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• Jose Antonio Barba Zapata

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Introducción El dengue es un problema creciente para la salud pública en las áreas tropicales del mundo, es en la actualidad la enfermedad viral transmitida por mosquitos más importante que afecta a los seres humanos. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima entre 50-100 millones las nuevas infecciones que se producen anualmente en más de 100 países endémicos El dengue es un problema de salud pública que anualmente afecta a un elevado número de personas en todo el mundo. “El número de pacientes notificados por la enfermedad pasó de 2,2 millones en 2010 a 3,2 millones en 2015” (OMS, 2017). Aunque la carga total de la enfermedad a nivel mundial aun es incierta, el comienzo de las actividades para la prevención en casos de dengue muchas veces no ha sido suficiente porque el aumento del número de casos notificados en los últimos años da una clara y concisa respuesta que el plan estratégico planteado por la OMS para la disminución de la epidemia ha sido en la gran mayoría de los estados miembros de la OMS casi nula. El dengue es una enfermedad infecciosa producida por un arbovirus del género Flavivirus al cual se le reconocen 4 serotipos (I, II, III, IV), trasmitidos mayormente por un mosquito del genero Aedes aegypti (MINSA, 2016). En su forma clínica la enfermedad se manifiesta por fiebre, dolor de cabeza, osteomioarticulosis, y adinamia por lo que estos síntomas nos llevan a la parte de la confirmación del diagnóstico a través de las diferentes pruebas que se realizan en el laboratorio que constituyen la base para el abordaje, control y tratamiento del paciente (PAHO & WHO., 2010). La emergencia o reemergencia del dengue en los diferentes países y en las diversas regiones geográficas dentro de los países, obedecen a la presencia de varios determinantes y una combinación de los mismos, que permiten la presencia del Aedes aegypti (también vector de la fiebre chikungunya) (MINSA, 2016). Entre estas determinantes deben considerarse: el cambio climático, la escasa disponibilidad de agua para consumo, el crecimiento poblacional sostenido, las intensas migraciones de áreas endémicas a áreas no endémicas de dengue persistencia de actividad epidémica en el interior del país y en los países limítrofes, la urbanización no controlada ni planificada, viviendas inapropiadas en centros urbanos, inadecuada disposición de residuos, uso cada vez mayor de envases no biodegradables en el medio así como neumáticos en desuso, el inadecuado saneamiento ambiental, el tránsito urbano, interprovincial y aéreo intenso (OMS, Enfermedades transmitidas por vectores., 2015).

En la región de las Américas el patrón es similar a la situación que se observó en Asia hace 30 años. Según datos de OPS/OMS, los casos de dengue se quintuplicaron en las Américas entre 2003 y 2013. Entre 2009 y 2012 se notificaron anualmente, en promedio, más de un millón de casos, y el 2013 fue uno de los años más epidémicos en la historia del continente, con más de 2,3 millones de casos, 37 705 casos graves y 1289 muertes. Sin embargo, la letalidad por dengue disminuyó de 0,07 a 0,05% en los últimos tres años, una reducción que se atribuye al mejor manejo clínico de los pacientes a partir del 2010 (OPS, 2017) Los primeros reportes de brotes de un síndrome febril compatible con dengue clásico en el país fueron descritos en 1700, 1818, 1850 y 1876, aunque no se tuvo confirmación laboratorial (Alvarez , Ftamani , Figueroa, & Grao, 2011). La reemergencia del dengue en el Perú en el siglo XX está ligado a la reintroducción del Aedes aegypti en 1984 (luego de su eliminación en 1956). En 1990 ocurrió una explosiva epidemia de dengue clásico por DENV-1 en las principales ciudades de nuestra Amazonía y, en la actualidad, casi todas las áreas del país con presencia de Aedes aegypti presentan casos de dengue y la circulación de cuatro serotipos de dengue (MINSA, Resumen de las enfermedades o eventos bajo vigilancia epidemiológicaenel Perú., 2011). Por lo anteriormente expuesto, este trabajo de investigación pretende analizar y validar la sensibilidad de las pruebas utilizadas por el MINSA para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad por lo que es necesario considerar al mismo de vital importancia ya que puede aportar la suficiente información para determinar cuáles son las pruebas más útiles que nos van a proporcionar la información certera y correcta en el diagnóstico de la enfermedad en el paciente para así poder tomar medidas de acción rápidas y así disminuir el riesgo de mortalidad por dicha enfermedad. Con el desarrollo de la investigación se busca concretamente analizar y determinar cuáles son las pruebas más sensibles de las más utilizadas por el ministerio de salud para lograr diagnosticar la enfermedad en los pacientes que muestran la sintomatología pertinente y a través de la exposición de los resultados se tendrá una base para la toma de decisiones en la prevención y erradicación de la enfermedad.

Evaluación y Análisis de la sensibilidad y especificidad de del Kit inmunocromatográfico de Dengue Dx™ para la detección de la proteína NS1 y los anticuerpos IgM e IgG el periodo de Enero a Julio del 2017, en el “Laboratorio Belén” Sullana.

CAPITULO I: Planteamiento de Estudio 1.1. Descripción del problema El dengue es una enfermedad viral, de carácter endemo_ epidémico trasmitida por el género Aedes generalmente por Aedes aegipty que constituye hoy la arbovirosis mas importante a nivel mundial en términos de mortalidad, morbilidad e impacto económico (Herrera Caquimbo , Buitrago Castillo, Rendon Ocampo, & Cipamocha Lucero, 2014). En las últimas décadas ha aumentado enormemente la incidencia de dengue en el mundo, puesto que se ha convertido en una epidemia mundial en los últimos años, según una estimación reciente, se producen 390 millones de infecciones por dengue cada año, de los cuales 96 millones se manifiestan clínicamente (OMS, 2017). Es por ello que el MINSA viene trabajando constantemente en la sensibilización y prevención de la enfermedad; es por ello que es importante mencionar dentro de esta fase, el diagnóstico eficiente y preciso de dengue para la atención primaria (es decir, la detección precoz de casos graves, confirmación de casos, y el diagnóstico diferencial con otras enfermedades infecciosas), las actividades de vigilancia, el control de brotes y la patogénesis es por ello que teniendo en cuenta que es importante analizar la sensibilidad de las distintas pruebas utilizadas en los laboratorios de análisis clínicos para realizar tal proceso se ha creído conveniente plantear la siguiente interrogante:

1.2. Definición del problema ¿Son de vital importancia y de utilidad clínica, analizar la sensibilidad y especificidad de las pruebas rápidas de Dengue Dx™ en pacientes con manifestaciones clínicas de la enfermedad en la posta “Comunidad Saludable” del AAHH Sánchez Cerro, Sullana?

1.3. Formulación de objetivos 1.3.1.

Objetivos generales Analizar la sensibilidad y especificidad de las en pacientes con manifestaciones clínicas de la enfermedad, en la posta “Comunidad Saludable” del AAHH Sánchez Cerro, Sullana.

1.3.2.

