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UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICA

GUIA DE PRÁCTICAS DE ANALISIS CLINICOS II Mg. JUAN CARLOS BENITES AZABACHE

ALUMNA:

INTRODUCCION

Una de las características del laboratorio de análisis clínicos es la de utilizar muestras clínicas con el objeto de obtener datos que sirvan de apoyo para el diagnóstico de enfermedades y como revisión rutinaria de la salud del paciente. Gracias a las pruebas que se realizan en el laboratorio de análisis clínicos podremos detectar enfermedades frecuentes, tales como la anemia, la diabetes, infecciones varias, y otras menos frecuentes y más graves como la leucemia u enfermedades cancerígenas. Esto plantea la necesidad de que el estudiante este preparado para poder utilizar la tecnología más actualizada en el análisis de estas muestras así como estar preparado para desarrollar las técnicas necesarias con este fin. El curso de Análisis clínicos II está diseñado para brindar al estudiante las herramientas necesarias para en el futuro poder desempeñarse en el campo de los análisis clínicos y uno de los medios para el logro de nuestros propósitos lo constituye la GUIA DE PRACTICAS DE ANALISIS CLINICOS II, el cual ha sido concebido como un material educativo que va a servir para afianzar conocimientos, desarrollar habilidades y destrezas, así como orientar la autoeducación permanente. por ello se ubica como un material de lectura independiente, es accesible, sirve de información y recreación, desempeña un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar conocimientos en otras fuentes, crear hábitos y actitudes, así como a desarrollar destrezas para el procesamiento de información, adquisición y generación de conocimientos. Los alumnos deben leer detenidamente cada práctica, antes de su realización, para una mejor comprensión en el desarrollo de esta, además debe realizar esquemas de lo observado el cual será revisado por el profesor responsable de cada grupo de práctica.

ALGUNAS REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS

Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior.

Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria.

1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: extinguidores, salidas de emergencia, botiquín de primeros auxilios.

2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse. 3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en los refrigeradores. 4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes). 5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceros, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. 8. No se permitirá pipetear con la boca. 9. No se permitirá correr en los laboratorios. 10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán anteojos de seguridad. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto. 11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, máquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación. 12. Las superficies de trabajo se descontaminan luego de finalizar el trabajo o al fin del día y luego de cada derrame o salpicadura de material viable con desinfectantes efectivos contra los agentes en cuestión. 13. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc. 14. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, aquellas que pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana.

15. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender fuego. No se operará con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca de las mismas.

16. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas.

17. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces. 18. Está prohibido descartar líquidos o material biológico por los desagües de las piletas. En cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos. 19. Todos los cultivos y otros desechos biológicos se descontaminan antes de ser desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. 20. Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia. -

Se sugiere la siguiente lectura: http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf

Tipificación del sistema ABO Objetivo: Al término de la práctica el alumno determinara los cuatro grupos sanguíneos en sangre del sistema ABO. Generalidades: En la membrana del glóbulo rojo existen complejos químicos que representan los llamados grupos o factores sanguíneos Fué Landsteiner quién realizó en 1900 el importante descubrimiento de que los eritrocitos del hombre pertenecen a varios sistemas Antigénicos diferentes, este autor descubrió el sistema A B O. La clasificación del grupo sanguíneo está, determinada por la presencia o ausencia de los aglutinógenos en el eritrocito y las aglutininas en el suero. Para la identificación del grupo sanguíneo ABO se deben hacer dos investigaciones consecutivas: la primera se llama tipado globular y es la determinación de los aglutinógenos eritrocíticos con antisueros o aglutininas conocidas, la segunda se llama tipado sérico o contratipado y es la identificación de las aglutininas utilizando glóbulos rojos con antisueros conocidos, los sueros patrones deben ser de alto título, estos sueros pueden ser preparados en el laboratorio o en su defecto, se consiguen en las casas comerciales de productos biológicos. La investigación de los aglutinógenos eritrociticos se deben realizarse por el método de tubo de ensayo. Se utilizan tres reactivos llamados: suero anti A (de sangre b), de color azul y que contiene aglutininas alfa, suero anti B (de sangre a), de color amarillo y que contiene aglutininas beta, existe además otro suero, el anti AB que contiene las dos aglutininas, alfa y beta. Fundamento: Los antígenos de los hematíes son estructuras químicas que proporcionan propiedades específicas a su superficie y que solo pueden detectarse con anticuerpos que corresponden a esos antígenos la mayoría de estas reacciones antígeno-anticuerpo implican la aglutinación o hemólisis de los hematíes. Material y equipo: 

Ø 1 gradilla



Ø 16 tubos 10 x 75



Ø 4 tubos 13 x 100



Ø 4 pipetas Pasteur con bulbo



Ø Centrifuga clínica



Ø Centrífugas Serofuge



Ø Sueros hemoclasificadores Anti-A, Anti B. Anti-AB



Ø Albúmina bovina al 22% o 33%



Ø Solución fisiológica en Pizeta



Ø Sangre problema

Tipificación en tubo. Técnica:

1. Se prepara una suspensión de glóbulos rojos al 5%, previamente lavado en solución fisiológica.

2. En una gradilla colocar 4 tubos de ensaye de 10 x 75, marcados con las letras A, B, AB y Control.

3. En cada tubo poner una gota de suspensión de glóbulos rojos al 5%. 4. En el tubo marcado con A poner una gota de suero anti A, en el tubo marcado con B, poner una gota de suero anti B, en el tubo AB una gota de suero anti AB

5. Se debe hacer un control agregando a 1 tubo con una gota de albúmina bovina al 22 % 6. Mezclar perfectamente los tubos y dejar reposar por dos minutos. 7. Mezclar nuevamente y se procede a centrifugar a 2,500 r p m durante un minuto 8. Se sacan los tubos cuidadosamente de la centrifuga evitando que se mezclen los glóbulos rojos que quedan depositados en el fondo de los tubos y para efectuar la lectura se sacuden cuidadosamente el botón del fondo, uno por uno buscando si existe aglutinación macroscópica.

9. Si la aglutinación tuvo lugar, puede comprobarse en el seno del líquido claro los hematíes que nadan y se flotan formando pequeños agrupamientos, si el resultado es negativo los glóbulos rojos se distribuyen uniformemente por el líquido.

10. El resultado se reporta de acuerdo a la intensidad del grupo y al color del liquido sobre nadante, de una o varias cruces, hasta cuatro.

11. Si existe duda en la lectura se podrá observar al microscopio una gota o incubar los tubos a 37° C. durante 30 minutos.

también se pueden

Prueba sérica o inversa Objetivo: Al contrario de las: pruebas anteriormente descritas que emplean sueros testigos, esta prueba utiliza glóbulos rojos testigos tipo A, B y AB en suspensión al 5% y suero de la persona a clasificar la prueba puede realizarse en tubo, de acuerdo con las técnicas antes descritas Interpretación de resultados: Grupo sanguíneo aglutinación en tubo Anti A

Anti-B

Anti AB

Grupo A

Positivo

Negativo

Positivo

Grupo B

Negativo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Grupo AB Grupo O

Es recomendable que la tipificación al realizarse, los resultados son más confiables tubo, ya que la aglutinación se puede expresar en cruces, de una a cuatro, dependiendo del grado de la misma. 4 cruces; la aglutinación se presentará como un botón sólido con fondo claro y grumos gruesos. 3 cruces; la aglutinación serán varios grumos grandes con el fondo claro o rosado 2 cruces pocos grumos y muy pequeños, una suspensión uniforme 1 cruz pocos grumos, muy pequeños, el fondo muy rosado. Negativo: Una suspensión uniforme de color rojo. Comentarios: Los principales errores que pueden existir en la clasificación sanguínea, son los siguientes: Error en la preparación de la suspensión de glóbulos rojos así si se ha colocado demasiada sangre (mezcla de color rojo intenso) en exceso de glóbulos rojos puede absorber la aglutinina del suero y no evidenciar la aglutinación.

Si se ha colocado poca sangre (La mezcla color rosa muy pálido) la escases de glóbulos dificultará la lectura macroscópicamente. Con respecto a los sueros hemoclasificadores:

a)

pueden estar envejecidos, mal preparados y su potencia débil. contaminado control de

calidad se observa turbio y de mal olor.

b)

con respecto a las sangres: sangres viejas o contaminadas con bacterias.

c)

con respecto a la manipulación:

Rotulación equivocada de los tubos Colocación errónea de los reactivos Equivocación en los reportes.

Tipificación del sistema Rho. Objetivo: Al término de la práctica el alumno clasificará además del sistema sanguíneo ABO el factor Rho. Generalidades: Además de los Antígenos del sistema ABO, existe otro sistema de mayor importancia que es el factor Rho. Landsteiner y Wiener descubrieron en 1990 la existencia de un aglutinógeno en los glóbulos rojos humanos que llamaron factor Rho, a fin de recordar con las dos iniciales del mono rhesus. El mecanismo que permitió ponerlo en evidencia fue el inyectar glóbulos rojos lavados de dicho animal (macacus rhesus) en conejos, obteniéndose de este modo un suero capaz de aglutinar un 85% de los hematíes humanos. El suero de conejo preparado en la forma indicada contenía la aglutinina correspondiente al factor Rho y se denominó Anti Rho, las personas cuyos glóbulos rojos eran aglutinados por el suero Anti Rho se denominaron Rh positivos, y los hematíes no eran aglutinados por el suero Anti Rho se denominaron Rh negativos, se comprobó que el 85% de las personas de raza blanca son Rh positivos y que el 15% restantes son Rh negativos, posteriormente se descubrió que el factor Rh no era el único, sino que se trataba de un factor muy complejo por tanto existen tres factores principales: 

Ø El rir(nomenclatura de Wiener) o d (nomenclatura de Fisher race).



Ø El rh1 (nomenclatura de Wiener) o c (nomenclatura de Fisher race).



Ø El r1r” (nomenclatura de Wiener) o e (nomenclatura de Fisher race).



