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• Camila Espinoza Salas

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ESTEQUIOMETRÍA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

ESTEQUIOMETRÍA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

La conversión microbiológica de carbohidratos para obtener biomasa y productos de interés industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente dependencia de los recursos renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operación de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se están llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energía resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha extendido ampliamente en ciencias básicas y aplicadas. La aparición en el mercado de sensores que permiten medir importantes variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los microorganismos) han ampliado el horizonte para la aplicación de balances de materia y energía. la producción de biomasa (biomasa = concentración de microorganismos expresada en gramos de células secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de C y energía, de nitrógeno y Oxígeno y las producción de CO 2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas en el planteo y cálculo de balances de materia y energía. Antes de proceder a considerar el sistema de análisis propuesto, es conveniente introducir

algunas

definiciones

y

hacer

ciertas

consideraciones

sobre

algunas

“regularidades” observadas experimentalmente en el cultivo de microorganismos. En primer lugar se ha encontrado que la composición elemental de un importante número de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se mantiene prácticamente constante; así podemos definir un “microorganismo promedio” (composición standard) como aquel cuya composición es (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el aproximadamente 5 % restante está representado por sales. Es importante

recalcar que si bien la composición elemental promedio de la biomasa se mantiene prácticamente constante, la concentración intracelular de proteínas, RNA y demás constituyentes celulares puede variar sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estadíos del cultivo de un mismo microorganismo. Teniendo en cuenta esta composición media, podemos escribir lo que sería la “fórmula mínima” de nuestro m.o. promedio como C H 1,79O0,5N0,2 (en la que está representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prácticos definir “1 C-mol de biomasa” como la cantidad de biomasa que contiene 1 átomo gramo de C. Así pues tenemos que:

1 C - mol de biomasa =

12 + 1,79 + 16x0,5 + 14 x0,2 = 25,8 g 0,95

Para conocer la cantidad de biomasa que corresponde a n C-moles de biomasa debemos conocer su composición elemental y en base a dicha composición, el peso de 1 cmol. En términos generales la masa resulta ser: n . Pcmol g de biomasa. De forma análoga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 1 C-mol de sustrato (entiéndase por sustrato fuente de carbono y energía, FCE), 1 C-mol de fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C6H12O6, 1 C-mol de glucosa estará representado por CH2O y pesará 30 g, y para el etanol, 1 C-mol de etanol (CH3O0,5) pesará 23 g. Otro concepto que debemos introducir es el de “grado de reducción” o “grado de reductancia”, el cual será de gran utilidad en el momento de plantear nuestros balances de materia y energía. Tomemos como ejemplo las siguientes reacciones de oxidación: C + O2→. CO2

γ=4

CH4 + 2O2 → CO2 + 2H2O

γ=8

CO + 0,5 O2 → CO2

γ=2

CH2O + O2 → CO2 + H2O

γ=4

CH3O0,5 + 1,5 O2 →CO2 + 1,5 H2O

`

γ=6

Podemos observar que los distintos valores de γ que figuran a la derecha de cada ecuación coinciden con el número de “electrones disponibles” que fueron transferidos desde

el compuesto a oxidar al oxígeno. En general γ se expresa en términos de n° de edisponibles / c-mol. Para calcular el valor de γ de un determinado compuesto se toman los grados de reducción 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el caso del CO 2, H2O y NH3 no se tienen e- disponibles (estados de referencia), luego γCO2 = γH2O = γNH3 = 0. Se considera además que el estado de oxidación predominante del N en la biomasa es -3. En términos generales para un compuesto de fórmula CHaObNc, su grado de reducción vendrá dado por: γ = 4 + a - 2b - 3c

(1)

Si tenemos un compuesto cuya fórmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la forma

CH i O j N k h

h

h

Si tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su γx (donde el subíndice x indica biomasa) será:

γ x = 4,19

e - disp. C - mol

Este valor, junto a Pcmol = 25,8 son dos de las “regularidades” a las que nos habíamos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser empleados en balances de materia y energía en aquellos casos en que se desconoce la composición de la biomasa sin temor de incurrir en errores groseros de cálculo. Otras regularidades observadas en el cultivo de m.o. es que el calor de reacción por mol de e - transferidos al O2 es relativamente constante para la oxidación de una amplia variedad de moléculas orgánicas y corresponde a 27 Kcal/mol e- disponibles transferidos al O2. Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de materia y energía, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera una reacción química simple. r = velocidad de

reaccion 1Cmol S +a mol FN +b O2  → y X X + yP prod +y CO2 CO2 +w H 2O +q (calor )

Donde X significa “biomasa”, cualquiera sea su naturaleza.

Debemos hacer notar que los coeficientes estequiométricos están referidos a 1 Cmol de fuente de C y energía. Así pues:

yx

  C - mol de X C - mol de fte. de C y E  lo mismo para yp e yCO2.  

El balance de carbono para esta reacción de formación de biomasa y producto será:

y x + y p + yCO2 = 1

(2)

De igual forma podemos establecer un balance del grado de reducción: γs + (-4)b = yx . γx + yp . γp

(3)

Reordenando y dividiendo por γs obtenemos

4b y x . γ + γs γs

x

+

yp . γ

γs

p

=1

(4)

o lo que es lo mismo ε+η+ξ=1

donde ε = η= ξ=

4b

γs

(5)

(fracción de e- disponibles de la FCE transferidos al O2)

y x .γ x

γs

y p .γ p

γs

(fracción de e- disp. de la FCE transferidos a la biomasa)

(fracción de e- disp. de la FCE transferidos al producto)

Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservación de la masa y la energía, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos más carbono del que un c-mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los electrones disponibles del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos.

Si asumimos, como ya se mencionó, que el calor de reacción por mol de e disponibles transferidos al oxígeno es constante para un importante número de moléculas orgánicas, el primer término de la ecuación (4) nos da la fracción de energía del sustrato que evoluciona como calor. Si llamamos qo a esa constante con qo = 27 Kcal/mol e- disponibles transferidos al O2, el calor generado en la ecuación l’ vendrá dado por: q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato

(6)

Si conocemos la velocidad de consumo de O 2 de nuestro cultivo podemos calcular la velocidad de producción de calor y por lo tanto los requerimientos de H 2O de enfriamiento para mantener constante la temperatura de nuestro biorreactor. El concepto de e- disponibles nos brinda un método simple de cálculo para chequear los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en llamar “análisis de consistencia interna”. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o (5) con datos obtenidos en el laboratorio, podemos estimar parámetros no medidos y tener idea de cuán confiables fueron nuestras determinaciones. Medidas realizadas en el laboratorio deben encontrarse dentro de los intervalos: 0,94 ≤ yx + yp + yCO2 ≤ 1,06 0,93 ≤ η + ε + ξ ≤ 1,07 Valores inferiores o superiores a estos límites de aceptabilidad determinados estadísticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones experimentales. En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificación de la biomasa producida se efectúa gravimétricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa expresado en g/l (∆x) correspondiente a la utilización de una determinada cantidad de sustrato (∆s) (igualmente expresada en g/l) con lo cual definimos nuestro rendimiento en base a sustrato como Yx = −

∆x al que tomamos como “rendimiento global” en el que sólo se tienen en ∆s

cuenta los valores finales e iniciales de biomasa y sustrato, más rigurosamente Y x debiera ser expresado por el límite ∆x / ∆s con ∆s → 0, esto es: Yx = − negativo es introducido porque x y s varían en sentido contrario).

dx (observar que el signo ds

Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de yx, yp, y yCO2 conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de P cmol de X, S, P y CO2 tal cual vemos a

continuación: yx = Yx

P cmol S ; P cmol X

yp = YP

P cmol S ; P cmol P

yCO2 = YCO2

P cmol S PM CO2

(7)