Objetivos específicos Determinar la sensibilidad y especificidad de la prueba del antígeno de la proteína no estructural (NS1) para el diagnóstico de dengue en pacientes

con manifestaciones clínicas de la enfermedad, en la posta “Comunidad Saludable” del AAHH Sánchez Cerro, Sullana. Evaluar la importancia que tiene en la parte clínica la sensibilidad y especificidad el examen de detección de IgM para el diagnóstico de dengue en pacientes con manifestaciones clínicas de la enfermedad, en la posta “Comunidad Saludable” del AAHH Sánchez Cerro, Sullana. Identificar cual es la importancia clínica de la sensibilidad y especificidad en la detección de IgG para el diagnóstico de dengue en pacientes con manifestaciones clínicas de la enfermedad, en la posta “Comunidad Saludable” del AAHH Sánchez Cerro, Sullana

1.4. Justificación e importancia de estudio Muchas de las enfermedades producidas por vectores se han vuelto epidemias en la mayoría de los paises con climas tropicales y en vías de desarrollo. Estas epidemias son consecuencia de las condiciones climáticas, deterioros en los programas de vectores, la carencia de insecticidas con buena relación al costo y efectividad y la falta de educación sanitaria por parte de la población (OPS, 2017). El dengue es una de las epidemias que está causando una tasa de mortalidad alta a nivel mundial; siendo esta epidemia un problema de salud pública que ha implicado en nuestro país la elaboración de un minucioso plan de contingencia en donde se ve implicado la prevención, el diagnóstico, el control del vector y la enfermedad y la atención post infección del virus; se ha creído conveniente analizar y tener en cuenta una de las fases importantes y significativas de este plan de contingencia que es la etapa de descarte y diagnóstico de la enfermedad. Por lo citado anteriormente es importante desarrollar este proyecto con la finalidad de realizar un análisis para determinar qué importancia y utilidad clínica tienen las pruebas serológica en el diagnóstico y descarte del dengue, esto con el fin de llevar un estricto control sistemático y estadístico de la enfermedad y para emitir datos certeros que ayuden a realizar un correcto examen clínico y diagnostico concreto de la enfermedad y contrarrestar en gran medida la transmisión de la epidemia. El proyecto de investigación contribuirá además a tomar medidas de acción frente a la propagación de la enfermedad ya que se busca de alguna manera crear un sistema de ideas que ayuden a las organizaciones nacionales como el MINSA a ejecutar un correcto plan de contingencia frente a la propagación de la epidemia. Además el proyecto de investigación busca ser un sector básico de información para aquellos que desarrollan la rama del laboratorio clínico porqué busca de alguna manera unificar y sistematizar información sobre la sensibilidad, especificidad y utilidad clínica que tienen las pruebas rápidas de Dengue Dx™ durante toda la etapa

de identificación y diagnóstico de la patología y además busca orientar que pruebas pueden ser aplicables y en qué momento pueden ser aplicables durante todo el desarrollo y proceso de la enfermedad.

CAPITULO II: Marco Teórico o Referencial. 2.1. Marco histórico 2.1.1. Autor Arias Puente, Julia del Carmen. 2.1.1.1. Título de la tesis ANÁLISIS DE LA RESPUESTA INMUNITARIA INFLAMATORIA EN LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DEL DENGUE Y SU IMPORTANCIA CLÍNICA. 2.1.1.2. Objetivo Evaluar el patrón de citoquinas proinflamatorias, antiinflamatorias y el marcador de apoptosis TRAIL en pacientes con dengue y su importancia clínica, con énfasis en estadios de desarrollo, gravedad, serotipo viral y tipo de infección. Examinar el efecto de DENV sobre la producción de citoquinas en PBMC cultivadas y apoptosis en monocitos de pacientes con dengue e infectados en diferentes días con el virus del dengue. 2.1.1.3. Conclusiones La infección por el virus Dengue produce un aumento significativo de las siguientes citoquinas pro-inflamatorias IL-6, TNFα, IL-12 e IL-17, pero no de IL-1β que se objetivan en la fase aguda con posterior normalización hasta la FRT. La intensidad del cuadro clínico se asocia a un diferente patrón de elevación de las mencionadas citoquinas. La infección por DENV produce un aumento significativo de las moléculas anti-inflamatorias (sTNF-RI, sTNF-RII y IL1RLI/sST2) y al estratificar a los pacientes por cuadro clínico solo se observaron en las formas más graves (DCSA y DG) y no se alteraron en la infección por los serotipos DENV-1 y DENV-3. Los monocitos de pacientes infectados con DENV muestran ex vivo un incremento de la producción de las citoquinas, TNFα, IL-1β e IL-12, pero no IL- 6, así como de su apoptosis y la infección in vitro por los cuatro serotipos de virus aislados de los pacientes induce muerte celular programada en monocitos sanos.

2.1.2.

Autor

Robles Lombana, Diana Faneyra. 2.1.2.1. Título de la tesis ANÁLISIS ESPACIAL DEL ESTUDIO DE LOS CASOS DE DENGUE EN LA GUAJIRA 2013.

2.1.2.2. Objetivos Desarrollar una metodología de análisis espacial para identificar la ubicación de casos y características de las zonas con mayor prevalencia de dengue en La Guajira. Identificar las variables relevantes que determinan los casos de dengue en La Guajira. Establecer y caracterizar las zonas con mayor prevalencia de dengue Evaluar la Bondad del Ajuste de los modelos propuestos en el conocimiento de los casos de dengue. 2.1.2.3. Conclusiones La distribución del agrupamiento de riesgo por dengue, presenta una tendencia desfavorable al occidente del departamento más exactamente en los centros urbanos. Por consiguiente se estableció que los sitios donde se presenta los focos de la Infección es: Riohacha, Dibulla, Manaure, Maicao y Uribia, pues allí se deben tomar medidas que permitan mitigar y prevenir dicha afección, debido a que el dengue es de fácil transmisión (se necesita el vector, el virus y personas susceptibles), la hipótesis que se presume es que esa región es muy favorable para los factores micro y macro determinantes de la transmisión. Los casos de dengue y dengue grave en La Guajira tienen una tendencia de distribución en sitios urbanos, identificada como agrupación o clúster significativo, donde sus áreas de máxima agrupación (según el indicador de Análisis por múltiples factores), coinciden con las superficies de las áreas de muy alto riesgo del total de casos. La distribución del agrupamiento de riesgo por dengue, presenta una tendencia desfavorable al occidente del departamento. La forma y extensión del riesgo de dengue, pueden tener relación con elementos socio-económicos, distribución de la densidad de población entre otros elementos, que confluyen en aquellas áreas para dar la forma actual de la mancha y que serán parte de la continuación del estudio.

2.1.3.

Autor:

Herrera Caquimbo, Claudia Lorena; Buitrago Castillo, José Eder; Rendón Ocampo, Mabel Cristina; Cipamocha Lucero, Leydi Susana. 2.1.3.1. Título de la tesis CONOCIMIENTOS Y PRÁCTICAS DE PREVENCIÓN DEL DENGUE EN LA COMUNA 1 DE NEIVA Y MUNICIPIO DE ACACIAS META Y DE QUÉ MANERA SE PUEDE EVITAR O ERRADICAR ESTA ENFERMEDAD.

2.1.3.2. Objetivos Identificar el nivel de conocimientos y las prácticas de prevención acerca del dengue, que tienen las personas de la comuna 1 de Neiva y del Municipio de Acacias Meta con el fin de establecer estrategias para evitar o erradicar esta enfermedad. 2.1.3.3. Conclusiones A pesar de las campañas que hacen en los municipios todavía falta más compromiso de la comunidad y del sistema de salud, porque solo hacen las campañas por tiempos y no son constantes y a las personas se les va olvidando y se descuida todo el programa de prevención. Con este mosquito la promoción y prevención debe ser de educación continua si queremos que algún día lo erradiquemos. Un factor clave para lograr un mayor impacto en las acciones que se implementen es impulsar la mejora continua en los procesos de prevención y control del dengue con integración interinstitucional: además de intensificar las acciones de promoción y protección de la salud con corresponsabilidad del gobierno tanto nacional como local y la ciudadanía en general, en materia de autocuidado de la salud y el fomento de entornos saludables. Realizar programas de educación, formación e información y con estrategias de concientización de la comunidad para evitar el aumento de los criaderos de zancudos y la trasmisión de la enfermedad.

2.1.4.

Autor: García Luna, Selene Marysol.

