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LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE DETERMINACIÓN DE SACAROSA EN AZÚCAR DE MESA POR POLARIMETRÍA

RESUMEN Se determinó experimentalmente, la concentración y la rotación especifica de sacarosa (C12H22011) en una muestra comercial de azúcar morena, mediante polarimetría, utilizando el método del patrón externo para la construcción de la curva de calibración. Obteniendo resultados de 99.13% (p/p) de concentración de sacarosa, con un porcentaje de error del 51.48% y una rotación especifica de 32,4°. Palabras Clave: Polarimetría, azúcar, patrón externo, rotación específica. DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS Estándar 1 Curva de calibración por patrón externo Para la construcción de la curva, se prepararon seis soluciones de sacarosa estándar en 25 mL de agua destilada, en el rango de 4.0 – 20.0% (P/V). A continuación, se muestra el cálculo para determinar la cantidad de gramos de azúcar analítica para preparar el primer punto de la curva (4.0% P/V). El resto de los resultados se muestran en la tabla 1. 25 mL ∗

4.0 g Sacarosa 100g Azúca Analítica 𝑥 100 mL 100g Sacarosa

25.0 mL ∗

Donde Xg/100 mL es la concentración corregida a partir de 1.0027 g de sacarosa. Al despejar Xg, se tiene: 𝑋𝑔 =

1.0027 g sacarosa ∗ 100 mL = 4.011 g sacarosa 25.0 mL

Por lo tanto: Xg 100 mL

= 1.0 ± 0.0001 𝑔 𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝐴𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 Tabla 1. Datos teóricos de gramos necesarios de sacarosa estándar para la preparación de 5 soluciones en rango de 4.0 – 20.0% (p/v)

Estándar

% (p/v)

1 2 3 4 5 6

4.0 6.0 8.0 12.0 18.0 20.0

Masa teórica Sacarosa (±0.0001 g) 1.0000 1.5000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000

Xg = 1.0027 g sacarosa 100 mL

=

𝑝 = 4.011 % ( ) 100 mL 𝑣

Se utilizó la ecuación 1 para calcular la desviación estándar de 4.011% (p/v), Las incertidumbres de las pipetas y matraces utilizados para esta para esta práctica se muestran en la tabla 4 de anexos 𝑆𝑋 𝑋

= √(

SX₁ X₁

2

) +(

S[estandar 1]

Corrección de las concentraciones de la tabla 1 Se realiza el cálculo para corregir las concentraciones reales, a partir de los gramos de sacarosa estándar exactamente medidos. Se muestra el procedimiento para la corrección del primer estándar, el ajuste del resto de estándares se resume en la tabla 2.

4.011 g

4.011 %

SX₂ X₂

= √(

2

) ….+(

0.04 25.00

SXᵢ Xᵢ

2

) + (

2

) 𝐄𝐜. 𝟏

0.0001 1.0027

%SEstandar 1 = 0.0064% %[Estandar 1 ] = 4.011 ± 0.0064% Medición del Ángulo de rotación

2

)

LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Se construye una curva de calibración por patrón externo al medir la rotación de la luz polarizada por triplicado de soluciones patrones de sacarosa y la muestra con volúmenes de 25 mL a treves de un polarímetro con camino óptico de 20 cm.. Los resultados se muestran en la tabla 2.

lineal o no, primero se realiza el cálculo para conocer (Sxx ), (Syy ) y Sxy (Ecuaciones 2, 3 y 4) las cuales son las variables necesarias para la determinación de r.

Tabla 2. Datos experimentales, pesos reales, concentración y medición de Rotación óptica en las soluciones estándares y la muestra. Masa real Rotación Concentración Solución Sacarosa óptica % (p/v) (±0.0001 g) ± 0.002 4.011 Estándar 1 1.0027 2.6441 ± 0.006 6.007 Estándar 2 1.5017 3.9673 ± 0.01 8.006 Estándar 3 2.0015 5.2488 ± 0.01 12.009 Estándar 4 3.0022 7.8466 ±0.02 16.015 Estándar 5 4.0038 10.4424 ±0.03 20.035 Estándar 6 5.0087 13.0450 ±0.03 Muestra 3.5003 9.0592

Sxx = 190.5386 % (p/v)2

Sxx = ∑(x1 − x̅)2 𝐄𝐜. 𝟐

Syy = ∑(y1 − y̅)2 𝐄𝐜. 𝟑 Syy = 80.1090 Sxy = ∑(x1 − x̅) ∗ (y1 − y̅) 𝐄𝐜. 𝟒 Sxy = 123.5467 % (p/v)

Los datos obtenidos experimentalmente por método de mínimos cuadrados, se encuentran tabulados en la tabla 2. Tabla 2. Datos estadísticos de la regresión lineal curva de calibración, método patrón externo.

