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• Alejo Topin

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UNIVESIDAD CENTRAL DEL ECUADOR Facultad de Ciencias Químicas Proyecto de Microbiología Industrial

TEMA: Aislamiento Identificación y Preservación de Cepas de bacterias fermentadoras de Embutidos cárnicos tipo Salami

INTEGRANTES:  Cadena Sandra  Guerrero Carol  Pazmiño Estefani  Pinto Alejandro

SEMESTRE: 8vo Alimentos

Tutora: Dra. Blanca Estela Bravo 2010

1. TEMA: Aislamiento Identificación y Preservación de Cepas de bacterias fermentadoras de Embutidos cárnicos tipo Salami 2. OBJETIVOS: 2.1.OBJETIVO GENERAL: El propósito del presente estudio es buscar un método efectivo para aislar, seleccionar y preservar los microorganismos, encargadas de la fermentación de un producto cárnico, tipo salami, a partir de un embutido comercial y del muestreo en el lugar de almacenamiento y maduración de los mismos.

2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS:  Establecer puntos clave de muestreo que permita colectar en su totalidad todos los microorganismos encargados de la fermentación del embutido.  Establecer las características mas propicias para que los microorganismos puedan desarrollarse en laboratorio.  Establecer cuales son los medios mas adecuados para el aislamiento especifico de microorganismos fermentadores de embutidos tipo salami  Seleccionar y dar un medio propicio para el desarrollo solo de los microorganismos de interés.  Buscar el método mas adecuado para la conservación de las cepas puras de microorganismos seleccionados.

3. ANTECEDENTES  Los Microorganismos encargados de la fermentación de Embutidos son varios y depende del producto que se desea obtener.  Se evidencia el aumento de la demanda de estos productos, por los siguientes factores detectados: o El consumo de embutidos, está ligado al aumento de comida rápida y precocida, que antes no eran común. o La preferencia está vinculada al fenómeno migratorio. Los hábitos de consumo se reproducen pese a la distancia. La relación más estrecha del emigrante ecuatoriano que habita en Europa en especial con España, donde la preferencia por los embutidos es alta.a No obstante el emigrante transmite a su familia esa costumbre y cuando retorna la sociabiliza. o Aumento en el consumo de embutidos (Gourmet).  En el Ecuador el mercado de embutidos se encuentra distribuido en más de 300 fábricas, de las cuales el 60% pertenece a la industria formal y el 40% a la producción informal. De éstas, las empresas más grandes son Procesadora Nacional de Alimentos (Pronaca), Embutidos Plumrose y Embutidos Don Diego, Embutidos “La Italiana”. A nivel de embutidos gourmet las empresas de producción más destacadas son: Embutidos

“Federer”, “La Italiana” y “El Salinerito”; además de los productos que se encargan de la venta de productos importados.  Pese que el país tiene empresas que se dedican a la elaboración de estos embutidos, no existe investigaciones publicadas respecto al tema de selección de microorganismos específicos o elaboración de un cultivo iniciador propio, en unos casos las empresas usan cultivos iniciadores comerciales y otro caso la fermentación se realiza sin adición de cultivo iniciador.  Existen artículos científicos en los cuales nos indican que tipo de microorganismos fueron aislados y utilizados para la fermentación de cárnicos (cultivos starter).

4. PROBLEMA La carencia de cultivos iniciadores para cárnicos y embutidos en nuestro mercado, ha impulsado a realizar el asilamiento, identificación y conservación de las cepas apropiadas para el desarrollo de las características deseadas de los productos cárnicos fermentados en específico del salami. Y así como también la reducción o eliminación del uso de aditivos químicos Una de las dificultades encontradas en el proyecto es el de desarrollar un medio completo que cubra las necesidades nutricionales de las bacterias a aislar, ya que si no se logra obtener el medio de cultivo adecuado no se obtendrá cepas de calidad, pudiendo presentarse inconvenientes en el desarrollo de biomasa pura y que estos microorganismos no proporcionen las características deseadas para el producto.

