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Procariotas Árbol filogenético universal "Lo que ayer creía todo el mundo y lo que Ud. cree hoy, no lo creerán mañana más que los necios" Sir Francis Crick

Versión simplificada y modificada del Árbol filogenético Universal establecido por Carl Woese y su discípulo Gary Olsen que muestra los tres Dominios. El termino "dominio" refiere a un nuevo taxón filogenético que incluye tres líneas primarias: Archaea, Bacteria y Eucaria. En línea descendente siguen seis Reinos: I-Moneras, II-Arqueobacterias (obviamente separadas de Moneras), III-Protistos, IV-Hongos, V-Plantas y VI-Animales. En realidad al título cabría agregarle: "del mundo celular" ya que no incluye a virus, viriones.... Se incluye en este esquema a LUCA. El "árbol" de la vida construido a partir de los estudios del ARNr (ácido ribonucleico ribosómico, al árbol se basa en el estudio de las diferencias en las secuencias de ARNr comunes a todos los "seres vivos"), muestra cercano a su "raíz" (allí donde se encuentra LUCA, último antepasado común universal de las células modernas, compartido por todos los "seres vivos") organismos "hipertermófilos" que viven a temperaturas cercanas a los 115 grados centígrados. Podría pensarse que la vida "transitó por la senda de los sistemas hidrotermales" o, por que no, se originó en ellos. Pero bien podríamos colocar en la base un manojo de raíces o nube difusa para representar a la "Comunidad ancestral común de células primitivas" a partir de la cual divergieron ramas que dieron orígenes a los tres dominios actuales y además surcar la grafica con enlaces transversales entre ramas para indicar la existencia de una transferencia horizontal de genes. Ver Bibliografía. Ver árbol alternativo.

Monera: el Reino Procariota Las bacterias (del griego bakterion = bastón) son organismos unicelulares que se reproducen por fisión binaria. Su tamaño es del orden de los micrones e implica una relación superficie volumen muy alta: aproximadamente 100.000. Las Bacterias se encuentran prácticamente en todos lo ambientes de la Tierra, desde las profundas fosas oceánicas o el interior de rocas sólidas hasta las camisas refrigerantes de los reactores nucleares, ni que decir del resto de los hábitats. La mayoría de ellas son capaces de una existencia independiente pero existen especies como Chlamydia y Rickettsia que son organismos intracelulares obligados. Se encontraron estructuras semejantes a las bacterias en un meteorito marciano con una antigüedad de 3.000 millones de años (el llamado ALH84001, encontrado en la Antártida). De confirmarse la naturaleza de estas investigaciones, y si la descripción de lo encontrado correspondiera realmente a restos fósiles, sería de presumir la existencia simultánea de vida bacteriana en Marte y la Tierra (¿en ese entonces?). Hasta el momento, la naturaleza celular de estas estructura no ha sido establecida. Para una ampliación de este tema que se relaciona con el origen de la vida en la Tierra consultar este enlace. El Reino taxonómico Monera comprende, entre otras, a las eubacterias (las bacterias "verdaderas" y las cianobacterias, o bacterias fotosintetizadoras). Los organismos de este grupo no poseen organelas rodeadas por membranas (como las formas superiores de vida) y se conocen como procariotas. Procesos bioquímicos que en eucariotas ocurren normalmente en los cloroplastos o mitocondrias, tienen lugar en la membrana citoplasmática. El cromosoma bacteriano esta constituido por ADN circular que se ubica en la región denominada nucleoide Distribuidos en el citoplasma bacteriano se encuentran pequeños lazos de ADN conocidos como plásmidos. Los genes bacterianos se encuentran organizados en un sistema conocido como operón. Su pequeño tamaño, velocidad de reproducción (Escherichia coli se reproduce por fisión binaria cada 15 o 20 minutos), y la "ocupación" de diversos hábitats y modos de existencia hacen de Moneras el Reino más abundante y diversificado sobre la Tierra. Una manera de clasificar las bacterias es subdividirlas de acuerdo a la forma en que adquieren su energía en:

Son autótrofas, y obtienen energía de la oxidación de compuestos Quimiosintetizadoras inorgánicos como el amonio, los nitritos (a nitratos) o los sulfuros (a sulfatos). Fotosintetizadoras

Heterotrófas

Convierten la energía lumínica en energía almacenada en carbohidratos. El grupo mas importante es el de las cianobacterias. Probablemente las primitivas cianobacterias formaron el oxígeno que se liberó en la primitiva atmósfera terrestre. Poseen clorofila a y también el pigmento azul ficocianina y el rojo ficoeritrina. Los miembros de este grupo obtienen su energía de materia orgánica elaborada por otros organismos. Podemos señalar dos grandes grupos: las saprofitas y las simbióticas. Las saprofitas se alimentan de materia muerta o en descomposición siendo por lo tanto importantes recicladores de nutrientes. Muchas de las que entablan relaciones simbióticas lo hacen en forma mutualística y colaboran con su huésped, ejemplo de ellos son las bacterias que en la vaca y otros rumiantes convierten la celulosa en glucosa asimilable por el animal. Otras entablan una relación parasitaria y se constituyen en patógenas para su huésped produciendo enfermedades tales como la fiebre reumática, cólera, gonorrea, sífilis. La patogenicidad puede derivar de causas tales como destrucción celular, liberación de toxinas o la misma reacción del cuerpo a la bacteria infectante. Las infecciones bacterianas pueden ser controladas, entre otros, por tratamiento con antibióticos. Los antibióticos son productos que interfieren en algún punto del procesos de división de las bacterias, son producidos por microorganismos tales como los hongos, que compiten con las bacterias por los recursos disponibles. Sin embargo el extendido uso de los mismos impuso una presión evolutiva de una intensidad antes inexistente que llevo, por el proceso de selección natural, a la expansión de cepas resistentes a los antibióticos. Esto en muchos casos lleva a frecuentes cambios de tratamiento de las enfermedades y a la necesidad de nuevos desarrollo de antibióticos.

Las Arqueobacterias El grupo más antiguo, las arqueobacterias, constituyen un fascinante grupo de organismos y por sus especiales características se considera que conforman un Dominio separado: Archaea. Si bien lucen como bacterias poseen características bioquímicas y genéticas que las alejan de ellas. Por ejemplo: no poseen paredes celulares con peptidoglicanos; poseen secuencias únicas en su ARN

algunas de ellas poseen esteroles en su membrana celular (una característica de eucariotas), poseen lípidos de membrana diferentes tanto de las bacterias como de los eucariotas (incluyendo enlaces éter en lugar de enlaces ester).

Células de Sulfolobus acidocaldarius adheridas a un cristal de sulfuro, observadas con microscopia de fluorescencia

Corte de Sulfolobus acidocaldarius observado con microscopio electrónico de transmisión(85.000 X)

Imágenes obtenidas de http://www.bact.wisc.edu/Bact303/MajorGroupsOfProkaryotes.

Hoy se encuentran restringidas (bueno lo de restringidas, si se lee mas adelante , ya no parece un termino aplicable) a hábitats marginales como fuentes termales, depósitos profundos de petróleo caliente, fumarolas marinas, lagos salinosos (incluso en el mar Muerto...). Por habitar ambientes "extremos",se las conocen también con el nombre de extremófilas. Existen tres tipos de arqueobacterias: 1. Metanogénicas: (generadoras de metano), crecen en condiciones anaeróbicas oxidando el hidrógeno. Para ello utilizan el CO2 como oxidante, en el proceso lo reducen a metano (CH4). Las metanogénicas usan ácidos orgánicos simples como el acetato para sintetizar sus componentes celulares. Estos ácidos orgánicos son producidos por otras bacterias anaeróbicas como producto final de la descomposición de la celulosa u otros polímeros. Por lo tanto las metanogénicas son abundantes donde existe materia orgánica y condiciones de anaerobiosis (por ej. rumen de las vacas) 2. Halófilas: desarrollan en ambientes salinos. Requieren una concentración de al menos 10% de cloruro de sodio para su crecimiento 3. Termófilas : desarrollan a temperaturas de 80oC y pH extremadamente bajos. Se considera que las condiciones de crecimiento semejan a las existentes en los primeros tiempos de la historia de la Tierra por ello a estos organismos se los denominó arqueobacterias (del griego arkhaios = antiguo). El grupo más antiguo, las arqueobacterias, constituyen un fascinante conjunto de organismos y por sus especiales características se considera que conforman un Dominio separado: Archaea. Fenotípicamente, Archaea son muy parecidos a las Bacterias. La mayoría son pequeños (0.5-5 micras) y con formas de bastones, cocos y espirilos. Las Archaea generalmente se reproducen por fisión, como la mayoría de las Bacterias. Los genomas de Archaea son de

un tamaño sobre 2-4 Mbp, similar a la mayoría de las Bacterias. Si bien lucen como bacterias poseen características bioquímicas y genéticas que las alejan de ellas. Por ejemplo: no poseen paredes celulares con peptidoglicanos presentan secuencias únicas en la unidad pequeña del ARNr poseen lípidos de membrana diferentes tanto de las bacterias como de los eucariotas (incluyendo enlaces éter en lugar de enlaces éster). Hoy se encuentran restringidas (bueno lo de restringidas, si se lee mas adelante, ya no parece un termino aplicable) a hábitats marginales como fuentes termales, depósitos profundos de petróleo caliente, fumarolas marinas, lagos salinosos (incluso en el mar Muerto...). Por habitar ambientes "extremos", se las conocen también con el nombre de extremófilas. Se considera que las condiciones de crecimiento semejan a las existentes en los primeros tiempos de la historia de la Tierra por ello a estos organismos se los denominó arqueobacterias (del griego arkhaios = antiguo).

Membranas de las Archeae Los lípidos presentes en las membranas son únicos desde el punto de vista químico, a diferencia de los eucariotas y las bacterias, en que los enlaces éster son los responsables de la unión entre los ác. grasos y glicerol, los lípidos de las Archaea poseen enlaces ÉTER para la unión del glicerol con cadenas laterales hidrofóbicas. En lugar de ac. grasos poseen cadenas laterales formadas por unidades repetitivas de una molécula hidrocarbonada como el isopreno. Los principales tipos de lípidos son los diéteres de glicerol. En algunos éteres las cadenas laterales (fentanil) se unen entre sí por enlaces covalentes formando una monocapa en lugar de la bicapa característica de las membranas, siendo más estables y resistentes, siendo habituales por lo tanto en las hipertemófilas.

Paredes celulares Algunas arqueobacterias metanogénicas poseen la pared celular formada por un compuesto similar al peptidoglicano de las bacterias, por lo que denomina pseudopeptidoglicano, con enlaces glucosídicos 1,3 en lugar de los 1,4 de los peptidoglicano. En otras archaeas la pared se compone de polisacaridos, glicoproteínas o proteínas. El tipo de pared más común es la capa superficial paracristalina (capa S) formada por proteína o glucoproteína, de simetría hexagonal. La pared celular impide la lisis celular y le confiere la forma a la célula. Las paredes de las Archaea son resistentes naturalmente a la lisozima, debido a la ausencia de peptidoglicano. La única arqueobacteria que carece de pared es Thermoplasma.

Árbol Filogenético de Archaea Sobre la base del análisis de la subunidad pequeña del ARN, las Archaea consisten en dos

grupos filogenéticamente diferentes: Crenarchaeota y Euryarchaeota. Se diferencias por el tipo particular de ARN que presentan y por el ambiente en que habitan. Las Crenarchaeota (crenotas) es un grupo fisiológicamente homogéneo de hábitats enteramente termofílicos. en cambio las Euryarchaeota (euryotas) son un grupo fenotípicamente heterogéneo, que incluye a las metanogénicas, halófilas, etc. Basados en su fisiología se distinguen: metanogénicas procariotas que producen metano halofilas extremas viven en regiones con muy alta concentración de sal (NaCl); requieren una concentración de al menos 10% de cloruro de sodio para su crecimiento extremas (hiper) termófilas viven a temperaturas muy altas. Además de las características unificadoras de las arqueobacterias, (pared celular sin mureína, lípidos de membranas con enlaces éter, etc.), estos procariotas exhiben atributos bioquímicos que le permiten adaptarse a estos ambientes extremos. Las Crenarchaeota son principalmente hipertermofílicos dependientes del sulfuro y los Euryarchaeota son metanogénicos y halófilos extremos.

