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• Patty Dorado

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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE JEREZ

INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS 7° SEMESTRE

ALUMNAS: PATRICIA DORADO FELIX. JESSICA ELIZABETH SORIANO GUERRERO. ERICA REYES ENRIQUES. BEATRIZ PEREZ PEREZ. PERLA BERENICE GUERRERO GARCIA.

DOCENTE: MAYRA NALLELY REGALADO PEREZ. MATERIA: TECNOLOGIA DE LACTEOS REPORTE DE PRÁCTICA

22 NOVIEMBRE DEL 2016

TEMA ANALISIS BACTERIOLOGICO DE SUBPRODUCTOS DE LECHE

OBJETIVO •

Determinar la presencia bacterias en productos derivados de la leche, mediante cultivos, e identificar el tipo de colonia que se desarrolle.

RESUMEN La leche debido a su composición química y a su elevada actividad de agua, es un magnífico

sustrato

para

el

crecimiento

de

una

gran

diversidad

de

microorganismos. La contaminación de la leche ocurre ya en las zonas inferiores del interior de la ubre y cuando el producto abandona ésta, la leche está expuesta a múltiples contaminaciones externas. La cantidad de microorganismos presentes en la leche puede condicionar su calidad sanitaria. En esta práctica se llevó a cabo el análisis bacteriológico de algunos subproductos de la leche para ello se empleó pruebas de cultivo las cuales pueden determinar si se encuentra la cantidad de bacterias presentes en una muestra de productos lácteos para que se dé el desarrollo de microrganismos, e identificar las diferentes colonias que pueden crecer en un medio de cultivo a partir de una dilución de los productos lácteos.

INTRODUCCIÓN La complejidad bioquímica de la leche en su composición y su elevada actividad de agua la convierte en una de los alimentos naturales donde proliferan fácilmente la mayor parte de los microorganismos y bien se podría catalogar como un medio universal de cultivo. Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son beneficiosos por las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer para la salud del consumidor cuando es portador de microorganismos patógenos o de sus toxinas y el segundo a las características de conservación de la misma que viene determinada por la

presencia de un mayor o menor número de floras aprofitita, está en elevadas concentraciones puede producir defectos y disminución de las propiedades nutritiva y organolépticas del producto. Existen grupos de microorganismos (M.O) que son tomados como indicadores en la Industria Láctea, pues su presencia permitirá comprobar el cumplimiento de la aplicación de las buenas practicas higiénicas. M.O indicadores:    

Bacterias aeróbicas mesófilas Coliformes totales y fecales Enterobacterias torales Enterococo

Los métodos de análisis para evaluar la calidad higiénico sanitaria de la leche han evolucionado sustancialmente desde la década de los 60, llegando a oficializare los métodos convencionales de conteo en placa. Estos métodos universalmente conocidos tienen limitantes como son el excesivo tiempo de realización, amplia laboriosidad y utilización de gran cantidad de medios de cultivo, placas y otros insumos. Entre la flora bacteriana existente en la leche cruda, leche pasterizada, y productos lácteos hay importantes diferencias. Intervienen muchas variables y el tipo de bacterias y la contaminación de productos alimenticios dependen de: 1.

Los microorganismos pueden producir cambios deseables en las características físico químicas de la leche durante la elaboración de

2.

diversos productos lácteos. Los productos lácteos y

la

leche

pueden

contaminarse

con

microorganismos patógenos o sus toxinas y provocar enfermedad en el 3.

consumidor. Los microorganismos pueden causar alteraciones de la leche y productos lácteos afectando la calidad de sus subproductos.

METODOLOGÍA

NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos. Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp. Este método es aplicable para la detección de Salmonella spp en productos para consumo humano, así como de áreas de producción y manejo de alimentos especialmente en productos donde las condiciones ambientales permiten la contaminación

de

estos

productos

por

microorganismos

de

la

familia

Enterobacteriacea. A.2 EQUIPO. A.2.1 Autoclave; A.2.2 Horno que alcance 180°C; A.2.3 Incubadora capaz de operar a 36°C ± 1°C; A.2.4 Baño de agua capaz de operar a 41.5°C ± 1°C o incubadora capaz de trabajar a 41.5°C ± 1°C; A.2.5 Baño de agua capaz de operar a 45°C ± 2°C; A.2.6 Baño de agua capaz de operar a 37°C ± 1°C; A.2.7 Potenciómetro; A.2.8 Balanza granataria con sensibilidad de 0.1g verificada el día de uso; A.2.9 Homogeneizador peristáltico o licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio, aluminio o acero inoxidable); A.2.10 Equipo de filtración con trampa, y A.2.11 Bomba de vacío.

