• Author / Uploaded
• MARÍA ALEJANDRA RAMÍREZ SALAZAR

Citation preview

RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

PRESENTADO POR: PAULA MARCELA MOLINA MOSQUERA C.C 1.039.466.746 GLORIA MERCEDES SUAREZ MORENO C.C 1.088.293.690

PRESENTADO A: NATALIE CHARLOTTE CORTES RENDON

LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA I

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y ALIMENTARIAS MEDELLÍN 2018 RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

1. OBJETIVOS General Reconocer por medio de observación microscópica metabolitos secundarios en diferentes muestras vegetales conocidas mediante pruebas químicas rápidas de coloración y precipitación de dichos compuestos.

Específicos ● Identificar la presencia de alcaloides en diferentes fuentes vegetales por medio de reacciones químicas rápidas de coloración y precipitación. ● Identificar la presencia de saponinas en diferentes fuentes vegetales por medio de reacciones químicas rápidas de coloración y precipitación. ● Identificar la presencia de flavonoides y compuestos fenólicos en diferentes fuentes vegetales por medio de reacciones químicas rápidas de coloración y precipitación. ● Identificar la presencia de cardiotónicos y taninos en diferentes fuentes vegetales por medio de reacciones químicas rápidas de coloración y precipitación. ● Identificar la presencia de antraquinonas en diferentes fuentes vegetales por medio de reacciones químicas rápidas de coloración y precipitación. ● Identificar la presencia de cumarinas en diferentes fuentes vegetales por medio de reacciones químicas rápidas de coloración y precipitación.

2. INTRODUCCIÓN

A diferencia de otros organismos, las plantas destinan una cantidad significativa del carbono asimilado y de la energía a la síntesis de una amplia variedad de moléculas

orgánicas que no parecen tener una función directa en procesos fotosintéticos, respiratorios, asimilación de nutrientes, transporte de solutos o síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos, y que se denominan metabolitos secundarios, o también denominados productos naturales. (1) Estos compuestos derivados del metabolismo secundario, se distribuyen diferencialmente entre grupos taxonómicos, presentan propiedades biológicas, muchos desempeñan funciones ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes o colorantes, entre otros. (1) Los compuestos secundarios no tienen una función aparente en el metabolismo primario pero sí tienen una implicación ecológica como defensa contra herbívoros, virus, hongos, bacterias, como sustancias alelopáticas, fitoalexinas o disuasorios nutritivos. Otros tienen una función fisiológica, por ejemplo los alcaloides, las pectinas que pueden servir para el transporte de nitrógeno tóxico y compuestos de almacenamiento, mientras los compuestos fenólicos como los flavonoides realizan una función como protectores de rayos ultravioletas. Además, son una fuente importante de principios activos de medicamentos y de valiosos productos químicos. (1) Por otro lado, los compuestos secundarios de plantas de interés comercial, han sido incluidos en tres principales categorías según sus rutas biosintéticas: terpenos, compuestos fenólicos y compuestos nitrogenados. Los terpenos se forman por la polimerización de unidades de isoprenos y esteroides y se dividen en seis grupos: monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos y esteroles, dentro de los cuales se encuentran carotenos, glicósidos cardiotónicos, taxol, entre otros. Entre los compuestos fenólicos se incluyen los ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides y taninos. Las aplicaciones farmacéuticas de estos compuestos son considerables, se refieren sus efectos como analgésicos, antibacterianos, anti hepatotóxicos, antioxidantes, antitumorales, inmunoestimulantes, entre otras. Los compuestos nitrogenados son principalmente los alcaloides y glucósidos cianogénicos. (1)

3. METODOLOGÍA

De cada extracto obtenido se conservó 1 mL en un tubo de ensayo para realizar comparación con los extractos en los que se realizaron pruebas químicas de coloración y/o precipitación.

3.1 Reconocimiento de alcaloides Se forma precipitación al reaccionar con reactivos específicos para alcaloides, se utilizaron los reactivos Mayer y Dragendorff. Obtención del extracto: Se tomó aproximadamente 5 g del material vegetal fresco (hojas y flores de borrachero), se macero en un mortero, se pasó la muestra a un beaker, se adicionó un volumen suficiente de HCl al 5% para cubrir la muestra, se calentó al baño maría durante 10 minutos, se dejó enfriar y se filtró. Prueba cualitativa (Precipitación con sales de metales pesados en medio ácido): Se colocó en dos tubos de ensayo 0.5 mL del filtrado ácido obtenido del extracto, a un tubo de ensayo se adicionó 2 gotas del reactivo Dragendorff y al otro tubo se adicionó 2 gotas del reactivo Mayer. Si se observa turbidez o precipitado en ambos tubos se considera como prueba presuntiva de la presencia de alcaloides.