Ø Levine y Stetson describieron un caso de inmunización materno fetal en el segundo embarazo de una mujer que dio a luz un feto muerto. La presencia del Anticuerpo inmune se comprobó al transfundirle sangre del esposo,

compatible con el sistema ABO, con la que reaccionó violentamente, esto hizo suponer que la madre había elaborado Anticuerpos contra un Antígeno poseído por el feto, que a su vez había heredado del padre, esto hizo evidenciar la presencia de otro tipo de Anticuerpo que no tenía nada que ver con los del sistema ABO y así descubrió el factor Rho-

El sistema sanguíneo rh-hr está formado por un grupo de antígenos de naturaleza proteica la transfunsión de glóbulo rojos con estos factores, a pacientes que no los tengan, pueden dar lugar a la formación de Anticuerpos específicos estos Anticuerpos pueden ser la causa de reacciones post transfusionales severas o casos de inmunización materno fetal produciendo una anemia hemolítica por defectos extra corpusculares ya que los Anticuerpos maternos actúan sobre los glóbulos rojos normales; además de los ya descritos, existen otros, pero el más importante se le llama factor rh ó factor du. Fundamento: El factor Rho. Es un antígeno que se encuentra en la membrana del eritrocito el cual reacciona con su Anticuerpo correspondiente que se encuentra en el suero anti-D que contiene la aglutinina correspondiente al factor Rho, llamado también anti Rho, anticuerpos que se detectan, son del tipo de la IgG que poseen la capacidad de cruzar la barrera placentaria por su bajo peso molecular, iniciando por tanto la enfermedad. La presencia del factor Rho se pone de manifiesto mediante una reacción antígeno-anticuerpo y se observa por aglutinación y hemólisis. Material y equipo: 

Ø 1 gradilla



Ø 4 tubos 10 x 75



Ø 4 tubos 13 x 100



Ø 4 pipetas Pasteur con bulbo



Ø Centrifuga Serofuge



Ø Suero Anti-D



Ø Antiglobulina humana



Ø Solución Salina en pizeta



Ø Baño maria a 37oC

Método en tubo: Técnica: Se prepara una suspensión de glóbulos rojos en solución fisiológica al 5%

1. En un tubo de ensayo 10 x 75, se coloca una gota de suero anti Rho (D) y se le agrega una gota de suspensión de los eritrocitos problema al 5%

2. Se homogeniza con un movimiento suave, se centrifuga a 3,500 r.p.m- durante 30”

3. Se realiza la lectura, en busca de aglutinación, en caso de duda se incuba durante 15’ al cabo de este tiempo se efectúa lectura, suspende suavemente el sedimento.

4. Nuevamente se centrifuga durante 30″ a 3,500 r.p.m. se rea liza la lectura 5. Se observa aglutinación con grumos visibles, si hay duda se confirma la lectura mediante observación microscópica. Interpretación de resultados. 

Ø Si la sangre examinada Rho. positiva se nota la formación grumos fácilmente observables a simple vista.



Ø En caso de ser Rho. negativo el aspecto es homogéneo, no existe aglutinación.

Determinación de antígeno Du

Objetivo: El alumno investigara la presencia de variante Du que es una expresión débil o incompleta de un factor del Rho, pero con capacidad antigénica. Introducción: El Du, es un alelo de D, muy importante pero irregular. No existe suero anti-Du específico. Algunas sangres Du deben esta característica al hecho de que el factor D normal heredado, de uno de los padres, está enmascarado por el factor C de un cromosoma aparejado dCe (r´) heredado de otro progenitor: este tipo se conoce como “Du por interacción genética”. El otro tipo “Du hereditario” puede atribuirse a transmisión de un D debilitado. Los glóbulos de algunos sujetos Du pueden ser aglutinados directamente por casi todos los sueros anti D, estos casos se denominan ”Du” de título elevado”. Otras sangres Du son aglutinados solamente por unos cuantos sueros anti D; son los “Du de título bajo”. Lo importante respecto a los glóbulos Du, especialmente la variedad “título bajo”, es que probablemente parecerán Rho. Negativos al ser mezclados con anti D. Solamente podrán reconocerse mediante:

1) Modificación enzimática previa

2) Exposición previa al suero anti D incompleto y luego prueba de Coombs. Los glóbulos Du dan una prueba de Coombs positiva en estas circunstancias. Se recomienda el segundo método. Otra consideración todavía más importante respecto al Du, es que todos los que poseen el alelo Du deben considerarse como donadores Rho. Negativos. Esto se debe a que el Du puede producir anti D en un sujeto Rho. Positivos, pero receptores Rho. Negativos. Esto se debe a que el Du puede producir anti D en un sujeto Rho. Negativo, y también a que algunos Du producen ellos mismos anti D. Además los sujetos Du por “acción intergenética” no deben recibir sangre que contenga el antígeno c, muy potente, en otras palabras, debe recibir sangre del genotipo Dce/dCe o DuCe/dCe esta última generalmente corresponde a su propio genotipo. Fundamento: Ciertos eritrocitos Rho.+, alrededor del 1% con mayor frecuencia en la raza negra que en la caucásica, no son aglutinados por el suero anti Rho. (anti D) pero después de ser expuesto a los anticuerpos Rho. (D), darán una reacción positiva si se tata con suero de Coombs. Generalidades: Los hematíes del grupo D presentan diferencias en cuanto a su reactividad; se acepta que varios de los factores del sistema Rho. en ocasiones se expresan en forma débil o incompleta los más importantes son: el Du, el Cw y el Eu en realidad solo el Du tiene importancia en el banco de sangre debe sospecharse de ser Du, las sangres que son difíciles de clasificar como Rh positivos o negativos, utilizando solo el suero anti-D El paciente Du positivo debe recibir sangre Du negativa ya que se han reportado casos que por recibir sangre Rho. positiva desarrollan anticuerpos Anti Rho. de especificidad Anti-D, elfactor Du de Stratton, como es débil no es fácil determinarlo, pero conserva su capacidad antigénica. Para investigar este grupo, la técnica de aglutinación con el suero Anti-D ha dado resultados débiles, sin embargo ha servido para que los Anticuerpos se fijen y la prueba de Coombs indirecta nos dará el resultado positivo; observando macroscópicamente el fenómeno de aglutinación: el Antígeno Du se determina

por la aglutinación de los glóbulos rojos en presencia del suero Anti-D y Antiglobulina Humana Material y equipo 

Ø 1 gradilla



Ø 4 tubos 10 x 75



Ø 2 pipetas pasteur con bulbo



Ø 1 Centrifuga Sarofuge



Ø 1 baño María a 370c



Ø Suero Anti-D



Ø Suero de Coombs



Ø Albúmina bovina al 22%



Ø Solución salina en pizeta

Método en tubo:

1. Preparar glóbulos Rho. negativos al 5% 2. Marcar dos tubos No 1 problema y No 2 control, agregar en cada tubo dos gotas de la suspensión de glóbulos rojos.

3. Al tubo No 1 agregar una gota de suero Anti-D y una gota de Albúmina bovina al 22%, al tubo No 2 dos gotas albúmina bovina al 22%

4. Mezclar y dejar reposar durante dos minutos 5. Centrifugar en busca de aglutinación 6. Lavar por tres ocasiones 7. Después del último lavado, decantar completamente y agregar dos gotas de Antiglobulina humana a cada tubo

8. Incubar durante 15 minutos a 37° C 9. Centrifugar a 3,500 rpm x 1 minuto 10. Leer sobrenadante y despegar el botón del fondo del tubo cuidadosamente en busca de aglutinación

11. Reportar por escrito

Interpretación de resultados 

Ø En el tubo control no debe encontrarse aglutinación.



Ø Si el tubo problema se observa con aglutinación se habla de la presencia del factor Du.



Ø Si hubiese aglutinación en los dos tubos significa que se trata de glóbulos rojos cubiertos o bloqueados, por lo tanto si se trata de donador la sangre será desechada

PRUEBA DE COOMBS OBJETIVO. Demostrar la presencia de anticuerpos hemoagrupadores absorbidos a las células rojas en vivo (prueba directa), además de la presencia de anticuerpos absorbidos invitro. FUNDAMENTO. Se basa en el principio de los ateroanticuerpos contra componentes del suero humano según la descrita por Mareschi y los principios de la aglutinación publicados por Landsteiner. Los eritrocitos humanos en presencia de un anticuerpos dirigido contra un antígeno que posean, pueden ser sensibilizadas para no lograr la aglutinación por la naturaleza misma del anticuerpo o el antígeno en cuestión. El suero antihumano, reaccionará contra la gamma globulina que han sensibilizado a componentes del complemente humano y propiciará la aglutinación de los eritrocitos. INTRODUCCIÓN. Marechi en 1908 escribió el principio de la reacción de antiglobulina. Fue hasta 1945, cuando se usó como prueba inmonohematológica por Coombs, Maurant y Race detectan anticuerpos anti Rh. En 1957 Dacie y colaboradores definieron la reacción del suero de antiglobulina con componentes de complemento humano. El suero anti-humano, llamado suero de Coombs se prepara por medio de inyecciones repetidas a los animales con sueros humanos mezclados del grupo 0, después de eliminar hemolisinas y aglutinas no específicas se agrega al suero ácido de sodio al 0.1% como conservador. El suero deberá mantenerse entre 2° y 8°C mientras no esté en uso, para evitar su desnaturalización y contaminación. Como lo dice su nombre, esta prueba permite establecer la presencia de globulinas; pero puesto que los anticuerpos son globulinas, permite encontrarlas también. Los anticuerpos incompletos, entre ellos muchos de los que explican la eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica adquirida, se absorben sobre la superficie de los eritrocitos, pero no los aglutinan. El suero antiglobulina humana (de Coombs) permite reconocer estos glóbulos rojos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulinicos que ya cubren su superficie, con lo cual se produce la aglutinación. Puesto que el suero contiene globulinas que neutralizan muy rápidamente los anticuerpos

antigobulinas humanas (de Coombs), es evidente que para identificar los glóbulos sensibilizados es absolutamente necesario remover la totalidad del suero de los glóbulos mediante lavados repetidos (tres cuando menos) con grandes volúmenes (50 a 100 veces el volumen de los glóbulos rojos) de suero fisiológico estéril. El suero de Coombs, es un auxiliar en el diagnóstico por lo que que se usa rutinariamente en las siguientes pruebas:

1.

Prueba de compatibilidad o pruebas cruzadas.

2.

Detección e identificación de anticuerpos.

3.

Prueba para la variante del antígeno Rh-D llamada Du.

4.

Pruebas de eritrocitos en cordón umblical a pacientes transfundidos (Coombs directo).

MATERIAL

1.

Gradilla metálica

2.

Tubos de Khan (13 x 75mm).

3.

Tubos de hemólisis

4.

Pipeta Pasteur con bulbo

5.

Cronómetro

6.

Termómetro de – 10°C a +110°C

7.

Torundas con alcohol

8.

Lanceta deshechable

APARATOS

1.

Centrífuga

2.

Baño maría eléctrico

MUESTRA

1.

Sangre completa

2.

Suero

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA: La prueba directa de Coombs se usa para demostrar la presencia de los anticuerpos que se han fijado en las células del paciente in vivo, por ejemplo en la enfermedad hemolítica del recién nacido, en la anemia hemolítica adquirida, etc.

PROCEDIMIENTO

1.

Preparar una suspensión al 2% en solución salina normal de las células probadas.

2.

Agregue dos gotas de la suspensión de las células preparadas a un tubo de 13 x 75mm.

3.

Lavar con solución salina y centrifuge a 3500 r.p.m. durante 1 minuto. Efectúe este lavado

tres veces.

4.

Después del último lavado, decante lo más posible.

5.

Agregue dos gotas de suero anti-humano

6.

Mezcle bien y centrifugue por 1 minuto a 1500 r.p.m. por 15 segundos.

7.

Resuspenda los eritrocitos de los tubos y examine el resultado.

INTERPRETACIÓN La aglutinación de los eritrocitos del paciente, por el anti-humano, indica que estos se encontraban sensibilizados por anticuerpos. PRUEBA INDIRECTA DE COOMBS: La prueba indirecta de Coombs es utilizada para demostrar la presencia de los anticuerpos circulares que cubren, pero que no aglutinan, a las células suspendidas en salina. Se efectúa esta prueba combinando “in vitro” a un anticuerpo con antígeno específico. Ejemplo, cuando se hace una prueba anti-D en un suero materno, las células de la prueba deberán contener el antígeno D. PROCEDIMIENTO

1.