A.3 MATERIALES.

A.3.1 Asa de platino, níquel o desechables de aproximadamente 3mm de diámetro o 10µL (microlitros); A.3.2 Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de diferentes capacidades 10mL, 5mL, graduadas respectivamente en divisiones de 0.5mL y 0.1mL protegidas con tapón de algodón; A.3.3 Pipetas de 1mL, con graduaciones de 0.1mL; A.3.4 Matraces Erlenmeyer de 500mL y/o capacidad apropiada; A.3.5 Cajas Petri estériles de vidrio o desechables de diámetro 15mm x 100mm y/o de un diámetro mayor a 140mm; A.3.6 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas; A.3.7 Tubos de ensaye de 16mm x 150mm y de 20mm x 100mm o de capacidades adecuadas; A.3.8 Gradillas para tubos de ensaye; A.3.9 Mecheros Bunsen o Fisher; A.3.10 Papel Indicador de pH; A.3.11 Pinzas estériles para membrana; A.3.12 Matraces Kitazato de 1000mL; A.3.13 Filtros de membranas estériles de tamaño de poro de 0.45µm, y A.3.14 Manguera de hule para equipo de filtración. Nota: El material desechable puede utilizarse como alternativa aceptable a la cristalería reutilizable si cumple las especificaciones adecuadas. A.4 MEDIOS DE CULTIVO. A.4.1 Agua Peptonada amortiguada; A.4.2 RVS; A.4.3 MKTTn; A.4.4 XLD;

A.4.5. EH; A.4.6 ASB; A.4.7 Agar Verde Brillante; A.4.8 Agar nutritivo; A.4.9 TSI; A.4.10 LIA; A.4.11 Agar Urea de Christensen; A.4.12 Medio L-Lisina descarboxilasa; A.4.13 Solución salina fisiológica; A.4.14 Caldo Triptona al 1%; A.4.15 CTT; A.4.16 CST; A.4.17 Caldo Nutritivo; A.4.18 Caldo Dey-Engley; A.4.19 Leche descremada, y A.4.20 Caldo Lactosado. A.5 REACTIVOS. A.5.1 Reactivos para la reacción VP (α -naftol y KOH); A.5.2 Reactivos para la reacción de indol. Reactivo de Kovac o Erlich; A.5.3 Antisuero somático (O) polivalente de Salmonella spp; A.5.4 Tolueno; A.5.5 -naftol; A.5.6 Solución de creatina; A.5.7 KOH; A.5.8 Salmonella Typhimurium ATCC 14028 (S. Typhimurium);

A.5.9 Salmonella diarizonae ATCC 12325. (S. diarizonae); A.5.10 Salmonella abortus equi ATCC 9842. (S. abortus equi); A.5.11 ONPG; A.5.12 Novobiocina (sal sódica); A.5.13 Yodo; A.5.14 Yoduro de Potasio; A.5.15 Alcohol etílico 96%; A.5.16 4-Dimetilaminobenzaldehído; A.5.17 HCI, r = 1.18g/mL a 1.19g/mL; A.5.18 2-metilbutan-2-ol; A.5.19 Cloruro de sodio; A.5.20 Monohidrato de creatina; A.5.21 Solución acuosa de verde brillante al 1%; A.5.22 Tergitol/Aniónico; A.5.23 Triton X-100; A.5.24 NaOH 1N; A.5.25 Alcohol al 70%; A.5.26 Sulfato Ferroso, y A.5.27 K2 SO3 Sulfato de Potasio. A.6 CONDICIONES DE PRUEBA. A.6.1 Muestreo. Es importante que el laboratorio se cerciore de recibir una muestra representativa y que no haya tenido daños o cambios durante el transporte y/o almacenamiento. El muestreo no es parte del método especificado aquí, es recomendable que las partes involucradas en este punto lleguen a un acuerdo al respecto, pueden