Metanogénicas Son anaerobias obligadas que no toleran ni siquiera breves exposiciones al aire (O2). En ambientes anaeróbicos son muy abundantes, incluyen sedimentos marinos y de agua dulce, pantanos y suelos profundos, tracto intestinal de animales y plantas de tratamiento de líquidos cloacales. Las metanogénicas tiene un tipo increíble de metabolismo que puede usar el H2 como fuente de energía y el CO2 como fuente de carbono para su crecimiento. En el proceso de construcción de material celular desde H2 y CO2, Las metanogénicas producen metano (CH4) en un único proceso generador de energía. El producto final, gas metano, se acumula en el ambiente, así se han creado la mayoría de las fuentes naturales de gas natural (combustible fósil) utilizado con fines industriales o domésticos.

Los procariotas Metanogénicos son habitantes normales del rumen de vacas y rumiantes. Una vaca puede eliminar unos 50 litros de gas metano por día, en el proceso de eructación. El metano es un importante gas del efecto invernadero que se acumula en la atmósfera a velocidad alarmante. Cuando se destruyen áreas verdes y se reemplazan por ganado se produce un doble impacto en el efecto invernadero ( "double-hit"): 1. menores cantidades de CO2 serán eliminadas debido a la remoción de las plantas 2. CO2 y CH4 adicionales serán liberados por el metabolismo combinado del ganado y los procariotas metanogénicos.

Por otra parte gran cantidad de gas metano es producido durante el tratamiento de los líquidos cloacales, sin embargo normalmente es descartado en lugar de ser reciclado. Methanococcus jannischii Methanococcus jannischii fue originalmente aislada de una muestra tomada de una chimenea ( white smoker: fumarola blanca) a 2.600 metros de profundidad en el Pacífico Este. Puede crecer en un medio de cultivo mineral que contenga solo H2 y CO2 como fuente carbonada y en un rango de temperatura entre 50º 86º grados. Estas células son cocos irregulares móviles, debido a la presencia de dos haces de flagelos polares insertos cerca del mismo polo .

Halófilas extremas Viven en ambientes naturales como el mar Muerto, el Great Salt Lake (Colorado USA), o en estanques de evaporación de agua salada, donde la concentración de sal es muy alta (hasta 5 molar o 25 por ciento de NaCl). Estos procariotas requieren la sal para el crecimiento, sus paredes celulares, ribosomas y enzimas se estabilizan con el ión Na+. Halobacterium halobium, la especie predominante en Great Salt Lake, se adapta al ambiente altamente salino por el desarrollo de una "membrana púrpura", que toma esta coloración por la presencia del pigmento del tipo de rodopsina llamado bacteriorodopsina que reacciona con la luz formando un gradiente de protones a lo largo de la membrana que permite la síntesis de ATP. Este es el único ejemplo en la naturaleza de una fotofosforilación sin clorofila. Estos organismos son heterótrofos y aerobios, la alta concentración de ClNa en el ambiente limita la disponibilidad de O2 para la respiración, por lo que usando bacteriorhodopsina aumentan su capacidad de producir a ATP, convirtiéndolo a partir de la energía lumínica.

Halobacterium salinarium Halobacterium salinarium es una halofila extrema que crece a 4 - 5 M NaCl y no crece por debajo de 3 M NaCl. La preparación por criofractura muestra la estructura de la superficie de la membrana celular y revela pequeños parches de "membrana púrpura" que contienen el pigmento bacteriorrodopsina embebidas en la membrana plasmática, este pigmento expulsa un protón de la célula, creando así un gradiente de protones que puede ser usado para generar ATP.

Termófilas extremas (Termoacidófilas) Representan varias líneas filogenéticas de Archaea. Estos organismos requieren temperaturas muy altas (80º - 105º grados) para crecer. Sus membranas y enzimas son inusualmente estables a estas temperaturas. La mayoría de ellas requiere sulfuro para crecer, algunas son anaerobias y usan el sulfuro como aceptor de electrones en la respiración, en reemplazo del oxígeno. Otras son litotróficas y oxidan sulfuro como fuente de energía, crecen a bajo pH (< pH 2) dado que acidifican su ambiente oxidando Su (sulfuro) a SO4 (ác. sulfúrico). Estos hipertermófilos son habitantes de ambientes calientes, ricos en sulfuro asociados a los volcanes, como los manantiales clientes, géiseres y las fumaroles del Parque National de Yellowstone , en respiraderos termales ("smokers") y en fracturas del piso oceánico. Sulfolobus fue el primer Archeae hipertermofílicos descubierto por Thomas D. Brock de la Universidad de Wisconsin en 1970. Su descubrimiento, junto al de Thermus aquaticus en el Parque Yellowstone, iniciaron el campo de la biología de los hipertermófilos. Thermus aquaticus, (fuente de la enzima taq polimerasa usada en la reacción en cadena de la polimerasa , PCR), crece a 70º grados. Sulfolobus crece en ambientes rico en sulfuro, manantiales calientes, 90º grados y pH 1. Thermoplasma, también descubierta por Brock, es un termófilo único, ya que es el representante exclusivo de una línea filogenética de Archaea. Thermoplasma recuerda a las bacterias micoplasmas ya que carece de pared celular. Thermoplasma crece a 55º grados y pH 2; solo han sido encontradas en pilas calientes de carbón, los cuales son productos de desecho humanos.

Sulfolobus acidocaldarius (T.D. Brock) izq: MET X85,000, der: microfotografía por fluorescencia de células adheridas a cristales de sulfuro

Parque National de Yellowstone

Sulfolobus es un termófilo extremo que se encuentra en manantiales ácidos productos de calentamiento por volcanes, y suelos con temperaturas entre 60º - 95º gradosC, y pH 1 a 5.

Yellowstone National Park, USA, izq: Octopus Spring, der: Obsidian Pool. A pesar que las Archaea son extremófilos por excelencia, también pueden encontrarse Bacterias, e inclusive algunos eucariotas en estos hábitat. Ninguna bacteria produce metano, pero existen algunas que creen en estos ambientes. Con respecto a la tolerancia ácida, una bacteria: Thiobacillus, puede crecer a pH 0. Un alga, Cyanidium, también puede crecer a pH 0. En ambiente supercálidos ( > de 100º C), los Archaea son exclusivos. Ninguna bacteria puede crecer en altas concentración de sales.

Relación entre los dominios Archaea Pared

pseudopeptidoglicano, o solo por proteínas

Bacteria

Eukarya

plantas (celulosa), peptidoglicanos animales (ninguna), fungi (quitina)

Lípidos: las cadenas hidrocarbonadas lípidos: las cadenas de ac. grasos están Membrana ramificadas están unidas al glicerol por unidas al glicerol por enlaces ester enlaces éter ADN fragmentado en Genoma ADN único, circular, presencia de plásmidos cromosomas múltiples

Descubriendo nuevos microbios En esencia el método consiste en la extracción de ADN de una muestra del medio ambiente, separar sus filamentos y mezclarlos con un "cebador" (una secuencia corta de ADN que se combinará con una secuencia complementaria del ADN de la muestra). Luego utilizando la el ADN de la muestra será sintetizado (y amplificado...) comenzando en el punto donde se pegó el cebador y continuando a lo largo de la cadena de ADN. Si se utiliza como cebador regiones altamente conservadas de los genes que codifican el ARNr de la (subunidad pequeña de los ribosomas), los genes de los ribosomas de la muestra serán copiados y su secuencia comparada con la de los organismos conocidos.

Toda secuencia nueva de genes representa un nuevo organismo, y puede representarse en el árbol filogenético construido a partir de la secuencia de los genes de la subunidad pequeña de los ribosomas. De esta manera se descubrieron nuevos tipos de arqueobacterias en los ambientes marinos. Parecen ser bastante comunes y la abundancia de su ADN en las aguas superficiales costeras sugieren que pueden representar hasta el 34% de la biomasa correspondiente a los procariotas en ciertas épocas del año.

El registro fósil La evidencia fósil soporta la idea que el origen de la vida en la Tierra comenzó en épocas tempranas: hace ya 3.500 millones de años, en notación científica un billón (o mil millones)= un Giga, Ga abrevia por Giga-años. Los fósiles más antiguos provienen de rocas marinas, como la piedra caliza y la piedra arenizca, formadas en el antiguo océano. J. William Schopf de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) descubrió recientemente posibles procariotas fotosintetizadores en rocas de 3,5 Ga; y son de tal complejidad que el hecho sugiere que formas primitivas debieron existir antes. De rocas obtenidas de Groenlandia se obtuvieron posiblemente las más antiguas células 3,8 (?) Ga. La roca más antigua conocida en la Tierra tiene 3,96 Ga y proviene de la región canadiense del Ártico. Por lo tanto, a partir de estas evidencias podemos suponer que la vida en la Tierra comenzó rápidamente luego del enfriamiento de la corteza y la formación de la atmósfera y los océanos. Recientes descubrimientos de la existencia de bacterias en las fosas marinas, en las cuales las placas tectónicas dejan lugar a fisuras. El calor y los materiales resultantes de esta circunstancia conforman un ambiente particular donde se desarrollan bacterias. Esto permite presuponer otro lugar donde la vida pudo haberse originado: en estas fosas marinas donde el calor y la roca derretida aflora a la superficie de la Tierra.

Estromatolitos El curso de la evolución puede ser reconstruido estudiando el registro fósil. Los fósiles son los restos mineralizados de organismos de períodos geológicos previos, que proporcionan un registro de la historia geológica de la tierra. Los fósiles microbianos se han encontrado en rocas compuestas por finas capas denominadas estromatolitos, formados por bacterias heterótrofas y fotótrofas que vivían en

un tipo de colonias. Las cianobacterias se encuentran en la superficie externa y otras bacterias fotosintetizadoras (anaerobias) se encuentran inmediatamente por debajo de ellas. Por debajo de las capas fotótrofas se encuentran capas de bacterias heterótrofas. Las capas de los estromatolitos son alternativamente biogénicas y sedimentarias en su origen. Los estromatolitos se siguen formando todavía en la actualidad y son relativamente comunes en lagunas y aguas termales. Los fósiles microbianos mas antiguos son de hace unos 3500 millones de años, casi tan antiguos como las rocas mas antiguas (3800 millones de años). A. Imagen de los estromatolitos de la Bahía de los Tiburones (Sharks Bay), Australia. B. Un corte de una de esas estructuras C. Ampliación que muestra las cianobacterias principal constituyentes de esta pieza. Imagen

Composición Química La célula bacteriana tiene un contenido en agua del 70 al 85%. El peso húmedo (masa húmeda) de los seres unicelulares se estima mediante centrifugación y separación de la masa celular de su medio de cultivo. El peso seco (masa seca) se estima luego de evaporar toda el agua, y estará comprendido por lo tanto entre el 15 al 30% del peso húmedo. Si las células contienen grandes cantidades de materiales de reserva (es decir, lípidos, polisacáridos, polifosfatos o azufre) el peso seco es proporcionalmente superior. Los datos de la composición elemental y la distribución de los compuestos orgánicos integrantes del peso seco se dan en las tablas siguientes

Composición elemental Elemento

Porcentaje

Carbono Oxígeno

50 % 20 %

Nitrógeno

14 %

Hidrógeno

8%

Fósforo

3%

Azufre

1%

Potasio

1%

Calcio

0,5 %

Magnesio

0,5 %

Hierro

0,2 %

Composición del peso seco Polímero Proteínas Pared celular ARN ADN Lípidos

Porcentaje 50 % 10-20 % 10-20 % 3-4 % 10 %

Forma y Tamaño Las bacterias típicamente tienen una de estas tres formas: 1. cilíndrica (bacilos): 2. esférica (cocos), el diámetro de los micrococos es de solo 0,5 µm 3. espiralada (espirilos) Son unicelulares y a menudo se agrupan formando agregados o filamentos. Generalmente son muy pequeñas su tamaño es del orden del micrón.