Resulta de gran interés conocer los destinos que toma la fuente de C y energía durante el crecimiento microbiano y la fracción de la misma empleada por el m.o. para obtener la energía necesaria para llevar adelante sus funciones metabólicas. Por balance de sustrato: ∆s = ∆sx + ∆sp + ∆sE donde

(8)

∆S = Sustrato total consumido ∆Sx = Fracción de sustrato utilizado en la formación de biomasa ∆Sp = Fracción de sustrato utilizado en la formación de producto ∆SE = Fracción de sustrato utilizado para obtener energía

por consiguiente: ∆SE = ∆S - ∆Sx - ∆Sp

∆SE = ∆S + ∆X ..

P cmol S P cmol S + ∆P. P cmol X P cmol P

fE = 1 - yx - yp = y CO 2 fE : fracc. de FCE destinada a la obtención de E.

(11)

Experimentalmente lo que se hace es determinar la producción global de CO2 y conociendo la masa de CO2 y sustrato consumido y calcular ∆SE por estequiometría. Este método presenta dos inconvenientes: en primer lugar existen reacciones enzimáticas que incorporan O2 a determinados componentes celulares (O2 que no es empleado para obtener energía) no obstante este consumo puede ser despreciado frente al global para oxidar la fte.

de C y E; y el más importante es que debemos suponer que γx ≅ γs, caso contrario se introduce un grosero error en el cálculo.

CINÉTICA DEL CRECIMIENTO

CINÉTICA DEL CRECIMIENTO Hasta aquí hemos visto las relaciones estequiométricas que existen en los cultivos microbianos, y cómo a través de ellas es posible obtener información del destino que tiene la fuente de carbono y energía. Las ecuaciones (2) y (4), resumen toda la información que es posible obtener mediante los balances de materia y energía, pero nada dicen acerca de la velocidad, r, con que transcurre el proceso; por lo que ahora centraremos la atención en este aspecto. Convendrá antes definir la forma en que expresaremos las distintas velocidades. De este modo llamaremos a: dx ; velocidad de crecimiento microbiano (o, brevemente, velocidad de crecimiento) y dt

rx =

las unidades serán:

Cmol biomasa L.h

del mismo modo:

rs =

ds dt

 Cmol FCE    = velocidad de consumo de sustrato  L.h 

rp =

dp dt

 Cmol de producto    = velocidad de formación de producto. L.h  

r O2 =

−d O 2

r CO2 =

dt d CO2 dt

 mol O 2    = velocidad de consumo de O2  L.h   mol CO2    = velocidad de producción de CO2  L.h 

Estas velocidades también pueden ser expresadas en diferenciarlo del anterior, las denotaremos con R. Por ej.:

g ; y en este caso, para L.h

Rx =

dx gramos de biomasa ; dt L.h

Análogamente tendremos: Rs, R O 2 , etc. La conversión entre rx y Rx estará dada por: Rx = 25,8 . rx Análogamente: Rs =

g de S . rs c mol de S

R O2 = 32. . rO2 , etc. Velocidades específicas: Corresponden alas anteriormente definidas pero referidas a la unidad de biomasa, es decir:

rx = µ ; velocidad específica de crecimiento. x rs = qs ; velocidad específica de consumo de sustrato (s puede ser la fuente de carbono y x energía o cualquier otro componente del medio)

rO 2 x rp x

= q O 2 ; velocidad específica de consumo de O2.

= q p ; velocidad específica de formación de producto.

etc. Las velocidades específicas suelen brindar información acerca de cuál es la actividad metabólica del microorganismo (o de la biomasa) durante el cultivo, ya que el estar referidos

a la unidad de biomasa cualquier modificación en el valor de µ, qs, etc. estará indicando que "algo" está ocurriendo en el metabolismo del microorganismo en cuestión. De hecho es frecuente que las velocidades específicas varíen durante el cultivo, y es muy común que por ej. el valor de µ al principio del cultivo difiera del que se encuentra en estadios posteriores. Lo mismo vale para qs, q O 2 , etc.

