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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

DESARROLLO DE UN PROGRAMA EN APLICACIONES DE VISUAL BASIC –EXCEL PARA SIMULAR EL CRECIMIENTO MICROBIANO EN UN ALIMENTO, USANDO EL MODELO DE GOMPERTZ MODIFICADO

Presentado por: Edson Martín, Aquino Méndez

2015

I. INTRODUCCIÓN La microbiología predictiva consiste en el desarrollo de modelos matemáticos para predecir la velocidad de crecimiento o de declinación de los microorganismos bajo un dado conjunto de condiciones ambientales (Walls y Scott, 1997; citado por Siciliano, 2010). El conocimiento detallado de las respuestas de crecimiento de los microorganismos frente a las condiciones ambientales, es decir, el conocimiento de la ecología microbiana, permite evaluar objetivamente el efecto del procesamiento, la distribución y el almacenamiento en la seguridad microbiológica y la calidad de los alimentos. Utilizando diseños experimentales adecuados y modelos matemáticos apropiados, la microbiología predictiva permite la selección de los factores de preservación para alcanzar la vida útil deseada de diversos alimentos (Siciliano, 2010). En microbiología de alimentos esto significa la habilidad del laboratorio de generar modelos para predecir el comportamiento de los microorganismos concernientes al alimento en preparaciones comerciales, almacenamiento y distribución. Claramente la validación en este nivel debe ser realizada antes que los modelos predictivos puedan ser usados en la práctica con cierto grado de certeza. Existen potenciales consecuencias de un prematuro uso comercial de un modelo predictivo. Desde el punto de vista de la seguridad de los consumidores y la aceptación de la industria de los conceptos de microbiología predictiva un fracaso de un modelo no validado puede ser serio (Mc Meekin et al., 1993; citado por Siciliano, 2010). El modelado microbiano comenzó aproximadamente en 1920 con los cálculos del tiempo de muerte térmica y el uso de los valores D (tiempo de reducción decimal) y Z (grados de variación en la temperatura, necesarios para reducir el valor de D en un 90%), para describir la resistencia térmica bacteriana. En la década del 70, se profundizó principalmente en el modelado de la probabilidad de producción de toxinas de C. botulinum, principalmente en USA y en el Reino Unido (Roberts e Ingram, 1973; citado por Siciliano, 2010). Se han propuesto varios esquemas para categorizar los modelos, uno de ellos propone dividirlos en modelos de crecimiento y modelos de inactivación/supervivencia. Dentro de cada categoría se subdividen en modelos primarios, secundarios y terciarios (Siciliano, 2010). Los modelos primarios describen cambios en la respuesta microbiana con el tiempo en un ambiente específico. El modelo puede cuantificar unidades formadoras de colonia por mililitro o por gramo (UFC/mL), formación de toxinas, niveles de sustrato o productos metabólicos; absorbancia e impedancia. Una vez generada la curva de crecimiento o muerte microbiana, se utiliza una función o ecuación matemática para describir el cambio de la respuesta en función del tiempo. Ejemplos de modelos primarios son: La función de Gompertz para crecimiento exponencial; el modelo de Gompertz modificado para describir la inactivación microbiana; modelos para describir la declinación no lineal de esporas sobrevivientes con el tiempo; el modelo logístico aplicado a destrucción térmica; el modelo de Stannard; el modelo de Schnute; la ecuación de Fermi; etc. (Mc Meekin et al., 1993; citado por Siciliano, 2010). El valor D