Tabla I Nombre de la bacteria

Diámetro

Longitud

0,4-0,5 µm

2-3 µm

Chromatium okenii

5 µm

20 µm

Escherichia coli

1 µm

5 µm

Thiospirillum jenense

3,5 µm

50 µm

Epulopiscium fishelsoni

250 µm

Pseudomona aeruginosa

Thiomargarita namibiensis

0,75 mm

Las de forma bacilar generalmente tienen 1 µm de diámetro y 5 µm de largo, las de 20 o más micras de largo se consideran "gigantes". Las bacterias gigantes son de crecimiento lento, la mayor de ellas es Thiomargarita namibiensis, bacteria esférica cuyo diámetro puede alcanzar 0,75 mm.

Obtenida de: http://129.109.136.65/microbook/ch002.htm Al microscopio los miembros de los géneros Pseudomonas y Bacillus se observan como varillas (bacilos) rectos.

El género Vibrio aparece como un bacilo curvado o forma de coma El género Corynebacterium tiene forma de maza y tendencia a cambiar de forma El género Mycobacterium presenta ramificaciones incipientes. El género Streptomyces puede formar un micelio El método usual de división en procariotas es la fisión binaria. Tras el alargamiento de la célula construyen de afuera hacia dentro paredes transversales que van progresando, y las células hijas se separan. Sin embargo muchas de ellas en determinadas condiciones, permanecen unidas durante un cierto tiempo, dando origen a agrupaciones características. Según el plano y número de divisiones pueden encontrarse en bacterias esféricas: diplococos estreptococos estafilococos sarcinas

1

2

3

1. Escherichia coli, cepa hemorrágica 0157:H7. Copyright Dennis Kunkel (MEB 22.810x http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery), usada con permiso.

2. Escherichia coli división por fisión binaria. Copyright Dennis Kunkel (MET 92.750x http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery), usada con permiso.

3. Esquema de un bacilo

Treponema pallidum, la espiroqueta que causa la sífilis http://www.bact.wisc.edu/Bact303/MajorGroupsOfProkaryotes.

Diferencias con Eucariotas Si bien la célula eucariota se describe in extenso es conveniente dejar planteadas aquí sus principales diferencias con la procariota.

Estructura/Proceso Membrana nuclear ADN Cromosomas División celular Mitocondria

en Eucariotas Presente Combinado con proteínas (histonas) Múltiples Mitosis o Meiosis Presentes (con ribosomas 70S)

en Procariotas Ausente Desnudo y circular

Único Fisión binaria Ausente. Los procesos bioquímicos equivalentes Presentes en células vegetales tienen lugar en la membrana Cloroplasto (con ribosomas 70S) citoplasmática. 80S(a 60S y 40S sus Ribosomas 70S(a 50S y 30S sus subunidades) subunidades) Presente en vegetales Pared celular Presente constituida por mureína constituida por celulosa Nucléolos Presentes Ausentes Retículo endoplásmico Presente Ausente Cilios y flagelos que al corte Órganos de transversal presentan una Flagelos sin estructura 9+2 locomoción distribución característica de microtúbulos: 9+ 2

Especie bacteriana La definición moderna de especie puede ser aplicada a la mayoría de los eucariotas, incluyendo hongos, algas y protozoos, pero no es aplicable a los procariotas, ya que la reproducción y el intercambio genético no son esenciales en su ciclo de vida. Dado que los microbiólogos necesitan identificar y clasificar las bacterias por diferentes razones prácticas, una especie puede definirse como una colección de cepas similares, que difieren lo suficiente de otros grupos de cepas para asegurar su reconocimiento como unidad taxonómica básica. Para ser exactos. una especie procariota podría definirse de manera precisa a partir de sus secuencia de ARNr. A pesar de no estar completamente aceptado, se ha propuesto que dos procariotas cuyo ARNr 16S tenga un 97% o mas de secuencias idénticas es muy probable que pertenezcan a la misma especie. Lo usual es que se defina una especie a partir de la caracterización de varias cepas o clones. Siendo CLON una población de células genéticamente idénticas derivadas de una (1) sola célula.

Nucleoide bacteriano El "núcleo" bacteriano: NUCLEOIDE Las células procariotas y eucariotas se distinguieron desde el principio sobre la siguiente base estructural: la estructura equivalente al núcleo eucariota (esa compleja estructura rodeada por membranas) no se observaba en procariotas. El tamaño de las bacterias dificultó los estudios acerca del "núcleo" bacteriano, sin embargo en el curso de las investigaciones destinadas a su esclarecimiento la utilización de los métodos citoquímicos y la microscopía electrónica demostraron su existencia. El gran poder de resolución del microscopio electrónico no solo amplia la típica forma bacteriana, sino que revela claramente la organización procariota. Obtenida de: http://129.109.136.65/microbook/ch002.htm Note la región nuclear o nucleoide (n) donde se localiza el ADN y las áreas oscuras del citoplasma de Neisseria gonorrhoeae.

Hoy se conoce que al igual que del resto de seres vivos (celulares) poseen ADN, y que el mismo no se haya distribuido al azar en el citoplasma, sino en una zona particular denominada región nuclear o nucleoide sin estar separado por una unidad de membrana.

Cromosoma bacteriano Por microscopía óptica puede constatarse la presencia de ADN por la tinción de Feulgen. Sin embargo, fueron los métodos autorradiográficos los que demostraron en forma indubitable que el ADN es el material "nuclear" de las bacterias, gracias a una de las características que posee esta molécula: es la única sustancia celular que posee timina. De los métodos autorradiográficos (usando timina tritiada) y bioquímicos también surgió el conocimiento que el ADN se presenta como una doble cadena (de cerca de 1 mm de longitud), circular y cerrada de manera covalente, que toma el nombre de cromosoma bacteriano. Esta "gigantesca" molécula circular tiene un peso de 3 X 10 9d (daltons). Sobre estas bases por lo tanto, el nucleoide es una estructura que contiene un solo cromosoma. No posee las histonas del cromosoma eucariota, pero se ha comprobado la existencia de proteínas y poliaminas de bajo peso molecular y de iones magnesio que cumplirían su función. Desde ya, la sola mención de la longitud del cromosoma bacteriano del orden del milímetro hace necesaria una explicación que concilie con el tamaño de la bacteria que está en el orden de micrones (1 µm = 0,001 mm), la microscopía electrónica muestra un cromosoma bacteriano altamente condensado y ordenado ("supercoiled" o superenrrollado), y que se encuentra anclado parcialmente a la membrana bacteriana. Este ADN superenrrollado adopta una forma mucho mas compacta que el circular. En la célula eucariota el enrollamiento se hace sobre las histonas en los nucleosomas, pero en las procariotas, existe una enzima: la ADN girasa que que provoca enrollamientos negativos (la torsión se hace de manera contraria a la dirección de la doble hélice, o sea hacia la izquierda). E. coli puede

presentar hasta unos 50 dominios superenrrollados debido a su asociación con proteínas estructurales, poliaminas de bajo peso molecular y de iones magnesio que cumplirían la función de las histonas eucariotas. De la misma forma que la ADN girasa superenrrolla el cromosoma para confinarlo dentro de la célula, otra enzima, la Topoisomerasa I es capaz de desenrollar y relajarlo para permitir la replicación.

Cromosoma de E. coli extendido por shock osmótico 1200 µm de long. (Dr. Gopal Murti/Science Photo Library) Es interesante como algunos antibióticos (ac. nalixídico y novobiocina) actúan inhibiendo la acción de la ADN girasa. El esquema supersimplificado de esta figura:

http://www.biosci.uga.edu/almanac/bio_103/notes/may_30.html.Esquematiza el cromosoma

bacteriano y representa los plásmidos.

Plásmidos Son elementos genéticos accesorios extracromosómicos, pequeños fragmentos circulares de ADN, que están presentes prácticamente en todas las células bacterianas. Contienen de 2 a 30 genes. Algunos tienen la capacidad para incorporarse o salir del cromosoma bacteriano. Se denomina episoma a un plásmido incorporado al cromosoma bacteriano. Los plásmidos se replican en manera similar al cromosoma bacteriano. En Escherichia coli se han reconocido muchos plásmidos, entre ellos el F ("factor sexual") y el R (resistencia a los antibiótico). El plásmido F contiene 25 genes, algunos de los cuales controlan la producción de los pilis , "tubos" que se extienden desde la superficie de las células bacterianas "machos"( F+), a la de las células bacterianas hembras ( F -).

Conjugación en una cepa de Escherichia coli (M.E 27.700x) © Dennis Kunkel, usada con permiso.

La resistencia a los antibióticos ha sido encontrada en gérmenes patógenos causantes de enfermedades tales como: tifoidea, meningitis, gonorrea y otras. Actúan proporcionando la información necesaria para destruir el antibiótico o para circunvalar el bloqueo que produce el antibiótico en la vía metabólica bacteriana. El plásmido R confiere, a las células que lo poseen, resistencia a los antibióticos o drogas. Un plásmido R puede llegar a tener hasta 10 genes que confieren resistencia. Los plásmidos R pueden transferirse a otra bacteria de la misma especie, a virus e

inclusive, a bacterias de diferentes especies.

Tamaño genómico El tamaño genómico de las bacterias se diferencia de una especie a otra, en un rango que va de 0,6 hasta 13.106 pares de bases (pb). La mayoría de los genomas bacterianos tienen el mismo orden de tamaño que el de Escherichia coli (esto es 4,6.106 kb). El número de genomas por célula difiere igualmente de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo. A efectos comparativos la tabla siguiente muestra el tamaño genómico de Escherichia coli y de una serie de eucariotas. Organismo

Tamaño genómico

Escherichia coli

4,6.106 pb

Neurospora crassa

19.106pb

Aspergillus niger

40.106pb

Homo sapiens

2,9.109pb

Zea maiz

7.109pb

Reproducción Bacteriana Los datos obtenidos a partir de las autorradiografías del cromosoma de Escherichia coli (imágenes theta por su similitud al aspecto de dicha letra griega) ya indican la manera en que se replicaría el ADN bacteriano, el esquema y la animación representan una replicación unidireccional, si bien en realidad se ha establecido que la misma es bidireccional y existen dos horquillas de replicación que acontecen por la desespiralización de la doble cadena. La duplicación de la célula va precedida por la duplicación o replicación del cromosoma bacteriano. Primero se replica y luego pega cada copia a una parte diferente de la membrana celular. Cuando las células que se originan comienzan a separarse, también se separa el cromosoma original del replicado. El número de copias por célula del cromosoma depende del estadio del ciclo celular (replicación del cromosoma, crecimiento de la célula, separación de los cromosomas, etc.). Si bien el mecanismo de separación de los cromosomas "hermanos" no se ha dilucidado en su totalidad, todo los modelos coinciden que una de las condiciones es que el cromosoma permanezca "pegado" a la membrana celular a través de varios estadios del ciclo de división bacteriano. Luego de la separación de las células (citocinesis), quedan dos células de idéntica composición genética (excepto en los raros casos de mutación espontánea). Ver animación abajo El tiempo necesario para la replicación del cromosoma de Escherichia coli es de aproximadamente 40 minutos, sin embargo la duplicación de la bacteria acontece (en condiciones optimas) en cerca de 20 minutos, este hecho paradojal se explica por el descubrimiento que en los cromosomas bacterianos "hijos" se inicia un nuevo ciclo de división antes de que se termine el primero.

El cromosoma procariota es mucho más fácil de manipular que el de los eucariotas y por lo tanto se conoce mucho acerca de sus genes y sus mecanismos de control. Una consecuencia de este método asexual de reproducción es que todos los organismos de una colonia son genéticamente iguales. Cuando se trata una enfermedad bacteriana, una droga que mata una bacteria matara todos los otros miembros de este clon (colonia) con los cuales se ponga en contacto. Ciertos tipos de bacterias pueden "donar " un pedazo de ADN a una célula receptora. Esta recombinación es el equivalente bacteriano de la reproducción sexual en eucariotas. Debe notarse que usualmente no se transfiere la totalidad de la molécula de ADN, solo una pequeña parte

Número de copias cromosómicas Las células procariotas en crecimiento rápido (fase logarítmica o exponencial) tienen la posibilidad de dividirse más rápido que lo que permite la maquinaria de replicación del ADN. Por ello pueden tener de 2 a 4 copias del cromosoma bacteriano o copias incompletas del mismo. Para asegurar que exista una copia completa para cada una de las células hijas en la fisión binaria, se inician nuevos ciclos de replicación del ADN antes que el último haya terminado. Únicamente en fase estacionaria, cuando las bacterias cesan de dividirse, existe un cromosoma por célula. Por ello este tipo de organismos son haploides, es decir el genoma mínimo por célula es una sola copia del cromosoma bacteriano, lo que implica que existe una sola copia de cada gen.