2.1.4.1. Título de la tesis IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LAS VARIANTES GENÉTICAS DEL VIRUS DEL DENGUE Y SU ASOCIACIÓN EN LA DINÁMICA DE SU TRANSMISIÓN. 2.1.4.2. Objetivos Identificar y analizar las variantes genéticas de los virus del dengue circulantes, así como su asociación en la dinámica de la transmisión de estos en el estado de Nuevo León, México. Aislar e identificar las variantes genéticas de los virus del dengue circulantes en Nuevo León en el período de Junio del 2010 a Mayo del 2011. Determinar la memoria inmunológica existente en habitantes del estado de Nuevo León, México contra el virus del dengue en periodos epidémicos e interepidémicos. Analizar las variantes genéticas del virus del dengue aisladas y su asociación con la dinámica de la transmisión en las áreas estudiadas. 2.1.4.3. Conclusiones El análisis filogenético realizado en este estudio fue determinante para conocer la variabilidad genética y el impacto epidemiológico de los virus circulantes en Nuevo León en el brote que se presentó en 2010. En consecuencia, los programas epidemiológicos deben incluir no solo diagnóstico viral, sino también vigilancia genotípica viral. Además se identificó un 3% de prevalencia de infecciones asintomáticas de DENV por medio de vigilancia serológica en un grupo de 943 sujetos sanos habitantes de Nuevo León. Destacando que de estas el 1.2% correspondió a infecciones primarias activas (IgM anti-DENV) y el 1.8% a infecciones secundarias activas (IgG anti-DENV).

2.1.5.

Autor(es)

Ognio Suarez, Luis; Arrasco, Juan; Casapia, Martin; Sihuincha, Moisés; Ávila, Jeannette; Soto, Gabriela; Álvarez, Carlos; Rodríguez, Hugo. 2.1.5.1. Título de la Tesis FACTORES ASOCIADOS A DENGUE GRAVE DURANTE LA EPIDEMIA DE DENGUE EN LA CIUDAD DE IQUITOS, 2010_2011. 2.1.5.2. Objetivos Identificar los factores de riesgo para dengue grave en la epidemia de Iquitos, 2010_2011. 2.1.5.3. Conclusiones El antecedente de Dengue, la edad menor de 15 años y no retornar al establecimiento de salud para recibir atención médica constituyeron factores de riesgo para dengue grave.

2.2. Bases teóricas 2.2.1. Dengue El dengue (DEN) es una enfermedad viral, de carácter endemo-epidémico, transmitida por la picadura de mosquitos hembras del género Aedes, principalmente Aedes aegypti. Actualmente es la arbovirosis de mayor relevancia a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y afectación económica (Balta, 1997).

2.2.2.

Agente etiológico

El virus del dengue es un arbovirus («arbo» acrónimo del inglés arthropod-borne, transportado por artrópodos) y pertenece al género de Flavivirus familia Flaviviridae un grupo de más de 68 agentes virales agrupados por su relación serológica y por la determinación de secuencias genómicas; al menos 30 de estos virus causan enfermedad en los humanos (INS, Dengue en el Perú: Aportes para su diagnóstico y control, 2005). La familia Flaviviridae agrupa virus ARN de cadena simple en sentido positivo que se multiplican en células de vertebrados y de insectos vectores. Esta familia está representada por tres géneros: Flavivirus (lt flavus, amarillo), Pestivirus (lt pestis, peste, plaga) y virus hepatitis C (gr hepato, hígado; también conocidos como hepatacivirus) (Rice, 1996). El género Flavivirus reúne en su mayoría (55%) a virus asociados con enfermedades humanas y algunos patógenos de animales domésticos o de interés económico. Además, consta de más de 70 virus clasificados en diez grupos (o especies), entre ellos el virus dengue 20 (INS, Dengue en el Perú: Aportes para su diagnóstico y control, 2005). El virus dengue (DENV), está constituido por ARN genómico de sentido positivo, con una cadena sencilla de aproximadamente 10,7 kb de longitud, rodeado por una

nucleocápside de simetría icosahédrica, de 30 nm de diámetro, la cual está constituida por una proteína C (cápside) de 11 kd. Esta estructura se encuentra rodeada por una bicapa lipídica de 10 nm de grosor; en la que se encuentran insertadas las proteínas estructurales E que conforma la envoltura y M que forma la membrana del virus, dando lugar a proyecciones que sobresalen de la superficie de los viriones. El virión completo mide alrededor de 50 nm de diámetro, y tiene forma esférica. El ARN de las partículas virales maduras codifica para una poliproteína, que es posteriormente procesada por enzimas tanto del virus como del hospedador, dando lugar a tres proteínas estructurales (prM/M, E y C) y siete no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016)

Imagen 1: Esquema del genoma del virus del dengue Fuente: (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016).

Posee cuatro serotipos antigénicamente relacionados (DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4) los cuales exhiben secuencias de aminoácidos idénticas en aproximadamente 70%. Pertenece a la familia Flaviviridae, del género Flavivirus (del latín flavus, amarillo), recibe este nombre por tener como miembro característico de la familia al virus de la fiebre amarilla; incluye un grupo de más de 68 agentes virales transmitidos por artrópodos y de los cuales por lo menos 55% están asociados con alguna enfermedad en el hombre (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016).

2.2.3.

Infección con el virus dengue

La interacción del DENV con la célula blanco, ocurre por endocitosis mediada por receptores. Utiliza múltiples proteínas transmembranales de la célula del huésped, las cuales tienen alta afinidad por la glicoproteína E del virus (OMS, 2017).

Estudios in vitro han demostrado que el DENV puede infectar una variedad de células de diferente origen. No obstante, in vivo, son pocos los tipos celulares que se han identificado como permisibles a la infección (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016). Para que se lleve a cabo la infección se necesita de una o algunas moléculas que funcionen como receptores para el virus, entre éstas se ha reportado el sulfato de heparán (HS) presente en la superficie celular de diversas células el cual se une con gran afinidad a la glicoproteína E (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016). Según (Guzman & Vasquez, 2002), otra vía para la internalización del DENV a la célula implica el receptor gamma IIa y IIb (FcγIIa, FcγIIb) para la fracción cristalizable (Fc) de las inmunoglobulinas. Se ha sugerido que los anticuerpos noneutralizantes de la clase IgG, producidos durante una infección primaria, facilitan la entrada de un serotipo diferente a la célula, por la formación de complejos IgGvirus y su interacción con los receptores Fcγ; la propuesta de esta ruta de infección incluye a los monocitos/macrófagos y a las células dendríticas como principales blanco celulares y por su capacidad para captar complejos inmunes.

Imagen 2: Fisiopatología del Dengue. Fuente: (Balta, 1997)

2.2.4.

Ciclo evolutivo del virus dengue

Una vez que el DENV ingresa a la célula blanco por unión de la glicoproteína Ereceptor celular, inicialmente la partícula viral queda dentro de una vesícula endosómica que conduce al desnudamiento, la envoltura viral se fusiona con la membrana vesicular liberando la nucleocápside y el material genético al citoplasma (Russi & Chiparelli, 2007).

La molécula de ARN viral es transcrito en el retículo endoplásmico rugoso a una poliproteína, que es procesada por proteasas virales y celulares para producir simultáneamente todas las proteínas virales: las tres estructurales (C, prM, y E) y siete proteínas no estructurales (NS). La ARN polimerasa ARN dependiente viral (NS5), asociada a otras proteínas NS, replica el ARN genómico produciendo una molécula complementaria de ARN de polaridad negativa, la que a su vez actúa como templado para la síntesis de nuevas cadenas de ARN de polaridad positiva (Russi & Chiparelli, 2007). Las réplicas de genoma viral son encapsuladas por la proteína C y luego, la nucleocápside adquiere su envoltura a partir de la membrana del retículo endoplásmico hacia el espacio luminal. A partir de allí, las partículas virales son transportadas por el sistema secretorio hacia la superficie en tanto que las glicoproteínas virales adquieren su forma madura por procesamiento de los residuos hidrocarbonados en el sistema de golgi y, finalmente, los viriones son liberadas al medio extracelular por fusión de la vesícula de transporte con la membrana plasmática (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016).