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(tiempo necesario a una determinada temperatura para reducir en un 90% la población microbiana) es también ejemplo de un modelo primario (Whiting y Buchanan, 1994; citado por Siciliano, 2010). Los modelos secundarios describen las respuestas de los parámetros de los modelos primarios frente a cambios en uno o más factores ambientales como temperatura, pH o aw. Ejemplos de modelos secundarios son el modelo de Arrhenius y el modelo de la raíz cuadrada (Bělehrádek), que describen la dependencia con la temperatura, y el modelo polinómico. El valor Z (°C necesarios para disminuir el valor D un ciclo logarítmico) utilizado en procesos térmicos es también un ejemplo de modelo secundario (Whiting y Buchanan, 1994; Citado por Siciliano, 2010). Los modelos terciarios son rutinas de software para computadora menos difundidas que convierten a los modelos primarios y secundarios en programas amigables. Estos programas pueden calcular las respuestas microbianas frente a condiciones que no fueron evaluadas inicialmente, comparar el efecto de diferentes condiciones o contrastar el comportamiento de varios microorganismos, por lo que permiten elegir a los microorganismos blancos de ataque en situaciones específicas de formulaciónprocesamiento de alimentos. Ejemplos de modelos terciarios son el programa “USDA Pathogen Modeling Program” realizado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Agricultural Research Service, 2013), y el “Food Micromodel” avalado por el Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación del Reino Unido (Wilson et al., 2002; citado por Siciliano, 2010). Es necesario remarcar que llevando a cabo este modelado se puede describir exitosamente el comportamiento microbiano en la mayoría de los alimentos pero hay ocasiones en las que se encuentran discrepancias entre el modelo y el crecimiento observado. Estas discrepancias son descriptas como fallas. Un ejemplo sería que el crecimiento observado es más lento que el predicho por el modelo (Wilson et al., 2002; citado por Siciliano, 2010).

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II. METODOLOGÍA 2.1. ENUNCIADO DEL PROBLEMA Determinar el tiempo de vida útil de un concentrado de chicha morada a 20°Brix que ha sido pasteurizado y envasado en un envase flexible de polietileno y Nylon de 3 L, además, envasado en caliente a 60°C y se exporta a EE.UU. se almacena y envía a temperatura ambiente (20°C). El deterioro de este producto es por crecimiento microbiano y en el tiempo llega a un nivel inaceptable. ¿Qué microorganismo puede ser causante de este deterioro? ¿Cuál es el nivel máximo de contaminación que se puede dar en el producto? El modelo matemático elegido para predecir el crecimiento microbiano, tomando en cuenta la condición de temperatura sobre el desarrollo de microorganismos aislados de un producto, es la ecuación modificada de Gompertz. 𝑵𝒕 = 𝑨 + 𝑪 × 𝑒𝑥𝑝 (−𝑒𝑥𝑝 (−𝑩 (𝒕 − 𝑴)))

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Donde: Nt: Es el Log10 de los recuentos microbianos obtenidos para cualquier tiempo (t). t: Tiempo transcurrido (variable independiente). A: Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo decrece indefinidamente (equivale aproximadamente al log de los niveles iniciales de bacterias, No). C: Diferencia entre la máxima línea asintótica de la curva de crecimiento y la línea asintótica menor (equivale a Nmax – No) (log UFC/mL). M: Tiempo al cual el rango de crecimiento es máximo (d). B: Velocidad de crecimiento relativa al tiempo (m d-1). Esta ecuación se ha empleado ampliamente en Microbiología Predictiva alimentos debido a su simplicidad y efectividad, para describir curvas crecimiento de cultivos iniciadores para modelar el crecimiento microorganismos deteriorantes, así como para describir la durabilidad productos (Beldarraín et al., 2007).

de de de de

Los parámetros del modelo de Gompertz se pueden reparametrizar a las clásicas características primarias de curva de crecimiento: (Costa y Kristbergsson, 2009). Microorganismo inicial: 𝐍𝐨 = A … … … (2)

(2)

𝐍𝐦𝐚𝐱 = A + C … … … (3)

(3)

Microorganismo máximo:

3

Velocidad de crecimiento exponencial: µ𝐦𝐚𝐱 =

B×C … … … (4) e1

(4)

1 … … … (5) B

(5)

Fase de latencia: = M−

Tradicionalmente, la curva de crecimiento sigmoidal se describe el uso de cuatro parámetros: La tasa de crecimiento exponencial (µmax), la fase de latencia (), el nivel de inóculo (No) y la densidad celular máxima (Nmax). La tasa de crecimiento exponencial se define como la tangente más pronunciada a la fase exponencial, por lo que es la tangente en el punto de inflexión, mientras que la fase de latencia se define como el momento en que dicha línea tangente extrapolada cruza el nivel de inóculo. El tiempo de generación, es el tiempo necesario para que una célula se multiplique en horas o días, puede calcularse a partir µmax (Costa y Kristbergsson, 2009).