Verificación de quorum Bajo el termino "verificación de quorum " (quorum sensing ) se describe la manera en que las bacterias determinan cuantas de ellas se encuentran en la vecindad. La "verificación de quorum " (quorum sensing) permite a una población de bacterias coordinar su expresión génica y, por lo tanto, su comportamiento colectivo. Usualmente la "verificación de quorum " sirve para controlar procesos que son efectivos cuando un gran numero de bacterias actúan en conjunto. Si existe quorum, es decir, si el numero de ellas es el adecuado, se desencadenara una respuesta colectiva. Por ejemplo Millones de bacterias bioluminescentes decidirán emitir luz simultáneamente a fin de permitir a su hospedador (un calamar) "encenderse" y utilizar la luz producida, para, por ejemplo, distraer a un predador...

Bacterias patógenas como Salmonella esperan a "reunir quorum" antes de liberar las toxinas que atacaran a su huésped. Si la bacteria ataca sola, en vez de hacerlo en conjunto, el sistema inmunológico la neutraliza rápidamente. Las investigaciones respecto a este tema mostraron además que las bacterias utilizan la 'verificación de quorum ' en : el proceso de formación del viscoso biofilm que forma las placas de los dientes la regulación de la división la formación de esporas. Investigadores de la Universidad de Princenton identificaron un autoinductor, el AI-2 (AutoInducer 2) que posee la potencialidad de mediar la comunicación en diferentes especies bacterianas y postularon la existencia de un mecanismo común empleado por las bacterias en ambientes naturales. La identificación química del AI-2 se realizó mediante cristalografía de Rayos X y llevó, entre otras, a la conclusión de que se trataba de un derivado de 4,5-dihidroxi-2,3pentanodiona y que, esto es lo novedoso, en su forma cíclica es un sustrato plausible para la adición de borato. Los estudios de densidad electrónica del AI-2 indican que se trata de un furanosil borato diester y representa el primer rol bioquímico definido para el Boro en sistemas biológicos.

Citoplasma bacteriano Membrana plasmática bacteriana La estructura de la membrana bacteriana es similar a la de plantas y animales, es por ello que se habla para ellas de una "membrana elemental ". Puede aislarse utilizando lisozima mediante shock osmótico. Esta compuesta primariamente de proteínas y fosfolípidos (cerca de 3:1). Realiza numerosas funciones que incluyen las de transporte, biosíntesis y transducción de energía. es la barrera osmótica de la célula es sede de los sistemas de transporte activo y de las permeasas específicas en la membrana (o junto a ella) se encuentran las enzimas y componentes del transporte de electrones y fosforilación oxidativa (recordemos que en eucariotas las mismas están en las mitocondrias) allí se realiza la síntesis de componentes de la pared celular y de las cápsulas lugar de excreción de exoenzimas sede del centro de replicación del ADN punto de anclaje de los flagelos Las membranas procarióticas, a diferencia de las de eucariotas, carecen de esteroles (excepto Oxyphotobacteria, ciertas bacterias metilotrofas y los Mollicutes). Pero en cambio, en muchas bacterias existe una peculiar clase de compuestos policíclicos, denominados hopanoides (triterpenoides pentacíclico) que parecen condicionar parte de la rigidez de las membranas citoplásmicas.

En arqueobacterias, que presentan en lugar de los habituales lípidos a base de ésteres de ácidos grasos con glicerol, existen lípidos a base de éteres de alcoholes de cadena larga con glicerol (p. ej., difitanil-glicerol-diéteres).Los alcoholes suelen ser derivados poliisoprenoides. Este tipo de membranas son más rígidas que las de eubacterias.

Citoplasma Bacteriano Esta limitado por la membrana citoplasmática, y en el se encuentran las inclusiones celulares. En un principio considerado una "solución" homogénea de proteínas, los métodos de fraccionamiento acoplados a los estudios bioquímicos y de microscopía electrónica mostraron la complejidad del sistema. En realidad esta atravesado por numerosas membranas que lo compartimentalizan, si bien esta compartimentalización no es tan desarrollada como en eucariotas. Si se homogeneizan células bacterianas y luego se las centrifuga a 100.000 g se separa en el fondo del tubo de centrifuga una fracción "particulada" que contiene los ribosomas y las membranas con los ácidos nucleicos, y una fracción "soluble" que contiene proteínas, y los ácidos ribonucleicos solubles ( tARN y mARN). Neisseria gonorrhoeae (dos célula dividiéndose, n=nucleoide)

Membranas intracitoplasmáticas En muchas bacterias la membrana rodea al citoplasma sin pliegues ni invaginaciones, en otras está invaginada y atraviesa el citoplasma (bacterias fototrofas como Chromatium o Rhodospirillum). El crecimiento e invaginación de la membrana citoplasmática rellena la luz de las bacterias fotosintetizadoras originando tubos y vesículas (cuando se rompen las bacterias aparecen como vesículas aisladas que reciben el nombre de "cromatóforos"). En otras bacterias fotosintetizadoras las vesículas están aplanadas y se apilan ordenadamente y, al igual que en las vesículas de los cloroplastos de las plantas verdes, se denominan tilacoides. Las membranas fotosintetizadoras son similares a la citoplasmática y en ella se encuentran las bacterioclorofilas y los carotenoides que intervienen en la fotosíntesis. También se encuentran aquí los componentes del sistema fotosintético de transportes de electrones y de la fosforilación.

Los ribosomas Los ribosomas son las estructuras celulares donde se sintetizan las proteínas. Se encuentran en el citoplasma bacteriano y al microscopio electrónico se presentan como partículas de unos 16 x 18 nm. Un ribosomas de E. coli es una ribonucleoproteina con una masa de 2700 kd, un diametro aproximado de 200 Å. Los 20,000 ribosomas de una célula bacteriana constituyen cerca de una cuarte parte de todo su volumen. Los ribosomas no disociados

tienen una velocidad de sedimentación en una ultra centrífuga de 70 S. Los ribosomas pueden disociarse en una subunidad grande (50S) y una subunidad pequeña (30S)que unidas forman el ribosoma 70 S.

Subunidades ribosómicas (A) 30S, (B) 50S, y (C) 70S Debe destacarse que los ribosomas de las organelas eucariotas (mitocondrias y cloroplastos) tienen 70 S, es decir son similares a los de los procariotas. (ver La hipótesis endosimbiótica del origen eucariota). El número de ribosomas depende de la velocidad de crecimiento de la célula ( > velocidad mas ribosomas) y oscila entre 5.000 a 50.000 / célula. En la constitución del ribosoma intervienen proteínas y ARNr (r por ribosómico), del 80 al 85% del ARN bacteriano está en los ribosomas. Son la parte principal ("core" ) de los ribosomas y posiblemente la clave del mecanismo de traducción de las proteínas. Se conocen tres tipos : 5S y 23S pertenecientes a la unidad 50S y el 16S de la unidad 30S , su estudio comparativo llevó a postulación de un Árbol Filogenético Universal. Durante la síntesis proteica en las microfotografías electrónicas se observan cadenas de ribosomas ordenados regularmente. Se trata de ribosomas alineados a lo largo del filamento de ARNm ( m por mensajero, los polirribosomas o polisomas Los ribosomas citoplasmáticos de los eucariotas tienen una velocidad de sedimentación mayor: 80 S. Esta diferencia entre los ribosomas de las bacterias (70 S) y de los eucariotas (80 S) constituyen para ellas (si, nosotros somos eucariotas) un "talón de Aquiles" ya que algunos antibióticos interfieren en algún punto de la síntesis proteica que procesan los ribosomas 70 S (ver Tabla siguiente), y no la afectan cuando se trata de ribosomas 80 S. Inhibición de la síntesis proteica por antibióticos en procariotas Antibiótico Punto de acción Eritromicina Función de la subunidad 50 S Tetraciclinas Anclaje del ARNt a los ribosomas Estreptomicina Unión de los aminoácidos Cloranfenicol Incorporación de aminoácidos a las proteínas

La hipótesis endosimbiótica del origen eucariota Posiblemente la simbiosis bacteriana con un eucariota primitivo fue la principal etapa en la evolución de la célula eucariota. En 1980, Lynn Margulis propuso la teoría de la endosimbiosis para explicar el origen de la mitocondria y los cloroplastos. De acuerdo a esta idea un procariota grande o quizás un primitivo eucariota fagocitó o rodeo a un pequeño procariota hace unos 1500 a 700 millones de años.

Esquema del probable proceso de fagocitosis que dio origen a la endosimbiosis. Modificado de: http://whfreeman.com/life/update/chap04.html.

En vez de digerir al pequeño organismo el grande y el pequeño entraron en un tipo de simbiosis conocida como mutualismo en el cual ambos se benefician y ninguno es dañando. El organismo grande gana un excedente de ATP provisto por la "protomitocondria" o un excedente de azúcar provisto por el "protocloroplasto", y proveyó al recién llegado de un medio ambiente estable y de material nutritivo para el endosimbionte. Con el tiempo esta unión se convirtió en algo tan estrecho (la función regeneradora de ATP se delegó a los orgánulos celulares) que las células eucariotas heterotróficas no pueden sobrevivir sin mitocondrias ni los eucariotas fotosintéticos sin cloroplastos (la membrana que rodea al protoplasto del eucariota no dispone de los componentes de la cadena de transporte de electrones), y el endosimbiota no puede sobrevivir fuera de la célula huésped. La división de mitocondrias y cloroplastos es muy similar a la de los procariotas. Sin embargo los orgánulos celulares, tal lo señalado, no son independientes a pesar de contener su propia molécula de ADN. Una parte de la información necesaria para la síntesis de sus proteínas se encuentra en el núcleo del eucariota. Como ejemplo citemos aquí la ribulosa-bifosfato carboxilasa el enzima clave de la fotosíntesis. Consta de 8 subunidades grandes y de 8 subunidades pequeñas. La información de las subunidades grandes se localiza en el ADN del cloroplasto, la de las pequeñas en el núcleo celular. Resumiendo, según la hipótesis endosimbiótica las mitocondrias proceden de bacterias aeróbicas incoloras y los cloroplastos, de cianobacterias, que entraron en una relación endosimbiótica con una célula eucariota primitiva.

La Pared bacteriana Cubiertas superficiales Las cubiertas que rodean la célula bacteriana se han identificado por medio de técnicas de tinción en microscopía óptica y electrónica, y técnicas de aislamiento y caracterización bioquímica de los componentes celulares. Las principales cubiertas son: cápsulas y limos la pared celular de las bacterias Gram-positivas la pared celular de las bacterias Gram-negativas la membrana plasmática los mesosomas (invaginación de la membrana plasmática) La relación topográfica entre la pared celular y la membrana plasmática se observa en la microfotografía electrónica de Micrococcus lysodeikticus (A) y de Bacteroides melaninogenicus (B).

A. Microfotografía electrónica de la bacteria Gram positiva Micrococcus lysodeikticus mostrando la gruesa capa de peptidoglicano que conforma la pared celular (cw), por debajo de ella la membrana plasmática (cm), un mesosoma(m), y el nucleoide (n). B. Célula bacteriana procesada mostrando la línea de fractura entre la membrana citoplasmática (m.i.) y la pared celular (m.e.). Barra = 1 µm.

Tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas poseen una pared celular de peptidoglicanos que les confieren su forma característica y les provee de protección mecánica. Dos grupos de bacterias carecen de pared celular: los Mycoplasma que poseen solamente membrana celular las formas L derivadas de bacterias que perdieron su habilidad de sintetizar su pared celular

La pared celular bacteriana rodea al protoplasto. La pared bacteriana es permeable a las sales y a muchas sustancias de bajo peso molecular. No es rígida sino elástica como el "cuero" de una pelota de fútbol, el protoplasto bacteriano confiere una cierta rigidez al conjunto protoplasto + pared que lo rodea, derivada de su presión interna o turgencia (al igual que la cámara hinchada de la pelota). La presión interna del protoplasto esta determinada osmóticamente. Se debe tener en cuenta que la membrana citoplasmática es la verdadera barrera osmótica (es semipermeable y controla la entrada y salida de sustancias a la célula).

La pared celular y la plasmólisis

La semipermeabilidad de la membrana citoplasmática y la permeabilidad de la pared celular originan, entre otros, el fenómeno de plasmólisis. Este fenómeno se observa cuando la tonicidad del medio externo es mayor que la del protoplasto (medio hipertónico) en estas condiciones el agua sale del protoplasto y este se encoge por lo que la membrana citoplasmática se separa de la pared.

La pared celular y la coloración de Gram La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tinción de Gram (1884). La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta coloración es un criterio de clasificación importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Unos pocos organismos son Gram-variables. Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma cantidad de cristal violeta (CV) e iodo (I). El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro de la célula Gram positiva por la deshidratación y la reducción del tamaño de los poros de la pared resultante del proceso de lavado con solvente. En contraste en las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no impide la extracción por el solvente del complejo. Avala lo antedicho el hecho que, si después de su tinción se tratan con lisozima bacterias Gram positivas, se ve que los protoplastos siguen teñidos, pero pierden el colorante si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas es la que impide la extracción del colorante. Corroborando esta suposición se observa que cuando Bacillus subtilis emerge de su espora su pared celular esta "inmadura" y se comporta como Gram negativa. Cuando la pared celular adquiere su estructura final pasa a ser Gram positiva.

La pared bacteriana: Estructura Química

El esqueleto de la pared celular bacteriana está constituido por un heteropolímero, el peptidoglicano mureína. El mismo, y las enzimas que intervienen en su síntesis, son una característica general de todas las eubacterias. Las arqueobacterias no poseen mureína.

Esta macromolécula esta formada por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina (NAG) y el ácido N-acetilmurámico (NAM) unidos mediante enlaces ß-1,4. La cadena es recta y no ramificada, constituyendo la estructura básica de la pared celular (su "backbone"). El ácido N-acetilmurámico es un éter resultante de la unión del oxhidrilo del C3 de la molécula de N-acetil-glucosamina con el oxhidrilo del ácido láctico. El grupo ácido del láctico enlaza con una pequeña cadena peptídica. Entre los aminoácidos típicos de esta cadena se encuentran la L-alanina, ácido D-glutámico, ácido mdiaminopimélico o la L-lisina o D-alanina. Los diaminoácidos al tener dos grupos amino pueden formar enlaces peptídicos con aminoácidos dicarboxílicos de otra cadena. A través de estas uniones peptídicas se unen entre sí las cadenas de heteropolímeros formando una molécula gigante, el sáculo de mureína.

Representación esquemática de los peptidoglicanos

Debemos destacar lo siguiente: Las formas D de la Alanina y del ácido glutámico no se presentan en las proteínas de los eucariotas. Tampoco en dichas proteínas se encuentra el ácido m-diaminopimélico. La secuencia alternante de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico no se encuentra en eucariotas Estas características estructurales hacen que las bacterias (al igual que con la diferencia en los ribosomas) presenten un "talón de Aquiles" susceptible de ser utilizado en su contra por los fármacos de la terapia medica. Los agentes terapéuticos que actúan en el ámbito de la pared celular bacteriana y tienen como "blanco" las enzimas involucradas en su síntesis son en gran medida inocuos para el organismo eucariota sometido a una agresión bacteriana (las "balas mágicas" visualizadas por Paul Erlich).

La pared celular de las bacterias Gram positivas Sus principales características son: La red de mureína esta muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas Los aminoácidos implicados varían de una especie a otra. La constitución del esqueleto es característica de la especie y constituye una buen parámetro taxonómico Es frecuente la presencia de los aminoácidos L-diaminopimélico o de lisina Los polisácaridos están unidos por enlaces covalentes (en el caso de tenerlos) Su contenido proteico es bajo. En ella se encuentran ácidos teicoicos

La pared celular de las bacterias Gram negativas La red de mureína presenta una sola capa La constitución del saco de mureína es igual en todas las bacterias Gram negativas. Contiene siempre únicamente meso-diaminopimélico Nunca contiene lisina No se encuentran puentes interpeptídicos. Se encuentran grandes cantidades de lipoproteínas y lipopolisacáridos que representan hasta el 80 % del peso seco de la pared celular. Para mantener la estabilidad de las capas de lipopolisacáridos es necesario el ión Ca++. En las bacterias Gram negativas la capa de mureína puede ser atacada por la lisozima cuando se las trata con EDTA (Etilen-diamino-tetracético). Este agente, al quelar el Ca++ libera una parte de los lipopolisacáridos y permite la acción de la enzima.. Hasta ahora no han podido demostrarse ácidos teicoicos.

Acción de la lisozima y la penicilina Un viejo refrán dice que Dios llama a la puerta de un hombre solo una vez en la vida. No es el caso de Sir Alexander Fleming a la de él llamo dos veces (o más), aunque es necesario coincidir que no es suficiente con el llamado, amén de él, es necesario escuchar y responder. Según se cuenta el descubrimiento de la lisozima tuvo lugar cuando las lagrimas de un niño (que estaba en el laboratorio donde trabajaba Fleming), caen en un tubo y aclaran una suspensión Micrococcus lysodeikticus, que, hoy se sabe, es la bacteria mas sensible a la lisozima, ma siii.... Este hecho esta un poco menos difundido que la novelesca historia de la espora de Penicilium que entro por la ventana del laboratorio de Fleming, cayo en una placa de Petri y al crecer puso de manifiesto la acción bactericida del antibiótico que llamo penicilina....( Florey y Chain en Oxford la aislaron, dieron las pautas de su producción industrial y al hacerlo pusieron en marcha la era de los antibióticos, por ello, Fleming , Florey y Chain recibieron el premio Nobel en 1945 ) La lisozima descubierta en 1922, es una enzima que rompe el enlace beta glucosídico de la mureína. Se la encuentra en el líquido lagrimal, secreciones nasales y en la clara de huevo. También se la ha aislado de bacterias y bacteriófagos. La acción de la lisozima se pone en evidencia por un aclaramiento rápido de una suspensión bacteriana, Micrococcus lysodeikticus ya se lisa con 1 ug de lisozima / ml. Para lisar otras bacterias p.e Bacillus megaterium se necesitan 50 ug / ml . La capa de mureína de muchas bacterias Gram negativas solo es atacada por la lisozima cuando se añade EDTA (Etilen-diaminotetracético). El mecanismo de lisis es el siguiente: la destrucción de la pared celular deja al protoplasma de las bacterias rodeado únicamente por la membrana celular ("protoplasto"), lo cual convierte a la bacteria en un organismo extraordinariamente sensible a las variaciones de tonicidad del medio, esta es la base del fenómeno de aclaración que tiene lugar luego de la acción de la lisozima, cuando la solución es hipotónica.

Los protoplastos son estables en medios hipertónicos e isotónicos; en medios hipotónicos, tal lo señalado, estallan y dejan restos de membrana citoplasmática llamados "fantasmas" (ghosts). El proceso de síntesis de la pared celular comienza en el citoplasma bacteriano, a partir de N-acetilglucosamina-1-fosfato que se une al UDP (uridin difosfato). El UDP se combina con la N-acetilglucosamina-1-fosfato, para dar UDP-Nacetilglucosamina que primero forma el éter láctico y luego en sucesivos pasos enzimáticos se unen al mismo los cinco aminoácidos para formar el N-acetilmurámico.

En el siguiente paso, que ocurre en el ámbito de la membrana citoplasmática la molécula que es hidrófila cambia a lipófila, lo cual facilita su transporte, por el cambio del UDP por undecaprenil-fosfato y el agregado de un pentapéptido de glicina a nivel de la L-lisina

En la siguiente fase, en el ámbito de la pared celular, se produce la transglucosidación y formación del enlace beta alargando de esta manera la molécula. Los enlaces transversales entre moléculas del polímero se produce por transpeptidación, se libera una D-alanina y el grupo carboxilo se une a un grupo amino de la lisina de otro oligopéptido, también se libera el undecaprenil-fosfato. La penicilina interfiere en este ultimo paso, es decir impide la unión transversal o puente interpeptídico pero no la elongación del polímero. De la misma manera actúan las cefalosporinas, vancomicina, bacitracina y cicloserina. Debe notarse que la síntesis de la pared no se realiza cuando no hay lisina disponible o cuando se impide la racemización de la L-alanina y por lo tanto la disponibilidad de la D-alanina por efecto de la c-clicoserina (oxamicina).

La membrana externa

En la bacterias Gram negativas se observa por fuera del saco de mureína una capa semejante a la membrana celular por lo que se ha dado en llamarla membrana externa, es de composición compleja y en ella intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. Cumple funciones mecánicas y fisiológicas. En esta bicapa lipídica (compuesta por el lípido A del lipopolisacárido en su parte externa y los fosfolípidos en la interna) se encuentran proteínas que la atraviesan en todo su espesor y que delimitan poros (por eso se denominan porinas) hidrófilos que permiten el paso de sustancias hidrófilas de bajo peso molecular. No se encontraron sistemas de transporte activo.

La membrana externa se encuentra unida al peptidoglicano a través de la proteína conocida como lipoproteína de Braun cuya parte lipídica se encuentra en la membrana y la proteína unida covalentemente a la mureína. de la membrana. La membrana externa tiene unos puntos de contacto con la membrana interna que se denominan uniones de Bayer y que se supone son importantes en el transporte a través de la membrana. ESPACIO PERIPLÁSMICO En las bacterias Gram negativas el espacio que va desde membrana plasmática a membrana externa (ver figura abajo) se denomina espacio periplásmico, tiene aparentemente una consistencia gelatinosa. En numerosas bacterias contiene abundantes enzimas, por ejemplo aquellas que inician la degradación de substratos como la glucosa, o la transformación de compuestos inorgánicos como los nitratos. También se encuentran las depolimerasas que actúan sobre los biopolímeros (proteasas, polisacaridasas, nucleasas y otros). Otras enzimas importantes presentes en el espacio periplásmico son las b-lactamasas responsables de la destrucción de los antibióticos b-lactámicos y, por tanto, de la resistencia de ciertas bacterias a ellos. Asimismo se encuentran allí sensores químicos destinados a detectar variaciones ambientales. Algunas de estas enzimas están libres y otras ligadas a la membrana citoplasmática. En las bacterias Gram-positivas no hay, en realidad, espacio periplásmico; pero pareciera que la parte más interna del peptidoglicano puede desarrollar una función similar reteniendo mediante fuerzas electrostáticas moléculas de enzimas equivalentes a las periplásmicas de las Gram-negativas.

Los lipopolisacáridos Los lipopolisacáridos con una estructura característica se encuentran en la capa externa, a diferencia de la membrana plasmática los forman: La parte glucosídica corresponde a dos molécula de N-acetilglucosamina (es, para ponerlo en un nombre mas largo una glucosaminadisacárido, es la estructura equivalente al

glicerol de los fosfolípidos) sus grupos hidroxilos están esterificados por ácidos grasos C12, C16, C18, que al ser hidrofóbicos se orientan hacia el interior. Se lo conoce como lípido A

unida a ellas y proyectándose al exterior se encuentra una cadena glicosídica. Esta cadena posee una zona central R y a ella le sigue extermamente la cadenas heteropolisacárida Oespecifica que representa a los antígenos somáticos. La función del lipopolisacárido en las bacterias es la de incapacitar las defensas del huésped, proporcionar carga negativa a la superficie de la membrana y estabilizarla. Constituyen una de las endotoxinas más activas de las bacterias, son fuente de origen de fiebre, diarrea y provocan una fuerte respuesta inmune, siendo uno de los agentes responsables del llamado «shock endotóxi producido cuando las células del sistema inmune entran en contacto con él. Tienen gran importancia en el diagnóstico bacteriológico y en la identificación de infecciones. Distintas cepas se diferencian entre sí por las llamadas cadenas laterales O específicas ya señaladas, hecho que puede ponerse de manifiesto por métodos inmunológicos. Las células bacterianas crecen sobre agar generalmente como colonias lisas y brillantes denominadas formas S (por smooth= lisos); la superficie regular contiene mucha agua debido a la presencia de las cadenas polisacáridas O-específicas. Estas formas lisas mutan espontáneamente a formas que crecen como colonias planas y rugosas, denominadas formas R (por rough = rugoso). Cuando invaden un organismo, la presencia de esas cadenas de polisácaridos dan a las bacterias S una ventaja selectiva al ser más resistentes a la fagocitosis por los leucocitos y por ello más virulentas. Hasta que el hospedador no forme anticuerpos y éstos se unan a los polisácaridos, las bacterias no son atacables, la gran variedad de polisacáridos O-específicos en bacterias patógenas puede deberse a una selección de tipos O-antigénicos (mutantes) nuevos cada vez; tienen por tanto una ventaja en el desarrollo, porque el hospedador no puede disponer simultáneamente de los anticuerpos contra cientos de antígenos.

