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Título: Metabolitos secundarios de hongos endófitos y fitopatógenos. Secondary metabolites of plant pathogens and endophytic fungi. Autor: Leonor Carrillo Càtedra de Microbiologìa Agrìcola, Facultad de Ciencias Agrarias, UNJu Resumen: Las plantas parecen totalmente autónomas, sin embargo, tienen hongos asociados en sus hojas y raíces. Estos hongos sintetizan metabolitos secundarios durante la fase estacionaria de su crecimiento, los cuales intervienen activamente en las relaciones mutualistas o patogénicas. Algunos de estos metabolitos son tóxicos para insectos y mamíferos por lo cual son importantes en el ambiente agrario. Palabras clave: metabolitos, hongos, endófitos, fitopatógenos

Summary: Plants seem to be totally autonomous, however, have in their leaves and roots associated fungi. These fungi synthesize secondary metabolites during the stationary phase of growth, which are actively involved in mutualistic or pathogenic relationships. Some of these metabolites are toxic to insects and mammals which are important in the agricultural environment.

Key words: metabolites, fungi, endophytes, plant pathogens 1

1. Introducción Hongos Los hongos comprenden a microorganismos unicelulares (levaduras) y filamentosos (mohos), así como macroorganismos (setas, bejines y otros). Los filamentos (hifas) presentan septos perforados, o carecen de ellos, lo que permite el movimiento del citoplasma. Las hifas generan un micelio que se extiende radialmente sobre una superficie plana. Los hongos se multiplican por medio de esporas. Las de origen asexual se encuentran dentro de esporangios (esporangiosporas) o se desarrollan sobre las hifas o bien en el ápice de los conidióforos (conidios). Estos últimos en algunos casos están reunidos en un coremio, dentro de un picnidio o sobre una acérvula. Las esporas de origen sexual reciben distintos nombres según el tipo de hongos (ascosporas, basidiosporas, oosporas, zigosporas) y se originan en cuerpos fructíferos de morfología diversa. Los esclerocios son estructuras de resistencia desarrolladas sobre las colonias y las clamidosporas son células modificadas que sobreviven al micelio (Webster y Weber, 2007). El concepto morfológico de especie (morfoespecie) está basado en la similitud del aspecto y presenta dificultades para definir los límites de la misma porque las pocas características usadas pueden variar por la influencia del ambiente. El concepto biológico de una especie está definido por el cruzamiento. El primer problema consiste en identificar las barreras entre individuos morfológicamente similares y este concepto no se puede aplicar siempre a los organismos homotálicos y asexuales. Tanto el concepto fisiológico como el ecológico parecen razonables cuando se trata de hongos parásitos o simbióticos y se ha usado con los patógenos vegetales. Las plantas parecen totalmente autónomas, sin embargo, tienen en sus raíces hongos asociados formando micorrizas, cuya función más importante es absorber los elementos minerales menos móviles del suelo y transferirlos a la planta hospedante, mientras ésta proporciona compuestos carbonados al hongo. El término endófito describe al microorganismo que pasa toda su vida o parte de ella dentro del tejido vegetal sin causar signos visibles de infección. Los asociados a las plantas herbáceas causan grandes cambios en el crecimiento y composición química de las mismas. Los hongos perjudiciales tienen un período endofítico muy corto, aunque algunos patógenos latentes suelen estar asintomáticos durante semanas o meses. Se han encontrado endófitos en cada órgano vegetal, aunque la distribución dentro de la planta es heterogénea (Moore y otros, 2011). 2

Tabla 1.1. Reinos, divisiones y subdivisiones de los hongos propiamente dichos y organismos relacionados (Moore y otros 2011; Spatafora y otros 2016).  PROTOZOA: principalmente fagotróficos, sin pared  Myxomycota: organismos mucosos, plasmodiales o unicelulares, de vida libre  Plasmodiophoromycota: plasmodio intracelular, zoosporangio, parásito obligado  Acrasiomycota: ameboide, saprobios  CHROMISTA: no fagotróficos, flagelos con mastigonemas (tipo pincel), pared con celulosa  Labyrinthulomycota: células deslizantes dentro de una red tubular, gametas biflageladas  Hyphochytriomycota: holo o eucárpico, esporangio, zoosporas con un flagelo anterior  Oomycota: unicelular o micelio sin septos, esporangio, zoosporas con dos flagelos, hifa somática diploide, reproducción oogámica  EUMYCOTA: osmotróficos, pared con quitina  Chytridiomycota: unicelular o micelial, zoosporas con solo un flagelo posterior, meiosis zigótica  Neocallimastigomycota: anaerobios, con hidrogenosomas  Blastocladiomycota: meiosis en esporos, gametotalo haploide, esporotalo diploide  Microsporidia: parasito unicelular, mitocondrias muy reducidas  Mucoromycota: micelio en general sin septos, zigosporas por conjugación gametangial 

Mucoromycotina: saprobios en su mayoría, mitosporas en esporangios



Mortierellomycotina: esporangios sin columela



Glomeromycota: agentes de las endomicorrizas arbusculares

 Zoopagomycota: forma esporangios, merosporangios o conidios, zyposporas por conjugación gametangial 

Entomophthoromycotina: parásitos de artrópodos o saprobios



Zoopagomycotina: parásitos



Kickxellomycotina: saprobios, parásitos o simbiontes

 Dikarya  Ascomycota: meiosporas dentro de ascas, anamorfos conidiales 

Pezizomycotina: micelio septado, ascas en ascomas diversos

3



Taphrinomycotina: parásito, micelio subcuticular o subepidérmico, ascas desnudas



Saccharomycotina: levaduras brotantes, ascas libres

 Basidiomycota: meiosporas sobre basidios o estructura equivalente, micelio con septos doliporo o levaduras 

Agaricomycotina o Agaricomycetes: basidioma visible carnoso, coriáceo o duro; hifas con fíbulas; basidio sin septos primarios sobre laminillas, poros o en gasteroma; saprobios (epígeos, hipógeos o lignícolas) o ectomicorrízicos, raramente parásitos o Tremellomycetes: basidioma visible gelatinoso o ceroso; basidio septado; lignícolas o micoparásitos o Dacrymycetes: basidioma gelatinoso, basidio bifurcado, parentesoma no perforado



Pucciniomycotina: meiosporas en soros, micelio sin fíbulas, parásitos obligados de plantas o insectos (royas)



Ustilaginomycotina: con fase levaduriforme, septo hifal por lo común sin doliporo (carbones)

Crecimiento Los mohos son organismos saprobios, simbiontes o parásitos, que tienen un área superficial amplia para absorber nutrientes y excretan enzimas para digerir parcialmente el sustrato orgánico que los nutre, cuya masa micelial contiene tanto células jóvenes como viejas. La trofofase es la etapa de captación de nutrientes y aumento del peso seco, mientras que la idiofase está asociada con el agotamiento de nutrientes y la síntesis de la mayoría de los metabolitos secundarios (Kale y Bennett, 1992). El área superficial es amplia y la actividad dinámica de esta estructura conduce a una interrelación íntima con el ambiente y los factores extrínsecos (temperatura, pH, actividad del agua, composición química del sustrato) tienen influencia sobre el crecimiento y la biosíntesis (Moss 1991). En general requieren una alta disponibilidad de agua, sin embargo algunos son xerófilos, tal es el caso de Xeromyces bisporus que puede crecer hasta en ambientes con una actividad de agua (aw) de 0,62 debido a la presencia intracelular de una alta concentración de solutos compatibles, como glicerol y otros polialcoholes, que contrarrestan el efecto de la pérdida de agua. Entre los mohos contaminantes que crecen en ambientes con aw entre