3.2 Reconocimiento de saponinas Obtención del extracto: Se tomó aproximadamente 5 g del material vegetal fresco (fruto seco de chumbimbo), se macero en un mortero, se adicionó agua suficiente para cubrir la muestra y posteriormente se realizó filtración a través de una gasa. Prueba cualitativa: Se pasó 4 mL del filtrado a un tubo de ensayo y se agitó vigorosamente durante un minuto. Si se forma abundante espuma que permanece estable durante 5 minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas.

3.3 Reconocimiento de flavonoides y compuestos fenólicos Obtención del extracto: Se tomó aproximadamente 5 g del material vegetal fresco (pétalos de rosa roja), se macero en un mortero, se pasó la muestra a un beaker, se adicionó un volumen suficiente de etanol para cubrir la muestra, se calentó al baño maría durante 10 minutos y se filtró en caliente. Prueba cualitativa para flavonoides (Ensayo de Shinoda): Se adicionó 1 mL del filtrado etanólico del extracto obtenido en un tubo de ensayo, se agregó limaduras de magnesio y por la pared del tubo de ensayo se agregó lentamente HCl concentrado (37%). La aparición de colores: naranja, rojo, violeta o rosado, indican que es prueba presuntiva de la presencia de flavonoides. Prueba cualitativa para compuestos fenólicos (Prueba del cloruro férrico): Se adicionó un 1 mL del filtrado etanólico del extracto obtenido en un tubo de ensayo y

se adicionó 2 gotas de solución de tricloruro férrico al 10%. La aparición de un color verde, azul o negro es prueba positiva para compuestos fenólicos.

3.4 Reconocimiento de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas; y reconocimiento de taninos 3.4.1 Reconocimiento de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas Obtención del extracto: Se realizó maceración en un mortero de 10 g del material vegetal finamente picado (semillas de catapiz), se agregó suficiente cantidad de etanol, se calentó al baño maría durante 5 minutos, se dejó enfriar y se filtró. Prueba cualitativa para cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas (Prueba de kedde): Se adicionó 1 mL de filtrado del extracto del material vegetal en un tubo de ensayo y se agregaron 0.5 mL de reactivo de Kedde A y 0.5 mL del reactivo de Kedde B. La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba presuntiva de la existencia de cardiotónicos. 3.4.2 Reconocimiento de taninos Obtención del extracto: Se realizó maceración en un mortero de 10 g del material vegetal (hojas de guayaba), se agregó suficiente cantidad de etanol, se calentó al baño maría durante 5 minutos, se dejó enfriar y se filtró. Prueba cualitativa de taninos (Prueba de precipitación de proteínas): En un tubo de ensayo se tomó 1 mL del filtrado y se agregó 20 gotas de la solución de gelatina-sal. La aparición de turbidez o formación de precipitado es prueba presuntiva de la presencia de taninos.

3.5 Reconocimiento de quinonas y/o antraquinonas Obtención del extracto: Se pesó 2 g de material vegetal en polvo (hojas de sen) en un beaker de 100 mL, luego se adicionó 20 mL de etanol al 95%, posteriormente se calentó en baño maría durante 5 minutos hasta ebullición y se filtró en caliente. Hidrólisis: Se tomó 5 mL del filtrado y se le adicionó 3 mL de ácido sulfúrico al 10%, y se calentó en baño maría durante 10 minutos hasta ebullición.

Oxidación: Al anterior filtrado se agregó 3 mL de peróxido de hidrógeno 20%, se calentó en baño maría durante 10 minutos hasta ebullición y se dejó enfriar. Extracción líquido-líquido en embudo de separación con acetato de etilo: Al extracto oxidado se adicionó 5 mL de acetato de etilo y un poco de agua para favorecer la separación de las fases, se agitó suavemente para no emulsionar y se realizó la extracción. Prueba cualitativa para antraquinonas (Prueba Bortranger): Se tomó 2 mL de la fase orgánica (acetato de etilo: fase superior) en un tubo de ensayo y se adicionó 1 mL de solución de hidróxido de sodio al 5% en amoníaco al 2%. La aparición de un color rojo cereza en la capa acuosa (fase inferior) indica presencia de quinonas en la muestra.