Prepare una suspensión al 2% en solución salina normal de las células seleccionadas para

la prueba.

2.

Agregue dos gotas del suero que va a probarse a un tubo de Khan.

3.

Agregue dos gotas de la suspensión de las células preparadas, al tubo Khan

4.

Agregue dos gotas de albúmina bovina solución al 22% al tubo

5.

Incube en un baño maría a 37°C por 15 minutos. (la incubación puede prolongarse hasta 60

minutos si se desea).

6.

Saque el tubo del baño maría, llénela con solución salina fresca, centrifugue a 3500

r.p.m. durante 1 minuto y decante. Lávese tres veces.

7.

Después del último lavado, decante lo más posible.

8.

Agregue dos gotas de suero Anti-humano y mezcle bien.

9.

Centrifugue por 1 minuto a 1500r.p.m. durante 15 segundos.

10. Resuspenda los eritrocitos con una agitación moderada y examine el resultado CONTROLES POSITIVOS

Y NEGATIVOS PARA LA PRUEBA ANTIGLOBULINA

(COOMBS)

1.

Preparese suspensiones al 2% de sangre conocidas como Rh positivas y Rh negativas, en

solución salina. (las muestras de sangre deberán ser de personas normales y sanas cuyas células den una reacción negativa en la prueba directa de Coombs).

2.

Diluya el suero Anti-D (anti-Rho) con solución salina a una proporción a cada de los tubos de

ensayo.

3.

Coloque dos gotas de las suspensiones preparadas a los tubos de ensaye identificados

adecuadamente.

4.

Incube a 37°C por 15 minutos. Durante este tiempo, las células Rh negativas permanecerán

sin cubrirse y servirán como el control negativo.

5.

Saque los tubos del baño maría. Llene los tubos con solución salina fresca y centrifugue a

alta velocidad. Repita el procedimiento por 3 veces. Decante completamente el sobrenadante después del último lavado dejando las células depositadas en el fondo de los tubos

6.

Agregue dos gotas de suero anti-humano en cada tubo y agítelo bién; centrifugue a

3500r.p.m. durante 15 segundos.

7.

Resuspenda el depósito celular mediante ligera agitación y examine el resultado.

8.

Las células Rh positivas estarán aglutinadas mientras que ls células Rh negativas

permanecerán sin aglutinarse.

ANTIGENOS FEBRILES

Los antígenos febriles son suspensiones estandarizadas de bacterias muertas preparadas para la detección y semi cuantificación por aglutinación en porta o tubo de las aglutininas séricas humanas, un grupo de anticuerpos que se desarrollan durante algunas infecciones febriles tales como la brucelosis, salmonelosis y ciertas rickettsiosis. La determinación se efectúa ensayando los antígenos somáticos y flagelares, frente a los sueros problema. La presencia o ausencia de aglutinación visible está usualmente relacionada con la presencia o ausencia del anticuerpo homólogo correspondiente en las muestras ensayadas. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Conservar a 2-8ºC. No congelar los componentes del kit ya que la funcionalidad del test podría verse afectada. Los Antígenos y los Controles son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

MUESTRAS Suero claro, reciente. Una vez separado, el suero puede guardarse a 2-8ºC durante una semana antes del ensayo, o por un período mayor a –20ºC. Portas o placas de vidrio. Palillos desechables. Tubos de ensayo (12 x 100 mm). Pipetas de volumen variable. Solución salina (NaCl 0,9%). Agitador mecánico rotatorio de velocidad variable Baño termorregulable (30-50ºC). Prueba cualitativa Equilibrar reactivos y muestras a temperatura ambiente. Resuspender el antígeno con suavidad. Aspirar y vaciar varias veces el cuentagotas para asegurar su homogeneidad antes del ensayo. Depositar 50 μL de suero problema en uno de los círculos de la tarjeta visualizadora. En la detección de anticuerpos anti-brucela, 20 μL de muestra es suficiente. En círculos adicionales, depositar 1 gota de control positivo y 1 gota de control negativo. Añadir a cada círculo 1 gota de la suspensión antigénica, próxima a la muestra a analizar. Efectuar la mezcla con ayuda de un palillo desechable, extendiéndola de forma que cubra por completo la superficie interior de cada anillo. Emplear palillos distintos para cada mezcla. Mover la tarjeta a mano o con agitador rotatorio (100 r.p.m.) durante 1 minuto. Observar de inmediato con la ayuda de una luz adecuada, la aparición de cualquier signo de aglutinación Lectura Reacción negativa: Suspensión uniforme sin cambio visible alguno, tal como se presenta en el control negativo. Reacción positiva: Aglutinación débil o intensa, fácilmente visible macroscópicamente.

Prueba semi-cuantitativa Para cada muestra a analizar, pipetear 80, 40, 20, 10 y 5 μL de suero en cada uno de los círculos de la placa visualizadora. Ensayar cada una de las diluciones tal como se describe en los pasos 4-7 de la Prueba Cualitativa. Lectura Como en la Prueba Cualitativa. El título de la muestra corresponde a la máxima dilución que presenta reactividad VALORES ESPERADOS Salmonelas y Brucelas: Títulos superiores a 1/80 (antígenos somáticos y brucelas 1/200) y 1/160 (antígenos flagelares) son generalmente indicativos de infecciones recientes. Proteus: Títulos inferiores a 1/160 no deben ser considerados significativos. Un resultado positivo aislado tiene menor significado clínico que la demostración de un aumento o disminución del título en muestras tomadas del mismo paciente en diferentes días. SIGNIFICADO CLINICO Antígenos Febriles es un término referido a un grupo de suspensiones bacterianas, representativo de un número de bacterias patógenas para la especie humana y responsables de la aparición de infecciones (brucelosis, salmonelosis y ciertas rickettsiosis) que cursan con un cuadro febril en el huésped infectado. La mejor forma para establecer la etiología de una enfermedad infecciosa es el aislamiento e identificación del agente causal de la misma. Sin embargo, estos medios de diagnóstico no son siempre de fácil aplicación y es ahí donde radica la importancia del uso de las suspensiones bacterianas en la detección de los anticuerpos presentes en el suero del paciente (método indirecto de diagnóstico). En el diagnóstico clínico, los resultados obtenidos con el uso de los Antígenos Febriles deben ser considerados siempre en relación a los hallazgos clínicos y otras pruebas de laboratorio. REFERENCIAS Felix, A. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 37: 321 (1944). Comité mixto FAO/OMS de expertos en Brucelosis. Wld. Hlth. Org. Tech. Rep. Ser. 148: 1 (1958)

DETERMINACION DE hCG BASES DEL ENSAYO La gonadotrofina coriónica humana (hCG) es una hormona de naturaleza glicoproteica secretada durante el desarrollo de la placenta, detectable en la orina y sangre de las mujeres embarazadas. Durante un embarazo normal, se puede detectar hCG en el suero en torno al décimo día después de la fecundación. El subsecuente incremento de su concentración en las primeras etapas de la gestación, la hacen un marcador ideal para la detección precoz del embarazo. Su existencia en un momento diferente al embarazo está asociada a la presencia de tumores. La molécula de hCG está constituida por dos sub-unidades, unidas no covalentemente, denominadas a y b. La subunidad a de hCG es similar a la subunidad a de varias hormonas secretadas por la hipófisis: la tiroide estimulante (hTSH), la folículo estimulante (hFSH) y la hormona luteinizante (hLH). La diferencia entre ellas se encuentra en la secuencia aminoacídica de la subunidad b la cual les confiere la especificidad biológica e inmunológica. El ELISA hCG, es un ensayo inmunoenzimático rápido para detectar la presencia de hCG en suero u orina, con una sensibilidad de 25 mUl/mL. Este ensayo utiliza una mezcla monoclonal y policlonal específico contra la subunidad b de hCG, lo cual elimina la interferencia de reacciones cruzadas con hFSH, hLH y hTSH, en niveles fisiológicos. El ensayo permite la reacción simultánea del anticuerpo conjugado con una enzima (anticuerpo indicador) y el anticuerpo unido a la fase sólida (anticuerpo de captura). En presencia de hCG, se forma un complejo específico en la superficie del pocillo compuesto por: anticuerpo-antígenoanticuerpo-enzima. El exceso de anticuerpo indicador se elimina por lavados y luego los pocillos se incuban con la solución de substratos. El desarrollo del color azul indica la presencia de hCG. Comparando la intensidad del color en la muestra con una re-ferencia conocida (control positivo), el nivel de hCG puede ser visualmente estimado como mayor o menor que 25 mUl/ mL. MATERIALES Y REACTIVOS INCLUIDOS

1. Conjugado: Frasco con 7 mL de solución del anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa. 2. TMB: Frasco con 11 mL de Substrato TMB, un componente. 3. Control Positivo 25 mUl/mL: Frasco con 1 mL de solución estándar de 25 mUl/mL de hCG. 4. Control Positivo 150 mUl/mL: Frasco con 1 mL de solución estándar de 150 mUl/mL de hCG. 5. Control Negativo: Frasco con 1 mL de solución proteica. 6. Acido clorhídrico 1N: Frasco con 10 mL de Acido clorhídrico 1N. 7. Placas de Micropocillos: Contienen los anticuerpos policlonales dirigidos contra hCG. 8. Soporte para las placas.

9. Gotarios desechables. INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Guarde los reactivos entre 2º y 8ºC. No los congele. PRECAUCIONES 1. No agregue Azida de Sodio a las muestras, porque inhibe la actividad de la peroxidasa. 2. No mezcle los reactivos que provienen de lotes diferentes. 3. No use reactivos cuya fecha de expiración se haya cumplido. 4. No intercambie las tapas de los frascos. 5. No exponga el reactivo sustrato B a la luz directa durante su uso o almacenamiento. OBTENCION DE LA MUESTRA La muestra de orina (0,5 mL) debe ser recolectada en un recipiente limpio, de plástico o vidrio, sin preservantes químicos ni detergentes. Se pueden usar muestras tomadas a cualquier hora del día, sin embargo, la primera orina de la mañana es la más recomendable porque contiene una mayor concentración de la hormona. Las muestras de orina pueden ser refrigeradas entre 2º y 8ºC, hasta 72 horas antes del ensayo. Si la muestra de orina contiene precipitados, puede ser filtrada, centrifugada o debe dejarse decantar. La muestra de suero (0,5 mL) no requiere una preparación especial. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

A. Técnica Cualitativa Todos los reactivos deben ser agitados y llevados a temperatura ambiente antes de empezar el ensayo.

1. Coloque los micropocillos sobre el soporte. 2.Dispense en pocillos separados una gota (50 µL) de la muestra del paciente, una gota de control negativo y una gota del control positivo. Use puntas desechables nuevas para cada muestra.

3. Agregue 1 gota del conjugado a cada pocillo. 4. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. 5. Remueva el contenido de los pocillos invirtiendo el soporte rápidamente sobre un lavadero y lave 5 veces, llenando el pocillo cada vez (300 µL) con agua corriente o agua destilada. Cuide que no haya contaminación entre los pocillos durante el primer lavado. Después del último lavado, ponga la placa invertida sobre el papel absorbente. No permita que la placa se seque.