SISTEMAS DE CULTIVO BATCH CONTINUO Y BATCH ALIMENTADO

CULTIVO EN BATCH La evolución del cultivo en el tiempo, sigue una curva típica la cual recibe el nombre de “curva de crecimiento en batch”. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente diferenciables. En primer lugar existe una fase donde prácticamente no hay división celular pero sí aumento de la masa individual de los microorganismos (fase “lag” o fase de retardo). Le sigue una etapa donde el crecimiento ocurre a velocidad específica (µ) máxima y constante = µm (fase exponencial). Al final de esta fase se alcanza la máxima concentración microbiana. Posteriormente hay un rápido período de desaceleración donde µ → 0 y se entra en la fase estacionaria la cual es causada por agotamiento de algún nutriente (el sustrato limitante) o bien por acumulación de inhibidores. Durante esta fase la concentración microbiana (o de biomasa) permanece constante. Finalmente se llega a una última etapa donde la concentración de biomasa disminuye por autolisis o como consecuencia del metabolismo endógeno (fase de decaimiento). La duración de cada una de estas fases es función del microorganismo en estudio y de la composición del medio de cultivo. En particular la fase lag depende además de la fase de crecimiento en que se encuentran las células en el momento de ser sembradas y de la composición del medio de cultivo en que fueron crecidas. Si éste es igual a la composición del medio en que se van a sembrar y las células están en fase exponencial, la duración de la fase lag, en general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que constituye tiempo perdido. La descripción matemática (modelado) de las cuatro fases descriptas es sumamente compleja y escapa a los fines de esta guía, por lo que sólo veremos una más simple que sólo contempla la fase exponencial y la estacionaria. De la definición de µ obtenemos rx = µ . x

(12)

donde x = concentración de biomasa. Hemos visto que µ varía durante el cultivo, siendo un valor constante y máximo en la fase exponencial (µm) y nulo en la estacionaria. Monod ha propuesto una relación muy simple entre el valor de µ y la concentración de sustrato limitante, S, entendiéndose por éste al componente del medio de cultivo que esté en menor

proporción respecto de las necesidades del microorganismo. Por tanto S puede ser la fuente de N, de C, algún aminoácido, etc. La ecuación es:

µ = µm

S KS + S

(13)

A KS se la conoce como Constante de Saturación, y da una idea de la afinidad que tiene el microorganismo por el sustrato en cuestión. A menor K S mayor afinidad. Normalmente KS tiene valores muy pequeños (10-2 - 10-3 g/l) por lo que concentraciones relativamente pequeñas de S son suficientes para hacer que: µ = µm

(14)

Reemplazando la ec. (13) en (12) queda:

rx = µm

S .x KS + S

(15)

Al principio del cultivo todos los nutrientes estarán en exceso, y en particular el sustrato limitante también, por lo que la ex. (15) se reduce a (fase exponencial)

rx = µm x ; o bien:

dx = µm . x dt

(16)

La ec. (16) es fácilmente integrable y si hacemos a t = 0; x = x o (concentración inicial de microorganismos) queda: ln x = ln xo + µm t

(17)

x = xo eµm t

(18)

o bien

Por tanto en esta fase la concentración de biomasa aumenta exponencialmente, y también lo hace rx ya que reemplazando: rx = µm xo e µm t

A partir de la ec. (17) se puede calcular el tiempo de generación del microorganismo (período de tiempo en que la biomasa se duplica) haciendo x = 2 xo y nos queda tg =

ln 2

µm

A medida que transcurre el tiempo de cultivo, S va disminuyendo (y por tanto r x) hasta que finalmente S = 0 (fase estacionaria), y rx = 0

(19)

lo que implica: x = cte = xf

(20)

xf = concentración final de biomasa. Si graficamos ln x vs. t se obtiene un gráfico como el de la fig.