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0,75 y 0,90 se encuentran especies de Aspergillus, Eurotium, y Penicillium (Carlile y otros, 2001). Los mohos epífitos requieren para la germinación una aw de 0,85-0,90, para el crecimiento 0,88-0,92 y para la esporulación 0,90-0,92. Esto equivale a una humedad relativa en equilibrio (HRE) de 85-90, 88-92 y 90-92% o expresado como potencial agua (Ψ) -22,4 a 14,5, -17,6 a -11,5 y – 14,5 a -11,5 MPa respectivamente. En cambio, el límite menor de aw para la esporulación en los patógenos oscila entre 0,90 y 0,98, como es el caso de Fusarium. Los hongos se desarrollan bajo un amplio rango de temperatura entre 0 y 35°C, aunque algunos pueden hacerlo a 40°C o más. Las especies psicrotolerantes crecen a la temperatura de congelación, así el rango de crecimiento en Penicillium aurantiogriseum va de -4 a + 35ºC, y las termotolerantes por sobre los 40ºC, como Humicola lanuginosa o Aspergillus fumigatus que alcanzan los 55°C, pero las ascosporas de Neosartorya fischeri y algunos otros hongos pueden sobrevivir a temperaturas extremas en ambientes secos (Lacey, 1989). Para la mayoría de las especies el rango de pH más favorable es 5,5 - 6,5 y algunos toleran condiciones muy ácidas. Los hongos requieren oxígeno para vivir, pero las levaduras y unos pocos mohos también tienen un metabolismo fermentativo. La concentración de O2 puede bajar hasta 4% antes que se observe un cambio importante en la velocidad de crecimiento de muchas especies. El aumento de la concentración de CO2 en la atmósfera hasta 5-10% suele estimular el crecimiento de algunas especies cuando el Ψ es alto. La tolerancia de Penicillium roquefortii a un alto nivel de CO2 disminuye con un descenso en la concentración de O2 y la temperatura. La luz no parece ser un factor limitante, especialmente en aquellas especies que poseen pigmentación oscura (Carlile y otros 2001). La radiación ultravioleta reduce la viabilidad de las esporas, y la luz azul disminuye la biosíntesis de algunos metabolitos, como es el caso de ocratoxina y citrinina (Scmidt-Heydt y otros, 2012). Por otra parte, las condiciones bajo las cuales hay un número de hongos mayor son aquéllas en las cuales pueden sobrevivir o competir más frente a otros organismos, no crecer mejor (Carlile y otros 2001). Metabolismo secundario El metabolismo secundario consiste en un pequeño número de procesos enzimológicos que convierten a unos compuestos intermediarios del metabolismo primario en otros, los 5

cuales permiten la comunicación intercelular facilitando la defensa y competitividad frente a otros organismos. La mayoría de los metabolitos secundarios tienen su origen en un pequeño número de intermediarios (figura 1.1).

Figura 1.1. Interrelaciones entre el metabolismo primario y las principales rutas para síntesis de los metabolitos secundarios (Moore y otros 2011). Entre los compuestos policetónicos se encuentran aflatoxina B1 y citrinina sintetizadas por Aspergillus, y la zearalenona formada por Fusarium. La ruta del shikimato conduce a una variedad de productos, tal como aminoácidos aromáticos, ácido lisérgico y ergocristina formada por Claviceps purpurea. Algunos metabolitos secundarios derivan de péptidos, entre ellos están las penicilinas y cefalosporinas. La modificación de los ácidos grasos conduce una variedad de metabolitos que incluye, entre otros la brefeldina presente en algunos Penicillium. Los terpenos derivan de unidades isoprenoides, los cuales pueden ser de cadena abierta o cíclicos, y la síntesis ocurre por sucesivas condensaciones tal como ocurre con el ácido giberélico (Moore y otros, 2011). 6

Muchos de los metabolitos secundarios conocidos son producidos por especies de Aspergillus, Penicillium y Talaromyces, en comparación Fusarium y Trichoderma forman pocos metabolitos. Éstos son definidos como pequeñas moléculas producidas durante la diferenciación química y morfológica y que luego son excretadas o depositadas en o sobre la pared celular (Frisvad, 2016). Tales metabolitos favorecen la prevalencia del moho frente a otros microorganismos y parte de ellos son tóxicos para animales y/o plantas (Swanson, 1987). Tabla 1.2. Origen biosintético de algunos metabolitos secundarios (Moss, 1987; Mousa y Raizada 2013) Precursores

Género

Productos del metabolismo secundario

Aminoácidos

Aspergillus

Ácido aspergílico

Penicillium

Gliotoxina

Pithomyces

Esporidesmina

Rhizoctonia

Eslaframina

Trichoderma

Gliotoxina

Fusarium

Tricotecenos: desoxinivalenol,

Mevalonato

neosolaniol, toxina T-2, otros Acetil y malonil

Aflatoxinas, citrinina,

Aspergillus

coenzima-A

esterigmatocistina, patulina Fusarium

Zearalenona

Penicillium

Ácido penicílico, citreoviridina, citrinina, luteoskirina, rugulosina

Intermediarios de

Byssochlamys

Ácido byssoclámico

ácidos tricarboxílicos

Penicillium

Ácido glaucánico, rubratoxina

Aminoácidos +

Aspergillus

Ácido ciclopiazónico, fumitremórgeno

mevalonato

Claviceps

Alcaloides del ergot

Aminoácidos +

Aspergillus

Ocratoxina A

policetonas

Helminthosporium

Citochalasina

Metarrhizium

Citochalasina

Penicillium

Ocratoxina A

Myrothecium

Roridina, verrucarina

Policetonas + mevalonato

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2. Endófitos Diversos hongos han sido aislados de los tejidos internos sanos de plantas terrestres y acuáticas. Estos endófitos están presentes en casi todas las partes de la planta: hojas, tallo, raíz, rizoma, y suelen llamarlos patógenos asintomáticos porque bajo ciertas condiciones algunos pueden causar daño y no es claro si todos son mutualistas. Diferentes factores pueden disparar la transformación del hongo saprobio o mutualista a patógeno. Por otra parte, la comunidad microbiana del filoplano es muy distinta a la endofítica a pesar estar muy próximas (Moore y otros, 2011). Los hongos permanecen dentro del tejido vegetal a menos que surjan como cuerpos fructíferos. Las hojas son colonizadas por una variedad de hongos a las pocas semanas de su emergencia y las colonias permanecen asintomáticas. Las especies fúngicas predominantes corresponden a los ascomicetos (anamórficos y teleomórficos) aunque también se encuentran algunos basidiomicetos y mucoromicetos (Rodriguez y otros, 1009; Arnold, 2007). En la interacción del endófito fúngico con la planta hospedante, los hongos producen las enzimas necesarias para penetrar y colonizar los órganos aéreos de sus hospedantes, local e intracelularmente, usando solo el fluido apoplástico como medio de crecimiento (Moore y otros, 2011).

Figura 2.1. Compuestos bioactivos en la relación endófitos-planta (Gouda y otros, 2016).

Tabla 2.1. Algunos géneros de hongos aislados de hojas de árboles e hierbas (Osono 2014; Bejarano 2016; Currie y otros, 2014)

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Géneros

árboles hierbas Géneros

árboles hierbas

Acremonium

-

+

Lasiodiplodia

+

-

Alternaria

+

+

Mycosphaerella

+

-

Ampelomyces

-

+

Mucor

-

+

Aspergillus

-

+

Nigrospora

+

+

Arthrinium

+

+

Nodulisporium

+

-

Ascochyta

+

-

Periconiella

+

-

Aureobasidium

+

+

Pestalotiopsis

+

-

Botrytis

-

+

Phialocephala

+

-

Cenangium

+

-

Phialophora

-

+

Chaetomium

-

+

Phoma

-

+

Cladosporium

+

+

Phomopsis

+

+

Coccomyces

+

-

Phyllosticta

+

-

Colletotrichum

+

+

Pleospora

-

+

Coniothyrium

-

+

Pseudocercospora

+

-

Drechslera

-

+

Stenella

+

-

Diplococcium

+

-

Surculiseries

+

-

Discostroma

+

-

Trichoderma

-

+

Discula

+

-

Trichothecium

-

+

Epicoccum

-

+

Tritirachium

+

-

Fusarium

+

+

Tubakia

+

-

Geniculosporium

+

+

Undifilium

-

+

Guignardia

+

-

Verticillium

-

+

Glomerella

+

-

Xylocoremium

+

-

Leptostroma

+

-

Xylaria

+

-

La composición de la comunidad endofítica dentro de una planta está determinada tanto por el hongo (genotipo, competitividad, especificidad del tejido, lugar de la infección) como por el hospedante (genotipo, variaciones en la defensa de la planta, ubicación geográfica). La interrelación es dinámica pues la composición fúngica varía a lo largo de las estaciones, con infecciones subsecuentes a la inicial. La transmisión generalmente ocurre por las esporas llevadas por el aire o el agua y las hifas entran por los estomas o directamente en el tejido. En contraste con la colonización micorrícica, la infección endofítica de las partes

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aéreas es limitada debido a las defensas de la planta, la competencia intra- e interespecífica entre los hongos y otros factores que gobiernan la ocupación del nicho. Los endófitos colonizan los tejidos del hospedante al menos en parte de su ciclo sin signos patológicos aparentes, simultáneamente pueden beneficiar al hospedante mejorando su tolerancia al estrés biótico tal como sequía, aumentando la fotosíntesis y transpiración, protegiéndolo contra patógenos mediante la inducción de la resistencia sistémica de la planta y desalentando a los invertebrados fitófagos. Estos beneficios surgen directamente del metabolismo del endófito o indirectamente a través de la producción de compuestos que alteran la fisiología del hospedante (Currie y otros, 2014). Los endófitos verdaderos son los que se transmiten verticalmente, vía las semillas, de una generación a otra. Estos hongos nunca aparecen fuera de sus hospedantes. También hay muchos endófitos que infectan las plantas mediante las esporas llevadas por el aire y a este tipo de transmisión se la llama horizontal. El número de especies endofíticas verdaderas en las plantas herbáceas es comúnmente bajo, aunque en los árboles y arbustos la diversidad foliar de especies suele ser grande (Braga y otros, 2016). Tabla 2.2. Criterios simbióticos usados para caracterizar los grupos de endófitos fúngicos (Rodriguez y otros, 2009) Clavicipetáceos