utilizarse diversos estándares internacionales tales como los planes de muestreo del CODEX alimentarios o las guías del ICMSF. A.6.2 Preparación de la muestra de ensayo. Lineamientos generales para la preparación de las muestras. A.6.2.1 General. La preparación de la suspensión inicial requiere 25g de la muestra en 225mL del medio de pre-enriquecimiento, para obtener una dilución 1:10. En una situación atípica y justificada, si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25g, se deberá utilizar la cantidad necesaria de medio de preenriquecimiento para obtener una dilución 1:10. En casos excepcionales, cuando es necesario analizar más de una porción de 25g de un lote específico de alimento y teniendo evidencia de que si hay mezcla de tales porciones no afecta el resultado, las muestras pueden ser compuestas; es decir, si 10 muestras de 25g serán examinadas, combinar las 10 porciones para obtener 250g y adicionar 2.25L del caldo de pre-enriquecimiento precalentado a 36°C ± 1°C. Sin embargo, se debe tomar en cuenta que para inocular el caldo selectivo RVS y MKTTn aumentarán las porciones de 10mL a 100mL teniendo que inocular 1mL y 10mL respectivamente. Continuar como se indica en el punto A.7.2. A.6.2.6 Yema de huevo en polvo, clara de huevo en polvo, huevo en polvo, leche fluida, leche descremada, leche con 2% de grasa, entera y suero de leche. Mezclas preparadas en polvo (Harinas para pastel, galletas, donas, bísquets y pan) Fórmulas infantiles y alimentos para administración por cánula u oral, que contengan huevo. Si las muestras no están en polvo, agregar 225mL de agua peptonada amortiguada. Si el producto es un polvo, agregar aproximadamente 15mL de agua peptonada y agitar con una varilla de vidrio, cuchara o abate lenguas, hasta obtener una suspensión homogénea. Agregar tres porciones más de 10mL, 10mL y 190mL para un total de 225mL. Agitar suficientemente hasta que la suspensión no contenga grumos. Tapar el frasco y

dejar en reposo durante 60 min ± 5 min a temperatura del laboratorio promedio que oscila entre 18°C y 27°C. Mezclar por agitación, aflojar la tapa a 1/4 de vuelta, e incubar a 36°C ± 1°C 18h ± 2h. Continuar como se indica en el punto A.7.2. NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1 529-18:98 CONTROL

MICROBIOLÓGICO

DE

LOS

ALIMENTOS.

CLOSTRIDIUM

PERFRINGENS. RECUENTO EN TUBO POR SIEMBRA EN MASA 1. OBJETO 1.1 Esta norma describe el método de recuento en tubo por siembra en masa para determinar el número de células viables de Clostridium perfringens, presentes en un gramo o centímetro cúbico de muestra de alimento. 2. ALCANCE 2.1 Este método es útil para situaciones en que se requiera de un método rápido y altamente selectivo. 5. MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 5.1 Medios de cultivo y reactivos 5.1.1 Requisitos básicos. Para que haya uniformidad en los resultados, es necesario que los componentes de los medios sean de una calidad uniforme y de grado analítico o, a su vez, se debe utilizar medios completos deshidratados, reconstituir y utilizarlos según las instrucciones del fabricante. 5.1.2 Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos. Ver NTE INEN 1529-1 5.1.2.1 Agar TSN 5.1.2.2 Agar triptosa-sulfito-cicloserina TSC 5.1.2.3 Agua peptona 0,1 % 5.1.2.4 Medio SIM

5.1.2.5 Reactivo de Kovacs 5.1.2.6 Tubos para el diagnóstico de Cl. perfringens (CPT). 5.1.2.7 Medio tioglicolato fluido 5.1.2.8 Vaselina liquida. 5.2 Instrumental y vidriería 5.2.1 La vidriería y utensilios que se utilicen en los ensayos deben ser de material inerte

y

resistente

a

esterilizaciones

repetidas,

además,

deben

estar

perfectamente limpios y estériles. 5.2.1.1 Pipetas bacteriológicas de boca ancha graduadas en 1/10 de cm3. 5.2.1.2 Tubos de ensayo de 22 mm x 200 mm 5.2.1.3 Tubos de ensayo de 12 mm x 120 mm 5.2.1.4 Frascos con tapa de rosca, para muestras 5.2.1.5 Jarras anaeróbicas o cualquier otro equipo adecuado para cultivo anaeróbico. 5.2.1.6 Incubador 46° C 5.2.1.7 Contador de colonias 6. MUESTREO, CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 6.1 Tomar las muestras según la NTE INEN 1529-2 6.2 Las unidades de muestras perecederas que llegan al laboratorio deben mantenerse en refrigeración, entre 0° C y 5° C, por no más de 24 h. En general, las muestras deben mantenerse en las condiciones adecuadas al producto, hasta el momento del examen. 6.3 La unidad analítica debe provenir de una unidad de muestra de por lo menos 100 g y ser preparada según la NTE INEN 1529-2.

