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• Semira Lopez Cordova

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AGAR SANGRE: FUNDAMENTO, USOS Y PREPARACIÓN El agar sangre es un medio de cultivo sólido enriquecido, diferencial pero no selectivo. Es utilizado para la recuperación y crecimiento de una gran variedad de microorganismos provenientes de muestras clínicas o para subcultivos. El agar sangre clásico debe ser incluido para el sembrado de la mayoría de las muestras clínicas recibidas en el laboratorio; a excepción de las muestras de heces en el que no es útil, a menos que se prepare con ciertas modificaciones.

  

Placa de agar sangre Este medio de cultivo se compone básicamente de un agar base enriquecido y 5% de sangre. La base de agar puede variar de acuerdo a las necesidades, pero principalmente estará compuesto por peptonas, aminoácidos, vitaminas, extracto de carne, cloruro de sodio, agar, entre otros. En cuanto a la sangre, normalmente se requiere tener contacto con un bioterio para la obtención de sangre de animales, tales como carnero, conejo o caballo. Sin embargo, esto no siempre es posible y en ocasiones se usa sangre humana. El medio agar sangre puede ser preparado en el laboratorio o puede comprarse ya listo a empresas que se dedican a ello. La preparación de este medio es uno de los más delicados, cualquier descuido en su elaboración dará como resultado un lote contaminado. Es por ello que deben tomarse todas las precauciones posibles y al final debe realizarse un control de calidad incubando a 37 °C 1 placa por cada 100 que se preparen.

Fundamento

  

Staphylococcus aureus cultivado en agar sangre. Nathan Reading on Flickr

Nathan

R.

on

twitter

(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)],

[CC via

BY

2.0

Wikimedia

CommonsYa se ha mencionado que el agar sangre tiene como característica ser un medio enriquecido, diferencial y no selectivo. A continuación se explica el basamento de cada una de estas propiedades. El agar sangre es un medio enriquecido porque lleva como aditivo principal 5 -10% de sangre sobre una base de agar. Ambos compuestos contienen muchos nutrientes y esta propiedad permite que en él puedan crecer la mayoría de las bacterias cultivables.

Ese

crecimiento

ocurre

sin

restricción;

por

este

motivo

es

no

selectivo. Sin embargo, si a este medio se le adicionan compuestos que impidan el crecimiento de algunos microorganismos y favorezca el de otros, se vuelve selectivo. Es el caso si se adicionan ciertos tipos de antibióticos o antifúngicos. Así mismo, el agar sangre es un medio diferencial, ya que permite distinguir 3 tipos de bacterias: los beta-hemolíticos, alfa –hemolíticos y gamma-hemolíticos. Los beta-hemolíticos son aquellos que tienen la capacidad de lisar o romper completamente los glóbulos rojos, formando un halo claro alrededor de las colonias, por tanto producen hemólisis ß ó ß –hemólisis y los microorganismos son llamados ß-hemolíticos. Ejemplos

de

bacterias

ß-hemolíticos

son Streptococcus

pyogenes y Streptococcus agalactiae. Los alfa-hemolíticos son los que realizan una hemólisis parcial, donde la hemoglobina

es

oxidada

a

metahemoglobina,

generándose

una

coloración verdosa alrededor de las colonias. A este fenómeno se le conoce como hemólisis α ó α –hemólisis y a las bacterias se les clasifica como α – hemolíticos. Ejemplo

de

bacterias

α

–

hemolíticos

son Streptococcus

pneumoniae y Streptococcus del grupo viridans. Por último, están las bacterias denominadas gamma-hemolíticas o no hemolíticas. Estas crecen sobre el agar sin generar cambios sobre el mismo, efecto conocido como γ –hemólisis, y los microorganismo son γ –hemolíticos.

Ejemplo de bacterias γ –hemolíticos: algunas cepas de Streptococcus del grupo D (Streptococcus bovis y Enterococcus faecalis).