3.6 Reconocimiento de cumarinas Obtención del extracto: Se tomó aproximadamente 1 g del material vegetal fresco (cáscara de limón), se macero en un mortero con un volumen suficiente de etanol comercial para cubrir la muestra. El extracto obtenido se adicionó a un tubo de ensayo grande, se cubrió la boca del tubo de ensayo con un trozo de papel filtro sujetándolo con una banda elástica. Prueba cualitativa para cumarinas: Se agregó 5 gotas de hidróxido de sodio al 10% sobre el papel filtro que cubre el tubo de ensayo, luego se llevó el tubo de ensayo a baño maría para calentar durante 5 minutos, posteriormente se dejó enfriar y se retiró el papel filtro. Finalmente se observó el papel filtro bajo luz ultravioleta a 365 nm. La aparición de una coloración fluorescente (verde, amarilla o roja) bajo luz ultravioleta a 365 nm es prueba positiva para cumarinas.

4. DATOS 4.1 Reconocimiento de alcaloides Para la detección de alcaloides se utilizó material vegetal de borrachero (Brugmansia arborea), utilizando de éste las hojas y flores . 4.2 Reconocimiento de saponinas Para la detección de saponinas se utilizó material vegetal de chumbimbo (Sapindus saponaria), utilizando de éste el fruto seco.

4.3 Reconocimiento de flavonoides y compuestos fenólicos Para la detección de flavonoides y compuestos fenólicos se utilizó material vegetal de rosa roja (Rosa sp), utilizando de éste únicamente los pétalos. 4.4 Reconocimiento de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas; y reconocimiento de taninos Para la detección de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas se utilizó material de catapiz (Thevetia peruviana), utilizando de éste las semillas. Para la detección de taninos se utilizó material vegetal de guayaba (Psidium guajava), utilizando de éste las hojas. 4.5 Reconocimiento de quinonas y/o antraquinonas Para la detección de antraquinonas se utilizó material vegetal de sen (Senna alexandrina), utilizando de éste las hojas. 4.6 Reconocimiento de cumarinas Para la detección de cumarinas se utilizó material vegetal de limón (Citrus x limon), utilizando de éste únicamente la cáscara.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS 5.1 Reconocimiento de alcaloides Los resultados obtenidos para el reconocimiento de alcaloides en la muestra vegetal de Brugmansia arborea con los reactivos de Dragendorff y Mayer se muestran en la figura 1:

Figura 1. Resultado de la prueba cualitativa para alcaloides en extracto de flores y hojas de borrachero (precipitación con sales de metales pesados en medio ácido), empleando el reactivo de Dragendorff y el reactivo de Mayer.

Las tres principales categorías de metabolitos secundarios de defensa son los fenólicos, los alcaloides, y los terpenos. Alrededor de 10,000 alcaloides han sido aislados y sus estructuras analizadas. Los alcaloides son moléculas relativamente pequeñas que contienen nitrógeno. Los alcaloides son altamente específicos para las especies de plantas o grupo de especies en las que se encuentran. Son efectivos en pequeñas cantidades (como es el caso de la cocaína, la nicotina y la cafeína) aunque en algunos casos particulares las plantas o partes de ellas producen altas concentraciones de alcaloides. . Los alcaloides son compuestos heterocíclicos que generalmente se sintetizan a partir de aminoácidos, tales como triptófano, tirosina, fenilalanina, lisina, arginina y ornitina, solos o combinados con terpenoides. También se pueden derivar de purinas y del acetato de los policétidos. Los alcaloides se pueden dividir en los siguientes grupos: alcaloides isoquinoleicos, alcaloides quinolizidínicos, alcaloides pirrolizidínicos, alcaloides tropánicos y alcaloides indólicos. (4) Los alcaloides sirven como productos de desecho o almacenamiento del nitrógeno sobrante, esta función es equivalente a la del ácido úrico o de la urea en los animales. Debido a que en su mayoría, los alcaloides son asociados con ácidos orgánicos que le facilita el transporte en la planta, pueden servir como productos de almacenamiento del nitrógeno no metabolizado o para transporte del mismo. La microquímica ha permitido mostrar en forma general, que los alcaloides son

