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Práctica 11 - Factores Físicos Microbiología Experimental (Universidad Nacional Autónoma de México)

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MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL Grupo: 6

Horario: Lunes y Miércoles (13:00 – 16:00)

Equipo: 2

Integrantes: Correa García, Víctor Josué Torres Santander, Fernando

Informe práctico 11: « Factores Físicos» Los agentes ambientales influyen en la sobrevivencia, crecimiento y actividad bioquímica de los microorganismos, esto nos permite entender cómo es que se lleva a cabo su distribución en la naturaleza y nos permite controlarlos. Los factores físicos que se involucran en estos procesos comprenden la temperatura, el pH, la presión osmótica, la humedad, las radiaciones, la naturaleza y concentración de las sustancias químicas presentes, aunque también tienen importante influencia la presencia de los demás seres vivos. Por ende, para poder cultivar un microorganismo, se requiere aplicar en forma conjunta, una serie de factores físicos que optimicen su desarrollo, sin embargo a menudo y por múltiples razones, la actividad es inoportuna e indeseable, en estos casos es necesario aplicar agentes físicos en tal cantidad que permitan disminuir o bien anular la actividad microbiana. (Keywords: Punto térmico mortal, periodo térmico mortal, radiaciones UV, pH, ósmosis, temperatura, halofilia).

Resultados Durante el desarrollo de esta práctica se evaluó el crecimiento de tres microorganismos diferentes modificando las condiciones a las que se expusieron, el primero Clostridium sp. fue evaluado para determinar el periodo térmico mortal y el punto térmico mortal, el segundo fue Serratia marcescens, en este se observó el efecto de las radiaciones UV y el posterior efecto de la exposición a los rayos solares. Finalmente, el último microorganismo utilizado fue Geobacillus stearothermophilus, con este microorganismo se evaluó el efecto del pH, de la presión osmótica, la temperatura y la halofília del microorganismo. -

Punto térmico mortal

realizada la inoculación, la caja se metió a incubación a 37ºC durante 48 horas. Los resultados obtenidos se muestran a continuación: Temperatura (°C) Crecimiento Positivo Testigo Positivo 50 Negativo 60 Negativo 70 Negativo 80 Negativo Ebullición *Imágenes Anexo No.1 Tabla 1. Resultados de Punto Térmico mortal para Clostridium sp. -

En esta prueba se realizó la inoculación de 5 tubos de SSI mediante la utilización de 3 asadas de la muestra del microorganismo Clostridium sp., se colocaron a diferentes temperaturas con el uso de baños maría. Tras mantenerlos durante 10 minutos en cada baño, se procedió a realizar la inoculación por estría recta en una caja de TSA dividida, dejando un sector de la caja como Testigo para monitorear que el microorganismo crece perfectamente a la temperatura de incubación y en el medio utilizado. Una vez

Periodo térmico mortal

La evaluación del periodo térmico mortal se realizó mediante el uso de las suspensiones preparadas para la evaluación del punto térmico mortal en Clostridium sp. El experimento consistió en dejar durante un determinado tiempo las suspensiones con los microorganismos en el baño maría de 60ºC y en el de Temperatura de Ebullición. A los 5, 10, 20 y 30 minutos, se tomó una asada y se inoculó un segmento de una caja Petri por estría recta. En este caso, se dejó un segmento sin inocular como

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Química Farmacéutico Biológica

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Crecimiento a Crecimiento temperatura de a 60 ºC ebullición Negativo Negativo Control Positivo Positivo Testigo Negativo Negativo 5 Positivo Negativo 10 Negativo Negativo 20 Positivo Negativo 30 *Imágenes Anexo No. 2 Tiempo (min)

-

Equipo: 2

Efecto de la temperatura

Para determinar el efecto de la temperatura en el crecimiento, se utilizó una cepa de Geobacillus stearothermophilus. Con la cepa se realizó la inoculación de 4 tubos con caldo TSA utilizando cuatro gotas con la pipeta Pasteur. Cada tubo se incubó a diferentes temperaturas y se obtuvo la siguiente grafica de crecimiento: Crecimiento de G. stearothermphilus 2.5 2

Crecimiento

Grupo: 6

control de esterilidad y un segmento como testigo, el cual al igual que en punto térmico mortal, sirvió para verificar que el microorganismo creciera en el medio y en las condiciones de incubación (37 ºC durante 48 horas). Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Tabla 2. Resultados del periodo térmico mortal para Clostridium sp.

