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Factores que Afectan la Actividad Enzimática. Regulación de la Actividad de enzimas en un Organismo Vivo.

Dra. María Mercedes Soberón Lozano

Factores que influyen en la actividad enzimática Concentración de sustrato Concentración de enzima Temperatura pH

¿De qué manera influyen?

Efecto de Temperatura Temperatura óptima para la mayoría de enzimas de origen animal: 40º - 45 ºC. Denaturación. Energía cinética es tan grande que excede barrera energética. Mayor colisión entre moléculas

Insuficiente calor para alcanzar barrera de energía. No hay catálisis, o es muy baja.

10

20

30

40

50

Temperatura ºC

60

70

Labilidad térmica de Glucosa-6-P deshidrogenasa resulta en anemia hemolítica. – G-6-PDasa: enzima importante para mantener integridad de membrana de glóbulos rojos. – Una mutación en esta enzima produce disminución de estabilidad térmica en eritrocitos  HEMÓLISIS EXCESIVA.

Efecto de pH Ionización de aminoácidos del sitio catalítico envueltos en CATÁLISIS PROPIAMENTE dicha.

Ionización en grupos del SUSTRATO para su fijación con la enzima.

Ionización en otros aminoácidos de la enzima, no ubicados en el sitio catalítico.

2

4

Ionización en aminoácidos de la ENZIMA involucrados en fijación del SUSTRATO.

6

8

10

12

14

pH

Efecto de pH en Sistemas Biológicos Alcohol deshidrogenasa

CH3CHO + NADH + H+

CH3CH2OH + NAD+

Acetaldehido

Etanol

Aldehido deshidrogenasa

CH3CHO + NAD+ + H2O

CH3COOH + NADH + H+

Acetaldehido

Alcohol deshidrogenasa (ADH) constituida por 3 cadenas polipeptídicas: α, β, . Variación de cadena β ha dado lugar a isoenzimas de ADH

Ác. acético

Residuo 47 Residuo 369

pH opt.

β-1

Arg

Arg

10

β-2

His

Arg

8,5

β-3

Arg

Cys

7

Regulación de la Actividad Enzimática 1)

2) 3) 4) 5)

Control de la transcripción. Biosíntesis de la enzima. Modificación covalente Control por retroacción Activación mediante ruptura Enzimas alostéricas

Control de transcripción Segundos mensajeros, hormonas, nutrientes, ejercen control en mecanismos de expresión del gen de enzimas

Insulina

-Insulina, hormona anabólica, induce síntesis de enzimas: -Glucoquinasa, fosfofructoquinasas, piruvato quinasa, glucógeno sintetasa. - Insulina reprime la síntesis de enzimas vía gluconeogénica

Control de la Transcripción SÍNTESIS ENZIMAS REGULADA A NIVEL GENÉTICO “enciende” la transcripción

A, Z = metabolito H = hormona

Bloquea la transcripción

Control de la Transcripción SÍNTESIS ENZIMAS REGULADA A NIVEL GENÉTICO

Enzimas constitutivas - Procesos

Síntesis enzimática  Degradación enzimática - Cantidad de proteína y mRNA permanecen inalterados - No suelen presidir pasos reguladores de vías metabólicas

Control de la Transcripción SÍNTESIS ENZIMAS REGULADA A NIVEL GENÉTICO

Enzimas inducibles - Niveles según las diferentes circunstancias metabólicas. - Inducción de la cantidad debido a estímulos. - Enzimas controladoras de vías metabólicas. - Fácilmente degradadas. Vida media Ornitina descarboxilasa 15-20 minutos Lactato deshidrogenasa 150 horas Ornitina descarboxilasa 0,3-0,5 horas

Regulación actividad enzimas a corto plazo.

Modificación Covalente: Fosforilación /Defosforilación Glugógeno sintetasa inactiva

Glugógeno sintetasa activa

Glicógeno fosforilasa inactiva

Glicógeno fosforilasa activa

Glicógeno sintetasa activa

Glicógeno sintetasa inactiva

Modificación Covalente Fosforilación: Protein quinasas R CH N O C Ser H C H N C R' CH N

H CH2OH O H

ATP

ADP

Proteinquinasa

R CH N O C Ser HC H N C R' C H N

H O CH2O P OOO H

Sobre residuos de Ser, Thr, Tyr en proteínas blanco

Modificación Covalente Defosforilación: Protein fosfatasas R CH N O C Ser HC H N C R' C H N

Pi

H 2O

H O CH2O P O-

O O H

Fosfatasa

R CH N O C Ser H C H N C R' CH N

H CH2OH O H

Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P de proteína blanco

Modificación Covalente: Fosforilación /Defosforilación Hay algunas proteinquinasas que fosforilan restos de His, Lys, Arg, Gln, Asp. Fosforilaciones sobre Ser/Thr están asociadas, generalmente, a procesos de regulación metabólica. Fosforilación sobre Tyr está con procesos de crecimiento celular y diferenciación.