Apéndices superficiales

Flagelos y pili En ciertas bacterias se pueden reconocer dos tipos de apéndices superficiales: los flagelos que son órganos de locomoción, y los pili (Latín: cabellos), conocidos también como fimbriae (Latín : flecos). Los flagelos se observan tanto en bacterias Gram positivas como Gram negativas, generalmente en bacilos y raramente en cocos. En contraste los pili se observan prácticamente solo en bacterias Gram negativas y solo escasos organismos Grampositivos los poseen. Algunas bacterias poseen tanto flagelos como pili.

A. Microscopía electrónica de células de Escherichia coli con tinción negativa mostrando flagelos

ondulados y numerosas estructuras, cortas mas finas y mas rígidas, similares a "cabellos", los pili. B. El largo pili sexual de Escherichia coli claramente distinguible de los pili comunes y más cortos.

Estructura La mayoría de las bacterias tienen como mecanismo de movimiento los flagelos que difieren estructuralmente de los flagelos eucariotas. Según el tipo de bacteria, los filamentos toman diferentes grosores (del orden de nanómetros) y longitudes (pueden alcanzar hasta 20 micrones). La flagelina, su proteína estructural esta compuesta por subunidades de bajo peso molecular, ordenadas de forma helicoidal a lo largo de un tubo axial. El flagelo se mueve por rotación a lo largo de su eje axial.

Estructura del Flagelo y la flagelina Recordemos que en el caso de los eucariotas poseen una distribución característica de microtúbulos cuando se observan en un corte transversal: 9 + 2. Los elementos motrices de los procariotas no presentan esta estructura. En algunos casos se los puede observar en campo oscuro, pero por lo general para verlos se necesitan métodos de tinción para microscopía óptica o la observación en microscopía electrónica. Los flagelos pueden eliminarse de la superficie celular sin afectarse la viabilidad de la bacteria, solo se vuelve temporariamente inmóvil pero luego de un tiempo sintetiza nuevos flagelos. El cloranfenicol, antibiótico que bloquea la síntesis proteica, impide la regeneración de los flagelos.

El flagelo bacteriano, una organela mótil, es un enorme complejo proteico, compuesto por unas 25 proteínas, que forman parte , ya sea de un anillo o una estructura filamentosa con decenas de miles de subunidades.

Bacteria politrica monopolar

Gancho y filamento flagelar

La estructura emerge desde la cara citoplasmática de la membrana celular hacia el espacio extracelular, desde donde el filamento helicoidal crece hasta alcanzar una longitud de unos 15 micrones. El ensamblaje del filamento procede desde la base a la punta del mismo, en una eficiente y bien regulada secuencia de eventos. Tal como se observa en el diagrama inferior, la flagelina es selectivamente exportada desde el citoplasma hacia el estrecho canal central de flagelo y, desde este punto progresa por el canal hasta el extremo distal donde es finalmente ensamblada. La "exportación" es mediada por un complejo proteico acoplado a la cara citoplasmática del motor. Este "aparato exportador de flagelina" utiliza energía derivada de la hidrólisis de ATP y es homólogo al sistema de secreción tipo III de las bacterias patógenas (por medio del cual se inyectan proteínas con efectos patogénicos a una célula receptora). Numerosas proteínas, llamadas "chaperonas" juegan un importante rol en la secreción "pegándose" a las moléculas secretoras en el citoplasma bacteriano, previniendo el plegado de las proteínas en conformaciones imposibles de secretar o, como en Shigella, impidiendo la asociación de las mismas antes de secretarse. Por otra parte parecen conducir proteínas hacia el aparato de secreción. El flagelo bacteriano existe en numerosas bacterias y también en arqueobacterias, esto último probablemente indica que la existencia del flagelo bacteriano es anterior al origen de las bacterias Gram negativas (donde por otra parte, fuera identificado el sistema de secreción tipo III).

Esquema del Motor flagelar y flagelo

Escala de tamaños

Diagramas basados en imágenes obtenidas del Protonic NanoMachine Group http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/en/seminar/09a.html Tal como se observa en el diagrama superior el "motor flagelar" se encuentra anclado en la membrana citoplasmática y la pared celular. Esta formado esencialmente por dos pares de discos o anillos, el par externo (anillo L y anillo P) se encuentra a la altura de la pared y membrana externa. El par interno (anillos S y M que conforman el "rotor") esta a la altura de la capa externa de la membrana citoplasmática. Su centro es el punto de partida del vástago que atraviesa pared celular y membrana externa. Al vástago se acopla una pieza (gancho) a su vez acoplada al filamento flagelar. La propulsión de la célula bacteriana esta dada por el giro en sentido contrario a las agujas del reloj de los discos (anillos) del motor, lo que causa la rotación del filamento. Este es el único caso (por lo menos que yo conozca.....) en que la naturaleza inventa la rueda y la acopla a movimiento traslativo.

El "motor flagelar" tiene solo de 30 a 40 nm de diámetro y sin embargo puede rotar de 20.000 a 100.000 rpm. Este "motor flagelar" es "alimentado" por el flujo de protones o iones sodio, que atraviesan un complejo de proteínas que conforman un "canal protónico", y que realizan la alimentación del motor flagelar. El flujo surge de las diferencias de concentración iónica existentes a través de la membrana citoplasmática (the proton or ion motive force) y la cantidad de corriente involucrada es de solo algunas decenas de fentoamperes.

Distribución de los flagelos La distribución de los flagelos es típica de las eubacterias móviles y tiene valor taxonómico. En un bacilo el o los flagelos se pueden insertar en uno de los polos (monopolar o monotrica), en ambos (bipolar o anfitrica) lateralmente, o en todo el contorno (peritrica).

Función Actúan a la manera de la hélice de un barco impulsando a la bacteria a través del medio. Su movimiento esta originado en los discos anteriormente señalados. La velocidad de rotación puede llegar a unas 3000 vueltas/minuto y alcanzar velocidades de desplazamiento tan altas como 12 milimetros/minuto (Vibrio cholerae). La capacidad de la bacterias de nadar por la acción de los flagelos provee el mecanismo para realizar movimientos dirigidos denominados taxias (movimientos en respuesta a atracciones o repulsas respecto a factores ambientales). La respuesta a los estímulos involucra a un sofisticado sistema sensorial que incluye receptores localizados en la superficie celular y la transmisión de la información a proteínas aceptoras de metilo que controlan el motor flagelar. Salmonella typhimurium atraída por el amino ácido serido en l apunta de un capilar(A) y repelidas por un tubo con fenol (B). Las fotos se tomaron 5 minutos después de que los capilares se introdujeron en el cultivo bacteriano

Las taxias de acuerdo al factor determinante de la misma se clasifican en: quimiotaxia, cuando reaccionan a estímulos químicos y se dirigen al lugar (o al extremo opuesto) donde se encuentra la sustancia. Las bacterias con esta taxia poseen quimioreceptores sensibles a la sustancia que la origina. aerotaxia, cuando se dirigen al lugar con la concentración de oxigeno adecuada a su metabolismo fototaxia, se presenta en las bacterias autotróficas que dependen de la luz para la obtención de energía magnetotaxia, es la capacidad de muchas bacterias de orientarse en un campo magnético y nadar en la dirección de las líneas de campo, las bacterias con esta propiedad contienen hierro en la forma de oxido de hierro ferromagnético o magnetita (mezcla de oxido de hierro II y III, Fe3 O4) y se lo encuentra en forma de gránulos (magnetosomas), cerca del anclaje de los flagelos. La existencia de magnetita en las "formas bacterianas" obtenidas del meteorito marciano ALH84001 constituye uno de los argumentos en favor de que las mismas corresponden a bacterias.

Antígenos O y H Proteus vulgaris posee una gran capacidad de movimiento que se traduce en la formación de una película, en alemán hauch, en una superficie de agar, de allí el nombre de formas H; en contraposición las cepas inmóviles (sin flagelos) no forman película, en alemán ohne hauch,de allí el nombre de formas O. De este fenómeno se generalizaron los términos de antígenos H (correspondiente a los flagelos) y de antígeno O (correspondiente al cuerpo, o somáticos) utilizados en métodos de diagnósticos serológicos .

Fimbrias y Pili Los términos pili y fimbriae usualmente son intercambiables, estos finos apéndices con apariencias de "pelos" están formados por proteínas llamadas pilinas. En apariencia son mas rígidos que los flagelos y, en algunos organismos (Escherichia coli y las especies de Shigella) están profusamente distribuidos en la superficie (hasta 200/célula). Son considerados factores de colonización por su importancia en los fenómenos de adhesión a la superficie de sus huéspedes. Características de algunas cepas bacterianas, tales como la Escherichia coli K12, cepa que posee el factor F (F+, Hrf, del ingles High frecuence of recombination), son unos pili muy largos (tubos proteicos huecos 0,5 a 10 um de longitud), que intervienen en la "reproducción sexual" de las bacterias, (recombinación).

Sustancias de reserva e inclusiones celulares Muchos microorganismos en determinadas circunstancias almacenan como materiales de reserva sustancias tales como: polisacáridos, lípidos, polifosfatos y azufre. Esto sucede cuando las sustancias de partida se encuentran en el medio, pero el crecimiento está limitado por la falta de nutrientes determinados o por la presencia de inhibidores. Los materiales de reserva se encuentran en la célula en forma osmóticamente inerte. Cuando es necesario, vuelven a ser metabólicamente activos y sirven como fuente de carbono y energía, prolongando la vida bacteriana en ausencia de aportes externos o bien permitiendo la formación de esporas.

Polisacáridos Entre los polisacáridos de reserva se han identificado (por su reacción con la solución de Lugol) moléculas de almidón (color azul) y glucógeno (color pardo), recuerde que a diferencia de los polisacáridos de la pared celular el monómero en este caso es alfa-Dglucosa y los enlaces en el polímero son alfa 1-4 glicosídicos. Una molécula similar al almidón distribuida en forma de pequeños gránulos se ha encontrado en Clostridium y se la denomino "granulosa". La presencia de glucógeno se ha demostrado en hongos, (entre ellos en levaduras), y enterobacterias (Salmonella, Escherichia etc.).

Lípidos Se presentan como gotitas o gránulos teñibles con el colorante Sudan Black B (y toman por ello el nombre de "sudanófilos"). En muestras sin teñir, observando con el microscopio óptico, se reconocen por su gran refringencia. En muchas bacterias están compuestos por un poliéster: el ácido poli-beta-hidroxibutírico (PHB),entre ellas las aeróbicas, las cianobacterias y en las fotótrofas anaeróbicas. Se acumula cuando las bacterias entran en la vía fermentativa del metabolismo y se reutiliza como fuente de energía en el metabolismo aeróbico. Se han encontrado, además, polímeros semejantes en los cuales intervienen también el ácido propiónico o el beta hidroxivaleriano, estos materiales obtenidos de cultivos de microorganismos están siendo utilizados como materia prima en fabricación de envases por la característica (a diferencia del polietileno) de ser biodegradables. Las levaduras y otros hongos almacenan lípidos en forma de grasas neutras, que en algunos casos (Candida, Rhodoturola) pueden constituir hasta un 80% del peso seco. Las micobacterias pueden contener hasta un 40% de ceras.

