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• Rafael Carrillo

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PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA

FF.CC.BB. UNSA

PRÁCTICA Nº 5 MEDIOS DE CULTIVO: I. INTRODUCCIÓN: Las bacterias necesitan una serie de compuestos para su desarrollo y crecimiento (fuentes de carbono, nitrógeno, elementos minerales y factores favorables para su crecimiento). Los medios de cultivo son sustratos o soluciones de nutrientes en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios complementarios. II. OBJETIVOS:  Preparar medios de cultivo líquidos y sólidos.  Realizar diferentes formas de preparación e identificación de los medios de cultivo.  Plaqueo y reparto de los medios de cultivo. III. FUNDAMENTO TEÓRICO: Constituyentes de los medios de cultivo bacteriológico: o Fuentes de energía: carbono, nitrógeno. o Sale minerales: azufre y fósforo. o Iones metálicos: sodio, potasio, magnesio. A concentraciones más bajas. Zinc, manganeso, cobre, cobalto, molibdeno. o Factores de crecimiento: cierto tipo de aminoácidos ejemplo cistina, sangre suero , extracto de levadura. o Factores de arranque: sustancias que permiten ala bacteria salir de fase latente y comenzar con la fase de crecimiento exponencial ejemplo algún ion que estimula el crecimiento. o Factores inhibidores: sirve para inhibir el crecimiento de determinadas especies bacterianas no deseadas ejemplo de colorantes de anilina (Ej. Verde brillante o eosina), metales pesados (bismuto) sustancias químicas (azidas, citrato, selenito). Agentes anti microbianos (por Ej. Neomicina, colistina, vancomisina, cloranfenicol). Fuentes de carbono Están ligados a metabolismo energético, corresponde a los azucares en forma de monosacáridos y disacáridos: glucosa, lactosa, sacarosa, otras bacterias utilizan azucares mas complejo para obtener energía como almidones. Existen bacterias capaces de utilizar sustancias mas sencillas como el acido acético, citrato de sodio. Fuentes de nitrógeno Es una fuente menos energética que la fuente de carbono es necesario para el metabolismo microbiano produciendo energía, tenemos a las proteínas, polipéptidos y aminoácidos. Peptonas: corresponde péptidos y polipéptidos. M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz

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La caseína es la peptona sometida la proceso de digestión debido a la digestión acido utilizada en muchos medios de cultivo, sobre todo en forma de peptona tripsica de caseína. CONDICIONES PARA UN MEDIO DE CULTIVO: Temperatura óptima: La temperatura es una de los factores ambientales que afectan el crecimiento y la supervivencia microbiana. Se debe mantener la temperatura apropiada según la especie bacteriana: Bacterias psicrófilas: cuando crecen a temperaturas menores de 20º C Bacterias mesófilas: crecen a temperaturas entre 18ºC y 45ºC Bacterias termófilas crecen a temperaturas mayores de 45ºC Las bacterias patógenas para el hombre crecen a temperaturas óptimas de 37ºC Presión osmótica: Se suele trabajar a condiciones isotónicas (300miliosmoles) aunque existen bacterias que pueden crecer a condiciones algo superiores. Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho es debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y este se rompa. Otro caso en bacterias halógenas su crecimiento se produce especialmente a concentraciones muy altas de cloruro de sodio, Staphylococcus es capaz de crecer a7.5%ClNa, Enterococcus a 6.5% de ClNa. Las bacterias no suelen tolerar las grandes concentraciones salinas de allí que la salazón es un buen método de conservación. Presencia y ausencia de oxigeno: Los microorganismos varían en sus necesidades o tolerancia al oxígeno. Aerobios: son capaces de crecer en presencia de oxígeno, microaerófilos: necesitan menor proporción de oxígeno. Anaerobios: crecen con absoluta o relativa ausencia de oxígeno. Anaerobios obligados solo se desarrollan en ausencia de oxígeno y anaerobios facultativos crecen en aerobiosis y en anaerobiosis. pH Existen sustancias que van a establecer el pH del medio a estas se conocen como tapones o buffers. Proporcionan al medio un pH adecuado y establece que facilita el crecimiento bacteriano. El pH óptimo en la mayoría de casos es cercano a la neutralidad, aunque existen bacterias que pueden crecer al pH muy bajo próximo a 0 los Thiobacilos, otros pH alcalino pH 8 Proteos, pH 9 Vibrio. En los medios de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia del metabolismo que se produce en la degradación de los nutriente y fermentación glucocida (acidificación del medio), degradación proteica se alcaniliza el medio por sales de amoniaco. M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz

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CLASIFICACION: POR SU ORIGEN: a) Naturales: donde no hay mucha modificación: por ej. Leche, papa, etc. b) Artificiales o sintéticos: Donde ha habido transformación por medios mecánicos o químicos; por ej.la mayoría de medios comerciales como agar nutritivo, Agar MacConkey. POR SU CONSISTENCIA a) Líquidos: son soluciones acuosas también denominas caldos por ej. caldo nutritivo, caldo BHI, leche, caldo suero. b) Sólidos: son los medios líquidos a los que se les ha añadido ciertas sustancias como Agar-agar, gelatina, silicatos solo con el objeto de endurecerlos; por Ej., agar nutritivo, agar sangre, agar sabouraud, etc. c) Semisólidos: son los medios que se hallan en un estado entre los dos primeros, sirven para estudios de motilidad (flagelo), transporte y semianaerobiosis ej. El medio de SIM. POR SU OBJETIVO a) Medios de transporte: son aquellos medios que permiten mantener a los microorganismos viables con una baja multiplicación y conservarse en buen estado; son mucho mejores si son semisólidos; por Ej. Cary- Blair, caldo Hajna, Stuard, etc. b) Medios de enriquecimiento: sirven para multiplicar bacterias antes de su siembra, pueden o no llevar inhibidores por Ej. Caldo Selenito para Salmonella typhi, Caldo Tetrationato para Salmonellas en general, Caldo Lactosado, etc. c) Medios enriquecidos o mejorados: constituidos por un medio base corriente, al que se le añade sustancias ricas en proteínas, aminoácidos o sustratos de mayor valor nutritivo. Sirve para aislar y cultivar microorganismos de mas exigencias en nutrientes: por Ej agar Sangre donde además se aprecian hemólisis; suelo coagulado, para la producción de toxina diftérica. d) Medios de aislamiento: pueden ser: o No selectivos: corrientes y mejorados. o Selectivos: poco selectivos, medianamente selectivos y altamente selectivos. o Especiales. MEDIOS DE AISLAMIENTO: a) Medios de aislamiento no selectivos: medios mejorados Son aquellos medios que, como su nombre dice, sirven para aislar o cultivar bacterias, donde la mayoría de ellas desarrollan porque no llevan inhibidores, y pueden ser: medios básicos como agar nutritivo que llevan sustancias que tienen un valor nutritivo; mejorados como agar sangre M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz

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b) Medios de aislamiento selectivos: o de diagnostico Estimulan el desarrollo y crecimiento de una especie microbiana, inhibiendo el desarrollo de otras morfológicamente semejantes. Mediante la adición de ciertas sustancias como colorantes, sales biliares Estos medios presentan el medio base, además llevan un substrato más indicadores y de manera especial inhibidores, que pueden ser sales, colorantes, antibacterianos tipo antibióticos. A medida que sean más complejos o lleven inhibidores más selectivos, pasan a la categoría de poco, mediano y altamente selectivos; así entre los poco selectivos tenemos; Agar Mac-Conkey, Agar EMB, ENDO Agar, Agar Brolacin en ellos desarrollan todas las enterobacterias, Enterococos, Pseudomonas, Alcalígenes, Candidas. Entre los medios selectivos SS Agar; en este medio desarrollan todas las enterobacterias pero desarrollan mejor y rápidamente las Salmonellas y Shigellas. Entre los altamente selectivos, que son más específicos, desarrollan pocas especies bacterianas, así en el Agar Chapman, Manitol Salado desarrollan las Micrococáceas; en el sulfito bismuto Agar, desarrollan Salmonellas, específicamente S. typhi; Agar verde brillante es propio para Salmonellas. c) Medios de aislamientos específicos: Éstos medios son generalmente altamente enriquecidos por el medio Bordet-Gengou, que es para Bordetella, que contiene además del medio básico: papa, glicerina y antibióticos; el medio de Lowwestein que es para el Mycobacterium tuberculosis éste medio a además del medio básico lleva huevo, glicerina e inhibidor de verde de malaquita; en éste tipo de medio los inhibidores tienen relativa importancia, pues su especificidad está en función a su riqueza, otro Ej. Es el Agar Saboraud, para hongos. d) Medios diferenciales o bioquímicos: Son aquellos medios que llevan un medio corriente, caldo o Agar nutritivo, al que se le ha añadido un substrato conocido, además lleva indicador de pH; aquí se estudiarán desdoblamiento de substratos por acción de enzimas bacterianas es decir el metabolismo microbiano. Así tenemos; TSI, SIM, LIA, Urea, Citrato de Sinmons, Caldo MR-VP; que sirven para pruebas específicas.

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

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1. MATERIAL REQUERIDO: o Matraces de 250ml. 100ml. 50 ml. o Probetas de 50 ml. 100ml. o Baguetas. o Balanza. o Espátula. o Agua destilada. o Placas Petri. o Tubos de Ensayo. 2. MEDIOS DE CULTIVO: o Agar Mac- Conkey. o Agar Nutritivo. o Agar EMB o Agar Manitol Salado o Agar Miuller Hinton 3.

OBSERVACIÓN: Usted encontrará en sus mesones diferentes medios de cultivo que utilizaremos en la práctica, lea cuidadosamente la composición y descríbalos según la utilización.

PLAQUEO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: 1. Se debe tener el ambiente limpio, fumigado o desinfectado. 2. Se debe tener el material de vidrio esterilizado y frío: Placas Petri, tubos, frascos, Castañeda, viales, según el caso que se dé. 3. Mecheros con gas. 4. Medios de cultivo esterilizado, licuado y a una temperatura entre 48 y 52ºC. PROCEDIMIENTO: Plaqueo o reparto de medios en Placas Petri: colocar todo el equipo necesario dentro del cubículo sobre la mesa, y: - Abrir las placas Petri, quitando hilo y papel. - Abrir el medio a repartir y flamear una ida y vuelta sobre la llama. - Con la mano derecha coger el frasco que contiene el medio de cultivo, agitar suavemente rotando, flamear la boca del frasco y verter dentro de la placa una cantidad adecuada, más o menos 15 ml. - Cerrar la placa y dejar sobre la mesa sin que el medio toque la tapa. - Proseguir con el resto del medio y placas, flameando con una ida y vuelta la boca del frasco que contiene el medio de cultivo que se está repartiendo. - Una vez acabado de repartir, se debe enjuagar con agua de caño los frascos.

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Una vez enfriado y endurado los medios en las placas se voltean y rotulan con lápiz de cera. Se deja en refrigeradora a 4ºC.