6. Agregue 2 gotas de TMB, e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.

7. Compare el color desarrollado en los pocillos de las muestras con el control positivo y con el control negativo. Lea los resultados dentro de 10 minutos.

B. Técnica semi-cuantitativa Con el fin de realizar un análisis semi cuantitativo debe realizar una curva estándar con los controles incluidos en el kit, siguiendo el mismo procedimiento indicado hasta el punto 6. Después de los cinco minutos de incubación agregue 2 gotas de solución de HCI 1N en cada pocillo. Lea los resultados en un lector para microplacas de ELISA utilizando un filtro de 450 nm. Calcule la concentración de hCG en las muestras por medio de la curva estándar. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

1. POSITIVO: El pocillo de la muestra presenta color azul, igual o más intenso que el Control Positivo de 25 mUl/mL de hCG. Indica la presencia de hCG.

2. NEGATIVO: El pocillo no muestra color a los 10 minutos indicando que no hay hCG en la muestra o su nivel es inferior al detectable por este ensayo. Una pequeña coloración, mucho más leve que la del Control Positivo, puede ser producto de un lavado insuficiente y debe considerarse negativo. Si las muestras resultan negativas, pero hay sospechas de embarazo, el ensayo debe repetirse usando muestras frescas obtenidas 48 a 72 horas después. La incubación prolongada con los reactivos-sustrato puede dar como resultado en el control negativo un azul menos intenso que el del control positivo. Esto debe ser considerado como negativo. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

1. Condiciones diferentes al embarazo las que incluyen enfermedades trofoblásticas y algunos neoplasmas no trofoblásticos producen altos niveles de hCG. Esto se debe considerar cuando se realiza un diagnóstico de embarazo.

2. Si la muestra de orina es muy diluida (gravedad especí-fica muy baja), puede no contener niveles representativos de hCG. Si hay sospecha de embarazo se debe obtener una muestra de la 1ª orina de la mañana para realizar el ensayo.

3. Una exposición prolongada del Kit a la luz solar puede causar activación del cromógeno. Por esta razón el producto no debe permanecer ni ser realizado el ensayo bajo una fuente de luz solar.

4. Así como ocurre con todos los ensayos de diagnóstico, el diagnóstico clínico definitivo no se debe basar en un solo resultado, y además debe ser realizado por el médico después que han sido evaluados todos los hallazgos clínicos y de laboratorio. REFERENCIAS

1. Batzer, F.R., Fertility & Sterility, 1980. 34: 1-13. 2. Catt, K.J., Dufau, M.L., and Vaitukaitis, J.L., J. Clin, Endocrinol. Metab. 1975. 40: 537- 540.

3. Braunstein, G.D., Rasor, J., Adler, D., Danzer, H., Wade, M.E., Am. J. Obstet. Gynecol., 1976. 126: 678-681.

4. Engvall, E. Methods in Enzymology, 1980. 70: 419-439. 5. Lenton, E.A., Neal, L.M., Sulaiman, R., Fertility & Sterility, 1982. 37 : 773-778. 6. Braunstein, G.D., et. al. Ann. lnter. Med., 1973. 78 : 39-45. 7. Wide, L., Acta Endocnnot, 41 (Supp. 70) 75, 1962. 8. Meyer. H.M., Jr., "Statement to be included in directions for use of Anti-hCG Serum". Memorandum, DEW, Bob, november 2, 1973.

PRUEBAS SEROLOGICAS PARA EL DIAGNOSTICO DE SIFILIS SIGNIFICACION CLINICA La sífilis es una enfermedad venérea causada por el Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en áreas de abrasiones. El contacto sexual es la forma más común de transmisión. La detección y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones traves como sífilis cardiovascular, neurosífilis y sífilis congénita. El diagnóstico de esta enfermedad sufre la carencia de un método para cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidérmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infección aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias denominadas "reaginas", que reaccionan con antígenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clínicos son por lo tanto los procedimientos más rápidos y útiles disponibles para diagnóstico de sífilis. FUNDAMENTOS DEL METODO Las "reaginas", presentes en individuos infectados por T.pallidum se detectan en suero por la reacción con un antígeno cardiolipínico purificado y estabilizado. Si la muestra contiene reagina, ésta se unirá al antígeno produciendo una floculación visible en microscopio. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina característica de la técnica USR (Unheated Serum Reagin) en la que no es necesario inactivar la muestra. REACTIVOS PROVISTOS Antígeno: suspensión acuosa de antígeno de cardiolipina y lecitina purificados, en buffer fosfatos con cloruro de colina y EDTA de acuerdo a las indicaciones de la O.M.S. REACTIVOS NO PROVISTOS - Solución fisiológica (para la prueba semicuantitativa). - Solución de cloruro de sodio 10 g/dl (para la técnica en líquido cefalorraquídeo). MATERIAL REQUERIDO

1- Provisto - 1 gotero 2- No Provisto - Agitador rotativo ajustable a 180 rpm. - Placa de vidrio transparente con sectores de 14 mm de diámetro cada uno. - Micropipetas para medir los volúmenes indicados. - Microscopio MUESTRA Suero, plasma o líquido cefalorraquídeo (LCR) a) Recolección: obtener de la manera usual. No inactivar. b) Aditivos: no se requieren para suero o LCR. Si la prueba se realiza con plasma, éste puede obtenerse empleando heparina, EDTA u oxalato de sodio como anticoagulantes. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis o hiperlipemia pueden ocasionar resultados erróneos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: en caso de no procesarse de inmediato los sueros pueden conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). El plasma puede emplearse hasta 24 horas luego de la extracción. PROCEDIMIENTO Tanto los reactivos como la muestra deben estar a temperatura

ambiente antes de realizar la prueba.

I- PRUEBA CUALITATIVA EN SUERO O PLASMA En cada uno de los sectores delimitados de la placa colocar: Muestra Con gotero provisto colocar: Antígeno

50 ul 1 gota

Agitar horizontalmente la placa a 180 rpm durante 4 minutos. Observar inmediatamente en microscopio con poco aumento (60 a 100 X). II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA EN SUERO O PLASMA Preparar diluciones de la muestra 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32 con solución fisiológica y realizar para cada dilución la prueba como se describe en I. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Reactivo: presencia de floculación. No reactivo: ausencia completa de floculación. Prueba semicuantitativa: el título estará dado por la inversa de la última dilución que se observe reactiva. Leer atentamente las LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar la calidad del sistema procesar un Control Positivo (suero seguramente reactivo) y un Control Negativo (suero seguramente no reactivo) utilizándolos de la misma forma que las muestras. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Resultados falsamente positivos pueden ser observados en individuos con cuadros patológicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cáncer, diabetes y enfermedades autoinmunes. Estos casos no son muy comunes y generalmente presentan reacciones con títulos bajos y una historia clínica que no coincide con las características de sífilis. Es imprescindible por estos motivos ante toda prueba cualitativa reactiva realizar la prueba semicuantitativa. Resultados falsamente negativos pueden observarse cuando se presenta el fenómeno de prozona. Por este motivo se recomienda repetir la prueba en suero diluido 1:5 con solución fisiológica para verificar el resultado. Si en estas condiciones se observa floculación la muestra es reactiva. A pesar de las ventajas de este método, sus resultados al igual que los de cualquier prueba serológica, sólo constituyen un dato auxiliar de diagnóstico que debe corroborarse con la historia clínica del paciente. BIBLIOGRAFIA - Zinsser Microbiología, Joklik W., Willett H. y Amos D., 17º edición Editorial Médica Panamericana, 1983. - Manual of Tests for Syphilis, cap. 8 - American Public Health Association, Washington, D.C 20005, 1990. - Podestá, D.; Svetaz. M.J.; Ricomi, R.; Capriotti, G.; Rojkín, L.; Lorenzo, L.; "Evaluación de tres reactivos para detección de sífilis" - VIII Congreso Argentino de Bioquímica, 54º Triduo Bioquímico Científico Anual 1990 - Revista A.B.A. 54/3, 1990.

DETERMINACION DE PROTEINA C REACTIVA MUESTRA: Suero MATERIALES Y EQUIPOS: Reactivo de Látex: suspensión de partículas de látex-poliestireno recubiertas con anti- PCR monoespecífico. Control Negativo: control prediluido, “no reactivo” con el Reactivo de Látex. Control Positivo: control prediluido, conteniendo más de 0,3 mg/l de PCR para dar una aglutinación visible.

- goteros o pipetas capaces de dispensar los volúmenes indicados - palillos mezcladores descartables - cronómetro - Lámina de vidrio - lámpara o fuente de luz PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo de Látex antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero. ITECNICA CUALITATIVA

1) Preparar muestra diluida 1:20 mezclando 1 gota (50 ul) de suero con 1 ml de Buffer. 2) En uno de los círculos de la placa de vidrio adjunta al equipo colocar:

Reactivo de Látex

Muestra diluida

1 gota (50 ul)

1 gota (50 ul)

Mezclar con palillo descartable hasta obtener una suspensión uniforme en la superficie del círculo. Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado dentro de 3 minutos. Para una correcta visualización de los resultados, debe mantenerse la placa sobre un fondo negro y ligeramente por encima de un haz luminoso horizontal. II- TECNICA SEMICUANTITATIVA (Titulación) Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en tubos de Kahn.

a) Colocar 1,9 ml de Buffer en el primer tubo y 1 ml en cada uno de los restantes. b) Agregar 0,1 ml de suero al tubo No 1 y mezclar.

Transferir 1 ml de esta dilución al tubo No 2 y mezclar, continuando así las diluciones hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc.

c) Ensayar cada dilución según la TECNICA I. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Negativo: suspensión homogénea. Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 3 minutos. Se califica de 1 a 4+. Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente. La concentración aproximada de PCR en la muestra puede ser calculada por la fórmula siguiente: PCR (mg/l) = Título x Sensibilidad de la reacción (0,3 mg/l) Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:40. Su concentración de PCR es de 40 x 0,3 = 12 mg/l.

DETERMINACION DE FACTOR REUMATOIDE MUESTRA: Suero MATERIALES Y EQUIPOS Antígeno de Látex-Globulina: suspensión de partículas de látex-poliestireno de 0,20 micrones de diámetro, que tienen adsorbidas molécula termoagregadas de gammainmunoglobulina o fracción II de Cohn. Buffer de Glicina (para diluir el suero a ensayar): solución conteniendo 7,5 g/l de glicina y 10 g/l de cloruro de sodio pH 8,2. Control Negativo: dilución de suero negativo. Control Positivo: dilución de suero positivo. Equivale a 2+.

- 1 placa de vidrio. - Palillo o varilla de vidrio. - Cronómetro. - Material volumétrico adecuado para efectuar mediciones y diluciones de las muestras. PROCEDIMIENTO: Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.

- TECNICA CUALITATIVA 1) Preparar Muestra diluida 1/20 mezclando 1 gota (50 ul) de suero con 1 ml de Buffer de Glicina. 2) En uno de los círculos de la placa de vidrio adjunta al equipo, colocar:

Muestra diluida 1 gota (50 ul) Antígeno de Látex-Globulina 1 gota (50 ul) Mezclar con palillo o varilla de vidrio hasta obtener una suspensión uniforme en toda la superficie del círculo. Inmediatamente, disparar un cronómetro, rotar suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos. Para una correcta visualización de los resultados, debe mantenerse la placa sobre un fondo negro y ligeramente por encima de un haz luminoso horizontal (ej. lámpara de microscopía). II- TITULACION Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas, en 8 tubos de Kahn. 1) Colocar 1,9 ml de Buffer de Glicina en el primer tubo y 1 ml en cada uno de los restantes.