Polifosfatos Se encuentran en forma de "gránulos" constituidos en su mayor parte por polifosfatos lineales tipo sal de Graham, las primeras observaciones se realizaron en Spirillum volutans, de allí el nombre de gránulos de volutina, que también se conocen como gránulos metacromáticos por el cambio de color en la tinción con colorantes como el azul de

metileno. Estos polifosfatos permiten a la célula dividirse en ausencia de fosfato en el medio.

Azufre Muchas bacterias que oxidan sulfuro a sulfato almacenan azufre liquido en forma de esferas refringentes. El azufre pasa lentamente a la forma ortorrómbica. Algunas bacterias (Thiobacillus) utilizan como fuente energética los compuestos reducidos del azufre llevándolos a sulfatos. Algunas bacterias que como el Sulfolobus acidocaldarius, crecen en ambientes extremos como las fuentes termales ácidas ( crece a pH entre 2-3 y a temperaturas de 70 a 75 C), son capaces de oxidar el azufre elemental a ácido sulfúrico. S-- + 2 O2-----> SO4 -S + H2O + 1 1/2 O2------ > SO4 -- + 2 H+ S2O3-- + H2O + 2O2 --------> 2 SO4-- + 2 H+ Las bacteria rojas, fotosintéticas y anaeróbicas (Chromatium) utilizan SH2 como dador de hidrogeno. También se deposita azufre como producto de desintoxicación del SH2 del medio en las cianobacterias. En las profundidades marinas, en los limites entre las placas tectónicas donde aflora agua a 350 ºC, minerales y abundante SH2; en los lugares donde el afloramiento entra en contacto con el agua fría del mar pueden crecer bacterias oxidadoras de S o SH 2 que sirven de base alimentaria a moluscos, helmintos y cangrejos. Un tubícola Riftia pachyptila tiene un órgano adaptado para que vivan en forma simbiótica las bacterias oxidados del SH 2. La sangre suministra SH2 y oxigeno al órgano y las bacterias los productos de síntesis necesarios para el tubícola.

Cristales parasporales En Bacillus thurigensis y especies relacionadas se encuentran cuerpos de inclusión cristalinos junto a las esporas. Estos cristales parasporales están construidos por una protoxina, que al disolverse en el jugo digestivo de insectos sensibles ( oruga de mariposa) libera una toxina que mata a la oruga. Por ello se los usa en la lucha biológica contra estos parásitos. Recientemente (en el siglo pasado...) se obtuvo algodón transgénico por inserción del gen productor de la toxina (aislado de Bacillus thurigensis) en el genoma del algodón, de esta manera se pretende reducir la cantidad de insecticidas necesarios para el cultivo. La utilización de técnicas de recombinación genética en plantas destinadas al consumo humano abrió un debate mundial. Estamos ante una opinión pública altamente sensibilizada, gente preocupada por el impacto de ellas sobre la salud humana y el medio ambiente pero, hay que hacer notar que, sus

argumentos son utilizados para hacer "el caldo gordo" de grupos que los utilizan para mantener UNA AGRICULTURA SUBSIDIADA.

Vacuolas de gas Se las observa en muchas bacterias acuáticas a quienes dan la capacidad de modificar su peso especifico y por ello flotar en una capa determinada de agua, en la que encuentran condiciones optimas de crecimiento. En cianobacterias estan compuestas de grupos de cilindros de 75 nm de diámetro por 1 um de longitud. (Microbiological Reviews, Gas Vesicles, Anthony E. Walsby, Mar. 1994, p 94-144) no puede ser llenada por inflado, por lo tanto el espacio para el gas debe ser formado a medida que se forma la pared de la vacuola (que tiene unos 2 nm de espesor y es de naturaleza proteica) y se llena rápidamente de gas por difusión.

Endósporas y formas de persistencia Introducción Las endósporas bacterianas son formas de perdurabilidad de ciertos grupos de bacterias frente al calor, la desecación, la radiación y las influencias químicas. Contienen un genoma y toda la maquinaria metabólica esencial. La termorresistencia de las endósporas es una de sus principales características. Mientras que las bacterias o las formas vegetativas de las bacterias esporuladoras sometidas a 80 ºC durante diez minutos (pasteurización) mueren, las endósporas sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para eliminarlas son necesarias técnicas de esterilización. Esta característica permite un fácil método de aislamiento de las bacterias esporuladas, calentando el material donde se supone que existen esporas a 100 ºC durante 10 minutos mueren todas las bacterias y, seguidamente, las esporas sobrevivientes se hacen germinar y crecer en el medio de cultivo adecuado. Son formadoras de esporas las bacterias bacilares Gram positivas, entre ellas, las pertenecientes al genero Bacillus son aeróbicas y las del genero Clostridium anaeróbicas. Un aspecto interesante es que el contenido de GC de este tipo de bacterias es bajo, los clostridios contienen la menor proporción de GC de los procariotas: 22 al 27 %.

Características microscópicas Observadas con microscopía óptica muestran una gran refringencia. Esto es debido al elevado índice de refracción, resultante de las proteínas deshidratadas y concentradas en el pequeño espacio de la espora. Prácticamente toda la materia seca de la bacteria esta en la espora que posee un volumen igual a la décima parte de la bacteria que la origino. Se colorean en caliente con carlbolfucsina y no se decoloran cuando el frotis es lavado con etanol.

E: endospora que da al conjunto aspecto de clava o masa Las bacterias formadoras de esporas se caracterizan por la posición de la endoespora en la célula madre antes de ser liberada. La espora pude ser central, terminal o subterminal, y la célula original puede o no hincharse para acomodar la espora.

Espora de Bacillus megaterium . Cubierta de espora (SC), extremo germinativo (G) capa externa del cortex: (OCL) cortex: (Cx) pared celular (GCW), membrana plasmática (PM), y nucleoid (n)

Esporulación

Tal como se observa en el esquema, la esporulación comprende:

una división asimétrica (1), durante la cual el futuro protoplasto de la espora recibe el material nuclear correspondiente. A diferencia de una división común, el

estrangulamiento del protoplasto de la célula materna no es seguido por el de la pared celular entre los dos protoplastos hijos (2). a posteriori el protoplasto de la futura espora es rodeado por la membrana citoplasmática de la otra célula resultante de la división, siendo finalmente englobada por la misma (ver esquema). el resultado de este englobamiento es que la futura espora esta rodeada por dos membranas citoplasmáticas que intervendrán en la fase final de la espora sintetizando la membrana del protoplasto de la espora sintetiza hacia el exterior la pared celular la membrana del protoplasto procedente de la otra célula sintetiza hacia el interior el cortex de la espora, compuesto de un glucopéptido similar a la mureína pero con mayor cantidad de enlaces transversales. esta otra célula forma en algunos casos el exosporio, que rodea a la espora como una envoltura suelta. El material de las envolturas representa casi el 50% del peso seco de la espora madura. El proceso someramente descrito es uno de los fenómenos de diferenciación más complejos de la célula bacteriana. Entre las transformaciones químicas y físicas que acompañan a los cambios morfológicos destaquemos: concentración del material proteico en la zona de formación de la espora en razón de la concentración de material aumenta el índice de refracción de la zona utilización del material de reserva (poli-beta-hidroxibutírico, en anaerobios y polisacáridos en aerobios) para procesos de degradación y síntesis síntesis de ácido dipicolínico, especifico de las esporas, no se lo encuentra en las células vegetativas. Este ácido se combina en forma de quelato con iones Ca ++. Se localiza en el protoplasto de las esporas termorresistentes. se liberan por autolisis de las células maternas

Propiedades no presentan actividad metabólica gran resistencia al efecto del calor gran resistencia al efecto de las radiaciones gran resistencia al efecto de los productos químicos La resistencia a los efectos del calor se atribuye al bajo contenido de agua (aprox. 15%) y al contenido de ácido dipicolínico. La resistencia al efecto de las radiaciones se atribuye a la presencia de puentes disulfuro, resultante de la presencia de cisteína en las proteínas de la cubierta externa. La resistencia al efecto de los productos químicos debe atribuirse a la impermeabilidad que presenta en esos casos la cubierta de la espora.

Inducción En condiciones favorables los bacilos de las especies esporuladoras se reproducen indefinidamente en su forma vegetativa, la esporulación no es una fase obligada del ciclo de vida de la bacteria.

La formación de esporas se desencadena cuando faltan nutrientes o se acumula un exceso de productos del metabolismo celular. Puede inducirse la esporulación colocando las células en agua destilada, la cual se produce a expensas de las sustancias de reserva de la célula y, probablemente como consecuencia de la ausencia de sustrato en el medio. Avalando esta hipótesis, la formación de esporas no se produce si dentro de las cinco horas de puestas en agua destilada células vegetativas de Bacillus cereus, se agrega glucosa al medio. La presencia de manganeso en el agua suele favorecer la esporulación.

Germinación El proceso por el cual las esporas pasan a formar células vegetativas se denomina germinación. Ocurre cuando se las coloca en el medio adecuado y se requiere en muchos casos la disponibilidad, entre otros, de glucosa, aminoácidos y nucleósidos. Es posible elevar el porcentaje de esporas que germinan con un shock térmico. Entre los fenómenos de la germinación destaquemos: perdida de la resistencia térmica aparición de la respiración aparición de actividad enzimática excreción de ácido dipicolínico, péptidos y aminoácidos ruptura de las cubiertas y aparición del "tubo germinativo"(origen de la célula vegetativa) A este punto la pared celular de la célula emergente esta incompleta la coloración de Gram por lo tanto no es la definitiva hay permeabilidad a moléculas como el ADN (lo cual facilita fenómenos de transformación)

Viabilidad Cuando se las almacena en tierra seca se ha demostrado que permanecen viables al cabo de 50 años el 10% de numero original. Recientes hallazgos parecen indicar que en ciertas arqueobacterias (Bacillus sphaericus, Bacillus permians) bajo determinadas condiciones (inclusión en ámbar o cristales salinos) la viabilidad de las esporas es tan prolongada, que cabe la posibilidad de plantearse que las mismas puedan sobrevivir indefinidamente.

Cápsulas y Limos Cápsulas Se las puede visualizar por tinción negativa, por ejemplo suspendiendo las bacterias en tinta china, como las partículas de carbón no penetran las cápsulas, las mismas aparecen claras sobre un fondo oscuro, tal como se aprecia en el siguiente esquema: Estas cápsulas nos son vitales para las bacterias, pero le confieren ventajas comparativas ya que las hacen resistentes a la fagocitosis. Las delgadas capas de los neumococos se hinchan haciéndose visibles en presencia de anticuerpos específicos (reacción de Neufeld o de "hinchamiento"), fenómeno utilizado en su clasificación. En Streptococcus, Xhantomonas y Corynebacterium están compuestas esencialmente por polisacáridos, que contienen además de glucosa, ramnosa, ácido 2-ceto-3-desoxigalactónico, ácidos urónicos, y los ácidos pirúvico y acético, en Bacillus por polipéptidos (ácido poliglutámico).

Limos Leuconostoc mesenteroides transforma la sacarosa en dextrano, por un lado es un contaminante extremadamente molesto en el proceso de fabricación de azúcar donde la abundante espuma de los líquidos contaminados le valió el apodo de "bacteria del desove de las ranas" (vea en este clip el aspecto de un autentico desove de rana) y por el otro la base de la fabricación de dos productos de alto valor agregado: sustituto del plasma sanguíneo y gel para separaciones cromatográficas. La enzima que produce esta transformación es una exoenzima conocida como dextransacara (una hexosiltransferasa). Otra hexosiltransferasa, presente en Streptococcus salivarium y Streptococcus mutans transforma la sacarosa en levanos (polifructosa), estos se fijan en los dientes y constituyen la base para la producción de ácidos que favorecen las caries dentales. Los limos mantienen en grupos a las bacterias (Zooglea) o bien en películas superficiales como en Acetobacter aceti subsp. xylinum, en este caso el producto excretado es celulosa quien da la consistencia correosa que la llevó a ser conocida como "mycoderma aceti".

