cuando hay mejores condiciones de iluminación y cuando las condiciones son más confortables.

indeterminado hay producción de nuevas flores masculinas y por ende de polen. La eliminación de los glomérulos basales y del ápice facilita la identificación del área donde hay que polinizar y cosechar.

Figura 6. Izquierda arriba, siembra de diferentes genotipos en invernadero en macetas pequeñas con fines de cruzamientos artificiales. Derecha arriba, material necesario para la realización de cruzamientos artificiales en amaranto. Abajo izquierda sistema radicular de miniplanta. Abajo derecha manejo de miniplanta fuera de su macetita.

Emasculación Es muy importante que la emasculación se realice antes de que la antesis para evitar la autopolinización de las flores femeninas. Las flores femeninas y masculinas se pueden distinguir antes de la antesis. Las flores masculinas se hinchan antes de la extrusión de las anteras. Cada flor estaminada sobresale de las flores pistiladas menos maduras que la rodean en su mismo glomérulo. Se recomienda utilizar lentes amplificadores 5X para facilitar el trabajo, pues esto amplifica las partes florales a un punto en el que son fácilmente distinguibles. Algunos materiales de A. cruentus tiene flores que pueden ser distinguidas fácilmente a simple vista; sin embargo hay otras mucho más pequeñas. Es muy complicado eliminar todas las flores sin utilizar lentes amplificadores. Los glomérulos de la parte basal de la inflorescencia debe ser eliminados, de igual manera el ápice de la inflorescencia deber ser eliminada ya que por ser de crecimiento

Para evitar contaminación de polen es necesario limpiar pinzas, tijeras, navajas y manos con alcohol. Es importante secar con aire estos utensilios antes de tocar la planta para evitar quemar los tejidos tiernos de la misma. La eliminación de las flores masculinas se realiza mejor con unas pinzas quirúrgicas o de relojero y es mejor remover las anteras con una de las puntas de las pinzas que tratar de eliminar la flor completa ya que es muy fácil remover el glomérulo completo por ser tejidos muy tiernos y frágiles; otra opción es cortar toda la flor estaminada con tijeras para cutícula. Después de completar el despunte y emasculación la inflorescencia se envuelve en algodón natural. Se coloca luego una cápsula de gelatina (de tamaño 000) sobre la inflorescencia envuelta en el algodón; este actúa como un pequeño colchón para ayudar a mantener la cápsula en su lugar, se pueden utilizar también glassines para cubrir la inflorescencia. E. Espitia Rangel et al.

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Figura 7. Miniplanta de amaranto, emasculación y despunte de inflorescencia en el proceso de cruzamientos artificiales en amaranto.

Polinización La mañana siguiente a la emasculación se colecta el polen de las plantas del progenitor masculino. El polen es más abundante de la 8 AM a las 11 AM. La mayoría de las variedades produce mayor cantidad de polen en días soleados y la producción disminuya cuando se tienen periodos prolongados de días nublados. Es muy conveniente consultar el pronóstico del tiempo y tratar de programar los cruzamientos fuera de periodos nublados. El polen se colecta en una mitad de la cápsula de gelatina. Se frota suavemente en las inflorescencias de las plantas del progenitor masculino y el polen caerá en la cápsula. La polinización se realiza primero descubriendo la inflorescencia del progenitor femenino (previamente emasculada). El polen colectado se frota sobre la superficie estigmática de la inflorescencia de la planta del progenitor femenino. Es muy difícil identificar cuando los estigmas están más receptivos por lo que este procedimiento se repite tres mañanas seguidas, esto asegura mayor amarre de semillas. La estructura y biología floral hace imposible que todas las flores estén receptivas el mismo día. El algodón y la cápsula de gelatina son colocados nuevamente sobre la pequeña inflorescencia. Se deberá tener cuidado de no mojar la cápsula de gelatina cuando se rieguen las plantas. Las 234

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plantas que son movidas a una maceta diferente requieren de mayor riego que las normales. Se debe utilizar algodón natural ya que de otra manera se forman hongos sobre algodones (cosméticos) sintéticos. Se debe etiquetar cada planta o cruza con los datos de los progenitores femenino y masculino, esto ayuda para estar seguros que se ha realizado la cruza planeada. Marcadores morfológicos Debido a que la forma de reproducción en amaranto es predominantemente autógama es muy probable que se tengan autofecundaciones en la realización de cruzamientos artificiales por lo que se recomienda seleccionar progenitores contrastantes en algunos caracteres que pudieran servir para diferenciar las plantas F1 autofecundadas para eliminarlas. Características dominantes como color del hipocotilo, color de los cotiledones, color del follaje, color de la inflorescencia, longitud de la bráctea, etc. pueden servir como marcadores morfológicos y ayudar a identificar las plantas que representan un cruzamiento verdadero. Por ejemplo, si se elige un progenitor femenino verde y un progenitor masculino rojo la F1 será toda roja; si se encuentran plantas verdes es seguro que se trata de plantas provenientes de una autofecundación y por consiguiente hay que eliminarlas (Figura 9).

Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

Figura 8. Recolección de polen de progenitor masculino, aislamiento con algodón de inflorescencia polinizada, maduración y cosecha de inflorescencia polinizada artificialmente.

Figura 9. En la F1 la utilización de marcadores morfológicos ayudan a eliminar plantas procedentes de autopolinización. En este caso las plantas verdes son eliminadas por ser autofecundaciones.

Forma alternativa de hacer cruzamientos artificiales Se puede aprovechar siembras comerciales o experimentales en campo a fin de realizar cruzamientos artificiales. Solo que hay que utilizar marcadores morfológicos para identificar las plantas F1 producto de cruzamientos verdaderos. Una recomendación práctica es tener progenitores femeninos con marcadores recesivos tales como hipocotilo verde, cotiledones verdes, tamaño de la bráctea,

etc. Estos progenitores se llevan a siembras de materiales contrastantes en estos marcadores morfológicos, pero con características ventajosas que se quieran pasar a variedades mejoradas (Figura 10). EL PROGRAMA DE MEJORAMIENTO Y SUS OBJETIVOS En la definición de una planta modelo en un cultivo, se utilizan varias características, en el caso de amaranto, esta descripción seguramente E. Espitia Rangel et al.

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Figura 10. Se puede aprovechar las siembras comerciales para hacer cruzamientos controlados. Las plantas F1 de la semilla de la planta verde en la foto que resulten plántulas de color rojo serán cruzas verdaderas.

evolucionará conforme se aprenda más sobre este cultivo, con la diversificación de usos, así como de nichos climáticos donde el amaranto demuestre ventajas comparativas. El ideotipo de la planta puede ser descrita como una planta con una altura de 1 a 1.5 m, madurez de acuerdo a los requerimientos de cada región, vigor en la semilla, sin ramificaciones, semilla blanca, inflorescencia encima del follaje, resistencia a plagas y enfermedades, caída de semilla mínima, secado uniforme, semilla grande y alto rendimiento (Weber y Kauffman, 1990). Para forraje, la producción de biomasa total será muy importante. (Pandey, 1981). Componentes nutricionales y funcionales como proteína, aceite, almidón, serán importantes para usos industriales y propósitos nutracéuticos del amaranto. OBJETIVOS DEL MEJORAMIENTO GENÉTICO Se han mencionado varias características para describir una planta modelo de amaranto de grano. Esta descripción seguramente evolucionará conforme se aprenda más sobre este cultivo, con la diversificación de usos, así como de nichos climáticos donde el amaranto demuestre ventajas comparativas. El ideotipo de la planta de amaranto puede ser descrita como una planta 236

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con una altura de 1 a 1.5 m, madurez de acuerdo a los requerimientos de cada región, vigor en la semilla, sin ramificaciones, semilla blanca, inflorescencia encima del follaje, resistencia a plagas y enfermedades, caída de semilla mínima, secado uniforme, semilla grande y alto rendimiento (Weber y Kauffman, 1990). Para la producción de forraje la producción de biomasa total será muy importante. (Pandey, 1981). Componentes nutricionales y funcionales como proteína, aceite, almidón, serán importantes para usos industriales y propósitos nutracéuticos del amaranto. A continuación se discuten algunas ideas sobre mejoramiento para algunas características y fuentes de germoplasma para las mismas. La gran mayoría de los programas de mejoramiento tienen como objetivo fundamental el incremento en el rendimiento de grano, en amaranto esto ha sido más enfocado a hacia la obtención de rendimientos más consistentemente. Desafortunadamente la pérdida parcial o total de siembras comerciales de amaranto es muy frecuente, debido ya sea por fallas en la cosecha o por un pobre establecimiento a la siembra. Se han reportado rendimientos promedio alrededor de las tres toneladas, sin embargo, se han tenido reportes excepcionales por encima de las cinco toneladas

Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

(Espitia, 1990 y Mujica et al., 1997) esto indica que el incremento de mayores rendimientos es posible. Un aspecto importante en relación al rendimiento es la influencia que tiene el ambiente sobre el mismo y la interacción de los genotipos x ambiente. Espitia (1991) en un experimento de 30 genotipos de amaranto en ocho localidades de la Mesa Central detectó gran variación entre ambientes (desde favorables hasta críticos), entre genotipos y en la interacción genotipo ambiente en todos los caracteres evaluados. Mediante el análisis de parámetros de estabilidad (Eberhart y Russell, 1966), se identificaron 13 genotipos deseables por su rendimiento, 13 por su precocidad a madurez y 23 por su altura de planta. Cuatro genotipos se consideraron con adaptación adecuada en los ambientes evaluados por su rendimiento y caracteres agronómicos, todos pertenecientes a la raza Mercado; por lo anterior, esta raza (A. hypochondriacus) es la que tiene mayor posibilidad de adaptación para las condiciones de temporal de la Mesa Central de México. Caída de semilla o dehiscencia es otro objetivo importante en un programa de mejoramiento de amaranto ya que la mayoría de las variedades cultivadas presentan un alto grado de caída de semilla a la madurez. Esto se debe a la tendencia normal del utrículo a abrirse a la madurez de la planta. Con el movimiento del viento a con las sacudidas de las plantas durante la cosecha, una buena cantidad de semilla cae perdiéndose y reduciendo el rendimiento. Mediante mejoramiento genético se puede reducir este problema desarrollando variedades que tengan utrículos indehiscentes; ya que existen especies relacionadas a las cultivadas con utrículo indehiscente y poblaciones nativas cultivadas con menor caída de grano (Hauptli et al., 1979; Brenner y Hauptli, 1990). La característica de utrículo indehiscente se transfirió de A. Powellii a A. hypochondriacuas y A. cruentus mediante mejoramiento convencional (Brenner, 1992). El carácter de dehiscencia-indehiscencia involucra probablemente dos o pocos genes Mendelianos (Brenner et al., 2000). El carácter indehiscente es un objetivo muy importante en los programas de fitomejoramiento de amaranto para grano, debido a la pérdida de las semillas. Con respecto a éste tema algunos resultados se han obtenido

transfiriendo de A. powellii (PI 572261) a A. cruentus y A. hypochondriacus usando las técnicas tradicionales de mejoramiento. Frecuentemente se menciona el incremento del peso o tamaño de semilla como un objetivo del programa de mejoramiento genético de amaranto (Weber y Kauffman, 1990). Semillas de mayor tamaño incrementarían seguramente el vigor de plántula, facilitaría el manejo, incrementaría la eficiencia en el reventado; sin embargo, el incremento del tamaño de la semilla también traería consigo una reducción en la proteína, si el incremento se da en el endospermo, en oposición a que si se diera en el embrión o en los cotiledones. Kauffman (1981) no pudo incrementar el tamaño de la semilla por selección. Hay especies relacionadas que podrían servir como germoplasma para incrementar el tamaño de la semilla, los mayores tamaños de semilla en el género se dan en A. pumilus y A. cannabinus, alcanzando más de 0.2 g por cada 100 semillas. Espitia (1994) reporta que la poliploidía podría ser otra opción de incrementar el tamaño de semilla, este mismo autor reporta que las accesiones de crecimiento determinado presentan ligeramente mayor tamaño de semilla. Con el fin de facilitar la cosecha mecanizada y reducir el problema de acame es necesario reducir la altura de planta. Poblaciones nativas de las razas Azteca y Mixteca pueden alcanzar alturas de planta sobre los 3 m bajo condiciones óptimas de crecimiento; mientras que poblaciones de las razas Prima y Picos pueden alcanzar 0.5 m en condiciones limitantes. Se han seleccionado líneas de baja estatura en las razas Africana, Nepal y Sudamericana; otras fuentes de plantas de baja estatura se han identificado en cruzas de A. hypochondriacus x A. cruentus, A. hypochondriacus x A. hybridus y A. hypochondriacus x A. quintensis (Weber y Kauffman, 1990; Pandey, 1982; Kulakow, 1987). Se ha indicado que métodos de selección reciproca recurrente podrían ser de utilidad para explotar las aptitud combinatoria general, así como efectos aditivos de genes menores para altura de planta (Pandey, 1982). En la raza Nepal se han encontrado genotipos con entrenudos cortos que podrían utilizarse para reducir la altura de planta en este cultivo.

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Figura 11. Semillas de amaranto de diferente tamaño, los materiales cultivados generalmente son de mayor tamaño.

Figura 12. Plantas de amaranto de gran altura y plantas de entrenudos cortos.

Un objetivo importante en un programa de mejoramiento debe ser la capacidad de reventado de la semilla. En México la semilla de amaranto se ha empleado tradicionalmente en la elaboración de la golosina denominada “alegría”, que se obtiene con el grano tostado en casa, proceso en el que no existe ningún control sobre tiempo o temperatura de reventado, contribuyendo a mayor desperdicio de materia prima y pérdidas de nutrientes (Bressani, 1984). El reventado de la semilla de amaranto conlleva varios propósitos: impartir sabor, color y aroma agradables, mejorar la relación de eficiencia proteínica (PER) así como la digestibilidad y la destrucción de factores antifisiológicos, lo que hace más nutritiva a la semilla (Beschart 238

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et al., 1981; Jaik y Tena, 1984; SánchezMarroquín, 1980; Tena, 1984). Los resultados en el incremento del volumen de la semilla van desde 390% (Jaik y Tena, 1984) hasta 1050% (Teutonico y Knorr, 1985) con pérdidas variables de peso y nutrientes. El alto volumen de reventado del amaranto se atribuye al reducido tamaño de los gránulos de almidón (de una a 3µ); a su forma esférica, angular o poligonal; a su bajo contenido de amilasa (7.2%), bajo poder de hinchazón, alta solubilidad, gran capacidad de retención de agua y alto rango de temperatura de gelatinización. Otros factores importantes en el volumen de expansión son la humedad del grano en el momento del reventado, el tiempo y las condiciones de almacenamiento, la temperatura

Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

de reventado, la madurez de la semilla y el fenotipo de la planta. En México, Vázquez et al. (1988) estudiando la capacidad de reventado de genotipos de diferentes razas encontraron que los genotipos 78S-125-2-4 de la raza Nepal, así como 153-5-3 y 8-1-3 de la raza Mercado, todos de la especie A. hypochondriacus sobresalieron por su capacidad de reventado. Además de los objetivos antes mencionados pueden haber otros caracteres a considerar en un programa de mejoramiento para caracteres especiales del amaranto que a la fecha han sido poco estudiados; a este respecto

MÉTODOS DE MEJORAMIENTO Por tratarse de una especie preponderantemente autógama con polinización cruzada frecuente (Espitia, 1994), los métodos de mejoramiento aplicables para el amaranto son aquellas desarrolladas para plantas autógamas. La elección del método de mejoramiento para amaranto estará en función de los objetivos del mejoramiento, las características del material de inicio y de los recursos disponibles. Los métodos de mejoramiento aplicables al amaranto son la selección a partir de poblaciones nativas y la hibridación. La selección a partir poblaciones

Figura 11. Semillas de amaranto de diferente tamaño, los materiales cultivados generalmente son de mayor tamaño.

Cai et al. (1998) evaluaron genotipos para la producción de betacianina, la cual podría ser utilizada como colorante en alimentos. Los aceites del amaranto incluyen el escualeno, que es muy útil como lubricante y para uso cosmético (Becker, 1994). El almidón por sus características también podría tener usos especiales, tiene potencial para la industria de las pastas (Rayas et al., 1996) y por lo pequeño de los gránulos de almidón podría ser utilizado en la industria de los cosméticos y en aerosoles (Schnetzler y Breene, 1994). El amaranto también tiene un inusual número de isómeros de la vitamina E, además de una serie de compuestos que le confieren al amaranto propiedades funcionales que pueden mejorar la salud humana.

nativas sobresalientes es quizá el método de mejoramiento más utilizado en amaranto; sin embargo está limitado al aprovechamiento a la explotación de la variabilidad genética disponible en forma natural. Por este método se han obtenido una buena cantidad de variedades de amaranto como Revancha, Nutrisol, Rojita, Amaranteca y Dorada (Espitia et al., 2010). En el caso del amaranto es necesario iniciar programas de mejoramiento a partir de la hibridación de diferentes progenitores con características sobresalientes que al combinarse permitan obtener mejores variedades tanto en lo agronómico como el calidad de industrialización. En este documento nos centraremos en esta última metodología. E. Espitia Rangel et al.

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LA HIBRIDACIÓN La hibridación como método de mejoramiento consiste en la combinación de caracteres favorables presentes en variedades o accesiones diferentes con la finalidad de combinarlos en el híbrido y posteriormente a partir de la F2 aplicar los métodos apropiados de selección para identificar líneas que presenten los caracteres favorables de los progenitores. La hibridación implica la definición previa de los objetivos del programa de mejoramiento genético, el conocimiento del material genético o las características del germoplasma disponible para el mejoramiento y el conocimiento de los métodos apropiados de hibridación (Poehlman y Slepper, 1995). Cuando las plantas cruzadas alcanzan la madurez fisiológica, se procede a cosechar individualmente cada planta y se trilla por separado conservando sus registros respectivos. La semilla obtenida por este proceso, se siembra en surcos individuales para generar las plantas de la primera generación filial conocida con F1. Cada progenie proveniente de una cruza, se verifica su condición híbrida mediante la expresión en la progenie de los marcadores morfológicos presentes en el progenitor masculino. Este procedimiento nos permite distinguir los híbridos verdaderos frente a los provenientes de autofecundaciones accidentales. MÉTODO GENEALÓGICO O DE PEDIGREE El método de selección genealógica o pedigree (Figura 14) es un método basado en la hibridación. El trabajo se inicia con la identificación de los progenitores de interés para combinar sus caracteres mediante la hibridación, luego realizar la hibridación para generar la primera generación filial o F1. Las progenies F1 provenientes de verdaderos cruzamientos, se autofecundan artificialmente. En el manejo de la F1, se deben tomar medidas agronómicas apropiadas para tener las progenies lo más vigorosas posible, puesto que el tamaño de la población segregante F2 depende del número de semillas que se pueda obtener por cada unidad de planta F1. Una vez identificada las plantas híbridas, se procede etiquetarlas y posteriormente se pasan a macetas grandes con el fin de tener unos 20 gramos de semilla por planta, esto en caso de que no se 240

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hayan sembrado en campo; esto asegura semilla suficiente para sembrar la F2 en una población grande (2000-5000 plantas) y así obtener la F2 con una población suficiente para que las progenies puedan expresar las combinaciones posibles donde se pueda ingresar con la selección por caracteres favorables. A la madurez fisiológica de las plantas, las F1 se cultivan en condiciones apropiadas para favorecer un mayor desarrollo de las plantas y de esta forma obtener mayor cantidad de semilla por planta individual (Poehlman y Slepper, 1995). La población F2 se obtiene a partir de semillas cosechadas en F1. Esta población que debe ser necesariamente grande para favorecer a la expresión de todos los segregantes posibles, esta constituye el material base para la selección por pedigree. Se sugiere tener 2000 a 5000 plantas F2, entre mayor sea el número mejor; Gandarillas (1979) sugiere una población de 2000 plantas por cruza para quinoa (Chenopodium quinoa), un cultivo muy semejante a amaranto. La selección en esta población consiste en la aplicación de los criterios de selección establecidos para el mejoramiento en una forma similar a la selección surco-panoja, pero con la diferencia de mantener un sistema de registro adecuado de progenitores y progenie, en otras palabras, consiste en llevar el registro de toda la genealogía de las diferentes progenies. Cada planta seleccionada debe tener suficientes datos que permita reconocer sus ancestros y también sus descendientes. Las líneas avanzadas que se obtienen por este método son líneas puras con toda la información pertinente a sus ancestros. Se debe incluir como testigo la variedad comercial a superar cada cierto número de unidades, esto con la finalidad de comparar la expresión de numerosos caracteres que son criterios de selección. Lescano (1994) en sus trabajos con quinoa indica que primero se selecciona la línea y después el individuo. Las semillas de las plantas seleccionadas de la F2 se siembran en panoja por surco y el tamaño de la familia debería ser lo suficientemente grande para mostrar la variabilidad existente en ella. Si se cultivan 50 plantas será tamaño suficiente para cada familia F3. Una variedad control deberá incluirse al menos cada 20 hileras y el número de selecciones raramente excede el número total de familias F3.

Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

Puede asumirse que se hacen 150 selecciones y que 25 de ellas se descartan después de llevar el material al laboratorio La generación F4 es similar a la anterior se tienen alrededor de 125 familias. Aún cuando las familias se muestren homogéneas se hará selección de planta. La F4 ofrece una buena oportunidad para reducir el tamaño de la población. Esta reducción se hace visualmente y analizando el pedigree. Aquí suponemos que se cosechan 100 plantas procedentes de 40 familias y que el número se reduce a 90, después de analizarlas en el laboratorio. El manejo de la F5 es similar a la F4. La diferencia radica en que usan parcelas más grandes, cuyas dimensiones se asemejan bastante a las condiciones de campo, en amaranto se recomienda sembrar tres surcos de 5 m. Como en F4, se eligen alrededor de 100 plantas, que se reducen luego a 80, después de pasar por el laboratorio. Al hacer las selecciones, asumimos que las plantas son homocigóticas. Por tanto, las selecciones deben hacerse de familias que se muestren uniformes y en rendimiento de las mismas, esto se denomina como pruebas preliminares de rendimiento. En la generación F6 la unidad de selección no es la planta individual, sino la familia derivada de una única planta. En este momento las parcelas se cosechan en conjunto y no separadamente la semilla de cada planta. Por tanto, la densidad de siembra se aproxima mucho a la siembra que se hace con fines comerciales. El tamaño de siembra será lo suficientemente grande como para permitir una identificación visual rápida de cada familia y si es posible también obtener datos de rendimiento. Si se dispone de abundante semilla, se deben hacer repeticiones de parcela. Si se tiene 80 selecciones la parcela de siembra será similar a la F5. La selección, al igual que la F5, tiene en cuenta, no sólo el pedigree, sino también el comportamiento en parcela. Probablemente 15 de las familias más uniformes y prometedoras se conservan después de hacer evaluación visual, análisis de rendimiento y análisis de laboratorio. En el F7 y generaciones sucesivas estas líneas seleccionadas pasan a ensayos de rendimiento en localidades hasta identificar la más sobresaliente en todas las localidades o identificar variedades con adaptación específica a ciertas condiciones o localidades (Poehlman. y Slepper, 1995).

El método de selección por pedigree es muy preciso en el seguimiento de las líneas y requiere gran conocimiento del mejorador en cuanto a autofecundación e hibridación, manejo de progenies, selección de progenies, registro de progenies y evaluación de progenies. Es aquí donde el proceso de mejoramiento se puede convertir de un proceso científico a arte ya que cada mejorador le imprime su propia personalidad a la selección. Este método permite más oportunidades que cualquier otro método para evaluar los resultados del cruzamiento si el mejorador conoce bien el cultivo y es lo suficientemente habilidoso para estimar el comportamiento en campo de cada planta en particular. Para caracteres cualitativos, tales como resistencia a enfermedades este método permite la eliminación temprana de los tipos que no tienen futuro alguno. De esta forma, se ahorra tiempo y espacio para el material prometedor. MÉTODO MASIVO La diferencia entre el método masivo o masal (Figura 15) y el de pedigree radica en el momento en que se hace la selección. El método masal a diferencia del de pedigree cultiva las generaciones tempranas en masa. El número de generaciones cultivadas de esta forma, está en función del mejorador y de la naturaleza del cruzamiento. Algunos piensan que la homocigosis absoluta no es necesaria al principio y hacen selección de plantas para formar familias y selecciones en la F5 o F6. Otros mejoradores hacen la selección en la F7 o F8, o incluso más tarde. La última generación masal a partir de la cual se seleccionarán las plantas que formarán líneas se plantarán espaciadas (como en la F2 del método pedigree). De aquí en adelante, ambos métodos son esencialmente iguales. El método masal y el de pedigree no son mutuamente excluyentes. Se pueden combinar de diversas manera por ejemplo se cultivan las poblaciones híbridas en masa hasta que las circunstancias sean favorables para la expresión de caracteres importantes, de aquí se realiza selección por planta individual y se sigue con las poblaciones aplicando el método de pedigree. Otros autores han preferido usar el método de pedigree en generaciones tempranas para eliminar fenotipos indeseables rápidamente y luego las mejores plantas en una población y continuar con el método masal (Poehlman y Slepper, 1995). E. Espitia Rangel et al.

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X F1 F2

F3

F4

F5

F6

F7

Ensayo de rendimiento

Figura 14. Método genealógico o de pedigree para el mejoramiento en amaranto.

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Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

X F1

F2

F3

F4

F5

Pruebas preliminares de rendimiento

F6

F7

Ensayo de rendimiento con repeticiones y localidades

Figura 15. Método masal o masivo para el mejoramiento en amaranto.

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El método masivo recientemente aplicado a la quinua consiste en el cruzamiento de dos progenitores identificados por sus características de interés y además portadores de caracteres morfológicos de herencia simple. Las progenies F1 que son híbridos verdaderos y han alcanzado la madurez fisiológica, se cosechan y se trillan juntas. Luego, la semilla masiva se siembra en una parcela con superficie que permita obtener una población aproximada de 30,000 plantas. En las generaciones posteriores, se repite el mismo procedimiento hasta llegar a la F5 o F6. Posteriormente, en la F6 o F7, se procede con la selección sea masal o individual según los criterios establecidos por el programa. Su bajo costo deriva del poco requerimiento en mano de obra en el manejo de la semilla y del campo de producción, puesto que se requiere menos mano de obra y costo de materiales. Una de las desventajas es que no se tiene un seguimiento preciso de las progenies (Gandarillas, 1979). COMENTARIO FINAL La amplia gama de características que tienen el amaranto desde el punto de vista nutricional, nutracéutico, usos alimenticios y cualidades agronómicas, hacen pensar que el amaranto puede ser una alternativa para coadyuvar a la falta de alimentos, a la desnutrición y a la salud humana; sin embargo, presenta todavía muchas características agronómicas desventajosas como: tamaño de la semilla, ramificación lateral, dehiscencia, maduración indeterminada, altura de planta, germinación escalonada, complejo de especies; otros aspectos como superficie de cultivo muy limitada y mercado muy volátil; pero sobretodo, que a pesar de todas sus bondades se le sigue considerando como un cultivo marginado. Las características agronómicas desventajosas se pueden solventar con un programa de mejoramiento genético serio, pues existe el germoplasma con las fuentes de resistencia o características deseables; lo que resta es que se le de la importancia debida al cultivo y se destinen recursos para investigación y transferencia de tecnología; además de la metodología para métodos de mejoramiento que involucran la hibridación de diferentes genotipos con características ventajosas que se podrán juntar en variedades mejoradas que hagan del amaranto un cultivo sustentable. 244

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LITERATURA CITADA Becker R (1994) Amaranth Oil: Composition, Processing, and Nutritional Qualities, 1 ed. Department of Biotechnology and Biochemistry, Center of Research and Advanced Studies National Polytechnic Institute, Irapuato, México.25-30 pp. Becker R, E L Wheeler, K Lorenz, A E Stafford, O K Grosjean, A A Betschart, R M Saunders (1981) A Compositional Study of Amaranth Grain Journal Food Science 46 p. Betschart A A, Irving D W, Shepherd A D, R M Sounders (1981) Amaranthus cruentus: milling characteristics, distribution of nutrients within seed components and the effects of temperature on nutritional quality. Journal Food Science 46: 1181–1187. Brenner D (1990) The grain amaranth gene pools, In Proc. 4th Amaranth Symp., Amaranth: Perspectives on Production, Processing and Marketing, Minneapolis, MN, 193 p Brenner D (1992) The Plainsman story. Legacy 1, 5:12-13. Brenner D (1993) Hybrid seeds for increased amaranth grain yield. Legacy 6:9-11. Brenner D y H Hauptli (1990) Seed shattering control with indehiscent utricule in grain amaranths, Legacy, 3, 2. Brenner D, D Baltensperger, P Kulakow, J Lehman, R Myers, M Salbbert, B Sleugh (2000) Genetic resources and breeding of Amaranthus. Pant Breeding Reviews 19:227284. Bressani R (1984) Efecto del procesamiento térmico húmedo o seco sobre la calidad proteínica del grano de amaranto. In: Memoria del Primer Seminario Nacional del Amaranto Vol. 1 Chapingo, México.

Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

Cai Y, M Sun, H Wu, R Wang, H Corke (1998) Characterization and quantification of betacyanin pigments form diverse Amaranthus species, Journal Agriculture Food Chemistry 46:2063-2070.

Espitia R E, S. Miranda C, F Castillo G (1992) Variabilidad genética e interrelaciones del rendimiento y sus componentes en alegría (Amaranthus spp). Agrociencia serie Fitociencia 3 (4): 83-98.

Cavagnaro JB (1985) Effect of Water Stress and Dry Matter Partitioning in Four Species of Amaranthus. M.S. thesis, University of California, Davis.

Espitia R E (1991) Revancha: variedad mejorada de amaranto para los valles altos de México. En: Primer Congreso Internacional del Amaranto. Oaxtepec, Morelos. pp: 64.

Eberhart S y W A Russell (1966) Stability parameters for comparing varieties. Crop Science. 6:36-40.

Food and Agriculture Organization (1972) Energy and proteins requirements, Report of a Join FAO/WHO Expert Commitee on Energy and Proteins Requirements. Nutr. Rep. Ser. 52 FAO. Rome.

Espitia (1990) Situación actual y problemática del cultivo de amaranto en México, In: TRINIDAD-SANTOS A; GOMEZLORENCE, F. Y SUAREZ-RAMOS, G. (eds) El amaranto (Amaranthus spp.) su cultivo y su aprovechamiento. Colegio de Postgraduados, Montecillos, México pp. 101-109. Espitia R E (1986) Caracterización y evaluación preliminar de germoplasma de Amaranthus. Tesis Profesional en Agronomía UAAN Saltillo, Coah. México. Espitia R E (1991) Estabilidad del rendimiento en amaranto. En: Primer Congreso Internacional del Amaranto, Oaxtepec, Morelos, 22-27 sep. México, pp:65. Espitia R E (1992) Amaranth germplasm development and agronomic studies in México. Food reviews International 8(1) 71-86. Espitia R E (1992) Efecto del déficit hídrico en dos etapas fenológicas de amaranto. XIV Congreso Nacional de Fitogenética, Tuxtla Gutiérrez, Chis. p.56. Espitia R E (1994) Breeding of grain amaranth: A comprehensive review. In: Paredes-López O. Amaranth, Chemistry and Technology, CRC Press, Boca Ratón FL., pp:23-38. Espitia R E, P R Toledo (2006) Catálogo de Productos y Servicios de la Región Centro. Catálogo No. 1. CIRCE-INIFAP.

Foy C D, T A Cambell (1984) Differential tolerances of Amaranthus strains to high levels of aluminum and manganese in acid soils. Journal Plant Nutrition. 7:1365-1388. Gandarillas H (1979) Mejoramiento genético. In: Quinua y Kañihua, Cultivos Andinos. M.E. Tapia et al. (Ed.). IICA, Bogotá, Colombia. pp. 65-82. Grant W F (1959) Cytogenetic studies in Amaranthus. Chromosome numbers and phylogenetic aspects. Canada. Journal Genetic and Cytology. Part 3. 1:313-328. Grubben G J H (1976) Culture of the amaranth, a tropical leaf vegetable, with special reference to south Dahomey. Medelelingen Landbouwhogescholl Wageningen 75 (6) 223 Gudu S, V K Gupta (1988) Male sterility in the grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus exNepal) variety Jumla, Euphytica, 37, 23. Hauptli H, R L Lutz, S K Jain (1979) Germ plasm exploration In Central and South America. In: Proc. 2nd Amaranth Conference Rodale Research Center, Kutztown, PA. pp:117123. Huaptli H (1977) Agronomic potential and breeding strategy for grain amaranths. Proceedings of the First Amaranth Seminar. Emmaus, PA. pp: 71-79. E. Espitia Rangel et al.

245

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Jaik A D, J A Tena (1984) Optimización del proceso de tostado de la semilla de alegría (Amaranthus hypochondriacus) y diseño de un prototipo de tostadora, En: Memoria del Primer Seminario Nacional del Amaranto (Vol. 1), Chapingo, México. Jain S K, H Hauptli, K R Vaidya (1982) Outcrossing rates in grain amaranths. J. Hered 73: 71-72. Kauffman C S (1992) The status of grain amaranth for the 1990’s. Food Reviews International 8(1): 160-165. Kauffman S C (1981) Grain amaranth varietal improvement: Breeding Program. Rodale Press Inc. Emmaus, Pa. 24p. Kigel J (1994) Development and ecophysiology of amaranth, In: Paredes-López O. Amaranth, Chemistry and Technology, CRC Press, Boca Raton FL. pp:185-205. Kulakow P A, H Hauptli, S K Jain (1985) Genetics of the grain amaranths. 1. Mendelian analysis of six color characteristics. Journal of. Heredity. 76: 27 – 30. Kulakow P A, S K Jain (1987) Genetics of grain amaranths. IV. Variation in early generation response to selection in Amaranthus cruentus L. Theor. Appl. Gen. 74:113-120. Kulakow P A, S K Jain (1990) Grain amaranth. Crop species, evolution and genetics. In: Amaranth: perspectives on production, processing and marketing. Minnesota. Ext. Serv., St. Paul. pp:105-114. Lehman J W, R. L Clark, K J Frey (1991) Biomass heterosis and combining ability in interspecific and intraspecific rating of grain amaranths. Crop Sci. 31: 1111-1116. Lehmann J W (1990) The potential of grain amaranths in the 1990s and beyond, in Proc. 4th Amaranth Symp., Amaranth: Perspective, Processing and Marketing, Minneapolis MN.

246

E. Espitia Rangel et al.

Lescano J L (1994) Genética y mejoramiento de cultivos andinos. Programa Interinstitucional de waru waru, Puno, Perú. 459 p. Lewis C F, M N Christiansen (1981) Breeding plant for stress environments. In: FREY K. Journal of. Plant Breeding II. Iowa. St. Univ. pp:151-177. Lorenz K (1981). Amaranthus hypochondriacus. Characteristics of the starch and baking potential of the flour. Starch/Starke 33 (181) 5, pp:149– 153. Mac Masters M M, P D Baird, M M Holzapfel, C E Rist (1985) Preparation of Starch from Amaranthus cruentus seed. Econ. Bot. 9 (3). Macler B, E Bomber, E Moffat, H Bui, E Minor, L Nishioka (1990) Effects of salinity and nitrogen on growth, productivity and food value of Amaranthus in controlled culture. In: 4th Proc National Amaranth symposium. Perspectives on production, processing and marketing. Minneapolis MN. 23-25 august St. Paul MN. Mujica S A, M Berti D, J Izquierdo (1997) El cultivo del amaranto (Amaranthus spp.) Producción, mejoramiento genético y producción. Oficina Regional de la FAO para America Latina y El Caribe, Santiago Chile. Pal M (1972) Evolution and improvement of cultivated amaranths: I. Breeding system and inflorescence structure. Proceedings of the Indian Nat. Sci. Acad. 38: 28-37. Pandey R M (1981) Genetic association in Amaranthus, Indian Journal Genetic Plant Breed., 41(1), pp:78. Pandey R M (1982) Genetic of agronomic traits in Amaranthus, SABRAO J., 14(2), 121pp. Pedroza R I (1989) Efecto de la fecha de siembra en cinco variedades de amaranto (Amaranthus spp.). Tesis Profesional Z. A. UACh. Chapingo, México. 81h.

Capítulo XVI. Estrategia y metodología para el mejoramiento genético del amaranto

Peters I, S K Jain (1987) Genetics of grain amaranths. III. Gene-cytoplasmic male sterility, Journal of Heredity., 78, 251. Poehlman J M Slepper D A (1995) Breeding field crops. 4th (ed). Desmoines, Iowa State University, Ames, USA. 494 p. Rayas D P, C M Mock, L D Satterlee (1996) Quality of spaghetti containing buckwheat, amaranth and lupin flours. Cereal Chemistry 73 (3): 381-387. Reyna T T (1986) Requerimientos climáticos del cultivo del amaranto (Amaranthus spp.) en México. En Primer Seminario Nacional del Amaranto. Comp. A. Trinidad S. C.P. pp. 81-89. Robertson K (1981) The genera of Amaranthaceae in the Southeastern United States. Journal of the Arnold Arboretum 62:268294. Sánchez M A (1980) Potencial agroindustrial del amaranto. Centro de Estudios Económicos y Sociales del Tercer Mundo. México. Sánchez, E M, R E Espitia y K S Osada (1991) Etiología de la mancha negra del tallo (Macrophoma sp.) en el Amaranto (Amaranthus spp.). En: Primer Congreso Internacional del Amaranto. Septiembre 22-27. Oaxtepec, Morelos, México. pp: 67. Sauer J D (1950) The grain amaranth. A survey of their history and classification. Annals of the Missouri Botanical Garden, USA. 37: 561-632. Sauer J D (1955) Revision of the dioecious amaranths. Madroño13:5-46. Sauer J D (1967) The grain amaranth and their relatives a revised taxonomic and geographic survey. Ann Miss Bot Gard 54(2):103-137. Schnetzler K A, W M Breene (1994) Food uses and amaranth product research: A comprehensive review. In: Paredes-Lopez O. Amaranth, Chemistry and Technology, CRC Press, Boca Raton FL. pp:155-184.

Smith E L (1987) A review of plant breeding strategies for rainfed areas. In: SRIVASTAVA J. P., PORSEDDU E., ACEVEDO E. and S. VARMA (Eds) Drought tolerance in winter cereals. Proc. Of an International workshop Capri, Italy. Pp: 19-87 Tena F J A (1984) Calidad de la proteína del amaranto predicha por el ensayo del C-PER. En: Memoria del Primer Seminario Nacional del Amaranto (vol.2) Chapingo, México. Teutonico R, A D Knorr (1985) Amaranth: Composition, properties and applications of a radiscovered food crop. Food Tech, pp:49. Tucker J M, J D Sauer (1958) Aberrant Amaranthus populations of Sacramento. San Joaquín delta, California. Madroño. 14:252261. Vázquez C G, R E Espitia y A R Márquez (1988) Potencial de reventado y calidad proteínica del amaranto. En: Reyna T. (ed) 1988. Investigaciones recientes sobre amaranto. Instituto de geografía UNAM. Villasana G F A (1985) Características morfológicas y fisiológicas que confieren resistencia a la sequía al amaranto (A. Hypochondriacus), Tesis, Universidad Autónoma de Chapingo, Méx., México pp:119. Weber, E L y C S Kauffman (1990) Plant breeding and seed production, in Proc. 4th Natl. Symp., Amaranth: Perspectives on Production, Processing and Marketing, Minneapolis, MN. pp:115. Wilson R L (1984) Entomological research on amaranth at the North Central Plant Introduction Station, in Proc. 3dr Amaranth Conf., Kutztown, P.A, September 11 to 13. Wilson R L (1989) Studies of insects feeding on grain amaranth in the Midwest, Journal Kansas Entomology Society. 62(4) 440.