localizados en los tejidos periféricos de los diferentes órganos de la planta, es decir en el recubrimiento de las semillas, corteza del tallo, raíz o fruto y en la epidermis de la hoja; esto nos permite pensar que los alcaloides cumplen una importante función como es la de proteger a la planta, por su sabor amargo de estos, del ataque de insectos. Los alcaloides también pueden servir de reguladores del crecimiento. (5) El fundamento de la extracción se basa en el carácter básico de los alcaloides y en el hecho de su existencia en las plantas como sales de ácidos orgánicos o como combinaciones solubles de otras sustancias (5). Las reacciones para la detección de alcaloides se pueden clasificar en reacciones de precipitación, de cristalización y reacciones coloreadas. Las reacciones de precipitación se basan generalmente en la combinación de los alcaloides con metales pesados. Se llevan a cabo en solución acuosa ácida (6). Lo cual sucede con los dos reactivos empleados en el reconocimiento de alcaloides: el reactivo Dragendorff está compuesto por tetrayodo bismuto de potasio e indica la presencia de alcaloides con la presencia de un precipitado color rojo-naranja y el reactivo de Mayer está compuesto por cloruro de mercurio y yoduro de potasio e indica la presencia de alcaloides con la presencia de un precipitado color blanco amarillento, dichos resultados de las pruebas cualitativas de alcaloides se pueden observar en la figura 1. Las especies de Brugmansia son originarias de Suramérica y se hallan distribuidas a lo largo de la Cordillera de los Andes. En Colombia se encuentran en forma natural, a partir de 1700 metros hasta poco más de los 3000 metros de altitud. Tradicionalmente se conocen como borrachero, cacao sabanero, guanto o floripondio y han sido utilizados por comunidades ancestrales en actos mágico religiosos. Son fuente de alcaloides tropánicos como escopolamina, hiosciamina y atropina, sustancias reconocidas como potentes psicoactivos. Los alcaloides tropánicos son la base de varios fármacos en la medicina alopática, por tanto se convierten, estos árboles, en su fuente comercial potencial. (7)

5.2 Reconocimiento de saponinas El resultado obtenido para el reconocimiento de saponinas en la muestra vegetal de Sapindus saponaria se muestra en la figura 2:

Figura 2. Resultado de la prueba cualitativa para saponinas en extracto de fruto seco de chumbimbo

Las saponinas son glicósidos cuya aglicona consiste en un núcleo esteroidal o triterpénico; esta característica estructural les confiere un carácter anfótero que les permite actuar como tensioactivos. Aprovechando esta propiedad, las dos pruebas más empleadas en la detección de saponinas son la de hemólisis y la de formación de espuma, puesto que al ser tensioactivas las saponinas inestabilizan la membrana celular de los eritrocitos, induciendo su ruptura. (8) La prueba de formación de espuma realizada consiste en agitar vigorosamente la solución acuosa del extracto obtenido, en un tubo de ensayo y observar la espuma formada, dicha espuma permaneció estable durante cinco minutos como se puede observar en la figura 2, por lo cual se consideró la prueba como presuntiva para presencia de saponinas en la muestra vegetal analizada. Las saponinas se pueden encontrar en órganos vegetales muy diversos. El contenido de saponinas en las plantas depende de diversos factores tales como, el tipo de cultivo, edad de la planta, estado fisiológico, la localización geográfica o el órgano vegetal. Las saponinas presentan un grupo de características generales que sirven de base para su identificación rápida: producción de espuma al ser agitadas sus soluciones acuosas, lo cual es la base de la reacción de selivoflo empleada en el tamizaje fitoquímico; producción de hemólisis de los glóbulos rojos por la mayoría de ellas, propiedad que se aprovecha en las técnicas en que se cuantifica la potencia de estas substancias; toxicidad en animales poiquilotermos, en especial los peces (sapotoxinas), a los cuales provocan parálisis de las agallas; producción de una reacción positiva en la prueba de Liebermann-Burchard. (9) 5.3 Reconocimiento de flavonoides y compuestos fenólicos Los resultados obtenidos para el reconocimiento de flavonoides y compuestos fenólicos en la muestra vegetal de Rosa sp, ensayo de Shinoda y prueba del cloruro férrico respectivamente se muestran en la figura 3:

Figura 3. A. Resultado de la prueba cualitativa para flavonoides en extracto de pétalos de rosa roja (Ensayo de Shinoda). B. Resultado de la prueba cualitativa para compuestos fenólicos en extracto de pétalos de rosa roja (prueba del cloruro férrico).