La curva de calibración de la Rotación Óptica en función de la concentración de sacarosa (%p/v), se muestra en la figura 1.

Variable

Valor

Número de estándar

𝑛

6

Pendiente

𝑏

0.64894

Desviación estándar pendiente

𝑆𝑏

0,000757

10

Intervalo de confianza pendiente al 95%

𝐼𝐶𝑏

0.00210

8

Intercepto

𝑎

0,0576

Desviación estándar Intercepto

𝑆𝑎

0.00937

Intervalo de confianza intercepto al 95%

𝐼𝐶𝑎

0.02601

Coeficiente de determinación

𝑟2

0.9999

Coeficiente de correlación

𝑟

0.9999

Tratamiento estadístico de datos

Promedio de x

𝑥̅

11,014

Método mínimo cuadrados Para determinar el factor de correlación (r) y verificar si la función obtenida en la curva es

Desviación en x

𝑆𝑥𝑥

190,5386

Promedio de y

𝑦̅

7,199

Concentración sacarosa % (p/v) 14 y = 0,6484x + 0,0577 R² = 1

12

6 4 2 0 0,000

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

Figura 1: Curva de calibración

LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Desviación en y

𝑆𝑦𝑦

80,1090

Covarianza de x e y

𝑆𝑥𝑦

123.5467

de significación. Por lo tanto, se realiza el test de Grubbs.

Teniendo en cuenta de que un método es lineal cuando presenta un r > 0.999, entonces se realizó prueba t para evaluar el r experimental obtenido. Prueba t para evaluar r

√1 − 𝑟 2

=

9.0592 − 0.0576 0.6484

[Sacarosa en muestra] = 13.88 % (p/v)

𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎 𝐻1 : r ≠ 0 hay correlación 0.9999 ≠ 0 |𝑟| ∗ √𝑛 − 2

𝑹 = 𝟎. 𝟔𝟒𝟖𝟒 𝑪(%𝒑/𝒗) + 𝟎. 𝟎𝟓𝟕𝟔 𝑬𝒄. 𝟓 𝑪(%𝒑/𝒗) =

Hipótesis nula H0 : si r = 0 no hay correlación 0.9999 = 0

𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 =

A partir de la ecuación de la recta y la rotación obtenida en la medición de la muestra en polarímetro, se determinó la concentración de sacarosa en % p/v en la muestra (Ecuación 5).

Cantidad de sacarosa en gramos: 13.88𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 × 25 𝑚𝐿 100 𝑚𝐿

|0.9999| ∗ √4 √1 − (0.9999)2

= 3.47 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎

𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 141.411 A partir de la concentración de sacarosa de 13.88 % (p/v), se determinó la concentración de sacarosa en la muestra de azúcar expresado en % (p/p).

𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑝𝑎𝑟𝑎 (𝑛 − 2) 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 3.18

3.47g sacarosa ∗ 100% 3.5003 g sacarosa

𝑠𝑖 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 > 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 → 𝑅𝑒𝑐ℎ𝑎𝑧𝑜 𝐻0 𝑠𝑖 141.411 > 3.18

99.13 % (p/p) sacarosa en azucar

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑙𝑢𝑠𝑖𝑜𝑛: Existe una relación lineal entre la señal analítica y la concentración, por lo tanto, la gráfica obtenida es lineal. Determinación de la sacarosa en muestra

concentración

de

La determinación de la ecuación de la recta se llevó a cabo mediante el método de mínimos cuadrados y el resultado obtenido fue:

Determinación de la rotación especifica de la sacarosa [α] Rotación especifica de la sacarosa a partir de la ecuación de la recta

[𝑹] =

𝑹

𝒍×𝒅 Ecuación 6. [1]: rotación específica

Con un coeficiente de correlación lineal √𝑅 2 de 0.9999.

R: rotación observado (grados °) [R]: rotación específica (grados °) l: camino óptico (dm) d: densidad de líquido puro o concentración de una solución (g/mL)

Como puede verse en la Figura 1, no existen puntos en la curva de calibración sospechoso que se podría eliminar por medio de una prueba

Generalmente la rotación observada de la luz se representa con la letra grieg a α y la rotación especifica [α]