Imagen 3: Ciclo evolutivo del Dengue. Fuente: (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016)

2.2.5.

El vector

El dengue es trasmitido a través de la picadura de mosquitos hematófagos infectados, principalmente el A. aegypti; el cual tiene su origen en regiones etiópicas y desde esas áreas se dispersó convirtiéndose en un mosquito cosmopolita (OMS, Enfermedades transmitidas por vectores., 2015).

Su presencia fue detectada en la mayor parte de zonas tropicales y subtropicales, comprendidas entre 45º de latitud norte y 35º de latitud sur, en las zonas isotermales intermedias a los 20ºC; esta especie ha sido diseminada por el hombre en todo el mundo, sus hábitos son altamente antropófilos y domésticos, tal es así que ponen sus huevos preferiblemente en aguas limpias y estancadas, ya sea en depósitos naturales o artificiales (MINSA, 2016). Otros vectores implicados en la trasmisión del Dengue es el Aedes albopictus, presente en América, tiene el mantenimiento del dengue en Asia y más recientemente en Sur América; Aedes polynesiensis y varias especies del grupo Aedes scutellaris; cada especie con una ecología, conducta y distribución geográfica particular. Recientemente, se ha reportado la existencia de transmisión vertical y por vía transfusional siendo estas infrecuentes, poco documentadas y muy raras (OPS, 2017).

Imagen 4: Vector del Dengue. Fuente: (MINSA, 2016)

Imagen 5: Distribución del Aedes aegypti según año de detección de su ingreso en el Perú. Fuente: (INS, 2010)

2.2.6.

Ciclo biológico del vector

Los mosquitos hembra pueden ovopositar de 100 - 200 huevos por postura, pudiendo resistir las sequías hasta por un año. El huevo mide aproximadamente 1 mm, es ovalado, blanco y luego se torna a negro al desarrollar el embrión. Es depositado individualmente en diferentes recipientes por encima del nivel del agua. El ciclo desde la postura a la eclosión en condiciones óptimas de humedad y temperatura dura 48 horas, pero puede prolongarse hasta 5 días. Entre 7 y 10 días los huevos se convierten en larvas. La larva tiene tres fases: acuática, de alimentación y de crecimiento. El mosquito se divide en cabeza, tórax y nueve segmentos abdominales; el segmento posterior y anal tienen cuatro branquias lobuladas; un sifón respiratorio corto por el cual respira y se mantiene en la superficie casi vertical. Poseen cuatro espinas torácicas, dos a cada lado. El octavo segmento con una hilera de siete a doce dientes formando el peine y sifón con el pecten. Tiene un movimiento serpenteante y presentan gran fotofobia. La fase completa demora entre ocho y doce días. Posteriormente, se forma la pupa, en esta fase no se alimenta y su función es la metamorfosis de larva a adulto. Se mueve rápidamente ante un estímulo y cuando están inactivas flotan en la superficie. Presentan una trompeta respiratoria corta y con un solo pelo en el borde de la paleta natatoria, en la base del abdomen tiene un par de aletas que le sirven para nadar. Este estadío dura de dos a tres días, para dar paso a la formación del mosquito adulto, el cual representa la fase reproductora del A. aegypti. Las hembras se distinguen de los anofelinos por tener palpos más cortos y por adoptar una posición

horizontal durante el reposo. Se caracteriza por tener un abdomen agudo, de color negro con manchas blancas y plateadas en diferentes partes del cuerpo. En el tórax (mesonoto) tiene un dibujo característico con franjas claras a manera de "lira” (Balta, 1997).

Imagen 6: Características morfológicas del Aedes aegypti. Fuente: (Balta, 1997)

2.2.7.

Ciclos de transmisión de virus

Según (OPS, 2017), la transmisión del Dengue se produce en ciclos, el enzoótico (endémico) y el epizoótico (epidémico). En el ciclo enzoótico participan mosquitos selváticos como Aedes furcifer y Aedes luteocephalus y primates inferiores no humanos, demostrado en los bosques tropicales de Asia y África. El ciclo epidémico/urbano es el de mayor importancia desde el punto de vista de salud pública, el cual involucra al hombre y al mosquito vector. En América, el Dengue persiste en la naturaleza mediante un ciclo de transmisión hombre – A. aegypti - hombre. El mosquito se infecta al picar a una persona infectada en periodo de viremia (fase febril), el virus se disemina sistemáticamente durante 8 a 12 días (incubación extrínseca), permaneciendo infectado de por vida. Luego de este periodo el mosquito puede transmitir el agente viral a un hombre susceptible durante su alimentación, produciendo un amplio espectro clínico que varía desde individuos asintomáticos o sub clínicos hasta una infección severa, con sangrados y choque (OMS, Enfermedades transmitidas por vectores., 2015).

Imagen 7: Paises de mayor incidencia con el vector del dengue. Fuente: (OMS, Enfermedades transmitidas por vectores., 2015).

2.2.8.

Manifestaciones clínicas del dengue

El dengue tiene un amplio espectro de presentaciones clínicas, a menudo evoluciona con resultados impredecibles. Aunque la mayoría de los pacientes se recupera después de un curso clínico benigno y resolución espontánea, una pequeña proporción progresa a enfermedad grave, caracterizada principalmente por aumento de la permeabilidad vascular, con hemorragia o sin ella (MINSA, 2016). Los cambios actualmente observados en la epidemiología del dengue, conducen a problemas en la utilización de los actuales criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS), para realizar la clasificación de los pacientes (OMS, Nota descriptiva del dengue, 2017). La infección por Dengue es una enfermedad a la que se le reconoce que varía desde una forma asintomática a una sintomática, ésta se inicia con un estadío febril agudo inespecífico (fiebre indiferenciada), la cual clínicamente es indistinguible de otras infecciones virales, la Fiebre por dengue (FD) y la Fiebre Hemorrágica por Dengue (FHD). Para considerar que el paciente es un caso de FD debe presentar fiebre y dos síntomas de los siguientes: cefalea, dolor retro-ocular, dolores

osteomioarticulares, exantema, leucopenia y algún sangrado (OPS, 2017). La FHD requiere la presencia de los cuatro criterios siguientes: a. Fiebre o historia de fiebre aguda. b. Algún sangrado espontáneo: petequias, prueba del Torniquete (PT) positiva, sangrado de mucosas o hematemesis, trombocitopenia menor o igual de 100.000 células por mm cúbico, y extravasación de plasma, evidenciada por elevación del 20% del hematocrito, o por la disminución del 20% del hematocrito después de la etapa crítica, o por la demostración de derrame pleural, ascitis o derrame pericardio mediante estudios de imágenes. Además, la FHD se clasificó en cuatro grados según su gravedad, grado I donde la fiebre podría estar acompañada de síntomas generales no específicos y una PT positiva como única manifestación hemorrágica; grado II caracterizado por las mismas manifestaciones del grado I más hemorragia espontánea de cualquier localización; grado III con insuficiencia circulatoria que se manifiesta por pulso rápido y débil, tensión diferencial disminuida (20 mmHg o menos) o hipotensión con piel fría y húmeda, y agitación; y grado IV choque profundo con presión arterial y pulso imperceptible en donde los grados III y IV corresponden al Síndrome de choque por dengue (OPS, 2017). En los últimos años se han publicado diversos artículos (Balmaseda, 2012), que cuestionan la utilidad de esta clasificación, por considerarla rígida, demasiado dependiente de resultados de laboratorio y no inclusiva de enfermos de dengue con otras formas de gravedad, tales como la afectación particular del SNC (encefalitis), del corazón (miocarditis) o del hígado (hepatitis grave). Tampoco era útil para el manejo clínico de los enfermos. Por tal razón, el Programa de Adiestramiento e Investigación en Enfermedades Transmisibles de la Organización Mundial de la Salud (TDR/OMS) auspició un estudio internacional, llamado Dengue Control (DENCO), uno de sus componentes es de clínica y su objetivo principal era obtener información de un número elevado de enfermos con dengue confirmado, y encontrar una mejor forma de clasificarlos, así como identificar cuáles serían los signos de alarma útiles para mejorar el protocolo de manejo de casos de dengue (Martinez, 2008). La OMS realizó dicho estudio clínico prospectivo en regiones endémicas determinando evidencias acerca de los criterios para la clasificación de dengue dentro de niveles de severidad. Se obtuvo información clínica de casi 2.000 enfermos con dengue confirmado, procedentes de siete países de dos continentes. El estudio concluyó que del 18 a 40% de los casos no podían ser clasificados mediante la clasificación actual y más de 15% de casos con choque tampoco podían