Los medios se deben guardar a 4ºC ; el tiempo de duración es relativo, por lo general corto, el agar Sangre hasta 72 horas, el resto de medios hasta una semana; los medios de cultivo no selectivos que han sido repartidos en placas, tubos o frascos, deben dejarse 24 horas en estufa a 37ºC para el control de su esterilidad, que demuestra el éxito cuando no desarrolla ninguna bacteria u otro microorganismo. En la preparación de los medios, después de pesado el medio de cultivo y haber agregado el agua destilada, se debe disolver calentando, y cuando esté a 40ºC se toma y justa el pH de 7.2 a 7.4. DESCRIPCIÓN Y PREPARACIÓN: AGAR NUTRITIVO: Este agar tiene como materia prima un medio base, que es el Caldo Corriente cuyos componentes son: - Peptona 1.0gr. - Extracto de carne 0.3gr. - Cloruro de sodio 0.50gr. - Agua destilada 100ml. A este medio se le añade Agar-agar 1.5gr. Y se obtiene el agar nutritivo. Preparación: Para su preparación, 100ml. De agar nutritivo se esterilizan a 15 lb de presión, 121 ºC durante 15 min, se deja enfriar Antes de que se enduren, se reparten en placas Petri y tubos en posición plano inclinado. AGAR MAC CONKEY: selectivos. Se basa en la fermentación de la lactosa, las colonias de organismos capaces de fermentar lactosa producen una caída localizada de pH, lo cual, seguido por la absorción del rojo neutro, imparte un color rojo a la colonia. Las colonias de organismos que no fermentan lactosa permanecen incoloras y traslúcidas. La selectividad del medio se debe a la presencia del cristal violeta y sales biliares que inhiben casi o completamente el crecimiento de bacterias Gram positivas. Composición: - peptona caseína 17.0 gr - Lactosa 10.0 gr. - Peptona 3.0 gr. - Sales biliares 1.5 gr - Cloruro sódico 5.0 gr. - Rojo neutro 2.0 gr. M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz

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- Cristal de violeta 0.001 gr. - Agar-agar 12.5 gr. - Agua destilada 1000ml. El medio comercial se disuelve en baño maría, se ajusta el pH a 7.2, se esteriliza a 15 lb de presión, 121 ºC durante 15 min., y se reparten en las placas petri. En este medio se buscan enterobacterias, además crecen estreptococos del grupo entérico, pseudomonas y cándida. Las bacterias degradan la lactosa haciendo variar el pH, y el indicador vira del color lila al rosado o grosella y las que no degradan desarrollan formando colores translucidos: Interpretación: COLONIA Incolora transparentes Grande, rojo con halo turbio Rosa grande y mucosa Diminutos, esporadicos, opacos

MICROORGANISMO Salmonella, Shigella E.coli Enterobacter, klebsiella Enterococos, estaphylococos

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) Desarrollar como el medio anterior. V. RESULTADOS, DISCUCIÓN, CONCLUSIÓN, REFERENCIAS: De cada uno de los medios se les dio, identificar cuales son los requerimientos energético y no energéticos según la composición. Diferencie que tipo de medios y para que se utiliza con ejemplos. Medios: medio agar nutritivo, Mac Conkey,agar EMB, Manitol Salado , Miuller Hinton,, Saboraud. VI. TRABAJO ENCARGADO Describir cada uno de los medios de cultivo según su clasificación. McConkey: POR SU ORIGEN: a) Naturales:. Leche b) Artificiales o sintéticos: Agar MacConkey. POR SU CONSISTENCIA d) Líquidos: lactosa e) Sólidos: cloruro de sodio f) Semisólidos: Sales biliares

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Realice un cuadro sinóptico de los medios de cultivo y sus usos. Agar Conkey:

USO

USO

Agar Monitol sal

Agar XLD

USO

Medios de cultivo Agar TSA

USO

USO

Agar cetrimida

Agar caso

USO

permite identificar bacterias gram

inhibe el crecimiento de ciertas bacterias gram

se utilizado para el aislamiento y diferenciación de organismos patógenos entéricos Gram negativos, especialmente del género Shigella. Su uso general permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias.

Es utilizado para el aislamiento selectivo de pseudomonas aeruginosa (una bacteria gram negativa) y de otras especies del género. Este medio inhibe a otros

medio de cultivo universal sin inhibidores ni indicadores.

Indica 3 medios de cultivo que no se autoclave y mencionar sus componentes. 

AGAR MAC CONKEY  sales biliares  colorante cristal violeta  indicador rojo neutro  lactosa

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 peptona  cloruro sódico. 

AGAR NUTRITIVO:

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 Peptona  Extracto de carne  Cloruro de sodio  -Agua destilada CALDO NUTRITIVO:  extracto acuoso de carne.  peptona al 1%.  cloruro de Sodio al 0.5%

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