𝑅 = (0.6484)%𝑝/𝑣 −1 𝑪𝑺𝒂𝒄𝒂𝒓𝒐𝒔𝒂 − 0.0576 𝑬𝒄. 𝟓

LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE De la ecuación 7, se obtiene la siguiente expresión la cual se compara con la ecuación 5 y se determina el valor de [R] 𝑹 = [𝑹] × 𝒍 × 𝒅 𝑬𝒄. 𝟕 → [𝑅] × 𝑙 × 𝑑 = 0.6484 𝐶(%𝑝/𝑣) + 0.0576 → [𝑅] × 𝑙 × 𝑑 ≈ 0.6484 𝐶(%𝑝/𝑣) → [𝑅] × 𝑙 × 𝑑 ≈ 0.6484 × 𝑑 × 100 → [𝑅] ≈

polarímetro digital grafico 1. La técnica de la polarimetría abarca los análisis de tipo óptico en los que interviene la luz polarizada[3]. En el caso de la sacarosa, esta práctica se limitó a la medida de la rotación del plano de polarización de la luz en el momento que atraviesa una capa de esta sustancia, la cual es ópticamente activa, es decir que tiene la capacidad de rotar el plano de polarización de la luz, y a partir de esta medición determinar también su concentración en disolución[4].

0.6484 × 100 𝑙

Reemplazando valores (l=20 cm = 2 dm) → [𝑅] ≈

0.6484 × 100 2

⟹ [𝑹] ≈ 𝟑𝟐. 𝟒

𝒈𝒓𝒂𝒅𝒐𝒔° × 𝒎𝑳 𝒅𝒎 × 𝒈

Utilizando la ecuación 20, se determina el porcentaje de error en la determinación específica de la sacarosa, teniendo en cuenta el valor reportado en la literatura de 66.5°[2] %Error =

Valor teorico − Valorexp. ∗ 100 𝐄𝐜. 𝟖𝟓 Valor teorico

%Error =

66.5 − 32.4 ∗ 100 = 12.48 66.5

% Error = 51.28%

4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Existen algunos materiales que actúan como pantallas cuando la luz los atraviesa, Las ondas que vibran pasan a través de dichas pantallas especiales mientras que las que vibran en otros planos son absorbidas o reflejadas de modo que la luz que sale por el otro extremo tiene una polarización bien definida por las características del material. La determinación de la concentración y rotación especifica de sacarosa, se realizó utilizando un

Gráfico 1. Esquema general de un polarimetro La polarimetría proporcionará información sobre la estructura molecular, la concentración de la sustancia y, en ocasiones, información sobre el disolvente utilizado. La actividad óptica también está influenciada por la temperatura, la longitud de onda de la luz y la longitud de la trayectoria óptica: cuanto más larga sea la ruta de la luz a través de una sustancia ópticamente activa, mayor será el ángulo de rotación. Estas variables se pueden usar para controlar la sensibilidad del instrumento. El coeficiente de rotación especifica determinado experimentalmente para la sacarosa [R]=32.4° con un porcentaje de error relativo respeto al valor real (66.5°) es de 51.28%. La diferencia entre el valor real y experimental se explican teóricamente debido a la presencia de interferencias causadas por las impurezas, además del efecto que causa la hidrolisis (inversión)[5] mientras se realizaba la medición de la señal grafico 2.

LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE

R// La ecuación de Clerget o doble polarización, es un método que se utiliza para determinar el porcentaje de sacarosa en una muestra desconocida. (Ecuación 24) 8.

Gráfico 2. Hidrolisis sacarosa La anterior interferencia se intentó reducir al mínimo realizando las mediciones poco después de haber preparado las muestras y aproximadamente al mismo tiempo de haberse preparado. El cálculo del ángulo e rotación específico para la sacarosa arrojo un valor de 32.4 (˚mL/g dm) para un porcentaje de error de 52,28 % lo que sugiere que el proceso de inversión de la sacarosa ocurrió de una manera significativa. Por último, se calculó la concentración de sacarosa en azúcar por el método de patrón externo, el cual arrojo una concentración de 99.13 %p/p.

5. CONCLUSIONES • El análisis de sacarosa por polarimetría arrojó una concentración de 99.13 %p/p lo que indica que el azúcar comercial está casi en su totalidad compuesto de sacarosa. El ángulo de rotación específico se determinó con un error del solo 52,28% lo que sugiere que el proceso de inversión de la sacarosa se dio significativamente. • la mayor confiabilidad para determinar fallas ya sea en el método o en el equipo, consiste en la medición por duplicado o triplicado, debido a que varias mediciones de muestras precedentes de una misma solución con resultados muy cercanos (con alta precisión) nos da mayor certeza de que el error estará enfocado a la parte operativa en el analista. • El resultado del método mostro no ser significativamente diferente. 6. PREGUNTAS a) Consulte en la literatura la ecuación de Clerget, ¿Cuál es su utilidad?. Con los datos obtenidos en la práctica realizada, puede utilizar la relación de Clerget para cuantificar la sacarosa en la muestra?. Explique.