ser clasificados como casos graves de dengue, porque no cumplían con alguno de los criterios para ser considerado FHD/SCD. Los resultados del estudio confirmaron que, mediante el uso de un conjunto de datos clínicos, parámetros de laboratorio, o ambos, se puede observar una clara diferencia entre pacientes con dengue grave (DG) y dengue no grave. Sin embargo, por razones prácticas fue conveniente dividir el gran grupo de pacientes con dengue no-grave en dos subgrupos: pacientes con signos de alarma y aquellos sin éstos; teniendo muy en cuenta que los pacientes con dengue sin signos de alarma pueden desarrollar DG (OMS, Dengue y Dengue grave, 2009).

Imagen 8: Factores que contribuyen a la proliferación del vector trasmisor del dengue. Fuente: (INS, 2010)

Imagen 9: Criterios de clasificación del Dengue. Fuente: (OMS, Dengue y Dengue grave, 2009)

2.2.9.

Fases evolutivas del dengue

El dengue es una enfermedad de amplio espectro clínico desde cuadros inaparentes hasta cuadros graves, que pueden evolucionar a la muerte, es vista como una enfermedad que puede evolucionar de múltiples formas (OMS, Nota descriptiva del dengue, 2017). Después del periodo de incubación, la enfermedad comienza abruptamente y es seguida por tres fases: febril, crítica y la de recuperación. La fase febril dura generalmente de 2 a 7 días, los pacientes desarrollan fiebre alta repentina, acompañada o no con exantema, malestar general, mialgias, artralgias, dolor de cabeza, de garganta, retro-orbital, anorexia, náuseas y vómitos (Martinez, 2008). En esta fase temprana, es difícil la diferenciación de dengue con otras enfermedades; se destacan influenza y otros virus respiratorios, enfermedades febriles exantemáticas de la infancia, leptospirosis, fiebre amarilla, fiebre tifoidea,

hepatitis, las púrpuras secundarias a bacteriemias, así como otras fiebres hemorrágicas virales (MINSA, 2016). Además, son indistinguibles entre casos de dengue grave del no grave; por lo tanto el seguimiento de los signos de alarma y de los parámetros de laboratorio son cruciales para el reconocimiento de la progresión a la fase crítica. En algunos casos se presentan hemorragias leves como petequias, epistaxis y gingivorragia. El hígado puede aumentar de tamaño (OMS, Dengue y Dengue grave, 2009). Una prueba de torniquete positiva y el inicio al tercer día de una disminución progresiva de la cuenta de leucocitos totales aumenta la probabilidad de dengue (Who, 2009). La fase crítica se inicia entre el 3er al 7mo día de evolución de la enfermedad; es el periodo donde la fiebre se presenta en menor proporción, es decir, temperaturas de 37,5–38ºC o menores, puede ocurrir un aumento de la permeabilidad vascular en paralelo con incremento del hematocrito en un 20% o más. El tiempo clínicamente significativo de la extravasación plasmática por lo general es de 24 a 48 horas, puede detectarse derrame pleural y ascitis dependiendo del grado de escape y de volumen de rehidratación. Algunos pacientes evolucionan a la forma más grave; precedido por signos de alarma; entre ellos dolor espontáneo o durante la palpación del abdomen, vómitos persistentes, acumulación clínica de fluidos, sangrado de mucosas, letargia, irritabilidad, hepatomegalia >2cm y aumento de hematocrito asociado a una rápida caída de plaquetas (Who, 2009). Puede desarrollarse un grave deterioro orgánico como hepatitis, encefalitis o miocarditis y/o hemorragias severas sin extravasación plasmática evidente o choque (Martinez, 2008). El dengue grave se caracteriza por la extravasación plasmática que lleva al SCD, y/o acumulación de líquido, con o sin dificultad respiratoria y/o daño severo de órganos (hígado, SNC, corazón, entre otros) y/o hemorragias graves. Por lo general, se desencadena en los días de defervescencia (fase crítica) entre el 4to o 5to día de evolución de la enfermedad, precedido por los signos de alarma (Martinez, 2008). Durante la etapa inicial del choque, los mecanismos compensatorios que mantienen normal la presión sanguínea sistólica, también producen taquicardia y vasoconstricción periférica con reducción de perfusión cutánea. La presión diastólica aumenta hacia la sistólica con pulso débil y rápido. Finalmente, existe una descompensación y ambas presiones desaparecen abruptamente. La hipotensión prolongada y la hipoxia pueden conducir a la falla de órganos y un curso clínico extremadamente difícil (OMS, Dengue y Dengue grave, 2009).

Los pacientes son considerados que presentan choque si la presión de pulso (es decir la diferencia entre sistólica y diastólica) es de ≤ 20 mm Hg en niños o si la persona presenta signos de mala perfusión capilar (extremidades frías, llenado capilar lento o pulso rápido). En los adultos, la hipotensión de ≤ 20 mm Hg puede indicar un choque más grave, dado que está asociada con choque prolongado el cual a menudo es complicado con hemorragias mayores (Who, 2009).

Imagen 10: Fases evolutivas del Dengue. Fuente: (Martinez, 2008) Los pacientes con DG presentan alteraciones de la coagulación, pero éstas no suelen ser suficientes para causar hemorragias mayores y están asociadas a choque profundo ya que, en combinación con trombocitopenia, hipoxia y acidosis, pueden conducir a la falla orgánica múltiple y a la coagulación intravascular diseminada avanzada (CID) (OMS, Nota descriptiva del dengue, 2017). Cada vez con mayor frecuencia se describen las llamadas manifestaciones inusuales, de las cuales la insuficiencia hepática aguda, miocardiopatías y trastornos neurológicos (encefalitis y encefalopatía) son las observadas con mayor frecuencia. La hipotensión, edema cerebral, hemorragias focales y la insuficiencia hepática fulminante pueden ser causa de la encefalopatía (OPS, 2017). Después de la etapa crítica, el enfermo pasa un tiempo variable en la etapa de recuperación, durante este período el paciente debe eliminar fisiológicamente el exceso de líquidos que se había extravasado hasta normalizar todas sus funciones vitales; en el niño y el adulto sano esta diuresis aumentada es bien tolerada, pero hay que vigilar especialmente a cardiópatas, nefrópatas o personas ancianas. Debe vigilarse también una posible coinfección bacteriana, casi siempre

pulmonar, así como la aparición del llamado exantema tardío (10 días y después) (MINSA, 2016). Algunos pacientes adultos se mantienen muchos días con astenia y algunos refieren bradicardia. El hematocrito comienza a estabilizarse y continúa el aumento de leucocitos y de plaquetas (Who, 2009).