Modificación covalente Adenilación: Sistema de la Glutamina sintetasa

AT = adenililtransferasa

Activación mediante ruptura proteolítica Eliminación de un hexapéptido del extremo Nterminal del tripsinógeno, por enteropeptidasa,

Tripsinógeno enteropeptidasa

Quimotripsinógeno

Tripsina

-Quimotripsina Proelastasa Procarboxipeptidasa

-Quimotripsina Elastasa Carboxipeptidasa

Quimotripsinógeno (Inactivo)

Tripsina -Quimotripsina (activa)

Autocatálisis (quimotripsina)

-Quimotripsina (activa)

Mecanismo de Coagulación sanguínea

Factor VIII Mecanismo de Coagulación sanguínea Factor de von Willebrand

(285 kDa, 2,351 aminoácidos) Trombina Arg-372

Arg-1689 Factor de von Willebrand

Arg-740

Arg-1648 Factor de von Willebrand

Factor VIIIa H3N 40 kDa 50 kDa

Ca2+

74 kDa

COO-

Hay tres variedades de hemofilia: Un caso de Hemofilia A

HEMOFILIA A, déficit del factor VIIIa de coagulación, HEMOFILIA B, déficit del factor IXa de coagulación, HEMOFILIA C, déficit del factor XIa.

Control por Retroinhibición Hexoquinasa Glucosa + ATP E1

A

B





E2

A



B

E2

E3

C

Síntesis de nucleótidos de purinas y pirimidinas E3 E1

Glucosa-6-P + ADP

D

E5

E4

D

E

E6

F

E

E7

G



C E4

K

E8

L

E9

M

E10

N

AMP

-

GMP

Enzimas Alostéricas Presentan subunidades (oligoméricas)

Poseen sitios catalíticos y alostéricos que pueden estar ubicados en una misma subunidad o en diferentes subunidades de la enzima alostérica

Generalmente son enzimas reguladoras de vías metabólicas.

Actividad regulada mediante un CENTRO ALOSTÉRICO, sitio distinto del sitio activo de la enzima.

Proteína-cinasa (PKA)

Enzima tetramérica: Dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras Muchos sustratos fosforilados

Sitio catalítico

Aspartato Transcarbamilasa Sitio regulador

ATCasa en estado T

• Participa en la síntesis de pirimidinas. • Tiene 6 subunidades catalíticas (C) y 6 subunidades reguladoras (R)

ATCasa en estado R

Enzimas Alostéricas Efector o regulador alostérico (inhibidor o activador) estructuralmente diferente de los sustratos; se fija en su propio sitio lejos de sitio activo Efector o regulador alostérico No se modifica como resultado de acción catalítica

Fosfofructoquinasa-1 (PFK-1) • [ATP] es alta, INHIBE a la enzima uniéndose a un sitio diferente al sitio activo, esto produce un cambio estructural en la enzima, que baja fuertemente su afinidad por fructosa6-P.

• Citrato, INHIBE alostéricamente a la PFK-1. • Fructosa-2,6-biP, AMP, ADP, ACTIVA fuertemente a esta enzima.

Enzimas Alostéricas Pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles: -R (relajada, alta afinidad por S)

-T (tensa, baja afinidad por S).

Enzimas Alostéricas Fijación de ligandos no sigue comportamiento Michaelis-Menten.

Vm Curva sigmoidal es característica de fijación cooperativa de ligandos a múltiples sitios de fijación de la proteína.

v

[S]0.5 (K0.5) es a menudo usado para representar la concentración de sustrato que permite alcanzar la mitad de la velocidad de reacción catalizada por una enzima alostérica.

[S]0.5

[S]

Interacción Homotrópica Fijación de S a un protómero afecta fijación de otra molécula de S a otro protómero de la enzima

Interacción Heterotrópica Efecto producido por el sustrato (S), activador (A), inhibidor (I)

REGULACIÓN DE LA ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCasa)

X

Carbamilfosfato sintetasa II

Aspartato transcarbamilasa

N-carbamil aspartato

Citidina trifosfato (CTP)

REGULACIÓN DE LA ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCasa)

Mecanismo de interacciones alostéricas y cooperatividad

Modelo de simetría (concertado) de Monod-WymanChangeux s

T

equilibrio

s

1º ligando se une a protómero en cualquier conformación. Cuando ocurre cambio conformacional, se altera afinidad de los protómeros por ligando

s

s

s s

Simetría molecular conservada durante cambio conformacional

s

s s

s s

R

S se une de preferencia a estado R A se une sólo a R. I se une sólo a T

Modelo encaje inducido secuencial Koshland-Némethy-Filmer - Ligando induce cambio conformacional en una subunidad. - Surgen interacciones cooperativas de este cambio conformacional sobre las otras subunidades. S

S s

s

S

S s s

s

s

s

s

s

s

Clasificación de Enzimas Alostéricas • Clase K – Efector altera el Km pero no Vm – Gráfica doble recíproca similar a inhibición competitiva porque afecta afinidad de centro de fijación de S

• Clase V – Efector altera Vm pero no Km – Gráfica doble recíproca similar a inhibición no competitiva porque incrementan/disminuyen velocidad de descomposición de E-S

¡Fin del primer capítulo!