%Sacarosa =

(V − ∆V) ∗ (𝑃𝐷 − f𝑃𝑖 ) Ec. 24 0.878 d ∗ m

Siendo: d= Longitud de la celda en dm. m= Peso de la muestra en gramos. V= Volumen (mL) al que se ha diluido la muestra tras su disolución. ∆V= Corrección del volumen (mL), debido al volumen de precipitado formado en la clarificación por precipitación de la materia. PD= Poder rotatorio total de la muestra. Pi= Poder rotatorio de la muestra después de la inversión. f= Factor de dilución. b) En el artículo referenciado al final de la bibliografía se hace un estudio de los perfiles de estabilidad y actividad luego de la hidrolisis de la sacarosa mediante dos métodos: un ensayo enzimático y un procedimiento directo polarimétrico. Describa como se utiliza la polarimetría para hacer el seguimiento de la actividad de la sacarosa (invertasa) sobre la sacarosa. ¿Cuál cree usted es la importancia que puede tener este método en el control del trastorno denominado Malabsorción Congénita de Sacarosa? R// El ensayo polarimétrico implica la medición del cambio en la rotación óptica de una solución de sacarosa a medida que se hidroliza mediante soluciones de levadura diluida para producir concentraciones equimolares de glucosa y fructosa. El proceso del seguimiento de la actividad de sacarosa es el siguiente: La actividad óptica a 25° C se relacionó linealmente con la concentración de sacarosa en el rango de 1-20 g*dL-1. Se requirió la presencia de los productos de hidrólisis glucosa y fructosa en los patrones ya que cada uno de ellos contribuyó a la rotación óptica de la muestra. La variabilidad para replicar medidas polarimétricas durante un período de 5 min para las soluciones estándar fue inferior al 1% tanto dentro como

LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE entre días. El LOQ para la sacarosa (la disminución más pequeña que podría cuantificarse) se calculó en 0.037 g*dL-1. Las concentraciones típicas de sacarosa al final de una incubación de 20 minutos en las soluciones de levadura diluidas (1: 500) a 25° C fueron 8.89 g dL-1. Estos valores corresponden a una actividad de aproximadamente 2.72g de sacarosa hidrolizada por minuto para 1 mL (no diluido) de la levadura en solución. Las mediciones de actividad repetida usando el ensayo de polarimetría variaron en menos del 2% tanto dentro como entre días. Utilizando el LOQ para la sacarosa de 0.037 g*dL-1, la actividad mínima cuantificable usando el ensayo de polarimetría fue 0.093 g min-1 mL-1 o el 3.4% de la actividad inicial. Se descubrió que las enzimas potencialmente contaminantes no tienen ningún efecto sobre la actividad determinada usando el ensayo de polarimetría. Se realizaron varios estudios para confirmar la idoneidad de las condiciones elegidas para la determinación de la actividad de la solución de levadura diluida. La dependencia del tiempo de la rotación óptica de las soluciones estándar (que contienen sacarosa, glucosa y fructosa) se midió después de 30 min, 1.5 y 4 h de incubación. No hubo esencialmente diferencia entre las medidas tomadas después de la incubación de 1.5 y 4 h. A medida que se incrementó la concentración proporcional de glucosa y fructosa en las soluciones estándar, hubo un aumento en el cambio dependiente del tiempo en la rotación óptica que muy probablemente reflejó el tiempo requerido para establecer un equilibrio entre las dos estructuras cíclicas de glucosa, aD- glucosa y bD-glucosa, y la forma de cadena lineal. A pesar de la dependencia temporal de la rotación óptica, las mediciones de rutina se realizaron inmediatamente después de que la reacción se inactivó para reducir el tiempo requerido para el análisis 10. Este método es de gran importancia en el control de la malabsorción congénita de la sacarosa, un trastorno en el cual la deficiencia congénita de la enzima sacarosa – isomaltasa que impide la absorción de sacarosa consumida en la dieta, debido a que se puede realizar periodos controlados de incubación de la enzima en azucares, que permitan elevar los niveles de absorción de sacarosa en el organismo humano.

7. REFERENCIAS 1 MORRINSON; BOYD, química orgánica 5ta ed. Universidad de Nueva York. Pearson education Pp [126-128]. 2. Acuña, A. F.; Química Orgánica; Primera Edición; Editorial EUNED: San José, 2006; pp. 284. 3. Solano, O. E.; Pérez, P. E.; Tomas, A. F.; Prácticas de Laboratorio de Química Orgánica; Primera Edición; Universidad de Murcia: Murcia, 1991; pp 65. 4. Atkins, P. W.; Jones, L.; Principios De Química: Los Caminos Del Descubrimiento; Editorial medica Panamericana: Madrid, 2006; pp. 629. 5. WADE, L. G. quimica organica . 3° ed Madrid 2004, Pearson education. pp.