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• Noel Martínez Nieto

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Microscopia MP04. QUBO. Ins La románica.

Concepto  Microscopia: Construcción y uso de los microscopios

 Microscopio: Elemento utilizado para crear una imagen visible y detallada de un objeto que es demasiado pequeño para verlo a simple vista.  Factores para una buena imagen:  Aumento  Resolución  Contraste

Tipos de microscopios: Óptico Instrumento formado por la consecución de lentes cuya función principal es ampliar la imagen del objeto observado. El ocular y el objetivo suelen estar constituidos en realidad por varias lentes. Además, el sistema óptico cuenta con espejos que permiten la separación necesaria entre el objetivo y el ocular y que además ajustan la trayectoria de los rayos a la forma del microscopio

Sistema de lentes Ocular: Es la lente o sistema de lentes situadas en el extremo superior del tubo, cerca del ojo del observador. Multiplican el aumento logrado por el objetivo y este se suele indicar mediante un número entero acompañado de una ‘x Objetivo: Es la lente o sistema de lentes situadas más próximas al objeto a observar. •

Normalmente los objetivos se sitúan en el portaobjetivos, también llamado revolver, de manera que un solo aparato pueda utilizar objetivos de distintas características con tan solo girar el revolver.

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Su valor también se especifica mediante un número entero acompañado de una ‘x.

Sistema de iluminación: Permite la iluminación óptima del objeto a aumentar Lámpara: Es la fuente de luz utilizada para producir la iluminación. Los microscopios modernos utilizan leds Sistema de focalización: Es el conjunto de lentes y espejos que dirigen los rayos de la lámpara al condensador y que regulan la cantidad de luz que llega a este Condensador: Es la lente o sistema de lentes que concentran los rayos de luz sobre el objeto a observar. Iris: sistema de apertura, permite concentrar la luz sobre la muestra.

Sistema mecánico: Engloba todas las piezas físicas en las que se encuentra el sistema óptico y el de iluminación Platina: Suele ser una pieza metálica en cuyo centro existe un orificio transparente. Tornillos: Se utilizan para enfocar, variando la distancia a la que se sitúa el objetivo y el ocular del objeto. Suele haber un tornillo de amplio desplazamiento, utilizado para el enfoque inicial y denominado macrométrico y otro de alta precisión que realiza desplazamientos muy cortos, denominado micrométrico Revolver: es el sistema que permite incorporar distintos objetivos al microscopio y usar uno u otro sin más que girar el dispositivo para alinear el deseado con el ocular

Otros tipos de microscopios •Microscopio digital: Esta variación incluye un sensor digital sobre el que se proyectan los rayos de luz. Dicho sensor se conecta a una pantalla LCD para visualizar la imagen •Invertido: Sitúa la fuente de luz en la parte superior del microscopio, dónde también se encuentra el condensador apuntando hacia abajo. Por otro lado, el objetivo está en la inferior apuntando hacia arriba •Microscopio fluorescente. Esta variante del microscopio liviano emplea fluorescencias o fosforescencias útiles para estudios específicos de la materia. •De campo oscuro: El condensador del microscopio es paraboloide y, en lugar de iluminar directamente el objetivo, lo ilumina oblicuamente. De esta manera los objetos aparecen claros sobre fondo oscuro, lo cual es muy útil para ciertas sustancias cuyo color claro contrasta poco con el color claro de fondo que produce la imagen del microscopio óptico convencional

INVERTIDO

DE FLUORESCENCIA

CAMPO OSCURO

Augmento: Capacidad de amplificación de la imagen que posee un aparato Ocular

Objectiu

Augments

10

10

100

10

20

200

10

40

400

10

100

1000

Objectiu d’inmersió

Resolución: distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos Microscopios ópticos: 0,2 micrómetros Viene determinada por la longitud de onda de la luz irradiada

Contraste: la diferencia relativa en la intensidad entre un punto de una imagen. Las variaciones en la intensidad de luz permiten ver que parte es diferente de otra parte vecina o del fondo del campo. De la luz que incide, una parte es absorbida por el objeto y otra es transmitida. Si un objeto y su entorno transmiten la misma cantidad de luz, la imagen se confunde con el fondo.

Necesario para: • Diferenciar el objeto del entorno • Apreciar estructuras internas Propiedad del objeto estudiado

Tinciones!!!!!

Uso del microscopio • Dar iluminación al conjunto.