No- clavicipetáceos

Criterios

grupo 1

grupo 2

grupo 3

grupo 4

Rango de

estrecho

amplio

amplio

amplio

retoños y

retoños, raíz

retoños

raíz

colonizados

rizomas

y rizoma

Colonización

extensiva

extensiva

limitada

extensiva

baja

baja

alta

---

vertical y

vertical y

horizontal

horizontal

horizontal

horizontal

NAH

NAH y AH

NAH

NAH

hospedantes Tejidos

in planta Biodiversidad in planta Transmisión Beneficios

NAH (no adaptado al hábitat): tolerancia a la sequedad, incremento del crecimiento AH (adaptado al hábitat): pH, salinidad, temperatura 10

Además de la transmisión por las semillas, la colonización de la planta comienza por penetración del hongo desde las aberturas naturales como los estomas, o las lesiones causadas por las prácticas agrícolas o los insectos. El aislamiento se hace depositando sobre el medio de cultivo los fragmentos de la planta cuya superficie fue desinfectada para eliminar los organismos epífitos (Gundel y otros, 2012). Los endófitos clavicipitáceos del grupo 1 (tabla 2.2) infectan pastos y los no-clavicipetáceos son recuperados de tejidos asintomáticos de musgos y otras plantas no vasculares, coníferas y angiospermas. La mayoría aumenta la resistencia del hospedante a los insectos y algunos lo protegen de la herbivoría (Rodriguez y otros, 2009; Estrada y otros, 2013). Los endófitos del grupo 2 son miembros de Dikaria y la mayoría pertenece a Ascomycota como en el grupo 3, teniendo este último un mayor número de especies. Cada grupo de endófitos domina una línea particular de plantas hospedantes o bioma. Así, los Leotiomycetes son aislados con frecuencia en coníferas mientras que los Sordariomycetes se encuentran dentro de plantas tropicales leñosas. Algunas especies de Basidiomycotina y Oomycetes están comúnmente asociadas con árboles o arbustos (Currie y otros, 2014). Algunos endófitos del grupo 2 evitan el estrés del hospedante, tal el caso de Curvularia protuberata que al colonizar los tejidos no embrionarios de la planta Dichanthelium lanuginosum le permite tolerar temperaturas cercanas a los 65ºC. Leymus mollis es un pasto de las dunas que al estar colonizado por Fusarium culmorum tolera la salinidad del agua de mar (300-500mM NaCl). El grupo 3 incluye una diversidad de hongos asociados a las hojas de los árboles, hierbas, helechos y musgos, mientras que el grupo 4 abarca a especies de ascomicetos que forman estructuras melanizadas en las raíces, tales como hifas inter e intracelulares y microesclerocios, coexistiendo con las micorrizas (Rodriguez y otros, 2009). Los hongos producen una gran variedad de metabolitos que no juegan un rol esencial en el crecimiento, desarrollo y reproducción del mismo, sin embargo, tales compuestos son bioactivos y suelen tener una importante función en las interacciones ecológicas. Los endófitos no micorrícicos asociados a las raíces pueden producir fitohormonas como ácido indol-acético y giberelinas promoviendo el crecimiento de la planta (Braga y otros, 2016). Algunos endófitos protegen a las plantas de los animales herbívoros, como es el caso de Epichloe typhina que produce una toxina en la Festuca arundinacea hospedante (Vega y otros, 2008). El control de las enfermedades por medio de endófitos antagónicos es una alternativa para ayudar a reducir o eliminar el uso de productos químicos en la agricultura. Además, los mismos endófitos son afectados por las modificaciones antropogénicas (Azevedo y otros, 2000). 11

Muchos metabolitos están implicados en las relaciones mutualistas y endosimbióticas del hábitat natural, y a modo de ejemplo se indican algunos casos en las tablas 2.3 y 2.4. Tabla 2.3. Ejemplos de interacciones (Braga y otros, 2016) Organismos

Interacción

Compuestos

Moniliophthora roreri -

fitopatógeno

---

Trichoderma harzianum

endófito

butenólido T39, harzianolido sorbicillinol

Trichoderma atroviride-

endófito

ácido indol-acético y relacionados

Arabidopsis sp.

planta

---

Stachybotrys elegans –

micoparásito

trichotecenos, atranonas

Rhizoctonia solani

hospedante

---

Tabla 2.4. Actividad de metabolitos de algunos hongos endófitos (Mousa y Raizada, 2013; Harris y otros, 1988) Endófito

Metabolito

Inhibe/ afecta a

diterpenos Periconia

periconicinas A y B

Bacillus subtilis

triterpenos Pichia guilliermondii

ácido helvólico

Magnapothe oryzae

sesquiterpenos Trichoderma harzianum

trichodermina*

Alternaria solani Rhizoctonia solani.

Xylaria

phomenona*

Cladosporium cladosporiodes C. sphaerospermum

Phomopsis sp.

cycloepoxylactona

Microbotryum violaceum Bacillus megaterium

Phomopsis cassiae

3,12-dihidroxicadaleno

Cladosporium cladosporoides C. sphaerospermum

Microdiplodia

phomadecalina E

Pseudomonas

Phoma

phomadecalina C

Bacillus subtilis

12

Phyllosticta sp.

ácido heptelídico

Choristoneura fumiferana**

Epichlôe typhina

chokols

Cladosporium phlei

derivados isocumarínicos Pezicula livida

R-mellein

Ustilago violacea

alcaloides Acremonium lolii

peramina

gorgojo del tallo

Epichloe, Neotyphodium

ergovalina y otros

ganado

Cryptosporiopsis quercina

cryptocin

Pyricularia oryzae

Pestalotiopsis adusta

pestalachloride A

Fusarium culmorum Gibberella zeae Verticillium albo-atrum

Neotyphodium uncinatum

loline

insectos áfidos

Rhizoctonia leguminicola

swainsonina

Spodoptera sp.** ganado

Metarhizium anisopliae esteroides Colletotrichum

3β,5α-dihidroxi-6β-acetoxi-

Phytophthora capisici

ergostan-7,22-dieno y otros

Gaeumannomyces graminis Rhizoctonia cereales Helminthosporium sativum

compuestos fenólicos Colletotrichum

ácido colletotrico

Helminthosporium sativum

gloesporoides policetónicos Penicillium rugulosum

rugulosin

Drosophila melanogaster

Hormonema dematoides

Spodoptera frugiperda**

Aschersonia samoensis Nodulisporium sp.

nodulisporinas

Microbotryum violaceum

Acremonium zeae

pyrrocidines A y B

Aspergillus flavus Curvularia lunata Fusarium verticilloides Fusarium graminearum Nigrospora oryzae Rhizoctonia zeae

13

Stenocarpella maydis Bacillus mojavensis Pseudomonas fluorescens Poecilomorpha adusta

pestalachloride B

Fusarium culmorum Gibberella zeae Verticillium albo-atrum

péptidos Acremonium

leucinostatin A

Cryptosporiopsis cf.quercina cryptocandin A

Pythium ultimum Botrytis cinerea Sclerotinia sclerotiorum

*también tienen un efecto fitotóxico frente a algunas especies vegetales **larvas 3. Entomopatógenos La expresión de los fenotipos metabólicos en los hongos es un estricto proceso gobernado por las fuerzas de la selección natural, asegurando la supervivencia bajo condiciones ecológicas alteradas. Los metabolitos secundarios permiten a los hongos sobrevivir y competir en un ambiente ecológico cambiante, debido a la presencia de organismos competidores, nutrientes limitados o protección contra insectos fungívoros (Singh y otros, 2016). Los hongos simbóticos endofíticos incluyen a todos aquellos que habitan las partes internas de los tejidos vegetales sin dañar a los hospedantes. Se los suele dividir en dos grupos: aquéllos que no generan estructuras externas y los que forman micorrizas. Los primeros tienen un rol importante en la protección frente a predadores y patógenos. El control de insectos por el uso de entomopatógenos es una alternativa para ayudar a reducir o eliminar el uso de productos químicos en la agricultura, pues éstos además de controlar pestes y microorganismos fitopatógenos, eliminan especies de insectos que a su vez afectan a otras pestes y microorganismos inhibidores del crecimiento y la multiplicación de otros que son dañinos (Strobel y Daisy, 2003). Los hongos entomopatógenos constituyen el grupo de enemigos naturales de muchas variedades de insectos y arácnidos. Comprenden unas 750 especies correspondientes a 90 géneros, distribuídos en el suelo, sobre y dentro de las plantas, y los mismos insectos. Las especies fúngicas actúan sobre la planta hospedante a través de sus interacciones (antagonismo, parasitismo o mutualismo) efectuando la producción de metabolitos 14