Los flavonoides son importantes para el desarrollo normal de las plantas; estos se encuentran localizados en la membrana del tilacoide de los cloroplastos, son utilizados en la vía de expresión de dos enzimas multigénicas: la fenilalanina amonio liasa y la chalcona sintasa y constituyen un grupo de sustancias colorantes importantes en las plantas. (10) Los flavonoides se ubican principalmente en las hojas y en el exterior de las plantas, apareciendo sólo rastros de ellos en las partes de la planta por encima de la superficie del suelo. Una excepción son los tubérculos de cebolla, que contienen una gran cantidad de quercitina 4'-D-glucósidos. (11) Los flavonoides se encuentran en frutas, verduras, semillas y flores. Desempeñan un papel importante en la biología vegetal; así, responden a la luz y controlan los niveles de las auxinas reguladoras del crecimiento y diferenciación de las plantas. Otras funciones incluyen un papel antifúngico y bactericida, confieren coloración, lo que puede contribuir a los fenómenos de polinización y tienen una importante capacidad para fijar metales como el hierro y el cobre. (11) Los flavonoides son compuestos fenólicos que contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante. (11) Una gran proporción de flores tienen tonalidades blancas marfil o crema, debido a estos pigmentos. También contribuyen a los colores naranjas escarlatas, malvas y azules. La gran mayoría de ellas están pigmentadas por las agliconas más comunes: flavonas y flavonoles. (10)

Las funciones de los flavonoides en las plantas se pueden resumir en tres grupos: papel de defensa, papel de señal química y efecto sobre las enzimas. Los flavonoides juegan un papel en la defensa de las plantas frente a agentes agresores externos. Entre estos agentes se puede mencionar la radiación UV de los rayos solares, los microorganismos tanto bacterias, como hongos e insectos y otros animales herbívoros, las otras plantas (efecto alelopático) y el entorno (medio ambiente agresivo). De hecho, el metabolismo fenólico se activa en las plantas a nivel de transcripción como una respuesta a diferentes condiciones de estrés tanto biótico como abiótico. (10) Los flavonoides actúan como señales químicas o marcadores florales que sirven para guiar a las abejas y otros insectos polinizadores hacia el néctar, facilitando indirectamente la polinización. (10) Los flavonoides y otras sustancias fenólicas brindan protección frente a los ataques por hongos, este es el caso de muchos flavonoides de naturaleza lipofílica (flavonas, flavanonas e isoflavanonas polimetoxiladas y/o isopreniladas) que presentan una actividad antifúngica muy considerable y que constituyen verdaderas barreras frente a la penetración de los hongos patógenos. (10) Las antocianinas son compuestos fenólicos del grupo de los flavonoides, que se encuentran principalmente en frutos, en flores y en hojas, responsables de conferir los colores rojo, azul y violeta, dependiendo de la copigmentación o interacción con compuestos, como metales, alcaloides, taninos y polisacáridos. (12) Como se puede observar en la figura 3, A) el resultado indica la presencia de flavonoides ya que el extracto se tornó de color rojo. En el caso de la prueba de reconocimiento de compuestos fenólicos se debe presentar la aparición de color verde, azul o negro, pero como se puede observar en la figura 3, B) el resultado para esta prueba fue la aparición de un color morado. Dicha prueba se considera igualmente positiva ya que se obtuvo un cambio en el color del extracto, por lo tanto se puede concluir que se ocasiona una interferencia en los resultados por el color del extracto obtenido de los pétalos de rosa (rosado) obteniendo un color diferente a los esperados para la prueba de compuestos fenólicos. 5.4 Reconocimiento de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas; y reconocimiento de taninos Los resultados obtenidos para el reconocimiento de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas en la muestra vegetal de Thevetia peruviana; y reconocimiento de taninos en la muestra vegetal de Psidium guajava, prueba de Kedde y prueba de precipitación de proteínas respectivamente se muestran en la figura 4:

Figura 4. A. Resultado de la prueba cualitativa para cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas en extracto de semillas de catapis (Prueba de Kedde). B. Resultado de la prueba cualitativa de reconocimiento de taninos en extracto de hojas de guayaba (prueba de precipitación de proteínas).

Los glicósidos cardiotónicos son compuestos que poseen características estructurales similares a las de las saponinas, con una estructura compuesta por un núcleo esteroidal glicosilado (2 desoxiazúcares) y una lactona insaturada de 5 o 6 miembros. (8) La Thevetia peruviana es una planta pequeña con hojas muy verdes y flores tubulares en forma de embudo de color amarillo a naranja, atributos que le otorgan su carácter ornamental. Esta especie vegetal, originaria del centro y sur de América pero también disponible en Asia y África, sintetiza metabolitos secundarios tipo glicósidos cardiotónicos, los cuales almacena en hojas, flores y semillas; pertenece a la familia de las Apocynáceaes y comúnmente se le conoce con los nombres de Yellow oleander, adelfa amarilla, azuceno, laurel amarillo, catape, cascabel o flor del Perú. (13) El glicósido cardiotónico Thevetin B fue aislado, purificado, caracterizado y cuantificado como el componente principal en las hojas de Thevetia peruviana, especie vegetal difundida en la región del Valle del Aburrá. Las potenciales propiedades cardiotónicas descritas para este tipo de compuestos, lo convierten en una molécula de interés para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva. (13) En la figura 4, A) se puede observar que para la prueba de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas en el extracto de semillas de catapis con los reactivos de Kedde fue positiva ya que se presentó la aparición de una coloración púrpura.