5. JUSTIFICACION La elaboración de productos fermentados mediante la utilización de cepas bacterianas, generan características beneficiosas sea para la salud, así como para el mejoramiento del procesamiento de este tipo de productos en sus características organolépticas duraderas y propiedades por su contribución a la hidrólisis de proteínas y polipéptidos generando péptidos y aminoácidos que influyen en el desarrollo del sabor y del aroma., obteniendo un producto de mayor estabilidad a temperatura ambiente. Uno de los principales aportes que brinda la adicción de este tipo de cultivos en la elaboración del producto se basa en su papel como inhibidor sobre la flora patógena que afecta al embutido. Las cepas que se quieren aislar son Lactobacillus plantarum y Micrococcus Varians que son las encargadas de brindar las características propias del SALAMI. Juntas con las bacterias encontramos hongos y levaduras que complementan la acción de las bacterias en dar al producto sus características de sabor y olor. Marcas Presentes en el Mercado Ecuatoriano. • Plumrose • Don Diego • Fritzz • La Ibérica • Juris • La Española • Pronaca • Supermaxi

6. MARCO TEORICO Embutidos Fermentados: método de elaboración , composición Cepas: características de las cepas, necesidades nutricionales, fermentación

6.1.Características de Crecimiento de los Micrococos Características del Género Micrococos  Cocos 0.5 – 2.5 μm de diámetro  Gram-positivas, catalasa positivas, aerobias (anaerobias facultativas)  Crecen a concentraciones del 5 % de ClNa y la mayoría hasta de 10-15%  Sensibles a la presencia de ácido  Tolerantes a aw más bajas que las BAL  Reducción de nitratos a nitritos  Producción enzima catalasa que destruye peróxidos  Participan en la formación del aroma: actividad lipolítica y proteolítica  Crecen muy poco.

6.2.Características de Crecimiento de los Lactobacilos Parámetros de Selección del Cultivo: El cultivo es seleccionado en función de la temperatura óptima de incubación y la cantidad de ácido lácteo deseado. (1) 

Las bacterias lácticas son organismos extremadamente exigentes en necesidades nutricionales.



Para desarrollarse no solo requieren carbohidratos sino también otro tipo de sustratos como aminoácidos, nucleótidos y vitaminas. Los diferentes nutrientes necesarios se encuentran en los medios de cultivo comunes, estos nutrientes son carbohidratos fermentables, peptonas, extracto de carne, extracto de levadura. Crecen en medios ligeramente ácidos (pH4,5-6,4) La fermentación se para cuando el pH baja a (3,6- 4,0). Son aerotolerantes, crecen mejor en medios completamente anaerobios. La mayoría son mesófilos crecen óptimamente a 40°C Son organismos Homofermentativos.

      

Los Micrococcos son aerobios estrictos y termorresistentes. Durante la maduración desciende su número. Elaboran proteasas y lipasas extracelulares.

6.3.Características de Crecimiento de Mohos 

Los mohos depende de su interacción con las variables fisico-químicas del medio ambiente (oxígeno, temperatura, humedad, actividad de agua, pH...)



La mayoría de los mohos son aeróbios, aunque algunas especies pueden desarrollarse en ambientes con escaso contenido de oxígeno (ej. Penicillium Roqueforti).



La temperatura óptima para su desarrollo va de 20 a 30 ºC. En temperaturas más bajas, su crecimiento se inhibe, aunque no son destruidos por el frío. Algunas cepas de Cladosporium o Penicillium pueden desarrollarse alrededor de 0 ºC, y aún menos (Cladosporium Herbarum desarrolla en carnes a -6 ºC).



La presencia de agua también es un elemento importante para el desarrollo del moho. El agua está presente en dos formas:

 

En la atmósfera, donde la humedad debe estar encima de 70%. Sin embargo algunas especies más exigentes que requieren 90-95% de humedad.



los mohos se adaptan a valores bajos de Aw .

