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Post-Laboratorio 5

Alumno: Jeisson Estiven Micelly Moreno

Docente: María Fernanda Garcés Gutiérrez

Genética Humana Grupo: C Bacteriología y Laboratorio Clínico Facultad de Ciencias de la Salud Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca Bogotá, 2021 1. ¿Qué es el bandeo de alta resolución y cómo se realiza?

Bandeo de Alta resolución -También se conoce como estudios de Bandeo extendido o cariotipo de alta resolución, este permite evaluar los cromosomas con una resolución más alta que la del análisis cromosómico estándar, los cromosomas están dispuestos de manera tal que se alargan un poco, por lo que se pueden ver más bandas. Esto permite observar partes más reducidas del cromosoma e identificar, de este modo, anomalías cromosómicas estructurales más pequeñas que no pueden ser vistas en un análisis de rutina. De esta manera, al producirse una elongación de los cromosomas es posible la detección de alteraciones estructurales más pequeñas como microdeleciones, duplicaciones y sutiles translocaciones.

Tomado de:

Técnica: Se debe realizar un cultivo para cualquier caso en donde, las células son sembradas en medios comunes como MEM o RPMI 1640 + SFB al 20% y se estimulan con fitohemaglutinina. Las preparaciones sobre los cromosomas para alta resolución se obtienen incrementando el número de células prometafásicas y profásicas, no en metafásicos. Para lograrlo se sincronizan las células en división bloqueando la síntesis de ADN con un inhibidor, el metotrexato. Así después de ser cultivada la muestra por 70 h a 37°C se adiciona metotrexato MTX. Al pasar 15 a 18 horas más se libera el ciclo celular timidina o BrdU, esto se deja actuar durante 5 a 5 h y media y así se obtienen cromosomas más largos, bandas que se desdoblan en subbandas. Se detectan alteraciones del orden de 3 a 4 Mb.

Esta técnica es indicada también en pacientes con retraso mental “idiopático”, retraso no explicado de crecimiento o baja estatura. En este último caso, las deleciones del brazo corto de X o Y, llevan genes importantes en determinación de altura. En casos de infertilidad se han observado reorganizaciones cromosómicas. La técnica implica una sincronización de linfocitos con Timidina y exposición mínima al colcemid y permite el análisis de los cromosomas detenidos en fases precoces de la mitosis.

Tomado de:

Cariotipo de alta resolución de Médula ósea (Resolución banda 600-800)

Tomado de: 2. Complete el siguiente cuadro:

TIPO DE BANDA

PRINCIPAL REACTIVO Y OBTENCIÓN

UTILIDAD

GIEMSA

Tinción con Giemsa, azul de metileno fosfatado y buffer fosfatado gota gruesa Giemsa (una mezcla de tintes de tiazina y eosina). No se trata solo se utiliza reactivo Giemsa.

-Observación de puntos frágiles sobre los cromosomas e incluso el análisis de la heterocromatina. -Permite detectar aneuploidías, aberraciones estructurales mediante la representación fotográfica de todo el complemento cromosómico. -Detecta regiones fluorescentes con alto predominio de A-T, Las bandas Q brillantes coinciden con las bandas G oscuras.

EJEMPLO VISUAL

-Permite detectar regiones centroméricas de alto contenido de heterocromatina centromérica y que tiende a apuntar a trastornos genéticos. que resultan de mutaciones que involucran la heterocromatina constitutiva. -Tiñe los genes de RNA ribosómico situados cerca de las regiones tallo y satélite de los cromosomas acrocéntricos.

BANDA G

Tinción con Giemsa, azul de metileno fosfatado y buffer fosfatado gota gruesa Giemsa (una mezcla de tintes de tiazina y eosina), después de tratar la muestra con tripsina (Digestión) produciendo bandas claras y oscuras. Bandas G+ (Oscuras) Bandas G- (Claras)

-Identifica cromosomas o regiones cromosómicas implicadas en rearreglos. -Detectar estructurales.

aberraciones

-Permite hacer correlación cariotipo fenotipo y así delinear nuevos síndromes cromosomicos. -Localización y mapeo de genes específicos. -Referencia

BANDA Q

Tinción con mostaza de -Excelente para investigación quinacrina o acridina. Se analiza de polimorfismos en regiones con microscopía fluorescente y se ricas heterocromatina. ven bandas brillantes . -Identificación del origen parental de cromosomas acrocéntricos. -Identificación específica de , pruebas de paternidad y trastornos como trisomía 13,14,15,21 y 22.

BANDA C

Extracción de ADN/proteínas teñidas con Giemsa o fluorocromos (actinomicina D o cromomicina) y se trata previamente con calor o álcali moderadamente fuerte (NaOH, Ba(OH)2) con el objetivo de desnaturalizar el DNA

Tiñe la heterocromatina estructural, que se encuentra normalmente cerca del centrómero. -Polimorfismos o heteromorfismos en bandas C (sirven como marcadores genéticos poblacionales). -Pruebas de paternidad y visualización de roturas cercanas a la región centromérica o traslocaciones que implican inactivación por efecto a posición contigua a otra. -Determinar el orígen de las trisomías.

BANDA NOR Tinción con Plata

0.2uL de solución de nitrato de plata al 50% filtrada a la preparación, luego adicionar 6 a 8 gotas de formaldehído al 0.3% (acelera la tinción) e incubar a 37°C durante 24h protegido de la luz.

Resalta los satélites y los brazos de los cromosomas acrocéntricos. -Determinan puntos de rotura en rearreglos que implican cromosomas acrocéntricos. -Estudio de la actividad de genes ribosomales en condiciones normales y en presencia de mutágenos, así como en diferentes tipos y estadios celulares.