funcionales, así las especies de Beauveria, Lecanicillium y Trichoderma inducen una resistencia sistémica adquirida en su hospedante (Singh y otros, 2016). Entre los factores abióticos que afectan la viabilidad y la persistencia de los hongos entomopatógenos en el campo están los rayos ultravioletas, la temperatura, la humedad relativa y los fungicidas. La relación con los hospedantes depende de los nutrientes presentes en los insectos, que son el medio para la propagación, dispersión y persistencia de los hongos. A diferencia de otros agentes, la infección puede ocurrir por el contacto y la adhesión de las esporas a las partes bucales, membranas intersegmentales o a través de los espiráculos (Pucheta-Díaz y otros, 2006). El desarrollo de la infección comienza por la adhesión del conidio, continúa con la penetración del apresorio en la cutícula del insecto y el desarrollo del micelio con la intervención de enzimas (proteasas, quitinasas, lipasas, lipooxigenasas) (Sánchez-Pérez y otros, 2014). Una vez que entra en el insecto, crece un propágulo que daña mecánicamente el hemocele y luego libera una batería de metabolitos entomotóxicos,

principalmente

péptidos

no

ribosómicos,

alcaloides,

terpenos

y

policetónicos. La mayoría de los hongos asociados con insectos pertenecen al orden Entomophthorales (filum Zoopagomycota) y al orden Hypocreales (filum Ascomycota), en cuyo ciclo de vida existe una fase sexual (teleomorfo) o una asexual (anamorfo) o ambas simultáneamente (holomorfo) (Singh y otros, 2016). Los más significativos son Beauveria, Lecanicillium e Isaria, anamorfos del género Cordyceps. Otros son Hirsutella y Metarhizium, anamorfos de Metacordyceps y Ophiocordyceps respectivamente (Sung y otros, 2007). Los primeros ácidos nudilospóricos, que exhiben potentes propiedades insecticidas frente a las larvas de Sarcophaga carnaria, fueron aislados de Nodulisporium sp., endófito de la planta Bontia daphnoides. Dos compuestos, 5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-5’-metil4’-hexenil) benzofurano

y

5-hidroxi-2-(1’-oxo-5’-metil4’-hexenil)

benzofurano,

que

muestran

toxicidad frente Choristoneura occidentalis fueron obtenido de un endófito de Gaultheria procumbens. Otro endófito, Muscodor vitigens, aislado de la liana Paullina paullinoides produce naftaleno, un repelente de Cephus cinctus y otros insectos (Strobel y Daisy, 2003). Los metabolitos de Beauveria bassiana controlan al barrenador Ostrinia nubilalis (6) y la efrapeptina de Beauveria nívea muestra actividad tóxica sobre Leptinotarsa decemlineata (Borges y otros, 2010). Tabla 3.1. Principales grupos fúngicos con miembros entomopatógenos, metabolitos y hospedantes (Singh y otros, 2016; Moore y otros, 2011).

15

Filum/subfilum

Géneros

Metabolitos

Hospedantes

Ascomycota

Cordyceps*

cordycepinas

larvas de lepidópteros

*teleomorfo,

Hypocrella*

ergosterol,

moscas blancas, cocídeos,

** anamorfo

Aschersonia**

dustanin,

nemátodos

hipocrelina, 3hopanetriterpenos Beauveria**

beauvericina,

lepidópteros, coleópteros,

bassianina,

hemípteros, homópteros,

oosporeína,

himenópteros

bassianólido Metarhizium**

swainsonina,

coleópteros, hemípteros,

dextruxinas

isópteros, homópteros, heterópteros, lepidópteros, dípteros (mosquitos), himenópteros, sifonápteros

Isaria** (ex

beauvericina,

Paecylomyces)

beauverólidos,

hemípteros

ácido dipicolínico Verticillium**

ácido

hemípteros,

hidroxicarboxílico, tysanópteros (trips) ciclosporina, ácido dipicolínico, bassianólido Tolypocladium**

efrapeptinas,

dípteros (mosquitos),

tolypin,

phemerópteros (efímeras)

dicetopiperazinas Hirsutella**

hirsutelina A y B

ácaros (Phyllocptruta oleivora), lepidópteros (Galleria melonella)

Nomuraea

ergosterol

lepidópteros, coleópteros,

rileyi**

peróxido

hemípteros

Torrubiella*

Torrubielin B

hemípteros (cocoideos)

16

Pucciniomycotina

Septobasidium

…

hemíperos (cocoideos)

Entomophthoro-

Entomophaga

…

ortópteros (saltamontes),

mycotina

coleópteros Erynia

…

hemípteros (áfidos)

Entomophthora

…

thysanópteros (thrips), dípteros (moscas)

…

Zoophthora

coleópteros, dípteros, hemípteros, himenópteros, lepidópteros, ortópteros, tricópteros

Blastocladiomycota Coelomycidium Oomycota

…

dípteros (moscas negras)

Myiophagus

…

dípteros

Lagenidium

…

dípteros (larvas de

Leptolegnia

…

mosquitos)

Pythium

…

4. Fitopatógenos Los hongos fitopatógenos que son clasificados en necrótrofos, hemibiótrofos u biótrofos, causan alteraciones durante todo el desarrollo de las plantas incluyendo el estado postcosecha y difieren en las estrategias usadas para adquirir nutrientes. Los necrótrofos tiene un amplio rango de hospedantes y producen enzimas que degradan las paredes celulares y toxinas selectivas que pueden ser péptidos o metabolitos secundarios. En contraste, los biótrofos obligados dependen enteramente del tejido de la planta viva y está caracterizado por estructuras de infección tales como apresorios, hifas de penetración e infección y haustorios que les permiten suprimir las respuestas defensivas de la planta y acceder a los nutrientes. La síntesis de sideróforos es importante para la virulencia de algunos mohos (v.g. Cochliobolus heterostrophus, Fusarium graminearum, Alternaria brassicicola) (Pusztahelyi y otros, 2015). En muchos casos la invasión comienza tan pronto como las hojas son expuestas al aire y los hongos continúan desarrollándose a lo largo de todo el crecimiento de la planta, especialmente en la senescencia y la maduración de las semillas (Lacey, 1989).

17

Figura 4.1. Metabolitos secundarios de Alternaria spp. (Pusztahelyi y otros, 2015)

Figura 4.2. Metabolitos secundarios de Fusarium spp. (Pusztahelyi y otros, 2015) Las fuentes de estrés abiótico como la sequedad y el calor afectan las interacciones. Algunos metabolitos secundarios fúngicos, tales como pigmentos, polioles y micosporinas, están asociados con la patogenicidad y/o tolerancia del hongo factores de estrés, incluyendo la temperatura y la luz UV. También la limitación de nitrógeno parece ser un estímulo esencial para la activación dela virulencia induciendo en Fusarium graminearum 18

la síntesis de desoxinivalenol, en Cochliobolus heterostrophus la de T-toxina y en Alternaria alternata la del péptido cíclico AM-toxina. Las fitotoxinas fúngicas se suelen dividir en huésped-selectivas (HST) y no selectivas (NHST). Las HST son activas solamente hacia la planta hospedante, con un único modo de acción y toxicidad para la misma y es esencial para la virulencia del hongo. Casi todas las HST conocidas son producidas por patógenos netrótrfos del orden Pleosporales, dentro de la clase Dothideomycetes y especialmente las especies de Alternaria y Cochliobolus. Estas HST toxinas son tanto compuestos de bajo peso molecular como péptidos cíclicos. Por el contrario, las toxinas NHT no son esenciales para la patogenicidad, aunque pueden contribuir a la virulencia. Otros compuestos fitotóxicos son la cornexistina de Paecilomyces variotii, el tetrapéptido cíclico tentoxina y la AA-toxina de A. alternata, la fumonisina B1 de Fusarium spp., la fusicoccina de Fusicoccum amygdali, el alternariol y el monometil alternariol de Nimbya y Alternaria, la cerulenina de Cephalosporium cerulens, y el zinniol de Alternaria sp. y Phoma sp. (Pusztahelyi y otros, 2015).

Figura 4.3. Metabolitos secundarios de Aspergillus (Pusztahelyi y otros, 2015) Se suele denominar exometabolitos a los metabolitos secundarios pues estas moléculas son excretada o depositadas en o sobre la pared celular y acumuladas, en contraste con los metabolitos primarios. La naturaleza química de las toxinas de los hongos patógenos 19

está relacionada con el grupo taxonómico de los mismos y pueden ser producidas solamente en ciertos estados de ciclo de vida del hospedante o del ciclo de la enfermedad fúngica (Frisvad, 2015).