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Capítulo XVII

Selección y adaptación de variedades criollas de amaranto (Amaranthus cruentus L.) en el Noreste de México SELECTION AND ADAPTATION ON LANDRACES OF GRAIN AMARANTH (Amaranthus cruentus L.) IN NORTHEAST MEXICO

Gabriel Alejandre Iturbide1*, Ciro. G. S. Valdés Lozano2 Jesús García Pereyra3 1Instituto Politécnico Nacional, Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Durango. Calle Sigma 119, Fraccionamiento 20 de Noviembre II, CP. 34220, Durango, Durango, México, Tel. (01 618) 8142091 y Fax (01 618) 8144540. 2 División de Estudios de Posgrado, Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Nuevo León, Carretera Zuázua – Marín, Km. 17.5, CP 66700, Marín N. L., México, Tel. y Fax (825) 2480101 3 Instituto Tecnológico del Valle del Guadiana, Apartado Postal 393, Durango, Dgo. *Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN Durante los ciclos agrícolas de tardío (ciclo 1, C1) el cual inicia en agosto y finaliza en diciembre y temprano (ciclo 2; C2), que inicia en febrero y finaliza en julio del año 2003, y el temprano (Ciclo 3; C3) de 2004 se evaluaron en Marín N. L. seis variedades criollas de germoplasma de amaranto (Amaranthus cruentus L.) proveniente de los estados de Guerrero, Morelos y Puebla. Se encontró que el mejor ciclo agrícola para seleccionar las variedades criollas fue el ciclo temprano. Los mejores promedios para rendimiento de grano fueron obtenidos con las variedades Santiago Xochistlahuaca, Morelos Anaranjada, y Morelos Cuarteada. Los mejores promedios obtenidos de la interacción ciclo por variedad se observaron en el C1 temprano 2003 y el C2 tardío 2003 donde las mejores variedades fueron: Santiago Xochistlahuaca y Morelos Anaranjada. En el C3 temprano de 2004 los mejores promedios de rendimiento de grano se registraron en las variedades Morelos Cuarteada y Morelos Rosada. De acuerdo con los resultados de esta investigación las variedades Morelos Amarilla y Morelos Anaranjada pueden ser recomendadas para usarse en los tres ciclos agrícolas evaluados.

Palabras clave: A. cruentus, germoplasma, rendimiento de grano, ciclos agrícolas. ABSTRACT During early 2003 and 2004 crop season six landraces of grain amaranths (Amaranthus cruentus L.) were evaluated in Marin, Nuevo León, México. These landraces were collected in the Mexican states of Guerrero, Morelos and Puebla. Results showed that early crop season is the best in order to evaluate the amaranth landraces. Varieties Santiago Xochistlahuaca, Morelos Anaranjada and Morelos Cuarteada showed the highest grain yields. Varieties by growing cycle interaction in average yield data were significant (pF 0.0000* 0.0000* 0.0020* 0.0000* 0.0000* 0.1040 NS 0.0010* 0.0000* 0.2210 NS 0.3100 NS 0.0669 NS 0.0000*

*Significativo P (0.05), NS=No significativo. G. Alejandre Iturbide et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

dos ciclos tempranos. Lo anterior indica que A. cruentus tiene un mejor desempeño agronómico durante el ciclo temprano, dichos resultados concuerdan con los obtenidos por García et al. (2004). El comportamiento del rendimiento de grano del amaranto en los ciclos temprano y tardío, se explica dado que en los dos primeros ciclos las variedades se establecieron

persisten durante todo el ciclo de cultivo. Por otro lado, el bajo comportamiento en el tardío, se puede explicar por que este ciclo se inicia con temperaturas cálidas en agosto (25°-35°C) que se reducen en septiembre para finalizar con temperaturas frescas en noviembre y diciembre (10-18°C) y a medida que la floración avanza coincide con temperaturas bajas por lo que no se da un llenado completo del grano.

Cuadro 4. Rendimiento promedio de grano (g) de seis variedades criollas con nueve familias por variedad, en Marín N. L., durante los tres ciclos.

Ciclo agrícola Temprano 2004 (C1) Temprano 2003 (C2) Tardío 2003 (C3) DMS (0.05)

Rendimiento de grano g/planta 34.01 a 33.86 a 14.44 b 2.71

Promedios con igual letra en el sentido de la columna, son estadísticamente iguales.

en condiciones de campo y el tercer ciclo que corresponde a temprano de 2004 el experimento se estableció en el área de bancales, pequeñas terrazas de 20 m de largo y 1.2 m de ancho, donde la unidad experimental fue de 1.2 m por 0.7 m de largo; las condiciones fueron más controladas tanto en distancia de plantas como en condiciones de riego , también el desarrollo radical no pudo ser el adecuado porque fue diferente a las condiciones de campo, por otra parte la distribución natural de amaranto en las zonas tradicionales donde A. cruentus se desarrolla mejor en zonas cálidas(20-30°C) de donde provienen las variedades criollas ensayadas y esta situación coincide con las condiciones climáticas imperantes en Marín, N. L. en el ciclo de temprano ya que las siembras de este ciclo se inician con las primeras temperaturas cálidas(20°25°C) de finales de febrero a marzo y estas

VARIEDAD DENTRO DE CICLOS En el Cuadro 5 se muestra las comparaciones de promedios de rendimiento de grano en gramos por planta para las variedades (V) dentro de los ciclos (C) agrícolas. Debido a que se detectó interacción V X C se compararon los rendimientos promedio de grano de cada una de las variedades dentro de cada ciclo. En el C1 las mejores variedades fueron: Santiago Xochistlahuaca y Morelos Anaranjada. En el C2 fueron: Santiago Xochistlahuaca y Morelos Anaranjada, en cambio en el C3 fueron: Morelos Cuarteada y Morelos Rosada. Santiago Xochistlahuaca y Morelos Anaranjada tuvieron un desempeño similar tanto en el temprano como en el tardío de 2003. Por otro lado, los genotipos que mostraron mayor rendimiento en el C3 que correspondió al temprano de 2004 fueron: Morelos Rosada y Morelos

Cuadro 5. Comparación de promedios de rendimiento de grano (g) para variedades criollas dentro de ciclos, Marín N. L.

Ciclo Temprano 2003 g/planta Variedad 56.7 a Santiago Xochistlahuaca Morelos anaranjada 38.1 b 31.8 bc Morelos amarilla Morelos cuarteada 29.9 c 24.3 d Morelos rosada 21.9 d Morelos morada

Ciclo Tardío 2003 g/planta Variedad 24.7 a Santiago Xochistlahuaca Morelos anaranjada 14.0 b 13.9 b Morelos rosada 10.8 bc Morelos amarilla 9.7 bc Morelos morada Morelos cuarteada 9.2 bc

Ciclo Temprano 2004 Variedad g/planta Morelos cuarteada 39.9 a Morelos rosada 38.0 a Morelos amarilla 35.5 a Morelos morada 34.9 a Morelos anaranjada 26.7 b Santiago 25.8 bc Xochistlahuaca

DMS = 7.55 Promedios con igual letra en el sentido de la columna, son estadísticamente iguales.

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G. Alejandre Iturbide et al.

Capítulo XVII. Selección y adaptación de variedades criollas de amaranto (Amaranthus cruentus L.) en el noreste de México

Cuarteada; lo que indica que las variedades criollas de amaranto rindieron mejor cuando se establecieron en campo tal como se hizo durante los dos primeros ciclos agrícolas, en cambio para el C3 se establecieron en el área de bancales, área de pequeñas terrazas de 20 m de largo y 1.20 m. de ancho donde las condiciones estuvieron más controladas pero que restringieron el desarrollo radical de las mismas, y debido a ello las variedades que tuvieron mejor rendimiento fueron distintas a los dos primeros ciclo agrícolas. Por lo tanto, de acuerdo a los resultados de este trabajo de investigación los genotipos mejor adaptados y que se pueden recomendar para su siembra comercial son Morelos Amarilla y Morelos Anaranjada, ya que tuvieron un comportamiento intermedio en cuanto a su rendimiento de grano durante los tres ciclos agrícolas. Es importante resaltar que Morelos Amarilla fue la que mostró rendimiento estable durante los C1 y C3, ya que durante el C1 obtuvo un rendimiento de 31.8 g/planta y en el C3 fue de 35.5 g/planta. En cambio, Morelos Anaranjada tuvo una variación de rendimiento de grano que varió de 38 g en el C1 a 29.7 g obtenidos durante el C3. Esta fue la razón principal para seleccionarla dentro de las materiales criollos recomendables bajo las condiciones donde se desarrolló la presente investigación. FAMILIAS DENTRO DE VARIEDADES Y SELECCIÓN En el Cuadro 6 se comparan los promedios de cada familia dentro de cada una de las variedades criollas (VC) ensayadas. En la VC1 (Santiago

Xochistlahuaca) las mejores familias fueron la 3 y la 2; en la VC2 (Morelos Morada) las mejores fueron la 1 y la 4; para la VC3 (Morelos Cuarteada) las mejores fueron la 7 y la 2; en la VC4(Morelos Rosada) las mejores fueron las 7 y 8; en la VC5 (Morelos Anaranjada) las mejores fueron la 5 y la 4; por último en la VC6 (Morelos Amarilla) las mejores fueron la 5 y 7. También se encontró que dentro de la variedad criolla Santiago Xochistlahuaca la familia 3 obtuvo los promedios de grano por planta más altos que todos los genotipos ensayados durante los tres ciclos agrícolas. La variedad Morelos Anaranjada fue la que no presentó diferencias estadísticas dentro de sus familias. Es importante resaltar que dentro del genotipo Morelos Amarilla en la familia 5 obtuvo el segundo mejor promedio de rendimiento de grano por planta. CONCLUSIONES El ciclo de temprano fue el mejor ambiente para seleccionar variedades de amaranto con alto potencial de rendimiento en Marín, Nuevo León. Los mejores genotipos fueron: Santiago Xochistlahuaca, Morelos Morada y Morelos Cuarteada debido a que mostraron la mayor producción de grano. Santiago Xochistlahuaca y Morelos Anaranjada, presentaron poca interacción en el segundo ciclo mientras que Morelos Cuarteada y Morelos Rosada sobresalieron en el tercer ciclo de evaluación. Las variedades recomendadas con base en los tres ciclos agrícolas son: Morelos Amarilla

Cuadro 6. Comparación de medias de rendimiento (g/planta) entre familias dentro de cada variedad criolla.

VC1 Medias VC2 Medias VC3 Medias VC4 fam fam fam fam 7 7 35.6 a 26.8 a 1 41.1 a 3 8 2 33.8 a 26.7 a 4 47.6 a 2 3 9 27.8 a 25.7 a 9 40.5 a 7 2 3 27.0 a 22.9 a 5 36.2 b 1 1 8 26.6 a 22.0 a 3 34.0 b 9 6 6 26.5 a 20.4 a 7 33.6 b 4 9 4 21.9 a 19.4 a 2 33.5 b 5 5 5 19.3 b 17.9 a 8 32.7 b 6 4 1 18.4 b 17.5 a 6 27.4 b 8

Medias VC5 Medias VC6 Medias fam fam 5 5 36.5 a 31.3 a 34.0 a 7 4 33.6 a 29.4 a 29.0 a 6 7 26.4 a 29.2 a 23.8 a 1 6 25.8 a 28.3 a 25.5 a 3 8 25.4 a 28.2 a 23.8 a 8 1 24.4 a 26.0 a 23.5 a 9 3 22.0 a 24.8 a 22.8 a 2 9 20.2 a 24.2 a 22.7 a 4 2 19.7 a 23.8 a 21.9 b

DMS (0.05) = 11.87, Medias con igual letra en el sentido de la columna, son estadísticamente iguales, VC1= Santiago Xochistlahuaca, VC2= Morelos Morada, VC3= Morelos Cuarteada VC4= Morelos Rosada VC5= Morelos Anaranjada, VC6= Morelos Amarilla. G. Alejandre Iturbide et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

y Morelos Anaranjada, ya que a pesar de tener rendimientos promedios inferiores a las que obtuvieron la más alta producción de grano, estos dos genotipos presentaron ligera variación en cuanto al decremento de grano durante los tres ciclos agrícolas. AGRADECIMIENTOS El autor G. Alejandre Iturbide agradece a la Comisión de Fomento a las Actividades Académicas del Instituto Politécnico Nacional la beca de exclusividad y al programa de Estímulos al Desempeño de los Investigadores, Secretaria Académica del IPN, los apoyos económicos otorgados para el desarrollo de esta investigación. BIBLIOGRAFÍA Angus J F, Mackenzie D E, Myers R J , Foale (1982) Phasic development in field crops 3.The pseudocereals , buckwheat and grain amaranth. Field Crop Research 5:305-318. García P J, C G S Valdés L, E Olivares S, O. Alvarado G, H Medrano R, G Alejandre I (2004) Evaluación de genotipos de amaranto para adaptabilidad productiva en el Noreste de México. Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27:53-56. Hauptli H, Jain S K (1984) Genetic structure of landraces population of the new world grain amaranths. Euphytica 33:857-864. Joshi B D (1986) Genetic variability in grain amaranth. Indian J. Agric. Sci.56:574-576. Kulakow P, Jain S K (1986) Genetics of grain amaranths. 4 Variation and early generation response to selection in Amaranthus cruentus L. Theor. Appl. Genet. 74:113-120. Lehmann J W, R.L Clark , K J Frey (1991) Biomass heterosis and combining ability in interespecific and intraspecific matings of grain amaranth. Crop Sci.31:1111-1116. Paredes L O (1994) Amaranth: biology chemistry and technology. CRC. Press Boca Raton, Fla. 270 p. 256

G. Alejandre Iturbide et al.

Sauer J D (1993) Historical geography of crop plants: A select roster. CRC Press. Boca Raton, Fla. 150 p. Senft J P (1979) Protein quality of amaranth grain. In: Proceedings of the Second Amaranth Conference. Rodale Press.pp:43-47. Vaidya K R, Jain S K (1987) Response to mass selection for plant height and grain yield in amaranth (Amaranthus spp.) Plant Breeding 98(1):61-64. Williams J T (1995) Cereals and pseudocereals underutilized crops. Chapman & Hall. London, U. K. 245 p.

Capítulo XVIII

Hábito de crecimiento de la inflorescencia y su relación con la calidad física y fisiológica en semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) INFLORESCENCE GROWTH HABIT AND ITS RELATIONSHIP WITH PHYSICAL AND PHYSIOLOGICAL SEED QUALITY ON GRAIN AMARANTH (Amaranthus hypochondriacus L.)

Ma. de la Luz Ramírez Vazquez1, Eduardo Espitia Rangel*2, Alejandrina Robledo Paz1, Juan C. Molina Moreno1 y Roberto Bernal Muñoz3 1Instituto de Recursos Genéticos y Productividad. Producción de Semillas. Colegio de Postgraduados. Km. 36.5. Carr. México-Texcoco, C.P. 56230. Tel. y Fax: 01(595)9520200 Ext.: 1555. Montecillo, Estado de México. 2Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, CIRCE-INIFAP. Km. 38.5 Carr. México-Texcoco, C.P. 56230. Texcoco, Estado México. 3Profesor-Investigador. Instituto Tecnológico del Altiplano No. 12 Xocoyucan, Tlaxcala. Km. 7.5. Carr. Fed. San Martín-Tlaxcala. *Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN La calidad de la semilla es muy importante ya que de ella depende en gran medida que se alcancen altos rendimientos. El crecimiento indeterminado en amaranto es la condición normal de la especie, dicha característica está asociada negativamente con aspectos tales como uniformidad en la madurez, producción de semilla, fisiología de postcosecha, almacenamiento, daño y cosecha mecánica; debido al traslape de etapas fenológicas en la misma planta. Por lo anterior, la presente investigación tuvo como objetivo determinar la calidad física y fisiológica de la semilla en relación al tipo de crecimiento. Se evaluaron en dos localidades 26 líneas de amaranto de crecimiento indeterminado y 24 líneas de crecimiento determinado. Los resultados indican que las diferencias de calidad, en términos generales, están asociadas al tipo de crecimiento. En calidad física se detectó, que los valores más altos de peso volumétrico correspondieron al crecimiento determinado; de manera similar, los mayores promedios de germinación, como indicativo de la calidad fisiológica, se asociaron con el crecimiento determinado, con lo anterior se concluye que sí hubo diferencias en la calidad

de la semilla en función del tipo de crecimiento y de manera particular, la mayor diferencia estuvo asociada a la calidad fisiológica y ésta al crecimiento determinado. Palabras clave: Amaranthus hypochondriacus, localidad, determinado, indeterminado, estratos. ABSTRACT Seed quality is very important feature since on it depends to a great extent to reach high performances. The indetermine growth in amaranth is the normal condition of the species, this characteristic is associated negatively with aspects such as uniformity in the maturity, seed production, postharvest physiology, and mechanical harvest; due to it overlapped phenological stages in the same plant. The present research had the objective to determine the physical and physiological quality of the seed in relation to the inflorescence growth habit. A set of 26 indetermine and 24 determine lines was evaluated in two locations of central part of Mexico in order to determine the effect of growth habit on both physical and physiological seed quality. The results showed that seed quality differences are associated to the inflorescence 257-265

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growth habit; it was detected that in physical quality, the highest values of test volume weight corresponded to the determine lines; Same way, the greater averages of germination, indicative of the physiological quality, were associated with the determine growth lines. Based on it can be concluded that there seed quality in amaranth are associated to the inflorescence growth habit, particularly physiological seed quality is associated to the determine growth habit in a greater extend. Key words: Amaranthus hypochondriacus, location, determine growth, indetermine growth. INTRODUCCIÓN El amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) es una especie originaria de México, importante por su producción de grano. En nuestro país se le cultiva desde los tiempos prehispánicos. Esta especie se encuentra distribuida ampliamente, además de México, en regiones como los Himalaya, Nepal y el Sur de la India. En los últimos años el cultivo del amaranto ha tomado gran importancia y es ampliamente reconocido por sus bondades alimenticias (hasta 16% de proteína) y agronómicas (buena respuesta a altas temperaturas y baja disponibilidad de agua), de hecho se le ha considerado como uno de los pseudocereales promisorios para la agricultura. En general el amaranto presenta inflorescencia de crecimiento indeterminado Kulakow (1987). Las especies con este tipo de crecimiento presentan superposición de etapas fenológicas en la misma planta, de esta manera se puede tener desde flores hasta semillas de diferente tamaño y grado de madurez, este traslape fenológico ha sido reportado en especies perenes, de hábito de crecimiento trepador o de guía y pastos entre otras especies (KilgoreNordqueti y Sneller, 2000; Funatsuki et al., 2000; Olivares et al., 2004; Nadal et al., 2005 y Mora et al., 2006). A. hypochondriacus presenta crecimiento indeterminado de la inflorescencia, lo cual resulta en una desventaja para la cosecha mecánica y uniformidad en la madurez, además, trae como consecuencia diferentes grados de madurez, tamaño y calidad en la semilla. El tipo 258

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de crecimiento en amaranto determinado se ha reportado solamente en A. edulis subespecie de A. caudatus Kulakow (1987). Espitia (1994) reportó un mutante de crecimiento determinado en la especie A. hypochondriacus raza Azteca, lo cual podría tener varias ventajas agronómicas y en la producción y calidad de semillas. La calidad de la semilla está determinada por un conjunto de atributos que inciden en el establecimiento y desarrollo de las plantas en el campo, en donde los componentes genético, físico, sanitario y fisiológico, juegan un papel relevante (Hampton, 2001). La calidad física abarca aspectos tales como: pureza analítica, contenido de humedad, tamaño, peso y color. La pureza analítica nos indica el grado de contaminación con semillas extrañas y materia inerte. El tamaño y peso son indicadores de la excelencia de la semilla, ya que un cultivo sujeto a condiciones ambientales desfavorables presentará una disminución en su peso volumétrico (Moreno, 1996; Copeland y McDonald, 2001). En la actualidad, las pruebas de germinación han sido aceptadas y se utilizan universalmente para determinar la calidad fisiológica de un lote de semillas (Delouche, 2002). Sin embargo, la germinación resulta inadecuada para evaluar el potencial de emergencia, por lo que se ha buscado un parámetro suplementario de calidad conocido ahora como vigor de semilla (Tekrony y Egli, 1991). En este aspecto, la ISTA (2004) define el vigor como la suma total de aquellas propiedades que determinan el nivel de actividad y capacidad de la semilla. Delouche (2002) señala que las principales causas que influyen en el vigor de la semilla son: composición genética, condiciones ambientales durante el desarrollo, factores ecológicos en la etapa de madurez a cosecha, densidad, tamaño y peso, integridad mecánica y sanidad, entre otros. El presente estudio se realizó bajo la hipótesis de que el hábito de crecimiento de la inflorescencia en amaranto tiene efecto sobre la calidad de semilla. Para lo cual se planteó el objetivo de determinar el efecto del tipo de crecimiento sobre la calidad física y fisiológica en líneas derivadas por descendencia de una sola semilla de un mutante de la especie A. hypochondriacus L.

Capítulo XVIII. Hábito de crecimiento de la inflorescencia y su relación con la calidad física y fisiológica en semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.)

MATERIALES Y MÉTODOS El material utilizado se obtuvo de un mutante de crecimiento determinado en la especie A. hypochondriacus raza Azteca, a partir de este mutante se derivaron 50 líneas de crecimiento determinado y 50 líneas de crecimiento indeterminado, se avanzaron a F5 por descendencia de una sola semilla, para este estudio se tomaron 26 líneas de crecimiento indeterminado y 24 de crecimiento determinado (Figura 1). La semilla de todos los genotipos fue proporcionado por el Instituto Nacional de Investigación Forestal, Agrícola y Pecuaria (INIFAP). La siembra se realizó en el ciclo 2004, en Chapingo México, en terrenos del Campo Experimental Valle de México, INIFAP y en San Miguel del Milagro, Tlaxcala. Se utilizó un diseño experimental de bloques al azar con tres repeticiones; cada unidad experimental consistió de un surco de 2 X 0.80 m. En la localidad de Chapingo se aplicó una dosis de fertilización de 70-70-30 (incorporada en la siembra y en el

primer cultivo). En Tlaxcala se uso la dosis 8070-50 (en una sola aplicación). Se realizaron labores de cultivo tales como deshierbes, aclareos y aplicación de insecticidas. A los 150 días después de la siembra se hizo la cosecha de toda la parcela (entre cinco y ocho plantas), para ser procesadas posteriormente en el laboratorio. Las inflorescencias se dividieron en nueve estratos de la base al ápice, en la semilla de cada estrato se analizó la calidad física y fisiológica en el Laboratorio de Análisis de Semillas del Colegio de Postgraduados durante el ciclo primavera-verano 2004. Con respecto a la calidad física se evaluó: el contenido de humedad (CH) de acuerdo con el método de la estufa a 130ºC (ISTA, 2004), con una modificación en el tiempo de exposición (2 horas) y dos repeticiones de 2 g; el peso de materia seca (MS) de la semilla fue considerado directamente como el peso seco de la semilla expresado en gramos. Para determinar el peso volumétrico (PV), se uso un recipiente de 6.5 mL y una báscula de 0.001 g de precisión en cuatro repeticiones, los resultados se reportaron en kg hL-1.

Figura 1. Material de crecimiento determinado encontrado en la zona productora del Distrito Federal en A. hypochondriacus raza Azteca.

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La calidad fisiológica se evaluó en términos de germinación y vigor. La prueba de germinación, se realizó sobre papel a 28 ± 1 ºC durante cinco días; se hicieron dos conteos (al segundo y quinto día después del inicio de la prueba). Cuatro repeticiones de veinticinco semillas, se colocaron en cajas Petri las cuales se introdujeron en una bolsa de plástico para evitar la pérdida excesiva de agua, se colocaron en una cámara de germinación. Las variables evaluadas fueron: plántulas normales (PN), plántulas anormales (PA) y semillas no germinadas (SNG) (ISTA, 2004), los resultados se reportan en porcentaje (%). Para determinar el vigor se utilizó como indicador el primer conteo (PC) de la prueba de germinación y la velocidad de emergencia (VE), para lo cual se sembró en charolas de plástico (40 x 30 x 3 cm) con arena común; se utilizaron cuatro repeticiones de veinticinco semillas. La semilla se sembró a una profundidad de 1 cm en surcos de 30 cm de largo con una distancia entre éstos de 2 cm y 1 cm entre semillas. Las charolas fueron colocadas en cámaras de germinación a 25 ± 1 ºC. Los resultados se reportan en términos del índice de velocidad de emergencia (IVE) de acuerdo con Maguire (1962). El análisis estadístico se hizo por localidad, se considero tipo de crecimiento y estrato, para el análisis de los datos en porcentaje se realizó una transformación. Los resultados se analizaron mediante el procedimiento GLM (SAS, 2000) y la comparación de medias se realizó con la prueba de Tukey (p≤0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN CALIDAD FÍSICA Las variables contenido de humedad, materia seca y peso volumétrico presentaron diferencias altamente significativas para tipo de crecimiento (Cuadro 1), no obstante, entre localidades, sólo el peso volumétrico mostró diferencias. Para estrato y la interacción tipo de crecimiento por estrato, sólo se obtuvieron diferencias significativas para materia seca. En relación a genotipos dentro de tipo de crecimiento y a tipo de crecimiento, se obtuvieron diferencias significativas en las tres variables evaluadas. El tipo de crecimiento tuvo mayor influencia en la calidad física de la semilla ya que para contenido de humedad, materia seca de la semilla y peso volumétrico sus efectos fueron mayores y solamente en velocidad de emergencia el efecto de localidades es mayor. En cuanto al efecto de los dos tipos de crecimiento, el crecimiento indeterminado tuvo mayor efecto en materia seca de la semilla y velocidad de emergencia; mientras que los efectos para contenido de humedad y peso volumétrico fueron mayores para el tipo determinado. En relación a la calidad física por localidades se muestra en el Cuadro 2, encontrándose diferencia significativa para la variable peso volumétrico, con una ligera ventaja para la localidad de Chapingo, Méx. mientras que, para contenido de humedad y materia seca no hubo efecto de la localidad.

Cuadro 1. Cuadrados medios del análisis de varianza para variables de calidad física y fisiológica de semilla en genotipos de amaranto con diferente hábito de crecimiento de inflorescencia evaluados en dos localidades de La Mesa Central.

Calidad Física FV Localidad (Loc) Loc (repeticiones) Crecimiento (Crec) Estrato Crec*Estrato Crec (Genotipos) Indeterminado Determinado Error

GL 1 6 1 8 8 50 27 23 154

CH 0.069 0.25 28.25** 1.48 1.23 14.17** 12.55** 16.75** 2.027

Calidad Fisiológica

PV PC VE MSS 0.44* 103.98* 4.65* 0.005 1.15 0.55 1.15 0.0004 65.91* 2.41* 0.038** 1.85* 3.19* 0.18* 0.0008* 0.01 2.03* 0.38* 0.0006* 0.01 0.007** 0.11** 20.66** 0.44 0.008** 0.37** 23.13** 0.48 0.007** 0.71** 18.19** 0.42 0.54 0.97 0.0013 0.016

PN 1.09 0.68 0.91* 0.47* 0.92 0.46 0.14* 0.55 0.47

PA 0.22* 0.59 0.81* 0.37 0.27 0.70* 0.38 0.86* 0.48

SNG 0.12* 0.17 0.04* 0.26* 0.31 0.29 0.55 0.21 0.24

FV: fuente de variación; GL: grados de libertad; CH: contenido de humedad; MSS: materia seca de la semilla; PV: peso volumétrico; VE: velocidad de emergencia; PC: primer conteo; PN: plántulas normales; PA: plántulas anormales; SNG: semillas no germinadas. *significativo al 0.05 de probabilidad; **significativo al 0.01 de probabilidad.

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Capítulo XVIII. Hábito de crecimiento de la inflorescencia y su relación con la calidad física y fisiológica en semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.)

En cuanto al tipo de crecimiento, Cuadro 3, la calidad física en términos de peso volumétrico y el contenido de humedad fue ligeramente superior para hábito de crecimiento determinado, en tanto que la materia seca fue menor. De igual manera, se observó que en el caso de los estratos de la inflorescencia, sólo peso volumétrico y dentro de éste solo el primer estrato presentó diferencias estadísticas con el valor más bajo, lo que se explica por ser la semilla

con menor grado de madurez (Cuadro 4), así se debe tomar en cuenta que en los extremos se ubicaron las semillas con menor y mayor grado de madurez, de modo que las semillas de la parte central presentaron los valores más altos debido a la mayor uniformidad en la madurez que se tiene en esa área de la inflorescencia. Los valores de peso volumétrico encontrados en este estudio son mayores que los reportados por Paredes et al. (1990) quienes mencionan un peso hectolítrico de 76.9 kg/hl para amaranto.

Cuadro 2. Comparación de medias para variables de calidad física de la semilla de amaranto por localidad.

Calidad Física Peso volumétrico Contenido de humedad (%) (kg hL-1) Localidad 8.24 a 85.23 b San Miguel del Milagro 8.24 a 85.69 a Chapingo 8.24 85.57 Media

Materia seca (g) 1.83 a 1.83 a 1.83

Medias con la misma letra dentro de columna son estadísticamente iguales (Tukey, p≤0.05). Cuadro 3. Calidad física de la semilla de amaranto en relación al tipo de crecimiento.

Hábito de crecimiento Peso volumétrico (kg hL-1) Contenido de humedad (%) Materia seca (g)

Determinado Indeterminado 85.82 a 85.23 b 8.38 a 8.12 b 1.83 b 1.84 a

Medias con la misma letra dentro de hilera son estadísticamente iguales (Tukey, P≤0.05). Cuadro 4. Comparación de medias para variables de calidad física de la semilla de amaranto por estrato de la inflorescencia.

Peso volumétrico (kg hl-1) Estrato 85.52 a 9 85.60 a 8 85.60 a 7 85.54 a 6 85.65 a 5 85.72 a 4 85.58 a 3 85.57 a 2 85.37 b 1 85.57 Media

Contenido de humedad (%) 8.46 a 8.24 a 8.18 a 8.23 a 8.24 a 8.29 a 8.23 a 8.16 a 8.15 a 8.24

Materia seca (g) 1.833 a 1.838 a 1.834 a 1.834 a 1.839 a 1.839 a 1.838 a 1.834 a 1.841 a 1.83

PV: peso volumétrico; CH: contenido de humedad; MS: materia seca. Medias con la misma letra dentro de columna son estadísticamente iguales (Tukey, p≤0.05).

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La inflorescencia de amaranto forma sus flores desde la base hacia el ápice, así, mientras la parte basal posee semillas maduras, la apical aún tiene flores en antesis. Los valores de humedad obtenidos en semillas de amaranto provenientes de inflorescencias de crecimiento indeterminado, son similares a los reportados en National Research Council 1984 (6 a 11%) y Teutónico y Knorr, 1985 (11.1%). CALIDAD FISIOLÓGICA Para la fuente de variación localidad se observaron diferencias significativas para localidad en las variables velocidad de emergencia, primer conteo, plántulas anormales y semillas no germinadas, no así para plántulas normales. En cuanto al hábito de crecimiento se encontraron diferencias significativas para todas las variables. Para estrato, únicamente la variable plántulas anormales no presentó diferencias significativas. Con respecto a la interacción crecimiento por estrato hubo diferencias significativas en las variables velocidad de emergencia y primer conteo. Para genotipos dentro de hábito de crecimiento se encontraron diferencias altamente significativas para velocidad de emergencia y significativas para plántulas

anormales (Cuadro 1). Dentro de localidades, en Chapingo se observó que a excepción de la variable semillas no germinadas, las demás no presentaron diferencias significativas (Cuadro 5). En cuanto al hábito de crecimiento los valores de las variables primer conteo y plántulas normales fueron superiores para el tipo determinado (Cuadro 6). Lo anterior implica que las semillas formadas en inflorescencias de crecimiento determinado presentaron mayor calidad fisiológica debido a que mostró menor porcentaje de plántulas anormales y semillas no germinadas, variables relevantes en la producción de semilla de amaranto de excelentes características. Con respecto al estrato dentro de la inflorescencia la prueba de medias, observado en el Cuadro 7, indica que se formaron dos grupos, uno que incluyó los estratos 3, 6, 7, y 8 y otro con los estratos 1, 2, 4, 5 y 9. De acuerdo a los resultados, las semillas más vigorosas se ubicaron en la parte apical de la inflorescencia (estratos 7, 8 y 9). Estas diferencias se podrían atribuir al grado de madurez fisiológica de cada estrato y de la semilla misma. Para el primer conteo también se observan diferencias significativas, los valores

Cuadro 5. Comparación de medias para variables de calidad fisiológica de semillas de amaranto por localidad evaluada.

Calidad Fisiológica Localidad VE PC (%) PN (%) PA (%) San Miguel del Milagro 4.97 b 87.71 b 84.15 a 12.06 b Chapingo 5.35 a 90.54 a 84.52 a 14.13 a Media 5.18 88.49 84.36 13.25

SNG (%) 3.78 a 1.31 b 2.36

VE: velocidad de emergencia; PC: primer conteo; PN: plántulas normales; PA: plántulas anormales; SNG: semillas no germinadas. Valores con la misma letra dentro de columna son estadísticamente iguales (Tukey, p≤0.05). Cuadro 6. Calidad fisiológica de la semilla de amaranto en relación al tipo de crecimiento.

Determinado Indeterminado Hábito de crecimiento 5.33 a 5.03 b Velocidad de emergencia 87.55 b 89.53 a Primer conteo (%) 83.26 b 85.55 a Plántulas normales (%) 13.95 a 12.51 b Plántulas anormales (%) 2.75 a 1.95 b Semillas no germinadas (%) Medias con la misma letra dentro de hilera son estadísticamente iguales (Tukey, p≤0.05).

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Capítulo XVIII. Hábito de crecimiento de la inflorescencia y su relación con la calidad física y fisiológica en semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.)

Figura 2. Calidad Fisiológica de la semilla se mide en semillas germinadas (izquierda) y semillas no germinadas y plantas anormales (derecha).

más altos se obtuvieron en los estratos apicales (9 y 8), seguidos por los estratos de la parte media y los basales. Estas diferencias pueden deberse a la posición en que se encuentra el estrato, siendo la parte apical que incluye los estratos 9 y 8, la que presentó la mejor germinación y la parte basal con los estratos 2 y 1 la que mostró los valores más bajos. Las semillas obtenidas en el presente trabajo, mostraron más del 80% de germinación para ambos hábitos de crecimiento, lo cual sería un indicador para posteriores evaluaciones de calidad física y fisiológica de semilla de amaranto.

El éxito reproductivo de las plantas con semilla depende de la producción de semillas saludables; la viabilidad del embrión se incrementa si la semilla contiene una cantidad substancial de reservas de almidón y proteínas para alimentar a la plántula después de la germinación. Mayor cantidad de reservas generalmente están acompañadas de una semilla de mayor tamaño (Sundaresan, 2005). La condición normal en amaranto es que su inflorescencia presente crecimiento indeterminado Kulakow (1987). Las especies con este tipo de crecimiento presentan superposición de etapas fenológicas en la misma planta, de esta

Cuadro 7. Comparación de medias para variables de calidad fisiológica de la semilla de amaranto por estrato de la inflorescencia.

Calidad Fisiológica Estrato 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Media

VE 5.19 b 5.24 a 5.32 a 5.25 a 5.18 b 5.11 b 5.22 a 5.12 b 5.00 b 5.18

PC (%) 90.05 a 89.02 a 88.65 b 88.72 b 88.59 b 88.91 b 88.27 b 87.48 c 86.78 c 88.49

PN (%) 85.66 a 84.32 b 83.35 b 84.77 b 83.73 b 84.76 b 85.00 b 83.92 b 83.75 b 84.36

PA (%) 12.66 a 13.34 a 14.31 a 12.81 a 14.08 a 12.86 a 12.34 a 13.26 a 13.57 a 13.25

SNG (%) 1.68 b 2.14 a 2.33 a 2.41 a 2.18 a 2.37 a 2.65 a 2.82 a 2.67 a 2.36

VE: velocidad de emergencia; PC: primer conteo; PN: plántulas normales; PA: plántulas anormales; SNG: semillas no germinadas. Medias con la misma letra dentro de columna son estadísticamente iguales (Tukey, p≤0.05).

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263

Amaranto: Ciencia y Tecnología

manera se puede tener desde flores hasta semillas de diferente tamaño y grado de madurez, este traslape fenológico ha sido reportado en especies perenes, de hábito de crecimiento trepador o de guía y pastos entre otras especies (KilgoreNordqueti y Sneller, 2000; Funatsuki et al., 2000; Olivares et al., 2004; Nadal et al., 2005 y Mora et al., 2006). La presencia de semillas de diferente tamaño y grado de madurez afecta la calidad de las mismas. En los resultados en este estudio se corrobora que efectivamente el amaranto presenta traslape fenológico y que hay efecto en la calidad de la semilla. Esto a pesar de que la estratificación que se realizó en la inflorescencia no es del todo representativa de la biología de la maduración; una estratificación que combine tanto la inflorescencia y las ramificaciones seguramente dará resultados más concluyentes sobre el efecto del tipo de crecimiento de la inflorescencia sobre la calidad tanto física como la fisiológica en amaranto. CONCLUSIONES Se corrobora la presencia de traslape fenológico en A. hypochondriacus y que este tiene efecto sobre la calidad tanto física como fisiológica de la semilla de amaranto. El tipo de crecimiento tuvo influencia en la calidad física de la semilla siendo mayor el efecto para contenido de humedad, materia seca de la semilla y peso volumétrico. En relación al efecto del tipo de crecimiento, el crecimiento indeterminado tuvo mayor efecto en materia seca de la semilla y velocidad de emergencia; mientras que, los efectos para contenido de humedad y peso volumétrico fueron mayores para el tipo determinado. En relación a la calidad física el hábito de crecimiento tuvo efecto en todas las variables, excepto plantas anormales. Las semillas de inflorescencias de crecimiento determinado presentaron mayor calidad fisiológica ya que mostraron menor porcentaje de plántulas anormales y semillas no germinadas, variables relevantes en la calidad de semilla.

264

M. L. Ramírez Vazquez et al.

LITERATURA CITADA Alejandre I G, F L Gómez (1986) Cultivo del amaranto en México. Universidad Autónoma de Chapingo. Ciudad de México. 245 p. Bartolini J S, J G Hampton (1989) Grain amaranth seed development, yield and quality. Proceedings of Annual Conference Agronomy Society of New Zeland. 19: 55-61. Copeland L O, M B McDonald (2001) Principles of seed science and technology. Fourth edition. Kluwer Academic Publishers. U. S. A. 488 p De León C H (1989) Disponibilidad y uso de las semillas mejoradas y criollas en México. In: Simposio Internacional sobre Tecnologías de Producción de Maíz. Memorias. Tomo I. FIRA. Noviembre 23 y 24. Guadalajara, Jal. México. pp: 89-99. Delouche J C (2002) Germinación, deterioro y vigor de semilla. Seed News 6(6):16-22. Ellis R H, T D Hong, E H Roberts (1985) Handbook of Seed Technology for Genebanks. Volume II. Compendium of Specific Germination Information and Test Recommendations. Handbook for Genebanks No. 3. International Board for Plant Genetic Resources. Rome, Italy. pp: 241-246. Espitia R E (1994) Breeding of grain amaranth. In: O. Paredes-López. (Ed.). Amaranth biology chemistry and technology. CRC Press Inc. pp: 23-28. Funatsuki H, W Murayama-Funatsuki, K Fujino, M Agatsuma (2000) Ripening habit of Buckwheat. Crop Science 40:1103-1108. Hampton J G (2001) ¿Que significa la calidad de semilla? Seed News 5(5): 16-19. ISTA (2004) International Rules for Seed Testing. The International Seed Testing Association. Chapters: 5 and 15. Glattbrugg, Switzerland. pp: 150-180.

Capítulo XVIII. Hábito de crecimiento de la inflorescencia y su relación con la calidad física y fisiológica en semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.)

Kilgore N, C. H Sneller (2000) Effect of stem termination on soybean traits in Southern U.S. production systems. Crop Science 40: 83-90. Kulakow P A (1987) Genetics of grain amaranths. II. The Inheritance of determinance, panicle orientation, dwarfism and embryo color in A. caudatus. Journal Hered 78: 293-297. Kulakow P A, H Hauptli, S K Jain (1985) Genetics of the grain amaranths. 1. Mendelian analysis of six color characteristics. J. Hered. 76: 27 – 30. Maguire J D (1962) Speed of germination –aid in selection and evaluation for seedling emergence and vigor. Crop Science 2:176–177.

