• Author / Uploaded
• Cris Alvarado

Citation preview

WESTERN BLOT Western Blot, también llamado inmunoblot, es una técnica analítica muy utilizada para identificar una proteína diana en una mezcla de proteínas complejas gracias a la especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno. El método se basa en la construcción de un complejo anticuerpo: proteína a través de la unión específica de anticuerpos a las proteínas inmovilizadas sobre una membrana de nitrocelulosa o PVDF y en la detección del anticuerpo unido mediante uno de los dos diferentes métodos de detección de western blot: el método de detección directo y el indirecto.

Método de Detección Directo VS. Indirecto En la detección indirecta de Western Blot (método tradicional), las muestras de proteínas se resuelven primero por SDS-PAGE y luego son electroforéticamente transferidas a la membrana. Después de una etapa de bloqueo, se añade primero un anticuerpo primario para unirse al epítopo de la proteína diana, luego se sondea la membrana con un anticuerpo primario (mono-o policlonal) específicamente dirigido contra la proteína diana. Esto es seguido por un anticuerpo secundario marcado que está dirigido contra el anticuerpo primario.En un gran número de marcadores se utilizan: enzima, tal como Horseradish Peroxidase (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), biotina, sondas fluorescentes tales como fluoresceína o rodamina.

Figura 1 – Método Indirecto de marcaje de anticuerpo. La bioconjugación se ha realizado con la tecnología nitzipper®.

En la detección directa de Western blot, sólo un anticuerpo primario, marcado con un marcador fluorescente o enzima, se utiliza para detectar un antígeno en la mancha (blot), sin necesidad de un anticuerpo secundario.

Figura 2 – Método Directo de marcaje de anticuerpo. La bioconjugación se ha realizado con la tecnología nitzipper®.

Ambos métodos son válidos y presentan cada uno pros y contras en comparación con el otro. Te proponemos un estudio de los pros y los contras de cada método en la siguiente tabla:

Método DIRECTO

Método INDIRECTO

PROS

CONTRAS

PROS

CONTRAS

* Rápido porque sólo se usa un anticuerpo y se necesitan menos etapas. *Unión específica del anticuerpo secundario (no hay reactividad cruzada). * Disminución

* Falta de sensibilidad para detector bajos niveles de expresión del antígeno. * Necesidad de marcar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés: consume tiempo y es costoso. *La inmunoreactividad del anticuerpo

* Mayor nivel de sensibilidad y genera una señal más intensa. * Una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados disponibles comercialmente. *Máxima inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene, ya que no está etiquetado.

* Unión no específica del anticuerpo secundario y alto ruido de fondo. * El uso de un anticuerpo secundario requiere pasos adicionales de bloqueo y de control.

Método DIRECTO

de la variabilidad del ensayo y mejora de la calidad de los datos.

primario puede verse afectada adversamente por el marcaje. * No hay flexibilidad en la elección marcador del anticuerpo primario de un experimento a otro. * Amplificación de señal mínima. * Altos conocimientos científicos especializados requeridos.

Método INDIRECTO

*Mayor amplificación de la señal debido a la unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.

Western Blot, un proceso todavía limitado por la disponibilidad de productos Hoy en día, una gran variedad de anticuerpos está disponible comercialmente, pero sólo unos pocos se comercializan directamente con un marcador. Ese es uno de los problemas que los científicos tienen que enfrentarse cuando tienen que realizar ensayos de Western Blot. Como los métodos de detección directos e indirectos son procesos complejos y costosos para los usuarios finales para marcar un anticuerpo, algunos kits de marcaje han sido desarrollados por varias empresas. Sin embargo, esta solución todavía tiene algunas limitaciones, ya que sólo ofrecen la posibilidad de marcar un número limitado de anticuerpos con un número limitado de marcadores y por lo tanto, no siempre se ajustan a las necesidades de los usuarios finales para la detección de una diana específica, o requieren el uso de equipos de detección, que por consiguiente les convierte en una solución cara. Por lo tanto los científicos todavía están limitados en sus avances en investigación, ya que no tienen una solución eficaz, universal y económica que les permita realizar sus western blot con cualquier tipo de anticuerpos y

cualquier tipo de marcador, superando las dificultades de marcaje convencional como la pérdida de anticuerpos, la orientación, etc.

Nitzipper® - La tecnología de marcaje de anticuerpos más simple, rápida y versátil para tus Western Blots nitzipper® es una tecnología de bioconjugación innovadora que permite el marcaje directo de anticuerpos, proteínas, péptidos u otras biomoléculas para su uso en diversas aplicaciones, el desarrollo de kits de diagnóstico, descubrimiento de nuevos medicamentos y cualquier otra aplicación que te puedas imaginar. Descubre rápidamente cómo funciona la tecnología de bioconjugación nitzipper® gracias a la imagen de abajo. Fig.3.

Figura 3 - Gráfica con tiempos del protocolo de bioconjugación nitzipper® para el marcaje de anticuerpos.

En este ejemplo, el anticuerpo purificado está funcionalizado con el Linker U de nitzipper® y el marcador está funcionalizado con el Linker T, linkers complementarios. El protocolo de un solo paso es tan rápido y fácil de usar, que permite marcar los anticuerpos en menos de 30 segundos. El investigador simplemente pipetea los anticuerpos funcionalizados con el Linker U con el marcador de interés funcionalizado con el Linker T complementario y se incuba unos 15 minutos. Obtienes finalmente tu anticuerpo marcado listo para usar en tus técnicas de western blot en menos de 17 minutos y con una alta pureza (hasta ~ 100% de conjugado anticuerpo-marcador sin necesidad de purificación adicional).