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FARMACIA Y BIOQUIMICA-UNSAAC

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS FISICAS MATEMATICAS FARMACIA E INFORMATICA

FARMACIA Y BIOQUIMICA

LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA II Protocolo de investigación

“Reconocimiento de metabolitos secundarios y extracción de

flavonoides en las hojas de Piper aduncum (MATICO)”

Docente: Q.F. Yanet Cuentas Romaña Integrantes: Edith F. Jalixto Checya Antony Ortiz Arando Catherin L. Sancho Huanca Yandely Zamata Gomez

   

Cusco- Perú

I.

INTRODUCCION

1

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Este proyecto está orientado a la investigación de plantas medicinales propias de nuestra región Cusco,

en la que se lograra identificar los metabolitos

secundarios de las hojas de matico (Piper aduncum) siendo así una alternativa emprendedora que pueden aprovechar los alumnos

de la asignatura de

farmacognosia II de la carrera de Farmacia y Bioquímica. El reino vegetal en sus distintas formas ha sido factor decisivo en los diferentes estudios que han llevado a cabo los fenómenos de la naturaleza. La identificación de algunas plantas útiles y otras dañinas nos han permitido llegar al conocimiento de productos químicos naturales extraídos de los vegetales. En general las plantas con el pasar de los años se han convertido en pequeños laboratorios que han llegado a metabolizar compuestos útiles para sí mismas y para otras especies que convivimos con ellas en este basto planeta. Pero también se han visto en la necesidad de elaborar metabolitos que les han permitido combatir ciertas patologías que aquejan a la humanidad en este caso este presente trabajo de investigación ayudara a saber que metabolitos secundarios se encuentran en la planta de Piper aduncum, determinándose estos metabolitos mediante extracción

los diferentes procesos

metodológicos de

y reconocimientos realizando análisis fotoquímico cualitativo y

cuantitativo en la identificación de estos metabolitos. En la actualidad entre las innumerables plantas con propiedades medicinales que se encuentran en nuestra región Cusco. La planta de matico (Piper aduncum) es una especie arbórea que crece en las partes bajas de temperatura templada (todo el valle de la Convención). El matico es una planta cosmopolita de la familia de la pimienta (Piperaceae) de aproximadamente 3 metros de altura que crece en la costa, selva alta y baja y en los valles interandinos de la sierra, crece hasta los 3.000 msnm Este trabajo investigatorio es de mucha importancia porque nos ayudara a conocer que moléculas o metabolitos secundarios que se encuentran en el Matico 2

mediante la extracción y reconocimiento de estos metabolitos;

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ayudándonos así de esta manera

contrarrestar ciertas enfermedades que

aquejan a la región cusco y ayudando también a la investigación de otras plantas que tengan propiedades medicinales. II. OBJETIVOS Objetivo general: 

Conocer e identificar los metabolitos secundarios que posee las hojas Piper aduncum (matico) provenientes de la región del Cusco.

Objetivos específicos: 

Realizar los diversos métodos para la extracción de metabolitos



secundarios de las hojas Piper aduncum (matico). Realizar los diferentes reconocimientos de identificación de metabolitos



secundarios de las hojas de Piper aduncum (matico). Extracción y aislamiento de flavonoides de las hojas Piper aduncum (matico).

III. METODOLOGIA 1.- MATERIAL DE ESTUDIO Hojas de Piper aduncum (Matico) proveniente de la provincia de La Convención, ciudad de Quillabamba, departamento de Cusco. 2.- MATERIAL, EQUIPOS Y REACTIVOS 

Materiales de Laboratorio

De uso común en el laboratorio de Farmacognosia.   

Equipos: De uso común en el laboratorio de Farmacognosia Reactivos y solventes: Solventes: Ácido sulfúrico 98% de pureza. Calidad Merck, Alcohol etílico de 70º. 3

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Reactivos Dragendorf Mayer Wagner Hager