SAS ( 2000) The SAS System. Release V 8.1. Cary. N. C. USA 830 p. Sundaresan V (2005) Control of seed size in plants. Proceedings of National Academy of Sciences 102(50): 17887-17888. Tekrony D M, D B Egli (1991) Relationship of seed vigour to crop yield: A review. Crop Science 31: 816-822. U. S. A. Teutonico R A, D Knorr (1985) Amaranth: composition, properties, and applications of a rediscovered food crop. Food Technology 39(4): 49–60.

Mora Aguilar R, A Peña Lomelí, E López Gaytán, J J Ayala Hernández, D Ponce Aguirre (2006) Agrofenología de Physalis peruviana L. en invernadero y fertirriego. Revista Chapingo Serie Horticultura 12(1):57-63. Moreno M E (1996) Análisis físico y biológico de semillas agrícolas. Tercera edición. Universidad Nacional Autónoma de México. Nadal S, Cabello A, Flores F, M T Moreno (2005) Effect of growth habit n agronomic characters in Faba Bean. Agriculturae Conspectus Scientificus. 70(2): 43-47. National Research Council (1984) Amaranth modern prospects for an ancient crop. Second printing. National Academy Press Washington, D. C. USA 77 p. Olivares A, M Johnston, E Salas (2004) Distribución de la precipitación y producción de semillas de alfilerillo, Erodium moschatum (L) L´Her. Agricultura Técnica 64(3): 251-263. Paredes L O, A P Barba, D L Hernánez, A T Carabez (1990) Amaranto características alimentarias y aprovechamiento agroindustrial. Organización de los Estados Américanos y Programa de Desarrollo Científico y Tecnológico, Washington, D.C. pp 97.

M. L. Ramírez Vazquez et al.

265

Plagas y Enfermedades

Capítulo IXX

Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.) PHYTOSANITARY ASPECTS OF GRAIN AMATANTH (Amaranthus spp.)

Patricia Rivas-Valencia1, Erica Muñiz-Reyes1 y Eduardo Espitia-Rangel2 1Campo Experimental Valle de México, Km. 13.5 Carr. Los Reyes-Texcoco. CP. 56250, Coatlinchán, Estado de México, 2Campo Experimental Bajío, CIR Centro. INIFAP. Km. 6.5 Carr. Celaya-San Miguel de Allende CP. 38110, Celaya, Guanajuato. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Autor por correspondencia: [email protected]

RESUMEN

ABSTRACT

El cultivo del amaranto ha sido a lo largo de la historia de nuestro país, parte importante, destacando sus características agronómicas y nutraceúticas. Sin embargo, considerado como un cultivo tradicional, no se había realizado avances importantes en la conservación, manejo y mejoramiento del mismo. Específicamente, en el manejo agronómico del mismo y en especial en la parte fitosanitaria, se cuenta con información científica limitada en México, lo que abre la oportunidad de estudiar diversos aspectos enfocados a este tema que aporten la base para la realización de propuestas de manejo y mejoramiento. En este capítulo se hace una revisión de las principales enfermedades y plagas que se han identificado en las regiones productoras del país y que coinciden con lo reportado por otros autores en el mundo, tratando así de motivar el estudio profundo de temas fitosanitarios.

The culture of amaranth has been throughout the history of our country, an important part, highlighting their agronomic and nutraceutical characteristics. However, considered as a traditional crop, had not made significant progress in the conservation, management and improvement of it. Specifically, in the agricultural management and especially in the phytosanitary traits, scientific information is limited in Mexico, which offers the opportunity to study various aspects focused on this topic that provide the basis for the implementation of management and proposals improvements. This chapter is a review of diseases and pests that have been identified in the regions of the country and similar to those reported by other authors in the world, thus trying to motivated the serious study of phytosanitary issues.

Palabras clave: enfermedades, plagas, A. cruentus, A. hypochondriacus, A. caudatus.

Key words: diseases, pests, A. cruentus, A. hypochondriacus, A. caudatus.

269-290

Amaranto: Ciencia y Tecnología

INTRODUCCIÓN El género Amaranthus se distribuye en todo el territorio mexicano, las especies A. cruentus, A. hypochondriacus y A. caudatus son las que mayormente se utilizan para la producción de grano, siendo las dos primeras las más importantes en México. Se reconoce al amaranto por su alto potencial agronómico, destacando la resistencia a sequía y su amplia adaptación a diversos ambientes, sin embargo también presenta ataques por artrópodos fitófagos y patógenos. Lo anterior, nos ofrece la oportunidad de caracterizar los elementos biológicos presentes en diferentes ambientes y/o regiones, lo cual constituye base para el estudio y la aplicación de estrategias para el manejo de las mismas. En México, es poca la información que se tiene sobre aspectos fitosanitarios de este cultivo, por lo que el objetivo de este capítulo es presentar las principales plagas y enfermedades que han sido detectados atacando al amaranto y se reportan aquellos identificados en México. ENFERMEDADES HONGOS Tizón del amaranto. Se observan lesiones necróticas con círculos concéntricos y un halo amarillento en las hojas, lo cual reduce el vigor de las plantas. En México es causado por Alternaria tenuis, en Estados Unidos Alternaria alternantherde, en la India, Kenia y Nairobi Alternaria amaranthi (Sánchez-Enciso et al., 1991), Perú, Nepal y Ecuador Alternaria spp. (Gardmenia 1985), Argentina Alternaria Chlamidospora y Alternaria alternata (Noelting et al., 2009). Estudios recientes en Sudáfrica identifican a Alternaria tenuissima como un patógeno que puede estar presente de forma latente e infectar y colonizar hojas de A. hybridus de manera consistente en ocurrencia de algún daño previo (Blodgett et al., 2002). Mancha negra y mancha del tallo. Se caracteriza por lesiones negras o pardas que inician en la porción baja del tallo, debilitándolo y avanzando a la parte superior, ocasionando la ruptura del mismo, provocando la muerte de la planta. El agente etiológico reportado por Sánchez y colaboradores (1991) es Macrophoma 270

P. Rivas-Valencia et al.

sp., sin embargo Espitia (1986) menciona a Phoma longissiama como el responsable. Cabe señalar, que el género Phoma produce lesiones ovales de color gris claro en el centro y bordes obscuros, con presencia en algunos casos de picnidios en el centro de la lesión, sin embrago éstas lesiones no sobrepasan los 5 cm de longitud y no estrangulan el tallo (Sánchez et al., 1991; Noelting et al., 2009). Pudrición marrón del tallo o esclerotiniosis. Se producen lesiones de color marrón en el tallo e inflorescencias; en hojas produce clorosis y muerte. En ataques severos se observan pudriciones a lo largo del eje central de la inflorescencia para posteriormente ocasionar marchitez. Esta enfermedad es causada por Sclerotinia sclerotiorium, que ataca a gran parte de los órganos de la planta (Noelting y Sandoval, 2005). Carbón del amaranto. Afecta las inflorescencias, reabsorbiendo los granos, lo cual al trillarla solo aparece un polvo negro, causando la pérdida total de grano en plantas, se han identificado dos especies del hongo Thecaphora amaranthi y T. amaranthicola como responsables del carbón (Bernal-Muñoz et al., 2000; Noelting et al., 2010) (Figura 1). Espitia-Rangel en 1991a reportó que en zonas tradicionales donde se ha sembrado el amaranto como monocultivo aparece Thecaphora iresine. Esta enfermedad se encuentra con mayor frecuencia en las zonas productoras de Tulyehualco y en San Miguel del Milagro y podría tener inclusive importancia cuarentenaria. Pudrición de raíz o damping-off. Se producen pudriciones en raíz y base del tallo y normalmente es un complejo de hongos de los géneros Phytium sp., Fusarium sp., Rhizoctonia sp., las especies identificadas por su importancia son P. aphanidermatum (Sánchez et al., 1991); Fusarium oxysporum y F. sambucinum (Chen y Swart, 2000; 2001) (Figura 2). Roya blanca. Albugo bliti es el hongo responsable de esta enfermedad que puede causar importantes pérdidas en la producción (Joshi y Rana, 1992). En México está enfermedad se presenta en la

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.)

a)

b)

d)

c)

Figura 1. Carbón del Amaranto (Thecaphora sp.). A) Planta con síntomas de carbón. B) Inflorescencias con síntomas de carbón. C) Inflorescencias trilladas con pérdida de grano por carbón. D) Esporas de Thechapora sp.

Figura 2. Pudrición de raíz en amaranto causada por hongos. P. Rivas-Valencia et al.

271

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Figura 3. Síntomas iniciales de roya blanca.

mayor parte de las zonas productoras del centro (Figura 3). Pudrición húmeda del tallo. Esta pudrición es producida por Choanephora cucurbitarum. HONGOS PATÓGENOS ASOCIADOS A SEMILLAS En México se reportan 18 especies: Alternaria sp., Aspergillus sp., Chaetophoma sp., Fusarium lateritium, Fusarium spp., Macrophoma sp., Penicillium sp. y Phoma sp. (Bernal-Muñoz, et al., 2000; Terrazas-Morales, 1999); Aspergillus parasiticus, Epicoccum nigrum, tres especies de Fusarium, Rhizopus rhizopodiformis, Stachybotrys chartarum y tres especies de Trichoderma (Moreno-Velázquez et al., 2005), todos ellos en semillas de A. hypochondriacus. En Argentina en un estudio realizado a semillas de A. cruentus cv Don Guiem y A. hypochondriacus cv G. Covas, se identificaron 14 géneros: Acrenomun sp., Alternaria sp., Aspergillus sp., Arthrinium sp., Aureobasidium sp., Colletotrichum sp., Crysosporium sp., Fusarium sp., Helminthosporium sp., Mucor sp., Penicillium sp., Rhizoctonia sp., Rhizopus sp. y Stemphylium sp. (Noelting et al., 2004). En Sudáfrica se reportan 19 especies de hongos asociados a semillas de Amaranthus cruentus: Alternaria amaranthi, A. tamarii, A. tenuissima, Aspergillus fumigatus, A. niger, A. flavus, Chaenophora cucurbitarum, Caldosporium sp. Cochliobolus geniculata, Curvularia geniculata, Fusarium oxysporum, F. pallidoroseum, F. verticillioides, Phoma sorghina, Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solani, Rhizopus 272

P. Rivas-Valencia et al.

oryzae y Thielavia terrícola (Adebanjo e Ikotun, 1994; Teri y Mlasani, 1994; Blodgett y Swart, 2002). En Polonia Pusz (2009) reporta al menos 18 especies de hongos asociados a semillas, siendo Alternaria alternata el más frecuente colonizador de semillas de A. cruentus, A. paniculatus y A. retroflexus; seguido de Epicoccum nigrum y Cladosporium cloadosporioides y esporádicamente de especies de Fusarium, Penicillium y Phoma. VIRUS Virosis. En campos de cultivo en Texcoco, México se han observado plantas con síntomas de achaparramiento o enanismo, clorosis, enrollamiento y deformación de hojas. Las plantas con síntomas de virosis se presentaron de forma espacialmente aleatoria, confirmándose la presencia de virus con la obtención de RNA bicatenario (De la O et al., 2010) (Figura 4). En Argentina, Asia y Oceanía se han encontrado afectando a A. blitum, A. caudatus, A. cruentus, A. gracilis, A. hypochondriacus, A. lecocarpus y A. spinosus al Amaranthus Mottle Virus (Mosyakin and Robertson, 2003, citado por Rojas-Martínez et al., 2009). Sammons y Barnett (1987) (citados por Joshi and Rana 1992), reportan al Tobacco Ringspot Virus causando daños a Amaranthus Hybridus en California, USA. A continuación se enlistan 10 especies de amaranto susceptibles a virus (Cuadro 1), según lo reportado en la base de datos: Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. URL http://biology.anu.edu. au/Groups/MES/vide/.

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.)

Figura 4. Síntomas de virosis. Cuadro 1. Especies de amaranto con susceptibilidad a diferentes virus. (Brunt et al., 1996. URL http://biology.anu. edu.au/Groups/MES/vide/).

Especie de amaranto Amaranthus caudatus

Susceptibilidad a virus Abelia latent tymovirus Alfalfa mosaic alfamovirus Amaranthus leaf mottle potyvirus Amaranthus mosaic (?) potyvirus Arracacha A nepovirus Arracacha B (?) nepovirus Bean yellow mosaic potyvirus Beet curly top hybrigeminivirus Beet mosaic potyvirus Cactus X potexvirus Carnation mottle carmovirus Carnation ringspot dianthovirus Carnation vein mottle potyvirus Celery latent (?) potyvirus Chicory yellow mottle nepovirus Clover yellow mosaic potexvirus Clover yellow vein potyvirus Cucumber mosaic cucumovirus Cymbidium ringspot tombusvirus Dahlia mosaic caulimovirus Elderberry carlavirus Grapevine fanleaf nepovirus Heracleum latent trichovirus Humulus japonicus ilarvirus Iris fulva mosaic potyvirus P. Rivas-Valencia et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología Continúa Cuadro 1...

Especie de amaranto

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P. Rivas-Valencia et al.

Susceptibilidad a virus Lamium mild mottle fabavirus Lettuce mosaic potyvirus Maclura mosaic macluravirus Marigold mottle potyvirus Peanut stunt cucumovirus Plantain X potexvirus Potato 14R (?) tobamovirus Potato Andean latent tymovirus Potato black ringspot nepovirus Potato leafroll luteovirus Red clover necrotic mosaic dianthovirus Ribgrass mosaic tobamovirus Telfairia mosaic potyvirus Tobacco etch potyvirus Tobacco necrosis necrovirus Tobacco rattle tobravirus Tobacco ringspot nepovirus Tobacco streak ilarvirus Tomato black ring nepovirus Tomato spotted wilt tospovirus Turnip mosaic potyvirus Ullucus mild mottle tobamovirus Viola mottle potexvirus Watermelon mosaic 2 potyvirus Zygocactus Montana X (?) potexvirus Amaranthus mosaic (?) potyvirus Amaranthus leaf mottle potyvirus Amaranthus mosaic (?) potyvirus Amaranthus leaf mottle potyvirus Viola mottle potexvirus Celery latent (?) potyvirus Amaranthus mosaic (?) potyvirus Alfalfa mosaic alfamovirus Amaranthus leaf mottle potyvirus Apple mosaic ilarvirus Asparagus 3 potexvirus Beet curly top hybrigeminivirus Beet mosaic potyvirus Beet western yellows luteovirus Cactus X potexvirus Celery latent (?) potyvirus

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.) Continúa Cuadro 1...

Especie de amaranto

Susceptibilidad a virus Cucumber mosaic cucumovirus Elm mottle ilarvirus Grapevine Bulgarian latent nepovirus Lilac chlorotic leafspot capillovirus Nerine X potexvirus Okra mosaic tymovirus Ribgrass mosaic tobamovirus Spinach latent ilarvirus Statice Y potyvirus Strawberry latent ringspot (?) nepovirus Tobacco rattle tobravirus Tobacco streak ilarvirus Tomato black ring nepovirus Tomato ringspot nepovirus Tomato spotted wilt tospovirus Tomato top necrosis (?) nepovirus Amaranthus leaf mottle potyvirus Amaranthus mosaic (?) potyvirus Apple mosaic ilarvirus Amaranthus mosaic (?) potyvirus

BACTERIAS Mancha bacteriana. Reddy y colaboradores (1980) (citado por Joshi y Rana 1992), reportan en la India a Xanthomonas amaranthicola como el agente causal de lesiones en hojas. La información de este patógeno atacando las diversas especies de amaranto en México es limitada, sin embargo se han reportado a Pseudomonas argentinensis (CasarrubiasCastillo et al., 2009) y Xhanthomonas campestris pv. phaseoli (Huerta y Rodríguez, 1994). FITOPLASMAS Escoba de bruja. Las plantas enfermas presentan proliferación de la panícula, amarillamiento foliar, acortamiento de entrenudos, y en algunas los brotes nuevos son raquíticos y amarillentos. Se evidenció la presencia de ADN fitoplásmico detectado en tallo, hoja e inflorescencia y semillas germinadas provenientes de plantas con síntomas. El fragmento obtenido mostró

una identidad de 99% con el grupo 16Sr III Candidatus Phytoplasma pruni (Rojas-Martínez et al., 2009). Enverdecimiento. Esta enfermedad ha sido reportada como crecimiento secundario (Espitia, 1992) y como filodia (Suárez, 1986) (Figura 5). NEMÁTODOS Nódulos o agallas de raíz. Entre los nemátodos que atacan al amaranto tenemos a Nacobbus aberrans (Santa Cruz y Marbán, 1986) y Meloidogyne incognita (Joshi y Rana, 1992), los cuáles producen nódulos en las raíces causando daños significativos a la producción del orden del 10-14% del rendimiento de grano. Se observa nódulos tanto en la raíz principal como raicillas, en ataques severos se observa decaimiento de la planta; se recomienda rotación de cultivos y evitar siembras en campos infestados.

P. Rivas-Valencia et al.

275

Amaranto: Ciencia y Tecnología

a)

b)

c)

Figura 5. Enverdecimiento o crecimiento secundario en amaranto.

PLAGAS Morales et al. (2009) libro, indican que A. cruentus muestra mayor susceptibilidad al daño por plagas que A. hypochondriacus. Espitia (1991) destaca la presencia de miembros de la familia Noctuidae, los cuales han sido observados cuando el cultivo es joven. En 2010, Fomsgaard y colaboradores, realizaron un estudio en varios países, para determinar los costos de producción del cultivo de amaranto, en los resultados de dicho estudio, reportan diversas plagas asociadas al cultivo en México: Lebia spp., Disonicha spp.; Diabrotica balteata, D. undecipunctata, D. virguifera, Colapsis spp.; especies de Cicadellidae, Microtalis spp., Orius spp., Lygus spp.; diversas especies de Pentatomidae, Catorhinta guttula, así como dermápteros y lepidópteros. Vejar et al., (1994) reporta en la región del Centro los fitófagos Acyrtosiphon pisum, Amphicerus cornutus, Aphis fabae, Chaetonema sp., Colaspis sp., Copitarsia decolora, 276

P. Rivas-Valencia et al.

Diabrótica balteata, Disonycha sp., Diabrotica undecimpunctata, Epicauta sp., Estigmene acraea, Herpetogramma bipunctalis, Lygus sp., Piesma cinérea, Pholisora catullus, Spodoptera exigua, Spoladea recurvalis. Espitia (1992), reporta el género Sciara sp. (Diptera) como barrenador del tallo en las zonas productoras. Por otra parte, la FAO (1990), categoriza a las plagas de amaranto como claves, secundarias y potenciales (Cuadro 2). Es importante señalar que aunque se tiene el reporte de diversas y numerosas especies presentes en el amaranto, no todas pueden considerarse como plagas aún cuando se hayan observado alimentándose de algunas plantas del cultivo. Se deben establecer y diferenciar las relaciones que guardan los organismos presentes para evitar aplicaciones innecesarias de insecticidas y buscar la conservación de los enemigos naturales.

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.) Cuadro 2. Plagas del amaranto

Plagas del amaranto Spoladea recurvalis Heliothis titicacae Peridroma spp, Agrotis spp Mythimna unipunctata Diabrotica speciosa Aphis spp, Myzus persicae Eurisacca melanocampta Pseudoplusia includens Spodoptera eridania Herpetograma bipunctalis Schistocerca peceifrons Calligrapha curvilinea Lygus lineolaris Palisot de Beauvois Contrachelus seniculus Le Conte Epicauta pennsylvanica De Geer Fuente: FAO, 1990

En general los trabajos de evaluación de daño en los diferentes genotipos y en las distintas regiones son escasos o nulos. PérezTorres (2011) presenta una lista de especies de insectos asociados al cultivo en la zona del volcán Popocatépetl, Puebla, de las cuales diez especies se relacionaron al follaje, tres atacando al tallo y uno a la raíz, sin embargo no presenta datos cuantificables de daño. En el Valle de Tehuacán que las pérdidas en producción sin control de plagas representa el 65%, además enlistan las principales plagas en la zona dentro de las cuales destacan las del follaje. El mayor daño en la planta se registra en época de sequía (Morales et al., 2009), en general las plagas presentes en el cultivo no son devastadoras pero tienen efecto en el rendimiento y calidad de grano (Carmona et al., 2008). A continuación se mencionan los principales fitófagos que tienen como hospedante al amaranto. Lygus lineolaris (DE BEAUVOIS) (HEMIPTERA:MIRIDAE) Importancia y distribución Cerca de 40 especies de este género son reportadas como plagas de importancia agrícola, es una plaga polífaga, considerada como una de las más abundantes en el cultivo de amaranto en

México, Aragón-García y López-Olguín (2001) encontraron hasta 35 chinches en hoja y panoja. Se menciona que en plantaciones comerciales la reducción en el rendimiento puede alcanzar hasta el 80% (Wilson, 1984 y Espitia-Rangel, 1994). Este mirido se encuentra distribuido en casi todos los estados del país; Vejar et al. (1994) reportan las localidades de Altepexi, Chapingo, Miacatlán, Montecillo y San Miguel de Milagro en la región central de México, por otra parte destaca su presencia en Estados Unidos, donde se reportaron siete especies de Amaranthus como hospedantes de este insecto. El género Amaranthus representa un hospedante muy importante ya que aloja los adultos que presentan diapausa (Snodgrass y Abel, 2004). Descripción El adulto macho mide entre 4.9-5.9 mm de longitud, mientras que la hembra mide 5.2-5.3 mm de largo. La cabeza es de color marrón amarillento, con líneas negras frontales sub-medianas (Figura 6). Las antenas son largas de cuatro artejos, con patas relativamente largas. El pronoto es de amarillento a café-rojizo con los ángulos anteriores redondeados, el mesoescuto es negro con las áreas laterales pálidas o rojizas. Los hemélitros (alas anteriores) son café-rojizas P. Rivas-Valencia et al.

277

Amaranto: Ciencia y Tecnología

con una pubescencia moderadamente larga, densa y amarillenta. A simple vista el cuerpo se observa en forma oval alargada, de color negro casi en su totalidad con áreas verde pálido a café rojizo. En el escutelo se observa un triángulo distintivo. Los huevos son pequeños (1 mm largo y 0.25 mm de ancho), truncados y ligeramente curvados (Dixon y Fasulo, 2009). Las ninfas o estados inmaduros son similares en forma y color y comienzan a alimentarse de las semillas en formación (Ferguson et al., 2012). Biología y ciclo de vida Los adultos hibernantes permanecen en zonas protegidas, tales como materia en descomposición, hojarasca, bajo la corteza, entre hojas de plantas, en rocas presentes en el campo, en hierba seca o en orillas de camino (Ferguson et al., 2012; Dixon y Fasulo, 2009) (Figura 7), éstos son mucho más oscuros que los adultos que se presentan en verano, razón por la cual a veces son considerados erróneamente como organismos diferentes. Es probable que la intensidad y el patrón de color, así como

cinco estados ninfales y una nueva generación de adultos ocurre después de 30-45 días. El ciclo de vida es completado de tres a cuatro semanas, cuando la duración del día es de 12.5 horas o menos, la diapausa es inducida en las ninfas y se manifiesta en los adultos (Ferguson et al., 2012). Esta especie presenta dos ó tres generaciones por año (Sutherland, 1989). Con frecuencia para así escapar cuando se le acercan, las ninfas caminan rápidamente y se caen si son molestadas. Daños Esta plaga presenta un aparato bucal chupador para succionar la savia de las plantas, esto ocasiona un daño en los tejidos vegetales. El daño lo inducen tanto ninfas como adultos, principalmente se alimentan de botones florales causando que el crecimiento terminal se marchite o distorsione, reduciendo el crecimiento de las plantas. Las hojas que crecen de los brotes dañados son de tamaños desiguales y descoloridos. Las flores de brotes dañados no se desarrollan de un lado y/o hay aborto de brotes enteros. Las poblaciones de

Figura 6. Adulto de Lygus lineolaris en amaranto.

las diferencias entre machos y hembras, estén influenciados por la temperatura, humedad, fotoperiodo hospedante y edad de los individuos. El insecto se encuentra presente durante todo el ciclo vegetativo pero el máximo de población se ha reportado en septiembre y octubre. (Capinera, 2001; Carmona et al., 2008; Dixon y Fasulo, 2012; Moreno, 2005). Los inmaduros pasan por 278

P. Rivas-Valencia et al.

chinches incrementan conforme el amaranto se va desarrollando, aunque en las primeras dos semanas de desarrollo las infestaciones de Lygus no son críticas, el peso de las semillas es reducido significativamente cuando la planta sufre el daño a la tercera a la quinta semana (Wilson y Oslon, 1992; Clark, et al., 1995; Carmona et al., 2008; Dixon y Fasulo, 2012). Espitia-Rangel (1994)

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.)

Figura 7. Estados inmaduros aglomerados.

reporta que las poblaciones nativas de bráctea más larga que el utrículo tienden a ser menos dañadas por esta chinche (Figura 8). Manejo Las poblaciones de este insecto se presentan en agregación, por lo que para realizar el muestreo se requiere tener un gran número de individuos para que sea representativa. Es

importante que se lleve a cabo un monitoreo en las malezas adyacentes hospederas de invierno y los lugares de hibernación que anteriormente se mencionaron para detectar las poblaciones de adultos (Carmona et al., 2008). Es posible utilizar cultivos trampa que ayuden a disminuir poblaciones. Las trampas pegajosas pueden ser útiles para detectar las primeras poblaciones del insecto en huertos

a)

b)

c)

Figura 8. a) Panoja infestada. B) Semillas sanas C) Daño en semillas de amaranto por ataque de Lygus. P. Rivas-Valencia et al.

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de manzano y se menciona que funcionan en hortalizas; las trampas amarillas también pueden resultar útiles. (Capinera, 2001). Wilson (1989) identificó algunas posibles fuentes de resistencia a este insecto. Aragón y López-Olguín (2001), reportan que el extracto de Croton ciliatusglandulosus Ort. (Euphorbiaciea) al 3% aplicado por semana otorga cierta protección al cultivo contra el daño de fitófagos de follaje, aunque no otorga datos de evaluación de su efecto para cada una de las plagas. También reporta que la semilla de Trichilia havanensis Jacq. (Meliacea), causa fitotoxicidad al cultivo por lo que se recomienda considerar su uso. Como controladores biológicos naturales se reporta a chinches depredadoras de los géneros Geocoris sp., Nabis sp., Zelus sp. y la especie Orius tristicolor. También se encuentran presentes Crysopas (Carmona et al., 2008). Algunos parasitoides reportados para esta chinche son Anaphis iole Girault, parasitoide de huevos y Leiophron uniformis (Gahan) que parasita ninfas. Los himenópteros Peristenus pallipes (Curtis) y P. pseudopallipes (Loan) son de los más importantes. Los parasitoides nativos parecen ser más efectivos en malezas que en cultivo, en Nueva Jersey se reporta que el parasitoide bracónido Peristenus digoneutis Loan disminuye la abundancia de Lygus en un 75%, además, esto parece no afectar a los parasitoides nativos (Capinera 2001). Liu et al. (2002) determinó que cepas de diversos hongos entomopatógenos entre ellos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae y el género Paecilomices tienen potencial como agentes de control microbiano contra L. lineolaris. BARRENADORES Hypolixus truncatulus (SIN: Lixus truncatulus) (FABRICIUS) (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) Importancia y distribución Junto con el díptero Amauromyza abnormalis, es de las especies más abundantes en el cultivo. Se han realizado pocas investigaciones al respecto de esta plaga polífaga. Como se verá más adelante, existen reportes que indican que el efecto del daño en rendimiento de amaranto no se puede generalizar a todas las especies y/o variedades, ni en todos los lugares donde se cultiva. Espitia-Rangel (1994) y Aragón y López280

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Olguín (2001) mencionan que esta especie es un problema serio en siembras comerciales de amaranto al igual que el género Sciara. TorresSaldaña et al. (2004) indican que la cantidad de larvas presentes está influenciada por el cultivar, por otra parte, Carmona et al. (2008), reporta infestaciones severas de hasta un 60%. Descripción Los huevos recién depositados se observan ovalados y redondeados de los extremos, suaves, translúcidos o amarillentos brillante, miden entre 1.25 mm de largo y 0.90 a 1.46 mm ancho. El color de éstos cambia conforme avanza el desarrollo (Carmona et al., 2008; Tara et al., 2009). Los huevos eclosionan después de tres a cinco días, las larvas son robustas, curvadas y ápodas, de color blanco. Se presentan cinco instares larvales, existen sólo pequeñas diferencias entre el primer y último instar, se utilizan entonces sólo la medida del cuerpo y la cápsula cefálica. La pupa es exarata, desnuda, con todos los apéndices visibles, libremente proyectados en la superficie ventral. De color blanco cremoso al inicio y gradualmente se torna amarillo pálido. Todos los segmentos tienen dorso transversalmente una hilera de setas en medio. Los adultos son café oscuro con pelillos blancos y zonas oscuras de densa pubescencia. Antenas geniculadas de 14 segmentos (Tara et al., 2010). El cuerpo mide 7.0 a 12.0 mm de largo (Carmona et al., 2008) y de 3.0 a 4.0 mm de ancho (Tara et al., 2009), las hembras sutilmente más largas que los machos. Cabeza prognata y rostrum pronunciado. Aparato bucal picador-masticador (Tara et al., 2009). Biología y ciclo de vida Casi inmediatamente después de la copulación, la hembra hace un hoyo de 1-2 mm de profundidad y en ramas tiernas o en las nervaduras centrales de la hojas depositando un solo huevo. El huevo tiene una duración de 2-4 días y las larvas avanzan a los tallos para barrenar. Pérez-Torres et al. (2011), reportan que las poblaciones se presentan entre septiembre y noviembre cuando la planta está al inicio de la antesis y empieza su maduración. Tara et al. (2009) reporta que el ciclo larval completo varía entre 42 y 45 días en la especie Amaranthus caudatus. Antes de la pupación, las larvas maduras

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.)

perforan el tallo hasta la superficie, donde hace un pequeño agujero redondo dejando la capa delgada epidermis intacta (Tara et al., 2009), este agujero se forma a nivel de la superficie del suelo o en la axila de la rama basal donde se desarrolla la cámara pupal, la cual se observa marrón-grisácea, dura y compacta. El adulto no es muy activo en vuelo pero siempre está alerta, de manera que si percibe un movimiento brusco, se deja caer al suelo y simula estar muerto. Daño Ocurre al dañar los tejidos vasculares de la planta y debido a esto la capacidad para la absorción de nutrientes se ve disminuida, provocando un debilitamiento de la planta. Los síntomas observables son amarillamiento progresivo, enrollamiento de la panoja, marchitez y finalmente la muerte de la planta (Carmona et al., 2008). Aragón-García et al. (1997) encontraron que las larvas pueden estar presentes hasta en un 92% de los tallos muestreados, es posible encontrar de 33-35 larvas atacando a una sola planta. Torres-Saldaña et al. (2004) observaron barrenación en la mayoría de los tallos de A. hypochondriacus en Tulyehualco, D.F., sin embargo, indican que el número de larvas no afectó positivamente el rendimiento en grano de las plantas de amaranto, tampoco el número de larvas en la producción de biomasa aérea. Manejo Se debe colocar atención sobre las áreas de hibernación, exponer a las larvas a los rayos solares y exponer a los enemigos naturales. Carmona (2008) recomienda la aplicación de hongos entomopatógenos con Beauveria bassiana o Metarhizium anisopliae después del trasplante cuando los tallos se empiecen a engrosar. También se recomienda el uso de extractos de higuerilla y epazote. Los insecticidas que son comúnmente recomendados son malatión y endosulfán, sin embargo, éstos condicionan un grave daño a la salud humana y una degradación a los recursos naturales locales. Hace falta mayor investigación respecto a estas y otros fitófagos presentes en este cultivo que sirvan para colocar las alternativas biológicas de manejo, así como los enemigos naturales locales para buscar la regulación de plagas.

Amauromyza abnormalis (MALLOCH) (DIPTERA:AGROMYZIDAE) Importancia y distribución La mosca barrenadora del amaranto es considerada una especie Neártica, la distribución abarca Estados Unidos y Canadá, así como la región Neotropical. El primer registro de esta especie en nuestro país fue realizada por Bautista et al. (1997) en localidades del Estado de México y Tlaxcala. Este díptero se encuentra atacando a las especies Amaranthus hypochondriacus y A. cruentus pero sin datos hasta la fecha que aporten la cuantificación del daño en este cultivo. Por otra parte A. hybridus la encontraron como maleza hospedante. Este insecto está dentro de las más importantes, en el estado de Puebla se registra de un 90-92% la infestación en el cultivo (Aragón y López-Olguín, 2001; Carmona et al., 2008), aunque está asociada a por lo menos cuatro especies más de barrenadores. Descripción No existe información acerca del estado de huevo, sin embargo se mencionan a continuación las características para los estados biológicos que se han reportado en el mundo. El adulto con halterios café oscuro y mesonoto café pálido (Frick, 1959; Spencer 1981), de 3 mm de longitud. La larva de color blanco de 7 mm de longitud, ápoda y alargada. Espiráculo caudal con cuatro lóbulos, lo cual es característica distintiva que separa el resto de las especies (Bautista et al., 2003). La pupa es de color café brillante, alargada (Carmona et al., 2008). Biología y ciclo de vida Se encuentra presente en tallos y raíces de especies de Amaranthus y Chenopodium. Los primeros adultos se observan a mitad de junio, cuando en campo están presentes tallos tiernos del cultivo para ovipositar. Las larvas se presentan en junio y julio y hasta el final del cultivo, la larva comienza a alimentarse en el tallo y conforme su desarrollo avanza se pueden encontrar galerías que avanzan desde la parte superior hasta la base de la planta (Bautista et al., 2003; Carmona et al., 2008). La pupa se encuentra en la parte interna del tallo o en el suelo (Spencer, 1981; Bautista et al., 2003).

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Daños Al hacer las galerías dentro del tallo, las larvas de la mosca afectan el sistema vascular. El daño por las larvas se ha encontrado hasta la mitad del pedúnculo de la panoja, en el último instar larval, hace una perforación para pupar. Carmona et al. (2008), menciona que es posible encontrar hasta diez larvas por planta, mientras que Espitia (1990) reporta 20 ó más larvas por planta. El daño mecánico producido por este insecto da cabida a la introducción de patógenos como el hongo Macrophoma sp., lo que puede ocasionar un debilitamiento general de la planta. Si las plantas presentan un ataque severo, pueden marchitar y morir.

que la infestación es severa. También se reporta que este insecto se encuentra presente en todas las áreas productivas de amaranto en el país.

Manejo No existe un manejo de la plaga, es necesario hacer mayor investigación para determinar el impacto del daño en un nivel de producción comercial, conocimiento puntual de la biología y ecología del insecto así como la evaluación de productos orgánicos o de origen vegetal como insecticidas. Es importante también obtener datos de parasitismo natural para tener elementos que nos permitan favorecer la conservación de estos organismos benéficos (Muñiz et al., 2011) Carmona et al. (2008), recomienda prácticas culturales para el caso de las pupas en el suelo.

Descripción De manera general los individuos de la familia Aphididae son de cuerpo blando, piriforme, de longitud variable en el caso de Macrosiphum de 4 mm, el color varía de verde a negro. Aparato bucal o rostrum es del tipo picador-chupador. La metamorfosis es paurometábola. Todos son polimórficos, es decir tienen formas aladas y ápteras. La frente o vértice, puede ser cóncava (Macrosiphum) o convexa (Aphis). En la base de las antenas se encuentran los tubérculos frontales, los cuales son en el caso de la tribu Aphidini poco desarrollados, no así en la tribu Macrosiphini.

a)

PULGONES (HEMIPTERA: APHIDIDAE) Importancia y distribución Vejar et al. (1994) y Carmona et al. (2008) reportan la especie Aphis fabae (Scop.) en Montecillo, Estado de México y Distrito Federal respectivamente. Mujica (1997) menciona como presentes al género Aphis spp. y Myzus persicae (Sulzer). En Puebla, Aragón y López-Olguín (2001) y Pérez-Torres (2011) registran al género Macrosiphum spp. Estos insectos son altamente polífagos y pueden causar daños severos.

b)

Figura 9. Daño por barrenadores en plantas de amaranto.

Sciara spp. (DIPTERA: SCIARIDAE) Espitia (1992) reporta a este díptero como un organismo capaz de ocasionar daño importante en el tallo, aunque no se han realizado evaluaciones dirigidas hacia el efecto en el rendimiento. La larva perfora desde un túnel a la punta de la planta, se pueden encontrar hasta tos como 20 ó más larvas en una sola planta. Muchas plantas no muestran síntomas externos del barrenador hasta 282

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Los tubérculos frontales pueden ser convergentes como en Myzus o divergentes Macrosiphum. Las antenas son de cuatro a seis segmentos y la longitud de los artejos varía. Los sensorios primarios se encuentran en los dos últimos segmentos de la antena, tanto en alados como en ápteros, y son siempre circulares. En los alados, los ojos compuestos están bien desarrollados y con tres ocelos. De la base del sexto segmento

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.)

emergen los cornículos o sifúnculos, que varían en tamaño y forma, llegando en algunos casos a reducirse casi por completo. Los cornículos pueden ser de lados paralelos o cilíndricos, como en el género Aphis. En algunos géneros de la tribu Macrosiphni, los cornículos poseen reticulación distal. La cauda puede ser bien desarrollada y tener lados paralelos (Aphis), o terminada en punta (Macrosiphum) (Cermeli, 1970). Biología y ciclo de vida El ciclo de vida de los áfidos es complejo, presentan heterogamia o reproducción cíclica, en la cual se alternan generaciones partenogenéticas con reproducción sexual. En la reproducción partenogénicas las hembras paren directamente ninfas, que cuando llegan a adulto pueden presentar alas o no. La migración se realiza a través de las formas aladas que empiezan a desarrollarse cuando las condiciones de la planta hospedante no son favorables, o bien cuando la colonia tiene un exceso de individuos ápteros, que son los responsables de la dispersión y colonización de las nuevas plantas, así como de la transmisión de las enfermedades virales. Los áfidos normalmente se localizan en grupos sobre hojas y brotes nuevos, formando en algunos casos densas colonias. Se observan entre los meses de mayo a septiembre (Aragón y López-Olguín, 2001). Daños Se encuentran en el envés de las hojas, sobre todo en las hojas tiernas, afectan los brotes, tallos y panojas, por lo que pueden producir deformaciones y los síntomas por virus. El perjuicio lo ocasionan al introducir los estiletes y succionar la savia de las plantas, llegando a presentar un daño del 13% (Aragón y LópezOlguín, 2001). El síntoma se observa con un amarillamiento generalizado en la planta y un enrollamiento en las hojas (Pérez-Torres et al., 2011). Manejo Se recomienda el uso de trampas pegajosas amarillas o azules. El incremento de enemigos naturales como catarinas del género Hippodamia y Crisopa (Chrysoperla sp.) es una opción viable ya que son depredadores clásicos de pulgones y que muestran una acción satisfactoria

en mucho de los casos (Gaona, 2000). También se recomienda el uso de jabones por su acción en el integumento del insecto, uso de insecticidas a base de extractos vegetales ya de uso comercial y de hongos entomopatógenos. Estigmene acrea (DURY) (LEIDOPTERA: ARCTIIDAE) Importancia y distribución Este insecto se encuentra en todo el país. Es una plaga generalista y se alimenta de más de 60 hospedantes (Castrejón y Rojas, 2010). Carmona et al. (2008) reporta infestaciones de hasta un 25%. Descripción La hembra deposita masas de huevos en el envés de las hojas, de color amarillo y forma esférica con la superficie esculpida. La larva es de color amarillo o verde-amarillento, tiene numerosas setas o pelos en toda la longitud del cuerpo. La larva mide alrededor de 10 mm durante el primer instar y crece hasta 55 mm de largo (Capinera, 2001). Antes de pupar se desprenden de los pelos para formar la pupa en el suelo (Sifuentes y Young, 1961; Carmona et al., 2008; Pérez-Torres, 2011). Los adultos son de color blanco en las alas anteriores y las posteriores de color amarillo o blanco con puntos negros y tienen una expansión alar de hasta 5 cm. Abdomen naranja con bandas negras transversales (Carmona et al., 2008). Biología y ciclo de vida Es mas activa y se reproduce en los meses de julio, agosto y septiembre. En los meses fríos, el insecto se interna en el suelo en estado de pupa protegiéndose en la hojarasca. Presenta cinco a siete instares larvarios, cuerpo. La duración del desarrollo larval es de 24 a 37 días, dependiendo de la alimentación, pero se han reportado periodos larvales de hasta 45 días. La pupa café oscuro y su duración es de 12 a 14 días. Las hembras viven de cuatro a cinco días, pero pueden producir más de un grupo de huevos (Capinera, 2001). Daños El daño por este lepidóptero se puede distinguir porque se alimenta de la hoja dejando solo las nervaduras laterales y la principal. El P. Rivas-Valencia et al.