Figura 4.4. Metabolitos de Paecilomyces variotii (cornexistina), Fusicoccum amygdali (fusicoccina),

Cephalosporium

(ceruleina),

caerulens

Botrytis

cinerea

(botrydial)

(Pusztahelyi y otros, 2015) Productos agrícolas El deterioro de estos productos es debido a un amplio rango de hongos que difieren mucho en sus determinantes ecológicas. Va desde patógenos vegetales, endófitos y saprobios superficiales que dañan los productos antes de la cosecha, hasta los mohos que causan pérdidas post-cosecha. Algunos producen metabolitos tóxicos para los animales y humanos. La cosecha perturba el ecosistema y marca la transición desde la variabilidad del ambiente de campo a las condiciones relativamente estables del almacenamiento. El crecimiento de los mohos antes y después de la cosecha está determinado por el ambiente (especialmente la disponibilidad de agua, la temperatura y la composición gaseosa) y las interacciones con otros microorganismos (pro- y eucariotas) y artrópodos, además de las medidas tomadas para su control (Lacey, 1989). El almacenamiento es un estado anormal de las plantas, donde se amontonan grandes masas de vegetales en espacios limitados, pues los frutos, las hortalizas y los granos almacenados están vivos. Las especies fúngicas del campo requieren un alto contenido de humedad e invaden las plantas antes de la recolección de los granos y en el acopio

20

predominan las que son capaces de crecer con bajo contenido de humedad y alta presión osmótica (figura 4.5).

Figura 4.5. Fases en la producción de metabolitos (Sanchis y otros, 2007) Los factores que influyen sobre la selección de los hongos son intrínsecos (composición del sustrato, aw, pH), extrínsecos (temperatura, humedad, O2, luz), tecnológicos (tratamiento térmico y químico), e implícitos (interrelaciones microbianas) (Sanchis y otros, 2007). Los hongos rara vez están puros sino que, con frecuencia, hay un grupo de mohos, bacterias e insectos interactuando en los micronichos. Las variaciones de temperatura, aw y composición gaseosa pueden originar cambios en las especies predominantes (Lacey, 1989). Metabolitos tóxicos Aunque hay aproximadamente unos 400 exometabolitos considerados tóxicos, desde el punto de vista de la salud humana o animal, los más importantes son aflatoxinas, ocratoxina A, fumonisinas, zearalenona, desoxinivalenol y otros tricotecenos (5). Estas sustancias pueden ser consecuencia de un almacenamiento inadecuado, pero suelen estar presentes antes del acopio. Alternaria, Fusarium, Aspergillus y Penicillium actúan como patógenos pre o post-cosecha de los granos y elaboran metabolitos tóxicos. Aunque Aspergillus y Penicillium son considerados con frecuencia como hongos del almacenamiento e incapaces de formar 21

toxinas antes de la cosecha, los Aspergillus sección Flavi pueden colonizar las plantas de maní durante el ciclo de crecimiento y cuando la planta experimenta estrés por sequía, próximo al tiempo de cosecha, comienzan a formar aflatoxinas en los granos. Lo mismo ocurre con maíz y algodón. A. flavus y especies relacionadas crecen bien con aw reducida (0,80) y las aflatoxinas se producen aproximadamente con aw = 0,85 (Hocking, 2003). Las especies de Aspergillus toxigénicas presentes en Argentina son A. flavus, A. parasiticus, A. arachidicola, A. minisclerotigenes, A. pseudocaelatus, A. pseudotamarii y A. nomius (Varga y otros, 2011). La aflatoxina B1 es hepatotóxica y cuando la exposición a la misma está combinada con hepatitis B ó C el riesgo de un cáncer hepatocelular primario en muy alto (Peraica, 2016). Penicillium verrucosum crece en climas fríos, contamina granos tales como trigo y cebada durante o inmediatamente después de la cosecha a través de la cosechadora, los secaderos y silos, es relativamente xerófilo pues crece con aw = 0,80 y produce ocratoxina A por sobre aw = 0,86. Aspergillus ochraceus, contaminante del maíz, produce la misma toxina que provoca una enfermedad renal en cerdos y humanos (Hocking, 2003). Las ocratoxinas también son generadas por Penicillium nordicum y otras especies de Aspergillus (A. alliaceus, A. auricomus, A. carbonarius, A. glaucus, A. melleus, A. niger) (Peraica, 2016). Los granos no son los únicos productos afectados por la contaminación fúngica antes de la cosecha. Las esporas de A. flavus llegan a los higos en maduración a través de los insectos. Cuando las frutas son secadas al sol, la temperatura cálida y una aw relativamente reducida favorece el crecimiento del hongo y la subsecuente formación de aflatoxinas. Los higos también pueden contener ocratoxina A si son colonizados en la fase tardía de maduración por A. niger, A. carbonarius o A. ochraceus. Las uvas pueden ser contaminadas justo antes de la cosecha por especies de Aspergillus negros productores de ocratoxina A (A. carbonarius y otros), especialmente sin son dañadas por la lluvia. Los mohos xerófilos no suelen ser detectados en los granos recién cosechados pues están en muy pequeño número, y la contaminación ocurre durante el transporte y el almacenamiento. Cuando crecen modifican su microambiente elevando la temperatura y humedad. Aspergillus penicilloides suele ser el pionero junto a Eurotium y Wallemia, seguidos por A. candidus. Una vez que la humedad aumentó (aw = 0,80-0,82) pueden desarrollar A. flavus, A. ochraceus, y A. versicolor (productores de aflatoxinas, ocratoxinas y esterigmatocistina respectivamente), así como algunas especies de Penicillium, pero son incapaces de generar toxinas por debajo de aw = 0,85 (Hocking, 2003). 22

Alternaria y Fusarium no compiten mucho a baja aw y no forman toxinas cuando el grano está seco o durante el acopio. F. culmorum predomina con aw >0,95. F. graminearum y F. culmorum causan enfermedades en diversos cereales, el primero predomina en climas templados y el otro en regiones más frías, y la toxina más importante formada por estas especies es el tricoteceno desoxinivalenol. Una humedad alta favorece la producción de la toxina estrogénica zearalenona (Popovski y Celar, 2013).

Figura 4.2. Niveles combinados de temperatura (ºC) y aw que permiten el desarrollo de mohos toxigénicos. La flecha indica la zona de crecimiento óptimo. (Sanchis y otros, 2007)

Otros hongos productores de tricotecenos son Trichoderma, Trichothecium, Myrothecium y Stachybotrys. Estos dos últimos, al igual que F. acuminatum, producen el tricoteceno T-2 que causa lesiones necróticas y hemorragias (Peraica, 2016). F. verticilloides y F. proliferatum forman fumonisinas responsables de la enfermedad del maíz amohosado o leucoencefalomalacia en los caballos (6). Las fumonisinas, análogos de la esfinganina, constituyen un grupo de 15 metabolitos cuyo miembro más frecuente es la B1 que interfiere en el metabolismo de los esfingolípidos y está clasificada como posible agente cáncerígeno (Popovski y Celar, 2013). También Alternaria alternata produce toxinas análogas de la esfinganina llamadas AAL-toxinas (Mansfield y otros, 2007).

23

Prevención Las opciones posibles en el campo son varias: la utilización de fungicidas, el cultivo de variedades resistentes, la modificación genética de las plantas o la aplicación de estrategias biocompetitivas. Aunque hay evidencia limitada y contradictoria sobre el efecto de los fungicidas, se emplean con éxito cepas atoxigénicas de Aspergillus sección Flavi competidoras de las toxigénicas y semillas genéticamente modificadas para el control de insectos vectores. Después de la cosecha se puede actuar directamente mediante tratamientos que limiten el crecimiento: variación de la aw y temperatura, modificación de la atmósfera, aplicación de antimicrobianos (Sanchis y otros, 2007). Tabla 4.1. Aplicación del sistema de análisis de peligros y control de puntos críticos en productos agrícolas (Park y otros, 2008) Punto de control crítico

Pre-cosecha

Cosecha

Post-cosecha y almacenamiento

Procesamiento y manufactura

Acción correctiva Utilizar variedades resistentes Aplicar un programa de control de insectos efectivo Mantener una irrigación adecuada Hacer una buena labranza, rotación de cultivos, práctica de control de malezas, etc. Cosecha en el momento apropiado Si es posible, mantener a baja temperatura Remover los materiales extraños Secar rápidamente por debajo de 10% de humedad Proteger los productos almacenados de la humedad, los insectos, otros factores ambientales, etc. Almacenar sobre superficies limpias y secas Analizar todos los ingredientes añadidos Controlar las operaciones de procesamiento/manufactura para mantener una alta calidad del producto Seguir las buenas prácticas de manufactura