• Colocar la preparación en la platina, centrarla y sujetarla de forma que quede sobre el haz luminoso. • Girar el revólver y seleccionar el objetivo que se desee (se empieza por el de menor aumento). • Con el tornillo macrométrico, subir la platina a una distancia adecuada hasta que se vea una imagen completamente nítida. A veces hay que bajar un poco el condensador y abrir el diafragma. • Una vez tenemos la imagen, centramos la zona que queremos ampliar y, con el revólver, pasamos a hacer la observación con un objetivo mayor. • Perfeccionar el enfoque con el tornillo micrométrico. • La luz se regulará en función del objetivo a utilizar, a mayor aumento, es necesario más iluminación. • Cuando tenga que cambiar la preparación, tenemos que bajar la platina suficientemente para no dañar la lente (el objetivo).

Uso del microscopio. Objetivo 100x • Poner una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos. • Subir la platina con el tornillo macrométrico hasta situar el objetivo muy cerca de la preparación, de forma que la gota de aceite toque la lente frontal del objetivo. Esto se hace mirando por el lado. • Empezar a observar por el ocular y bajar muy despacio la platina con el tornillo micrométrico hasta obtener la imagen enfocada. • Si se separa la gota de aceite del objetivo, habrá que empezar de nuevo.

• Una vez enfocada la preparación, habrá que observar todos los campos con el tornillo de carro móvil que permite desplazarse en todas direcciones.

Precauciones básicas • Hay que guardar el m.c. con su funda de plástico siempre que no se utilice para evitar que se ensucie por el polvo. • Hay que evitar la grasa y los golpes. • Para transportar el m.c., se tomará por el pie con una mano y el brazo con el otro para evitar que caigan los oculares. • Si hay que cambiar un ocular, se hará de forma rápida para evitar la entrada de polvo al tubo. • Los movimientos de los tornillos macrométrico y micrométrico deben ser suaves. • Los objetivos y oculares siempre deben estar limpios. Los oculares se ensucian con la grasa de las pestañas o de los dedos y el polvo. Se deben limpiar con un papel muy fino para no rayar la lente. • Los objetivos, cuando se haya utilizado aceite de inmersión, se limpiarán con un paño de hilo impregnado en alcohol de 90º. (Xilol en casos muy extremos)

Preparación de la muestra • Distribución homogénea sobre el puerta. Demasiada cantidad en un lugar determinado, puede impedir la visualización. • Elegir la técnica adecuada al tipo de m.o. o la parte del m.o. que queremos observar. • La ausencia de elementos contaminados (condiciones estériles, agua destilada, impurezas de los colorantes ...) • Los m.o. se pueden observar al m.c. de dos formas: • Manteniendo vivos: visualización "in vivo“ • Muertos y teñidos: tinciones

Visualización "in vivo“ Examen en fresco sencillo Se pone una gota de la muestra en el centro del portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. Hay que evitar que queden burbujas de aire. Técnica rápida (evitar desecación). Método de la gota pendiente Para apreciar mejor el movimiento de los m.o., pero más larga de preparar: • Colocar una gota de la suspensión de m.o. en el centro de un cubreobjetos. • Poner unas gotas de vaselina hilando en las cuatro esquinas del cubreobjetos. • Colocar encima un portaobjetos excavado (con concavidad en el centro) de forma que la concavidad quede encima de la gota. • Girar la preparación. • Observar al m.c. con el objetivo de 100x de inmersión.

Tinciones Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera.

Función de las tinciones: 1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes. 2. Revelan su forma y tamaño. 3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas. 4. Producen reacciones químicas específicas 1. No todos los colorantes tiñen todo 2. Los diferentes colorantes dan también coloraciones diferentes. 3. No todos los colorantes tiñen en los mismas condiciones.

Tipos de colorantes Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera.

Básicos: son sales en las que la base, aporta el color. Es decir, son colorantes catiónicos. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glicosaminoglicanos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina. Ácidos: son sales con el anión coloreado. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno. Indiferentes o hidrofóbicos: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante Sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

Tipos de tinciones Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. Las tinciones se pueden clasificar según la vitalidad de las células que se quieren teñir: Vitales: Las tinciones vitales son tinciones que se realizan sobre células vivas, manteniéndolas en dicho estado. La técnica se basa en la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. El verde Jano, las sales de tetrazolio o el azul de metileno son ejemplos de colorantes vitales. Supravitales: Las tinciones supravitales son idénticas a las vitales, con la diferencia de que la técnica se realiza sobre células o tejidos vivos que están aislados del organismo del que proceden. No vitales: Las tinciones no vitales son tinciones hematológicas que se realizan sobre células muertas. Estas técnicas requieren un paso previo, que es la fijación de dichas células al portaobjetos haciendo uso de calor, etanol o metanol, con la particularidad de mantener inalteradas las estructuras de los diferentes componentes celulares.