2.2.10. Diagnóstico de laboratorio de la infección por virus dengue El diagnóstico de laboratorio, eficiente y preciso es de fundamental importancia para la atención clínica, contribuye, a la detección temprana de casos graves, la confirmación de casos y el diagnóstico diferencial con otras enfermedades infecciosas, actividades de vigilancia, control de brotes, patogénesis, investigación académica, desarrollo de vacunas y pruebas clínicas. El diagnóstico eficiente y preciso de dengue es de gran importancia para la atención primaria (es decir, la detección precoz de casos graves, confirmación de casos, y el diagnóstico diferencial con otras enfermedades infecciosas), las actividades de vigilancia, el control de brotes, la patogénesis, la investigación académica, el desarrollo de vacunas y ensayos clínicos (Martinez, 2008). Los métodos de diagnóstico para dengue están clasificados en diagnóstico virológico o directo y diagnóstico serológico o indirecto (Cabezas, Fiestas, Garcia Mendoza, Mamani, & Dinames, 2015). Los directos incluyen el aislamiento del Dengue, la detección del genoma viral y la detección de antígenos virales. En los indirectos se determinan las inmunoglobulinas específicas del virus IgM e IgG (Who, 2009). La infección por dengue puede ser diagnosticada directamente detectando la presencia del virus, mediante el aislamiento en cultivo celular, detectando el ARN mediante técnicas moleculares o detectando el antígeno de la glicoproteína no estructural 1 (NS1); de manera indirecta demostrando la presencia de anticuerpos, a través de pruebas inmunoenzimáticas (ELISA) o Inhibición de la hemaglutinación (IHA) o neutralización en placas (PRNT) y microneutralización (INS, 2010).

Las pruebas de diagnóstico deben aplicarse según el tiempo de enfermedad, así el aislamiento viral, la detección de RNA por PCR y la detección de antígenos pueden hacerse en los primeros cinco días, y a partir del quinto día en promedio el uso de pruebas para la detección de anticuerpos IgM. En infección secundaria los

anticuerpos IgG aparecen junto a los anticuerpos IgM y persisten indefinidamente (MINSA, Resumen de las enfermedades o eventos bajo vigilancia epidemiológicaenel Perú., 2011). En el Perú, se ha desarrollado una prueba ELISA de captura que detecta anticuerpos IgM (MAC ELISA) como kit de diagnóstico (TARIKI-DENGUE), que presenta una sensibilidad de 96% y una especificidad del 98%, es una prueba que nos ayuda en el diagnóstico y la vigilancia de dengue y se tiene distribuida a la red de laboratorios del país (47). La prueba fue desarrollada en el Laboratorio de Referencia Nacional de Metaxénicas Virales del Instituto Nacional de Salud y es producido por el Centro de Producción de Biológicos del mismo INS (INS, 2010). Finalmente, se cuenta con pruebas rápidas comerciales que detectan el antígeno NS1 y anticuerpos IgM e IgG. Si bien en trabajos de laboratorio estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad, en condiciones de campo la sensibilidad puede no sobrepasar el 60%, por lo que debemos considerar también en contexto en el que se utilizan (Guzman & Vasquez, 2002).

Imagen 11: Componentes del Kit Tariki-Dengue para la determinación de anticuerpos IgM. Fuente: (INS, 2010)

2.2.10.1.

Diagnóstico virológico

El método seleccionado para el aislamiento viral depende de las facilidades disponibles en cada laboratorio.

El diagnostico virológico o directo tiene por objetivo identificar el patógeno y monitorear el serotipo viral circulante. Debe realizarse con muestras tomadas durante el período de viremia (antes del día 5). El virus puede recuperarse de muestras de suero, plasma y células mononucleares (CMN) de sangre periférica y tejidos de autopsia. Al igual que otros virus envueltos el Dengue tiende a ser lábil al calor y las muestras deben ser conservadas y transportadas en hielo húmedo para mantener su viabilidad (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016). Los cultivos celulares de mosquitos y principalmente de células de línea Aedes albopictus, C636 y de Aedes pseudoscutellaris (AP61) son los más utilizados de rutina para el aislamiento del virus (Who, 2009). Otros cultivos de células de mamíferos y la inoculación intracerebral en ratones lactantes también se han empleado, pero tienen poca sensibilidad (Guzman & Vasquez, 2002). La inoculación intratorácica de mosquitos y en particular del Toxorhynchites amboinensis es el método más sensible para aislar el DENV (Rosen L. El aislamiento es seguido con la identificación viral a través del desarrollo de una inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos monoclonales específicos a los cuatro serotipos (Russi & Chiparelli, 2007). La detección del genoma viral (ARN) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polimerase chain reaction) ofrece una mayor sensibilidad en comparación con el aislamiento viral y los resultados se pueden obtener entre 6 y 24 horas después de recibida la muestra. Este sistema se desarrolla en tres etapas básicas: la extracción del ácido nucleico y purificación; la amplificación y la detección del producto amplificado (Who, 2009). Desde el año 1990, varios ensayos de PCR-Transcriptasa Reversa (RT-PCR) se han desarrollado para la detección del ARN viral, destacándose aquellos que detectan la presencia del gen que codifica la envoltura del virus o alguno de los genes que codifican para las proteínas no estructurales (Guzman & Vasquez, 2002). La RT-PCR anidada (nested/PCR) es ampliamente utilizada por su mayor sensibilidad. El ensayo PCR-TR en tiempo real es recientemente uno de los sistemas más sensibles que permite detectar y cuantificar el ARN viral presente en las muestras de suero y CMN de sangre periférica de pacientes con dengue aun en presencia de un bajo número de copias. Se realiza en un solo paso lo que disminuye las posibilidades de contaminación, la señal que se produce en las muestras positivas se monitorea en tiempo real, utiliza pares de cebadores y sondas específicas para cada serotipo viral (Who, 2009).

Los métodos para la detección de antígenos virales en particular proteínas de la envoltura/membrana (E/M) y la proteína 1 no estructural (NS1) del DENV están en proceso de evaluación y validación por el OMS/TDR. Varios autores han reportado la detección de la proteína E como método de diagnóstico temprano, sin embargo su baja sensibilidad obtenida principalmente en pacientes con infección secundaria aún no ha permitido su uso en la rutina diagnóstica (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016). La proteína NS1 se ha demostrado que circula en sangre durante las etapas tempranas de la enfermedad lo que sugiere su posible aplicación en el diagnóstico agudo de la infección (Russi & Chiparelli, 2007).

2.2.10.2.

Pruebas serológicas (MAC-ELISA)

La prueba de MAC-ELISA tiene una buena sensibilidad y especificidad, pero sólo cuando se usa cinco o más días después de la aparición de fiebre. Diferentes estuches comerciales (ELISA o pruebas rápidas) están disponibles, pero tienen una sensibilidad y especificidad variable, se ha encontrado que las pruebas de ELISA en general proporcionan mejores resultados que las pruebas rápidas (SHU & Huang, 2004). La reactividad cruzada con otros Flavivirus, tales como la encefalitis japonesa, encefalitis de San Luis y la fiebre amarilla, no figuran como un problema, pero algunos falsos positivos se han obtenido en el suero de pacientes con infección por malaria, leptospirosis y dengue pasado. Estas limitaciones tienen que ser tomadas en cuenta cuando se utilizan las pruebas en las regiones donde estos patógenos co_circulan. Cabe mencionar que no es posible utilizar los ensayos de IgM para identificar los serotipos del dengue ya que estos anticuerpos poseen una amplia reactividad cruzada incluso después de las infecciones primarias (WHO & W, 2009).

2.2.10.3.

ELISA IgM (MAC-ELISA)

El IgM total en el suero de los pacientes es capturado por los anticuerpos anticadena µ específicos (específico para IgM humana), recubierta en una microplaca. Antígenos específicos de Dengue, de los cuatro serotipos (DEN-1, -2, -3 y -4), están vinculados a la captura de anticuerpos IgM anti-dengue y se detectan los anticuerpos monoclonales o policlonales directa o indirectamente, conjugado con

una enzima que transforma un sustrato incoloro en productos de color, posteriormente la densidad óptica se mide por espectrofotometría (WHO & W, 2009). Suero, sangre en papel filtro y la saliva, pero no orina, se pueden utilizar para la detección de IgM si las muestras se toman dentro del marco de tiempo apropiado (cinco días o más después de la aparición de la fiebre). Las muestras de suero se pueden probar en una sola dilución o diluciones múltiples. La mayoría de los antígenos utilizados para este ensayo se deriva de la proteína de envoltura del virus del dengue (generalmente infectadas por el virus sobrenadantes de cultivo celular o la succión preparaciones de cerebro de ratón) (WHO & W, 2009).