24

Detoxificación Las prácticas para descontaminar o inactivar los alimentos y forrajes contaminados con toxinas fúngicas comprenden separación física, inactivación térmica, irradiación, el uso de compuestos adsorbentes inorgánicos y la degradación biológica. La limpieza por flotación permite reducir el contenido de aflatoxinas en un lote de maníes de 300 a 20 µg/kg. También se logra reducir un 25% el contenido de desoxinivalenol en harina de trigo por limpieza y pulido de los granos y la cantidad de patulina en manzanas disminuye 93-99% separando las porciones alteradas. La distribución de toxinas en gluten, germen, fibras y almidón es variable, alcanzando un valor mínimo en el almidón producido por molienda húmeda. Por contrario, el salvado resultante de la molienda seca es la más contaminada. El tratamiento de forrajes con amoníaco reduce el contenido de aflatoxinas en casi 99%. Los materiales adsorbentes, como el carbón activado, las zeolitas y las arcillas, disminuyen el contenido de aflatoxinas pero no de zearalenona. Por otra parte, el control biológico es un medio para prevenir la producción de toxinas (Doko y Park, 2008). 5. Análisis Muestreo La muestra es una pequeña porción obtenida de una gran cantidad de material y su distribución puede ser uniforme, selectiva o azarosa. Cuando el lote no es uniforme el muestreo al azar es la técnica apropiada. Se recolectan pequeñas porciones en diferentes áreas o secciones de manera que todos los componentes individuales tengan la misma probabilidad de formar parte de la muestra (Njapau, 2008). La concentración de un metabolito en un lote es estimada por la medición en una pequeña porción del mismo, para luego decidir la calidad de dicho lote. Por tal motivo, hay planes de muestreo para minimizar la clasificación errónea del lote a la hora de decidir si es aceptable o no. El procedimiento utilizado para la toma de la muestra es extremadamente importante. Si el

lote

ha

sido

cuidadosamente

mezclado,

las

partículas

contaminadas

están

probablemente distribuidas de manera uniforme. En este caso poco importa de cual lugar se toma la muestra. Sin embargo, si la muestra tiene grumos, causados por la humedad u otra razón, dichas partículas estarán repartidas irregularmente (Zeng y otros, 2006). En las tablas 5.1 y 5.2 se dan ejemplos del tamaño de las muestras.

25

Tabla 5.1. Protocolo para la recolección de mazorcas (Njapau, 2008). Producto

Muestreo Dividir el campo en secciones de ½ ha. Recoger 3

Campo, 2 a 5 ha

mazorcas en cada una. Desgranar y reducir a una muestra de 5 kg

Campo, mayor a 5 ha

Recolectar 2 mazorcas cada ½ ha. Estimar la cantidad total, tomar las mazorcas de zonas

Depósito en hogar

accesibles, desgranar y mezclar. Obtener 1 kg/100 kg de granos.

Camión o vagón

Tomar 10 muestras y mezclar (mínimo total 5 kg).

Supermercado

Tomar 10 envases de 0,5 kg.

Alimento preparado

Un plato es toda la muestra

En general, la FAO recomienda tomar 200 g de muestra cada 200 kg del producto a analizar. Cuando el lote es muy grande, la muestra también lo es, y en este caso debe ser mezclada y molida antes de obtener la sub-muestra representativa para el análisis. Cuando un gran lote está contenido en bolsas o cajas, se deben tomar varias de éstas dispersas en el mismo. Por otra parte, para tomar la muestra de un lote que se desplaza, tal como una corriente de granos, se debe hacer a intervalos periódicos (Njapau, 2008). Tabla 5.2. Tamaño de la muestra según el producto (Whitaker, 2008) Producto maníes nueces maíz leche

Nº unidades de

Tamaño de la

Muestra total

muestra

unidad (kg)

(kg)

50

0,5

25

consumidor

10

0,5

5

a granel

50

0,5

25

10

0,5

5

10

1

10

50

0,5

25

Envase consumidor y a granel

consumidor y a granel consumidor y a granel

frutas

consumidor y

secas

a granel

26

Suponiendo que el muestreador (figura 5.1) tiene una abertura de 6 cm, se mueve a una velocidad de 30 cm/seg y se quiere obtener 10 kg de un lote a granel de 30.000 kg, el tiempo entre cada toma está dado por la ecuación siguiente: T = (6 cm x 30.000 kg) / (10 kg x 30 cm/seg) = 10 minutos

Figura 5.1. Muestreador automático (Whitaker, 2008)

Figura 5.2. Cuarteador del material para análisis.

Cuando la muestra total es homogénea y mucho mayor que la de análisis se suele usar un separador como el de la figura 5.2 u otro, y se hace un cuarteado o sea, una de las dos muestras recogidas se vierte nuevamente en la tolva y otra vez es dividida, luego se repite el proceso hasta obtener dos alícuotas de unos 200 g, una de las cuales es molida y utilizada para el análisis. En el caso de material no homogéneo, tal como nueces, la muestra total se somete a molienda y luego se obtiene la alícuota analítica (Whitaker, 2008). 27

Curvas de operación Dos tipos de errores están asociados con cualquier programa de muestreo (figura 5.3): lotes buenos pueden ser rechazados (riesgo del vendedor) y lotes malos pueden ser aceptados (riesgo del comprador). Sin embargo, hay métodos para predecir tales riesgos, el número de lotes aceptados y rechazados, y la cantidad de metabolito en ambos lotes, lo que permite elaborar un plan aceptable de investigación de un metabolito en un producto determinado.

Figura 5.3. Forma típica de una curva característica de operación (Whitaker, 2008)

Figura 5.4. Ejemplo del efecto del tamaño de muestra sobre los riesgos asociados (Whitaker, 2008) 28

Figura 5.5. Ejemplo del efecto del límite de aceptación/rechazo (Whitaker, 2008) Aun cuando se empleen procedimientos de muestreo, preparación de la muestra y técnicas analíticas aceptados, hay errores asociados con cada uno de estos pasos. Aumentando el tamaño de la muestra, el de la sub-muestra, el grado de molienda, el número de alícuotas analizadas y usando un método analítico más preciso, se puede reducir la variabilidad del resultado como se observa en las figuras 5.4 y 5.5 (Whitaker, 2008). Extracción de metabolitos Las diversas técnicas usadas para el análisis de los metabolitos incluyen molienda, extracción con una mezcla disolvente, purificación y detección. La complejidad del sustrato y el método para la detección influyen sobre el tratamiento que se aplica. En la extracción se emplean diversos solventes orgánicos y sus mezclas, principalmente acetonitrilo, metanol, acetona y acetato de etilo, así como agua, según las propiedades físicoquímicas del metabolito y la matriz del producto analizado. Las mezclas acetonitriloagua (84:16 v/v), acetonitrilo-metanol-agua (25:25:50 v/v/v) y acetona-agua (70:30 v/v; 60:40 v/v) son usadas para la extracción simultánea de aflatoxinas, ocratoxinas, desoxinivalenol, trichotecenos, zearalenona y fumonisinas presentes en cereales o harinas, pero la eficiencia de la misma depende de la naturaleza del sustrato. La mezcla más conveniente para la determinación de aflatoxina B1 en granos es metanol-agua (8020 v/v). Comúnmente se agita el producto molido con la mezcla disolvente, pero se suelen emplear otras técnicas que usan temperatura, ultrasonido, presión o fluidos supercríticos (Trombete y otros, 2013). El siguiente paso es la purificación o limpieza del extracto y el enriquecimiento del o los metabolitos a analizar. 29

Figura 5.6. Columna de extracción en fase sólida (Zeng y otros, 2006) Las columnas de purificación por extracción en fase sólida (figura 5.6) contienen gel de sílice, florisil o resinas de intercambio iónico para retener al metabolito sobre el adsorbente, el que luego es eluído con la mezcla disolvente (Zeng y otros, 2006). La columna de purificación por inmunoafinidad (figura 5.7) contiene un anticuerpo específico inmovilizado sobre un soporte sólido y al agregar el extracto de la muestra, el metabolito se une al mismo dejando pasar el disolvente. Luego se agrega agua para eliminar las impurezas y finalmente se añade un eluyente para recuperar el metabolito purificado.

Figura 5.7. Columna de inmunoafinidad para purificar la muestra (Zeng y otros, 2006).

30

Análisis La identificación de los metabolitos presentes en el eluato de la columna de purificación se hace mediante técnicas inmunológicas, o cromatográfícas: capa fina (hoy, poco usada), líquida de alta resolución (HPLC) o gaseosa. La cuantificación, directa o previa derivatización, se lleva a cabo por detección de fluorescencia, espectroscopía en el infrarrojo cercano, espectrometría de masas u otra, alcanzando un límite menor que 1 ng/g en algunos casos (Trombete y otros, 2013). Por otra parte, el uso de la columna de inmunoafinidad (figura 5.7) es un método selectivo y eficiente para la recuperación de un metabolito, el que puede ser cuantificado por espectrometría o fluorometría, considerando la variación de la concentración del mismo durante el proceso. El término “método rápido” se refiere a un método más simple, desde el punto de vista operativo, que las respectivas técnicas de referencia. Algunos pueden desarrollarse en menos de 30 minutos con la muestra pre-molida, y por lo tanto son útiles en el campo. El inmunoensayo de flujo lateral o ‘método de las tiras’ está basado en la técnica de la inmunocromatografía. La tira de una membrana transportadora contiene los reactivos secos que son activados al aplicar la solución de la muestra. Cada tira está compuesta por varias almohadillas como se observa en la figura 5.8. Cuando se deposita el extracto, la zona destinada a la muestra se satura y llega por capilaridad a la almohadilla del conjugado que contiene el reactivo específico para la detección (anticuerpo anti-metabolito conjugado con un marcador) y luego migra a lo largo de la membrana hacia la zona de prueba y control (Zeng y otros, 2006). Hay dos tipos de formato, en el sandwich el color indica la presencia del metabolito.

