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Técnicas de aislamiento

Una de las actividades más apasionante del trabajo con hongos es el aislamiento de colonias puras. Entre las miles de especies que existen en la naturaleza el micólogo o el cultivador necesita aislar una para poder trabajar con ella. Todas las materias naturales pueden poseer multitud de hongos creciendo en ellas. Cada hongo es distinto y produce una colonia característica que lo diferenciará de los demás. Las técnicas de aislamiento se pueden dividir en dos amplias categorías que pueden combinarse de multitud de formas: métodos directos y métodos selectivos. -Transferencia directa: Las esporas, tejidos de la seta, etc. se siembran en un medio nutritivo con agar. Esta técnica favorece a hongos de crecimiento rápido por lo que se debe combinar con la utilización de medios especiales (Martin´s, Rose Bengal) o la utilización de una técnica de dilución seriada. Si tenemos problemas de bacterias al intentar aislar podemos usar sulfato de gentamicina, en una proporción aproximada de 60 mg por litro de medio. -Cámara húmeda: En ocasiones es recomendable hacer crecer el hongo desde el sustrato original en que se encuentra para, una vez aflore en la superficie, poder realizar una transferencia directa a un medio nutritivo. Se procede colocando en un pequeño recipiente algún tipo de material estéril que sea capaz de almacenar mucha agua para que se mantenga una buena humedad en su interior (algodón, papel filtro, turba, agar con agua, etc.) El material a estudiar se deposita en la pequeña cámara y se deja incubar. Esta técnica se puede utilizar para aislar hongos desde excrementos, madera, hojas, tallos, corteza, semillas, frutos, viejos hongos, insectos muertos, etc. -Cebos: Muchos hongos tienen necesidades muy específicas de nutrientes y utilizan materiales que no pueden utilizar otros hongos. Podemos sacar ventaja de estas necesidades para su aislamiento. Un ejemplo de un hongo que se aísla así es el hongo de la creosota, Amorphotheca resiniae. Se colocan palillos impregnados con creosota en el suelo, donde se formarán conidios que más tarde podrán transferirse directamente a placa nutritiva. Otros tipos de cebos pueden ser piezas de madera, insectos, plásticos, pelo o cualquier cosa que podamos imaginar. Los cebos pueden introducirse en hábitats naturales o en cámaras húmedas. Técnicas especiales -Técnicas de estrés: los hongos, como todos los seres vivos, pueden soportar hasta un umbral de estrés. Se utilizan los diferentes umbrales de estrés para aislar los hongos que nos interesan, una vez que hayamos eliminado al resto. Existen esporas de hongos, como la de algunos coprófilos (que se desarrollan en los excrementos de los herbívoros) que son capaces de aguantar las duras condiciones del tracto digestivo de estos animales. Otras esporas de hongos sólo germinan después de ser expuestos al fuego o a la congelación. Para explorar estas importantes adaptaciones podemos utilizar el calor, alcohol, ácidos, bases, u otras sustancias químicas o tratamientos que se nos ocurran. Una vez sometidos al estrés trataremos la muestra con alguna de las técnicas de aislamiento directo descritas. -Esterilización de la superficie: Consiste en la utilización de algún esterilizante químico para evitar que las esporas que se encuentran en la superficie de las muestras puedan interferir con el aislamiento que se encuentra en el interior. Para ello se puede proceder sumergiendo la muestra en una dilución al 10% de lejía comercial o al 3% de agua oxigenada durante una hora, aunque todo depende del tipo de muestra y de contaminante. Deben probarse distintos tiempos de esterilización. Esta técnica funciona para semillas, grandes hongos, madera, materiales artificiales, insectos muertos, etc. -Nutrientes selectivos: Consiste básicamente en la técnica del cebo pero realizada al revés; en esta ocasión es la muestra de la que se quiere aislar el hongo la que dispone sobre el medio. Podemos desear, por ejemplo, aislar aquellos hongos que utilizan la celulosa. Para seleccionar estos hongos elaboraremos un medio como el Czapek´s, pero usando la celulosa en vez de la sucrosa; aquellos hongos que no puedan utilizar la celulosa no crecerán o lo harán muy lentamente. Las posibilidades son ilimitadas siempre que utilicemos medios sintéticos para que los nutrientes modificados sean conocidos. En el agar siempre existen impurezas por lo que se pueden obtener hongos que no utilizan el ingrediente específico, aunque siempre podrán reconocerse por su raquítico crecimiento. Un ejemplo de medio selectivo muy curiosos fue el desarrollado por el Dr. Barron que hizo crecer nematodos en un caldo de guisantes. Una vez que los nematodos eran abundantes en el caldo añadió un poquito de tierra. Aquellos hongos que se alimentan de nematodos y que viven en el suelo se desarrollaron y finalmente dominaron el caldo. Aquí los nematodos son el nutriente selectivo sobre el que se siembra la tierra.