2.2.10.4.

ELISA IgG

El ELISA IgG se utiliza para la detección de infecciones recientes o pasadas de dengue (si sueros pareados se recogen en el plazo correcto). Este ensayo utiliza los mismos antígenos que el MAC-ELISA. El uso de ELISA de captura IgG específicos E/M (GAC) permite la detección de anticuerpos IgG por un período de 10 meses después de la infección. Los anticuerpos IgG son para toda la vida, medido por la ELISA IgG indirecta recubierta por antígeno E / M, pero un aumento al cuádruple o más de los anticuerpos IgG en sueros pareados de fase aguda y de convalecencia se puede utilizar para documentar casos de infección reciente. Un método de inhibición de ELISA (EIM) para detectar anticuerpos IgG del dengue también se utiliza para el diagnóstico serológico y vigilancia de casos de dengue, sistema que se basa en la competencia por los sitios de antígenos por anticuerpos IgG del dengue en la muestra y el conjugado IgG humana anti-dengue (WHO & W, 2009). Este método puede ser usado para detectar anticuerpos IgG en suero o plasma y papel de filtro almacenadas muestras de sangre y permite la identificación de un caso como una infección primaria o secundaria por Dengue. En general, el ELISA IgG carece de especificidad dentro de los grupos del serocomplejo flavivirus. Después de infecciones virales, los anticuerpos producidos recientemente son menos ávidos que los anticuerpos producidos meses o años después de la infección. La avidez de los anticuerpos se utiliza en algunos laboratorios para discriminar las infecciones de primaria y secundaria, dichas pruebas no son de uso generalizado y no están disponibles comercialmente (SHU & Huang, 2004).

2.2.10.5.

Detección de antígenos

Hasta hace poco, la detección de antígenos de dengue en la fase aguda de suero fue poco frecuente en pacientes con infecciones secundarias ya que estos pacientes tenían antecedentes de inmunocomplejos de anticuerpos IgG. Nuevos desarrollos

en ELISA y dot blot dirigidos a la envoltura / membrana (E / M) y el antígeno de la proteína no estructural 1(NS1) demostraron que las altas concentraciones de estos antígenos en forma de complejos inmunes se pudo detectar en los pacientes con ambos infecciones de dengue primaria y secundaria hasta nueve días después de la aparición de la enfermedad. La glicoproteína NS1 es producida por todos los flavivirus y es secretada por las células de mamíferos, esta produce una respuesta humoral muy fuerte. Por lo que muchos estudios se han dirigido en el uso de la detección de NS1 para hacer un diagnóstico precoz de la infección por el virus del dengue (Abbas, Litchman, & Pillai, 2016). Pruebas comerciales para la detección de antígeno NS1 ya están disponibles, aunque no diferencian entre los serotipos del dengue. Su aplicación y utilidad están siendo evaluadas por los laboratorios de todo el mundo, incluyendo la red de la OMS / TDR / PDVI laboratorio (WHO & W, 2009).

2.3. Marco normativo El presente estudio corresponde a una investigación retrospectiva de corte transversal la cual se realizó en el Centro de análisis clínicos y microbiológicos Belén.

2.3.1.

Universo: Todos las muestras de pacientes que llegaron a realizarse las pruebas para diagnóstico y descarte de Dengue entre los meses de Enero y Julio del 2017 2.3.2. Muestra: La muestra corresponde a sueros de los 574 pacientes con manifestaciones clínicas de la enfermedad, el cual representa el 100% del total de pacientes que llegaron a realizarse las pruebas para diagnóstico y descarte de Dengue entre los meses de Enero y Julio del 2017. Para ello se utilizaron 2 criterios: 2.3.2.1. Criterios de inclusión: Todas aquellas muestras pertenecientes al estudio clínico del Dengue que hayan sido tomadas durante la fase aguda de la enfermedad y que fueran manejadas con todos los criterios de calidad para la toma, manejo y conservación de especímenes. 2.3.2.2. Criterios de exclusión: Todas aquellas muestras que no pertenezcan al estudio clínico del Dengue y las que hayan sido tratadas inadecuadamente. Recolección y procesamiento de la información: Los datos de cada una de las muestras serán obtenidas a través de la ficha epidemiológica la cual es llenada por el médico en el momento de la consulta. Dicha información se encuentra además en la base de datos del estudio. (Ver anexo No 5) Los resultados de laboratorio tales como el diagnóstico serológico IgM, ELISA Inhibición, y la RT-PCR se utilizaran para

valorar la utilidad diagnóstica de la prueba inmucromatográfica SD Dengue NS1, a partir de los cálculos estadísticos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo e índice Kappa (κ). Los datos serán procesados con el paquete informático Epi info vs. 2003, y presentados a través de tablas y gráficos que faciliten su Interpretación.

2.4. Marco conceptual 2.4.1. Arbovirosis: enfermedades que son trasmitidas por virus que tienen

2.4.2.

2.4.3.

2.4.4.

2.4.5.

2.4.6.

2.4.7.

como vector artrópodos hematófagos (mosquitos y garrapatas) que trasmiten el mismo a través de sangre infectada (Gallego, 2014). Endemo-epidémico: se refiere a la presencia de casos habituales de una enfermedad cuando esta (cualquier enfermedad, no sólo infecciosa) afecta a un grupo humano determinado con mayor frecuencia de la esperable en un período de tiempo (Leon, 2002). Aedes aegypti: es el principal vector de los virus que causan el dengue. Los seres humanos se infectan por picaduras de hembras infectadas, que a su vez se infectan principalmente al succionar la sangre de personas infectadas (OMS, El mosquito del dengue, 2006). Nucleocápside: Es un complejo de proteína y ácido nucleico que forma parte de la totalidad de los viriones. Está constituido por una CÁPSIDE más ácido nucleico encerrado; dependiendo del virus, la nucleocápside puede corresponder a un núcleo 'desnudo' o estar rodeado por una cubierta membranosa (Descriptores.com, 2008). Simetría icosahédrica: Se refiere al patrón icosaédrico (El icosaedro posee 20 caras, cada una de simetría rotacional es un triángulo equilátero, 12 vértices y ejes quíntuples, triples y dobles), es decir al arreglo más eficiente para subunidades dentro de una cubierta cerrada (Garcia, 2006). Proteínas estructurales: aquella que está presente en el virión en proporción importante y mantiene la estructura del mismo, estas pueden ubicarse en la cara interna de la envoltura, en capas de capsómeros colocados debajo de la cápside, y en el centro del virión asociadas al core (CIENCIAS, 2006). El virión: Es la partícula vírica morfológicamente completa e infecciosa que está compuesto por el ácido nucleico vírico (Puede ser ADN o ARN, de cadena doble o sencilla) y por proteínas víricas que forman la cubierta externa o cápside (Salud, 2016).

2.4.8.

2.4.9.

2.4.10.

2.4.11.

2.4.12.

2.4.13.

2.4.14.

2.4.15.