Figura 5.8. Tira de inmunocromatografía y resultado en el formato sandwich (Zeng y otros, 2006) 31

En cambio, en el formato competitivo el color es inversamente proporcional a la concentración del metabolito y la zona de prueba será invisible con una muestra de concentración mayor o igual al nivel de corte previsto, mientras que la zona de control siempre estará invisible indicando la validez del ensayo (Yu y otros, 2015). Sin embargo, es más bien una técnica de presencia/ausencia antes que una cuantitativa rigurosa. El método ELISA está basado en la capacidad de un anticuerpo específico para distinguir la estructura tridimensional de un metabolito específico. La técnica ELISA clásica usa una placa de microtitulación y requiere 1-2 horas para el equilibrio de la reacción antígenoanticuerpo, pero los equipos comerciales corrientes trabajan con la fase cinética de dicha reacción reduciendo el tiempo de incubación a minutos, y aunque hay alguna pérdida de sensibilidad el resultado es exacto y reproducible (Zeng y otros, 2006). Hay dos formas de ELISA, competitivo y no competitivo, y en cada caso puede ser directo o indirecto. Con el ensayo competitivo se obtiene la máxima sensibilidad con una mínima cantidad de anticuerpo (Niapau, 2008).

Figura 5.9. Principio de ELISA competitivo: (a) muestra mezclada con el conjugado; (b) mezcla agregada al pocillo revestido con el anticuerpo; (c) unión del metabolito (libre o conjugado) al anticuerpo; (d) lavado para eliminar material sobrante; (e) se añade sustrato para desarrollar color; (f) se detiene la reacción y se hace la lectura (Zeng y otros, 2006). En el método de ELISA competitivo, directo y cuantitativo (figura 5.9), el pocillo de la placa está recubierto con un anticuerpo que reconoce al metabolito. Se agrega una mezcla del extracto de la muestra y una enzima conjugada con el metabolito. Este conjugado compite con el metabolito libre presente en la muestra, por la unión con el anticuerpo. El exceso de reactantes se lava y se añade el sustrato de la enzima, entonces se desarrolla un color azul. La reacción se detiene por agregado de una solución ácida y la lectura se hace bajo 32

luz de 450 nm con un límite de detección de 2,5 µg/kg. La intensidad del color es inversamente proporcional a la concentración del metabolito en la muestra. Una vez conocida la concentración del metabolito en la muestra, el valor es comparado con el límite aceptación/rechazo predefinido por las normas legales en el caso de sustancias tóxicas para humanos, ganado y animales de granja (Whitaker, 2008). Determinación de la exposición La OMS define la exposición dietaria como una valoración cuali y/o cuantitativa de la ingesta probable de agentes físicos, químicos o biológicos a través de los alimentos. Otra definición establece que corresponde al proceso dirigido a estimar o medir la extensión, frecuencia, y tiempo de exposición a un agente según las características de la población expuesta, y describe las fuentes, rutas e incertidumbres en la determinación. Es importante obtener información segura de la concentración de los metabolitos en los alimentos y del consumo de los mismos. Exposición (ng/kg) /día = [concentración x consumo] / peso corporal Tabla 5.3. Análisis de biomarcadores de exposición (Brera y otros, 2016) Biomarcador País

Muestra Grupo humano Nivel

AFM1

Brasil

orina

Ghana

suero

AFM1

Turquía

OTA

Rep. Checa

OTA

…

1,8-3,9 pg/mL

niños

189 pg/mL

1-2,5 años

5,0-6,2 pg/mL

leche

mujeres

60,1-299,9 ng/ml

suero

adultos

0,28 ng/mL

Sierra Leona suero

niños

2,4 ng/mL

OTA

Italia

orina

…

0,01-0.046 ng/mL

OTA

Turquía

leche

mujeres

0,62-13 ng/mL

DON

China

orina

adultos

4-94 ng/mL

DON

Reino Unido

orina

adultos

1-61 ng/mL

FB1

Sudáfrica

orina

adultos

225 pg/mL

FB1

México

orina

adultos

147 pg/mL

ZEA

Nigeria

orina

…

0,3 ng/mL

ZEA

Italia

orina

adultos

0,056 ng/mL

AFM1 AFB1

AFM1: aflatoxina M1; AFB1: aflatoxina B1; OTA: ocratoxina A; FB1: fumonisina B1; ZEA: zearalenona

33

Los datos de toxicidad y estimación de la exposición a un biomarcador particular ayudan a interpretar e interrelacionar los efectos adversos para la salud. Los biomarcadores o sus metabolitos se pueden medir en los tejidos o fluidos corporales (tabla 5.3). Para ser funcional deben estar correlacionados con la ingesta, tener una vida media de días y poder ser medido con la precisión y especificidad necesarias. La exposición a metabolitos tóxicos de Aspergillus, Penicillium y Fusarium (Tabla 5.4) representa un peligro para la salud y una preocupación sanitaria pues inevitablemente se encuentran en cereales y oleaginosas (Brera y otros, 2016). Tabla 5.4. Evaluación de la exposición (Brera y otros, 2016)

Metabolito

País

Ocratoxinas

(ng/kg corporal)/día 0.32-0,89

veganos

0,9-2,1

Suecia

adultos

0,76-2,10

Italia

niños

1,16-2,42

España

adultos

0,37-1,31

niños

15-44,6

adultos

7,45-29,1

niños

6,48-30,4

adultos

2,44-15,89

Italia

ancianos

12-111

Noruega

adultos

8-19

Holanda

niños

21-55

Fumonisina B1

Francia

Fumonisina B2

Francia

Zearalenona

Exposición

niños

Francia

Aflatoxinas

Grupo humano

(µg/kg corporal)/día T-2

Francia

Tricotecenos HT-2 Francia

niños

4,00-38

adultos

0,11-1,92

niños

10,5-53,1

adultos

0,07-1,82

Alcaloides del ergot Dinamarca niños

34

0,075-0,170

Tabla 5.5. Ingesta diaria tolerable en la Unión Europea (Vettorazzi y López, 2016) Ingesta tolerable

Metabolitos

/kg peso corporal

Año

Metabolitos

Ingesta tolerable /kg peso corporal

Año

Ocratoxina A

120 ng semanal

2006 Zearalenona 0,25 µg diario

2011

Patulina

0,4 µg máx diario

2000 T-2 y HT-2

0,1 µg diario

2011

Desoxinivalenol 1 µg diario

1999 Nivalenol

1,2 µg diario

2013

Fumonisinas

2003 Alcal. ergot

0,6 µg diario

2012

2 µg diario

Tabla 5.6. Niveles máximos permitidos en alimentos en la Unión Europea (Vettorazzi y López, 2016) Aflatoxinas

Nivel máximo (µg/kg)

Ocratoxinas

Nivel máximo

Producto

total

B1

M1

Producto

µg/kg

Maníes, nueces y otros

4-15

2-12

-

Cereales y derivados

3

Frutas desecadas

4-10

2-5

-

Alimentos para niños

0,50

Leche

-

-

0,050

Vino y jugo de uva

2

Maíz y arroz

10

5

-

Frutas desecadas

10

Cereales y derivados

4

2

-

Café

5

Alimentos para niños

-

0,1

-

Café soluble

10

Lácteos para bebés

-

-

0,025

Desoxinivalenol

Alimentos dietéticos

-

0,1

0,025

Cereales

750-1750

Especias

10

5

-

Alimento paraniños

200

-

-

Pastas secas

750

Pan y bizcochos

500

20-

Licores de raíces Patulina Producto

80 Nivel máx. µg/kg

Nivel

Zearalenona

máx.

Producto

µg/kg

Fumonisinas Producto

Nivel máx. µg/kg

Jugo frutas conc.

50

Cereales

75-350

Maíz

1000-4000

Puré manzanas

25

Aceite maíz

400

Cereales desay.