Usos El medio de cultivo agar sangre es uno de los más comúnmente utilizados en el laboratorio de microbiología. Entre los microorganismos capaces de crecer en el medio agar sangre se tienen:

bacterias

aerobias

estrictas,

facultativas,

microaerófilas,

anaerobias, Gram positivas o Gram negativas, bacterias de crecimiento rápido o crecimiento lento. También crecen algunas bacterias exigentes o fastidiosas desde el punto de vista nutricional, así como hongos y levaduras. Así mismo, es útil para realizar subcultivos o reactivar cepas que metabólicamente estén muy débiles. Sin embargo, la elección del tipo de sangre y del agar base variará dependiendo del microorganismo probable que se sospecha recuperar y al uso que se le va a dar a la placa (cultivo o antibiograma).

ELECCIÓN DEL TIPO DE SANGRE La sangre puede ser de cordero, conejo, caballo o humana. La

más

recomendada

es

la

sangre

de

cordero,

salvo

algunas

excepciones. Por ejemplo, para aislar especies de Haemophilus, donde la sangre recomendada es la de caballo o conejo, ya que la sangre de cordero posee enzimas que inhiben el factor V. La menos recomendada es la humana, sin embargo es la más usada, quizás por ser la más fácil de obtener.

La sangre debe ser desfibrinada, obtenida sin ningún tipo de aditivo y proveniente de animales sanos. Para el uso de la sangre humana hay que tener presente varios factores: Si la sangre proviene de individuos que han padecido infecciones bacterianas,

estas

poseerán

anticuerpos

específicos.

En

estas

condiciones es probable que se inhiba el crecimiento de algunas bacterias. Si la misma se obtiene del banco de sangre, esta contiene citrato y es posible que ciertas bacterias no se desarrollen en su presencia. Por otra parte,

si

la

sangre

proviene

de

pacientes

que

están

tomando

antibióticos, puede inhibirse el crecimiento de bacterias susceptibles. Y si la sangre es de una persona diabética, el exceso de glucosa interfiere en que se desarrollen adecuadamente los patrones de hemólisis.

ELECCIÓN DEL TIPO DE AGAR BASE El agar base utilizado para la preparación del agar sangre puede ser muy amplio. Entre ellos se tienen: agar nutriente, agar infusión cerebro corazón, agar soya tripticasa, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter, etc.

USOS DEL AGAR SANGRE DE ACUERDO AL MEDIO BASE UTILIZADO PARA SU PREPARACIÓN Agar nutriente Esta base es la menos utilizada, pues sobre él crecerán principalmente bacterias no exigentes, como bacilos entéricos, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, entre otros. No es recomendable para aislar Streptococcus.

Agar infusión cerebro corazón (BHI) Es uno de los más utilizados como base del agar sangre, porque posee los nutrientes necesarios para el crecimiento de la mayoría de las bacterias, incluyendo Streptococcus sp y otras bacterias exigentes. Aunque no es apropiado para observar patrones de hemólisis. Con esta base generalmente se usa sangre de cordero. También se puede preparar variantes de agar sangre, donde se adicionan

otros

microorganismos. Por

compuestos ejemplo,

el

para agar

aislar infusión

determinados cerebro

corazón

suplementado con sangre de conejo, cistina y glucosa, sirve para aislar Francisella tularensis. En

tanto

que,

con

cistina

telurito

es

útil

para

el

aislamiento

de Corynebacterium diphteriae. Se puede usar sangre humana o de cordero. Con la primera la beta-hemólisis se verá como un halo estrecho, mientras que con la segunda el halo será mucho más amplio. Así mismo, esta base junto con bacitracina, almidón de maíz, sangre de caballo y otros suplementos de enriquecimiento (IsoVitaleX), se usa para

el

aislamiento

del

género Haemophilus

sp a

partir

de

muestras

respiratorias. También, si se le adiciona la combinación de antibióticos cloranfenicol – gentamicina o penicilina – estreptomicina con sangre de caballo, es ideal para el aislamiento de hongos patógenos exigentes, incluso con un rendimiento superior al agar Sabouraud glucosa. Especialmente es útil en el aislamiento de Histoplasma capsulatum.