1.5 1 0.5

-

Efecto de la radiación UV 0

En esta prueba, se llevó a cabo la inoculación masiva de una suspensión de Serratia marcescens por medio de la técnica de hisopo en una agar TSA. Esto se realizó por duplicado. Ambas caja de agar fueron divididas en 4 segmentos iguales. Las dos cajas fueron irradiadas con luz UV, cada segmento se expuso a diferentes tiempos a la radiación y uno de ellos se utilizó como testigo (no se irradio con luz UV). Una vez llevado a cabo esto, una de las cajas se colocó a la luz del sol durante 30 minutos y ambas cajas se envolvieron con papel aluminio y dejaron incubar a temperatura ambiente durante 48 horas. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Sólo Radiación UV y radiación posterior radiación UV solar ++++ ++++ Testigo ++++ ++++ 10 ++ +++ 30 + ++ 60 Tabla 3. Resultados del efecto de la radiación UV en Serratia marcescens.

Tiempo (s)

0

20

40

Temperatura ( ºC)

Figura 6. Grafica de crecimiento de Geobacillus stearothermophilus. -

Efecto osmótico

De la misma manera que en el efecto de la temperatura, se inocularon tres tubos de solución con sacarosa a distintas concentraciones, con la cepa de Geobacillus stearothermophilus. Una vez inoculados, se metieron a incubación a 55 ºC durante 48 horas. Los resultados que se obtuvieron fueron los siguientes: Concentración de Sacarosa 3% 7% 10%

Turbidez (crecimiento) + +

Tabla 4. Resultados del efecto de la presión osmótica en una cepa de G. stearothermophilus

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Efecto del pH

Para observar el efecto del pH en el crecimiento de la cepa Geobacillus stearothermophilus, se realizó la inoculación de 3 diferentes tubos, los cuales poseían diferentes pH. Estos tubos se metieron a incubación durante 48 horas, a una temperatura de 55 ºC. Los resultados que se obtuvieron fueron los siguientes:

Microorganismo Resultado Gram (+) Clostridium sp. Geobacillus sterothermophilus Gram (+) *Imágenes Anexo No. 4 Tabla 7. Resultados de tinción de Gram para los microorganismos utilizados. Análisis de resultados

pH Turbidez (crecimiento) ++ 3 + 7 9

-

Con base en los resultados, el punto térmico mortal de nuestra cepa de Clostridium sp. es de 60 ºC debido a que, a partir de esta temperatura ya no hubo crecimiento del microorganismo.

Tabla 5. Resultados del crecimiento de Geobacillus stearothermophilus a distintos pH. -

Halofilia -

Para determinar el efecto de la concentración de NaCl en la cepa de Geobacillus stearothermophilus, se llevó a cabo la inoculación de tres tubos con NaCl a diferentes concentraciones. Una vez inoculados, se metieron a incubación a 55 ºC durante 48 horas. Los resultados obtenidos fueron los que se muestran a continuación:

Tabla 6. Resultados del crecimiento de Geobacillus stearothermophilus a diferentes concentraciones de NaCl. Tinción de Gram

Como parte de la práctica, se llevó a cabo una tinción de Gram de la cepa de Geobacillus stearothermophilus y de la cepa de Clostridium sp. obteniéndose lo siguiente:

Periodo térmico mortal Los resultados obtenidos para esta prueba no son concluyentes en el caso de la evaluación en la temperatura de 60 ºC, debido a que obtuvimos crecimientos irregulares, ya que a los cinco minutos no hubo crecimiento del microorganismo (esto coincide con la prueba de punto térmico mortal), sin embargo hubo crecimiento del microorganismo en el tiempo de 10 y 30 minutos. La única explicación para esto es que al momento de la inoculación de la muestra no se llevó a cabo una buena homogenización de esta y quizá la temperatura tampoco fue homogénea en todo el tubo, ya que si el crecimiento se hubiera debido a una contaminación de la muestra, se hubieran observado colonias aisladas y no homogéneamente sobre la estría que se realizó, otra posible razón es que la temperatura a la cual estaba el baño fuera menor por falta de monitoreo de ésta.

Concentración de NaCl Crecimiento 3.5% 7% 10%

-

Punto térmico mortal

-

Efecto de la radiación UV Se sabe que las radiaciones afectan directamente el material genético de os microorganismos inhibiendo de esa manera su crecimiento o modificando alguna característica fenotípica (Ramírez, 2013).

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Como se observa en los resultados obtenidos, para el caso de la caja en la que solo se radió con luz UV, hubo un crecimiento menor a partir de los 30 segundos en comparación con la caja a la cual se le irradio luz solar, y para ambos casos el crecimiento disminuyo aún más a los 60 segundos. Esto se debe a que la luz solar activa un mecanismo de fotorreactivación, en el cual actúa una enzima llamada fotoliasa, el objetivo de este mecanismo dependiente de la luz es el de corregir los dímeros de timina que se forman durante la radiación con luz UV, esto produce que las bacterias puedan sobrevivir aun después de un tiempo prolongado a radiaciones, pero es indispensable que la bacteria sea expuesta a la luz ya que el mecanismo requiere de manera forzosa fotones, la inhibición del crecimiento no es la única consecuencia de la exposición a los rayos UV, también hay cambios en el fenotipo expresado como puede ser el cambio de coloración, de las colonias de un rojo a un color blanquecino-incoloro. -

-

-

Efecto osmótico Con base en los resultados obtenidos, encontramos que Geobacillus

Efecto del pH Los resultados que se obtuvieron en esta prueba, indican que Geobacillus stearothermophilus es un microorganismo acidófilo neutrotolerante; es decir crece mejor a condiciones de acidez altas, pero logra tolerar concentraciones neutras de pH (pH = 7), sin embargo en la literatura se encuentra que tiene una limitada tolerancia a la acidez con un máximo de pH de 5.2 (Silva, 1999); los resultados anteriores pudieron haberse visto afectados por la cantidad de microorganismos inoculados, pudo no haber sido homogénea en todos los tubos lo que supondría un mayor desarrollo a un pH ácido que un pH neutro si se inoculó mayor cantidad en el tubo ácido en contra parte con el pH neutro.

Efecto de la temperatura Los resultados del efecto de la temperatura en el microorganismo Geobacillus stearothermophilus muestran que el microorganismo crece en el rango de 28 ºC 55 ºC, sin embargo su temperatura optima es entre 37 ºC - 55 ºC por lo que se podría considerar como un microorganismo mesófilo o termófilo. Sin embargo, consultando la literatura, se ha encontrado que Geobacillus stearothermophilus es un microorganismo termófilo debido a que su temperatura optima se encuentra a los 55°C (Abdul, 2002), el crecimiento a las temperaturas menores de 55 °C pueden deberse a la inoculación, esta pudo no haber sido homogénea en los tubos, sin embargo se nota que la mayor proliferación es en 55°C.

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stearothermophilus es un microorganismo osmófilo ya que creció en los medios con concentraciones altas de sacarosa, y en cambio en concentraciones bajas de sacarosa no hubo crecimiento. Lo anterior indica que para que el microorganismo se desarrolle, requiere de elevadas concentraciones de soluto.

-

Halofília Con respecto a la prueba de halofília, encontramos que el microorganismo Geobacillus stearothermophilus es no halófilo, debido a que no creció en ninguno de los tubos con NaCl. La inhibición del crecimiento por el uso de NaCl se debe a que esta sal normalmente desorganiza los transportes de membrana y desnaturaliza proteínas.