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consumo del follaje para una larva madura es aproximadamente de 13 centímetros cuadrados de follaje. Se estimó además que de 1 a 1.5 larvas maduras por planta podrían provocar el 20% de defoliación a una planta de frijol, un nivel adecuado para causar la pérdida en campo. Manejo Existen depredadores tales como coccinélidos, melíridos y redúvidos pero no son muy importantes en la regulación poblacional del gusano peludo. Respecto al control químico, los productos autorizados están en función del cultivo en que se presente, sin embargo, se recomienda usar éstos de manera eficiente y de grupos toxicológicos bajos. Carmona et al. (2008), mencionan que el insecto es susceptible al contacto con Bacillus thuringiensis. Es posible el uso de extractos vegetales como repelentes o insecticidas orgánicos. Pholisora catullus Fab. (Lepidoptera: Hesperiidae) Importancia y distribución Graves y Shapiro (2003), la reportan en siete especies del género Amaranthus. Carmona et al. (2008) indica que este insecto no es de importancia en el Distrito Federal debido al control por enemigos naturales, las infestaciones son del 5%.

Descripción El adulto mide 26-32 mm con las alas extendidas, el patrón de manchas blancas en la zona distal de las alas anteriores es evidente. Se pueden diferenciar la hembra porque tiene mayor número de manchas que el macho (Aragón y López-Olguín, 2001). Huevos color negro, larvas con dos manchas negras dorsales en el primer segmento torácico que simula un anillo interrumpido. La cabeza es oscura y el cuerpo verde con una línea longitudinal dorsal. La pupa en sus primeros días de desarrollo es blanca y al final es oscura (Aragón y López-Olguín, 2001). Biología y ciclo de vida El adulto se alimenta de néctar de flores y oviposita sobre el haz de las hojas en masas de 15 huevos, la larva completa su desarrollo en aproximadamente 19 días, la pupa se forma en la hoja que enrolla para su protección. Daños y Manejo El daño se produce en las partes terminales de la planta, Aragón y López-Olguin (2001) reportan infestaciones de hasta el 57%, la larva enrolla hojas tiernas para elaborar la pupa, de manera que evita un desarrollo normal de la planta. El uso de Bt es muy útil para disminuir las poblaciones del insecto en las primeras apariciones en el cultivo.

Figura 10. Larva de Pholisora catullus y diferentes aspectos del daño.

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Spodoptera exigua (HÜBER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) Importancia y distribución El gusano soldado Spodoptera exigua es nativo del oriente de Estados Unidos, fue reportado primeramente de California en 1876, su distribución es mundial y se rata de una plaga polífaga, se reportan 60 especies vegetales de 23 familias botánicas. Descripción, biología y ciclo de vida En S. exigua, el adulto puede medir hasta 15 mm de longitud, las alas anteriores de color café grisáceo con una mancha central pálida o anaranjada orbicular y reniforme de color ocre (Alfaro, 2005). Las alas posteriores son blancas con bordes sombreados oscuros. La hembra oviposita masas de huevos en grupos de 50 o más en el envés de las hojas o cerca de la base del tallo, La larva puede medir hasta 30 mm, adelgazada en su parte anterior, color verdoso con una línea dorsal y otra más ancha, oscura, por encima de la línea de estigmas y con otra clara debajo de ella. Las larvas se encuentran en la planta en forma agregada, se alimentan de hojas tiernas dejando solo las nervaduras centrales. Para el caso de este insecto, se pueden diferenciar el nivel de daño, desde el daño leve, con una a tres larvas por planta o daño severo cuando se encuentran de 10 larvas en adelante. La dinámica poblacional es variable en cada ciclo, en un año pueden ser muy destructivas pero en otros no constituir un verdadero riesgo. Los meses de mayor incidencia es de julio a septiembre. Además de S. exigua, se encuentra presente S. ornitoghalli y S. frugiperda como un complejo de gusanos soldados. Manejo Manejo de malezas adyacentes y/o utilizarlos como cultivo trampa. Trampas de luz con cebo alimenticio. Se encuentran depredadores como Geocoris spp., Orius spp., Hippondamia convergens y Chrysoperla carnea. También se reportan los parasitoides del género Cotesia y miembros de la familia Tachinidae. El uso de Bt es recomendado para este tipo de larvas. El uso de trampas con feromonas también resulta útil. Es importante señalar que en la literatura sólo se cuentan escasos trabajos científicos que den soporte a datos de porcentaje

de daño o la abundancia y eficacia de enemigos naturales como porcentaje de infestación de las plagas. OTROS FACTORES DE RIESGO PARA LA PRODUCCIÓN DE AMARANTO Agentes abióticos Las bajas temperaturas y heladas que se presentan durante el desarrollo vegetativo del amaranto, son factores que tienen mucha importancia para la producción, siendo la fase fenológica de floración y panoja las más sensibles; cuando las temperaturas descienden bajo 4°C afecta no sólo el crecimiento del amaranto, si no que puede causar daño mecánico en el cultivo como consecuencia del congelamiento, trayendo como resultado muchas veces pérdida completa de la producción. Las granizadas durante la maduración y llenado del grano causan daños considerables en la producción, trayendo como consecuencia caída de las semillas maduras y dejando las inflorescencias sin semillas, además de destrozar la planta completa. Los excesos de humedad en el suelo también causan pérdidas en la producción, especialmente en los primeros estados de desarrollo, produciendo pudriciones radiculares, acame de las plantas y consecuentemente mayor incidencia de enfermedades; sobre todo cuando ocurren precipitaciones seguidas en un lapso corto de tiempo, recomendándose efectuar drenes en el campo. OTROS FACTORES QUE DAÑAN AL AMARANTO Las aves producen daños considerables en la producción pudiendo disminuir el rendimiento hasta en un 45%, sobre todo en áreas donde existen árboles y la presencia de ellas es significativa; no sólo consumen los granos maduros, si no que destrozan la inflorescencia trayendo como consecuencia caída de las semillas al suelo (Figura 12). Cuando los granos cosechados son almacenados y no se tiene la precaución de controlar los roedores, estos causan daños considerables no sólo consumiendo las semillas en almacenaje si no que disminuyendo la calidad por las defecaciones que dejan y como consecuencia disminuye fuertemente el precio. P. Rivas-Valencia et al.

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Figura 11. a) Larvas de S.exigua, b) Larvas de S. ornithogalli. A)

B)

Figura 12. Daños por agentes abióticos. A) Heladas y B) cicatrices de daño por granizo.

Figura 13. Pájaros alimentándose de amaranto.

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BIBLIOGRAFÍA Adebanjo A, T Ikotun (1994) Effects of harvest season on the incidence of seed-born mycoflora of three Amaranthus cultivars. Mycopathologia 128:25-32.

Casarrubias-Castillo K, Estrada-Hernández M.G, Martínez-Gallardo N A, J P Castrejón, F J Rojas (2010) Behavioral responses of larvae and adults of Estigmene acrea (Lepidoptera: Arctiidae) to light of different wavelengths. Florida Entomologist 93(4):504-509.

Alfaro M A (2005) Entomología Agraria. Los parásitos animales de las plantas cultivadas. Edición póstuma. Santiago-Alvarez, C. (ed.). Universidad de Córdoba, España. 301 p.

Cermeli M L (1970) Los áfidos de importancia agrícola en Venezuela y algunas observaciones sobre ellos (Homoptera; Aphididae). Agronomía Tropical 20(1):15-61.

Aragón-García, A, A M Tapia-Rojas I M T Huerta-Sánchez (1997) Insectos asociados con el cultivo de amaranto Amaranthus hypocondriacus L. (Amaranthaceae) en el Valle de Tehuacán, Puebla, México. Folia Entomol. Mex. 100: 33-43.

Chen W, W J Swart (2000) Fusarium oxsporum and F. sambucinum associated with root rot o Amaranthus hybridus in South Africa. Plant Dis. 84:101.

Bautista M N, L M Hernández F, C C Llanderal (2003) Insectos de importancia agrícola poco conocidos en México. 33 p. Colegio de Postgraduados. Bernal-Muñoz R, Rodríguez-Vallejo J, Estrada-Gómez A, Hernández-Livera A, M Gática-Vásquez (2000) Micoflora asociada a la semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.). Revista Fitotecnia Mexicana 23:109-118. Blodgett J T, W J Swart (2002) Infection, colonization, and disease of Amaranthus hybridus leaves by Alternaria tenuissima group. Plant Disease 86:1199-1205. Brunt A A, Crabtree K, Dallwitz M J, Gibbs A J, Watson L, Zurcher E J (1996) Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th August 1996.’ URL: http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/. Consulta: 25 de enero de 2011. Capinera J L (2001) Handbook of Vegetable Pests. Academic Press, San Diego. 729 pp.

Clark K M, W C.Baley, R L Myers (1995) Alfalfa as a companion crop for control of Lygus lineolaris (Hemiptera: Miridae) in Amaranth. Journal of Kansas Entomological Society 68(2):143-148. De la O Olán M, Rivas-Valencia P, Hernández-Casillas J M, Cortés-Espinosa L, Espitia-Rangel E, Ruíz-Hernández V C (2010) Variación de caracteres cualitativos y caracterización fitosanitaria de germoplasma de Amaranthus spp. XXXIII Congreso Nacional y III Internacional de Fitogenética. Sociedad Mexicana de Fitogenética. Nuevo Vallarta, Nayarit. pp:420. Délano-Frier J P (2009) Bacteriosis resistance in genotypes of amaranth (Amaranthus spp.) of agronomic interest. XIII National Congress of Biochemistry and Plant Molecular Biology y 6th Symposium Mexico-USA. Guanajuato, Gto., Mexico. November, 2009. Dixon y Fasulo W N, T R Fasulo (2012) Tarnished Plant Bug, Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) (Insecta: Hemiptera: Miridae). Originally published as DPI Entomology Circular 320.Publication Number:EENY-245. Espitia R E (1992) Amaranth germplasm development and agronomic studies in Mexico. Food Reviews International 8(1):71:86.

P. Rivas-Valencia et al.

287

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Espitia-Rangel E (1986) Situación actual y problemática del cultivo del amaranto en México. In: Primer Seminario Nacional del Amaranto. Colegio de Postgraduados. Chapingo, Méx. 101–108.

Huerta L M, M L Rodríguez (1994) Survival of the causal agent of common bean bligth, Xanthomonas campestris pv phaseoli (E.F.Sm.) in soil and in rhizosphere of some weeds at Chapingo, Mexico State. Rev. Chapingo1:29-33.

Espitia-Rangel E (1991) Recursos genéticos de Amaranto (Amaranthus spp.). In: Ortega, P.R., H.G. Palomino, G.F. Castillo, H.V. González and M.M. Livera. (Eds.). Avances en el estudio de los recursos fitogenéticos de México, SOMEFI, Chapingo, México.

Joshi B D, R S Rana (1992) Grain Amaranths: The future food crop. NBPGR, Shimla Sci. Monogr. No. 3. pp:117-119.

FAO (1990) Guía para el manejo de plagas en cultivos andinos subexplotados. Oficina Regional para América Latina y el Caribe. Santiago, Chile. 116 p. Ferguson G, G Murphy, L Shipp (2012) Managing the Lygus Bug in Greenhouse Crops. Factsheet ISSN 1198-712X. Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs. Ontario. Fomsgaard I S, Añon M C, Barba de la Rosa A P, Christophersen C, Dusek K, Frick K E (1959) Synopsis of the species of Agromyzid leaf miners described from North America. Proceedings of the United States National Museum. Vol. 108 No. 3407. 465 p. Gaona G G, E C Ruíz, R M Peña (2000) Los pulgones (Homoptera: Aphididae) y sus enemigos naturales en la naranja Citrus sinensis (L.) en la zona Centro de Tamaulipas, México. Acta Zoológica Mexicana (n.s.) 081. P. 1-12. Garmendia A (1985) Enfermedades del amaranto. Programa de Investigación del Amaranto. Informe 83-2. Cusco, Perú. Graves S D, A M Sahpiro (2003) Exotic and hot plants of the California butterfly fauna. Biological conservation. 110:413-433. Grubben G J H (1976) The cultivation of amaranth as a tropical leaf vegetable. Department of Agricultural Research, Royal Tropical Institute, Amsterdam. 207 p.

288

P. Rivas-Valencia et al.

Liu H, Skinner M, Parker B L, M Brownbridge (2002) Pathogenicity of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes), and other entomopathogenic fungi against Lygus lineolaris (Hemiptera: Miridae). J Econ Entomol. 95(4):675-81. Mazzuferi V E, A Maidana, P Fichetti, L G Hansen, D S Avalos (2011) Abundancia y riqueza específica de pulgones (Hemiptera: Aphididae) y sus parasitoides en diferentes genotipos y estados fenológicos del garbanzo. Agriscientia vol.28 no.2 Córdoba. Morales J C, N Vázquez-Mata, R. Bressani (2009) El amaranto: Características físicas, químicas, toxicológicas y funcionales y aporte nutricional. 269 p. Moreno-Vázquez M, Yáñez-Morales M J, Rojas-Martínez R I, Zavaleta-Mejía E, Trinidad-Santos A, J L Arellano-Vázquez (2005) Diversidad de hongos en semilla de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) y su caracterización molecular. Revista Mexicana de Fitopatología 23:111-118. Mosyakian S L, K R Robertson (1996) New infrageneric combination in Amaranthus (Amaranthaceae). Ann Bot. Fennici 33:275281. Muñiz-Reyes E J, R Lomeli-Flores, J Sánchez-Escudero (2011) Parasitoides nativos de Rhagoletis pomonella Walsh (Diptera: Tephritidae) en tejocote Crataegus spp. en el centro de México. Acta Zoológica Mexicana (n.s.), 27(2): 425-440

Capítulo IXX. Aspectos fitosanitarios en el cultivo del amaranto (Amaranthus spp.)

Noelting M C I, M C Sandoval (2005) Evaluación “in vitro” de cepas de Trichoderma spp. sobre Sclerotinia sclerotiorum, patógeno en cultivos de amaranto (Amaranthus spp.). Amarantos. Trabajos Científicos y Técnicos. Facultad de Agronomía, UNL. Pam.

Rojas-Martínez R I, Zavaleta-Mejía E, Lee I M, A Aragón-García-García (2009) Identificación de un aislamiento del grupo 16SRIII, Candidatus Phytoplasma pruni en plantas y semillas de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) en México. Agrociencia 43:851-860.

Noelting M C I, Sandoval M C, Gassó M M. A, M C Molina (2010) Review of Thecaphora amaranthicola M. Pieoenbr., Casual agent of smut on Amaranthus mantegazzianus Pass. In: Management of Fungal Plant Pathogens. CAB International eds. A. Arya and A.E. Perelló. pp:311-317.

Sánchez-Enciso M C, Espitia-Rangel E, S Osada-Kawasoe (1991) Etiología del Tizón (Alternaria tenuis) en amaranto (Amaranthus spp.). Memoria del Primer Congreso Internacional del Amaranto. Oaxtepec. México. pp:66.

Noelting M C, Sandoval M C, M C Molina (2009) Revisión de las principales patologías de origen fúngico que afectan el cultivo de amaranto en Argentina. Memoria Jornadas Amaranto. Noelting M C, Sandoval M C, N N Abbiati (2004) Determinación de microorganismos fúngicos en semillas de amaranto (Amaranthus spp.) mediante diferentes métodos de análisis. Rev. Perú. Biol. 11(2):168-178. Pedersen E J, H A, Stavelikova H, Steffensen S K, de Troiani R M, Taberner A (2010) Adding Value to Holy Grain: Providing the Key Tools for the Exploitation of Amaranth – the Proteinrich Grain of the Aztecs. Results from a Joint European - Latin American Research Project. Department of Integrated Pest Management, Aarhus University, Faculty of Agricultural Sciences, Denmark. 76 p. Pérez-Torres BC, A Aragón-García, N Bautista Martínez, A M Tapia Rojas, J F López–Olguín (2009) Entomofauna asociada al cultivo de jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) en el municipio de Chiautla de Tapia, Puebla. Acta zoológica mexicana 25(2) Xalapa. Pusz W (2009) Fungi from seeds of Amaranthus spp. Phytopathologia 54:15-21.

Santa Cruz U H, M N Marban (1986) Respuesta del cultivo de alegría Amaranthus hypochondriacus a niveles iniciales de infestación del nematodo Nacobbus aberrans. In: Primer Seminario Nacional del Amaranto. Chapingo, México. pp:193-203. Sifuentes J A, W R Young (1961) El gusano peludo Estigmene acraea (Drury): biología, hospederas, enemigos naturales y efectividad de algunos insecticidas para su combate en el Valle del Yaqui. INIA. 16 pág. Singh H (1961) Grain Amaranth, Buckwheat and Chenopods. Indian Council of Agricultural Research. Cereal Crops. Series No. 1. New Delhi. pp:104. Snodgrass G L, Abel C A (2004) Effect of host plant species on diapause in the tarnished plant bug. In: Dugger, P., Richter, D.A. (Eds.), Proceedings of Beltwide Cotton Conferences vol. 2, National Cotton Council, Memphis, Tennessee, pp. 1764–1770. Spencer K A (1981) A revisionary study of the leaf-mining flies (Agromyzidae) of Califonia. Division of Agricultural Science. University of California. Special Publication 3273. ISBN0.931876.53-2 Sutherland J R, Shrimpton G M, R N Sturrock (1989) Diseases and insects in British Columbia forest seedling nurseries. CanadaBritish Columbia Forest Resource Development Agreement Report. 065. 85 pp.

P. Rivas-Valencia et al.

289

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Tara J S, A Mohammad, A Shaloo, M Feroz, V V Ramamurthy (2009) Bionomics of Hypolixus truncatulus (F.) (Coleoptera: Curculionidae: Lixinae: Lixini), a major pest of Amaranthus caudatus L. Mun. Ent. Zool. Vol. 4, No. 2. Tara J S, S Sharma, R Kour (2010) A record of weevil (Coleoptera: Curculionoidea) Diversity from district samba (Jy K). The Bioscan 5(3): 391-394. Teri J M, D K Mlasani (1994) Choanephora blight and Alternaria leaf spot of Amaranth in Tanzania. Plant Pathology 43:228-229. Terrazas-Morales L A (1999) Tratamiento fitosanitario para semilla de amaranto. Tesis de Licenciatura. Departamento de Parasitología, Universidad Autónoma de Chapingo, Chapingo Edo. Mex. 60 p. Torres-Saldaña G, A Trinidad-Santos, T Reyna-Trujillo, H Castillo-Juárez, N BautistaMartínez, F de León-González (2004) Barrenación del tallo de amaranto por Hypolixus truncatulus (Coleoptera: Curculionidae) y Amauromyza abnormalis (Diptera: Agromyzidae) Acta Zoológica Mexicana (n.s.) 20(1): 131-140 Vejar-Cota N, Bautista-Martínez, J L Carrillo Sánchez (1994) Las plagas del amaranto (Amaranthus spp.) en la región Central de México. Avances de Investigación. Instituto de Fitosanidad. Colegio de Postgraduados. Montecillo, México. Pp. 46-47. Wilson R L (1984) Entomological research on amaranth at the North Central Plant Introduction Station, in Proc. 3dr Amaranth Conf., Kutztown, P.A, September. pp.192. Wilson R L (1990) Insect and disease pest amaranth. In: Proc. 4th Natl. Symp., Amaranth: Perspectives on Production, Processing and Marketing, Minneapolis, MN. pp:163.

290

P. Rivas-Valencia et al.

Wilson R L, D L (Olson (1990) Tarnished plant bug, Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) (Hemiptera:Miridae) oviposition site preference on three growth stages of a grain amaranth, Amaranthus cruentus L. J. Kansas Ent. Soc. 63(1): 88-91.

Proteínas y Propiedades Funcionales

Capítulo XX

Caracterización bioquímica y estructural de las proteínas de reserva de amaranto BIOCHEMICAL AND STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF AMARANTH SEED STORAGE PROTEINS

José Ángel Huerta Ocampo, Ana Paulina Barba de la Rosa IPICyT, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C., Camino a la Presa San José No. 2055, Lomas 4ª sección C.P. 78216, San Luis Potosí, S.L.P., México. Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El amaranto es reconocido como una planta con alto potencial agroalimentario debido a que sus hojas y sus semillas son de alto valor nutricional y ambas pueden emplearse para la alimentación humana y animal. Aunado a esto, la planta puede crecer en climas áridos bajo poco suministro de agua. En el siglo pasado el amaranto fue conocido por sus propiedades nutricionales, el grano contiene tres veces más lisina en que el trigo, el arroz y el maíz. La grasa de la semilla de amaranto está compuesta por escualeno y ácidos grasos insaturados como los ácidos linoleíco, oleico y palmítico, además de otros compuestos como tocotrienoles, fitoesteroles y esteroles que ayudan a disminuir el colesterol en la sangre. En este nuevo siglo el estudio de las proteínas de amaranto se ha enfocado en la caracterización de péptidos con importantes funciones biológicas encriptados en estas proteínas. Las estructuras tridimensionales de proteínas como el inhibidor de alfa amilasa y globulinas 11S han sido resueltas. Proteínas aisladas de las fracciones albúminas y globulinas se han empleado en la modificación genética de maíz, trigo y papa con el fin de mejorar su calidad nutricional. En este capítulo hacemos una revisión de la

caracterización bioquímica y estructural de las proteínas de reserva de la semilla de amaranto. Palabras clave: Albúminas, tridimensionales, Globulinas, Prolaminas. ABSTRACT

Estructuras Glutelinas

Amaranth is recognized as a crop with high agri-food potential because its leaves and seeds are highly nutritious and can be used both as food and feed resources. In addition, the plant can grow in arid climates under low water supply. The last century amaranth was known for its nutritional properties, the grain contains three times more lysine than wheat, rice and corn. Amaranth seed fat comprises squalene and unsaturated fatty acids such as linoleic, oleic and palmitic acids. It is also a source of compounds such as tocotrienols, fitosterols and sterols that help to lower blood cholesterol. In this new century, studies have focused on the characterization of bioactive peptides encrypted in amaranth seed storage proteins, such peptides have shown important biological functions to improve the health of consumers. Threedimensional structures of proteins such as alpha amylase inhibitor, lectin and 11S globulins 293-302

Amaranto: Ciencia y Tecnología

isolated from amaranth have been resolved. Due to the high quality of amaranth seed proteins, crops such as corn, wheat and potato have been genetically modified with amaranth albumins and globulins in order to improve their nutritional quality. In this chapter we review the biochemical and structural characterization of amaranth seed proteins. Key words: Albumins, Globulins, Glutelins, Prolamins, 3D structures. INTRODUCCIÓN Se conocen tres especies de amaranto que pueden producir semillas nutritivas: Amaranthus hypochondriacus L., Amaranthus cruentus L., y Amaranthus caudatus L. (Figura 1), los dos primeros tienen origen en México y América Central y el último tiene como centro de origen Perú y Ecuador. La composición proximal de las

a)

harinas de estas semillas muestra que el contenido de proteína varía entre 13 a 18%, la grasa de 6.3 a 8.1%, la fibra de 2.2 a 5.8% y el contenido de cenizas de 2.8 a 4.4%. La comparación de la composición proximal de amaranto con la de los principales cereales se muestra en el Cuadro 1. La composición de aminoácidos esenciales en semilla de amaranto (Cuadro 2) presenta un perfil sobresaliente debido a que el balance de aminoácidos es cercano al óptimo requerido en la dieta humana (FAO/WHO, 1973). CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE AMARANTO Las proteínas de las semillas pueden clasificarse de diferentes maneras. Con base en su localización, se agrupan en proteínas de endospermo, embrión y perispermo; con base en sus funciones biológicas se clasifican como proteínas con actividad enzimática, regulatorias,

c)

b)

Figura 1. Aspecto de la inflorescencia de A) Amaranthus hypochondriacus L., B) Amaranthus cruentus L., C) Amaranthus caudatus L. Cuadro 1. Composición proximal de amaranto y los principales cereales1.

Componente Amaranto 11.1 Humedad 17.9a Proteína Grasa 7.7 Fibra 2.2 Cenizas 4.1 Carbohidratos 57.0 1Porcentaje en base de peso seco; aNx5.85, bNx6.25,cNx5.7.

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Maíz 13.8 10.3b 4.5 2.3 1.4 67.7

Arroz Trigo 11.7 12.5 8.5b 14.0c 2.1 2.1 0.9 2.6 1.4 1.9 75.4 66.9

Capítulo XX. Caracterización bioquímica y estructural de las proteínas de reserva de amaranto

estructurales y ribosomales, y considerando su composición química se clasifican en simples (constituidas exclusivamente por una o varias cadenas de aminoácidos) y conjugadas (aquellas que contienen otros grupos químicos unidos a la o las cadenas de aminoácidos, por ejemplo: lipoproteínas, glicoproteínas, nucleoproteínas, metaloproteínas). Osborne (1924) clasificó a las proteínas de granos con base en su solubilidad en diferentes solventes. Las albúminas son proteínas solubles en agua, las globulinas solubles en soluciones salinas, las prolaminas solubles en soluciones alcohólicas y las glutelinas solubles en soluciones ácidas o básicas.

Las proteínas de amaranto se han caracterizado con base en la clasificación de Osborne, aún en la actualidad existe discrepancia sobre cuál es la fracción mayoritaria, esto principalmente debido a los diferentes métodos y solventes de extracción empleados por los diferentes autores. En general el contenido de albúminas varía del 19 al 45%, el de globulinas (11S y 7S), del 16 al 35%, el de prolaminas de 0.7 a 1.3%, y el de glutelinas de 22 a 41% (Barba de la Rosa et al., 1992a). En la Figura 2 se muestra el patrón electroforético de las principales fracciones de proteínas de reserva de amaranto. Interesantemente la fracción

Cuadro 2. Composición de amino ácidos esenciales (g/100 g de proteína).

Requerimiento estimado por Amaranthus Amino ácido FAO/WHO caudatus cruentus hypochondriacus Adultos niños Cisteína 3.0 2.3 2.9 Isoleucina 3.3 3.8 5.2 4.6 1.3 Leucina 5.4 6.1 5.3 9.3 1.9 Lisina 4.6 6.1 5.3 6.6 1.6 Metionia 1.4 2.9 1.7 Fenilalanina 4.1 3.7 3.8 Treonina 3.4 3.8 5.3 4.3 0.9 Triptofano 2.5 1.1 nd 1.7 0.5 Tirosina 3.5 2.8 3.2 Valina 3.7 4.4 4.1 5.5 1.3 Met+Cys1 4.1 4.7 4.6 4.2 1.7 Phe+Tyr2 7.7 6.2 7.1 7.2 1.9 1metionina+cisteína; 2fenilialanina+tirosina. nd=no determinado

Figura 2. Patrón electroforético en condiciones reductoras de las 4 fracciones de principales de proteínas de reserva en amaranto. Carril 1=marcador de peso molecular, carril 2=albúminas, carril 3=globulinas 7S, carril 4=globulinas 11S, carril 5=glutelinas. J. A. Huerta-Ocampo y A. P. Barba de la Rosa

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glutelinas presenta un patrón electroforético similar al de las globulinas y se ha demostrado que las subunidades de globulinas inmunoreaccionan con las de glutelinas (Vasco-Méndez y Paredes-López, 1994). La composición de las fracciones de proteínas de reserva le da otro interés especial al amaranto debido a que su contenido de prolaminas es muy bajo. Estas proteínas son consideradas como tóxicas para personas que sufren de enfermedad celiaca, por lo tanto se propone al amaranto como un grano libre de prolaminas (Ballabio et al., 2011; Calderón de la Barca et al., 2010; Shoenlechner et al., 2010). COMPOSICIÓN DE LA FRACCIÓN ALBÚMINAS Las albúminas eran consideradas como proteínas funcionales (housekeeping) hasta que Youle y Huang (1978) reportaron la presencia de albúminas en los cuerpos proteínicos. Konishi et al. (1991) aislaron dos tipos de fracciones de albúminas (alb-1 y alb-2) de A. caudatus L. y A. hypochondriacus L., con propiedades bioquímicas diferentes, sugiriendo que la alb-2 son proteínas de almacenamiento que podrían estar asociadas con cuerpos proteínicos, inaccesibles a la digestión enzimática. En amaranto las albúminas representan una fracción importante de las proteínas de reserva. De esta fracción se han aislado proteínas de alto valor nutricional como las proteínas ricas en metionina, una proteína de 35 kDa conocida como AmA1, así como péptidos con actividad antimicrobiana, inhibidores de proteasas, inhibidores de alfa amilasa y lectinas. Proteínas ricas en metionina En la fracción 2S de albúminas de amaranto se encuentra un grupo de proteínas de aproximadamente 18 kDa conocido como

proteínas ricas en metionina (2SMRPs). Se han aislado dos tipos, MRP-1 y MRP-12 con 18.6 y 16.6% de metionina, respectivamente y también altos contenidos de lisina, 6.4 y 6.1% (SeguraNieto et al., 1994). Un gen de albúmina de amaranto (A. hypochondriacus L.) que codifica para una proteína de 35 kDa con altas cantidades de amino ácidos esenciales, denominada como AmA1 (Figura 3) ha sido empleado para transformar el trigo panadero y la papa, incrementando significativamente el contenido de proteína y aminoácidos esenciales en estas cosechas. Estos resultados sugieren que la expresión de AmA1 es una estrategia potencial para mejorar el valor nutricional de diversos cultivos (Tamás et al., 2009; Chakraborty et al., 2010). Péptidos antimicrobianos Péptidos antimicrobianos han sido aislados de A. caudatus L. y A. retroflexus L. los cuales fueron denominados como Ac-AMP y Ar-AMP, respectivamente. Ambos péptidos presentan alta homología con la super familia de proteínas que enlazan-quitina caracterizadas por tener un dominio de enlace a quitina rico en cisteína/glicina (Broekaert et al., 1992, Lipkin et al., 2005). Los Ac-AMPs inhiben el crecimiento de hongos con mayor potencia que otros péptidos antifúngicos (Broekaert et al., 1992). Esta propiedad única como potentes inhibidores del crecimiento fúngico in vitro sugiere que estos péptidos pueden tener un papel importante en la defensa de las semillas contra la invasión fúngica y por lo tanto podrían emplearse como herramientas para la transformación de plantas contra el ataque de hongos en plantas (Lipkin et al., 2005).

Figura 3. Secuencia de aminos ácidos de la proteína AmA1. Los aminoácidos en negritas representan los aminoácidos esenciales (GenBank ID: AF491291.1).

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Inhibidores de proteasas Los inhibidores de proteasas son de particular interés en cereales, leguminosas y papa debido a sus posibles efectos negativos sobre la nutrición animal y humana, así como por su posible papel en la defensa contra ataques de insectos y microbios (Ryan, 1990). En amaranto, se han descrito al menos 13 inhibidores de tripsina altamente termoestables reteniendo el 20% de su actividad original después ser tratados durante 7 h a 100 °C (Koeppe et al., 1985). El inhibidor de tripsina de amaranto, con un peso molecular de 7.4 kDa y un pI cercano a 7.5 es un inhibidor del tipo serina-proteasas que reconoce quimotripsina y tripsina, además inhiben las proteasas tipo-tripsina extraídas de la larva del insecto Prostephanus truncatus (ValdesRodriguez et al., 1993). Un inhibidor tripsina/subtilisina (ATSI) con pI de aproximadamente 8.3 y peso molecular de 7.8 kDa fue aislado de A. caudatus L. La forma madura del (ATSI) muestra una identidad del 33 al 51% con los inhibidores de otras plantas. ATSI es un potente inhibidor de tripsina (Ki aprox 0.34 nM), también inactiva quimotripsina y varias proteínas microbianas alcalinas incluyendo la subtilisina NOVO. Este inhibidor contiene Trp en lugar del altamente conservado Arg en la posición 53 lo cual se asume es importante en la estabilización del loop del sitio activo durante la formación del complejo proteína-inhibidor (Hejgaard et al., 1994). Otro inhibidor aislado de amaranto denominado Aml, es una proteína de 8 kDa estable tanto a

pH neutro como alcalino y es relativamente termoestable. Aml es capaz de inhibir la tripsina y quimotripsina del sistema digestivo de insectos como Tribolium castaneum y Locusta migratoria, soportando la hipótesis de que los inhibidores de proteasas presentes en la semilla pueden ser parte de los mecanismos de defensa contra el ataque de insectos (Tamir et al., 1996). Inhibidores de alfa amilasa Un inhibidor de alfa amilasa (AAI) de 31 residuos de aminoácidos fue aislado de la semilla de amaranto (Chagolla-López et al., 1994). La estructura tridimensional del AAI adopta un doblamiento knottin de topología abcabc estabilizado por tres enlaces di-sulfuro. Esta estructura adopta una conformación más compacta cuando se une al sustrato (Figura 4). El doblamiento knottin se caracteriza por un incremento en el número de enlaces hidrógeno intermoleculares, una disminución de volumen y la isomerización de trans a cis en el residuo prolina 20 (Carugo et al., 2001). El ADNc que codifica para un inhibidor de cisteína-proteasas (AhCPI) fue aislado de semilla inmadura de A. hypochondriacus L. Este inhibidor codifica para un polipéptido de 247 aminoácidos incluyendo un péptido señal al extremo N-terminal. Los estudios indican que AhCPI actúa como un regulador de la germinación de semillas y es un agente protector contra diversos tipos de estreses abióticos. AhCPI contiene los motivos LARFAV conservados en las fitocistatinas (proteínas de plantas que inhiben

Figura 4. Estructura tridimensional del inhibidor de alfa amilasa presente en la semilla de amaranto. Las flechas indican las estructuras de lámina beta y las barras en amarillo muestran los tres enlaces di-sulfuro (Tomada de la base de datos PDB ID: 1HTX). J. A. Huerta-Ocampo y A. P. Barba de la Rosa

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cisteína-proteasas), así como el sitio reactivo QVVAG (Valdés-Rodríguez et al., 2007). Esta proteína es capaz de inhibir el crecimiento de Fusarium oxysporum, Sclerotium cepivorum y Rhyzoctonia solani (Valdes-Rodriguez et al., 2010). Lectinas Las lectinas son glicoproteínas sin actividad catalítica que se unen con alta afinidad a carbohidratos. Se emplean en inmunología, biología celular y en investigación en cáncer debido a sus efectos biológicos tales como inmunosupresión, mitogenicidad y citotoxicidad. Una lectina de 45 kDa y denominada como ACL fue aislada de A. hypochondriacus L. ACL es un dímero con un peso molecular estimado de 66 kDa constituido por dos subunidades de 35 kDa y contiene 2.2% de carbohidratos neutros. La lectina de A. caudatus (ACA) es un homodímero formado por dos subunidades con un peso molecular de 33 a 36 kDa. A diferencia de muchas lectinas, ACA no es glicosilada y no requiere de cationes metálicos para enlazar azúcares (Figura 5). La función biológica de esta lectina no ha sido caracterizada pero se ha mostrado que tiene alta especificidad por glicoproteínas del antígeno de Thomsen-Fredenreich o antígeno-T. El antígeno-T se expresa en más del 85% de los carcinomas humanos tales como colon, mama y próstata, por lo que ACA tiene un promisorio uso como reactivo para la detección histoquímica temprana de carcinoma (Transue et al., 1997).

COMPOSICIÓN DE LA FRACCIÓN GLOBULINAS Debido a la gran funcionalidad de la fracción globulinas y a que se encuentra en un porcentaje importante en la semilla de amaranto, existe un interés especial por caracterizarlas. Las globulinas son la fracción principal en leguminosas y existen dos clases principales, globulinas 7S y 11S referidas de acuerdo con su coeficiente de sedimentación. Las globulinas 7S son glicoproteínas de 170-141 kDa, compuestas de seis diferentes combinaciones de tres subunidades, α (57 kDa), α´(58 kDa) y β (42 kDa) asociadas vía interacciones hidrofóbicas (Utsumi y Kinsella, 1985). La proteína 7S más representativa es la faseolina de frijol. Las globulinas 11S consisten de dos anillos hexagonales asociados hidrofóbicamente conteniendo tres pares de subunidades ácidas (35-37 kDa) y básicas (18-20 kDa) unidas por puentes di-sulfuro. La globulina 11S modelo es la glicinina de soya (Peng et al., 1984). Konishi et al. (1985) caracterizaron una globulina de amaranto con peso de 440 kDa con un coeficiente de sedimentación de 12.7S. Esta proteína está formada por las subunidades ácidas y básicas de 36 y 32 kDa, y de 20 y 18 kDa, respectivamente. Barba de la Rosa et al. (1992b) reportaron por primera vez la presencia de los dos tipos de globulinas (7S y 11S) en amaranto. Las globulinas 11S de amaranto mostraron el fenómeno de asociación-disociación presente en las proteínas de soya. Barba de la Rosa et al. (1996) aislaron y caracterizaron el gen de una globulina 11S de amaranto, la cual contiene altos contenidos de metionina (Figura 6).

Figura 5. Estructura tridimensional de ACA, lectina purificada de semilla de A. caudatus. ACA es un dímero con sitios de enlace para el disacárido Gal-β1,3-GalNAc-α-O-benzilo (círculos rojos y negros) del antígeno-T. El dímero esta está compuesto de dos subunidades relacionadas por una díada no-cristalográfica. Cada dominio contiene dos dominios trébol-β. En amarillo se representan las estructuras lámina-β (tomada de la base de datos PDB ID: 1JLX).

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La estructura cristalográfica de la globulina 11S (Figura 7) ha sido resuelta por Tandang-Silvas et al. (2012). La estructura muestra los dominios α-hélice y láminas-β a ambos extremos N-terminal y C-terminal característicos de las globulinas 7S y 11S. Konishi y Yoshimoto, (1989) reportaron que la estabilidad y actividad de la emulsión de globulinas de amaranto son alrededor del doble que las reportadas para la proteína de soya y menores que las de la caseína. También demostraron que la globulina de amaranto es relativamente estable al calor. Estos estudios fueron validados por el análisis estructural, confirmando que la alta estabilidad térmica y las buenas propiedades emulsificantes de la globulina de amaranto se deben al balance entre la hidrofobicidad e hidrofilicidad de su superficie (Tandang-Silvas et al., 2012). El gen de la globulina 11S de amaranto ha sido empleado para llevar a cabo la transformación genética del maíz con el fin de mejorar su contenido de aminoácidos esenciales (Rascón-Cruz, et al., 2004).

FRACCIÓN GLUTELINAS Las glutelinas de amaranto tienen un perfil electroforético similar al de las globulinas 11S, mostrando tres bandas principales de 50, 30 y 20 kDa, por lo que se ha sugerido que esta fracción pudieran ser las globulinas 11S en una forma más agregada. También se ha descrito que dependiendo de la solución de extracción se puede aislar otra fracción denominada como globulina-P que presenta una solubilidad y un grado de asociación intermedio entre las globulinas y las glutelinas (Castellani et al., 1988; Abugoch et al., 2003). La atención prestada a la fracción glutelinas se debe a que es una fracción mayoritaria de proteínas de reserva en amaranto y que en esta fracción se detectó por primera vez la presencia del péptido tipo-lunasin. Los péptidos generados por la hidrólisis enzimática de la fracción glutelinas (Figura 8) fueron analizados por LC/MS-MS reportando la presencia de péptidos con diversas funciones biológicas entre los que destacan los péptidos antihipertensivos, antidiabéticos, opioides entre otros (Silva-Sánchez et al., 2008).