Tipos de tinciones Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. Las tinciones se pueden clasificar como: Simples: cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china) Diferencial: cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o ZiehlNeelsen)

Específica: cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular (inmunocitoquímico).

Proceso de tinción Extensión o Frotis. Consiste en extender por toda la superficie del portaobjetos la muestra de los m.o. que queremos observar. Cuando tomamos la muestra de un cultivo sólido (ej. Una pequeña parte de una colonia) ponemos un poco de agua estéril al portaobjetos y después la muestra de m.o. que tomaremos con el asa de Kolle. Proceso de fijación. El más utilizado es la fijación por calor. Este proceso mata a m.o. pero mantiene sus estructuras que quedan pegadas al portaobjetos. Extendemos una gota de la muestra que queremos estudiar por encima de un portaobjetos haciendo una película delgada (frotis). Dejamos secar al aire. Se pasa la preparación rápidamente por encima de una llama, que mata los m.o. INCONVENIENTES: menudo distorsiona la apariencia de la célula, dificultando la identificación, y tampoco permite estudiar la movilidad.

Proceso de tinción Tinción. Aplicamos el colorante a la preparación y la dejamos el tiempo suficiente para que pueda ser absorbido por la muestra. Lavado del exceso de colorante (normalmente con agua). Secar antes de hacer la observación.

Tinción simple Utiliza un solo tipo de colorante, que es básico. Ex. Azul de metileno. Sirve para aumentar el contraste. Tiñe del mismo color todas las células que absorben el colorante. Procedimiento: • Se fija la muestra. • Se aplica el colorante. • Se deja tiempo para que sea absorbido (5 min). • Se retira el exceso. • Dejamos secar la muestra. • Observación.

Tinción Diferencial Estas tinciones suelen consistir en dos etapas: • Tinción primaria: es una tinción simple. • Tinción de contraste: en el contraste se aplica otro colorante para teñir las que no se han teñido con el colorante primario Tinción de GRAM. Se utiliza para teñir bacterias. Separa las bacterias en dos grupos: bacterias Gram / bacterias Gram negativas

Tinción GRAM

Procedimiento: Se tiñe la muestra con el primer colorante (violeta de cristal). Se aplica el yodo (Lugol), que actúa como mordiente (sustancia que hace más intensa la tinción, aumenta la afinidad de las células por el colorante). Se aplica un agente decolorante, que suele ser una disolución de acetona o de etanol. (Bacterias gram pierden el color). Como contraste, añade safranina, un colorante rosado. (Este colorante vuelve de color rosa las bacterias que se habían decolorado mientras que las bacterias gram + toman un color violado más oscuro).

Tinción GRAM

Otros tipos de microscopios: Electrónico Observar estructuras celulares que están por debajo del límite de resolución del microscopio óptico, como algunos orgánulos, membranas, estructuras citosólicas, complejos moleculares de la matriz extracelular o virus. Los microscopios electrónicos iluminan el objeto con electrones, en lugar de fotones, cuya longitud de onda es menor que la de cualquier fotón del espectro visible.

No usa lentes sino imanes que concentran los haces de electrones emitidos por un filamento.

Otros tipos de microscopios: Electrónico Tipos: Microscopio electrónico de transmisión. Haz de electrones en un filamento de tungsteno que funciona como cátodo. Los electrones se condensan mediante electroimanes y se focalizan sobre una sección de tejido. Secciones de tejido deben ser muy finas, de unas decenas de nanómetros, para permitir que sean atravesadas por los electrones y para conseguir imágenes nítidas. Las secciones deben ser tratadas con metales pesados como el osmio, el plomo y el uranilo (~colorantes)→ tonalidades de grises.

Otros tipos de microscopios: Electrónico Tipos: Microscopio electrónico de barrido Los microscopios electrónicos de barrido sirven para observar superficies tisulares. Los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan con su superficie y rebotan. Para que esto ocurra hay que cubrir a la muestra con una máscara de metales que se adapta perfectamente al relieve de la muestra. La imagen completa se formará cuando el haz recorra toda la superficie de la muestra ("scannig“). La resolución del estos microscopios es un orden de magnitud menor que el de transmisión.