Agar soya tripticasa Esta base es la más recomendada para una mejor observación del patrón de hemólisis y realización de pruebas diagnósticas tales como taxos de optoquina y bacitracina. Es el agar sangre clásico que se usa de rutina. Con esta base también se puede preparar el agar sangre especial para Corynebacterium

diphteriae, con

cistina

telurito y sangre

de

cordero. Así mismo, la combinación de este agar con sangre de cordero, más kanamicina-vancomicina es ideal para el crecimiento de anaerobios, especialmente Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton Esta base suplementado con sangre se usa para realizar el antibiograma de microorganismos exigentes, tal como Streptococcus sp.También es útil para el aislamiento de bacterias como Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin Este medio es ideal como base del agar sangre cuando se sospecha del género

Neisseria,

especialmente Neisseria

gonorrhoeae no crece en agar sangre.

meningitidis, ya

que N.

También sirve para realizar las pruebas de susceptibilidad a Neisseria meningitidis.

Agar Columbia Esta base es excelente para sembrar muestras de biopsias gástrica en busca de Helicobacter pylori. El medio se prepara adicionando 7% de sangre de cordero desfibrinada con antibióticos (vancomicina, trimetoprim, anfotericina B y cefsulodin) para restringir el crecimiento de otros tipos de bacterias que puedan estar presentes. Esta misma base suplementada con sangre humana o de cordero, ácido nalidíxico y colistina es útil para aislar Gardnerella vaginalis. También es ideal para evaluar la susceptibilidad antimicrobiana a los antibióticos del mismo microorganismo. Además, sirve para la preparación de agar sangre para el cultivo de anaerobios, adicionando aminoglucósidos y vancomicina. Esta base permite observar adecuadamente los patrones de hemólisis.

Agar Brucella Este medio usado como base del agar sangre junto con la adición de vitamina K es ideal para el cultivo de bacterias anaerobias. En este caso se recomienda el uso de sangre de cordero.

Agar Campylobacter Agar Campylobacter suplementado con 5% de sangre de carnero y 5 antibióticos (cefalotina, anfotericina B,

trimetoprima,

polimixina B y

vancomicina), es el medio utilizado para aislar Campylobacter jejuni en muestras de heces.

PREPARACIÓN Cada casa comercial trae al reverso del envase las indicaciones para preparar un litro de medio de cultivo. Se pueden hacer los cálculos correspondientes para preparar la cantidad deseada, según el agar base seleccionado.

PESAR Y DISOLVER El agar base viene deshidratado (en polvo), por tanto debe disolverse en agua destilada ajustada a pH 7,3. Se pesa la cantidad que indique el agar base escogido y se disuelve en la cantidad de agua correspondiente en una fiola, luego se calienta a fuego moderado y se mezcla con movimientos rotativos hasta disolver todo el polvo.

ESTERILIZAR Una vez disuelto, esterilizar en autoclave a 121°C por 20 minutos.

AGREGADO DE LA SANGRE Al salir del autoclave se dejar enfriar la fiola hasta que la temperatura oscile entre 40 a 50 °C; es una temperatura que la piel humana soporta y a la vez el agar aun no se ha solidificado. Para ello, se toca la fiola con la mano y si el calor es tolerable, es la temperatura ideal para agregar la cantidad de sangre desfibrinada correspondiente (50 ml por cada litro de agar). Mezclar suavemente para homogeneizar.El paso del agregado de la sangre es crucial, pues si

se realiza cuando el medio está muy caliente los glóbulos rojos se romperán y el medio no servirá para observar hemólisis. Si se agrega demasiado frío, se formarán grumos y la superficie del medio no quedará lisa para poder hacer el estriado adecuadamente.

VERTER EN LAS PLACAS DE PETRI Servir

en

placas

homogeneizar

la

de

Petri

sangre.

estériles En

cada

inmediatamente placa

de

Petri

después se

de

vierte

aproximadamente 20 ml. Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar o cerca del mechero. Al momento de servir el agar sangre en las placas de Petri no deben quedar burbujas de aire en la superficie de la placa. Si esto sucede se pasa la llama del mechero de Bunsen rápidamente sobre la placa para eliminarlas. Las placas se dejan solidificar y se guardan en nevera (2-8°C) de forma invertida hasta su uso. Antes de usar las placas de agar sangre se deben atemperar (dejar que tomen temperatura ambiente) para poder ser sembradas. Las placas preparadas tienen una duración aproximada de 1 semana.