FPG

Fluorescencia más Giemsa Las células se cultivan en BrdU durante dos ciclos celulares completos. Un par de cromosomas en metafase sin intercambios tendrá una hermana con ambas cadenas marcadas con BrdU y la otra hermana con solo una de las dos cadenas marcadas. Utilizar

reactivo

-Permite la fácil visualización de los intercambios de cromátidas hermanas (SCE). -Se utilizan comúnmente como un indicador de efectos genotóxicos en las células.

-Se consideran actualmente más un biomarcador de exposición y reparación que Solución un indicador de efecto

Hoechst 33342 (colorante mutagénico . fluorescente de ADN empleado en la microscopía de fluorescencia y en la separación celular por citometría de flujo). Alternativamente se puede realizar con Naranja de acridina.

3. Describa la técnica de hibridación genómica comparativa y de un ejemplo de su utilidad. Opcional en una hoja aparte entregue este punto y tendrá un adicional para el parcial).

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Hibridación Genómica Comparativa (HGC / CGH) Corresponde a un método citogenético que permite analizar las variaciones en el número de copias en relación con el nivel de juegos completos de cromosomas (ploidía), es decir, se realiza un análisis de una muestra de ADN Control (Cianina 3) (marcada con una sonda fluorescente verde) con una muestra de ADN Paciente (Cianina 5)(marcada con una sonda fluorescente roja) para ver si en el embrión hay alguna desviación con respecto a la muestra de referencia. sin necesidad de montar un cultivo celular. Amarillo: Si el ADN de ambas muestras coincide, en la placa del array se observa fluorescencia amarilla, fruto de la combinación de las moléculas fluorescentes verdes y rojas. Verde: Si falta información genética en el ADN del embrión, se observará fluorescencia roja.

Roja: Si el ADN embrionario está duplicado, es decir, se encuentra en una cantidad mayor de lo normal, la fluorescencia emitida será verde.

Tomado de:

El objetivo de esta técnica es comparar de manera rápida y eficiente dos muestras de ADN genómico derivado de dos organismos diferentes, que a menudo se relacionan pues se sospecha que tienen diferencias ya sea en la ganancia o pérdida de cromosomas completos o regiones sub cromosomales (una porción del cromosoma). Esto se logra con el uso de la hibridación competitiva fluorescente in situ, es decir, microarrays. Aplicaciones: -Investigación contra el cáncer -Diagnóstico de enfermedades raras -Diagnóstico prenatal y preimplantatorio Ejemplo:

CONSIDERACIONES FINALES 1. ¿Qué es la citogenética molecular? En forma general, agrupa un conjunto de técnicas que aplican diferentes métodos de la biología molecular directamente sobre preparaciones citológicas tales como tejidos, células, cromosomas y fibras de ADN. Actualmente, la mayoría de las técnicas de citogenética molecular se basan en la tecnología de la hibridación in situ fluorescente o FISH ( hibridación fluorescente in situ). Esta tecnología abrió la posibilidad de estudiar regiones específicas de la

cromatina directamente sobre los cromosomas, gracias a la información derivada de la secuencia misma del ADN, y no solamente por simples características morfológicas. Se basa en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, permitiendo la detección de y localización de secuencias específicas de ADN. Se utilizan técnicas como: -

FISH (Hibridación fluorescente in situ): Utiliza nucleótidos marcados con sustancias fluorescentes puede observarse la señal inmediatamente después del FISH al microscopio de fluorescencia. Con el FISH se obtienen diagnósticos rápidos y precisos en anomalías cromosómicas totales y parciales y en alteraciones específicas, tales como: -Síndrome de Down -Sindrome de Patau -Síndrome Prader-Willi -SíndromeWilliams -Cáncer y leucemias.

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CGH (Hibridación Genómica Comparativa): Al igual que el cariotipo, estudia globalmente el genoma. Tiene más resolución que el cariotipo. No necesita cultivo, es de alta especificidad y sensibilidad.

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SKY o M-FISH: Utiliza sondas marcadas fluorescentemente hechas para marcar DNA específico de cada cromosoma. Permite el estudio y visualización de los 23 pares de cromosomas en forma simultánea. Identifica aberraciones estructurales cromosómicas en células cancerígenas.

2. ¿Qué reactivo se usa en el bandeo funcional y para qué sirve? -Mayormente conocido como Bandeo R, corresponde al bandeo reverso al bandeo G para ello se debe pretratar con calor y luego teñir con colorante de Giemsa. La banda inversa es una técnica de bandas descrita por primera vez por Dutrillaux y Lejeune. Observaron que si los cromosomas se trataron con tampón fosfato 0,02 M (pH 6,5) a 87 ° durante diez minutos y luego se tiñeron con Giemsa, el patrón de bandas era el opuesto al de bandas G. El calentamiento provoca la desnaturalización del ADN. Es utilizado para teñir los extremos de los cromosomas que contienen Eucromatina es decir regiones ricas en GC (Guanina y Citosina) donde se produce la transcripción.

La técnica es útil para analizar deleciones genéticas o translocaciones cromosómicas que involucran los telómeros de los cromosomas.

En algunos casos, las bandas R son un complemento útil para las bandas G porque algunas pequeñas G ligeras así la banda se puede detectar más fácilmente cuando se tiñen con bandas R.

Cariotipo del paciente. (A) Giemsa (GTG) y (B) bandas inversas (RBG). La flecha es un cromosoma 4 anormal, que tiene un material adicional de origen desconocido en la región terminal del brazo corto (4p). Tomado de: https://www.researchgate.net/figure/Karyotype-ofthe-patient-A-Giemsa-GTG-and-B-reverse-RBG-banding-The-arrow-is-an_fig1_221883045

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