Figura 6. Secuencia de aminoácidos de la globulina 11S de amaranto (tomada de base de datos GenBank ID: CAA57633.1).

Figura 7. Estructura tridimensional de la globulina 11S de amaranto (tomada de base de datos PDB ID: 3QAC).

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CONCLUSIONES Existen aún discrepancias en el porcentaje de las fracciones de proteínas de reserva de amaranto y estudios sobre la estandarización de la metodología de extracción de estas proteínas es necesario. Son necesarios más estudios sobre la caracterización funcional y estructural de las proteínas de amaranto, en especial de la fracción glutelinas.

Ballabio C, F Uberti, C Di Lorenzo, A Brandolini, E Penas, P Restani (2011) Biochemical and immunochemical characterization of different varieties of Amaranth (Amaranthus L. ssp.) as a safe ingredient for gluten-free products. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59:12969-12974.

Figura 8. Perfil de digestión con tripsina de las glutelinas de amaranto. Carril 1=marcador de peso molecular, carril 2=glutelinas nativas, carriles 3 a 7=glutelinas digeridas con tripsina durante 0.25, 0.5, 1, 12 y 24 h, respectivamente.

Las estructuras de algunas proteínas aisladas de semilla de amaranto muestran características estructurales interesantes, entre más proteínas de amaranto sean estudiadas más podremos entender a esta planta que presenta alto potencial biotecnológico y se ha declarado como alimento nutritivo y funcional que más que nutrir aporta grandes beneficios para la salud del consumidor. AGRADECIMIENTOS Agradecemos el apoyo otorgado por la Fundación Produce San Luis Potosí (Proyecto Validación y Transferencia del Cultivo de Amaranto en San Luis Potosí). LIRETATURA CITADA Abugoch L E, E N Martínez, M C Añón (2003) Influence of the extracting solvent upon the structural properties of amaranth (Amaranthus hypochondriacus) glutelin. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51:4060-4065. 300

J. A. Huerta-Ocampo y A. P. Barba de la Rosa

Barba de la Rosa A P, J Gueguen, O ParedesLópez, G Viroben (1992) Fractionation procedures, electrophoretic characterization, and amino acid composition of amaranth seed proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40:931-936. Barba de la Rosa A P, O Paredes-López, J Gueguen (1992) Characterization of amaranth globulins by ultracentrifugation and chromatographic techniques. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40:937-940. Barba de la Rosa A P. A Herrera-Estrella, S Utsumi, O Paredes-López (1996) Molecular characterization, cloning and structural analysis of a cDNA encoding an amaranth globulin. Journal of Plant Physiology 149:527-532. Broekaert W F, W Mariën, F R G Terras, M F C De Bolle, P Proost, J Van Damme, L Dillen, M Claeys, S B Rees (1992) Antimicrobial peptides form Amarnathus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins. Biochemistry 31:4308-4314.

Capítulo XX. Caracterización bioquímica y estructural de las proteínas de reserva de amaranto

Calderón de la Barca A M, M E RojasMartínez, A R Islas-Rubio, F Cabrera-Chávez (2010) Gluten-free breads and cookies of raw and popped amaranth flours with attractive technological and nutritional qualities. Plant Foods for Human Nutrition 65:241-246. Carugo O, S Lu, J Luo, X Gu, S Liang, S Strobl, S Pongor (2001) Structural analysis of free and enzyme-bound amaranth alpha-amylase inhibitor: classification within the knottin fold superfamily and analysis of its functional flexibility. Protein Engineering 14:639-646. Castellani O F, E N Martínez, M C Añón (1998) Structural modifications of an Amaranth globulin Induced by pH and NaCl. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46:48464853. Chagolla-Lopez A, A Blanco-Labra, A Patthy, R Sanchez, S Pongor (1994) A novel alphaamylase inhibitor from amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seeds. The Journal of Biological Chemistry 269:23675-23680. Chakraborty S, N Chakraborty, L Agrawal, S Ghosh, K Narula, S Shekhar, P S Naik, P C Pande, S K Chakrborti, A Datta (2010) Nextgeneration protein-rich potato expressing the seed protein gene AmA1 is a result of proteome rebalancing in transgenic tuber. Proceedings of the National Academy of Sciences 107:1753317538. FAO/WHO (1973) Energy and protein requirements. En: FAO Nutrition Meeting Report Series, 52, Food and Agriculture Organization/World Health Organization, Geneva. 118 p. Hejgaard J, J Dam, L C Petersen , S E Bjørn (1994) Primary structure and specificity of the major serine proteinase inhibitor of amaranth (Amaranthus caudatus L.) seeds. Biochimica et Biophysica Acta 1204:68-74.

Koeppe S J, J H Rupnow, C E Walker, A Davis (1985) Isolation and heat stability of trypsin inhibitors in amaranth (Amaranthus hypochondriacus). Journal of Food Science 50:1519-1521. Konishi Y, N Yoshimito (1989) Amaranth globuiln as a heat-stable emulsifying agent. Agricultural and Biological Chemistry 53:33273328. Konishi Y, O Y Horikawa, J Azumaya, N Nakatani (1991) Extraction of two albumin fractions from amaranth grains: comparison of some physicochemical properties and the putative localization in the grain. Agricultural and Biological Chemistry 55:1745-1750. Konishi Y, Y Fumita, Ikedo K, Okuno K, Fuwa H (1985) Isolation and characterization of globulin from seeds of Amaranthus hypochondriacus L. Agricultural and Biological Chemistry 49:1453-1459. Lipkin A, Anisimova V, Nikonorova A, Babakov A, Krause E, Bienert M, Grishin E, Egorov T (2005) An antimicrobial peptide ArAMP from amaranth (Amaranthus retroflexus L.) seeds. Phytochemistry 66:2426-2431. Osborne T P (1924) The vegetable proteins. En: Monographs on Biochemistry 2nd edition. Longmans green and Co., London. pp: xiii+154. Peng I C, D W Quass, W R Dayton, C E Allen (1984) The physicochemical and functional properties of soybean 11S globulin–a review. Cereal Chemistry 61:480-490. Rascón-Cruz Q, S Sinagawa-García, J A Osuna-Castro, N Bohorova, O ParedesLópez (2004) Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize. Theoretical and Applied Genetics 108:335-342. Ryan C A (1990) Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insects and pathogens. Annual Review of Phytopathology 28: 425-449.

J. A. Huerta-Ocampo y A. P. Barba de la Rosa

301

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Segura-Nieto M, A P Barba de la Rosa, O Paredes-López (1994) Biochemistry of amratnh proteins. En: Amaranth Biology Chemistry and technology. O Paredes-López (ed). CRC Press, Boca Raton, FL. pp:75-106.

Utsumi S, J E Kinsella (1985) Structurefunction relationships in food proteins: subunit interactions in heat-induced gelation of 7S, 11S, and soy isolate proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 33:297-303.

Shoenlechner R, J Drausinger, V Ottenschlaeger, K Jurockova, E Berghofer (2010) Functional properties of gluten-free pasta produced from amaranth, quinoa and buckwheat. Plant Foods for Human Nutrition 65:339-349.

Valdés-Rodríguez S, A Cedro-Tanda, V Aguilar-Hernandez, E Cortes-Onofre, A Blanco-Labra, A Guerrero-Rangel (2010) Recombinant amaranth cystatin (AhCPI) inhibits the growth of phytopathogenic fungi. Plant Physiology and Biochemistry 48:469-475.

Silva-Sánchez C, A P Barba de la Rosa, M F León-Galván, B O de Lumen, A De LeónRodríguez, E González de Mejía (2008) Bioactive peptides in amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seed. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56:1233-1240.

Valdés-Rodríguez S, A Guerrero Rangel, C Melgoza-Millagómez, A Chagolla-López, F Delgado-Vargas, N Martínez-Gallardo, C Sánchez-Hernández, J Délano-Frier (2007) Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress. Plant Physiology and Biochemistry 45:790-798.

Tamás C, B N Kisgyörgy, M Rakszegi, M D Wilkinson, M S Yang, L Láng, L Tamás, Z Bedö (2009) Transgenic approach to improve wheat (Triticum aestivum L.) nutritional quality. Plant Cell Reports 28:1085-1094. Tamir S, J Bell, T H Finlay, E Sakal, P Smirnoff, S Gaur, Y Birk (1996) Isolation, characterization, and properties of a trypsinchymotrypsin inhibitor from amaranth seeds. Journal of Protein Chemistry 15:219-229. Tandang-Silvas M R, C S Cabanos, L D Carrazco Peña, A P Barba De La Rosa, J A Osuna-Castro, S Utsumi, B Mikami, N Maruyama (2012) Crystal structure of a major seed storage protein, 11S proglobulin, from Amaranthus hypochondriacus: insight into its physico-chemical properties. Food Chemistry 135:819-826. Transue T R, A K Smith, M Hanqing, I J Goldstein, M A Saper (1997) Structure of benzyl T-antigen disaccharide bound to Amaranthus caudatus agglutinin. Nature Structural and Molecular Biology 4:779-783.

302

J. A. Huerta-Ocampo y A. P. Barba de la Rosa

Valdés-Rodríguez S, M Segura-Nieto, A Chagolla-López, A Verver y Vargas-Cortina, N Martínez-Gallardo, A Blanco-Labra (1993) Purification, characterization, and complete amino acid sequence of a trypsin inhibitor from amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seeds. Plant Physiology 103:1407-1412. Vasco-Méndez N L, O Paredes-López (1994) Antigenic homology between amaranth glutelins and other storage proteins. Journal of Food Biochemistry 18:227-238. Youle R J, A H C Huang (1978) Albumin storage proteins in the protein bodies of castor bean. Plant Physiology 61:13-16.

Capítulo XXI

Amaranto: propiedades benéficas para la salud AMARANTH: BENEFICIAL PROPERTIES FOR HEALTH

José Ángel Huerta-Ocampo, Enrique MaldonadoCervantes y Ana Paulina Barba de la Rosa IPICyT, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A. C., Camino a la Presa San José No. 2055, Lomas 4ª sección C.P. 78216, San Luis Potosí, San Luis Potosí, México. E-mail: [email protected]

RESUMEN Las semillas de las especies de amaranto (Amaranthus spp.) además de su alto valor nutricional poseen propiedades que contribuyen a mejorar la salud humana. La digestión de las proteínas de reserva de la semilla de amaranto libera péptidos con diferentes funciones biológicas, dentro de las cuales los péptidos con capacidad de inhibir diferentes tipos de enzimas son los más abundantes. Entre los péptidos bioactivos más representativos se encuentran inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina (ECA) y de la enzima Dipeptidil Peptidasa IV (DPPIV). La ECA es responsable, en cierta medida, de aumentar la presión arterial. Un posible mecanismo de acción de estos péptidos inhibidores de la ECA involucra la producción del óxido nítrico a través de la inducción de la enzima endógena Óxido Nítrico Sintetasa (eNOS). La DPPIV es responsable de la degradación de hormonas insulinotrópicas relacionadas con estimular la síntesis y promover la secreción de insulina por las células beta del páncreas, disminuyendo así los niveles de glucosa en sangre. El uso de inhibidores de la DPPIV incrementa el tiempo de acción de estas hormonas y potencia sus efectos. También

se ha confirmado la presencia en amaranto de un péptido similar al péptido lunasin de soya y que posee propiedades cáncer-preventivas. Además de su alto contenido de proteínas ricas en aminoácidos esenciales y la presencia de péptidos bioactivos, la semilla de amaranto es una fuente de compuestos con actividad antioxidante tales como la rutina. Extractos alcohólicos y acuosos de amaranto contienen compuestos fitoquímicos con propiedades antioxidantes, hipocolesterolemiantes, antidiabéticas, anti-helmínticas y anti-diarreicas. El objetivo de este capítulo es ofrecer una visión general de los péptidos bioactivos presentes en las proteínas de la semilla de amaranto, así como de los compuestos fitoquímicos benéficos para la salud que se han reportado están presentes en la semilla y la planta de amaranto. Palabras clave: Amaranthus, Fitoquímicos, Lunasin, Péptidos bioactivos. ABSTRACT In addition to its high nutritional value, the seeds of the amaranth species (Amaranthus spp.) have properties that help to improve human health. Digestion of amaranth seed 303-312

Amaranto: Ciencia y Tecnología

storage proteins release peptides with different biological functions, among them, the peptides capable of inhibiting different types of enzymes are the most abundant. The most representative bioactive peptides are inhibitors of the enzyme Angiotensin Converting Enzyme (ACE) and Dipeptidyl Peptidase IV (DPPIV). To some extent ACE is responsible to increase blood pressure. One possible mechanism of action of amaranth ACE-inhibitory peptides involves the production of nitric oxide through the induction of the endogenous enzyme Nitric Oxide Synthase (eNOS). DPPIV is responsible for the degradation of insulinotropic hormones responsible for the stimulation of the synthesis and promotion of insulin secretion by pancreatic beta cells, lowering blood glucose levels. The use of DPPIV inhibitors increases the life span of these hormones and enhances their effects. Amaranth has also a lunasin-like peptide, which possess anti-tumor properties. In addition to the presence of bioactive peptides, high protein content and essential amino acids, amaranth seed is also a source of potent compounds with antioxidant activity such as rutin. Aqueous and alcoholic extracts of the plant contain phytochemicals with antioxidant, hypocholesterolemic, anti-diabetic, antihelminthic and anti-diarrheal properties. The aim of this chapter is to provide an overview of the bioactive peptides present in the seed proteins of amaranth, as well as beneficial health effects attributed to the phytochemicals present in both the seed and the amaranth plant. Key words: Amaranthus, Bioactive peptides, Lunasin, Phytochemicals. INTRODUCCIÓN El género Amaranthus agrupa a más de 50 especies e incluye plantas con potencial como cultivo alternativo debido a su resistencia a plagas y a condiciones de estrés abiótico como la sequía y el estrés salino (Huerta-Ocampo et al., 2009; Huerta Ocampo et al., 2011; Omami et al., 2006; Aguilar-Hernández et al., 2011). Las tres especies comerciales de amaranto de grano, Amaranthus hypochondriacus, A. cruentus, y A. caudatus son nativas de América. Las dos primeras están ampliamente distribuidas en 304

J. A. Huerta-Ocampo et al.

México, lo que convierte a nuestro país en el centro más importante de diversidad para el amaranto de grano (Espitia-Rangel et al., 2010). Otras especies del género como A. hybridus crecen como maleza y están distribuidas por todo el mundo. Algunos autores reconocen a A. mantegazzianus Pass o A. edulis Speg como una cuarta especie cultivable, pero los estudios genéticos no parecen justificar el reconocimiento de este grupo (Espitia-Rangel, 1994). El amaranto es una excelente fuente de alimento debido al alto valor nutricional de sus hojas y semillas. Las semillas de amaranto contienen un alto contenido de proteínas y estas poseen un mejor balance de aminoácidos esenciales que la mayoría de los cereales y leguminosas (Barba de la Rosa et al., 1992, Schnetzler y Breene, 1994). El amaranto ha ganado importancia en Estados Unidos y es un producto emergente en Europa, especialmente como un sustituto del trigo para la elaboración de alimentos para pacientes con enfermedad celiaca. Por su efecto hipocolesterolémico se ha sugerido que el amaranto podría ser un buen sustituto alimenticio en pacientes con hipercolesterolemia alérgicos a cereales (Sangameswaran y Jayakar, 2008). El gránulo de almidón del amaranto (Figura 1) es uno de los más pequeños de la naturaleza (0.8 - 2.5 μm), y presenta características especiales como una mayor capacidad de hincharse, baja solubilidad, gran capacidad de unión al agua y baja susceptibilidad a la digestión con la enzima α-amilasa (Sugimoto et al., 1981; Wilhelm et al., 2002). El aceite de amaranto tiene un alto valor debido a su gran cantidad de escualeno (Johnson y Henderson, 2002). El amaranto se ha incorporado en varios alimentos industrializados tales como, productos de repostería (panes, pasteles y galletas), productos de extrusión (hojuelas de cereal, tortillas y pastas) (Schnetzler y Breene, 1994; Tapia-Blácido et al., 2009), hidrolizados de su almidón permiten obtener una fracción rica en carbohidratos y una harina con un alto contenido de proteínas (Paredes-López et al., 1990). Debido a su alta calidad nutritiva, las globulinas 11S y la albúmina de 35 kDa (AmA1) se han empleado para la transformación genética de maíz, trigo y papa con la finalidad

Capítulo XXI. Amaranto: propiedades benéficas para la salud

Figura 1. Gránulos de almidón de amaranto A) a 2 mm y B) a 500 nm de amplificación.

de incrementar su contenido de aminoácidos esenciales (Chakraborty et al., 2000; Chakraborty et al., 2010; Rascón-Cruz et al., 2004; Tamás et al., 2009). La adición de albúminas de amaranto para complementar la harina de trigo no solo mejora la calidad del volumen de la miga y el pan sino que también mejora el balance de aminoácidos esenciales (Silva-Sánchez et al., 2004). En este nuevo milenio, una nueva era de descubrimientos en amaranto ha comenzado. Mediante un análisis in silico se predijo la presencia de péptidos bioactivos contenidos en las proteínas de amaranto (Silva-Sánchez et al., 2008), esto ha despertado mucho interés por determinar si los digeridos de proteína de amaranto producen estos efectos predichos, así como por dilucidar los mecanismos mediante los cuales dichos péptidos ejercen sus efectos benéficos a la salud.

LAS SEMILLAS DE AMARANTO COMO FUENTE DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS Los péptidos liberados por la hidrólisis enzimática de las proteínas presentes en los alimentos que consumimos han recibido mucha atención de parte de los profesionales de la ciencia de los alimentos. Estos péptidos son inactivos cuando se encuentran formando parte de las proteínas que consumimos, pero al ser liberados durante la digestión o el procesamiento de los alimentos son absorbidos por el sistema digestivo (Pihlanto-Leppälä et al., 2000). El análisis in silico de la digestión enzimática de las proteínas de reserva de la semilla de amaranto (Figura 2), predijo que el amaranto podría ser una fuente de péptidos con actividades anti-hipertensivas, anti-trombóticas, anti-oxidantes, entre otras (Silva-Sánchez et al., 2008). Este primer reporte detonó el interés por evaluar y caracterizar los péptidos bioactivos presentes en las proteínas de la semilla de amaranto.

17%

39%

2%

Inhibidores de enzimas Anti-hipertensivos Anti-trombóticos Anti-amnésicos Ópioides Inmunomoduladores Antioxidantes Otros

2% 3%

4%

5%

28%

Figura 2. Actividad de los péptidos predichos tras la digestión in silico de las secuencias de proteínas de amaranto disponibles en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez. J. A. Huerta-Ocampo et al.

305

Amaranto: Ciencia y Tecnología

PÉPTIDOS INHIBIDORES DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA La Enzima Convertidora de Angiotensina (ECA) es una hidrolasa de péptidos que tiene un importante papel en la función cardiovascular y en la regulación de la presión arterial a través de dos mecanismos diferentes. La ECA cataliza la conversión del péptido inactivo angiotensina-I al péptido angiotensina-II, el cual es un potente vasoconstrictor, así que la inhibición de la ECA resulta en una disminución de la presión arterial (Koike et al., 1980; Fleming, 2006). Adicionalmente, la ECA inactiva al vasodilatador bradicinina que regula algunos procesos biológicos, incluyendo la liberación de óxido nítrico (NO) en el endotelio vascular. El NO ejerce sus efectos sobre el musculo liso vascular y promueve su relajación (Ju et al., 1998). Entre los péptidos predichos mediante la digestión in silico de las proteínas de reserva de la semilla de amaranto, los péptidos inhibidores de la ECA se encontraron entre los más abundantes. La digestión con tripsina de la fracción de glutelinas de amaranto y su análisis mediante espectrometría de masas (LC-MS/MS) reveló la presencia de di-, tri- y tetra-péptidos inhibidores de la ECA. Entre los péptidos liberados tras la digestión de la fracción de glutelinas de amaranto se encontraron algunos de los péptidos inhibidores de la ECA más potentes reportados hasta ahora, entre ellos el tri-péptido IKP, así como el di-péptido YP y los tri-péptidos LPP, LRP y VPP (Silva-Sánchez et al., 2008). La actividad de estos péptidos ha sido demostrada en ratas y humanos mostrando una reducción en la presión arterial (Motoi y Kodama, 2003; Nurminen et al., 2001; Seppo et al., 2003; Mallikarjun-Gouda et al., 2006). La capacidad de inhibir a la ECA se probó en la fracción de glutelinas de amaranto digeridas con tripsina. La mezcla de péptidos obtenida tras la digestión mostró una IC50 (la mitad de la máxima concentración inhibitoria) de 25 µg/ml, siendo menos potente en comparación con el Captropil, medicamento utilizado para el tratamiento de la hipertensión, el cual tiene una IC50 de 5.4 ng/ml (Barba de la Rosa et al., 2010). Sin embargo, es reconocido que los compuestos activos provenientes de los alimentos pueden tener baja potencia, pero 306

J. A. Huerta-Ocampo et al.

al ser ingeridos regularmente en la dieta, se ha demostrado que tienen efectos fisiológicos sin los efectos secundarios producidos por los fármacos empleadas como medicamentos (FitzGerald y Meisel, 2000). La capacidad de inhibir a la ECA también ha sido probada en digeridos de albúminas y globulinas de amaranto (TovarPérez et al., 2009). El efecto de la hidrólisis gástrica y la resistencia al tratamiento térmico fueron evaluadas por Tiengo et al. (2009) en muestras digeridas con alcalasa. Los hidrolizados con alcalasa producidos antes y después de la digestión con jugo gastrointestinal artificial mostraron el doble de actividad inhibitoria de la ECA que los no tratados con alcalasa, mientras que el tratamiento térmico no modificó la actividad inhibitoria de le ECA de los digeridos. La purificación de los péptidos inhibidores de la ECA incrementó su potencia (Vecchi y Añón, 2009). Mientras que la purificación de los péptidos inhibidores de la ECA incrementa su potencia, los hidrolizados crudos de proteínas de amaranto podrían ser una fuente económica de péptidos antihipertensivos. PÉPTIDOS INHIBIDORES DE LA ENZIMA DIPEPTIDIL PEPTIDASA IV La Dipeptidil Peptidasa IV (DPPIV) es responsable de la degradación de hormonas insulinotrópicas relacionadas con estimular la síntesis y promover la secreción de insulina por las células beta del páncreas, disminuyendo los niveles de glucosa en sangre. El uso de inhibidores de la DPPIV incrementa el tiempo de acción de estas hormonas y potencia sus efectos. Existen varios tipos de inhibidores de la DPPIV que han mostrado resultados prometedores como agentes anti-diabéticos, sin embargo la búsqueda de productos naturales con una actividad similar es una vía alternativa para el tratamiento de enfermedades como la diabetes y abre un nuevo campo de investigación (Velarde-Salcedo et al., 2012). Al probar diferentes fracciones de las proteínas de reserva de amaranto (Albúminas, Globulinas/S, Globulinas 11S y glutelinas) digeridas con tripsina Velarde-Salcedo et al. (2013) encontraron que todas son capaces de inhibir la actividad de la DPPIV y que esta inhibición es dosis-dependiente. Al probar

Capítulo XXI. Amaranto: propiedades benéficas para la salud

con un modelo de digestión gastrointestinal para determinar si el consumo de amaranto de manera natural es capaz de liberar estos péptidos inhibidores de la DPPIV encontraron resultados similares. Al comparar la actividad inhibidora de DPPIV en harinas y grano reventado de dos especies de amaranto, no se encontraron diferencias entre las especies evaluadas, sin embargo la actividad inhibitoria del grano reventado disminuyó considerablemente en comparación con las harinas (Velarde-Salcedo et al., 2012). PROPIEDADES ANTI-TUMORALES Al amaranto también se le han atribuido propiedades inhibitorias de la proliferación celular cancerosa. Las hojas de Amaranthus tricolor contienen compuestos capaces de inhibir la proliferación celular cancerosa (Jayaprakasam et al., 2004). En todas las fracciones de las proteínas de reserva de la semilla de A. hypochondriacus L. se detectó la presencia de una proteína de aproximadamente 20 kDa que es reconocida por un anticuerpo anti-lunasin de soya (Silva-Sánchez et al., 2008). Este péptido se purificó y su secuencia fue similar al péptido lunasin de soya. El lunasin es un péptido de 43 aminoácidos, cuyas propiedades cáncerpreventivas han sido demostradas en cultivos de células de mamífero y en modelos animales como el ratón. El lunasin es eficiente en la protección de células contra químicos carcinogénicos, oncogenes (genes descontrolados que inducen cáncer), e inactivadores de las proteínas supresoras de tumores (De Lumen, 2005). La presencia del lunasin ha sido reportada en

otros granos como la cebada y el trigo (Jeong et al., 2002; Jeong et al., 2007a). En el caso del amaranto, la fracción proteínica de las glutelinas muestra tener una alta concentración de lunasin (de 1.39 a 1.98 µg de lunasin por gramo de proteína extraída). En semillas no maduras y en semillas reventadas de amaranto también fue posible detectar la presencia del lunasin. Esto sugiere que la proteína tipo lunasin del amaranto se produce en las etapas tempranas de la maduración del grano y no es afectada por los tratamientos térmicos necesarios para reventar el grano. En ensayos con cultivos y líneas celulares, la adición de glutelinas digeridas de amaranto a concentraciones de 1 y 5 μg/ ml indujo un 30 y 40% de muerte celular por apoptosis en una línea celular de cáncer cervicouterino (HeLa), mientras que a las mismas concentraciones solamente 3 y 4% de apoptosis en células normales (fibroblastos) fue reportado. Estos resultados preliminares mostraron que los hidrolizados de amaranto tienen una actividad anti-proliferativa (Figura 3) y son selectivos para células neoplásicas (Silva-Sánchez et al., 2008). En ensayos in vitro, la proteína tipo lunasin de amaranto, mostró la habilidad de internalizarse en células de mamífero y dirigirse al núcleo 12 horas después de ser administrado (Maldonado-Cervantes et al., 2010). Este tiempo de internalización al núcleo es menor al reportado con los péptidos lunasin de soya y cebada (Jeong et al. 2002; Jeong et al., 2007b). La proteína tipo lunasin de amaranto también mostró un efecto inhibitorio dosis-dependiente sobre la acetilación de las histonas en células HeLa. La

45

Célula apoptóticas (%)

40 35 30 25 20 15 10 5 0

ControlC

ontrol

Células HeLa

Fibroblastos

Figura 3. Efecto anti-proliferativo de digeridos de glutelinas de amaranto sobre células de mamífero. Células HeLa, línea celular de cáncer cérvicouterino y fibroblastos, células de mamífero control. J. A. Huerta-Ocampo et al.

307

Amaranto: Ciencia y Tecnología

inhibición de la acetilación de las histonas se propone como un mecanismo epigenético para las propiedades anti-carcinogénicas del lunasin de amaranto, esto es similar a lo reportado para el lunasin de soya, cebada y tabaco cimarrón (Jeong et al., 2007b). Barrio y Añón (2010) investigaron las características anti-tumorales de los aislados proteínicos de A. mantegazzianus digeridos con alcalasa. Estos autores demostraron un efecto anti-proliferativo dosis y tipo celular dependiente sobre la proliferación de líneas celulares tumorales. También demostraron que la acción inhibitoria se debe a los aislados proteínicos y no es afectada por componentes de bajo peso molecular. Para evaluar la recuperación de las líneas celulares tumorales después de la acción del aislado proteínico, células UMR106 se expusieron por 24 horas a diferentes dosis de aislados proteínicos y después se realizaron lavados con el fin de dejarlas recuperarse. Las células expuestas a 0.1 mg/ml de los aislados proteínicos dejaron de proliferar, pero no perdieron su viabilidad, mientras que concentraciones mayores a 0.3 mg/ml ocasionaron la perdida irreversible de la viabilidad celular. El mecanismo de acción de la actividad anti-tumoral de los aislados proteínicos del grano del amaranto propuesto por Barrio y Añón (2010) involucra la inhibición de la adhesión y proliferación celular junto con la producción de daño celular resultando en una pérdida permanente de la viabilidad celular. PROPIEDADES ANTI-DIABÉTICAS E HIPOCOLESTEROLEMIANTES Ratas diabéticas fueron alimentadas con suplementos de 250 y 500 mg/kg de extractos metanólicos de A. spinosus. Después de 15 días se observó una disminución en los niveles de glucosa en sangre similar al que se obtuvo cuando las ratas fueron tratadas con 500 µg/kg del hipoglucemiante glibenclamida. Además del efecto hipoglucemiante, los niveles de colesterol, triglicéridos, HDL, LDL, VLDL y fosfolípidos séricos en estas ratas fueron similares cuando se trataron con extracto metanólico de amaranto o con glibenclamida (Sangameswaran y Jayakar 2008). El efecto positivo del consumo de amaranto sobre los perfiles lipídicos plasmáticos se ha demostrado en ratas alimentadas con dietas altas en colesterol (Czerwińskia et al., 308

J. A. Huerta-Ocampo et al.

2004), mientras que el consumo de la aislados de proteína, el grano completo y el aceite de amaranto han demostrado tener efectos hipocolesterolemiantes en hámsteres (Berger et al., 2003; Mendonça et al., 2009). PROPIEDADES ANTIOXIDANTES El potencial antioxidante de las proteínas del amaranto (Amaranthus mantegazzianus) y de sus hidrolizados con alcalasa fueron evaluados por Tironi y Añon (2010), todos las fracciones proteínicas tuvieron efecto antioxidante. Además de las proteínas, la harina del amaranto contiene polifenoles. Fenoles como la rutina, isoquercetina y la nicotiflorina, además de ácidos fenólicos como el ácido vaníllico, el ácido 4-hidroxibenzoico y el ácido siríngico; se han identificado y cuantificado en la harina de amaranto (Barba de la Rosa et al., 2009). Los polifenoles son compuestos fitoquímicos que están involucrados en la defensa contra la radiación ultravioleta o la agresión por patógenos en plantas. Estos compuestos contribuyen al amargor, astringencia, color, sabor, olor y estabilidad anti-oxidativa de los alimentos (Pandey y Rizvi, 2009). Casi todos los polifenoles muestran propiedades antioxidantes y se les han atribuido efectos benéficos para la salud. Están asociados con la protección contra el cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas y el envejecimiento (Pandey y Rizvi, 2009). Polifenoles como la quercetina sirven como defensa contra el daño oxidativo in vivo (Meyers et al., 2008). Se ha afirmado que la nicotiflorina tiene efectos protectores al reducir la disfunción de la memoria (Huang et al., 2007) y tiene potencial terapéutico en la enfermedad isquémica cerebral (Li et al., 2006). La rutina es uno de los fitoquímicos con mayor potencial antioxidante y también presenta actividad cardioprotectora. Se ha demostrado que la rutina en combinación con un fármacos reductores del colesterol como la lovastatina incrementa el efecto hipocolesterolemiante en modelos animales (Ziaee et al., 2009). OTROS EFECTOS BENÉFICOS Diversos efectos benéficos diferentes a los nutricionales y a los ya anteriormente mencionados en este capítulo también han sido reportados y se le atribuyen a los compuestos

Capítulo XXI. Amaranto: propiedades benéficas para la salud

fitoquímicos presentes en la planta de amaranto, por ejemplo, Kumar et al. (2010) demostraron que los extractos metanólicos de hojas de tres especies de amaranto tienen propiedades anti-helmínticas, mientras que Sawangjaroen y Sawangjaroen (2005) han reportado que los extractos acuosos de amaranto poseen propiedades anti-diarreicas.

Barba de la Rosa A P, A Barba Montoya, P Martínez-Cuevas, B Hernández-Ledesma, M F León-Galván, A De León-Rodríguez, C González (2010) Tryptic amaranth glutelin digests induce endothelial nitric oxide production through inhibition of ACE: Antihypertensive role of amaranth peptides. Nitric Oxide 23:106111.

CONCLUSIONES

Barba de la Rosa A P, I S Fomsgaard, B Laursen, A G Mortensen, J L Olvera-Martínez, C SilvaSánchez, A Mendoza-Herrera, J GonzálezCastañeda, A De León-Rodríguez (2009) Amaranth (Amaranthus hypochondriacus) as an alternative crop for sustainable food production: phenolic acids and flavonoids with potential impact on its nutraceutical quality. Journal of Cereal Science 49:117-121.

Además de su alto valor nutricional el amaranto es una fuente de péptidos bioactivos y una serie de compuestos fitoquímicos con propiedades benéficas para la salud humana y con potencial de desarrollo biotecnológico. Es necesario comprender de una mejor manera los mecanismos mediante los cuales los péptidos bioactivos ejercen sus efectos benéficos sobre la salud humana. También es necesario identificar los compuestos específicos responsables de los efectos anti-diabéticos, hipocolesterolemiantes y anti-helmínticos, entre otros efectos reportados en los extractos obtenidos de diferentes partes de la planta. Finalmente, los usos tradicionales del amaranto como antipirético, como remedio contra la gonorrea, entre otros efectos supuestos a partir de su uso tradicional en diferentes partes del mundo aguardan estudios científicos rigurosos para evaluar si en realidad estas propiedades existen en el amaranto y en caso afirmativo será necesario identificar las moléculas responsables de dichos efectos. AGRADECIMIENTOS Agradecemos el apoyo otorgado por la Fundación Produce San Luis Potosí (Proyecto Validación y Transferencia del Cultivo de Amaranto en San Luis Potosí). LITERATURA CITADA Aguilar-Hernández H S, L Santos, F LeónGalván, A Barrera-Pacheco, E Espitia-Rangel, A De León-Rodríguez, R G Guevara-González, A P Barba de la Rosa (2011) Identification of calcium stress induced genes in amaranth leaves through suppression subtractive hybridization. Journal of Plant Physiology 168:2102-2109.

Barba de la Rosa A P, J Gueguen, O ParedesLópez, G Viroben (1992) Fractionation procedures, electrophoretic characterization, and amino acid composition of amaranth seed proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40:931-936. Barrio D A, M C Añón (2010) Potential antitumor properties of a protein isolate obtained from the seeds of Amaranthus mantegazzianus. European Journal of Nutrition 49:73-82. Berger A, G Gremaud, M Baumgartner, D Rein, I Monnard, E Kratky, W Geiger, J Burri, F Dionisi, M Allan, P Lambelet (2003) Cholesterol-lowering properties of amaranth grain and oil in hamsters. International Journal for Vitamin and Nutrition Research 73:39-47. Chakraborty S, N Chakraborty, A Datta (2000) Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus. Proceedings of the National Academy of Sciences 97:3724-3729.

J. A. Huerta-Ocampo et al.

309

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Chakraborty S, N Chakraborty, L Agrawal, S Ghosh, K Narula, S Shekhar, P S Naik, P C Pande, S K Chakraborti, A Datta (2010) Nextgeneration protein-rich potato expressing the seed protein gene AmA1 is a result of proteome rebalancing in transgenic tuber. Proceedings of the National Academy of Sciences 107:1753317538. Czerwińskia J, E Bartnikowskab, H Leontowicza, E Langeb, M Leontowicza, E Katrichc, S Trakhtenbergd, S Gorinstein (2004) Oat (Avena sativa L.) and amaranth (Amaranthus hypochondriacus) meals positively affect plasma lipid profile in rats fed cholesterolcontaining diets. The Journal of Nutritional Biochemistry 15:622-629. De Lumen B O (2005) Lunasin: a cancer preventive soy peptide. Nutrition Reviews 63:16-21. Espitia-Ragel E (1994) Breeding of grain amaranth. In: Amaranth Biology Chemistry and Technology. O Paredes-López (ed). CRC Press, Boca Raton, FL. pp:23-38. Espitia-Rangel E, C Mapes-Sánchez, D Escobedo-López, M De la Ólan, P RivasValencia, G Martínez-Trejo, L CortésEspinoza, J M Hernández-Casillas (2010) Conservación y Uso de los Recursos Genéticos de Amaranto en México. SINAREFI-INIFAPUNAM, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanajuato, México. 201 pp. FitzGerald R J, H Meisel (2000) Milk proteinderived peptide inhibitors of angiotensin-Iconverting enzyme. British Journal of Nutrition 84:S33-S37. Fleming I (2006) Signaling by the angiotensinconverting enzyme. Circulation Research 98:887-896. Huang J L, S T Fu, Y Y Jiang, Y B Cao, M L Guo, Y Wang, Z Xu (2007) Protective effects of Nicotiflorin on reducing memory dysfunction, energy metabolism failure and oxidative stress in multi-infarct dementia model rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior 86:741-748. 310

J. A. Huerta-Ocampo et al.

Huerta-Ocampo J A, E P Briones-Cerecero, G Mendoza-Hernández, A De León-Rodríguez, A P Barba de la Rosa. Proteomic analysis of amaranth (Amaranthus hypochondriacus L.) leaves under drought stress. International Journal of Plant Sciences 170:990-998. Huerta-Ocampo J A, M F León-Galván, L B Ortega-Cruz, A Barrera-Pacheco, A De León-Rodríguez, G Mendoza-Hernández, A P Barba de la Rosa (2011) Water stress induces the up-regulation of DOF1 and MIF1 transcription factors and down-regulation of proteins involved in secondary metabolism in amaranth roots (Amaranthus hypochondriacus L.). Plant Biology 13:472-482. Jayaprakasam B, Y Zhang, M G Nair (2004) Tumor cell proliferation and cyclooxygenase enzyme inhibitory compounds in Amaranthus tricolor. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52:6939-6943. Jeong H J, J B Jeong, D S Kim, J H Park, J B Lee, D H Kweon, G Y Chung, E W Seo, B O de Lumen BO (2007a) The cancer preventive peptide lunasin from wheat inhibits core hystone acetylation. Cancer Letters 255:42-48. Jeong H J, Y Lam, B O de Lumen (2002) Barley lunasin suppresses ras-induced colony formation and inhibits histone acetylation in mammalian cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:5903-5908. Jeong J B, H J Jeong, J H Park, J B Jeong, H J Jeong, J H Park, S H Lee, J R Lee, H K Lee, G Y Chung, J D Choi, B O de Lumen (2007b) Cancer-preventive peptide lunasin from Solanum nigrum L. inhibits acetylation of core histones H3 and H4 and phosphorylation of retinoblastoma protein (Rb). Journal of Agricultural and Food Chemistry 55:1070710713. Johnson B L, T L Henderson (2002) Water use patterns of grain amaranth in the northern Great Plains. Agronomy Journal 94:1437-1443.

Capítulo XXI. Amaranto: propiedades benéficas para la salud

Ju H, V J Venema, M B Marrero, R C Venema (1998) Inhibitory interactions of the bradykinin B2 receptor with endothelial nitric-oxide synthase. The Journal of Biological Chemistry 273:24025-24029.

Motoi H, T Kodama (2003) Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from wheat gliadin hydrolyzates. Nahrung 47:354-358.

Koike H, K Ito, M Miyamoto, H Nishino (1980) Effects of long-term blockade of angiotensin converting enzyme with captopril (SQ14,225) on hemodynamics and circulating blood volume in SHR. Hypertension 2:299303.

Nurminen M L, M Sipola, H Kaarto, A Pihlanto-Leppälä, K Piilola, R Korpela, O Tossavainen, H Korhonen, H Vapaatalo (2001) Alpha-lactorphin lowers blood pressure measured by radiotelemetry in normontensive and spontaneously hypertensive rats. Life Sciences 66:1535-1543.

Kumar A B, K Lakshman, K N Jayaveera, R Nandeesh, B Manoj, D Ranganayakulu (2010) Comapartive in vitro anthelmintic activity of three plants from the Amaranthaceae family. Archives of Biological Sciences, Belgrade 62:185-189.

Omami E N, P S Hammes, P J Robbertse (2006) Differences in salinity tolerance for growth and water-use efficiency in some amaranth (Amaranthus spp.) genotypes. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 34:11-22.