Enzimas: Son proteínas que actúan como catalizadores de una reacción química acelerándola. Las enzimas son protagonistas fundamentales en los procesos del metabolismo celular (Molecular, 2017). Aminoácidos: son compuestos orgánicos que se combinan para formar proteínas, las cuales son indispensables para nuestro organismo. Están formadas de carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. Entre sus funciones, los aminoácidos ayudan a descomponer los alimentos, al crecimiento o a reparar tejidos corporales, y también pueden ser una fuente de energía (Navas Méndez, 2000). Célula blanco: Son aquellas células que poseen en sus membranas los receptores específicos para ejercer la acción directa de una hormona en particular (bien sea por pasando a través de la membrana o adhiriéndose a un receptor de superficie) (Blanco, 2009) Endocitosis: es el proceso de incorporación de moléculas externas en grandes cantidades, principalmente para su degradación; estas moléculas son englobadas por membranas que normalmente pueden ser vesículas; este proceso puede ser mediado por receptores (histología, 2016). Proteínas transmembranales: son proteínas que contienen uno o más fragmentos que atraviesan la membrana celular; son especialmente importantes ya que participan en la comunicación de señales entre los espacios extracelular e intracelular y son clave en el establecimiento de las interacciones intercelulares (Molecular, 2017). Sulfato de heparán: Es un componente esencial de la lámina basal que lo producen la mayoría de las célula; pueden encontrarse de tres maneras: unido a la superficie celular a través del receptor CD44v3, unido covalentemente a los glucosil-fosfatidilinositoles de la membrana o libres en la matriz, donde se anclan al perlecano, la agina y al colágeno tipo XVIII (histología, 2016). Glicoproteína E: es la proteína viral más expuesta y ella interacciona con el complejo receptor a través de su dominio III localizado hacia el extremo carboxiterminal de la proteína (Del Angel, 2006). Células dendríticas: son leucocitos que juegan un importante papel tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa, siendo las células presentadoras de antígeno más potentes que existen y con la capacidad única de activar linfocitos T colaboradores que no han tenido contacto antigénico previo (Romero Palomo , y otros, 2011).

2.4.16. Vesícula endosómica

2.4.17. 2.4.18. 2.4.19. 2.4.20. 2.4.21. 2.4.22. 2.4.23. 2.4.24. 2.4.25. 2.4.26. 2.4.27. 2.4.28. 2.4.29. 2.4.30. 2.4.31. 2.4.32. 2.4.33. 2.4.34. 2.4.35. 2.4.36. 2.4.37.

Envoltura viral Membrana vesicular Retículo endoplásmico rugoso Proteínas virales Espacio luminal Mosquitos hematófagos Mosquito cosmopolita Antropófilo Fotofobia. Pupa Anofelinos Epizoótico Permeabilidad vascular Petequia Hematemesis Tejidos de autopsia Proteína NS1 Inmunocomplejos Anticuerpos IgG ELISA Glicoproteína NS1

2.4.38. Antígeno NS1: es un ensayo inmunocromatográfico in vitro, rápido de un solo paso que se utiliza para detectar el antígeno NS1 del virus Dengue en el suero de origen humano, plasma o sangre entera (Standar Diagnostc, 2016). 2.4.39. ELISA IgG: Es un ensayo inmunoenzimatico, que consiste en detección de anticuerpos(del suero del paciente, el cual debe adherirse a los antígenos, que se encuentran unidos a partículas plásticas, a su vez adheridos a una enzima que en presencia de una sustancia(sustrato) específica para la enzima (International, 2012). 2.4.40. Anticuerpos monoclonales: es un anticuerpo homogéneo producido por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral (Wikipedia, 2010).

Diseño metodológico del Estudio El presente estudio se realizó con todos los pacientes que presentaban las manifestaciones clínicas de dengue y llegaron al Laboratorio Belén a realizarse las pruebas. Este estudio se llevó a cabo entre los meses de enero y julio del 2017 y se realizó en 3 fases: 1. Recolección, rotulación y clasificación de las muestras: Las muestras fueron obtenidas de todos los pacientes que llegaron a realizarse la prueba al “Laboratorio Belén” entre los meses de enero y julio del 2017; donde se les registraron sus datos y los días que llevaban con las manifestaciones clínicas sospechosas de la enfermedad y según este parámetro se les clasifico en 3 grupos según como se muestra en el cuadro

Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Total

1_7 días

8_14 días

12 15 96 137 143 54 14 471

5 8 18 9 13 12 12 77

14_ días 2 3 6 1 9 3 2 26

20

Total 19 26 120 147 165 69 28 574

CANTIDAD DE MUESTRAS CLASIFICADAS SEGUN LOS DIAS DE MANIFESTACIONES CLINICAS DEL PACIENTE 14_ 20 días 143

8_14 días

ABRIL

JUNIO

2

MAYO

14 12

12 3

MARZO

13 9

18

FEBRERO

9 1

15 8 3

ENERO

6

12 5 2

54

96

137

1_7 días

JULIO

2. Procesamiento y análisis de las muestras 2.1. Obtención de la muestra biológica: Es a partir de los pacientes que llegaron a realizarse las pruebas de descarte de Dengue, en donde se les tomo sangre venosa que posteriormente fue centrifugada para la separación del suero y plasma sanguíneo. 2.2. Procesamiento de la muestra: Se procederá a analizar las muestras según la descripción del método de laboratorio prescripto según la técnica que trae consigo el kit inmunocromatográfico de Dengue Dx™ que está diseñado para detectar la proteína NS1 y los anticuerpos IgM e IgG, en suero o plasma durante toda la fase de la enfermedad y el tipo de determinación es cualitativa. 3. Validez estadística: Para hacer la validación interna del kit a partir de los resultados obtenidos del procesamiento de las muestras, se realizaran los siguientes cálculos estadísticos para ello es necesario tener en cuenta conceptos tales como: 3.1. Sensibilidad: Proporción de muestras positivas correctamente identificadas por la prueba empleada. 3.2. Especificidad: Proporción de muestras negativas correctamente identificadas por la prueba empleada. Valor predictivo positivo: Tipo de estudio:

REPORTES DE RESULTADOS DEL KIT DE DENGUE EN EL MES DE ENERO: "LABORATORIO BELEN" Negativo

1

3

4

15

16

18

Positivo

IG G

IG M

NS1

REPORTES DE RESULTADOS DEL KIT DE DENGUE EN EL MES DE FEBRERO: "LABORATORIO BELEN" Negativo

0

3

5

21

23

26

Positivo

IG G

IG M

NS1

REPORTES DE RESULTADOS DEL KIT DE DENGUE EN EL MES DE MARZO: "LABORATORIO BELEN"

13

24

96

100 20

Negativo 107

Positivo

IG G

IG M

NS1

REPORTES DE RESULTADOS DEL KIT DE DENGUE EN EL MES DE ABRIL: "LABORATORIO BELEN Negativo

14

28

36

111

119

133

Positivo

IG G

IG M

NS1

REPORTES DE RESULTADOS DEL KIT DE DENGUE EN EL MES DE MAYO: "LABORATORIO BELEN Negativo

19

42

46

119

123

146

Positivo

IG G

IG M

NS1

REPORTE DE RESULTADOS DEL KIT DE DENGUE EN EL MES DE JUNIO: "LABORATORIO BELEN" Negativo

8

16

19

50

53

61

Positivo

IG G

IG M

NS1

REPORTE DE RESULTADOS DEL KIT DE DENGUE DEL MES DE JULIO: "LABORATORIO BELEN"

23 IG G

3

3

5

25

Negativo 25

Positivo

IG M

NS1

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DEL KIT DE DENGUE REALIZADAS EN EL PERIODO ENERO_JULIO DEL 2017: "LABORATORIO BELEN" Negativo

58

127

199

375

447

516

Positivo

IG G

IG M

NS1

Ojiva de las tendencias de resultados de las Pruebas del Kit de Dengue, realizadas en los periodos de Enero_ Julio del 2017: "Laboratorio Belen" Ig G POSITIVO

Ig G NEGATIVO

Ig M POSITIVO

Ig M NEGATIVO

NS1 POSITIVO

NS1 NEGATIVO

200 150 100 50 0 ENERO

FEBRERO

MARZO

ABRIL

MAYO

JUNIO

JULIO