2) Agregar 0,1 ml de suero al tubo No 1 y mezclar. Transferir 1 ml de esta dilución al tubo No 2 y mezclar, continuando de esta forma las diluciones hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; etc.

3) Ensayar cada dilución según TECNICA CUALITATIVA. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Negativo: suspensión homogénea. Positivo: aglutinación que aparece dentro de los dos minutos. Se califica de 1 a 4 (+). Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente. La concentración aproximada de factor reumatoideo en la muestra, puede ser calculada por la fórmula siguiente: FR (UI/ml) = Título x Sensibilidad de la reacción (1 UI/ml) Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:40. Su concentración en FR es de 40 x 1 = 40 UI/ml. VALORES DE REFERENCIA No están claramente establecidos. Se consideran patológicos valores superiores a 20-30 UI/ml.

DETERMINACION DE ANTIESTREPTOLISINA O MUESTRA: Suero MATERIALES Y EQUIPOS Reactivo de Látex: suspensión de partículas de látex poliestireno recubiertas con estreptolisina O. Control Negativo: suero humano no reactivo con el Reactivo de Látex. Control Positivo: suero humano conteniendo antiestreptolisina O en superior a 250 UI/ml.

concentración

- goteros o pipetas para dispensar los volúmenes indicados. - palillos mezcladores descartables - cronómetro - lámpara o fuente de luz - Placa de vidrio - tubos de Kahn - Suero fisiológico PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo de Látex antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero. ITECNICA CUALITATIVA En uno de los sectores delimitados de la placa de vidrio adjunta al equipo colocar:

Reactivo de Látex 1 gota (50 ul) Muestra 1 gota (50 ul) Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensión uniforme en la superficie delimitada de la placa. Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos.

II- TECNICA SEMICUANTITATIVA (Titulación) Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en tubos de Kahn.

a) Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno de los tubos.

b) Agregar 0,5 ml de suero al tubo No 1 y mezclar. Transferir 0,5 ml de esta dilución al tubo No 2 y mezclar, continuando así las diluciones hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc.

c) Ensayar cada dilución según técnica I. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Negativo: suspensión homogénea. Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1 a 4 +. Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente. El nivel aproximado de antiestreptolisina O en la muestra, puede ser calculada por la fórmula siguiente: ASO (UI/ml) = Título x Sensibilidad de la reacción (200 UI/ml) Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:2. El nivel de ASO es de 2 x 200 = 400 UI/ml

COPROLOGIA FUNCIONAL – REACCIÓN INFLAMATORIA. I Las materias fecales están constituidas en unas tres cuartas partes por agua. Las sustancias sólidas del cuarto restante comprenden: · 30% de bacterias muertas. · 10 - 20% de grasa. · 2 - 3% de proteínas. · 10 - 20% de sustancias inorgánicas. · 30% de restos no digeribles, componentes sólidos del jugo digestivo como pigmentos biliares y detritus celulares. El estudio de laboratorio de muestras fecales de origen humano, permite obtener datos que nos sirve para determinar: 1.- La situación del funcionalismo digestivo. 2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos. 3.Infecciones causadas por parásitos intestinales. Este estudio tiene su máxima indicación en las diarreas crónicas, y comprende la observación macroscópica y microscópica de las heces, así como su análisis /químico, bacteriológico y parasitológico. ESTUDIO DEL FUNCIONALISMO DIGESTIVO Con este estudio procuramos saber la digestión de los principios inmediatos. La digestión es el conjunto de fenómenos mecánicos y bioquímicos que transforman los constituyentes orgánicos más o menos complejos de los alimentos en sustancias simples directamente asimilables. Los alimentos son triturados en la boca sufriendo una división física. Luego comienza una disgregación química mediante fermentos digestivos y elementos bacterianos, siendo absorbidas, las sustancias transformadas, por la mucosa intestinal y por último los residuos no aprovechables de la digestión son expulsados fuera del organismo. ALIMENTACIÓN PREVIA AL ANÁLISIS Se debe seguir con el régimen habitual de comidas, pero hay que añadir aquellos elementos que nos pueden suministrar una base para el diagnóstico, como son: · Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe comerse lo más cruda posible. · Patatas: Se investiga la digestión de almidón. · Grasa: Se tomará en forma de leche, mantequilla o carne. Este plan se sigue durante 3 días y luego se recoge la muestra de heces. TOMA DE MUESTRA Se recogerán las heces en un frasco limpio con cierre hermético, no es necesaria la esterilidad. El análisis se hará en las 12 horas siguientes a la deposición, guardando la muestra en el frigorífico a 4-10º C. Si el análisis se pospone más de 24 horas se añadirá un volumen igual al de las heces de una solución acuosa al 5% de formol comercial. CARACTERES ORGANOLÉPTICOS

A) OLOR: a) Según la ingesta: o Inodoro: Meconio. o Aumentado: Comidas ricas en carne y pescado. o Débil: Dieta vegetariana y láctea. o Ligeramente agrio: Niños de pecho. b) Fecaloide normal. c) Pútrido (olor a amoniaco)

Debido a la flora proteolítica aumentada. Provoca diarreas de putrefacción (heces alcalinas y gases). d) Agrio penetrante o rancio Debido a la flora sacarolítica aumentada. Provoca diarreas de fermentación (heces ácidas y gases). e) Nauseabundo Debido a la descomposición de tejidos, ocasionada por carcinoma, úlceras...

B) COLOR: a) Marrón: Es el color habitual. b) Verde: Puede ser debido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la presencia de biliverdina (rapidez del tránsito intestinal, diarreas infantiles). c) Rojo: Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia de hemorragias próximas al ano. d) Negro: Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos (carbón, hierro, bismuto) o a hemorragias internas (heces pastosas, melenas). e) Blanco: Debido a la ingesta (leche, bario, caolín...) o a la ausencia de bilis fundamentalmente. f) Amarillo: Debido a la ingesta (régimen lácteo) o a diarreas de fermentación hidrocarbonada.

C) CONSISTENCIA: Puede ser dura, normal, pastosa, líquida...

D) FORMA: Varía con la consistencia a) Cilíndrica: Es la normal. b) Laminada o en cinta: Debido a papilomas. c) Bolitas secas y duras: Estreñimiento. d) Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis. e) Bola maleable del tamaño de un puño: Se presenta en la atonía del recto (personas ancianas). E) VISCOSIDAD: Se determina tocando las diferentes partes de las heces con un agitador de vidrio.

a) Viscosas (pastosas): Se adhieren al agitador. b) Poco viscosas: No se adhieren al agitador. c) Grasas: Tienen gran maleabilidad moldeándose en ellas el agitador, como tierra amasada. EXAMEN MACROSCÓPICO Para este examen se tritura ligeramente en un mortero con agua una cantidad de heces del tamaño de una nuez. Luego se pasa a una placa de Petri y colocamos esta sobre una cartulina blanca y negra. Los fragmentos de carne aparecen de color gris o marrón. El tejido conectivo tiene forma de membranas o paquetes filamentosos. Se puede confundir con moco. Para diferenciarlo se añadirá ácido acético al 30% y si desaparece es tejido conectivo. El moco se puede presentar de varias formas: amorfo, transparente, opaco (con restos celulares) y membranoso (en forma de paquetes o moldes de la mucosa). La presencia de moco es importante, salvo en los recién nacidos, y siempre deberá resaltarse en el informe. ANÁLISIS MICROSCÓPICO Nos aporta datos más fidedignos acerca de los trastornos de la digestión. Para ello habrá que instaurar la alimentación explicada anteriormente, si no se hace así la significación del estudio es muy limitada. Para este estudio se hace una suspensión de heces en agua destilada o suero fisiológico. 1. Se coge una cantidad de heces, del tamaño de una castaña, y se coloca en un mortero, copa, vaso de precipitado o tubo de ensayo.

2. Se añade agua o suero fisiológico y mezclar con una varilla hasta formar una papilla homogénea y fina, ni muy fluida ni muy espesa. 3. Se coloca una gota de esta suspensión en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos encima, cuidando que se extienda formando una capa delgada, homogénea, sin burbujas de aire. No se debe aplastar el cubre. Se observará con el objetivo de x10 aumentos, obteniendo una visión de conjunto, y luego se enfoca con el de x40 aumentos. Cuando se trata de heces líquidas, se debe hacer una mezcla homogénea y se /coloca una gota directamente al portaobjeto. Podremos observar:

A) CÉLULAS: Normalmente epiteliales de las últimas porciones del intestino. No son patológicas. B) LEUCOCITOS: Se observarán deformados. Si se encuentran en poca cantidad no es patológico. Se observan mejor mezclando la gota de la suspensión fecal con otra de azul de metileno de Loefler. C) HEMATÍES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Si aparecen será a causa de evacuación muy rápida o hemorragias en tramos intestinales bajos. D) CRISTALES: Presentan el mismo aspecto que en el sedimento urinario. Hay unos, característicos del parasitismo intestinal, llamados cristales de Charcot-Leyden, presentando una forma típica de agujas de brújula. E) FIBRAS MUSCULARES: Se pueden observar de diferentes formas dependiendo del grado de digestión: a) Mal digeridas: Fragmentos rectangulares estriados, débilmente amarillos. Las estrías son transversales y longitudinales. Los bordes del rectángulo son rectos. b) Parcialmente digeridas: Trozos más pequeños con los bordes redondeados y las estrías longitudinales. c) Bien digeridas: Trozos muy pequeños con los bordes redondeados y sin estrías. La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se puede deber a una insuficiencia gástrica o pancreática. F) TEJIDO CONJUNTIVO. Se observa como fibras o filamentos que se reúnen en fascículos y se entremezclan entre si. Son incoloros y no poseen estriación. Se podría confundir con el moco, pero se distinguen porque se transparentan al añadirle ácido acético al 30 %. G) ALMIDÓN. Para su investigación se añade a la gota de emulsión fecal una gota de lugol. Los gránulos de almidón tomarán un u otro dependiendo del grado de digestión. También podrán estar dentro de células o aislados: a) No digeridos: Azul oscuro, casi negro. b) Parcialmente digeridos: Rojo o rosa. c) Digeridos: Amarillos o color arenilla. El tejido muscular, al añadir almidón a la preparación toma un color rojo-caoba. La presencia de almidón no digerido en las heces se llama AMILORREA. H) LÍPIDOS. Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota de este colorante se mezclará con una gota de la suspensión fecal. Los lípidos o grasas se encuentran en las heces en forma de: a) Ácidos grasos: Tienen aspecto cristalino, en forma de escamas o agujas finas rectas o curvadas. Difícilmente se tiñen. b) Grasa neutra: Aparece como gotitas de color rojo o naranja Si la temperatura es fría (< 20º C) las gotas se transforman en masas o placas algo amarillentas o rojas. c) Jabones: Difíciles de reconocer al microscopio. No se tiñen. Se presentan como masas amorfas o cristales en forma de agujas cortas. En la observación lo mas importante son las grasa neutras. Se informa positivamente a partir de 1520 gotas/campo (objetivo x40). El aumento patológico de grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el microscopio se observa mas de 60 gotas /campo es seguro esteatorrea

. Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos suavemente a la llama. De esta forma todas las grasas (ácidos grasos, neutros y jabones) se transforman en gotitas de color rojoanaranjado (con Sudan III). En el estudio de las grasas en heces puede inducirnos a error, los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y cubreobjetos mal desengrasados. ESTUDIO FÍSICO-QUÍMICO pH Varía entre 6,8 y 7,2 dependiendo del régimen alimenticio. Los valores normales se van a modificar según el proceso digestivo. La medición se hace impregnando un papel indicador con una varilla de vidrio que contenga heces. La lectura se efectúa por el reverso del papel. SANGRE También se llama este análisis investigación de hemorragias ocultas. Se puede observar sangre en heces, de color rojo, proveniente de fisuras anales o hemorroides. Esto no se considera importante. Cuando proviene de hemorragias gástricas, duodenales, cáncer de colon, etc., la sangre se digiere, tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si es importante. Para este análisis es importantísimo que el paciente durante los 2-3 días anteriores a la toma de muestras se someta a un régimen riguroso (“blanco”), sin carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, plátanos etc., es decir alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deberá tomar medicamentos que contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar pérdidas sanguíneas como salicilatos o esteroides. La alimentación permitida consiste en: Huevos, patatas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche. La mayoría de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinación de peroxidasas como indicativo del contenido de hemoglobina. Las más importantes son: A) REACCIÓN DE LA BENCIDINA: Sobre un papel de filtro manchado de heces, se ponen unas gotas de bencidina y agua oxigenada de 10 volúmenes. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formará un halo de color verde-azulado en torno a la mancha.

B) REACCIÓN DE WEBER O DEL GUAYACO: La prueba es igual que la anterior pero en lugar de poner bencidina se pone guayaco Estas pruebas son muy inespecíficas y dan habitualmente falsos positivos. La reacción de la bencidina es más sensible que la del guayaco. Actualmente existe una técnica que no se basa en la peroxidasa: C) PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO: Tiene más sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la capacidad del Cr radioactivo (Cr51) para ser fijado por los hematíes y por el hecho de no ser reabsorbido en el tracto gastrointestinal. Así pues, es excretado por las heces en las que puede ser medido por espectrofotometría de rayos ã. PIGMENTOS BILIARES Investigaremos en las heces la presencia de bilirrubina y estercobilinógeno mediante 2 métodos: A) PRUEBA DEL SUBLIMADO: Más sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo: · Dilución de heces........................................... 5 ml. · Sublimado (ClHg)........................................... 5 ml. Se agita y se incuba a 37º C durante 1-2 horas y se observan los resultados: · ROJO .................................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINÓGENO · VERDE ................................. BILIRRUBINA. · BLANCO ............................. Ausencia de Pigmentos. B) PRUEBA DE GRIGAUT: Más sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo: · ClH concentrado. ............................................ 5 ml.

· Cl3Fe (10%) .................................................... 2 gotas. · Dilución de heces........................................... 5 ml. Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados:

· VERDE ........................................... BILIRRUBINA. · ROJO ............................................. ESTERCOBILINÓGENO. Las 2 pruebas se hacen simultáneamente, debido a su diferente sensibilidad, y los resultados se interpretan así: SUBLIMADO GRIGAUT ESTERCOBILINOGENO + + Heces normales BILIRRUBINA + + Tránsitointestinal acelerado ESTERCOBILINÓGENO + Tránsitointestinal medianamente acelerado BILIRRUBINA Obstrucción biliar ENZIMAS PROTEOLÍTICAS: Se intenta comprobar la presencia de Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces normales (hasta una dilución 1/100) licuan la gelatina. La prueba se realiza aplicando una gota de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50, 1/100) de la heces a estudiar de heces sobre una película de gelatina. Se considera un resultado positivo si la gelatina queda disuelta en ½ hora. · Positivo hasta una dilución 1/100. .................................. Digestión normal. · Positivo hasta una dilución 1/50. .................................... Digestión media. · Positivo hasta una dilución 1/10. .................................... Digestión deficiente. CUERPOS REDUCTORES O AZÚCARES REDUCTORES EN HECES Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar más de una hora desde que son emitidas hasta que se realiza el examen. Hay que diluir una parte de heces en dos partes de agua destilada, mezclar bien y centrifugar a un número bajo de revoluciones (1.500 rpm.). Se toman 15 gotas del sobrenadante, se colocan en un tubo de vidrio y se le añaden dos gotas de ClH 1 N. Luego calentamos para desdoblar la sacarosa. Una vez que ha enfriado el líquido anterior, se añade una tableta de CLINITESTÒ (Ames) para azúcares reductores y se deja disolver. A continuación comparamos con la escala de colores que lleva el reactivo. El resultado se da en g./litro. El resultado será negativo si es inferior a 2,5 g./l. Entre 2,5 y 5 es dudoso y será positivo si es mayor de 5 g./l.

UROCULTIVO Las infecciones del tracto urinario (UTI) son unas de las infecciones más comunes en humanos. En general un limitado número de especies bacterianas son responsables de la mayoría de estas infecciones. La presencia de mocroorganismos en orina se denomina bacteriuria , sean o nó ,causantes de infeccion. UTI puede ocurrir a toda edad desde neonatos hasta ancianos, en personas sanas o comprometidos y debilitados. Es responsable por el aumento de los costos en programas de salud, como en morbilidad, mortalidad y perdida de productividad.

MATERIALES Muestras de orina Asa calibrada de platino o descartable de 0,001 mL ó 0,01 mL. Guantes de látex. Contenedor de material contaminado. Pinza estéril. Propipeta o pipetor automático. Placas con agar sangre de carnero (AS) o CLED Placas con agar Mc Conkey (McC) Tubos con TSI Tubos con LIA Tubos con Citrato de Simons Tubos con medio SIM

PROCEDIMIENTO Mantener las muestras en refrigeración (4 °C) hasta su procesamiento por cultivo. Las placas con AS y McC que se utilizarán en el urocultivo deben estar a temperatura ambiente. Rotular las placas. Si el asa calibrada no es descartable, esterilizar el asa de siembra flaméandola en el mechero Bunsen hasta que se ponga rojo vivo. Dejar enfriar el asa. Tomar el frasco con la muestra de orina, abrir la tapa y flamear la boca del frasco en el mechero Bunsen. Tomar la muestra de orina con el asa de siembra estéril introduciéndola y sacándola del frasco en forma vertical Tapar el frasco con la muestra. Inocular en el centro de la placa con AS a partir del cual se extiende la muestra, hacia delante y hacia atrás. Luego, sin quemar el asa, el inóculo se disemina uniformemente con trazos perpendiculares a la siembra inicial en toda la placa

Proceder de la misma forma para el agar Mc Conkey. Esterilizar el asa de siembra en el mechero. Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia arriba. Incubar la placa de AS y Mc Conkey a 35 – 37° C en condiciones aeróbicas por 24 horas. Tomar una azada de la muestra sin centrifugar, realizar un extendido y colorearlo por GRAM. Hacer un sedimento de orina y observarlo. Realizar su reporte.

Lectura Realizar la evaluación a las 24 horas, si no hay crecimiento bacteriano dejar incubar hasta las 48 horas. La evaluación consiste en realizar el recuento de colonias, cuyo resultado se multiplica por el factor de dilución para obtener las UFC por mL.

RESULTADOS Anote e interprete sus resultados FUENTES DE INFORMACION 1.-CUMITECH 2A: LABORATORY DIAGNOSIS OF URINARY TRACT INFECTIONS. ASM PRESS., MARCH 1987.-

CULTIVO DE SECRECION DE HERIDA Un paso importante en el tratamiento de la enfermedad infecciosa es conocer el microorganismo que está ocasionando la infección, para ello se realiza el cultivo respectivo, esta prueba se realiza principalmente en muestras de esputo, Hisopados faríngeos, nasales, oculares, de herida, de oído, vaginales, uretrales, pústulas y otros. La prueba se realiza en tres fases: La primera fase (Macroscópica) consiste en reportar las características físicas de la muestra. En la segunda fase (Microscópica) la muestra es analizada para poder observar células u otros elementos que pueden estar presentes. La tercera fase (Bacteriológica) puede identificar al microoganismo . MATERIALES Muestras de secreción de herida purulenta. Contenedor de material contaminado. Placas de Agar sangre de carnero Placas Agar Mc Conkey Placas de Agar Manitol sal Placas de Agar chocolate Agar Triple Sugar Iron Agar Lisina Iron LIA Reactivo de oxidasa Medio SIM Agar Citrato de Simmons Tubos con agar Urea Tubos con caldo plasma

PROCEDIMIENTO Realizar los cultivos en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero Bunsen. Utilizar placas con medios de cultivo cuando éstas hayan alcanzado la temperatura ambiente. Con una porción de la muestra hacer un extendio y colorearlo por GRAM. Inoculación de la muestra: Muestra de aspirado purulento: Con una pipeta Pasteur inocular una gota de la muestra en un extremo de la superficie de la placa de agar de sangre de carnero, agar Mc Conkey, agar manitol sal y agar chocolate.

Hisopado de secreción: Frotar rotando el hisopo sobre la superficie de los medios de cultivo tratando que toda su superficie haga contacto con el agar, empezando con el agar chocolate, agar sangre de carnero, Mc Conkey u otros medios. Esterilizar el asa de siembra en el mechero de Bunsen hasta que se ponga rojo vivo. Dejar enfriar el asa. Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia central el inóculo de la muestra, realizar la siembra por dispersión agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa con el propósito de obtener colonias aisladas. Esterilizar el asa de siembra en el mechero. Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia arriba. Incubar las placas a 35 – 37 °C por 24 – 48 horas en condiciones aeróbicas. Lectura A las 24 horas observar el crecimiento de colonias. Si no se observa crecimiento, seguir incubando hasta las 48 horas. Realizar la identificación según lo aprendido en las prácticas anteriores.

RESULTADOS Anote e interprete sus resultados FUENTES DE INFORMACION

1. -ESSENTIAL PROCEDURES FOR CLINICAL MICROBIOLOGY H.D.Isenberg. American Society for Microbiology, 1998.-

2. -CUMITECH 23:INFECTION OF THE SKIN AND SUBCUTANEOUS TISSUE. ASM PRESS., JUNE 1988.3. -CUMITECH 13A: LABORATORY DIAGNOSIS OF OCULAR INFECTIONS. ASM PRESS., SEPTEMBER 1994.4. -CLINICAL LABORATORY TECHNICAL PROCEDURE MANUALS 3RD EDITION NCCLS DOCUMENT GP2-A3 1996.-

CULTIVO DE SECRECION VAGINAL Y URETRAL

Las infecciones vaginales son aquellas en las cuales el agente etiologico coloniza la mucosa vaginal produciendo secreción asintomática. Los tres agentes etiologicos más importantes son la flora vaginal mixta aeróbica y anaeróbica , levaduras y Trichomonas vaginalis .menos común es el Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus .

MATERIALES

- Hisópos estériles - medio de transporte Amies. Tubos con suero fisiológico estéril

- agar chocolate - agar sangre - agar Mac Conkey - agar Sabouraud - agar manitol sal - Reactivos de la tinción de Gram. - Agar Triple Sugar Iron - Agar Lisina Iron LIA - Reactivo de oxidasa - Medio SIM - Agar Citrato de Simmons - Tubos con agar Urea - Tubos con caldo plasma PROCEDIMIENTO: DIA 1:

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El alumno traerá muestras de secreción vaginal y secreción uretral obtenidas de pacientes. Realizar una coloración de Gram de las láminas obtenidas. Suspender la muestra en suero fisiológico sobre una lámina portaobjetos, colocar la laminilla cubreobjetos y observar al microscopio con el lente de 400X buscando la presencia de Trichomonas vaginalis y levaduras. Sembrar la muestra en las placas de agar sangre, agar chocolate, agar Mac Conkey y Sabouraud según las indicaciones del profesor. Incubar las placas de agar chocolate en presencia de CO2 a 37 oC Las demás placas incubarlas a 37 oC en condiciones aerobias

DIA 2: Las placas de cultivo se deben leer a las 48-72 horas de incubación. La presencia de colonias sospechosas con las pruebas de identificación presuntiva y posteriormente definitivas indican la presencia de patógenos en las muestras en las muestras.

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Realice las pruebas necesarias para identificar a los patógenos.

RESULTADOS: Anote e interprete sus resultados. FUENTE DE INFORMACION

1. Murray, PR et al., Manual of Clinical Microbiology, 9th Ed., ASM Press, Washington, DC, 2007 2. Baron, EJ et al., Cumitech 17A: Laboratory diagnosis of female genital tract infections, Amer. Soc. for Microbiol., Washington DC, 1993. 3. CDC/MMWR. Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease: Revised Guidelines from CDC. August 16, 2002

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ESPERMATOGRAMA MUESTRA: Semen RECOLECCION DE LA MUESTRA

a. b.

c.

d. e.

f. g.

Lo ideal es recoger la muestra después de 48 horas y no más de 7 días de abstinencia sexual. En el formulario que acompaña a cada análisis de semen se debe anotar el nombre del paciente, el período de abstinencia, así como la fecha y la hora de la recolección. Lo ideal es que la muestra se recoja en la intimidad de una dependencia próxima al laboratorio. De lo contrario, se debe enviar al laboratorio antes de transcurrida una hora de recolección y si la motilidad de los espermatozoides es anormalmente baja (menos del 25 % con progresión lineal rápida), examínese una segunda muestra lo antes posible después de la recolección. La muestra debe obtenerse mediante masturbación y eyacularse dentro de un recipiente de vidrio o plástico de boca ancha que esté limpio; si se usa plástico, verifíquese la ausencia de efectos tóxicos sobre los espermatozoides. Si se va a hacer un análisis bacteriano, el paciente debe orinar y luego lavarse y enjuagarse las manos y el pene antes de recoger la muestra en un recipiente estéril. Por lo general, no se deben usar condones para recoger semen porque pueden comprometerse la viabilidad de los espermatozoides. El coitus interruptus no es aceptable para hacer la recolección del semen, porque puede perderse la primera porción del eyaculado, que suele contener la mayor concentración de espermatozoides. Además habrá contaminación celular y bacteriana de la muestra y el pH ácido del líquido vaginal ejercerá una influencia adversa sobre la motilidad de los espermatozoides. Las muestras deben protegerse de las temperaturas extremas (no menos de 20 oC ni más de 40 oC) durante el traslado al laboratorio. El recipiente debe rotularse con el nombre del sujeto, la fecha y la hora de la recolección y la eyaculación y la duración de la abstinencia.

EXAMEN MACROSCOPICO LICUEFACCION.Una muestra de semen normal se licúa dentro de los 60 minutos de la eyaculación, a temperatura ambiente. En algunos casos la licuefacción no es completa a los 60 minutos y esto debe ser informado. La presencia de hilos de moco, señal de licuefacción incompleta, puede interferir con el recuento celular. El semen normal puede contener gránulos gelatinosos que no se licúan y cuya significación no es conocida. La muestra debe ser mezclada cuidadosamente en el recipiente original. Un mezclado incompleto es la principal causa de error en el recuento de espermatozoides. Un mezclado continuo mediante la rotación del recipiente durante el tiempo de licuefacción contribuye a disminuir este error. ASPECTO La muestra de semen debe ser examinada inmediatamente luego de su licuefacción o dentro de los 60 minutos de eyaculada, por simple inspección a temperatura ambiente. Una muestra normal tiene una apariencia homogénea gris – opalescente. Puede aparecer menos opaca cuando la concentración de espermatozoides es muy baja y marrón cuando contiene glóbulos rojos.

VOLUMEN El volumen del eyaculado debe ser medido en un cilindro graduado de base cónica o por aspiración de la muestra completa en una pipeta, utilizando un aparato de aspiración mecánica. Si la muestra será utilizada para un espermocultivo, se debe utilizar material estéril para su manejo. Las jeringas plásticas y agujas de inyección no deben ser utilizadas para este propósito pues alteran la calidad del semen, especialmente la motilidad. CONSISTENCIA La consistencia de la muestra (viscosidad) puede ser estimada aspirando la muestra en una pipeta de 5 ml. Y permitiendo la libre caída de gotas, en las que se observa la longitud del filamento formado. En una muestra normal se observan gotas pequeñas y bien definidas mientras que en una muestra de consistencia aumentada se formará un filamento mayor de 2 cm. Como método alternativo, la consistencia se puede evaluar introduciendo una varilla de vidrio en la muestra y observando la longitud del filamento que se forma al retirarla. Este no debe exceder los 2 cm. Una consistencia anormal, por ejemplo debida a un alto contenido de moco, puede interferir con la determinación de varias características del semen, como ser la motilidad y la concentración. PH Se distribuye una gota de semen sobre papel de pH (rango de 6.1 a 10). Al cabo de 30 segundos el color de la zona impregnada debe ser uniforme y se compara con la cartilla de calibración para determinar el pH de la muestra. Todo tipo de papel de pH utilizado para este análisis debe ser controlado con estándares de pH conocido antes de ser usado. El pH de la muestra debe ser medido dentro de los 60 minutos de la eyaculación y debe caer en el rango de 7.2 a 8.0. cuando el pH es menor de 7.0 en una muestra con azoospermia se debe sospechar disgenesia del conducto deferente, las vesículas seminales o el epidídimo. EXAMEN MICROSCOPICO Durante el examen microscópico inicial de la muestra se realiza una estimación de la concentración y motilidad de los espermatozoides, de la presencia de aglutinación y de otras células. Se deposita 10 ul. De semen en un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos de 22 x 22 mm. Es importante que la cantidad de semen depositado y el tamaño del cubreobjetos utilizado sean siempre los mismos para que todos los exámenes se realicen en una preparación del mismo espesor (aproximadamente 20 um.). Esta profundidad permite la expresión completa del movimiento rotatorio de los espermatozoides normales. Este preparado se examina con una magnificación de 400 x. El peso del cubreobjetos distribuye la muestra para una visión óptima y se debe permitir la estabilización de la misma durante un minuto. Dado que la motilidad y la velocidad de los espermatozoides son muy dependientes de la temperatura, estas determinaciones deben hacerse a una temperatura tan próxima a los 37 oC como sea posible. El resto del examen debe ser realizado a temperatura ambiente, procurando estandarizar entre los 20 y 24 oC.

Cuando el número de espermatozoides varía considerablemente entre campos visuales significa que la muestra no es homogénea y que el semen debe ser mezclado cuidadosamente. MOTILIDAD El campo microscópico es recorrido espermatozoide observado se clasifica en: G3

motilidad progresiva rápida

G2

motilidad progresiva lenta G1

sistemáticamente

y

la

motilidad

de

cada

motilidad no progresiva G0

inmóviles

Usualmente hace falta contar 4 a 6 campos para acumular 100 espermatozoides y obtener un porcentaje de cada categoría. Se repite la cuenta con otros 100 espermatozoides y se obtiene un promedio para cada categoría, que luego será informado. Es recomendable repetir este recuento de la motilidad en una segunda gota de semen preparada de la misma manera. Los resultados de ambos recuentos, si no difieren en más del 10 %, se promedian. Para verificar si se cumple este criterio, se suman los porcentajes de categorías G3, G2, G1 (motilidad total) y se establece que la suma de los valores de las dos muestras no difiera en más de 1/20 entre cada recuento. En aquellas muestras en que la motilidad total sea menor al 50 %, se compara el porcentaje de espermatozoides clase G. entre ambos recuentos. Cuando la diferencia en el recuento es superior al 10 % se debe preparar y contar una tercera gota y estos resultados se promedian con los dos anteriores. ELEMENTOS CELULARES DIFERENTES DE LOS ESPERMATOZOIDES El eyaculado siempre contiene células diferentes de los espermatozoides. Encontramos células epiteliales del tracto uretral, células de la espermatogénesis y leucocitos. Estas células han recibido el nombre genérico de “células redondas”. Su concentración debe ser determinada en las preparaciones frescas utilizando la cámara de Newbauer. Como regla general, un eyaculado normal debe contener menos de 5 x 106 células redondas/ml y el número de leucocitos no debe exceder 1 x 10 6/ml. Las células redondas no identificadas como leucocitos incluyen las espermáticas, espermatocitos y espermatogonias. Debido a que solo se incluyen los espermatozoides en el recuento, la concentración de las otras células germinales y los leucocitos pueden ser calculados de manera relativa a aquellos. Si (N) es la cantidad de un tipo celular dado contado en los mismos campos que 100 espermatozoides y si (S) es el recuento de espermatozoides en millones por ml, se puede calcular la concentración de la célula dada en millones por ml (C) con la siguiente fórmula, puesto que la relación entre el número de células y el número de espermatozoides se considera igual en el extendido y en el semen:

C=

NxS 100

por ejemplo, si la cantidad de células germinales inmaduras es 10 por 100 espermatozoides contados y si el recuento del semen es 120 x 106/ml, la concentración de células germinales inmaduras es: 10 x 120 x 106 = por mililitros = 12 millones/ml 100 AGLUTINACION La aglutinación de los espermatozoides significa que los espermatozoides móviles se adhieren entre ellos cabeza con cabeza, pieza intermedia, cola con cola o de otras maneras, como pieza intermedia con cola. A la adherencia de espermatozoides inmóviles o móviles con filamentos de moco, con células que no son espermatozoides o con detritos no se le considera aglutinación y no se la debe anotar como tal. La presencia de aglutinación sugiere la existencia de una causa inmunológica de la infertilidad, pero no es evidencia suficiente para probarla. La aglutinación se determina en 10 campos microscópicos elegidos al azar. El número promedio de espermatozoides aglutinados entre sí se estima con un error menor al 5 %. El porcentaje de espermatozoides aglutinados puede ser un dato de importancia. Sin embargo, aún la presencia de unos pocos espermatozoides aglutinados debe ser informado. El tipo de la aglutinación: cabeza-cabeza; cola-cola o mixto también debe ser informado. VIABILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES La viabilidad espermática refleja la proporción de los espermatozoides totales que están “vivos” de acuerdo al criterio de exclusión de algún colorante vital o mediante la expresión de su capacidad osmorreguladora cuando se los expone a condiciones hipoosmóticas. Reactivo: Eosina Y; hágase una solución al 0,5% (p/v) en solución fisiológica. Mezclese una gota (10 a 15 ul) de semen fresco con una gota de solución de eosina al 0,5% en un portaobjetos y cúbrase con el cubreobjetos. Al cabo de dos minutos obsérvese el preparado a 400 X con luz intensa o contraste de fase. Se cuentan cien espermatozoides, diferenciando a los espermatozoides no teñidos (vivos) de los teñidos (muertos). Estas técnicas de tinción supravital permiten diferenciar a los espermatozoides inmóviles pero vivos de los que están muertos. RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES La concentración de espermatozoides puede determinarse con el método de la cámara de Newbauer. En este procedimiento se prepara una dilución de 1:20 con cada muestra homogénea mezclando bien 50 ul de semen licuado con 95 ul de diluyente. Este último consiste en 50 gr. de NaHCO3, 10 ml de formalina al 35% (v/v) y agua destilada en cantidad suficiente para obtener un volumen final de 1000 ml. Si el examen preliminar del semen indica que la concentración de espermatozoides es demasiada grande o demasiada baja, se debe ajustar el grado de dilución de la muestra como corresponda.