Li R, M Guo, G Zhang, X Xu, Q Li (2006) Neuroprotection of nicotiflorin in permanent focal cerebral ischemia and in neuronal cultures. Biological and Pharmaceutical Bulletin 29:18681872.

Pandey K B, S I Rizvi (2009) Current understanding of dietary polyphenols and their role in health and disease. Current Nutrition and Food Science 5:249-63.

Maldonado-Cervantes E, H J Jeong, M F León-Galván, A Barrera-Pacheco, A De León-Rodríguez, E Gonzélez de Mejía (2010) Amaranth lunasin-like peptide internalizes into the cell nucleus and inhibits chemical carcinogen-induced transformation of NIH3T3 cells. Peptides 31:1635-1642. Mallikarjun-Gouda K G, L R Gowda, A G Appu-Rao, V Prakash (2006) Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide derived from glycinin, the 11S globulin of soybean (Glycine max). Journal of Agricultural and Food Chemistry 54:4568-4573. Mendonça S, P H Saldiva, R J Cruz, J A G Arêas (2009) Amaranth protein presents cholesterol-lowering effect. Food Chemistry 116:738-742. Meyers K J, J L Rudolf, A E Mitchell (2008) Influence of dietary quercetin on glutathione redox status in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56:830-836.

Paredes-López O, A P Barba de la Rosa, A Cárabez-Trejo (1990) Enzymatic production of high-protein amaranth flour and carbohydrate rich fraction. Journal of Food Science 55:11571161. Pihlanto-Leppälä A, P Koskinen, K Piilola, T Tupasela, H Korhonen (2000) Angiotensin I-converting enzyme inhibitory properties of whey protein digests: concentration and characterization of active peptides. The Journal of Dairy Research 67:53-64. Rascón-Cruz Q, S Sinagawa-García, J A Osuna-Castro, N Bohorova, O ParedesLópez (2004) Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize. Theoretical and Applied Genetics 108:335-342. Sangameswaran B, B Jayakar (2008) Antidiabetic, anti-hyperlipidemic and spermatogenic effects of Amaranthus spinosus Linn. on streptozotocin-induced diabetic rats. Journal of Natural Medicines 62:79-82.

J. A. Huerta-Ocampo et al.

311

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Sawangjaroen N, K Sawangjaroen (2005) The effects of extracts from anti-diarrheic Thai medicinal plants on the in vitro growth of the intestinal protozoa parasite: Blastocystis hominis. Journal of Ethnopharmacology 98:67-72. Schnetzler K A, W M Breene (1994) Food uses and amaranth product research: a comprehensive review. In: Peredes-López O (ed), Amaranth Biology Chemistry and Technology. CRC Press, Boca Raton, FL. pp:155-184. Seppo T, T Jauhiainen, R Poussa, A Korpela (2003) Fermented milk high in bioactive peptides has a blood pressure-lowering effect in hypertensive subjects. The American Journal of Clinical Nutrition 77:326-330. Silva-Sánchez C, A P Barba de la Rosa, M F León-Galván, B O De Lumen, A De LeónRodríguez, E González de Mejía (2008) Bioactive peptides in amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seed. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56:1233-1240. Silva-Sánchez C, J González-Castañeda, A De León-Rodríguez, A P Barba de la Rosa (2004) Functional and rheological properties of amaranth albumins extracted from two Mexican varieties. Plant Foods for Human Nutrition 59:169-174. Sugimoto Y, K Yamada, S Sakamoto, H Fuwa (1981) Some properties of normal- and waxytype starches of Amaranthus hypochondriacus L. Starch 33:112-116. Tamás C, B N Kisgyörgy, M Rakszegi, M D Wilkinson, M S Yang, L Láng, L Tamás, Z Bedo Z (2009) Transgenic approach to improve wheat (Triticum aestivum L.) nutritional quality. Plant Cell Reports 28:1085-1094. Tapia-Blácido D R, P J A Sobral, F C Menegalli (2009) Potential of Amaranthus cruentus BRS alegría in the production of flour, starch and protein concentrate: chemical, thermal and rheological characterization. Journal of the Science of Food and Agriculture 90:1185-1193.

312

J. A. Huerta-Ocampo et al.

Tiengo A, M Faria, F M Netto (2009) Characterization and ACE-inhibitory activity of amaranth proteins. Journal of Food Science 74:H121-H126. Tironi V A, M C Añón (2010) Amaranth proteins as a source of antioxidant peptides: effect of proteolysis. Food Research International 43:315–322. Tovar-Pérez E G, I Guerrero-Legarreta, A Farrés-González, J Soriano-Santos (2009). Angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptide fractions from albumin 1 and globulin as obtained of amaranth grain. Food Chemistry 116:437-444. Vecchi B, M C Añón (2009) ACE inhibitory tetrapeptides from Amaranthus hypochondriacus 11S globulin. Phytochemistry 70:864-870. Velarde-Salcedo A J, E González de Mejía, A P Barba de la Rosa (2012) In vitro evaluation of antidiabetic and antilipogenic potential of amaranth protein hydrolisates. In: Hispanic Foods: Chemistry and Bioactive Compounds. M Tunik, E de Mejía (Eds) (Accepted/in Press). Velarde-Salcedo A J, A Barrera-Pacheco, S Lara-González, GM Montero-Morán, A Díaz-Gois, E González de Mejia, A P Barba de la Rosa (2013). In vitro inhibition of dipeptidyl peptidase IV by peptides derived from the hydrolysis of amaranth (Amaranthus hypochondriacus L.) proteins. Food Chemistry 136:758-764. Wilhelm E, T Aberle, W Burchard, R Landers (2002) Peculiarities of aqueous amaranth starch suspensions. Biomacromolecules 3:17-26. Ziaee A, F Zamansoltani, M Nassiri-Asl, E Abbasi (2009) Effects of rutin on lipid profile in hypercholesterolaemic rats. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology 104:253-258.

Situación Actual, Rentabilidad y Comercialización

Capítulo XXII

El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos GRAIN AMARANTH IN MEXICO, DESCRIPTION OF VALUE CHAIN, IMPLICATIONS AND CHALLENGES

Alma Velia Ayala Garay1, Diana Escobedo López 2, Lorena Cortés Espinosa1, Eduardo Espitia Rangel2 1INIFAP Campo Experimental Valle de México, Km.18.5 Carretera Los Reyes-Lechería, Texcoco Estado de México C.P. 56230, Tel. 01(595) 955 76 25 2INIFAP Campo Experimental Bajío, Celaya, Guanajuato. Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El cultivo de amaranto es una alternativa ideal de producción y consumo en regiones marginadas de México. Dada la importancia que ha ido adquiriendo el cultivo, este estudio tiene el fin de analizar las perspectivas de la producción de amaranto en México. Destaca que tanto la superficie sembrada como el volumen de producción de amaranto, registraron durante el periodo de 1982 a 2010, tasas de crecimiento media anual (TCMA) del 8.17% y 15.34%, respectivamente. El porcentaje de participación del valor de la producción del amaranto en el valor de la producción agrícola total, creció a una tasa media anual de 8.17% durante el mismo periodo. El incremento de la producción de amaranto se vio determinado principalmente por la combinación del incremento de la superficie y el rendimiento en un en 66.12%. El 95% de los productores son minifundistas con superficies de 1.5 hectáreas. La comercialización se realiza por diversos agentes. Actualmente existen centros de acopio que han sido creados por productores primarios, que entregan el grano limpio a las agroindustrias. Sobre la organización de los productores de amaranto, en los principales estados se han conformado

sistemas producto y consejos de productores que son reconocidos por los gobiernos estatales, sin embargo, continúan en proceso de consolidación. El amaranto contribuye a la soberanía alimentaria, debido a que es originario de México, por su alto contenido nutricional, por formar parte de la cultura y tradiciones de los pueblos del país. Palabras clave: Producción, comercio internacional, comercialización, agroindustria y transformación. ABSTRACT Amaranth is an alternative for production and consumption in marginal areas of Mexico due to its agronomic, nutritive and nutraceutical properties. Due to the importance that the crop had been acquiring, this study has the objective to analyze the current situation and perspectives for the production of grain amaranth in Mexico. The cultivated area and the volume of production of amaranth increased during the period from 1982 to 2010, at an annual average growth rate (TCMA) of 8.17% and 15.34%, respectively. The percentage of participation of the production value within the value of 315-330

Amaranto: Ciencia y Tecnología

total agricultural production grew at an annual average rate of 8.17% during the same period. The production increase of grain amaranth was determined by the combination of increments in the surface and in the productivity in 66.12%. About 95% of farmers are small holders averaging 1.5 hectares of land. The marketing is done by various actors; currently, there are collection centers created by farmers who deliver the clean grain to the agro-industries. On the organization of grain amaranth producers, in the main producing States there are Product Systems and Farmers Councils, who are recognized by State Governments and, its consolidation process is undergoing. Key words: production, international trade, marketing, agribusiness and transformation. INTRODUCCIÓN El amaranto es una planta cultivada, domesticada y utilizada en México desde hace más de 7,000 años, (Casas et al., 2001; Sauer, 1976), con una gran tradición, ya que su fruto fue utilizado en ofrendas a los dioses en las culturas prehispánicas. Su rusticidad, el agradable sabor de la gran cantidad de productos que se pueden fabricar con su semilla y su buen contenido nutricional han hecho que su cultivo e industrialización se realicen en varias partes de México. Según la FAO (1997), el cultivo del amaranto tanto en el área andina como en la costa de los países de América, tiene enormes posibilidades y perspectivas técnicas de desarrollo, puesto que las características agroclimáticas, edáficas y tecnológicas son adecuadas y propicias para el cultivo, transformación e industrialización; así mismo el uso y consumo de este producto de alto valor proteico traería como consecuencia disminución considerable de los niveles de desnutrición existente en muchos países en desarrollo; también la demanda del amaranto en los países europeos e industrializados hace que la producción en América Latina tenga un enorme impulso y estímulo, con mayores posibilidades de incrementar el área de cultivo. Es uno de los cultivos más antiguos de América, la superficie de siembra se ha

incrementado tanto por sus cualidades alimenticias que posee como por su capacidad de adaptabilidad a la mayoría de las condiciones climáticas de México. A pesar de su importancia económica y social, el amaranto no ocupa un lugar dentro de los productos que son considerados básicos y estratégicos en la Ley de Desarrollo Rural Sustentable , sin embargo, autores como la FAO (1997) lo catalogan como un cultivo con la misma cantidad de nutrientes que la soya y capacidad productiva que podría aprovecharse. Otros autores como Barrales et al. (2010) mencionan que es un cultivo prometedor como la mejor fuente de proteínas de origen vegetal que se puede obtener en condiciones de temporal, ya que en sequías puede sobrevivir por largo tiempo y presentar mejores rendimientos que otros cultivos en similares circunstancias, además ante la crisis económico y social en que se encuentran inmersos países como México, el amaranto es una alternativa ideal de producción y consumo en regiones marginadas del país. Derivado de lo anterior y dada la importancia que ha ido adquiriendo el cultivo, el presente estudio tuvo como finalidad analizar las perspectivas de la producción del amaranto en México. CONTEXTO INTERNACIONAL A pesar de que no existen estadísticas oficiales que permitan conocer el comportamiento de la producción y comercio de este producto, de acuerdo a Jacobsen (2002) en los últimos veinte años ha existido un aumento notorio en la investigación y producción de amaranto en América, Asia, África, y varios países del este de Europa. En África, el amaranto es domesticado y considerado como verdura, mientras que en otros países, como en Rusia, el amaranto silvestre es usado como forraje (Komen, 1992). En China se usa el amaranto cultivado para grano y forraje (Yue y Sun, 1993). En Dinamarca, la investigación con amaranto se inició en 1986 (Sørensen y Jacobsen, 1987; Itenov y Jacobsen, 1996), pero todavía no se cultiva comercialmente. En otros países se utiliza además de la semilla, la planta (tallos y hojas) que se procesa y consume en la alimentación humana,

1En el artículo 70 de la Ley de Desarrollo Rural Sustentable se menciona que productos son considerados como productos básicos y estratégicos (maíz, caña de azúcar, frijol, trigo, arroz, sorgo, café, huevo, leche, carne de bovinos, porcinos, aves, pescado).

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Capítulo XXII. El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos

como forraje para los animales y en la industria farmacéutica. Los principales países que cultivan el amaranto de grano son China, India, Kenya, México, Nepal, Perú, los EE.UU., y Russia (Bale y Kauffman, 1992). En la India, se conoce como rajgeera, el grano de los reyes, (Singhal y Kulkarni, 1988). Se sabe que en la región de los Himalayas existen pequeñas unidades de producción, donde se obtiene como un producto de autoconsumo (Singhal y Kulkarni, 1988). a) China El principal productor de este cultivo es China, según estadísticas de Export To China (ETCH, 2012), abastece gran parte del mercado internacional, las exportaciones e importaciones que realizó de este producto crecieron de 2005 al 2010 en promedio, se exportaron 111.78

millones de dólares y se importan 142.08 millones de dólares durante el periodo (Figura 1). China se colocó como principal exportador durante 2005 a 2010, los principales países compradores fueron Japón (31%), Estados Unidos (15 %) y Holanda (9%). Otros países que desatacaron fueron Tailandia, Dinamarca y República de Corea. Se espera, que continúen aumentando las exportaciones del amaranto, dada la importancia que ha adquirido en los últimos años, como un cultivo prometedor y sustentable (Figura 2). b) Estados Unidos El amaranto se siembra y utiliza en los Estados Unidos, donde las semillas se combinan con granos de trigo y maíz, en productos para desayuno, harina para diferentes usos como panes, galletas y pastas (NRC, 1989). La

Importaciones en 1000 USD

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Exportaciones

Figura 1. China, exportaciones e importaciones de amaranto ($1000 USD). Fuente: elaborada con datos de ETCN (2012) http://trade.e-to-china.com/trade-data/china-import-export-amaranth.html?year=2010. Francia 5% Chile 5% Japón 31%

Australia 6%

Israel 7%

República de Cores 6%

Dinamarca 8%

Estados Unidos 15%

Tailandia 8% Holanda 9%

Figura 2. China, exportaciones de amaranto (%), promedio 2005 a 2010. Fuente: elaborada con datos de ETCN, 2012 http://trade.e-to-china.com/trade-data/china-import-export-amaranth.html?year=2010. A.V. Ayala Garay et al.

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Amaranto: Ciencia y Tecnología

producción comercial de amaranto de grano en los Estados Unidos comenzó a finales de 1970, (Sooby et al., 1999), creció en la década de los 80 y ha fluctuado desde entonces (Hackman, 2003). La superficie cultivada varía entre 1,500 y 3,000 hectáreas. El precio es relativamente alto, por lo general 10 veces más que el precio del maíz. Su tolerancia a la sequía lo ha llevado a ubicarse desde Nebraska, Iowa, Minnesota, Dakota del Norte, Montana, Kansas, Pennsylvania, y en otros lugares dispersos (Hackman, 2003). La comercialización en EE.UU. es a partir de productores locales, sin embargo, el principal productor y transformador en EE.UU. es New World Amaranth quienes han llegado a proveer al mercado Canadiense y Alemán y han desarrollado un modelo de agricultura bajo contrato, en Iowa, Kansas y Nebraska (Hackman, 2003). Se considera que el mercado del amaranto en los EE.UU. está dirigido a los consumidores que optan por alimentos saludables, de acuerdo a Hackman (2003), las personas que compran amaranto son aquellas que buscan un cereal con un perfil nutricional alto. Según el mismo autor, para que el amaranto pueda encontrar una mayor aceptación en EE.UU. tendrá que superar varios obstáculos, por ejemplo, los consumidores tendrán que reconocer los beneficios nutricionales del grano, que será difícil a menos que se comience a invertir en publicidad.

CONTEXTO NACIONAL EN MÉXICO a) Características generales de producción El porcentaje de participación del valor de la producción del amaranto al valor de la producción agrícola total aumentó a una tasa de crecimiento media anual (TCMA) sostenida de 8.17% (1982-2010). Su máxima aportación fue en 1999, a partir de ese momento disminuyó y en los últimos años la contribución del amaranto ha tenido altibajos y en promedio de 2006 a 2010 aporta el 1% (Figura 3). De acuerdo a SAGARPA (2012), la TCMA de la superficie sembrada de 1982 a 2010 fue de 9.82%, entre 1982-2010, esta tasa refleja la importancia que ha adquirido el amaranto en los últimos años. Durante los años 1997,1999 y 2001, se tuvieron las máximas superficies cultivadas con áreas superiores a las tres mil hectáreas. De 2004 a 2007, se estabilizó la superficie a un nivel ligeramente superior a las dos mil hectáreas, ya entre 2008-2010 la superficie alcanzó nuevamente más de tres mil ha, en promedio 3047 ha (Figura 4). Una situación similar ha ocurrido con la producción, donde se tuvieron incrementos y gran variabilidad, con un salto a partir de 1995, y un máximo histórico en el año 2001, con la misma tendencia a la estabilización de 2004 a 2007 de tres mil toneladas, de 2008 a 2010 un

3.00%

2.50% 2.00% 1.50% 1.00%

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2009 2010

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Figura 3. México. Porcentaje de participación del valor de producción del amaranto en el valor de la producción agrícola de México, precios constantes, 2003=100. Fuente: Elaboración propia con datos de SAGARPA-SIACON, 2010.

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Hectàreas

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Figura 4. Superficie nacional sembrada con amaranto en el periodo 1982-2010. Fuente: Elaboración propia con datos de SAGARPA-SIACON, 2010.

promedio de 4,075 toneladas, y una TCMA (1982-2010) de 15.34% (Figura 5). El aumento en superficie y producción, responde a que recientemente ha habido un gran interés en el consumo de este grano a nivel nacional, dadas sus propiedades nutritivas. Para analizar el incremento de la producción durante el periodo de estudio 19822010, se hizo una estimación de Descomposición de factores del crecimiento de la producción. Estos determinan de manera precisa el grado de influencia que han tenido factores como los rendimientos, como indicador de innovación y la superficie cosechada y/o un efecto combinado en el crecimiento de la producción. Para lograr lo anterior, se utilizó la fórmula de Contreras (2000) y se tomaron los datos de SAGARPASIACON, 2012:

Pt = Y0(At-A0)+Ao(Yt-Y0)+(At-A0)(Yt-Yo); Donde: Pt = Incremento total de la producción para el periodo de análisis. Y0(At-A0) = Cuantifica la contribución de la superficie. Ao(Yt-Y0) = Cuantifica la contribución del rendimiento At-A0)(Yt-Yo) = Cuantifica el efecto combinado de superficie y rendimiento, A0 = Superficie promedio cosechada inicial (1980=222.50 ha). At = Superficie promedio cosechada final (2010= 3,047.33 ha). Y0 = Rendimiento promedio nacional inicial (1980= 0.41, en t/ha). Yt = Rendimiento promedio final (2010= 1.34t/ ha).

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1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

-0

Figura 5. Producción nacional de amaranto en el periodo 1980-2010. Fuente: Elaboración propia con datos de SAGARPA-SIACON, 2010. A.V. Ayala Garay et al.

319

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Si el incremento total de la producción para el periodo 1982-2010 es igual a 100%, es posible determinar la proporción que corresponde a cada factor, para determinar si el crecimiento ha sido intensivo o extensivo. El crecimiento extensivo consiste en el aumento de la producción vía el incremento de la superficie cosechada, situación que remite a obsolescencia tecnológica. El crecimiento intensivo se relaciona con el aumento en la producción vía incremento en rendimientos, hecho que remite a un mayor nivel tecnológico. Un crecimiento combinado remite a incremento de superficie y rendimiento por igual (Zarazúa et al. 2009). En el Cuadro 1 se puede observar que el crecimiento de la producción de amaranto se vio determinado principalmente por la combinación del incremento de la superficie y el rendimiento en un en 66.12 %, es decir, este crecimiento se ha dado por la interacción entre ambos factores. Por otro lado, el incremento del rendimiento por hectárea entre 1982-2010 (Figura 6) creció a una TCMA de 4.36%, mientras que el de la producción fue de 15.34%.

En relación al incremento de la productividad, su crecimiento está en función de la adopción de paquetes tecnológicos, que son recomendados según las características de las zonas de producción (Estrada et al., 2006). Sin embargo, la adopción de estos paquetes tecnológicos, ha sido complicada. De acuerdo con Muñoz, et al. (2007) en la formulación de esos paquetes se pueden recuperar las experiencias de los productores, en especial la de aquellos con mayor potencial de innovación. b) Características de las unidades de producción Las unidades de producción se caracterizan por ser principalmente ejidales y muy pocas superficies son pequeña propiedad. Otra característica que se resalta, es que aproximadamente el 95% de los productores son minifundistas con extensiones individuales de 1.5 hectáreas en promedio y el 5 % restante son productores cuyos predios son de alrededor de 5 hectáreas (INEGI, 2009). El 97% de la producción de amaranto es de temporal, por lo que su manejo agronómico está basado y calendarizado en torno al periodo de

Cuadro 1. Participación de factores en el incremento de la producción de amaranto.

Rendimiento 207.95 5.21%

Valor obtenido Porcentaje

Total 3,992.55 100%

Fuente: Elaboración propia con datos de SAGARPA-SIACON, 2010. 2.00 1.80 1.60 1.40

ton/ha

1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20

1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

1985 1986 1987 1988 1989 1990

1982 1983 1984

-0

Figura 6. México. Rendimiento de amaranto (ton/ha). 1982-2010. Fuente: Elaboración propia con datos de SAGARPA-SIACON, 2010.

320

A.V. Ayala Garay et al.

Capítulo XXII. El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos

lluvias de las regiones productoras, de tal manera que dicho manejo es ligeramente diferente en cada región, pero su ciclo de producción es en primavera verano.

exportación se realiza cumpliendo las normas de calidad para consumo humano y grano reventado de amaranto, establecidas en México y en los otros países (Figura 8).

c) Comercio exterior en México El amaranto está considerando como un cereal, de acuerdo a estadísticas de SAGARPA (2010), las exportaciones del cultivo registraron una caída en 2007 y una recuperación en 2010, en 2007 se mencionan 12.96 miles de dólares; en 2009 1.93 miles de dólares, el año con una menor cantidad y en 2011 con 29.75 como el de mayor (Figura 7). Los principales destinos son Italia (42%), Estados Unidos (37%) y Colombia (12%), según promedio de 2007 a 2011. La

CONTEXTO REGIONAL De acuerdo a datos del SAGARPA-SIACON (2012), la producción de amaranto se concentra en la zona central de México, destacan los estados de Puebla, Morelos, Tlaxcala, Estado de México, y el Distrito Federal (Figura 9 y Cuadro 2). También se siembra en menores superficies y de manera más esporádica en Aguascalientes, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Michoacán, Oaxaca, Querétaro, Nayarit, San Luis Potosí y Veracruz; a nivel de huerto familiar se cultiva en la zona serrana de Sinaloa, Sonora,

35

Miles de dólares

30 25 20 15 10 5 -0 2007

2008

2009

2010

2011

Exportaciones

Figura 7. México. Exportaciones de amaranto. Fuente: SAGARPA con datos del Sistema de Seguimiento Oportuno de Comercio Exterior en Economía, 2012. Cuba 1%

Otros 3%

Canadá 5% Colombia 12%

Italia 42%

Estados Unidos 37%

Figura 8. México. Exportación de amaranto, principales destinos (2006/2010). Fuente: SAGARPA con datos del Sistema de Seguimiento Oportuno de Comercio Exterior en Economía, 2012. A.V. Ayala Garay et al.

321

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Chihuahua y Durango (SAGARPA-SIACON, 2010). El comportamiento de la producción por estado ha variado a través de los años, cabe resaltar, la participación de Puebla ya que esta entidad en la década de los ochenta, no figuraba en la producción, pero a partir de 1995, se convirtió en el principal productor (Figura 9).

Cohuecán, Huaquechula, Ixcaquixtla, Molcaxac, San Andrés Cholula, San Felipe Teotlalcingo, San Martín Texmelucan, San Matías Tlalancaleca, San Salvador El Verde, Tecamachalco, Tlacotepec de Benito Juárez y Tochimilco (Santa Cruz, 2010). Los rendimientos en esa región han crecido a un ritmo mayor que los nacionales, su TCMA es de 2.88% (1982-2010), su comportamiento es similar al promedio nacional, con tendencias a la alza. De acuerdo a Santa Cruz (2010) Tochimilco presenta una tendencia constante posicionándose como la zona de mayor rendimiento; el resto de los municipios presenta altibajos.

a) Puebla Como ya se mencionó, el estado de Puebla mantuvo la hegemonía en la producción de amaranto, las zonas de producción se ubican en los municipios de Atlixco, Atzitzihuacán, 4000 3500

X

X XX

3000

ton

2500 2000

X

1500

X

X X

500

1980

X

X

1000

-0

XX

X

XX

X

X

1985

X

X

X

XX X X

1990 D.F.

1995 MÉX.

año MOR.

2000

X PUE.

2005

2010

2015

TLAX.

Figura 9. México. Principales estados productores amaranto en el periodo 1982-2010. Fuente: Elaboración propia con datos de SAGARPA-SIACON, 2010 e INEGI 2012. Cuadro 2. Volumen de producción de amaranto en diferentes estados, varios años (ton).

1990 2000 2008 Estado 193 3,059 2,511 Puebla 60 México 147 408 138 Morelos 506 575 Guanajuato 7 146 Tlaxcala 276 190 Distrito Federal 109 218 164 Jalisco Querétaro 9 Oaxaca 7 7 Campeche 20 25 Guerrero 671 4,240 3,863 Total * Se considera el promedio de la producción 2008/10 Fuente: SAGARPA-SIACON (2010)

322

A.V. Ayala Garay et al.

2009 3,356 440 325 196 151 19 7

4,493

Participación % 2010 Promedio* en la Producción 66 2,489 2,785 11 491 446 9 303 401 5 225 225 5 193 193 4 165 160 0 19 0 5 7 0 7

3,870

4,243

100

Capítulo XXII. El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos

b) Morelos Para el caso de Morelos, ocupa el segundo lugar a nivel nacional en cuanto a producción se refiere, las zonas productoras se ubican en los municipios de Temoac, Tetela del Volcán y Zacualpan de Amilpas. Sobre la superficie sembrada y cosechada, el municipio de Temoac ha permanecido en el primer lugar (Santa Cruz, 2011). El rendimiento del cultivo ha crecido a una TCMA de 1.55% presenta altibajos pero

En los últimos años a nivel nacional, se ha dado una caída drástica de los precios del amaranto, en términos reales en Puebla este precio siempre ha sido menor que el promedio nacional, aun cuando se tienen tendencias constantes y comportamiento similares. A pesar de la caída del precio, los productores continúan sembrando el producto en el estado, hasta convertirlo en el principal productor a nivel nacional (Figura 10 y 11). 2

X

1.8

X

1.6 1.4

X

X

ton/ha

1.2 1

X

0.8

X

0.6

X

X

X X XX

XX

X

X

X

X

X X X

X

X

X X

X

X

0.4

X

0.2

1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

-0

Puebla X Promedio Nacional Figura 10. Puebla. Rendimiento por ha. 1980-2010. Fuente: Elaboración propia con datos del SIACON, 2010.

35,000 30,000

X

25,000

$/ton

20,000

15,000 10,000

X X

X

X

X

XX X X X X

5,000

X

X X

X X

X X X X

X

XX

XX X

X

X X

1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

-0

Puebla

X Promedio Nacional

Figura 11. Comportamiento del precio medio rural del amaranto en el estado de Puebla, 1982-2010. (2003=100). Fuente: Elaboración propia con datos de SAGARPA- SIACON, 2010 e INEGI 2010. A.V. Ayala Garay et al.

323

Amaranto: Ciencia y Tecnología

en general se encuentra por abajo del promedio nacional mostrando un comportamiento similar a la tendencia nacional (Figura 12). Sobre el precio medio rural del grano de amaranto, Morelos refleja en algunos momentos una tendencia similar al comportamiento nacional, sin embargo, hay que resaltar que entre 1998 y 2010 fue mayor en Morelos que el nacional a excepción del 2005. (Figura 13).

200 Hectáreas (Santacruz, 2011). La superficie sembrada y cosechada de Amaranto se concentra prácticamente en el municipio de Nativitas, mientras que Sanctorum de Lázaro Cárdenas sólo figura en el 2002 con una superficie de 4 Hectáreas. En cuanto al volumen de producción del grano de amaranto, el municipio Nativitas ha permaneciendo como principal zona de producción (Santacruz, 2011). En cuanto al rendimiento del cultivo de amaranto en el estado de Tlaxcala muestra altibajos en el período 1987 a 2010, a diferencia de Puebla y Morelos, para Tlaxcala no existen datos de 1982 a 1986 en el SIACON. En general se encuentra por arriba del promedio nacional hasta 2003, pero a partir de este año es inferior al promedio nacional (Figura 14).

c) Tlaxcala Tlaxcala aportó el 5% de la producción su superficie sembrada ha registrado una tendencia a la baja, las zonas de producción se ubican en los municipios de Nativitas y Sanctorum de Lázaro Cárdenas. Actualmente la superficie cultivada con Amaranto oscila alrededor de las 2.5

2

X

ton/ha

1.5

X

X 1

X X

X

X

XX X X

X X

X X

XX

X

X X

X

X X X

X

X X

X

0.5

X

1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

-0

Morelos

X Promedio Nacional

Figura 12. Morelos. Rendimiento por ha. 1982-2010. Fuente: Elaboración propia con datos de SIACON, 2010. 35,000.00

30,000.00

X

$/ton

25,000.00

20,000.00 15,000.00

X

X

X

X

10,000.00

XX X XXX

5,000.00

X

X X

X X

X XX X X

X X XX X X X X

-0 1982 1984 1986 1988 1990 19921994 19961998 2000 2002 2004 20062008 2010 Morelos

X Promedio Nacional

Figura 13. Morelos. Precio medio rural, (2003=100). 1982-2010. Fuente: Elaboración propia con datos del SIACON, 2010 e INEGI, 2010

324

A.V. Ayala Garay et al.

Capítulo XXII. El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos

d) Estado de México Otro estado importante en la producción de amaranto es el Estado de México, aporta el 10%; las zonas de producción se ubican en los municipios de Amecameca, Ayapango, Ocuilan, Ozumba, Tepetlixpa y Tlalmanalco, el

En cuanto al Precio Medio Rural (PMR), Tlaxcala presenta un comportamiento semejante al precio nacional solo en algunos año, a partir de 2003, en Tlaxcala el precio va en aumento (Figura 15). 2.50

2.00

X

1.50

X

ton/ha

X 1.00

X X X X

X X

X

X X

X

X

X

X

X X

X

X

X

X

X 0.50

Tlaxcala

2008 2009 2010

2006 2007

2005

2002 2003 2004

2000 2001

1998 1999

1995 1996 1997

1994

1992 1993

1991

1990

1989

1988

1987

-0

X Promedio Nacional

Figura 14. Tlaxcala. Rendimiento por hectárea. 1987-2010. Fuente: elaboración propia con datos del SIACON 2010 e INEGI 2010. 20,000.00 18,000.00 16,000.00 14,000.00

$/ton

12,000.00

X

10,000.00 8,000.00

X XX

X

X X

6,000.00

X

X

X X

4,000.00

X X

X

X X

X X

X X X

X

X X

2,000.00

Tlaxcala

2006 2007 2008 2009 2010

2004 2005

1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

1992

1987 1988 1989 1990 1991

-0

X Promedio Nacional

Figura 15. Tlaxcala. Precio medio rural, (2003=100). 1987-2010. Fuente: elaboración propia con datos del SIACON 2010 e INEGI 2010. A.V. Ayala Garay et al.

325

Amaranto: Ciencia y Tecnología

rendimiento del cultivo y su precio medio rural es similar que el de los otros estados (Santacruz, 2011). TRANSFORMACIÓN, AGROINDUSTRIA Y COMERCIALIZACIÓN La transformación del producto puede ser de manera tradicional o bien a través de un proceso de industrialización con mayor complejidad. Para los pequeños productores las instalaciones de las unidades de producción varían en cuanto a equipamiento e infraestructura, generalmente se ubican en las casas de los productores y ahí se han adaptado talleres en donde se encuentran desde equipos de uso domestico hasta hornos industriales. Cabe mencionar que debido a la demanda de espacio, algunas unidades que poseen los recursos han cambiado el taller del hogar a una nave semiindustrial, los productores que cuentan con pequeños talleres familiares donde procesan la semilla de manera artesanal, verifican el contenido de humedad del grano para procesarlo. Enseguida, el grano se revienta, es decir la semilla se coloca en comales de barro o metálicos calentados con fuego de leña o de gas para que se infle (esta forma de reventado ya es muy rara). El grano reventado se criba o cierne para separar el grano que no se expandió, se envasan bolsas para almacenarlo, se vende como cereal o se utiliza como insumo de otros productos. Otra opción es molerlo y cernirlo para obtener harina (Escalante, 2011). a) Usos de amaranto El amaranto tiene una serie de aplicaciones similares a la de los cultivos básicos, principalmente del maíz, que van desde dulces artesanales como granola, harinas integrales, alimentos extruidos (frituras), panificados, pastas; hasta productos más sofisticados como aceites comestibles, papillas para bebés, concentrados proteicos, barras energéticas y alimentos nutricionales y funcionales para mejorar la salud humana (Manrique de Lara Soria, 2011). El producto tradicional es la alegría que es mezclada con miel, azúcar o piloncillo y algunos otros ingredientes. Entre los productos de mayor aceptación en el mercado además de las alegrías, se encuentran palanquetas simples o 326

A.V. Ayala Garay et al.

combinadas con chocolate, garapiñadas; barras energéticas y granola combinadas con miel y otras semillas como ajonjolí, nueces, girasol, cacahuates, pepita de calabaza; pan, galletas, tamales, frituras, harina de amaranto, entre otras. Los productos los empacan en bolsas de plástico o celofán, algunos ya tienen marca (Escalante, 2011). Existen también los transformadores que realizan todo el proceso desde el tostado y reventado, para elaborar una gran diversidad de productos, desde los relacionados con la panadería hasta los dulces típicos (Cerezo Barreto, 2012). b) Calidad En México existe la Norma Mexicana NMXFF-114-SCFI-2009, denominada “Grano de amaranto. Especificaciones de calidad y métodos de ensayo”. En ella se establece las especificaciones de calidad del grano de amaranto que se cosecha, procesa y comercializa en el territorio nacional para uso y consumo humano, excluyendo el grano de amaranto genéticamente modificado, (Secretaría de Economía, 2009). Los granos de amaranto, en cualquiera de sus grados de calidad, deben estar exentos de sabores y olores extraños, y presentar color típico de la variedad. Estas especificaciones se verifican sensorialmente. Además deben cumplirse especificaciones fisicoquímicas y sanitarias. La declaratoria de vigencia de esta norma fue publicada en el Diario Oficial de la Federación el 25 de agosto de 2009 (Secretaría de Economía, 2009). Existe un proyecto de Norma PROY NMX-116-SCFI-2010, “Grano reventado de amaranto (Amaranthus spp.) para uso y consumo humano”. En las etapas de trilla y encostalado pueden existir riesgos de contaminación por metales, vidrios y cristales, además de riesgos químicos por la condición de almacenaje en espacios pequeños por productores en lugares cerca de los corrales de sus animales de traspatio, insecticidas, diesel, todos se almacenan en el mismo espacio de almacenaje. Un mecanismo se salvaguarda inherente al proceso de transformación de amaranto es que el proceso de reventado a temperaturas superiores a los 200° C volatiza casi la totalidad de químicos. Para cumplir con la norma, los granos de amaranto reventado, en cualquiera de sus grados

Capítulo XXII. El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos

de calidad deben estar limpios, es decir, exentos de cualquier materia extraña visible, de plagas y daños causados por ellas, que afecten al aspecto general del producto, de humedad anormal, de cualquier olor y/o sabor anormal o que indiquen rancidez y deben tener el color característico de la variedad. Estas especificaciones se verifican sensorialmente (Escalante, 2011). Asimismo, el grano reventado de amaranto debe cumplir con especificaciones físicas, fisicoquímicas, microbiológicas y toxicológicas (Secretaría de Economía, 2010). Uso de moldes de plástico para hacer figuras. Esta innovación consiste en sustituir tarimas y moldes de diversos materiales por el uso de los plásticos debido a que estos últimos contribuyen con proporcionar una mejor presentación de los productos y asegurar la inocuidad de los mismos (Escalante, 2011). c) Comercialización del producto La comercialización del grano se realiza por agentes de diversos tamaños, actualmente existen centros de acopio que han sido creados por productores primarios, que entregan el grano limpio a las agroindustrias. Existen diversas formas de comercializarlo, como semilla, amaranto reventado y harina integral que se venden a las agroindustrias según su interés, consolidación y escala: Grupo Nestlé, Grupo de Amarantos Popocatépetl, Amarantos Poblanos, Grupo Becerra, Grupo San Miguel de Proyectos Agropecuarios (Manrique de Lara Soria, 2011). Existen cuatro grandes industrias que se dedican a la comercialización en gran escala del amaranto procesado: Qually, Xomor, Grupo San Miguel de Proyectos Agropecuarios, Expo Food (Espitia Rangel, 2012). De acuerdo a Manrique de Lara Soia, (2011) estos grupos se encuentran consolidados y han exportado productos e incluso han vendido a grandes corporativos como Gamesa (Manrique de Lara Soria, 2011). La Asociación Mexicana del Amaranto detalla que desde hace unos cuantos años la producción y la valoración del amaranto como alimento se está retomando a raíz de la demanda de grandes empresas, como Nestlé y Bimbo, que han incursionado en la producción de las llamadas barritas energéticas. Otro de los grandes consumidores ha sido el gobierno federal, a través del Sistema Nacional para el Desarrollo Integral

de la Familia (DIF) y Diconsa, instituciones que adquieren productos hechos con amaranto para niños y adultos, lo que también ha alentado la producción (Martínez, 2007). En pequeña escala, la comercialización del amaranto es uno de los aspectos más vulnerables de la cadena, puesto que más del 80% de la producción, es comercializada por intermediarios, quienes deciden el precio a inicios de la temporada de cosecha y lo van incrementando o disminuyendo, dependiendo de la oferta y la demanda, es decir, los productores que venden volúmenes pequeños, son los más vulnerables, ya que están expuestos a la fijación de precios de los intermediarios (SAGARPAComité Sistema Producto Amaranto Puebla, 2009). En los estados de Morelos, Tlaxcala y Distrito Federal, la comercialización de los productos a pequeña escala se realiza en un local, en algunas ocasiones, este forma parte de las casas, en ellos se comercializan productos de elaboración propia. Los compradores arriban a los pequeños comercios y adquieren productos al menudeo y mayoreo para posteriormente venderlos al consumidor final en otros lugares (Cerezo Barreto, 2012). LA ORGANIZACIÓN Y LOS SISTEMAS PRODUCTO EN MÉXICO. Sobre la organización de los productores de amaranto, cabe destacar que en los principales estados se han conformado sistemas producto y/o consejos de productores que son reconocidos por los gobiernos estatales, sin embargo, continúan en proceso de consolidación (Cerezo Barreto, 2012): 1. Los estados de San Luis Potosí, D.F. Puebla, Tlaxcala, en este momento están legalmente constituidos y reconocidos como Sistema Producto. 2. En Oaxaca está en proceso la constitución de un Sistema Producto Estatal, ya que existe el Consejo Integrador de Productores de Amaranto, Asociación Civil. 3. En Morelos, el Consejo de Productores está en proceso de cambio a una Asociación Civil. Además, existen otro tipo de organizaciones como la Asociación Mexicana del Amaranto, A.C. (AMA) que es una asociación civil sin ánimo lucrativo, integrada A.V. Ayala Garay et al.