La acción biológica de estos glicósidos, que incluye actividad digitálica, antiviral, anti-ATpasa y antibacterial, entre otras, ha estimulado múltiples investigaciones en procura del aislamiento, caracterización y evaluación de análogos estructurales de este tipo de esteroides cardiotónicos. (13) La insuficiencia cardíaca congestiva (ICC) aparece cuando el corazón es incapaz de atender las necesidades del organismo mediante un funcionamiento normal, el corazón aumenta de tamaño, pierde fuerza de contracción e impide que pueda bombear sangre con la eficacia requerida. El tratamiento clásico de la ICC va dirigido a reducir los factores que lo provocan y a mejorar la función del miocardio, lo cual se puede alcanzar incrementando la eficacia por aumento de la fuerza contráctil y el vaciado del corazón con agentes inotrópicos positivos (cardiotónicos). (13) Por otro lado, los taninos son polifenoles que tienen la propiedad de unirse a las proteínas y precipitarlas. Por esta razón, la prueba más empleada para la detección de este grupo de metabolitos secundarios emplea el reactivo de gelatina-sal, el cual produce un precipitado blanco en presencia de taninos, luego de haber obtenido el extracto etanólico de la muestra vegetal(8), como se puede observar en la figura 4, B) la cual presenta turbidez por la formación de un precipitado color blanco. Los metabolitos secundarios, en particular los alcaloides, fenoles, flavonoides y taninos, son compuestos químicos que no actúan en el metabolismo primario de las plantas, pero intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta y su ambiente. Se sintetizan cuando las plantas están en condiciones adversas, entre ellas, el ataque por herbívoros, microorganismos y la presencia de diferentes especies que compiten por luz, agua y nutrientes. (14) Los taninos constituyen la principal fracción fenólica responsable de producir las características de astringencia y/o amargas de las especies vegetales, y por ende, resultan desagradables para los depredadores de la planta. Los taninos a altas concentraciones son considerados antinutricionales, debido a que forman complejos insolubles con proteínas, carbohidratos y otros polímeros del alimento, lo cual disminuye su digestibilidad. (14) 5.5 Reconocimiento de quinonas y/o antraquinonas El resultado obtenido para el reconocimiento de quinonas y/o antraquinonas en la muestra vegetal de Senna alexandrina con la prueba de Bortranger se muestra en la figura 5:

Figura 5. Resultado de la prueba cualitativa para quinonas y antraquinonas en extracto de hojas de sen (prueba Bortranger).

Las antraquinonas están ampliamente distribuidas en microorganismos, plantas, equinodermos e insectos. Las familias vegetales más ricas en compuestos antracénicos son las rubiáceas, las ramnáceas y las poligonáceas; y en una menor proporción las liliáceas, leguminosas, bignoniáceas, melastomatáceas, droseráceas, vismiáceas, etc. En las plantas inferiores como los líquenes se conoce una gran variedad de antraquinonas, incluyendo antraquinonas halogenadas. Estas sustancias pueden encontrarse en diferentes partes de la planta como hojas, tallos, madera y frutos; se les encuentra principalmente en forma de glicósidos y en menor proporción en forma libre o agliconas. (15) Entre los compuestos fenólicos caben destacar las antraquinonas, que son por mucho el grupo más amplio de las quinonas naturales y son la base y fuente de una importante cantidad de colorantes; además son una clase de metabolitos secundarios vegetales con una funcionalidad p-quinoide en un núcleo antracénico. (15) La detección de antraquinonas se lleva a cabo por medio de la reacción de Borntrager. Esta reacción solo se da en las antraquinonas libres (formas oxidadas libres), que son solubles en un disolvente orgánico (color amarillo) y se le añade una solución acuosa de hidróxido de sodio, se formará un capa de color rojo debido a las sales, que irá haciendo desaparecer el color amarillo (reacción positiva). Esas sales que se forman son fenatos. (16)