800

Jugos p/ niños

10

Alimento niños

20

Alimento niños

200

La concentración sin efecto adverso observable (NOAEL) y el nivel menor al cual se observan (LOEL)

pueden ser determinados experimentalmente bajo condiciones

controladas y sirven para determinar la exposición diaria tolerable (TDA). Para agentes sin 35

nivel de umbral (genotóxicos) se calculan unos parámetros que permiten predecir el nivel de riesgo asociado a la exposición. En la determinación de riesgos se consideran los grupos vulnerables: niños, ancianos, con deficiencias metabólicas u otros. Para poder extrapolar los resultados obtenidos en animales al hombre, se consideran las diferencias cuali- y cuantitativas en la respuesta a la sustancia tóxica, y además las que surgen de resultados obtenidos en períodos cortos cuando se aplican a situaciones de exposición crónica (Ruiz y Font, 2007). Las aflatoxinas están entre las más importantes sustancias genotóxicas pero aún no se ha fijado el valor de la ingesta diaria tolerable. Se hallan en granos y productos alimenticios en concentraciones que van desde 1 µg/kg a 1 mg/kg (Brera y otros, 2016). 6. Contaminación ambiental Bioaerosol Es una colección de virus, bacterias, esporas fúngicas y otros microorganismos, viables o no, transportados por el aire cuyo tamaño varía de 0,02 a 100 µm, que pueden estar adheridos a las partículas de polvo y gotas. Las fuentes incluyen la actividad agrícola, el tratamiento de aguas cloacales y la deposición de residuos municipales, entre otras. El transporte de bioaerosoles puede ser definido en términos de tiempo y distancia. La microescala implica corto tiempo (< 10 minutos) y corta distancia (< 100 m) y es común en los espacios cerrados. El transporte a mesoescala dura entre 10 minutos y 1 hora, alcanzando desde 100 m a 1 km. La macroescala se refiere a días y distancias de hasta 100 km. La difusión o disipación responde al gradiente de concentración y la gravedad, ayudada por el flujo de aire y la turbulencia atmosférica. Finalmente se depositan por gravedad, difusión descendente, impacto, lluvia o fuerzas electrostáticas. Los factores ambientales más importantes que influyen en la supervivencia son la humedad relativa, la temperatura y la radiación UV. La atmósfera es un ambiente inadecuado para los microorganismos, sin embargo, las esporas fúngicas, cuyo tamaño varía entre 0,5 a 30 µm, resisten al estrés ambiental y están adaptados al trasporte por el aire. La inhalación de las mismas puede causar enfermedades alérgicas o infecciosas, así como intoxicación. Numerosos patógenos vegetales, así como patógenos animales. son diseminados por aerosoles (Pepper y Gerba, 2015).

36

Figura 6.1. Formación de aerosoles (Tesson y otros, 2016) Exposición ocupacional Las rutas típicas de exposición ocupacional a los metabolitos fúngicos son la inhalación y el contacto dérmico (Mayer y otros, 2008). Una característica de esta exposición es la manipulación de productos y materiales a escala industrial generando grandes cantidades de polvo. Así la concentración de toxinas fúngicas en el aire de un granero suele llegar a ser 15 veces mayor que la presente en el material embolsado (Straumfors y otros, 2008). Para que haya exposición a los metabolitos debe haber condiciones favorables para el desarrollo fúngico: nutrientes, humedad, temperatura, pH y a veces luz (Magan y Aldred, 2007). Si se conocen las especies fúngicas que predominan en una zona se pueden predecir los problemas, sin embargo, no es necesario que haya mohos visibles pues un grano limpio puede transportar 103-104 esporas y la fricción con otros granos los libera al aire (Halstensen y otros, 2013). Más obvia es la presencia de mohos sobre residuos y materiales orgánicos húmedos, tal como macetas de cartón reciclado donde crece fácilmente Stachybotrys chartarum (Dill y otros, 1997). Para determinar el riesgo potencial en la exposición ocupacional a metabolitos fúngicos hay que considerar no solo la concentración de los mismos sino también la duración y frecuencia de la exposición, así como el volumen de aire respirado por hora en las condiciones del trabajo, y que no todo el metabolito inhalado es absorbido (Bünger y otros, 2004). Además, algunos metabolitos lipofílicos de bajo peso molecular pueden penetrar la piel humana (Boonen y otros, 2012). 37

Cuadro 6.1. Metabolitos en diferentes ambientes (WHO, 2009) Lugar Molino de maníes Zona de descarado de maníes

Concentración del metabolito 250-410 ng AfB1/g polvo 0,9-72 ng AfB1/m3 aire 0,4-7,6 ng AfB1/m3 aire 2-128 ng OTA/g polvo 2-600 pg/m3 aire

Elevador de granos

0,07-690 pg OTA/m3 aire 0,2-720 ng DON/m3 aire 0,1-501 ng ZEA/m3 aire 0,4-2,8 ng OTA/g polvo

Cosecha de granos

0,1-239 ng DON/g polvo 4-339 ng NIV/ g polvo

Manipulación de trigo a granel 36 ng OTA/m3 aire Manipulación de maíz a granel 127 pg fumonisinas/m3 aire Porqueriza

5-421 ng AfB1/m3aire

Establo

0,2-70ng OTA/g polvo

Gallinero

0,08 ng AfB1/m3 aire

Interior (alfombra)

2-4 ng esterigmatocistina/g polvo 1300 pg tricotecenos/m3 aire

Interior

0,25 ng satratoxina G/m3 aire 0,43 ng satratoxina H/m3 aire 0,009-4 ng roquefortina C/m3 aire

Tratamiento de residuos

1,1-6,1 pg AfB1/m3 aire 3,3-31 pg OTA/ m3 aire

AfB1: aflatoxina B1; OTA: ocratoxina A; DON: desoxinivalenol; NIV: nivalenol; ZEA: zearalenona La humedad es el principal factor el desarrollo fúngico en los interiores y éstos pueden producir compuestos orgánicos volátiles (ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, éteres, fenoles, hidrocarburos, lactonas, terpenoides) durante su metabolismo primario y secundario. El patrón de emisión de las especies de Aspergillus incluye 2-heptanona, 2hexanona, 3-octanol y α-terpineol. Entre los mohos que requieren una humedad relativa en equilibrio superior a 80% se encuentran especies de: Cladosporium, Mucor, Rhizopus, Sporobolomyces, Alternaria, Exophiala, Epicoccum, Fusarium, Trichoderma, Ulocladium, 38

Rhodotorula y Stachybotrys. Sin embargo, otros se desarrollan a valores menores, tal como especies de Aspergillus y Penicillium (Mayer, 2016). 7. Referencias o Arnold AE. 2007. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi. Fungal Biology Reviews 21: 51-66. o Azevedo JL, W Maccheroni, JO Pereira, WL de Araujo. 2000. Endophytic microorganisms. Electron. J. Biotechnol. 3 (1): 15-16. o Bejarano NV, L Carrillo. 2016. Fungal endophytes in sweet orange Citrus sinensis in Jujuy-Argentina. Asian J. of Agriculture and Food Science 4 (1): 54-59. o Bing LA, LC Lewis. 1993. Occurrence of the entomopathogenic Beauveria bassiana in different tillage regimes in Zea mays and virulence towards Ostrinia nubilalis. Agriculture, Ecosystems & Environment 45: 147-156. o Boonen J, SV Malysheva, L Taevernier, JD Di Mavungu, S De Sager, Bart De Spiegeleer. 2012. Human skin penetration of selected model mycotoxinas. Toxicology 301: 21-32. o Borges D, AO Díaz, AN San-Juan, E Gómez. 2010. Metabolitos secundarios producidos por hongos entomopatógenos. ICIDCA 44 (3): 49-55. o Braga RM, MN Dourado, WL Araújo. 2016. Microbial interactions: ecology in a molecular perspective. Brazilian Journal of Microbiology 475: 86-98. o Brera C, F Debegnach, E Gregori, S Colicchia, S Soricelli, B Miano, B De Santis, 2016. Dietary exposure assessment of European population to mycotoxins. Pp. 223260 en: Environmental Mycology in Public Health. C Viegas, AC Pinheiro, R Sabino, S Viegas, J Brandao, C Verissimo, eds. Academic Press-Elsevier, Amsterdam. o Bünger J, G Westphal, A Mönnich, B Hinnendahl, E Hallier, M Müller. 2004. Citotoxicity of occupationally and environmentally relevant mycotoxinas. Toxicology 202 (3): 199-211. o Carlile MJ, SC Watkinson, GW Gooday. 2001. Fungal cells and vegetative growth. Pp. 85-184 en: The Fungi, Academic Press, San Diego. o Currie AF, J Wearn, S Hogson, H Wendt, S Broughton, L Jin. 2014. Foliar fungal endophytes in herbaceous plants. Pp. 61-84 en: Advances in Endophytic Research. VC Verma, AC Gange, eds. Springer, India. o Dill I, C Trautmann, R Szewzyk. 1997. Mass development of Stachybotrys chartarum on compostable plants pots made from recycled paper. Mycoses 40 Suppl 1: 110114. 39

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