327

Amaranto: Ciencia y Tecnología

por profesionales y personas interesadas en promover la integración de la cadena productiva del amaranto en México. El objetivo de esta asociación es establecer estrategias, objetivos y líneas de acción para consolidar la producción, el consumo y el aprovechamiento integral del amaranto (Asociación Mexicana del Amaranto, 2012). La AMA es una organización multidisciplinaria compuesta por productores de amaranto, micro industrial, industriales, comercializadores, investigadores, farmacéuticos, médicos, químicos, biólogos, dietistas, nutriólogos, etc. AMARANTO PARTE IMPORTANTE DE LA SOBERANÍA ALIMENTARIA De acuerdo a Trápaga (2005), el concepto de soberanía alimentaria se entiende como la capacidad y el derecho que tienen los pueblos y naciones a determinar, según sus propios intereses y preferencias históricas y socioculturales, el tipo de productos agrícolas que servirán como base para la alimentación de su población, suponiendo que es de alta prioridad para promover un modelo de desarrollo que fortalece el mercado interno e incorporar a las zonas rurales para lograr un desarrollo sustentable. Tomando como referencia la definición anterior, se puede decir que la protección y fomento del cultivo del amaranto, contribuye a la soberanía alimentaria, debido a que es originario de México, por su alto contenido nutricional, por formar parte de la cultura y tradiciones de los pueblos del país, además su producción se basa en pequeñas unidades, utilizando sistemas de producción agro-ecológicos, que aseguran que los productores tienen acceso a la tierra, por medio de acciones genuinas de redistribución. La obtención de amaranto garantiza la generación doméstica de alimentos y materias primas, avalando con ello estabilidad en el abasto alimentario básico, al margen de las fluctuaciones del mercado internacional y generando un flujo estable de materias primas para la industria de transformación. Un aspecto primordial es que permite, el arraigo de los productores familiares en el campo, ya que sólo ellos pueden llevar a la práctica dichos objetivos y las nuevas tareas que la agricultura está llamada a cumplir en un contexto de la sustentabilidad. Al mismo tiempo 328

A.V. Ayala Garay et al.

que se evitan mayores presiones en el mercado laboral nacional, que no está en condiciones de absorber a la población expulsada del sector rural, y que se contiene la creciente tendencia a la emigración dentro del país y hacia los Estados Unidos. Por otro lado, permite asegurar que haya una alimentación con calidad, de acuerdo con las necesidades del mercado interno, el bienestar de los mexicanos y el medio ambiente. COMENTARIOS FINALES La producción de amaranto va en aumento, a pesar de que las unidades de producción se caracterizan por ser pequeñas. Se considera al cultivo como un grano versátil para la transformación e industrialización, puede utilizarse como cualquier cereal; lógicamente con mayores ventajas nutricionales. El amaranto presenta una gran importancia en la agricultura y alimentación debido entre otras razones, a su alto contenido de proteínas, sus usos múltiples en la alimentación. Este cultivo se constituye como una importante fuente de empleo, en actividades agrícolas, en procesamiento agroindustrial, en comercialización, en diversas actividades y servicios colaterales. Cumple con los requisitos básicos que permiten asegurar la soberanía alimentaria en los pequeños productores de la región centro del país, sin embargo, es necesario hacer mayor promoción de los beneficios del cultivo de amaranto entre los consumidores para poder incrementar su demanda y que sea considerado como un cultivo básico y estratégico para México. Cabe resaltar, la falta de datos estadísticos a nivel internacional e incluso nacional, sobre todo en la parte de comercio, dada la poca relevancia que han dado a este cultivo. LITERATURA CITADA Alejandre Iturbide, Gabriel y Federico Gómez Lorence (1986) Cultivo del amaranto en México. Colección Cuadernos Universitarios. Serie Agronomía No. 12. Universidad Autónoma Chapingo. México.

Capítulo XXII. El cultivo de amaranto en México, descripción de la cadena, implicaciones y retos

Asociación Mexicana del Amaranto (2012) Centro de Información al Consumidor de Amaranto. Consultado el 25 de Septiembre de 2012, de http://www.amaranto.com.mx Bale, J R and C S Kauffman (1992) Special issue on grain amaranth: New potential for an old crop. Food Rev. Int. 8:1-190. Barrales D J S, E Barrales y E Barrales (2010) Amaranto. Recomendaciones para su producción. Universidad Autónoma Chapingo, Plaza y Valdés y Fundación Produce Tlaxcala. México D.F. 166 p Cámara de Diputados del H Congreso de la Unión (2011) Ley de Desarrollo Rural Sustentable. Publicada en el Diario Oficial de la Federación el 7 de diciembre de 2001. Última reforma publicada DOF 26-05-2011. Casas A, A Valiente-Banuet, J L Viveros, J Caballero, L Cortés, P Dávila, R Lira, e I Rodríguez (2001) Plant Resources of The Tehuacán-Cuicatlán Valley, Mexico. Economic Botany 55 (1): 129-166. Centro de Investigación Regional Centro del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. (2010) Variedades Sobresalientes de Amaranto en el estado de Tlaxcala. Hoja desplegable para productores número 8. Tlaxcala, Tlaxcala. Consultado 10 de julio de 2012. Contreras-Castillo J M (2000) La competitividad de las exportaciones mexicanas de aguacate: un análisis cuantitativo. Reporte de investigación No. 46, Centro de Investigaciones Económicas, Sociales y Tecnológicas de la Agroindustria y la Agricultura Mundial (CIESTAM). Universidad Autónoma Chapingo (UACh), México. 42 p. Escalante Escoffié M C (2011) Rescate y revaloración del cultivo del amaranto. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura (IICA). 2010, Fondo CONACYTSAGARPA, COFUPRO e IICA, p. 91.

Estrada León Ángel, Salvador Sahagún Castellanos, José S. Muruaga Martínez, Juan M. Hernández Casillas y Ma. Luisa P Vargas Vázquez. (2006) Guía para la producción de amaranto en el Distrito Federal. Folleto para Productores No. 16. INIFAP. SAGARPA. México. Food Agriculture Organization (FAO) (1997) El cultivo del amaranto (Amaranthus spp.): producción, mejoramiento genético y utilización. http://www.rlc.fao.org/es/agricultura/produ/ cdrom/contenido/libro01/Cap1.htm Hackman, D (2003) Market Opportunities for grain amaranth and Buckwheat grains in Missouri. Missouri Depertament of Agriculture. Report to the federal /state marketing improvement program 1400 independence avenue, Sw Washington D.C. 57 pp. Itenov K and S E Jacobsen. (1996) Field and Laboratory Internal Report: Amaranth. Danish Institute of Plant and Soil Science, Roskilde. 10 p. Komen, J (1992) Grains for the tropical regions. Biotechnology and Development Monitor. Publication of the Ministry of Foreign Affairs and the University of Amsterdam. The Netherlands. 10:3. Martínez Jiménez A (2007) El Cultivo del Amaranto en la Delegación Xochimilco, D.F. En 1er Congreso de Investigación y Transferencia de Tecnología Agropecuaria y Forestal en el Distrito Federal (págs. 293-301). México: Fundación Produce A.C. Distrito Federal. Muñoz Rodríguez Manrrubio, J Reyes Altamirano Cárdenas, Jorge Aguilar Ávila, Roberto Rendón Medel, J Guadalupe García Muñiz y Anastasio Espejel García (2007) Innovación: motor de la competitividad agroalimentaria. Políticas y Estrategias para que en México ocurra. CIESTAAM/PIAI. Universidad Autónoma Chapingo. México.

A.V. Ayala Garay et al.

329

Amaranto: Ciencia y Tecnología

National Research Council. (1989) Lost crops of the Incas. Little known plants of the Andes with promise for worldwide cultivation. National Academy Press, Washington, D.C. Santacruz De León, E E (2011) La producción de Amaranto en el Estado de México, en Observatorio de la Economía Latinoamericana, Nº 157, 2011. Texto completo en http://www. eumed.net/cursecon/ecolat/mx/2011/ Santacruz De León, E E (2011) El amaranto en el estado de Morelos, México; caracterización de su eslabón primario” en Observatorio de la Economía Latinoamericana, Nº 145, 2011. Santacruz De León, E E (2011) La producción de Amaranto en Tlaxcala, México” en Observatorio de la Economía Latinoamericana, Nº 148, 2011. en http://www.eumed.net/ cursecon/ecolat/mx/2011/ Santacruz De León, E E (2010.) Caracterización de la producción primaria de Amaranto en Puebla, México. En Observatorio de la Economía Latinoamericana, Nº 137, 2010. Sauer J D (1976) Grain amaranths. In: Evolution of Crop plants. N W Simmonds (ed). Longman Group Limited, London. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) y Sistema de información agroalimentaria de consulta (SIACON) (2010) Sistema de información agroalimentaria de consulta. México, D. F. Secretaría de Economía. (2009) http://200.77.231.100/work/normas/ nmx/2009/nmx-ff-114-scfi-2009.pdf, fecha de consulta 24/08/2012 (consultado el 12 de septiembre de 2012). Singhal, R.S., and P.R. Kulkami. (1988) Review: amaranths-an underutilized resource. Int. J. Food Sci. Tech., 23:125-139.

330

A.V. Ayala Garay et al.

Sooby J, R Myers, D Baltensperger, D Brenner, R Wilson and C Block (1999) Amaranth production manual for the central United States. Misc. Pub. EC 98-151-S. Univ. Nebraska Cooperative Extension, Sidney. Sørensen, A M and S E Jacobsen (1987) Amarant (Amaranthus sp.). Ugeskrift for Jordbrug 7, 3-8. Trápaga Delfín Y (2005) La soberanía alimentaria el desarrollo rural y la normatividad de la OMC. Universidad Autónoma de México. Junio de 2005. Pp. 25. Yue, S y H Sun (1993) The research and development of grain amaranth in China. In: The research and development of grain amaranth in China (ed. S. Yue). Inst. Of Crop Breeding and Cultivation, Chinese Acad. Agr. Sciences, Beijing. 119. Zarazúa J, A Solleiro, J L Altamirano, R Castañón, R Rendón, R (2009) Esquemas de innovación tecnológica y su transferencia en las agroempresas frutícolas del estado de Michoacán. Revista Estudios Sociales 17(34): 37–71. Entrevistas a informantes clave Cerezo Barreto Jesús Emigdio (2012). Entrevista directa a informante clave. Facilitador del Sistema Producto de Puebla. Mayo de 2012. Espitia Rangel Eduardo (2012). Entrevista directa a informante clave. Investigador del CIRCE, INIFAP. Agosto de 2012. Manrique de Lara Soria. B. (2011). Entrevista directa a informante clave. Presidente de San Miguel de Proyectos Agropecuarios Sociedad de Producción rural. Noviembre de 2011.

Capítulo XXIII

La rentabilidad del amaranto en la Región Centro de México PROFITABILITY OF GRAIN AMARANTH IN CENTRAL MEXICO

Alma Velia Ayala Garay1, Lorena Cortes Espinoza1, Patricia Rivas Valencia1, Micaela de La O Olán1, Diana Escobedo López2, Eduardo Espitia Rangel2. 1INIFAP Campo Experimental Valle de México, Km.18.5 Carretera Los Reyes-Lechería, Texcoco Estado de México C.P. 56230, Tel. 01(595) 955 76 25; 2 INIFAP Campo Experimental Bajío, Celaya, Guanajuato Autor para correspondencia: [email protected]

RESUMEN El cultivo del amaranto es una alternativa para los agricultores sobre todo en las zonas de temporal de la región centro del país, porque, además, de tener características nutricionales, tiene características agronómicas que lo identifica como un cultivo alternativo en donde otros cultivos no se pueden adaptar; en suelos secos, zonas montañosas y altas temperaturas. El objetivo de este estudio fue determinar la rentabilidad de la producción de amaranto para grano de las principales zonas productoras en la región centro del país. Para ello, se utilizó información de producción y costos por hectárea de 2011 de los estados de Morelos, Puebla y Tlaxcala, los datos se obtuvieron de entrevistas directas con los productores mediante un cuestionario. Los resultados encontrados muestran que en Puebla se tiene una mayor rentabilidad, a pesar de que no varía muchos sus costos con respecto a los de Morelos; sin embargo, en cuanto al rendimiento en Puebla fue mayor. La rentabilidad más baja, se obtuvo en Tlaxcala, donde, tanto costos como rendimiento también fueron los más bajos. No obstante lo anterior es una opción productiva para los lugares sobre todo de temporal, debido a que se adapta a condiciones ambientales adversas y por sus características nutracéuticos que van tomando cada día mayor importancia.

Palabras clave: Costos de producción, ingreso, productividad, rentabilidad. ABSTRACT Grain amaranth is an alternative crop for farmers especially in rainfall areas of the central region of the country, due to its nutritional, nutraceutical and agronomic characteristics. Grain amaranth grows well at low water supply and high temperatures. The main objective of this study was to determinate the profitability of production of grain amaranth for the main producer areas in the central region of the country utilizing information of production and cost per hectare of 2011 from the States of Morelos, Puebla and Tlaxcala. Data were obtained from interviews with producers through a questionnaire. Based on the obtained results it can be concluded that the state of Puebla showed the best profitability, despite the production costs do not vary much with respect to Morelos; the state of Puebla showed better grain yields. The lowest profitability and grain yield were obtained in Tlaxcala. Key words: Production costs, income, yield, profitability.

331-340

Amaranto: Ciencia y Tecnología

INTRODUCCIÓN El amaranto tiene excelentes características agronómicas, debido a que se puede adaptar a condiciones ambientales adversas, en donde otros cultivos no se adaptan (Omami et al., 2006). Es decir, el amaranto es una alternativa para los pequeños productores; por tener las características de mayor resistencia a la sequía (Morales et al., 1991; Turriza et al., 1991; López y López, 1991). El grano presenta una gran importancia en la alimentación para México, Desde el punto de vista nutricional es especialmente benéfico para los grupos sociales más vulnerables, como serían los niños y mujeres embarazadas o las que se encuentran en la fase de la lactancia (Espitia, 1991); debido entre otras razones, a que tiene un alto valor nutritivo debido a la cantidad y calidad de sus proteínas; cuenta con el doble de proteína que el maíz y el arroz, y de un 60 a 80% más que el trigo. Es una planta cultivada, domesticada y utilizada en México desde hace más de 7000 años, (Casas et al., 2001; Sauer, 1976), con una gran tradición, ya que su fruto fue utilizado en ofrendas a los dioses en las culturas prehispánicas. En México la producción comercial del amaranto se encuentra concentrada en cuatro regiones: Huazulco y Amilcingo, Morelos; Nativitas, Tlaxcala; San Juan Amecac, Santa Clara Tetla, Tochimizolco, Huaquechula y Temoac, Puebla; Tulyehualco, Mixiquic, Tetelco y Tecómitl en el Distrito Federal (Espitia, 1989; Loza 1991; Ángeles, 1994; Medina, 1995). Además van tomando importancia los lotes que se localizan en Oaxaca, Estado de México, Querétaro, Guerrero, Durango y últimamente Chihuahua y San Luis Potosí (Espitia, 1994; Espitia et al., 2010). Según datos de SAGARPA (2012), la producción del amaranto está retomando niveles de producción importantes. En los últimos 28 años, la superficie sembrada ha crecido a una tasa media anual (tma) de 9.82%, entre 1982-2010; esta tasa refleja la importancia que ha adquirido el amaranto en los últimos años. Uno de los problemas que enfrentan los productores de amaranto es la baja rentabilidad, esto ha sido consecuencia de la caída drástica de los precios medios rurales; además de los altos 332

A.V. Ayala Garay et al.

costos de producción debido a la mano de obra utilizada. En términos reales, entre 1980 y 2010, los precios pagados al productor han decrecido a una tasa media anual de 5.28% (1982-2010), base 2003=100 (SIACON-SAGARPA, 2011 e INEGI, 2012). Mientras que el índice de precios de fertilizantes y específicamente de urea se han incrementado a una tasa media anual de 24.49% y 22.30% respectivamente (base 2003=100) (INEGI, 2012). El comparativo de estos precios se observa que mientras los de los fertilizantes van a la alza, los pagados al productor van a la baja influyendo negativamente sobre la rentabilidad del amaranto. Actualmente, la estructura de costos de producción, la dispersión espacial de los productores, la rentabilidad y el precio de venta de los productos generados por el sector agrícola crean una intrincada red de interacciones que influyen directamente sobre la rentabilidad del mismo producto. En este contexto se hizo necesario un estudio de rentabilidad del cultivo del amaranto en el Centro de México en los estados de Morelos, Puebla y Tlaxcala. METODOLOGÍA La metodología empleada en este estudio, se basó principalmente en trabajo de campo; utilizándose la encuesta como herramienta de trabajo. Éste fue diseñado por los apartados de datos generales, características de producción para los ciclos P-V y O-I, información general del cultivo, manejo postcosecha, comercialización, variables económicas de las unidades de producción, control de calidad, programas de subsidio de gobierno y proceso de transformación. Los sujetos de estudio fueron productores de amaranto para grano de los estados de Morelos (municipio de Temoac), Puebla (municipios de Tochimilco y Cohuecan) y Tlaxcala (municipio de Nativitas). Para lograr lo anterior, se entrevistaron a 193 productores, distribuidos como se observa en el Cuadro 1. Se utilizó una encuesta dirigida , ya que actualmente no se tiene un padrón actualizado de productores dedicados a producir amaranto. Se entrevistaron 193 productores, los cuales acudieron a diversas reuniones, a las que fueron invitados a través de los Sistemas Producto de Morelos, Puebla y Tlaxcala.

Capítulo XXIII. La rentabilidad del cultivo amaranto en la región centro de México Cuadro 1. Distribución de las encuestas por estado.

Estados

Total

Morelos

76

Puebla

86

Tlaxcala

31

Total

193

Las encuestas se aplicaron en los meses de noviembre de 2011 a marzo de 2012, el cálculo de la rentabilidad corresponde al ciclo P-V de 2011; se estimó el costo total de producción y el ingreso total del cultivo. Para cuantificar el costo de producción fue necesario captar a través de un cuestionario todos los desembolsos que se realizaron durante el ciclo productivo en cada estado sujeto del análisis. Además, de información para hacer el estudio de rentabilidad del amaranto, dentro de la encuesta se consideraron otros aspectos como las características socioeconómicas del productor y del proceso de producción. Los precios comerciales utilizados, fueron los que estaban vigentes durante 2011 en las zonas de producción, por ejemplo precios de insumos (semilla, fertilizantes e insecticidas), así como otros involucrados dentro de las actividades de producción, (renta de la tierra, jornales, abono, renta de maquinaria, etc.). También se utilizó el precio medio rural de la zona (P-V 2011) y el rendimiento por hectárea proporcionado por los productores para el mismo año. Para cuantificar la rentabilidad a nivel unidad de producción, se determinó la productividad y los costos de producción y se comparó entre estados. Los costos fueron divididos en dos partes; costos directos y costos indirectos. Dentro de los costos directos se incluyeron los costos de los insumos y medios de producción, tales como semilla, fertilizantes, renta de maquinaria, mano de obra y el costo de oportunidad de la inversión. En los indirectos se incluyó el costo anualizado del mantenimiento de la inversión en capital en maquinaria, renta de la tierra y gastos generales.

Para determinar la rentabilidad se utilizaron las expresiones algebraicas siguientes: CT=PxX; Donde CT = Costo total, Px= Precio del insumo o actividad X y X= Actividad o insumo. El ingreso total por hectárea se obtiene de multiplicar el rendimiento del cultivo por su precio del mercado. La expresión algebraica es: IT= PyY; Donde IT= Ingreso total ($ ha-1), Py=Precio del mercado del cultivo Y ($ t-1); Y= Rendimiento del cultivo (t ha-1). La rentabilidad finalmente es igual: Rentabilidad =IT - CT Producción de Amaranto Según datos de SAGARPA-SIACON, (2012) la superficie sembrada y cosechada, la producción, el rendimiento y el valor de la producción se observa en el Cuadro 2. Donde se observa que Puebla tiene la mayor superficie cosechada (84.38%) y la mayor producción (81.70%), aunque obtiene el menor rendimiento, en cuanto a los tres estados; por lo contrario, Tlaxcala tiene el menor número de hectáreas cosechadas y la menor producción; sin embargo, es el que obtiene el mayor rendimiento. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Dentro de los resultados, los productores encuestados tienen una edad promedio de 48 años, la edad varió de 34 a 72 y apenas el 57% de los entrevistados tiene estudios de primaria (Cuadro 3). Lo cual indica que son productores

1 Esta se emplea en diversas disciplinas tanto sociales (antropología, sociología, pedagogía, trabajo social) como en otras áreas, para realizar estudios de carácter exploratorio, ya que permite captar información abundante y básica sobre el problema. También se utiliza para fundamentar hipótesis y orientar las estrategias para aplicar otras técnicas de recolección de datos. La entrevista estructurada o dirigida se emplea cuando no existe suficiente material informativo sobre ciertos aspectos que interesa investigar, o cuando la información no puede conseguirse a través de otras técnicas. A.V. Ayala Garay et al.

333

Amaranto: Ciencia y Tecnología

con un nivel de estudio bajo. Damián (2007), señala que la apropiación de tecnología agrícola, la edad y el nivel de escolaridad son variables que tienen un alto impacto en el desempeño de las actividades, ya que acceden a folletos y revistas técnicas con información agrícola y son capaces de adoptar nuevas tecnología. En este estudio se encontró que la edad del productor es una variable determinante para las prácticas agronómicas lo que presenta un impacto en el rendimiento del cultivo. Lo anterior también ha sido observado por otros autores como Ruiz et al. (2001); INEGI (2002); Rueda (2003). En la región los entrevistados reconocen que su principal actividad es la agricultura, en donde cultivan primordialmente el amaranto para grano, y entre los cultivos complementarios o secundarios se encuentran en orden de importancia el maíz, frijol, sorgo, cacahuate, hortalizas y trigo. Cabe mencionar que, en Tlaxcala no se identificaron otros cultivos adicionales. Por el contrario, en Morelos hay más diversificación de los cultivos adicionales o complementarios y en Puebla principalmente son maíz y frijol (Cuadro 4). En segundo lugar lo ocupa la actividad comercial, la cual se relaciona directamente con la venta de semilla; la actividad económica agroindustrial tienen mayor importancia en el estado de

Morelos, debido a que hay un mayor número de agricultores que procesan el grano del amaranto. Otra actividad que combinan o complementan con la agrícola es la pecuaria, así como diversos trabajos asalariados. Esto indica que el ingreso lo complementan con varias actividades económicas; por lo que la rentabilidad del amaranto no permite dedicarse únicamente a la producción del grano, por consecuencia algunos productores se dedican hasta tres actividades. Sobre la organización de los productores, el 12.44% pertenece alguna estructura productiva de amaranto, lo que refleja la falta de organización de los productores y bajo nivel de desarrollo de su capital social. Esto implica, por ejemplo, que se enfrentan a los intermediarios que son los que definen el precio al producto y les afecta en gran medida a los costos de producción. El 95% de los productores refirió que una de las limitantes es la falta de organización para la venta de su producto. Si los productores se organizaran tratarían de mantener el rumbo de sus producción de una manera fructífera que buscaría una vida mejor para los socios y sus familias, una mayor autonomía en la toma de decisiones, la conservación de los recursos productivos y una relación más equitativa con el mercado, de este modo se generarían economías de escala.

Cuadro 2. Valor de la producción del amaranto: Superficie cosechada, producción, rendimiento y precio medio rural (2011).

Valor de la

producción

Producción Rendimiento

Estado

(t)

(t ha )

(Miles de pesos)

Puebla

2,493.50

1.18

8,920.44

Morelos

284.00

1.36

4,279.36

Tlaxcala

276.00

1.50

1,220.00

-1

Fuente: Elaboración propia con información del SAGARPA-SIACON, 2012. Cuadro 3. Nivel académico de los productores (%).

Licenciatura

N.D

6.58

1.32

13.16

5.81

0.00

9.30

41.94

3.23

3.23

0.00

24.87

5.70

1.04

9.33

Secundaria Preparatoria

Estado

Ninguno

Primaria

Morelos

1.32

57.89

19.74

Puebla

3.49

58.14

23.26

Tlaxcala

0.00

51.61

2.07

56.99

General

Fuente: Elaboración propia con datos obtenidos de campo. N.D.= No Disponible.

334

A.V. Ayala Garay et al.

Capítulo XXIII. La rentabilidad del cultivo amaranto en la región centro de México Cuadro 4. Frecuencia de agricultores por producto cultivado.

Cultivo

Total

Morelos

Puebla

Tlaxcala

Maíz

58

9

49

0

Frijol

41

2

39

0

Sorgo

12

11

1

0

Hortalizas

5

1

4

0

Cacahuate

5

5

0

0

Trigo

2

0

2

0

Elaboración propia con datos obtenidos de campo. Cuadro 5. Número de productores por tipo de tenencia de la tierra y superficie promedio por productor.

Estado

Ejidal

Propiedad

Comunal

privada

Total

Sup. promedio

(ha)

Sembrada (ha/productor)

Puebla

67

12

1

150.80

1.90

Morelos

56

2

0

257.01

4.01

Tlaxcala

11

20

0

46.50

1.50

Total

134

34

1

454.4

2.52

Fuente: Elaboración propio con datos obtenidos en campo.

La producción en superficies menores de 5 ha, en promedio siembran 2.52 ha, lo que los caracteriza por ser minifundistas, por otro lado, en su mayoría (81.2%) cultivan tierras ejidales y aproximadamente el 70% son ejidatarios (Cuadro 5). El amaranto se produce en condiciones de temporal, en rendimiento se obtienen en promedio 1.52, 1.43 y 1.02 toneladas por hectárea en Puebla, Morelos y Tlaxcala, respectivamente. Los datos anteriores son similares a lo mencionado por Cortes et al. (2011), quienes indican que el rendimiento promedio para 2010 fue de 1.5, 1.6 y 1.12 toneladas por hectárea en Puebla, Morelos y Tlaxcala, respectivamente. En cuanto al rendimiento promedio de la región, los productores obtienen 1.46 toneladas por hectárea, este promedio está por debajo del nacional que es de 1.66 ton/ha, incluso durante 2009/2010 en Guanajuato se obtuvieron hasta 3 toneladas. En el escenario actual, la producción primaria de amaranto demanda una gran cantidad de mano de obra, sobre todo en la cosecha, que de manera generalizada se realiza manualmente 24 jornales por ha; mano de obra familiar, en Tlaxcala ésta contribuye en promedio con 3.7 integrantes que participan durante todo el proceso, en Puebla con 3.4 jornales y en Morelos con 3.2 integrantes, de

acuerdo a Cortés et al. (2011) mencionan que si bien se genera empleo en la región, esto influye en el incremento de los costos de producción (Cuadro 6). Análisis de rentabilidad del cultivo Para el cálculo de la rentabilidad, se obtuvieron promedios, según el total de productores encuestados por cada estado, los resultados se presentan en el Cuadro 7. Rendimientos En la producción obtenida por ha, se encontró que Tlaxcala tiene el menor rendimiento y Puebla el mayor, (Cuadro 7). La importancia de tener una mejor productividad, radica en que los costos unitarios disminuyen. Costos por hectárea y tonelada En Tlaxcala, el costo por ha es menor, al igual que el rendimiento, por lo que las ganancias son menores. El costo más alto se registró en Morelos, mientras que en Puebla es menor (Ver Cuadro 7). De acuerdo a lo anterior, en Morelos se tiene el mayor costo de producción por ha; sin embargo, al obtener un mayor rendimiento promedio, el costo por tonelada es menor, lo que repercute directamente en el ganancia unitaria. Por estado, los productores de Tlaxcala realizan una mayor inversión en la adquisición A.V. Ayala Garay et al.

335

Amaranto: Ciencia y Tecnología

de insumos en comparación a los otros dos estados. En labores mecanizadas Puebla invierte más y en el caso de labores manuales, Tlaxcala es el que tiene un mayor costo. En la Figura 1 se observa que la ganancia unitaria disminuye si el costo por tonelada aumenta, en Puebla se presentan los mejores rendimientos, por lo que también se obtiene la mejor utilidad. En Tlaxcala, los costos de producción unitarios elevados están relacionados con los bajos rendimientos que los productores obtuvieron. Es indispensable que los productores ubiquen sus costos por tonelada similares al precio pagado al agricultor, el cual puede ser alcanzado por un mejor uso de la tecnología que permita incrementar los rendimientos. La estructura de los costos por hectárea tiene a los gastos en labores manuales como el rubro más importante, el cual acapara 37% de los costos totales, le sigue el uso de insumos con 21%, después labores mecanizadas con 19% y después la renta de la tierra con 13%. Finalmente, gastos generales e intereses, que suman 10% (Figura 2). Los factores que han limitado la productividad de amaranto son aspectos tecnológicos, como el uso inadecuado de fertilizantes, uso de semilla criolla y falta de asesoría técnica hacen que se tengan rendimientos bajos. En el Cuadro 8 se muestra la inversión y utilidad de los productores tomando en consideración rendimientos, precio de venta del amaranto por hectárea, utilidad bruta, factor rentabilidad (ingreso/costo de producción). Bajo estas condiciones, los costos de producción de amaranto, se ven afectados por la productividad, lo que repercute directamente en las ganancias unitarias. La menor utilidad se explica por los bajos rendimientos, que debido a la falta de tecnología utilizada (semilla criolla,

fertilización inadecuada, bajo o nulo control de plagas, etc.), hacen que los costos se incrementen de manera significativa. Los problemas técnicos que enfrentan los productores son elementos que conducen a la necesidad de realizar un programa de transferencia de tecnología y capacitación continuo, que detecte las necesidades del productor, con la finalidad de mejorar la producción y la productividad, así como minimizar los riesgos que se tienen. Las prácticas agrícolas en la región son, en términos generales, eficientes, sin embargo, el productor requiere de paquetes tecnológicos que le permitan hacer frente a los aspectos de control de plagas malezas y enfermedades en su cultivo. Para incrementar la productividad bajo condiciones de temporal, se requiere generar procesos de innovación que incrementen los rendimientos por unidad y con ello sea rentable el cultivo. Es relevante mencionar que no se trata sólo de mejorar la rentabilidad, sino la competitividad del cultivo, para lo cual se requiere entre otras del uso de variedades mejoradas y programas de innovación tecnológica, el conocimiento y manejo del mercado que permitan a los agricultores tener certidumbre respecto a los precios y a la comercialización de su producto, la presencia de organizaciones eficaces, adecuadas políticas públicas, diferenciadas para regiones y tipo de productores, que brinden apoyos integrales para lograr un desarrollo sustentable. Existen resultados de investigaciones por autores como Villasana (1985), Jaik-Dipp y Tena-Flores (1990), De Macvean (1997), Cai y Corke (1999) que han referido que los costos de producción para los productores son muy altos y que eso lleva a que las ganancias sean menores, pero a pesar de esto siguen siendo fieles a la siembra del cultivo (Enama, 1994; Judd, 2008; Sánchez 1980, 1991).

Cuadro 6. Precio promedio del jornal por día.

Estado

$ por día

Morelos

148

Puebla

106

Tlaxcala

127

Promedio

125

Fuente: Elaboración propia con datos obtenidos en campo.

336

A.V. Ayala Garay et al.

Capítulo XXIII. La rentabilidad del cultivo amaranto en la región centro de México Cuadro 7. Costos de producción y utilidad por tonelada. Morelos

Tlaxcala

Semilla

75.6

100.3

104.2

3.4

Abono

930.6

1,328.2

1,104.8

,121.2

Fertilizante

2,350.0

2,048.8

2,973.2

2,457.3

Insecticidas

331.0

370.0

142.6

281.2

Insumos

3,687.2

3,847.3

4,324.8

3,953.1

Labores mecanizadas

4,208.5

3,379.0

2,655.0

3,414.2

Labores manuales

5,607.0

7,348.0

7,637.0

6,864.0

13,502.7

14,574.3

14,616.8

14,231.3

Renta de la tierra

3,200.0

2,522.0

1,570.0

2,430.7

Gastos generales

1,080.2

1,165.9

1,169.3

1,138.5

615.7

664.6

666.5

648.9

Concepto

Puebla

Costo directos ($ ha-1)

Costo de oportunidad Costo indirectos Costo total

Promedio

4,895.9

4,352.5

3,405.9

4,218.1

18,398.6

18,926.9

18,022.6

18,449.4

Rendimiento (t ha )

1.4

1.5

-1

1.3

1.0

Costo por tonelada ($ t-1)

12,104.4

13,235.6

17,669.2

14,336.4

Precio ($ t-1)

18,000.0

18,000.0

18,000.0

18,000.0

5,895.6

4,764.4

330.8

3,663.6

Utilidad ($ t-1)

Fuente: Elaboración propia con datos obtenidos en campo. 20,000 18,000 16,000 14,000 $

12,000 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 0

Puebla Costo por hectárea

Morelos Costo por tonelada

Tlaxcala Utilidad por tonelada

Figura 1. Costos de producción y utilidad por tonelada. Fuente: Elaboración propia con datos obtenidos en campo. Gastos generales 6%

Costos de oportunidad 4%

Insumos 21% Renta de la tieierra 6%

Gasto direco ($ ha-1) 0% Labores mecanizadas 19%

Labores manuales 37%

Figura 2. Promedio de la estructura de costos. Fuente: Elaboración propia con datos obtenidos en campo. A.V. Ayala Garay et al.

337

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Según Ziesemer (2007), existe un potencial para el incremento en la producción si se aumenta la rentabilidad y el consumo. Para ello, una opción es la transformación de la producción al sistema orgánico, lo que puede abaratar los costos de cultivo abrir nuevos mercados y permitir obtener mejores precios por las cosechas; traduciéndose en un mejor nivel de vida para los productores de amaranto.

cultivo, sin embargo, los productores demandan un paquete tecnológico adecuado que les permita incrementar el rendimiento, reducir costos de producción y por ende incrementar sus ganancias. Adicionalmente, por la diversidad de uso del amaranto, es una alternativa potencial para el productor por ser un cultivo versátil en su aprovechamiento.

Cuadro 8. Inversión y utilidad de una hectárea en cada estado.

Concepto

Puebla

Morelos

Tlaxcala

producción ($ ha-1)

17,027.69

17,451.33

16,420.37

Rendimiento (t ha-1)

1.52

1.43

1.02

-1

Precio de venta ($ t )

18,000.00

18,000.00

18,000.00

Ingreso total ($ ha )

27,360.00

25,740.00

18,360.00

Utilidad bruta ($ ha-1)

10,332.31

8,288.67

1,939.63

1.61

1.47

1.12

Costo total de

-1

Factor de rentabilidad (Precio de venta/costo de producción) Fuente: Elaboración propia con datos obtenidos en campo.

CONCLUSIONES

LITERATURA CITADA

Los costos de producción del amaranto son altos, esto debido al gran número de mano de obra que se utiliza y aunado a la tendencia del índice de los precios pagados al productor que ha ido a la baja; por consecuencia esto influye negativamente a la rentabilidad del amaranto. Sin embargo, los rendimientos han favorecido en los estados de Puebla y Morelos; en Tlaxcala a pesar de se tiene los menores costos de producción, el rendimiento es bajo a comparación de los encontrados en Puebla y Morelos; por lo que en Tlaxcala se obtuvo la menor rentabilidad. Por otro lado, el amaranto tiene enormes posibilidades y perspectivas técnicas de desarrollo, entre otras, el mejoramiento genético, la mecanización, etc. En el proceso de producción se demanda una gran cantidad de mano de obra, que de manera generalizada se realiza manualmente, si bien influye en los costos de producción, también permite la generación de empleos y el arraigamiento de los pobladores a su lugar de origen. Además, las características agroclimáticas y edáficas en la Región Centro son adecuadas y propicias para el

Ángeles A R (1994) Costos de producción del amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) en el municipio de Atzitzihuacán, Puebla. Tesis Profesional en Agronomía. Universidad Autónoma Chapingo, Estado de México, México. 140 p.

338

A.V. Ayala Garay et al.

Barrales D J S, E Barrales y E Barrales (2010) Amaranto. Recomendaciones para su producción. Universidad Autónoma Chapingo, Plaza y Valdés y Fundación Produce Tlaxcala. México D.F. 166 p. Cai Y y Corke H (1999) “Amaranthus betacyanin pigments applied in model food systems”, Journal of Food Science 64 (5):869-873. Casas A, A Valiente-Banuet, J L Viveros, J Caballero, L Cortés, P Dávila, R Lira, e I Rodríguez (2001) Plant Resources of the Tehuacán-Cuicatlán Valley, Mexico. Economic Botany 55 (1): 129-166.

Capítulo XXIII. La rentabilidad del cultivo amaranto en la región centro de México

Cortés E L; R E Espitia, V P Rivas, y C J M Hernández (2009) Diagnóstico socioeconómico de la producción de amaranto en Valles Altos. VI Reunión Nacional de Innovación Agrícola. León, Guanajuato, México. p. 327.

López de J R y V L López (1991) Factores edafológicos externos donde se desarrolla Amaranthus hybridus. I Congreso Internacional del amaranto. Oaxtepec, Morelos, México. p. 48.

Enama M (1994) “Culture: The missing nexus in ecological economics perspective”, Ecological Economics 10 (10): 93-95.

Loza P A (1991) El cultivo, transformación y comercialización del amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) en Tlaxcala. I Congreso Internacional de amaranto. Oaxtepec, Morelos, México. p. 116.

Espitia Rangel E (1994) Breeding of grain Amaranth. In: Paredes-López O (ed). Amaranth biology, chemistry and technology. CRC Press, Boca Raton, Fl. pp: 23-38. Espitia Rangel E (1991) Informe de avances en la investigación en amaranto. Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales y Agropecuarias. CIRCE. Cevamex. Chapingo, México. 1992. 76 pp. Espitia Rangel E (1989) Guía cultivar amaranto en Valles Altos de la Mesa Central. INIFAPCEVAMEX. Folleto para productores No. 18. 13p. Espitia Rangel E; S C Mapes, L D Escobedo, O M De la O, V P Rivas, T G Martínez, E L Cortés, y C J M Hernández, (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de amaranto en México. INIFAP, México. 200 p. FAO (1997) El cultivo del amaranto (Amaranthus spp.): producción, mejoramiento genético y utilización. http://www.rlc.fao.org/ es/agricultura/produ/cdrom/contenido/libro01/ Cap1.htm Jaik-Dipp A y J A Tena-Flores (1990) “Optimización del proceso de tostado de la semilla de alegría (Amaranthus hypochondriacus) y el diseño de un prototipo de tostadora”, El amaranto. Amaranthus spp., su cultivo y aprovechamiento. El Colegio de Posgraduados, México. Judd R M (2008) Plant systematics: A phylogenetic approach, 3ª edición. Sunderland, ma: Sinauer Associates, pp: 123-143.

MacNeish R (1970). The Prehistory of the Tehuacán Valley. Texas: University of Texas Press. Medina R J J (1995) Estudio de rentabilidad técnico-financiero del cultivo y elaboración del dulce de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) en el oriente del Estado de México. Ciclo 1993. Tesis Profesional en Agronomía. Universidad Autónoma Chapingo, Estado de México, México. 120 p. Morales R M; R J E Treviño, F H Rodríguez y B J Aldape (1991) Estudio de ocho genotipos de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L. y A. cruentus) en dos fechas de siembra, ciclo temprano 1988 en Marín, Nuevo León. I Congreso Internacional del amaranto. Oaxtepec, Morelos, México. p. 35. Omami E N, P S Hammes, P J Robbertse (2006) Differences in salinity tolerance for growth and water-use efficiency in some amaranth (Amaranthus spp.) genotypes. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 34:11–22. Rojas Soriano Raúl (1991) Guía para realizar investigaciones sociales. P.E. Plaza y Valdés (P Y V), ED. México p.130. Sánchez E M, R E Espitia, y K S Osada (1991) Etiología de la mancha negra del tallo (Macrophoma sp.) en el Amaranto (Amaranthus sp.), I Congreso Internacional del Amaranto. Oaxtepec, Morelos. p. 67.

A.V. Ayala Garay et al.