Para la detección de este tipo de metabolitos secundarios se empleó la reacción de Bornträger-Kraus. Para ello, el extracto etanólico seco fue extraído con una solución etanólica al 95%, a la cual se adicionó ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno y se procedió a calentar; bajo estas drásticas condiciones, se hidrolizan los enlaces glicosídicos y se oxidan las antronas y los antranoles hasta antraquinonas, las cuales fueron extraídas con acetato de etilo, y posteriormente la fase orgánica o superior fue agitada en presencia de una solución de hidróxido de sodio al 5% que contiene amoniaco al 2%. Como se puede observar en la figura 5, debido a la presencia de antraquinonas, al separarse las fases, la fase acuosa o inferior toma una coloración rojiza, siendo prueba positiva para la presencia de antraquinonas en la muestra vegetal de hojas de sen. Las antraquinonas son productos del metabolismo secundario con gran importancia en la industria farmaceútica. En la industria farmacéutica las antraquinonas (AQ glicósidos) se utilizan en la producción de productos farmacéuticos para el tratamiento de gingivitis, estomatitis, úlceras bucal, inflamación de la mucosa y condiciones periodontal. Otro miembro del grupo de las antraquinonas “senna” se utiliza en la preparación de laxantes para el estreñimiento o para la desocupación del intestino antes de un procedimiento de radiología abdominal. (17) Es mundialmente reconocida la importancia farmacognóstica de las hojas y frutos de la especie exótica S. alexandrina, considerada como la especie vegetal que proporciona uno de los más seguros y eficaces laxantes conocidos por el hombre. Las propiedades catárticas del "sen" están dadas por la riqueza en derivados antracénicos que contiene. Su empleo en medicina data del siglo X (Perrot 194345), pero recién en el siglo XX se descubrieron los primeros glucósidos activos y en 1950, Stoll et al. aislaron por primera vez los glucósidos en forma cristalina. Los principales constituyentes del sen son los glucósidos diméricos denominados senósidos A, B, C y D. (18)

5.6 Reconocimiento de cumarinas El resultado obtenido para el reconocimiento de cumarinas en la muestra vegetal de Citrus x limon con fluorescencia bajo luz ultravioleta a 365 nm se muestra en la figura 6:

Figura 6. Resultado de la prueba cualitativa para el reconocimiento de cumarinas en extracto de cáscara de limón (Fluorescencia bajo Luz Ultravioleta a 365nm).

El aislamiento de la cumarina fue descrito por primera vez por Vogel en 1820 de un árbol de Guyana. Asoció el aroma característico con el del compuesto obtenido de Melillotus ofcinalis y concluyó que los cristales aislados de ambas especies eran idénticos. El nombre de cumarina se origina en una palabra del caribe “ coumarou” con el que era conocida su fuente de obtención: el árbol conocido botánicamente como Coumarouna odorata Aub. Cumarina es el nombre trivial con que actualmente se conoce el compuesto cuya estructura fue deducida casi medio siglo después y es el nombre dado al grupo de lactonas naturales que poseen este esqueleto como unidad estructural fundamental. (19) Las cumarinas son compuestos heterocíclicos derivados del ácido cinámico con un núcleo formado por un anillo bencénico condensado con un anillo piránico, aunque en muchas se fusiona un tercer anillo heterocíclico. Las cumarinas dan su olor a la hierba recién cortada y, aparentemente, son desagradables para las ovejas en cantidades altas. No obstante, la rapidez con la que son excretadas les hace ser poco tóxicas para los vertebrados. (20) A pesar de que se encuentran en algún género de leguminosas, compuestas y otras familias, su distribución es más amplia en umbelíferas y rutáceas. Las cumarinas poseen propiedades fotosensibilizadoras, esto es, su acción tóxica se refuerza en presencia de la luz ultravioleta: algunas son causantes de fotodermatitis, cuya acción retardada podría no ser suficiente para evitar la ingestión de las plantas por los herbívoros. (20) Las cumarinas son compuestos derivados de la α-benzopirona. Dado que en su estructura presentan un gran número de insaturaciones, estos compuestos exhiben una fuerte fluorescencia azul o verde al ser irradiados con luz ultravioleta, propiedad que se aprovecha para su detección (8), como se puede observar en la figura 6 en la cual las cumarinas presentes en el extracto se acumularon en el papel filtro, por ello al observar el papel filtro bajo luz ultravioleta a 365 nm presenta punto fluorescentes, lo cual indica un resultado positivo para dichos metabolitos secundarios en el extracto de cáscara de limón.