7. PROCEDIMIENTO 7.1 Siembra 7.1.1 En tubos que contengan agar TSN fundido y temperado entre 50 y 55°C, de cada dilución decimal, pipetear por duplicado volúmenes de 1 cm3, introduciendo la pipeta hasta el fondo y dejando caer la muestra al retirar la pipeta con movimiento helicoidal ascendente. Utilizar una nueva pipeta estéril para cada dilución. 7.1.2 Poner los tubos en pie en un baño de agua fría para que el agar se solidifique rápidamente. 7.1.3 Cubrir la siembra con una capa de vaselina líquida estéril de 1 cm de espesor (vaselina-parafina, agar al 2%, parafina) o poner los tubos en una jarra anaeróbica. 7.1.4 Incubar a 46°C por 16 a 18 h. 7.2 Recuento de colonias 7.2.1 Elegir los dos tubos de la dilución que contengan entre 30 ± 10 colonias negras, contarlas y calcular el número de unidades formadoras de colonias (células vegetativas y esporos) por gramo o centímetro cúbico de alimento. Cuando la siembra ha sido en placas, realizar el recuento inmediatamente después de abrirlas, antes que las colonias empalidezcan. 7.2.2 Si parte de los tubos están completamente ennegrecidos y es difícil contar las colonias aisladas características, hacer el recuento en los dos tubos de la dilución inmediata más alta y, aun cuando el número sea menor de 15, anotar la media aritmética de estos dos valores. 7.2.3 Si todos los tubos contienen más de 40 colonias, contar en los tubos inoculados con la dilución más alta.

7.2.4 Si no hay desarrollo de colonias características en los tubos sembrados con muestras no diluidas (liquidas) o con la suspensión inicial (10-1), anotar: "no se observan colonias". 7.3 Pruebas confirmatorias 7.3.1Selección y purificación de colonias 7.3.1.1 De las colonias sospechosas contadas en 7.2, seleccionar al azar, el bien aisladas, en un número equivalente a la raíz cuadrada del total, con un mínimo de cinco. Evitando cualquier roce, tocar en el centro de cada una de éstas y hacer un frotis; teñirlo por el método de Gram y verificar la presencia de sólo bacilos Gram positivos, rectos, de extremos romos, solos o agrupados en pares, de 0,6 a 2,4µm x 1,3 a 19,0 µm; esporos grandes, ovales, centrales o subterminales y la célula distendida (en condiciones normales de cultivo raramente esporulan). Continuar con el numeral 7.3.2 para verificar la no producción de indo e movilidad. 7.3.1.2 Si no es posible seleccionar colonias sospechosas bien aisladas, elegir cinco colonias e inocularlas individualmente en tubos que contengan tioglicolato fluido. 7.3.1.3 Incubar los tubos en anaerobiosis a 46°C durante 16 a 18 horas 7.3.1.4 De este subcultivo, con un asa, sembrar en estría sobre la superficie seca de placas de agar TSC e incubarlas en anaerobiosis a 46°C durante 16 a 18 horas. 7.3.1.5 De cada placa, seleccionar, por lo menos, una colonia típica bien aislada y confirmarla según 7.3.2 7.3.2 Pruebas de movilidad y producción de indo 7.3.2.1 Con una aguja de cultivo y haciendo una picadura profunda en el tubo de diagnóstico CPT, sembrar individualmente cada una de las colonias purificadas

(7.3.1). El tubo CPT contiene tres capas de medio de cultivo de 2 cm de alto cada una, la del fondo es de agar TSN o TSC, la del medio de agar-agar y la superior de medio SIM. 7.3.2.2 Poner los tubos sembrados en jarras anaeróbicas e incubarlos a 46° C durante 16 a 24 h. 7.3.2.3 Lectura de la movilidad: ver el tipo de crecimiento a lo largo de la línea de siembra. Si el crecimiento es difuso, fuera de la línea de picadura, la movilidad es positiva. El Cl. perfringens es inmóvil, crecerá sólo a lo largo de la picadura sin extenderse fuera de ella. 7.3.2.4 Lectura de la prueba del indol: cubrir la superficie del medio con unas gotas de reactivo de Kovacs. El aparecimiento de un color púrpura indica una reacción positiva. El Cl. perfringens produce reacción negativa. 7.4 Interpretación 7.4.1 Considerar como Cl. perfringens a aquellas bacterias que producen colonias negras en agar TSN o TSC al ser incubadas a 46°C.

ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificación, de las Enterobacteriaceae. Técnica del NMP y método por recuento de colonias Esta directiva expone dos métodos para el recuento de Enterobacterias. El primero de ellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que presentan contaminación baja (1 – 100 por mililitro o gramo de muestra). Para ello se siembran en tres tubos de medio de doble concentración, una cantidad determinada de la muestra problema si la muestra es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de concentración simple con la primera dilución decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35º C o 37º C (según acuerdo)

durante 24 horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más probable de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de muestra de ensayo mediante la tabla NMP. El segundo método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examinar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C o 37º C durante 24 horas +/2 horas. Cálculo del número de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias características confirmadas obtenidas en las placas de Petri NF V 08-054 Método de rutina para la enumeración de Enterobacteriaceae mediante el recuento de colonias Este método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examinar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 30ºC durante 24 horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias características confirmadas obtenidas en las placas de Petri.

MATERIAL         

Probeta 100ml Vasos de precipitado Balanza analítica Cajas de Petri (agar-agar) Asa Alcohol solido Mantequilla Queso Yogurt

PROCEDIMIENTO Dilución liquida. - yogurt 1ml: 9 de agua •

Se tomará 1ml de yogur en cual se disolverá en agua destilada hasta conseguir una muestra homogénea, con el asa se tomará una pequeña cantidad para proceder a disolverse en el agar y se llevará a la incubadora.

Disolución del sólido. - queso molido con 1g:9ml de agua

•

Moler en la licuadora el queso hasta que se formen una especie de polvo, pesar una muestra de 1g y diluirla en 9 ml de agua destilada hasta que esté totalmente homogénea la disolución, tomar con el aza una pequeña muestra de esta y sembrar sobre el agar.

Mantequilla caliente directa. •

Se derretirá la mantequilla con la finalidad de obtener una muestra

liquida, se tomará con el aza y se procederá a realizar el sembrado en el agar de forma sesgada. Condiciones de la muestra es de 24 a 35 °C durante 24hrs.

Aplicación 1.

La producción de ácido sulfhídrico se utiliza el cultivo de salmonela formadora de colonias de centro negro en medios de cultivo Salmonela

2.

Shigella Agar para quesos. Streptococcus dentisani. - Es una bacteria capaz de prevenir el problema dental de las caries, reduce entre tres y diez veces la producción de ácido [el ambiente favorable para la vida de las bacterias de la caries] sobre la placa dental. De acuerdo con los científicos, el descubrimiento podría ponerse en un futuro próximo a disposición de la población en forma de yogur, chicle o enjuague bucal.

3.

La determinación del Clostridium se aplica principalmente en los productos enlatados para evitar que los consumidores contraigan

4.

botulismo, así evitar muertes. Evaluación de la aplicación del cribado de estreptococo del grupo B para la prevención de la infección perinatal en un hospital de tercer nivel. - Los protocolos de prevención de la enfermedad por estreptococo del grupo B se emplean ampliamente y su eficacia ha sido demostrada. El objetivo del estudio es evaluar la aplicación del cribado de EGB en nuestro centro de trabajo, que recomienda efectuar un cultivo vaginal y rectal a todas las embarazadas en las semanas 35-37 de gestación

Resultados

Conclusión  Solo se logró el desarrollo de microorganismo en una sola de las muestras procesadas.

 Se determinó que en procesamiento de las muestras fue inadecuado y no se realizó bajo los requerimientos necesarios y por lo tanto hubo una contaminación por parte del operario hacia esta.  El desarrollo se vio afectado del mismo por una falla en la incubadora, por lo que haberse presentado un descenso de la temperatura necesaria para el buen desarrollo de las bacterias.  Es necesario aprender de forma correcta el tratamiento, manejo y siembra de muestras para lograr cultivos de microorganismos exitosos.

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