339

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Sánchez M A (1980) Potencial agroindustrial del amaranto. México: Centro de Estudios Económicos y Sociales del Tercer Mundo. Sauer J D (1976) Grain amaranths. In: Evolution of Crop plants. N W Simmonds (ed). Longman Group Limited, London. pp: 4-7. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) y Sistema de información agroalimentaria de consulta (SIACON) (2010) Sistema de información agroalimentaria de consulta. México, D. F. Tena F J A (2001) Calidad de la proteína del amaranto predicha por el ensayo del C-PER. I Seminario Nacional del Amaranto, Vol. 2. Chapingo, Estado de México. Turriza E L; C M Burgos, H A Rodríguez, M R Gutiérrez y R M Naal (1991) Adaptación de cuatro variedades de amaranto de grano (Amaranthus hypochondriacus L. y A. cruentus). Villasana G F A (1985) Características morfológicas y fisiológicas que confieren resistencia a la sequía al amaranto (A. hypochondriacus L.), Tesis Profesional en Agronomía. Universidad Autónoma de Chapingo, Estado de México. México. Ziesemer, Jodi (2007) Energy use in organic food systems. Natural Resources Management and Environmental Department. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome. http://www.fao.org/docs/eims/ upload/233069/energy-use-oa.pdf (Consultado el 26 de mayo de 2009).

340

A.V. Ayala Garay et al.

Capítulo XXIV

Formas de consumo del amaranto en México CONSUMPTION FORMS OF GRAIN AMARANTH IN MEXICO

Diana Escobedo-López1, Alma Velia Ayala Garay2, Luz Gabriela Campos Silva1 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Bajío1; Campo Experimental Valle de México2 Autor para correspondecia: [email protected]

RESUMEN El objetivo principal de esta investigación fue identificar los diversos productos elaborados a base de amaranto, con la finalidad de conocer los puntos de venta en los que se distribuyen, clasificar el proceso que lleva el amaranto para su elaboración, verificar el contenido de amaranto en cada producto, comprobar la calidad y limpieza de los productos terminados. Se llevó a cabo en la zona centro de México: San Luís Potosí, Guanajuato, Querétaro, Estado de México, Distrito Federal, Tlaxcala, Morelos y Puebla, durante los meses de mayo a julio de 2012. Se visitaron cadenas comerciales, tiendas de oportunidad, artesanales y naturistas, donde se compraron diversos productos comestibles que contenían amaranto. Se realizó una clasificación en la que se tipificó cada producto por contenido de amaranto, precio, contenido neto, limpieza, ingredientes extras y localidad de venta. Se concluye que la mayor parte de productos elaborados con amaranto no solo corresponden a dulces de tipo artesanal, en los que destacan las alegrías o palanquetas, si no que la mayoría de los productos encontrados se manejan como cereal (52.04%); además que el 47.3% de los productos contienen más del

95% de amaranto, y en cuanto a la calidad y limpieza el 68.03% de los productos se clasificó como excelente. Existe una demanda creciente de amaranto, principalmente, en el mercado nacional de la confitería. Palabras clave: precios, transformación, comercialización, calidad y valor. ABSTRACT The main objective of this research was to identify the various products made out of amaranth, know the outlets in which are distributed, classify the preparation process, verify the amaranth content of products and test quality and cleanliness of the end products. The study was carried out in San Luis Potosí, Guanajuato, Queretaro, State of Mexico, Mexico City, Tlaxcala, Morelos and Puebla states, during May to July 2012. Retail chains, convenience stores, craft and naturists were visited in order to buy edible products containing amaranth. Products were classified by amaranth content, price, cleanliness, extra ingredients and sale location. The conclusion was that the majority of products made out of amaranth do not correspond to traditional candies (alegría or crowbars), since 341-354

Amaranto: Ciencia y Tecnología

52.04% products were different types of cereals. In addition, the 47.3% of products contain more than 95% of amaranth; and in terms of quality and cleanliness, 68.03% products were classified as excellent. There is a growing demand for amaranth, mainly in the domestic market of confectionery. Key words: prices, processing, marketing, quality and value. INTRODUCCIÓN El amaranto tiene múltiples usos tanto en la alimentación humana y animal como en la industria, medicina y en la ornamentación. Para la alimentación humana se usa el grano entero o molido en forma de harinas, ya sea tostada, reventada o hervida, las hojas tiernas en reemplazo de las hortalizas de hoja, con los granos enteros o molidos se puede preparar desayunos, sopas, postres, papillas, tortas, budines, bebidas refrescantes y otros (Singhal y Kulkarni, 1988). Desde el inicio de la historia se recolectaban las hojas y tallos jóvenes que servían como alimento (Sauer, 1950). En la época de los aztecas el amaranto se consideraba un alimento importante, además que lo usaban en ceremonias y festividades religiosas, pues con masa de harina de amaranto a la que le llamaban Zoale, hacían figuras de sus dioses para venerarlos y después comerlos a manera de comunión. Otro uso que le daban a este cultivo era hacer atoles y tamales con la semilla (Sauer, 1967; Early, 1978). El cultivo tiene una amplia gama de usos en la alimentación humana debido a su alto contenido y calidad biológica de proteínas y su elevado aporte de vitamina E (ParedesLópez et al., 1990). Además, el amaranto puede ser postulado como un cultivo potencial para aliviar problemas alimentarios y de desnutrición (Paredes-López et al., 1994). En 1698 aparece la palabra “alegría”, nombre que se le da al dulce elaborado con semilla de amaranto reventado y que en la actualidad se sigue conociendo (Sauer, 1950). Este dulce es uno de los principales productos en la actualidad, quedando en segundo término otros productos como el atole y los tamales. De acuerdo a Hernández y Herrerías (1998) este cultivo puede consumirse casi desde 342

D. Escobedo-López et al.

la siembra, en forma de germinado, de hojas tiernas en ensalada, o molidas para servirse en forma de sopa. Su digestibilidad es muy alta, alcanzando entre el 80 y el 92%. Puede aportar alimento a la familia a todo lo largo del ciclo de cultivo por su abundante producción de hojas, que son ricas en vitaminas, proteínas y minerales, entre los que destaca el hierro, además del calcio y el fósforo. La hoja de amaranto tiene más hierro que la espinaca, lo que la hace ideal para evitar la anemia que afecta principalmente a mujeres embarazadas y a niños. Además de consumirse fresca, la hoja puede deshidratarse y molerse para conservarla en forma de polvo. Después de la cosecha, el grano puede emplearse como cereal, tostado y molido para hacer harina y gran cantidad de derivados. De acuerdo con Escalante (2010), el amaranto tiene una serie de aplicaciones análogas al de los cultivos básicos, principalmente del maíz, que van desde dulces artesanales, granolas, harinas integrales, alimentos extruídos (frituras), panificados, pastas; hasta productos más sofisticados como aceites comestibles, papillas para bebés, concentrados proteicos, barras energéticas, alimentos nutracéuticos especiales para prevenir diabetes o cáncer y productos para personas mayores. Las galletas y panes adicionados con harina de amaranto son un alimento hipoalergénico para los que padecen intolerancia al gluten, y no pueden consumir panificados a base de harina de trigo. Sólo en Europa hay más de diez millones de personas con este padecimiento; dato que permite dimensionar la potencialidad de estos productos en el mercado (Escalante, 2010). Según la Asociación Mexicana de Amaranto (2003), el grano de amaranto posee aproximadamente un 16% de proteína, un porcentaje un poco más alto que el de los cereales tradicionales: el maíz 9.33%; el arroz 8.77% y el trigo 14.84%. Sin embargo, su importancia no radica en la cantidad sino en la calidad de la misma con un excelente balance de aminoácidos. Además, la digestibilidad de su grano es del 93%. Cuando se realizan mezclas de harina de amaranto con harina de maíz, la combinación resulta excelente, llegando a índices cercanos del 100, porque el aminoácido que es deficiente en uno abunda en el otro.

Capítulo XXIV. Formas de consumo del amaranto en México

Por otro lado, de acuerdo a Jacobsen (2002) el amaranto tiene un nivel alto de lisina, metionina y cisteina, con leucina como el aminoácido limitante. El contenido de proteínas y lípidos fue mayor en amaranto que en trigo, que normalmente contiene 10-14% de proteínas y 2% de lípidos. En la avena y el maíz el contenido de lípidos es de aproximadamente 6%. La quinoa, especie bastante relacionada al amaranto, contiene 13-18% de proteínas y 6% de lípidos (Repo-Carrasco et al., 2001). Todo lo anterior, lo hacer un producto ideal para el consumo humano, Dada la importancia que ha ido adquiriendo este producto en la alimentación y su prioridad en la demanda del producto en el mercado, ya que ha logrado captar un creciente interés debido a su potencial como alimento y su calidad nutritiva (Martínez Jiménez, 2007; Kauffman, 1992; Mujica et al., 1999) surge el interés de identificar la diversidad de productos elaborados con amaranto en la actualidad y verificar los puntos de venta en los que se comercializan. Además de clasificar el proceso que lleva el amaranto para su elaboración, verificar el contenido de en cada consumible y comprobar la calidad y limpieza de los productos terminados. Para lograr el objetivo planteado, durante los meses de mayo a julio de 2012, se visitaron cadenas comerciales, tiendas de oportunidad, tiendas artesanales y tiendas naturistas, en las cuales se compraron diversos productos comestibles que contenían amaranto en su preparación. Se realizaron visitas en los principales estados productores de amaranto, en la zona centro de México: San Luis Potosí, Guanajuato, Querétaro, Estado de México, Distrito Federal, Tlaxcala, Morelos y Puebla. Las tiendas que se visitaron fueron Walmart, Comercial Mexicana, Soriana y Aurrera, otros centros como la Central de Abastos de la Ciudad de México, ubicada en la Delegación Iztapalapa, otro tipo de tiendas como Oxxo y naturistas, además de tiendas ubicadas en las principales zonas productoras. También se hizo compra a vendedores ambulantes. Para el análisis de la información, los productos se clasificaron de la siguiente manera:

1. Presentación, en función del tipo de producto que se refiere: dulces, cereales, fritura, panificación, tostada, pinole y verdura; 2. Proceso de elaboración del producto, grano reventado, harina y grano extruído; 3. Limpieza del producto, el porcentaje de contenido de amaranto, la marca, el precio, el contenido neto de producto, los ingredientes extras en el caso de que sea un producto combinado y la caducidad. 4. Precio, según el tipo de producto. De los productos muestreados se obtuvieron porcentajes de las variables antes mencionadas para conocer las tendencias del mercado y la calidad de los productos. Cabe resaltar que el documento se divide en los siguientes puntos: consumo internacional, consumo nacional, análisis de mercado y consideraciones finales. CONSUMO A NIVEL INTERNACIONAL El consumo de productos de amaranto además de darse en México, también se da en países andinos, de donde es originario; otros países en los que se pueden encontrar productos de amaranto son Perú, Ecuador y Bolivia. En Argentina hay una empresa de producción primaria y transformadora, se conoce que existen producciones experimentales en Cuba. En Estados Unidos a partir de productores locales, existe consumo y comercialización de productos de amaranto a través del principal productor y transformador que es New World Amaranth, quien también ha llegado a proveer al mercado Canadiense (Manrique, 2011). En los últimos años se ha ampliado el mercado de consumo principalmente en el ramo naturista en países industrializados como Estados Unidos, Japón y Alemania. Sin embargo, se ha constatado la presencia creciente de productos elaborados con amaranto destinados al mercado masivo (Escalante, 2010). En Europa el consumo de amaranto como cereal, se hace mezclando amaranto con trigo, linaza y avena entre otros y empleándolo reventado, inflado, como hojuela o cubierto de miel Jacobsen (2002). En los noventas el consumo de amaranto se basaba principalmente en productos que contenían grano reventado, aunque en Estados Unidos ya lo consumía como harina con D. Escobedo-López et al.

343

Amaranto: Ciencia y Tecnología

la que complementaba la mezcla para elaborar panques, muffins y multigranos que promovieran la salud (Paredes-López et al., 1994). El amaranto es utilizado en los Estados Unidos, donde las semillas se combinan con granos de trigo (Triticum aestivum L.) y maíz (Zea mays L.) en productos para desayuno, panes, harina de panques y pasta (National Research Council, 1989), además, se preparan panes de consistencia esponjosa aprovechando sus buenas condiciones para el horneado (Manrique, 2011). La producción comercial de amaranto de grano en los Estados Unidos comenzó a finales de 1970, siendo una producción de 1,000 ha cada año (Sooby et al., 1999). En África, el amaranto es domesticado como verdura, mientras que en otros países, como en Rusia, el amaranto silvestre es usado como forraje (Komen, 1992). En China se usa el amaranto cultivado para grano y forraje (Yue y Sun, 1993). En Dinamarca, la investigación con amaranto se inició en 1986 (Sørensen y Jacobsen, 1987; Itenov y Jacobsen, 1996), pero todavía no está cultivado comercialmente. Los países principales para el cultivo del amaranto de grano son China, India, Kenya, Mexico, Nepal, Perú, los EE.UU., y Rusia (Bale y Kauffman, 1992). Los granos reventados se consumen mezclados con miel de abejas, miel de caña o chocolate, dándole diferentes formas en moldes de madera o metálicos a las que se conoce como turrones de kiwicha en Perú, “alegría” en México y “tadoos” en India. En Nepal, las semillas de amaranto son consumidas como mazamorra llamada “satoo” o la harina se convierte en un alimento llamado “chappatis” (Singhal y Kulkarni, 1988). CONSUMO NACIONAL En México, el consumo del amaranto se remonta a la época prehispánica, pues se le cultivaba desde el tiempo de los aztecas, actualmente se continúa cultivando con una amplia distribución en México (Espitia et al., 2010). La importancia del amaranto como alimento en la época de los aztecas incrementó, además del valor religioso que le daban por ser usado ceremonias y festividades, pues hacían una masa de harina de amaranto a la que llamaban Zoale, para elaborar figuras de sus dioses, venerarlos y finalmente comerlos. También se 344

D. Escobedo-López et al.

menciona que con la semilla de amaranto hacían atoles y tamales (Sauer, 1967; Early, 1978). El cultivo del amaranto se realiza actualmente en pequeñas regiones de México, las que han persistido a través de los años. Las principales zonas productoras son: Tulyehualco, D. F.; Amilcingo y Huazulco, Morelos; San Miguel del Milagro, Tlaxcala y Huaquechula, Santiago Tecla, San Juan Amecac, Tochimilco y Tochimizolco en Puebla. Recientemente se han iniciado siembras en la zona de Tehuacán Puebla, Guanajuato, Querétaro y San Luís Potosí (Espitia et al., 2010). El cultivo es una excelente fuente de alimento debido al alto valor nutricional de sus hojas y semillas. Las semillas contienen un alto grado de proteínas y éstas poseen un mejor balance de aminoácidos esenciales que la mayoría de los cereales y leguminosas (Barba de la Rosa et al., 1992, Schnetlzer y Breene, 1994). En México se prepara con las semillas “tostadas”, molidas o enteras, el conocido plato denominado “atole” y “pinole”, que es una especie de mazamorra, del mismo modo se elaboran los tamales con harina de maíz, tallos y hojas de amaranto picadas, potaje conocido desde la época prehispánica con los nombres de “vauquilitl”, “hoauhquilitl” en México (Jiménez y Cordero, 1986). El aceite de amaranto tiene un gran valor debido a su elevada cantidad de escualeno (Johnson y Henderson, 2002). El amaranto se ha integrado en varios alimentos industrializados como, productos de repostería (panes, pasteles y galletas), productos de extrusión (hojuelas de cereal, tortillas y pastas) (Schnetzler y Breen, 1994; Tapia-Blácido et al., 2009) (Figura 1). El almidón del amaranto está dividido en dos tipos: aglutinante y no aglutinante, el primero es el apropiado para la industria panadera, este almidón también lo tienen los cereales como el arroz, maíz, cebada, sorgo y mijos; el amaranto se puede utilizar en la industria ya que reúne esta primera característica (Okuno y Sakaguachi, 1984); sin embargo, el amaranto podrá ser utilizado en la elaboración de productos panificados que no necesiten expansión debido a que carece de gluten funcional, y podrá ser utilizado en mezclas con harinas de otros cereales (National Research Council, 1984). Al respecto Lorenz (1981)

Capítulo XXIV. Formas de consumo del amaranto en México

Hojas

Consumo Directo Concentrado Protéico Extrusión

Churros

Planta Entera Reventado Cereal Semillas

Molienda Fermentado Germinado Nixtamalizado

Tallo

Alegría Oblea Palanqueta Horchata Rompope Barra Energética Granola Grano Garapiñado

Harina Integral

Atole Mazapan Aceites Pinole

Mezcla

Tortillas Tostadas Pastas Hotcakes Pan Galletas

Forraje

Fracciones

Rica en Proteina

Aceites Aislados

Rica en Almidones

No alimenticio: Aditivos y Jarabes

Figura 1. Categorías de salida de productos de amaranto.

señala que el amaranto puede ser utilizado en la elaboración de panes en sustitución de 10% de harina de trigo, lo que mejoraría la calidad nutritiva y el sabor es descrito como muy parecido al de la nuez y fue preferido sobre el pan hecho con 100% de harina de trigo. ANÁLISIS DE MERCADO En las visitas que se realizaron a los diferentes puntos de venta, se detectaron 244 diferentes productos los cuales se clasificaron por tipo de producto (dulces, cereales, fritura, panificación, tostada, pinole y verdura), el proceso del amaranto para la elaboración del producto (grano reventado, harina y grano extruído), además se tomó en cuenta la limpieza del producto, el porcentaje de contenido de amaranto, la marca, el precio, el contenido neto de producto, los ingredientes extras en el caso de que sea un

producto combinado y la caducidad. De los 244 productos encontrados, 70 son dulces (28.68%); 127, cereales (52.04%); 9, frituras (3.68%);35, productos de panificación (14.34%); 1, tostada (0.42%); 1, Pinole (0.42%), y 1, Verdura (0.42%) (Figura 2). Se puede observar que en presentación de cereal es el de mayor demanda, lo que indica que existe preferencia por parte del consumidor. El amaranto en forma de cereal es distribuido principalmente en los centros comerciales como Walmart, Comercial Mexicana y Soriana. Por tipo de proceso para su elaboración se encontraron que 195 corresponden a grano reventado (79.91%); 42, a harina (17.21%), y 7, extruido (2.88%)(Figura 3). Según los resultados, el amaranto se consume principalmente como grano reventado, del cual se elaboran los siguientes productos D. Escobedo-López et al.

345

Amaranto: Ciencia y Tecnología Tostada 0.42%

Verdura 0.42%

Frituras 3.68%

Pinole 0.42%

Dulces 28.68%

Cereales 52.4%

Figura 2. Clasificación de los productos de amaranto. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis.

finales: alegrías, amaranto (cereal) reventado, granolas, atoles, pinole, mazapán, etc. La importancia de conocer el tipo de proceso radica en que existe un efecto del tostado sobre la disponibilidad de lisina, que contiene el amaranto, ya que uno de sus compuestos nutricionales más valiosos es éste aminoácido; el cual, no soporta temperaturas altas. Los procesos que utilizan calor seco, como el tostado a alta temperatura y reventado, o el expandido

de los granos, pueden disminuir notablemente la disponibilidad de la lisina. Así, la pérdida es significativa en el grano de amaranto reventado en calor seco; lo mismo en la harina tostada, por lo que se debería preferir el consumo en forma hervida, en hojuelas o en extruído. El contenido de amaranto por producto se dividió en los siguientes rangos: menos del 50%, del 51 al 70%, del 71 al 90% y más del 90%. Con base a estos rangos se encontró que

Extruido 2.88%

Harina 17.21%

Grano Reventado 79.91%

Figura 3. Productos de amaranto por tipo de proceso para su elaboración. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis.

346

D. Escobedo-López et al.

Capítulo XXIV. Formas de consumo del amaranto en México

23 productos contienen menos del 50% de amaranto (9.43%); 27, del 51 al 70% (11.07%); 77, del 71 al 90% (31.55%), y 117, más del 90% (47.95%) (Figura 4). De lo anterior, se puede mencionar que el que un producto tenga mayor contenido de amaranto es garantía de que es un producto de mayor calidad nutricional, sin embargo, es importante resaltar que también en algunos casos, son productos que no presentan fechas de caducidad. En relación a la limpieza los productos encontrados se clasificaron en tres rangos: 1. Excelente. Cuando están empaquetados herméticamente y no presentan elementos extraños al producto ni daños físicos.

2. Bueno. Cuando podrían presentar daños físicos, el empaquetado no es totalmente hermético, podían tener residuos propios del amaranto pero sin contaminación de otros elementos. 3. Malo. Cando no cumplían con las normas de sanidad mínimas establecidas y su empaque mostraba un aspecto poco apetecible y hasta sucio. Para estos rangos se tuvieron 166 en calidad excelente (68.03%); 58, buena calidad (23.77%), y 20, mala calidad (8.20%) (Figura 5). Los productos con calidad excelente, en general fueron adquiridos en los centros comerciales y cadenas de autoservicio. Los

Menos de 50% 9.43% 51 a 70% 11.07%

Más de 90% 47.95%

71 a 90%% 31.55%

Figura 4. Porcentaje de contenido de amaranto en productos comprados. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis. Mala 8%

Buena 24%

Excelente 68%

Figura 5. Calidad y limpieza de los productos de amaranto. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis. D. Escobedo-López et al.

347

Amaranto: Ciencia y Tecnología

productos clasificados como de mala calidad fueron encontrados en pequeñas tiendas artesanales o con comercializadores ambulantes. Cabe resaltar que los granos de amaranto, en cualquiera de sus grados de calidad, deben estar exentos de sabores y olores extraños, y presentar color típico de la variedad. Dentro de la clasificación que se hizo con los 70 dulces encontrados se tiene que 41 de ellos son alegrías (58.57%); cuatro son dulces cubiertos de amaranto (garapiñados, bombones, choco-hojuela) (6.34%); cinco son obleas (7.9%); 17 son palanquetas (barras compactadas de amaranto reventado con cacahuate, avena, coco, pasas, nuez, pepitas, entre otros) (24.28%); se encontró un polvo de amaranto para preparar horchata de amaranto (1.58%); además encontramos una muestra de mazapán (1.58%) y una bebida de rompope (1.58%)(Figura 6). Se sabe de otros productos como no convencionales nieve, pulque, tlayudas, tortillas, guisados, etc., (Espitia et al., 2010). Es importante mencionar que de acuerdo a Escalante (2010), la forma más conocida de comer amaranto es como “alegría”, ésta palanqueta se ha diversificado en los últimos años al adicionarle otros productos como chocolate, miel, nuez, pasas, linaza, arándano, etc., las presentaciones varían de círculos a cuadrados y rectángulos de diferentes tamaños y cubitos en bolsas de papel celofán; de igual manera hay variaciones en colores.

Mazapán 1.58%

Rompope 1.58%

Sobre los precios de los dulces se dividieron en cinco rangos: de $2.00 a $10.00 por producto, de $11.00 a $15.00, de $15.50 a $18.00, de $18.50 a $25.00 y de $25.00 a $36.00, donde se encontraron 40 productos en el rango de $2 a $10 (57.15%); 16, $11 a $15 (22.86%); 4, $15.50 a $18 (5.71%); 3, $18.50 a $25 (4.28%), y 7, $25 a $36 (10%). El producto se concentra principalmente en el de menor precio, por lo que la mayoría de la población que consume amaranto lo relaciona con una golosina, sin saber que a un bajo costo adquieren un alimento con un gran potencial de proteínas. Una de las razones del desconocimiento de las propiedades del producto, es que en México no existe información de las bondades que tiene este producto y las diferentes formas de consumirlo, por lo que no hay una cultura de comer amaranto a pesar de ser un cultivo tan tradicional como el maíz y el frijol. Con menor popularidad, pero con mayor representación en el mercado, los productos como cereales, que se expenden preferentemente en tiendas naturistas y de autoservicio así como también amaranto reventado en bolsas de 250 g para ser consumido como cereal. Para este grupo de cereales se encontraron 127 y se clasificaron de la siguiente manera: barritas energéticas con 94 productos (74.01%); 20, a base de grano reventado (15.75%); 12, granola (9.45%), y un producto de grano garapiñado (0.79%).

Horchata 1.58%

Palanqueta 24.28%

a)

Alegría 58.57%

Oblea 7.9%

Cubierto 6.34%

348

D. Escobedo-López et al.

Capítulo XXIV. Formas de consumo del amaranto en México

$18.5-25 4.28%

$25.5-36 10%

$15.5-18 5.71%

b)

$2-10 57.15%

$10.5-15 22.86%

Figura 6. a) Clasificación de dulces. b) Costos de dulces. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis.

Las empresas dedicadas a la transformación de cereales ubicadas compran la semilla para reventarla, procesarla y elaborar barras energéticas, harinas y alimentos proteínicos. Los cereales, como barritas integrales, son un alimento que además de ser nutritivo y gustar tanto a niños como a grandes, son concentrados proteicos, y alimentos nutracéuticos. Los precios de estos se agruparon en los siguientes rangos: de $1 a $5, $5.5 a $10, $10.50 a $20, $20 a $30, $30.50 a $50 y más de $50. Para lo que tenemos que de $1 a $5 se encontraron 31 productos (24.41%); 29

productos de $5.5 a $10 (22.83%); 35 cereales de $10.5 a $20 (27.56%); 15 de $20.5 a $30 (11.81%); 12 de $30.50 a $50 (9.45%) y finalmente más de $50 se encontraron cinco (3.94%) (Figura 7). De los 9 productos encontrados dentro del grupo de frituras se tiene que todos corresponden a churritos de amaranto (100%) y sus precios se mueven de $6 a $10. En la clasificación de productos panificados encontramos 35 divididos en 24 productos de pan (bisquet, cochinitos, conchas, empanadas, entre otros) (68.57%); siete tipos de galletas (integrales, regañadas, con mermelada, entre otras) (20%); cuatro tipos de harina de

Grano Garapiñado 0.79% Granola 9.45%

a)

Grano Reventado 16.75%

Barra Energética 74.01%

D. Escobedo-López et al.

349

Amaranto: Ciencia y Tecnología Más de $50 3.94%

$30.5-50 9.45% $1-5 24.41%

b)

$20.5-30 11.81%

$5.5-10 22.83% $10.5-20 27.56%

Figura 7. a) Clasificación de cereales. b) Costos de cereales. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis.

amaranto (harina integral, blanca, harina para hotcakes y harina para tortilla) (11.43%). Los productos que incluyen harina de amaranto se siguen mejorando por combinaciones de harinas, para aportar alimentos de alto contenido nutritivo que es ideal en anemias y desnutrición, es un alimento rico en hierro, proteínas, vitaminas y minerales; a tener en cuenta también en la osteoporosis, ya que contiene calcio y magnesio. Los precios para este tipo de producto se agruparon en tres rangos de: 1 a 10 pesos, de 11 a 20 pesos y más de $20. En base a

esto encontramos que 21 productos para la elaboración de panificados oscila de 1 a $10 (60%); 11, de 11 a 20 pesos (31.42%), y 3, con precios a más de $20 (8.57%) (Figura 8). Sobre los precios, los productos son económicos y quedan al acceso de la población, se encontró que los productos que tienen un mayor precio fueron adquiridos en las cadenas comerciales como Walmart, Soriana, Comercial Mexica, etc. Estos productos contienen una calidad mayor, son productos que poseen una etiqueta y por lo general una marca. Esto es debido a que el consumidor que acude a

Harina 11.43%

a)

350

Galletas 20%

D. Escobedo-López et al.

Pan 68.57%

Capítulo XXIV. Formas de consumo del amaranto en México

Más de $20 9%

b)

$11-20 31%

$1-10 60%

Figura 8. a) Clasificación de panificados, b) Costos de panificados. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis.

este tipo de lugares, se ha vuelto cada vez más exigente y quiere tener conocimiento sobre lo que consume. Dentro de lo que se observó con las muestras encontradas es que el amaranto tiene una diversidad de productos además de las alegrías, se puede emplear en muchos platillos como sopas (grano y harina), pasteles, galletas, panes (harina, grano entero, grano reventado), cereal para el desayuno (entero, reventado o germinado y molido), lo diferentes usos son mencionados también por Ortega (1990), quien menciona que con el amaranto, tanto de sus semillas como de las hojas se preparan diversos platos, desayunos, almuerzos, postres, bebidas y dulces, sin embargo de acuerdo al estudio, predomina su uso para la elaboración de las alegrías. El objetivo principal de promover e incrementar el consumo de productos elaborados con amaranto o mezclados, es el de dar un mejor valor nutritivo a los alimentos, a un costo muy económico, mejorando así el estado de salud de la población. Hoy en día se pueden encontrar productos a base de amaranto o como complemento aunque ya se utilizan otros cereales y granos como ingredientes extras en la elaboración de consumibles a base de amaranto, dentro de estos encontramos: trigo, nuez, avena, maíz, cacahuate, semilla de girasol, pasas, pepitas, linaza, arándano, nopal y papaya, además de otros insumos como: miel, miel de agave, chocolate, canela, vainilla, piloncillo, jugo de limón, entre otros.

Los artículos de amaranto encontrados en el mercado, se hacen por medio de elaboración artesanal aunque ya se está involucrando la industria alimenticia en incursionar con productos a base de amaranto de consumo tradicional, pero a la vez se observó que actualmente se están generando nuevas formas de preparar el amaranto y con esto el cultivo está obteniendo mayor demanda. La mayoría de los productos encontrados tienen marca, aunque no reconocida es un sello distintivo que en cierta medida respalda la calidad de elaboración. De los 244 productos recolectados 78 se encontraron en Celaya, Guanajuato (33.60%); uno en Cuapiaxtla, Tlaxcala (0.40%); 82 en Huazulco, Morelos (38.93%); dos en Lerma (0.81%), 26 en Texcoco (9.42%), 13 en México, D.F. (5.32%); 8, en Querétaro (3.27%); 14, Oaxaca (5.73%), y 20, San Luis Potosí (2.45%)(Figura 9). Un aspecto importante que se encontró es que de las 244 muestras de productos, sólo 64 mencionan una fecha de caducidad y las 190 restantes quizá por el lugar de elaboración no lo creen importante, cabe destacar que la mayoría de los productos que no se muestra su caducidad son alegrías, dulce de fácil obtención. En la zona centro del país donde se encuentra concentrada la mayor parte productora de amaranto y que a su vez se transforma y comercializa es notable la presencia de los productos como cereales y granolas (52.04%) sobre lo que se consideraba el principal mercado, los dulces tradicionales (28.68%), de D. Escobedo-López et al.

351

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Oaxaca, Oax. 5.73% Querétaro, Qro. 3.27% México, D.F. 5.32%

San Luis Potosí, SLP. 2.45%

Celaya, Gto. 33.6% Texcoco, Edo. Méx. 9.42% Lerma, Edo. Méx. 0.81%

Huazulco, Mor. 38.93%

Cuapiaxtla, Tlax. 0.4%

Figura 9. Distribución de productos recolectados. Fuente: elaboración propia con datos extraídos del muestreo del análisis.

los cuales en su mayoría son preparados a base de grano reventado (79.91%) y que contienen más del 90% de amaranto en su composición (47.95%), alcanzan en su mayoría una calidad de excelente ( 68.03%). La prevalencia dentro de este estudio son productos de Huazulco, Morelos (38.93%) y Celaya, Guanajuato (33.60%). Esto indica que el amaranto ya no solo es considerado un ingrediente de dulces dirigido al público del mercado artesanal, sino que ahora podemos encontrar una gran variedad de productos dirigidos al público en general y muchos ya específicos para atender etapas de desarrollo como papillas infantiles, concentrados proteicos y suplementos para la tercera edad, así como para aquellos que busquen el cuidado de la salud y el bienestar. Cabe señalar que el mercado nutricional es el principal campo para este cultivo ya que aporta los componentes necesarios para el desarrollo de las funciones del organismo y contribuye con aportes nutricionales para personas que puedan presentar alguna deficiencia en la salud (diabéticos, hipertensos, ancianos, etc.), además favorece el crecimiento y desarrollo de los niños y jóvenes en estado óptimo, malnutrición y desnutrición. 352

D. Escobedo-López et al.

Una de las particularidades del cultivo del amaranto y su transformación en variedad de productos que se comercializan por lo regular como pequeñas y medianas empresas, es que se trata de una labor casi artesanal. CONSIDERACIONES FINALES El amaranto tiene un mayor posicionamiento dentro de los granos utilizados por la industria alimenticia, principalmente en la integración de alimentos precursores y conservadores de la salud a nivel mundial, sobre todo porque las utilidades nutricionales y económicas son altas, sin embargo, debe de considerarse que el amaranto es un grano que no es de consumo masivo, por lo que es importante fomentar el consumo del mismo. En México aunque el mercado artesanal, sigue siendo uno de los pilares fundamentales de la producción y consumo de amaranto, el crecimiento del mercado de la salud en cuanto a granos integrales ha permitido al amaranto posicionarse de una manera satisfactoria permitiendo un mayor impulso en la producción del país. Actualmente ya existe

Capítulo XXIV. Formas de consumo del amaranto en México

un mayor número de empresas productoras y transformadoras de amaranto que poco a poco se han ido posicionando en el mercado. La mayoría maneja un signo distintivo que lo diferencia y coloca dentro del mercado, lo cual ha permitido al consumidor identificar una gran variedad de productos de origen nacional que mantienen un nivel de calidad superior a los que se elaboraban y comercializaban alrededor de los ochentas. Así, de acuerdo con lo anterior, existe una demanda creciente de amaranto, principalmente, en el mercado nacional de la confitería. De esta forma, se identifica una oportunidad de negocio y fomento para este cultivo entre los pequeños productores. LITERATURA CITADA Asociación Mexicana del Amaranto (2003) Amaranto, el mejor alimento de origen vegetal, beneficios y propiedades nutritivas. Centro de Información al Consumidor de Amaranto. http://www.amaranto.com.mx/ salud/propiedades/propiedades.htm. Fecha de consulta 22 de noviembre 2012. Bale J R, C S Kauffman (1992) Special issue on grain amaranth: New potential for an old crop. Food Rev. International. 8:1-190. Barba de la Rosa A P, J Gueguen, O ParedesLópez, G Viroben (1992) Fractionation procedures, electrophoretic characterization, and amino acid composition of amaranth seed proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40:931-936. Early K D (1986) Cultivo y usos del Amaranthus (kiwicha) en dos centros de domesticación: México y Perú. In: V Congreso Internacional de Sistemas Agropecuarios Andinos. Puno, 0- 14 marzo. PISA, IID-Canadáa. Puno, Perú. Escalante E M C (2011) Rescate y revaloración del cultivo del amaranto. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura (IICA). 2010, Fondo CONACYTSAGARPA, COFUPRO e IICA. 91 p.

Espitia R E, M C Sánchez, L D Escobedo, M De la O Olán, V P Rivas, T G Martínez, E L Cortés, C J M Hernández (2010) Conservación y uso de los recursos genéticos de Amaranto en México. Libro Técnico No. 1. SINAREFIINIFAP-UNAM, Centro de Investigación Regional Centro, Celaya, Guanjuato, México. 201 p. Hernández G R, G G Herrerías (1998) Amaranto: Hhistoria y promesa. Tehuacán: Horizonte del Tiempo Vol. 1 Patrimonio Histórico de Tehuacán A. C. México. pp: 1998, 529. Jacobsen S E, K Iteno, Á Mujica (2002) Amaranto como un cultivo nuevo en el norte de Europa. Agronomía Tropical Volumen 52(1): 109-119. 2002, INIA, Venezuela. Jiménez P R, E S Cordero (1986) Amaranthus spp. en la alimentación xochimilca y su proyección en la alimentación básica. pp: 56-64. In: Primer Seminario Nacional del amaranto. Chapingo, México Komen J (1992) Grains for the tropical regions. Biotechnology and Development Monitor. Publication of the Ministry of Foreign Affairs and the University of Amsterdam. The Netherlands. 10:3. Lorenz K (1981) Amaranthus hypochondriacus. Characteristics of the starch and baking potential of the flour. Starch-Stärke 33 (181) Vol. 3, núm. 3. pp. 149 – 153. Martínez J A (2007) El Cultivo del Amaranto en la Delegación Xochimilco, D.F. In: 1er Congreso de Investigación y Transferencia de Tecnología Agropecuaria y Forestal en el Distrito Federal. pp: 293-301. México: Fundación Produce A.C. Distrito Federal.

D. Escobedo-López et al.

353

Amaranto: Ciencia y Tecnología

Mujica A, S E Jacobsen (1999) Recursos genéticos, etnobotánica y distribución del amaranto (Amaranthus caudatus L., A. cruentus L. y A. hypochondriacus L.). In: Libro de Resúmenes (eds. Jacobsen, S. E. y A. Valdez), Primer Taller Internacional sobre Quinua Recursos Genéticos y Sistemas de Producción, 10-14 Mayo. UNALM, Lima, Perú. 131 p. National Research Council (1989) Lost crops of the Incas: Little-known plants of the Andes with promise for worldwide cultivation. National Academy Press, Washington D.C. 415 p. National Research Council (1984) Amaranth: Modern prospects for an ancient crop. National Academy Press, Washington, DC. 80 p. Okuno D, A A Kintomo, E A Akinrinde, M O Akoroda (2007) Comparative effect of phosphorus sources for grain amaranth production. Communications in Soil Science and Plant Analysis 38(1-2) 35-55. Ortega GL (1990) Usos y valor nutritivo de los cultivos andinos. INIA, PICA. Arequipa, Perú. Paredes-López O, A P Barba-de la Rosa, D Hernández-López, A Cárabez-Trejo (1990) Amaranto-Características alimentarias y aprovechamiento agroindustrial. OEA, Washington, D.C. Paredes-López O, H Guzman-Maldonado, C Ordorica-Falomir (1994) Food proteins from emerging seed sources. In New and Developing Sources of Food Proteins; Hudson, B. J. F., Ed.; Chapman and Hall: London, 1994; pp 240279. Pharmacia LKB. Separation Technique File No. 100. Repo-Carrasco R, C Espinoza, S E Jacobsen (2001) Valor nutricional y usos de la quinua (Chenopodium quinoa) y de la kañiña (Chenopodium pallidicaule). In: Memorias (eds. S. E. Jacobsen y Z. Portillo). Primer Taller Internacional sobre Quinua - Recursos Genéticos y Sistemas de Producción. 10-14 May. UNALM, Lima, Perú. pp:391-400 354

D. Escobedo-López et al.

Sauer J D (1967) The grain amaranths and their relatives: a revised taxonomy and geography survey. Annals of the Missouri Botanical Garden 54:103-137. Sauer J D (1950) The grain Amaranthus. A survey of their history and classification. Annals of the Missouri Botanical garden. 37: 561-632. USA. Schnetzler K A, W M Breene (1994) Food uses and amaranth product research: a comprenhensive review. In: Peredes-López O (ed), Amaranth Biology Chemistry and Technology. CRC Press, Boca Raton, FL. pp:155-184. Singhal, R S, PR Kulkami (1988) Review: amaranths-an underutilized resource. Int. J. Food Science. Technology. 23:125-139. Sooby J, R Myers, D Baltensperger, D Brenner, R Wilson, C Block (1999) Amaranth production manual for the central United States. Misc. Pub. EC 98-151-S. Univ. Nebraska Cooperative Extension, Sidney. Sørensen A M, S E Jacobsen (1987) Amarant (Amaranthus sp.). Ugeskrift for Jordbrug 7, pp: 3-8. Tapia-Blácido D R, P J A Sobral, F C Menegalli (2009) Potential of Amaranthus cruentus BRS alegria in the production of flour, Starch and protein concentrate: Chemicals, termal and rheological characterization. Journal of the Science of Food and Agriculture 90:1185-1193. Yue S, H H Sun (1993) The research and development of grain amaranth in China. In: The research and development of grain amaranth in China (ed. S. Yue). Inst. of Crop Breeding and Cultivation, Chinese Academia. Agricola. Sciences, Beijing. 119 p. Entrevista a informante clave: Manrique de Lara Soria B. (2011). Presidente de San Miguel de Proyectos Agropecuarios Sociedad de Producción rural. Noviembre de 2011.

Amaranto: Ciencia y Tecnología Se terminó de imprimir en diciembre de 2012 en los talleres de Celsa Impresos S.A. de C.V. Calle Cuencamé No. 108, Parque Industrial Gómez Palacio, Cuarta Etapa, Gómez Palacio Durango, C.P. 35070 Diseño y diagramación:

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