7. MARCO METODOLOGICO 7.1.

Muestreo

El muestreo se realizara según lo que reza el documento de muestreo para alimento de la FAO (1) 7.1.1. Procedimiento de Muestreo Si el alimento se presenta en empaque comercial, seleccionar al azar la o las unidades que conformarán la muestra. Cortar asépticamente una porción de carne o piel de partes diferentes de la carcasa o el corte de carne o remover una porción de carcasa. Poner, por lo menos, 200 g de muestra en una bolsa de plástico o en un frasco de vidrio o plástico de boca ancha. Refrigerar. Con guante plástico estéril, colocar la carcasa del ave o un gran trozo de carne en una bolsa grande estéril de plástico. Añadir 100 a 300 mL de caldo de enriquecimiento. Cerrar la bolsa y agitar, para que el caldo de enriquecimiento bañe la pieza completamente, remueva la muestra y cierre la bolsa. Pasar una esponja o hisopo estéril sobre un área grande de carcasa o corte de carne. Poner el hisopo en un frasco con caldo de enriquecimiento. Humedecer un hisopo con agua destilada bufferada o con agua peptonada al 0.1%. Tomar con el hisopo una parte grande de carcasa o corte de carne. Colocarlo en el caldo de enriquecimiento para el microorganismo buscado. Para muestras que serán sometidas a análisis microbiológico utilizar material estéril tanto para la toma como para contener la muestra. En caso de querer AISLAR microorganismos en gran cantidad, se debe realizar un muestreo por evidencias. 7.1.2. Tratamiento de las muestras Conservación y transporte Las muestras deben manejarse y transportarse de tal manera que se impida su ruptura, alteración o contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa. Es sumamente importante evitar que durante el transporte de las muestras se produzca la multiplicación de los microorganismos presentes y/o la inactivación de algún microorganismo o componente del alimento.

Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C. Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas, salvo cuando el analito así lo determine.

7.2.Medios de Cultivo Utilizados 7.2.1. Caldo de enriquecimiento y Medios De Cultivo Para Su Aislamiento E Identificacion De Lactobacilos Plantarum 

Caldo de Enriquecimiento Tanto el caldo de enriquecimiento como el medio de cultivo de preferencia para el desarrollo de Lactobacilos es el MRS que contiene: Componentes Peptona Extracto de carne Extracto de Levadura Dextrosa Acetato Sódico Fosfato dipotásico Citrato triamónico 1. Sulfato maqnesico Sulfato de Manganeso Sulfato Ferroso Tween 80 pH



g/L 15,0 10,0 5,0 2,0 2,0 1,0 1,0 0,20 0,05 0,01 1,0 ml 6,2

Otro medio de cultivo utilizado para el aislamiento de bacterias lácticas en especial para el Lactobacilos Plantarum es el Medio Plasma de Bovino (BPM),

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO La sangre fresca de bovino fue obtenida de un matadero de la localidad al momento de ser sacrificado el animal y recolectada en envases plásticos a la cual, se le agregó 100 ml/L de sangre de una solución de citrato de sodio al 2% (p/v). Una vez en el laboratorio, se mantuvo la mezcla a 5°C. Se separó el mismo día en plasma y en fracción de glóbulos rojos por centrifugación a 2.500 rpm durante 20 minutos. Al plasma se le determinó el contenido de proteína mediante el método de Biuret. Con el objeto de determinar la cantidad de proteína plasmática conveniente para lograr un buen crecimiento de los microorganismos de prueba, se deben preparar varias soluciones de plasma al 25, 50 Y 75%. Luego a cada dilución se le agregó dextrosa o sacarosa al 1 %. El pH fue ajustado en todos los casos hasta 6.2 con ácido acético Ingredientes Agua destilada Glucosa o sacarosa FeS047H20* Acetato de Sodio Citrato de Amonio KH2P04* K2HP04* MgS047H20*

Cantidad 250 ml/L 750 ml/L 10 g/L 0.02 g/L 6 g/L 1 g/L 3 g/L 3 g/L

MnS047H20* Extracto de levadura Plasma

0.5 g/L 0.05 g/L 5 g/L

* Las cantidades de minerales utilizados fueron de acuerdo a las recomendaciones de Morisha y col. (1981).