Conclusiones El conocimiento y la manipulación de los factores físicos resultan importantes en el laboratorio de Microbiología debido a que permiten obtener mejores resultados cuando se trabaja con algún microorganismo en específico, es decir, permitir el mejor desarrollo del

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microorganismo y de manera íntegra o de manera contraria, resulta necesario conocerlos para poder llevar a cabo su correcta eliminación o la disminución de la carga microbiana. Bibliografía  Ramírez, R., Luna, B., et. all. Manual de Prácticas de Microbiología General, 6ª ed.; Universidad Nacional Autónoma de México: México, 2013; pp. 233-240.  Alarcon R., Manual de Practicas de Microbiologia y Microbiologia de Alimentos, 1ra ed.; Universidad Autónoma de Ciudad Juarez, 2004; pp. 25 – 27

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 Abdul, A.; Farid, M. y Chen, X. Theoretical and experimental investigation of the thermal inactivation of Bacillus stearothermophilus in food pouches. Journal of Food Engineering; 2002, 51(3):221-228.  ÁVILA, I. & SILVA, C. Methodologies to optimize thermal processing conditions: An overview. In: Oliveira, F.A.R. y Oliveira, J.C. (eds). Processing foods quality optimization and process assessment. CRC Press. Boca Ratón, FL, USA 1999. pp: 67-82.

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Anexo 1. Resultados para punto térmico mortal

Fecha: 29 / Octubre / 2015. Muestra: Clostridium sp. Medio: TSA Descripción: Resultados obtenidos para la prueba de punto térmico mortal. En la imagen se observa crecimiento en el sector destinado para el testigo, y en el sector en el que se inoculo el microorganismo a 50 ºC, sin embargo en las temperaturas posteriores (60°C, 70°C, 80°C y ebullición) no se observa crecimiento.

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Anexo 2. Resultados para periodo térmico mortal

Fecha: 29 / Octubre / 2015. Muestra: Clostridium sp. Medio: TSA Descripción: Resultados obtenidos para periodo térmico mortal a 60 ºC para Clostridium sp. En la imagen se observa crecimiento en los segmentos destinados para el testigo, 10 minutos y 30 minutos.

Fecha: 29 / Octubre / 2015. Muestra: Clostridium sp. Medio: TSA Descripción: Resultados obtenidos de periodo térmico mortal en la temperatura de ebullición para Clostridium sp. En la imagen se observa que únicamente hay crecimiento en el testigo, el cual no fue sometido a ninguna temperatura.

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Anexo 3. Resultados para efecto de las radiaciones

C 10’’

Fecha: 29 / Octubre / 2015. Muestra: Serratia marcescens Medio: TSA Descripción: Resultados obtenidos para la caja inoculada con Serratia marcescens a la cual solo se le irradio luz UV. Como se puede observar, el crecimiento disminuye mientras más tiempo se expone a las radiaciones.

Fecha: 29 / Octubre / 2015. Muestra: Serratia marcescens Medio: TSA Descripción: Resultados obtenidos para la caja inoculada con Serratia marcescens a la cual se le irradio luz UV y posteriormente se expuso a la luz solar. Como se puede observar, el crecimiento disminuye mientras más tiempo se expone a las radiaciones, sin embargo se obtiene una cantidad significativa de colonias, debido a la exposición a la luz solar.

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Anexo 4. Tinción de Gram de los microorganismos utilizados.

Fecha: 27 / Octubre / 2015 Muestra: Clostridium sp. Tinción: Gram Aumento: 1000 X Descripción: En la imagen se observan algunos bacilos Gram positivos, los cuales no poseen alguna asociación microbiana.

Fecha: 4 / Noviembre / 2015 Muestra: Geobacillus stearothermophilus. Tinción: Gram Aumento: 1000 X Descripción: En la imagen se observan algunos bacilos cortos Gram positivos, los cuales no poseen alguna asociación microbiana aparente.

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