De la fase exponencial se calcula µm mediante la ecuación (17). La duración de la fase lag, tL, se puede calcular del gráfico, o bien haciendo una corrección en la ec. (17).

ln x = ln xo + µm (t - tL) Si tomamos un valor cualquiera de x que corresponda a la fase exponencial, xe, podemos calcular tL. tL = te -

l x ln e µm xo

Consumo de Sustrato

Hemos visto que el rendimiento se definía como yx = -

dx dx / dt rx µ =− = = ds ds / dt rs q s

por tanto rs =

rx yx

(22)

reemplazando en la ec. (22) la ec. (15) queda:

rs =

µm S . . x yx k S + S

(23)

A medida que S tiende a cero, rs también. En fase exponencial será S>> ks y además x estará dado por la ec. (18), por tanto:

ds µ x e − = m o dt yx

µ

mt

(24)

Si a t = 0 es S = So implica:

S = So -

(

)

xo µ m t e −1 yx

(25)

La ec. (25) da la variación de S en función de t durante la fase exponencial. Si se conoce de antemano el rendimiento y x (o Yx) y las concentraciones iniciales de sustrato y biomasa, es fácil estimar el valor de xf ya que: ∆x = -Yx . ∆S

(26)

x - xo = Yx (S - So)

(27)

Si S es el sustrato limitante, se tendrá que para x = xf será Sf = 0, por tanto: xf = xo + Yx. So

(28)

La ec. (27) permite calcular S para un x dado (o viceversa) en cualquier parte de la curva de crecimiento, siempre y cuando Y x (o yx) se mantenga constante. Alternativamente la ec. (27) puede emplearse para verificar si tal supuesto se cumple ya que la gráfica de (x xo) en función de (So - S) deberá ajustarse a una recta. De todos modos siempre es posible calcular un rendimiento global, independientemente de las variaciones que pueda tener durante el cultivo, empleando sólo valores iniciales y finales:

Yx = -

( xf − xo ) ( Sf − S o )

(29)

Consumo de O2 Hemos visto que realizando un balance entre la composición de los gases que ingresan y salen del biorreactor se puede calcular r O 2 . Con este valor y el de la concentración de biomasa, x, se puede calcular a distintos tiempos el valor de q O 2 =

rO 2 x

,

con lo cual tendremos una idea de lo que ocurre con la capacidad respiratoria de los microorganismos durante el cultivo. Al respecto es útil estudiar cuáles son las posibles causas de variación de q O 2 .

1) Sea yx/o =

t

∫o

∆x rO 2 dt

(30)

yx/o = rendimiento de biomasa base a O2 consumido

Al igual que en la ec. (21) podemos hacer:

yx/o =

rx µ = rO 2 q O 2

(31)

de donde reemplazando µ por la ec. (13)

q O2 =

µm S y x/ o k s + S

(32)

µm = q O2m y x/ o

(33)

En fase exponencial es S>> ks y ∴

q O2 =

es decir que en esta fase q O 2 se mantiene constante y con un valor máximo. A medida que S disminuye, q O 2 también hasta que virtualmente se hace nulo en la fase estacionaria. Esto es particularmente válido cuando el sustrato limitante es la fuente de carbono y energía, ya que al agotarse ésta, los microorganismos se quedan sin “combustible” y por tanto el consumo de O2 cesa. No ocurre lo mismo cuando el sustrato limitante es por ej. la fuente de nitrógeno, pues si bien cuando ésta se agote se detendrá el crecimiento, nada impide que los microorganismos sigan respirando ya que cuentan con “combustible” en exceso. 2) Otra causa que afecta el valor de q O 2 es la concentración de O2 disuelto. Por analogía con la ecuación de Monod, se ha propuesto la ecuación:

q O2 = q O2 m

donde C = concentración de Os disuelto.