Existe aceite esencial en un 2,5 % aproximadamente en la cáscara del limón. Además, contiene cumarinas de las cuales las principales son: limetina, con bergamotina, bergapteno (5-metoxipsoraleno), di-metoxicumarina, 8geranoxipsoraleno isoimperatoreno y Isopimpinelina. Las cumarinas como el bergapteno es muy conocido debido a que causan fotosensibilización; este efecto a veces es aprovechado en la fabricación de bronceadores. (21)

6. CONCLUSIONES alcaloides: Las características generales de los alcaloides podríamos resumirlas en el hecho de que se forman a partir de aminoácidos, aunque los esteroídicos y los triterpénicos no lo hagan y contienen, en general, nitrógeno heterocíclico. Presentan gran cantidad de hidrógeno. Tienen capacidad para combinarse con sustancias de origen ácido para dar sales. sólo las hojas de S. schultesiana ocasionaron precipitación del reactivo gelatina - sal, puede concluirse que en este órgano se concentran los taninos producidos por la planta, y dado que el

precipitado obtenido es soluble en urea y produce coloración verde tras la adición de cloruro férrico, se infiere que estos taninos son del tipo catéquico o condensados. Sin embargo, la reducida cantidad de precipitado obtenido indica una baja concentración de taninos en la muestra.(PARA GUIARNOS)

http://files.uladech.edu.pe/docente/32924394/Farmcognosia_y_Fitoquimica/Sesion_ 14/TEMA_14.pdf

Compuestos fenólicos. Cumarinas, flavonoides, lignina y taninos.

7. PREGUNTAS DEL MANUAL 7.1 Consultar las reacciones químicas que se presentan en cada una de las pruebas de identificación de metabolitos secundarios. 7.1.1 Reconocimiento de alcaloides a) Reacción Dragendorff

b) Reacción Mayer

7.1.2 Reconocimiento de esteroides y/o triterpenoides (Ensayo de LiebermanBurchard)

7.1.3 Reconocimiento de saponinas En la prueba cualitativa para saponinas no se presenta una reacción química, solo se da formación de espuma, ya que poseen una característica estructural que les confiere un carácter anfótero que les permite actuar como tensioactivos.

7.1.4 Reconocimiento de flavonoides y compuestos fenólicos a) Flavonoides (Ensayo de Shinoda)

b) Compuestos Fenólicos (Prueba del Cloruro Férrico)

7.1.5 Reconocimiento de leucoantocianidinas, antocianinas, cardiotónicos y taninos a) Leucoantocianidinas (Prueba de Rosenheim)

b) Antocianinas (Prueba Richard Willstater, Cambio de color a diferente pH)

c) Cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas (Prueba de Kedde)

d) Taninos (Prueba de Precipitación de Proteínas) Los taninos son polifenoles que tienen la propiedad de unirse a las proteínas y precipitarlas, por esta razón el reactivo gelatina-sal se precipita.

7.1.6 Reconocimiento de quinonas y/o antraquinonas (Prueba de BortrangerKrauss)

7.1.7 Reconocimiento de cumarinas (Fluorescencia bajo Luz Ultravioleta a 365nm)

8. BIBLIOGRAFÍA (1) https://eprints.ucm.es/9603/1/Metabolismo_secundario_de_plantas.pdf (2) https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/255/837 (3) http://www.scielo.org.mx/pdf/rcscfa/v14n1/v14n1a9.pdf

(4) http://www.redalyc.org/html/612/61221317/ (5) http://www.innovacion.gob.sv/inventa/attachments/article/856/alcaloides.pdf (6) http://files.uladech.edu.pe/docente/32924394/Farmacognosia_y_Fitoquimica/ Sesion_14/TEMA_14.pdf (7) http://www.scielo.org.co/pdf/bccm/v13n2/v13n2a02.pdf (8) http://www.scielo.org.co/pdf/cofo/v12n1/v12n1a11.pdf (9) http://www.repositorio.usac.edu.gt/2065/1/06_3661.pdf (10) http://www.redalyc.org/html/1932/193215009001/ (11) http://www.nutricionhospitalaria.com/pdf/3338.pdf (12) http://www.scielo.org.co/pdf/rudca/v16n1/v16n1a13.pdf (13) http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=84922625048 (14) http://www.scielo.org.ve/pdf/ba/v29n1/art06.pdf (15) http://recursosbiblioteca.utp.edu.co/tesisd/textoyanexos/5430894V436. pdf (16) http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/handle/11059/1818/5428 S211.pdf;jsessionid=17F2DF25896289EEF56B180F19B33A15?sequence=1 (17) http://www.redalyc.org/pdf/1812/181220525053.pdf (18) http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2212/Documento_com pleto.pdf?sequence=14 (19) https://www.researchgate.net/publication/273692784_Identificacion_de _cumarinas_en_especies_autoctonas_del_genero_Pterocaulon_Ell (20) http://digital.csic.es/handle/10261/8179 (21) http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?pid=S888888882015000100006&script=sci_arttext