Figura 01: Curva de crecimiento sigmoidal ajustado a los datos experimentales establecidos (Costa y Kristbergsson, 2009). Los valores de los parámetros del modelo de Gompertz se tomaron de una investigación que se trabajó en Pseudomans a diferentes temperaturas. Los valores tomados, solamente son para simular el tiempo de vida útil mediante un programa de Visual Basic de un producto.

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III. RESULTADOS Tabla 01: Resultados obtenidos de la Pseudomona spp. a diferentes temperaturas en carne de vacuno.

Fuente: Zhang et al., 2011.

Figura 02: Las curva de crecimiento a diferentes temperaturas de Pseudomonas spp. En carne de vacuno almacenado aeróbicamente a 0, 4, 7, 10, 15 y 20°C (•, ☆, x, +, *, T) respectivamente (Zhang et al., 2011)

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3.1. PRESENTACIÓN DEL FORM

En el ingreso de datos se digitará los valores (T°, No, Nmax, µmax y  ) que se encuentran en la tabla 01 (parte inferior de la gráfica), luego presionar el botón de comando “CALCULAR”. Instantáneamente se calculará los parámetros de Gompertz (A, C, B y M), el crecimiento del microorganismo junto con la gráfica. Finalmente presionar el botón de comando “LIMPIAR”. En este programa se puede probar con otras temperaturas con sus respectivos valores (también se encuentran en la tabla 01).

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3.2. EJECUCIÓN DEL PROGRAMA

Una vez ejecutado, se mostraran los resultados correspondientes, así como la gráfica, mostrando la fase lag y la máxima velocidad de crecimiento exponencial mediante las líneas punteadas.

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IV. CONCLUSIONES  La bacteria responsable del deterioro es la Pseudomona spp.; que se caracteriza por ser un agente patógeno introducido al producto por un mal almacenamiento.  El nivel máximo de contaminación de Pseudomona spp., que deteriora el producto es de 8,7884 Log (UFC/ml) a temperatura ambiente (20°C).  El tiempo de vida útil estimada del producto (chicha morada) es de 88 horas almacenado a temperatura ambiente (20°C).

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V. BIBLIOGRAFÍA 1. Agricultural Research Service. 2013. Pathogen Modeling Program (PMP) Online. Disponible en: http://pmp.arserrc.gov/PMPOnline.aspx?ModelID=3&Aerobic=False 2. Beldarraín, T.; Nuñez, M.; Ramos, M.; Bruselas, A.; Santos, R. y Vergara, N. 2007. Modelo predictivo del efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento de E. coli y Alcaligenes sp. Revista de Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 17, No 3. Disponible en: http://revistas.mes.edu.cu/greenstone/collect/repo/import/repo/20090319u/08644497173031.pdf 3. Costa, R. y Kristbergsson, K. 2009. Predictive modeling and Risk assessment. Editorial Springer, New York – USA. 4. Siciliano, M. 2010. Estudio de la vida útil de queso crema utilizando microbiología predictiva. Tesis de maestría en Tecnología de Alimentos. Universidad Tecnologica Nacional. Buenos Aires – Argentina. Disponible en: http://posgrado.frba.utn.edu.ar/investigacion/tesis/MTA-2011-Siciliano.pdf 5. Valbuena, E.; Barreiro, J.; Sánchez, E.; Castro, G.; Kutchinskaya, V. y Briñez, W. 2008. Predicción del crecimiento de Lactococcus lactis subsp. Lactis en leche descremada estéril en función a la temperatura. Revista Científica, FCV-LUZ/ Vol. XVII, N° 6: 745 – 758. Disponible en: http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S079822592008000600014&script=sci_arttext 6. Zhang, Y.; Mao, Y.; Li, K.; Dong, P.; Liang R. y Luo, X. 2011. Models of Pseudomonas growth kinetics and shelf life in chilled longissimus dorsi muscles of beef. Asian – Aust. J. Anim. Sci. Vol. 24, No. 5: 713 – 722.

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