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• Greycy Ventura

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PRACTICA N°2 “PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO” INTRODUCCIÓN: Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:  Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.  Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.  De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:  Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.  Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.  Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

 Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:  Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.  Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.  Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada.  Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.  ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor. Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15ºC. Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0ºC porque se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft). Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.

FUNDAMENTO: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en la autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: 1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales. 5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos. 6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.fosfatos bisódicos o bipotásicos. 7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio. 8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej. cisteína y tioglicolato. 9. Agentes selectivos: sustancia como el cristal violeta, las sales biliares, etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO. POR SU CONSISTENCIA:  Sólidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada).  Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.

POR SU COMPOSICIÓN:  Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.  Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.  Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.  Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee. LA ESTERILIZACIÓN Se utilizan dos tipos principales de esterilización:  Por MÉTODOS FÍSICOS (calor, filtración, radiaciones).  Por MÉTODOS QUÍMICOS (empleo de soluciones químicas). Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso del calor húmedo. La autoclave es un aparato que permite elevar la presión y la temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullición del agua. Normalmente, se lleva la presión a 1 atmósfera (por encima de la ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126ºC, manteniéndolo en estas condiciones durante 20 minutos. Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc.) se esteriliza con calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato más empleado (se somete a temperaturas de 140-180 ºC durante 2h-3h).

OBJETIVOS:  Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos.  Manejar los instrumentos de uso rutinario, en el laboratorio de microbiología.  Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de medios de cultivo deshidratados.  Conocer los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso común en Microbiología.

MATERIALES:

 Balanza analítica  Luna de reloj  Matraz  Varilla  Autoclave  Agar plate count  Agua destilada

PROCEDIMIENTO: 1. Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo agar Plate Count 2. Pesarnos la cantidad exacta de medio (1.175 g) de agar Plate Count en una luna de reloj. 3. En un matraz agregamos 50 ml de agua destilada y también agregamos el agar (Plate Count) pesado. 4. Agitamos con la varilla desapareciendo algunos de los grumos. 5. Tapamos y llevamos a la autoclave.

RESULTADO: MEDIO DE CULTIVO: Plate Coun CANTIDAD PREPARADA: 50ml CANTIDAD PESADA: 1.175 g CÁLCULOS:

23.501000 X 50 X=1.175

AGAR Plate Count (APC) Medio de cultivo sólido, de identificación de organismos heterotróficos (aerobios mezofilos), recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. También es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas. RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS Método de recuento en placa (SPC): determina células viables en un alimento 1. 2. 3. 4.

Método: Recuento por siembra de inclusión. Siembra en caja de Petri vacía. Añade muestra, añade medio, homogeniza. Todas las células forman una colonia y todas las colonias nacen de una célula. 5. Grado de contaminación de alimento en cualquier proceso de producción. COMPOSICION

MODO DE ACCION DEL INGREDIENTE

Caseína enzimática hidrolizada 5.0 gr

Agar Plate Count

Extracto de levadura 2.5 gr Dextrosa 1.0 gr Agar 15.0 gr

Caseína enzimática hidrolizada: Provee aminoácidos y otros complejos de sustancias nitrogenadas Extracto de levadura: Provee complejo de vitamina B. Trifenil cloruro de tetrazolio (TTC): Ayuda al reconocimiento de las colonias de microorganismos debido a la formación del colorante rojo insoluble (TTC es reducido)

pH final 7.0 +/- 0.2

DISCUSIÓN: Dentro del marco de discusión podemos Destacamos el resultado positivo sobre los medios de cultivo, ya que en él aplicamos toda la teoría estudiada en la clase, es decir, los diversos modos de cultivo fueron necesarios para hacer comparaciones entre ellos, y de esta manera definir el que se acomodaría de mejor forma a la práctica que elaboramos.

Agar Nutritivo

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes. Características del medio: ámbar claro a medio ligeramente opalescente. Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona Extracto de carne Cloruro de sodio Agar

Instrucciones 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua 3.0 destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. 8.0 Calentar suavemente agitando 1 o 2 minutos 15.0 hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos pH final: 7.3 0.2

CONCLUSIÓN:  En esta práctica se aprendió la importancia de preparar medios de cultivo, los distintos tipos de cultivos que pueden desarrollarse en el laboratorio, así como su clasificación, sus características principales, los distintos tipos que pueden servir para identificar diferentes bacterias, así como las condiciones que estos deben de reunir.  Mediante el desarrollo de la práctica definimos, estudiamos y aplicamos los procedimientos que se deben realizara para la elaboración de un medio de cultivo, es claro que esto es referido para con la unidad que estamos estudiando, microbiología.

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la importancia de conocer el tipo de medio para el aislamiento de microorganismos? Para que podamos diferenciar la gran variedad de tipo de agares y poder emplearlos correctamente en las muestras que queramos utilizar para así presencia de microorganismos en una muestra y su posterior identificación 2. ¿ Por qué algunos medios de cultivo no necesitan ser llevados a autoclave? Porque algunos de sus componentes se degradan con la temperatura de autoclave. Además si es un medio altamente selectivo, es hipersalino y con pH muy alcalino. Solamente sobreviven bacterias halo y alcalinotolerantes, como las bacterias del género Vibrio, así que no se necesita esterilizar porque su riesgo de contaminación es muy bajo. En todo caso, el agua que agregas para hacer el medio, debe ser destilada y estéril, y prepararla en un matraz previamente esterilizado. 3. Averiguar sobre el método petrifilm 3M Las placas Petrifilm contienen un medio de cultivo selectivo listo para usar: Violeta Rojo Bilis (VRB), un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador de tetrazolio que facilita la enumeración de colonias. El film superior atrapa el gas producido por la fermentación de la lactosa por los coliformes totales, y también coliformes termotolerantes (fecales). El tiempo y la temperatura de incubación, así como la interpretación, varía según el método seguido. Las placas Petrifilm pueden leerse con un contador de colonias standard u otra lente de aumento iluminada. Las colonias pueden aislarse para una posterior identificación. Levantar el film superior y seleccionar la colonia del gel.

REFERENCIAS:

 http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html  http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU342_SPA.pdf  Merck. 2002. Microbiology Manual  Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general.