Pigmentos Introducción La síntesis de productos coloreados por parte de los microorganismos es una característica determinada genéticamente. Su formación en muchos microorganismos es dependiente de la presencia de la luz, composición del sustrato y la temperatura de incubación. Son metabolitos secundarios, algunos tienen propiedades antibióticas y, muchos microorganismos pigmentados producen antibióticos. Las especies coloreadas muchas veces son fácilmente reconocibles, por ejemplo: colonias rojas aisladas de un medio selectivo para Gram negativos lleva de inmediato a pensar en Serratia marcescens. Los pigmentos derivan de distintos productos químicos: carotenoides, pirroles y otros.

Funciones La presencia de pigmentos en las bacterias que medran en hábitats sometidos a la luz les confieren un efecto protector frente a la luz visible y el ultravioleta cercano. Los carotenoides se localizan en la membrana plasmática y protegen a la célula de la fotooxidación, su presencia confiere a las bacterias colores que van desde el tono amarillo al rojo, entre ellas los géneros Micrococcus, Corynebacterium, Mycobacterium y Nocardia entre las levaduras los géneros Rhodotorula, Sporobolomyces. El mecanismo por el cual la luz visible afecta a los microorganismos se basa en el fenómeno de fotooxidación, en presencia de oxígeno atmosférico algunos pigmentos celulares (flavinas, citocromos) actúan como fotosensibilizadores. Es posible explotar este fenómeno para eliminar bacterias patógenas utilizando colorantes vitales (p.ej. azul de metileno). La molécula de colorante absorbe energía lumínica y la cede al O2 pasándola de su estado normal a un estado excitado el cual inicia reacciones de oxidación en cadena que llevan a la muerte del microorganismo. Este tipo de colorantes se suele incorporar a la bebida de animales de los zoológicos o de criaderos donde se aprovecha su piel. En las bacterias fotosintetizadoras los pigmentos absorben luz con fines fotosintéticos, los carotenoides se localizan junto a las bacterioclorofilas en las membranas fotosintéticamente activas de los tilacoides o cromatóforos

Ejemplos

Pulquerrimina: pigmento rojo que contiene hierro en su molécula, es sintetizado por Cándida pulcherrima, levadura aislable de zumos de frutas, flores con néctar y el tracto gastrointestinal de las abejas. Prodigiosina: en medios que contengan hidratos de carbono medra frecuentemente una bacteria que llevaba el nombre de Bacterium prodigiosus o Micrococcus prodigiosus conocida también como " hongo de las hostias". Actualmente se la conoce como Serratia marcescens. Este pigmento de naturaleza pirrólica es de color rojo oscuro, muy parecido al de la sangre. Es el origen de una de las mas bellas catedrales y del mito de la profanación de la hostia (es largo busque Micrococcus prodigiosus.) Indigoina: pigmento azul derivado de las azaquinonas, es excretado al medio por Pseudomonas indigofera entre otros. Entre los colorantes fenacínicos el mas conocido es la piocianina producido por Pseudomonas aeruginosa. Los cultivos de Pseudomonas aeruginosa muestran una fluorescencia amarillo verdosa al ser examinado bajo tubos fluorescentes o lámpara ultravioleta, su origen esta en las pioverdinas cromopéptidos que aparecen cuando hay limitación de hierro, actúan como sideroforos que sirven para captar y transportar hierro al interior de la célula.

Nutrición bacteriana CONCEPTOS BÁSICOS Cualquier ser vivo, por su actividad vital (crecimiento, mantenimiento y reproducción) requiere continuos aportes de energía para reponer las pérdidas y, para que todo el sistema pueda funcionar. La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para los dos objetivos que comprende el metabolismo: 1. fines energéticos o catabolismo (reacciones de mantenimiento) 2. fines biosintéticos o anabolismo (reacciones plásticas ). Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del medio ambiente. Anteriormente señalamos los principales modos de captación y obtención de energía existentes en las bacterias. El estudio de la nutrición microbiana se puede desglosar en varios apartados: así, podemos considerar los tipos de nutrientes requeridos, los aspectos cuantitativos, e incluso podemos abordar los aspectos ambientales (en cuyo caso entramos dentro del campo de la Ecofisiología). Igualmente podemos estudiar la aplicación práctica de la nutrición bacteriana, que se plasma sobre todo en el diseño de medios de cultivo para manejar los microorganismos en el laboratorio. Es importante tener claros desde el principio una serie de conceptos y nomenclaturas relacionados con los principales tipos de nutrición bacteriana. Puesto que, como acabamos de ver, la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de

suministro de materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos "clasificaciones" de tipos de nutrición: Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden dividir en: 1. litotrofas (del griego lithos = piedra): son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH2 , S0, NH3, NO2-, Fe, etc.). 2. organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos, proteínas, ......). Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en: 1. autótrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas sencillas. Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la capacidad de utilizar una fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO 2. 2. heterótrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma inorgánica). Otros conceptos: autótrofas estrictas: son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica como fuente de carbono. mixótrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litótrofo, pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su metabolismo biosintético. Sean autótrofas o heterótrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg) micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...) En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgánicas y/o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles. El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofos capaces de usar amplia gama de fuentes orgánicas de carbono. A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición muy distintos, desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía, hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar más de 100 tipos de fuentes de C, incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos

alifáticos y cíclicos. De cualquier modo, entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa. En los heterótrofos- organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto del material celular -CH2O-) entran simultáneamente al: metabolismo energético (o catabolismo, donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras sustancias no totalmente oxidadas); metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular). Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3--, NH3, SO4=, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioautótrofos (o quimiolitoautótrofos): obtienen su energía de la oxidación de sustancias inorgánicas sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales. Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar del medio ciertos compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.

CLASES DE NUTRIENTES Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías: 1. universales: agua, CO2, fosfatos y sales minerales; 2. particulares 3. factores de crecimiento

NUTRIENTES UNIVERSALES El agua Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es: el principal constituyente del protoplasto bacteriano; el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas; un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas). Las fuentes de agua pueden ser: endógena: procedente de procesos de oxido-reducción; exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas.

Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria: Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben (respectivamente), de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas inasequibles a la bacteria. Los solutos disueltos en agua (p. ej. , sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo. La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como aW= PS/PW donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y PW es la presión parcial de vapor del agua destilada. ¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la aW = humedad relativa/100). Las bacterias tienen valores de aW normalmente entre 0.90 y 0.99. Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a 1. Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales, tienen aW de alrededor de 0.995. Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980. Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de 0.950. En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones arriba citadas: bacterias halófilas extremas, como la arqueobacteria Halobacterium, que habita lagunas hipersalinas; bacterias (y sobre todo, ciertos microorganismos eucarióticos como levaduras) sacarófilas, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares. El anhídrido carbónico (CO2) El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias: Las autótrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz (en el caso de las fotoautótrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos). Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía: CO2 + 4H2 ---------> CH4 + 2H2O ( DG'02NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi)

Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes: Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (En realidad existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S9-homocitrato) Componente II o nitrogenasa- reductasa, que posee átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se denomina a veces ferroproteína). Dos cosas llaman la atención de la ecuación anterior: Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al menos 18 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el dinitrógeno (N=N) es una molécula extremadamente inerte (su energía de disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de activación para transferirle 6 electrones. Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) "se pierden" en reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este "despilfarro", pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático. Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina, que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada dos electrones transferidos se hidroliza una molécula de ATP. La nitrogenasa-reductasa reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (=componente I), y le transfiere los electrones. Una vez reducida la molibdoferroproteína, ésta transfiere los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). Un aspecto muy importante del complejo nitrogenasa es su extrema sensibilidad al oxígeno, de modo que queda rápida e irreversiblemente inactivado por este gas. Ahora bien, esto no significa que la capacidad de diazotrofía esté relegada a bacterias anaerobias, ya que, la evolución ha "inventado" distintas estrategias para proteger a la nitrogenasa en fijadores aerobios como las cianobacterias que han confinado el sistema al interior de células con gruesas paredes (los heterocistos). Debido a lo "caro" que resulta fijar nitrógeno, no es extraño comprobar que este proceso esté regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de fuentes combinadas de nitrógeno (nitratos, amonio, aminoácidos): la actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado; ante N combinado, se reprime la transcripción de los genes codificadores de la nitrogenasa y demás funciones relacionadas (genes nif, fijadores de nitrógeno). La nitrogenasa es una enzima relativamente "inespecífica", ya que puede reducir otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como cianuros (N=C-) y acetileno (HC=CH). La reducción de acetileno a etileno sirve de base al método más usual de medir

la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción del acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa.

FACTORES DE CRECIMIENTO Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte o toda de una ruta biosintética. Ejemplos: las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico. Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos. En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas bacterias:

Factor o vitamina

Funciones principales

p-aminobenzoico (PABA)

Precursor del ácido fólico

Ácido fólico

Metabolismo de compuestos C1, transferencia de grupos metilo.

Biotina

Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2

Cobalamina (vitamina B12)

Reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de desoxirribosa

Niacina (ácido nicotínico)

Precursor del NAD; transferencia de electrones en reacciones redox

Riboflavina

Precursor de FAD y FMN

Ácido pantoténico

Precursor de la CoA

Tiamina (vitamina B1)

Descarboxilaciones; transcetolasas

Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina)

Transformaciones de aminoácidos y cetoácidos

Grupo Vitamina K, quinonas

Transportadores de electrones (ubiquinonas)

MEDIOS DE CULTIVO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano,

están acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo. Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un (os) determinado (s) microorganismo (s). Los medios de cultivo se pueden clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos: 1) Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos: Ejemplos: Extracto de carne Extracto de levadura Autolizado de levadura Peptona de carne o de soja Digeridos de caseína (de la leche). Digeridos de embrión de semilla de algodón Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos nutrientes. 2) Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas. 3) En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores, denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas. Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos elaborar dos tipos de "versiones", según su estado aparente: medios líquidos medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solución.

En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se licua), y además, muchas bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina. El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100 oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesófilas. Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautótrofos) se suele recurrir a un gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice. Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al igual que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de clases prácticas:

Concentración de iones hidrógeno El establecimiento de un pH inicial óptimo y en muchos casos su mantenimiento durante el crecimiento es de gran importancia, sobre todo para aquellos microorganismos que a pesar de producir ácidos no los toleran. La mayoría de los microorganismos desarrolla a pH 7 (Alcaligenes, Pseudomonas), tan solo unos pocos lo hacen a valores de pH bajos por lo cual se denominan acido tolerantes (Lactobacillus, Acetobacter) o realmente acidófilas (Thiobacillus, Sulfolobus, Helicobacter) que medran a pH alrededor de 2, la figura que sigue muestra un esquema de distribución de preferencias de algunas bacterias.

Temperatura: Los microorganismos presentan distintos comportamiento en cuanto a temperatura requerida para su incubación. La mayoría de las bacterias del agua o del suelo son mesófilas crecen entre 20 oC y 42 oC. Otros comportamientos en referencia la temperatura son: psicrófilo, por debajo de 20 oC; termófilo: entre 40 y 70 oC; termófilos extremos: por encima de los 70 oC; hipertermófilos: por encima de 80 y 100 oC. La figura muestra algunos ejemplos de bacterias que crecen a diferentes temperaturas.

RELACIONES DE LAS BACTERIAS CON EL OXÍGENO Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno: Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas. Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas). Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales). Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa y peroxidasa. Por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno. (Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias metanogénicas). Anaerobias aerotolerantes: Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes.

Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones. Ejemplos son las enterobacterias como Escherichia coli.

Algunos tipos de medios de cultivo Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas). Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio. Ejemplos: en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de ciertas fuentes de carbono. El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la capacidad (y el tipo) de hemólisis de ciertas bacterias. Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales. P. ej., el agar de MacConkey, que el alumno manejará en los prácticos. Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal. Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal, y también contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las Enterobacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio. En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo. Cultivos sobre soporte sólido inerte

Desde hace un tiempo estamos utilizando en la cátedra un soporte poroso inerte las "perlitas" material que tiene la característica de ser barato, fácilmente esterilizable y con una gran capacidad de retención de líquidos en sus oquedades lo cual permite variados cultivos.