Metabolito

Ninhidrina Baljet Bomtrager Liebermann-burchard Rosenhein Shinoda Kedde Cloruro férrico Gelatina

aminoacidos lactonas Quinonas Triterpenos esteroles Antocianinas Flavonoides Glicosidos cardiotónicos Polifenoles Taninos

alcaloides



RECOLECCION: se recolectara hojas frescas y maduras de Piper aduncum



(matico) de la ciudad de Quillabamba. 1050 m.s.n.m 20°C SELECCIÓN: se seleccionara la materia vegetal con el objetivo de realizar una separación de las partes deterioradas y evitar la mezcla con otras especies. IDENTIFICACION TAXONOMICA: La planta medicinal seleccionada será



llevada al herbario Vargas de la universidad nacional de san Antonio abad del cusco para su identificación taxonómica. CLACIFICACION TAXONOMICA: la especie Sambucus peruviana, es



nativa de nuestro país de acuerdo al sistema de clasificación filogenética de Adolph

Engler

publicada

en

la

XII

Edición

del

syllabus

DER

PFLANNZENFAMILIEN del año 1954-1964 DESECACION: las hojas seleccionadas se colocaran sobre papel kraft en



un lugar fresco y seco durante 24 horas. Luego serán pasadas a bolsas hechas con papel kraft y se llevara a una estufa a una temperatura de 40°C, durante 48 horas. MOLIENDA Y TAMIZACION: una vez desecado el material vegetal se



procederá a su molienda en un mortero de acero hasta el tamaño de 4

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partícula adecuado 2mm se almacenara en frascos de color ámbar en un lugar sin humedad ni luz directa hasta su posterior utilización.

3.-PREPARACION DEL EXTRACTO FLUIDO DEL MATICO: Pesar 250 gr de la muestra y proceder a humectar, separar en porciones equivalentes a 125 gr, 75 gr y 50 gr de droga. Colocar la porción de 125 en un pre colador, macerar con alcohol de 70° por 48 horas se prosigue a percolar y recoge 50ml de extracto fluido las cuales se separan y se guardan en un frasco ámbar. Se sigue recibiendo 5 porciones sucesivas de percolado de 75 ml cada una enumerándola en el orden que se recibe. Colocar la porción equivalente a 75 gr de extracto fluido en un pre colador y macerar con las porciones de75 ml por 48 horas se percola hasta obtener 75 ml y se guarda en el frasco ámbar se sigue percolado 5 porciones de 50 ml de extracto fluido, cada uno enumerado. Se coloca la tercera porción equivalente a 50 gr y se macera por 48 horas con las porciones del lote anterior proceder a percolar hasta obtener 125 ml de extracto los cuales se pasan a un frasco ámbar, la cantidad final del extracto fluido debe ser de 250 ml. 4.-TAMIZAJE FITOQUIMICO DEL EXTRACTO FLUIDO: “Prueba de la gota” evaporar el solvente del extracto fluido y el solvente disolver con los solventes necesarios (diclorometano, etanol, agua y agua acida) 4.2.1.- EXTRACTO DICLOROMETANICO: identifica compuesto de muy baja polaridad como esteroles y quinonas. 4.2.2.- EXTRACTO ETANOLICO: identifica compuestos d polaridad muy variada como esteroides, alcaloides, flavonoides y taninos 4.2.3.-EXTRACTO ACUOSO ACIDO: identifica compuestos básicos como alcaloides 4.2.4.- EXTRACTO ACUOSO: Identifica compuestos de alta polaridad como flavonoides, leucoantiosantinas, saponinas y taninos. 5

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5.-PROCEDIMIENTO PARA EL RECONOCIMENTO DE METABOLITOS 5.1.- RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES: Colocar en dos tubos de ensayo aproximadamente 0.5 ml del filtrado ácido, Agregar a cada uno de los tubos previamente rotulados con el respectivo Nombre del reactivo, 2 gotas de los reactivos de: Dragendorff, Mayer. Si se Observa turbidez o precipitado en los dos tubos se considera que la muestra Contiene alcaloides (Prueba presuntiva).

5.2.- RECONOCIMIENTO DE ESTEROIDES Y/O TRITERPENOIDES: En un tubo de ensayo limpio y seco tomar 1 ml del filtrado orgánico y agregar por la pared del tubo 1 ml de anhídrido acético y con precaución 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La aparición de coloraciones: verdes, azules, rojas o violeta es prueba positiva (+) para esteroides y/o triterpenoides en la muestra.

5.3.- RECONOCIMIENTO DE SAPONINAS: Tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco y macerar en un mortero, adicionar suficiente cantidad de agua que cubra la muestra, filtrar a través de gasa, pasar 4 ml del filtrado a un tubo de ensayo y agitar vigorosamente durante un minuto, si se forma abundante espuma, estable aproximadamente 5 minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra.