7.2.2. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA SU AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MICROCCUS CALDO DE ENRIQUECIMIENTO INFUSION CEREBRO CORAZON El medio de Infusión Cerebro Corazón es una modificación de las formulaciones desarrolladas por Rosenow y Hayden en las que se adicionó infusión de cerebro de ternera y difosfato de sodio. El medio de Infusión Cerebro Corazón está especificado en varios procedimientos estándares para la industria alimenticia y el análisis de aguas. También es recomendado por la NCCLS para preparar el inóculo para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. En este medio la infusión de carne de corazón y de cerebro de ternera así como la peptona proveen la fuente de carbono, nitrógeno sulfuro y vitaminas. La dextrosa actúa como fuente de energía. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio. El fosfato disódico actúa como buffer.

MEDIO DE CULTIVO AGAR MANITOL SALADO: Los Micrococcus crecen bien en este medio. Forman colonias rojas, relativamente grandes, levadas, cupuliformes y opacas, de consistencia cremosa, a las 18-24 horas de incubacion a 35-37 °C, en aerobiosis. No fermentan el manitol. AGAR MANITOL SALADO Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacion de estafilococos, donde tambien desarrolla especies del Genero Micrococus, a partir de muestras clinicas, alimentos, productos cosmeticos y otros materiales de importancia sanitaria. Fórmula (en gramos por litro) del medio base: Extracto de carne 1.0 Pluripeptona 10.0 D-Manitol 10.0 Cloruro de sodio 75.0 Agar 15.0 Rojo de fenol 0.025 PH final: 7.4 ± 0.2

PREPARACION DEL MEDIO: Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar muy bien hasta obtener una suspensión homogenea. Calentar en bano Maria con agitacion frecuente hasta disolver muy bien el polvo. Esterilizar 15 minutos a 121°C. Distribuir en placas. Características del medio: Medio preparado: color rojo Por su versatilidad metabolica algunas especies del Genero Micrococcus tienen la capacidad de utilizar un extenso rango de substratos. Pueden tambien realizar la biodegradacion de muchos otros contaminantes ambientales y de esta manera participar en la conservacion del ecosistema. Son sintetizadores de largas cadenas (C21-C34) de hidrocarbonos alifaticos utilizados para la produccion de aceites lubricantes.

7.2.3. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA SU AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS. Caldo de Enriquecimiento Extracto de malta

La composición del agar extracto de malta consistió en: extracto de malta (30 g/L); peptona de soya (3 g/L) y agar (15 g/L). Se sugiere para el crecimiento de las levaduras, la utilización de caldo extracto de malta acidificado ya que es un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano. Medio de Cultivo Agar papa glucosa Este es un medio especifico para mohos y levaduras, para darle mas selectividad y evitar el crecimiento de microorganismos se adiciona un antimicrobiano (soln. De gentamicina al 1%) Se ralla 250 g de papa con cáscara blanca y se agrega 1 L de agua. Se calienta en autoclave a ½ kg/cm 2 durante 45 minutos. Luego se filtra por gasa, se repone el agua perdida y se agrega 20 g de glucosa o sacarosa y 20 g de agar. Se esterilizan 15 minutos a 120°C (Seifert 2000). Se esteriliza a 120°C durante 15 minutos. Después de enfriar a 60°C se agrega 1 mL de la suspensión de iprodiona al 0,3% p/v. Se incuba a temperatura ambiente durante 7 días bajo la alternancia de luz fluorescente + luz negra (o luz solar indirecta) con obscuridad.

7.2.4. Método de Crio conservación Conservación en Glicerol En cajas petri que contienen medio PDA con micelio de hongo crecido se lavan las esporas con 3,75ml de caldo agar saboraud, se coloca esta suspensión en un frasco que contiene 1,25ml de glicerol estéril (autoclavado). Homogenizar por vortex y alicutar a razón de 1,5ml en microtubos estériles (3 por cepa) rotular los tubos con la identificación correspondiente. Conservar los tubos a – 20ºC en el congelador [1]