-Temperaturas selectivas: Los hongos que crecen fácilmente a las temperaturas ambiente de nuestras casas se denominan mesófilos. La mayoría de los hongos que conocemos son mesófilos y su crecimiento es inhibido por las temperaturas inusualmente altas o bajas. Aquellos hongos que necesitan temperaturas superiores a 40º C para crecer se denominan termófilos y los que requieren temperaturas por debajo de 15º C se denominan psicrófilos. En los nidos de los pájaros se encuentran gran cantidad de termófilos, mientras que en los excrementos de los conejos o en materiales compostados se encuentran multitud de psicrófilos. Los termófilos son los hongos que más rápidamente crecen, aunque también existen psicrófilos de crecimiento rápido, probando que no es sólo la temperatura el factor que influye en la rapidez del crecimiento. Algunos hongos termófilos, sobre todos los que pueden crecer a 37º C, pueden causar serias infecciones en humanos y animales, por lo que no es recomendable incubar a estas temperaturas sin el conocimiento de la biología de estos hongos. -Osmofilia: muchos productos almacenados, como granos, especímenes de museo, libros, etc. son atacados por hongos. Todos estos daños son causados por hongos que prosperan en condiciones inusualmente secas. Estos hongos se denominan osmófilos, un término que hace referencia al gran potencial osmótico del ambiente. Los osmófilos prosperan en ambientes relativamente secos o azucarados. La mayoría de los hongos que se pueden encontrar en vieja ropa o materiales de cuero, en las jaleas y mermeladas son osmófilos. Los hongos osmófilos crecen pobremente en medios de cultivo normales y deben adaptarse añadiendo grandes cantidades de azúcares. Otra fuente excelente de hongos osmófilos son las frutas deshidratadas. Por lo que se sabe, los hongos de las frutas deshidratadas no producen toxinas, no así como algunos de los que se desarrollan en los frutos secos. -Esporada: Existen multitud de formas para obtener una esporada según el tamaño del hongo o su pertenencia a los ascomicetos o basidiomicetos (los ascomicetos lanzan sus esporas más lejos). Para obtener esporadas de las setas comestibles que nos interesan debemos tener sobre todo en cuenta su color y la cantidad de humedad que posee la seta. Normalmente las setas pequeñas con láminas deben protegerse de la evaporación, colocando un vaso sobre ellas para que le dé tiempo a formarse el depósito de esporas. En las setas grandes debemos dejar que se sequen un poco si no queremos obtener un caldo de esporas en las que podrán reproducirse gran cantidad de bacterias. Una vez obtenida la esporada podemos sembrar las esporas, como mejor opción, utilizando la técnica de siembra por agotamiento. Método de Pitt para identificación de Penicillium, Aspergillus y otros hongos Se deposita el inóculo en tres puntos equidistantes de cada placa de los medios Malta-Glucosa, Czapek-Levadura y Czapek-Glicerol vaciados en sendas en cajas de Petri medianas, que se incuban a 25°C durante 7 días y si es necesario se prolonga hasta 14 ó 21 días. También se inoculan dos placas de Czapek que se incuban a 5 y 37°C, respectivamente, durante 7 días. Con los resultados obtenidos se accede a las claves. Microcultivo Se deposita un cuadrado del medio Zapallo o Papa estéril sobre un portaobjetos previamente flameado y frío, se siembra el hongo en sus bordes, se coloca un cubreobjetos que también fue flameado y enfriado. Se apoya el conjunto sobre dos varillas de vidrio, dentro de una caja de Petri en cuyo fondo hay un papel absorbente estéril embebido en agua. Se incuba a temperatura ambiente con alternancia de luz solar indirecta y obscuridad durante el tiempo necesario. BIBLIOGRAFIA

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Ainsworth GC. (1976), Introduction to the History of Mycology, Cambridge, UK: Cambridge University Press, ISBN 0-521-11295-8 Introductory Mycology, John Wiley and Sons, 1996, ISBN 0471522295 Deacon J. (2005), Fungal Biology, Cambridge, MA: Blackwell Publishers, ISBN 1-4051-3066-0