Así, para las muestras que contienen menos de 20 x 106 espermatozoides/ml, se puede emplear una dilución 1:10 mientras que para las que contienen más de 100 x 106 espermatozoides/ml corresponde una dilución 1:50. La muestra diluida se debe mezclar muy bien y luego se pasa una gota a una cámara de Newbauer. Déjese reposar por uno a cinco minutos, con preferencia en una cámara húmeda para reducir a un mínimo el secado. En este tiempo las células sedimentan y luego se cuentan con el microcopio óptico o de contraste de fase con una magnificación de 100 X o 400 X. Solo se cuentan los espermatozoides con cola. Los espermatozoides sin cabeza y las cabezas sin cola no se cuenta. El procedimiento para contar es el siguiente: el cuadrado central de la cámara de Newbauer contiene 25 cuadrados grandes, cada uno de los cuales contiene 16 cuadrados más pequeños; para las muestras que contienen menos de 10 espermatozoides por cuadrado se debe contar los 25 cuadrados; para las que contienen 10 a 40 espermatozoides por cuadrado pueden estudiarse 10 cuadrados, y para las que contienen más de 40 espermatozoides por cuadrado es suficiente analizar cinco cuadrados. Si un espermatozoide está en la línea que divide a dos cuadrados adyacentes, sólo se lo debe contar si está en el lado superior o izquierdo del cuadrado que se estudia. Se cuentan ambas cámaras del hemocitómetro y se calcula un promedio de ambos recuentos, siempre que la diferencia entre ellos no exceda el 10%. En el caso de que los recuentos difieran en más de un 10%, ambos se descartan y se prepara una nueva dilución. Para determinar la concentración de espermatozoides, en millones/ml del semen original, se divide el promedio del recuento por el factor de conversión que aparece en el recuadro. Por ejemplo, si la muestra fue diluida 1 + 19 y se contaron 162 y 170 espermatozoides en 10 cuadrados de cada cámara, la concentración de espermatozoides en la muestra original es de 83 x 106/ml (166 dividido entre 2). Factores de corrección

Número de cuadrados grandes contados Dilución (semen + diluyente)

25

10

5

1+9

10

4

2

1 + 19

5

2

1

1 + 49

2

0.8

0.4

De Mortimer, 1985. ANALISIS DE LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LOS ESPERMATOZOIDES

Los espermatozoides humanos pueden ser clasificados utilizando un microscopio convencional de campo claro, una coloración por el método de Papanicolaou o Giemsa.. Se deben tomar en cuenta las siguientes categorías de defectos:

a. b.

c. d.

Defectos de tamaño/forma de la cabeza: puede ser grande, pequeña, acintada, piriforme, amorfa, vacuolada (> 20% del área ocupada por vacuolas no teñidas), doble y toda combinación entre estos. Defectos del cuello y pieza media: incluye la ausencia de cola (cabezas aisladas), cola mal insertada o doblada (la cola en un ángulo de 90º con respecto al eje longitudinal de la cabeza), pieza media distendida, irregular o doblada, pieza media anormalmente fina (falta la batería de mitocondrias), y toda combinación entre éstos. Defectos de la cola: puede ser: corta, múltiple, en horquilla, rota (ángulo > 90 grados), de espesor irregular, arrollada, con gota citoplasmática terminal, y toda combinación entre éstos. Las gotas citoplasmáticas mayores de 1/3 de la superficie de la cabeza normal. Las gotas citoplasmáticas se encuentran, habitualmente, en el cuello y pieza intermedia pero algunas células inmaduras pueden tenerla en algún lugar de la cola.

Se deben contar al menos 100 espermatozoides, preferiblemente 200, con un objetivo de inmersión de 100 X en campo claro y una preparación teñida. Sólo se cuentan las células reconocibles como espermatozoides. Las células inmaduras no se cuentan como espermatozoides. Las cabezas aisladas se cuentan como formas anormales, pero no se cuentan las colas libres. Si se nota una alta incidencia (>20% de los espermatozoides) de formas en “cabeza de alfiler” esto debe ser informado separadamente. Estas formas no se cuentan como defectos de la cabeza ya que rara vez contienen cromatina o estructuras propias de la cabeza. Se pone una gota de semen en el medio de un portaobjetos limpio y se apoya otro portaobjetos limpio sobre el primero. La gota se extiende entre ambas superficies que luego se separan suavemente, deslizando uno sobre otro, para obtener dos extendidos. El contorno de todas las partes del espermatozoide debe ser claramente visible. Con la tinción de Papanicolaou la cabeza aparece teñida de azul claro en la región acrosomal y azul oscuro en la zona posacrosomal. La pieza media puede teñirse de rojo, pero esto es considerado anormal sólo cuando está groseramente distendida o es irregular. La cola también se teñirá de azul. Las gotas citoplasmáticas, usualmente ubicadas detrás de la cabeza en la pieza media, se tiñen de verde.

VALORES NORMALES DE LAS VARIABLES DEL SEMEN

Volumen

2 ml o más

PH

7,2 – 7,8

Concentración de espermatozoides

20 x 106 espermatozoides/ml o más

Total de espermatozoides

40 x 106 espermatozoides o más.

Motilidad

50% o más con progresión anterógrada

(categorías G3 y G2), o 25% o más con progresión lineal rápida a los 60 min. De la recolección. Morfología

30% o más con morfología normal.

Viabilidad

75% vivos o más (no se colorean)

Leucocitos

Menos de 1 x 106/ml.

Acido cítrico total

52 umol o más por eyaculado.

Fructosa total

13 umol o más por eyaculado.

DIAGNOSTICO DE VIH Introducción: El VIH el 1/2 una prueba rápida del paso es un immunoensayo rápido para la detección cualitativa de tipo 1 y/o de type-2 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en suero o plasma.

Principio: El VIH el 1/2 una prueba rápida del paso es un immunoensayo cromatográfico del flujo lateral basado en el principio de la técnica doble del antígeno-emparedado. La membrana está cubierta con los antígenos recombinantes del VIH en la línea región de la prueba del dispositivo. Cuando un espécimen es aplicado en un extremo de la membrana, reacciona con la conjugación cubierta antígeno del oro del VIH en la prueba. La mezcla entonces emigra cromatográfico por la acción capilar y reacciona con los antígenos recombinantes del VIH en la membrana en la línea región de la prueba. Si el suero o el plasma contiene los anticuerpos a HIV-1 o a HIV-2, una línea coloreada aparecerá en la línea región de la prueba, demostrando un resultado positivo. La ausencia de la línea coloreada de la prueba indica que el suero o el plasma no contiene los anticuerpos anti-VIH, demostrando un resultado negativo. Una línea coloreada aparecerá siempre en la línea de control región servir como control procesal. Esto indica si han agregado al volumen apropiado de espécimen y esa membrana ha ocurrido el wicking. Característica de producto: Una prueba lateral del rapid del flujo Detección inmediata de infección del VIH el 1/2 Utiliza GP120, 41, y 36 recombinantes como antígenos Detecta los anticuerpos a todos los subtipos del VIH incluyendo el tipo “O” Tarda solamente 15-20 minutos para conseguir los resultados Resultado visual, interpretación fácil

Sensibilidad: 100%

Especificidad: 99.8%

POSITIVO

NEGATIVO

FUENTES DE INFORMACION: Bantar, Lopardo. Apuntes De Laboratorio: Urocultivo. Laboratorios Britania. 2007 Carrasco, Luis coord. / Almendral del Rio, Jose Ma. coord., "Virus patogenos", Madrid Helice Fundacion BBVA cop. 2006 D. Male, J. Brostoff, D. B. Roth e I. Roitt. Inmunología (Séptima edición) Editorial Elsevier-Masson (2007). Flint, S. J., "Principles of virology Molecular biology, pathogenesis, and control of animal viruses", Washington, D.C. ASM Press cop. 2004 Henry-Marban. El Laboratorio En El Dx Clinico. Masson-Salvat Medicina, 2007 K. Abbas, A. H. Lichtman y S. Pillai. Inmunologia celular y molecular (Sexta edición) Editorial Elsevier (2008). Koneman E.W., Allen S.D., Dowell S.R.Jr., Sommers H.M. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO, Texto y Atlas Color. Buenos Aires, Ed. Panamericana, 6ta edición 2008. Mac Faddin J. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MÉDICA. Buenos Aires, Ed. Panamericana, 3° Edición, 2003. Medvedeff, MG; Mereles. BE; Vedoya, MC; Chade, ME. . Guia De Trabajos Practicos. Catedra De Micologia. Universitaria, 2007 T. J. Kindt, R.A. Goldsby y B. A. Osborne. Inmunología de Kuby (Sexta edición) Editorial McGraw-Hill (2007). Pérez Peña, Efraín. Infertilidad, esterilidad y endocrinología de la reproducción: un enfoque integral. Ed.: México. 2005 Edición: 2 Speroff L, Fitz M. Endocrinología ginecológica clínica e infertilidad, 7th ed. Lippincott Williams & Wilkins; 2004.

Santaeulària I Pérez, Ariadna. MANUAL PRACTICO DE ESTIRILIDAD Y REPRODUCCION HUMANA: LABORATORIO DE REPRODUCCION ASISTIDA (3ª ED.) McGRAW-HILL/INTERAMERICANA DE ESPAÑA, S.A.U. 2007 http://whfreeman.com/immunology5e/ web del texto Inmunología de R.A. Goldsby http://www.blink.biz/immunoanimations/ animaciones del texto Inmunobiología de CA Janaway. http://www.immunologylink.com/ buscador general de inmunología: revistas, links, textos, bases de datos de secuencias genómicas.... http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ buscador de bibliografía de ciencias en general http://www2.cbm.uam.es/confocal/Protocolos.htm protocolos de técnicas usadas en el laboratorio de inmunología http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi toda la información sobre citoquinas y biología de la comunicación celular. http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/index.html Curso basico de virología on line (University of Leicester)