5.4.- RECONOCIMIENTO DE TANINOS: Tomar 1 ml de la solución acuosa en un tubo de ensayo y adicionar dos (2) gotas de solución de tricloruro férrico (FeCL al 1%). La aparición de un color verde, azul o negro es prueba positiva (+) para compuestos fenólicos; en un segundo tubo de ensayo tomar otro mililitro del filtrado y agregar unas gotas de gelatina sal, si hay turbidez o formación de precipitado es prueba positiva para taninos en la muestra. Las dos pruebas son necesarias para comprobar la presencia de taninos. 6

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5.5.- RECONOCIMIENTO DE QUINONAS: Adicionar aproximadamente 1 ml de hidróxido de sodio al 5% en amoníaco al 2%. Luego de agitar se obtiene un color rojo cereza en la capa acuosa, lo que indica presencia de quinonas en la muestra. 5.6.- RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES • Ensayo de Shinoda Los flavonoides con el núcleo benzopirona (p. ej. flavonas, flavonoles, flavanonas, etc.) producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o alcohólicas se les adiciona magnesio seguido de HCl concentrado. Aunque no se conoce el mecanismo de esta prueba, es muy utilizada para reconocer esta clase de compuestos. • Ensayo con Zn/HCl Al remplazar el Mg por el Zn en el procedimiento del ensayo de Shinoda, solamente los dihidroflavonoles (o flavononoles) producen coloraciones rojo-violetas. Las flavanonas y flavanoles no producen color o producen coloraciones rosadas débiles. 5.6.1.- HIDRÓLISIS DE FLAVONOIDES EXTRACCION: Medir 20 mL del extracto fluido a un balón y llevar a reflujo con 20 mL de ácido sulfúrico al 10 % durante dos horas. Para obtener los cristales purificados 5.6.2.- CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES: La determinación de flavonoides se llevara a cabo mediante una modificación a la técnica reportada en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, empleando como referencia hesperidina. 

Se utilizara 1.5 g de la materia vegetal pulverizada, para la obtención de la solución madre, mediante 2 reflujos de 1 h cada uno con etanol al 60% y aforando el extracto obtenido con etanol a 250 mL. Se preparara una 7

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disolución de la referencia, utilizando 10 mg de hesperidina que se disolverá en metanol absoluto y se llevara a un aforo de 100 ml. 

Posteriormente se preparara 4 disoluciones (aforando a volúmenes finales de 25 mL), la composición de estas 4 disoluciones será la siguiente:



Disolución 1: 2 mL de la disolución madre, 2 mL de una disolución de cloruro de aluminio al 2%, y se aforara con metanol.

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Disolución 2: 2 mL de la solución madre, aforando con metanol.



Disolución 3: 2 mL de la disolución de referencia, 2 mL de una solución de cloruro de aluminio al 2% y aforando con metanol. Por último, la disolución 4, contendrá 2 mL de la disolución de referencia y se aforara con metanol.

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Se medirán las absorbancias de las disoluciones 1 y 3, empleando un espectrofotómetro Spectronic 20D+ modelo 333183, a una longitud de onda de 394 nm. Se emplearan como blanco las disoluciones 2 y 4, respectivamente. La cantidad de flavonoides expresada en porcentaje se calculara de la



siguiente manera: % de flavonoides expresados como: hesperidina = (A1 x P2 xV1 x 100) / (A2 X P1 X V2) Dónde: A1: absorbancia disolución P1: peso de la muestra. V1: aforo de la muestra. 8

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A2: absorbancia disolución 3. P2: peso del estándar. V2: aforo de la referencia. IV. BIBLIOGRAFIA:  

Villar del fresno, A.M. farmacognosia general. Editorial síntesis, 1999. Q.F. Yanet Cuentas Romaña, laboratorio de farmacognosia II. Farmacia y

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Bioquímica, Fotocopias Mery, UNSAAC. Q.F. Nancy Edith Mamani Quispe, Laboratorio de Farmacognosia I.

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Farmacia y Bioquímica, fotocopias Mery, UNSAAC. Trabajo de investigación del trébol amarillo, laboratorio de farmacobotanica, farmacia y bioquímica, UNSAAC. Palacios Vaccaro, Julio: “Plantas Medicinales Nativas del Perú”. Concytec. 1997. Domínguez J. Métodos de investigación fitoquímica. México: Editor Limusa Wiley; 1973.

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