C ko + C

(34)

Al igual que ks, se encuentra que ko es pequeño, y en general valores de C del orden de 0,8 mg/l (10% de saturación) son normalmente suficientes para que q O 2 = q O 2 m. A la concentración de O2 disuelto por encima de la cual el valor de q O 2 se mantiene constante, se la conoce como concentración crítica (Cc).

PARTE EXPERIMENTAL Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Medio de cultivo: Glucosa ..............................................................................10,00 g/l Urea ................................................................................... 1,50

g/l

K2HPO4 ............................................................................. 1,00

g/l

MgSO4.7H2O ..................................................................... 0,60

g/l

CaCl2.2H2O ........................................................................ 0,10

g/l

ácido cítrico ........................................................................ 0,45

g/l

H3BO3 ................................................................................. 0,10

mg/l

CuSO4 ................................................................................. 0,10 mg/l KI ........................................................................................ 0,10

mg/l

FeCl3 ................................................................................... 0,10 mg/l Na2MoO4 ............................................................................. 0,10 mg/l inositol ................................................................................. 6,00 µg/l biotina .................................................................................. 6,00 µg/l acido fólico .......................................................................... 6,00 µg/l pantotenato de calcio ............................................................ 0,80 mg/l tiamina .................................................................................. 0,80 mg/l ácido nicotínico ..................................................................... 0,80 mg/l ácido p-amino benzoico ......................................................... 0,40mg/l riboflavina ............................................................................. 0,40 mg/l piridoxina .............................................................................. 1,60 mg/l antiespumante ....................................................................... 3 gotas pH 5,50 (ajustado con HCl o H2SO4 1N) Volumen de cultivo: 4,0 l

Los fosfatos se esterilizan por calor húmedo (autoclave), fraccionados en un erlenmeyer con salida lateral, disolviendo la cantidad necesaria para preparar 3,7 l de medio de cultivo, en 500 ml de H2O y se ajusta el pH en 5,50. El resto de los componentes (excepto la urea y la solución de vitaminas) se disuelven en 3,2 l. de H 2O, los microelementos se agregan en solución concentrada 1000 veces a razón de 1 ml/l, se ajusta el pH en 5,50 y se esterilizan, en autoclave, en el biorreactor. El tiempo de esterilización será en ambos casos de 15 minutos. La urea se esteriliza por filtración. Se prepara una solución madre con 500 g/l de urea y se esteriliza con membrana absoluta. Esta solución se adiciona en proporción de 6,0- ml por litro de medio de cultivo. Las vitaminas se preparan en solución concentrada 1000 veces, se esterilizan por filtración y se adicionan a razon de 1 ml/l de medio. Inóculo: Tres erlenmeyers de 1000 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo diluido 2,5 veces se esterilizan por calor durante 10 min. En este caso para mayor simplicidad se esterilizará el medio de cultivo completo (excepto la urea y las vitaminas que se adicionarán en proporción de 0,5 ml y de 0,1 ml de las soluciones madres). Los erlenmeyers serán sembrados el día anterior a la realización de trabajo práctico con células de levaduras provenientes de un cultivo en agar inclinado. Las mismas se resuspenden fácilmente en agua. La temperatura de incubación será en todos los casos de 30°C. Procedimiento: 1.- Termostatizar el biorreactor a 30°C 2.- Conectar el sistema de aireación al filtro estéril del biorreactor. 3.- Conectar el sistema de agitación del biorreactor. Fijar la agitación en 600 rpm. 4.- Adicionar en forma estéril los fosfatos, la urea y las vitaminas al resto del medio de cultivo contenido en el biorreactor. 5.- Calibrar el electrodo para medir O2 disuelto haciendo pasar por el biorreactor, primero una corriente de nitrógeno y ajustando la lectura a 0% de saturación (ajuste del cero) y luego aire a un caudal de 2 l/min., ajustando con la perilla de calibración a 100% de saturación. En ambos casos, antes de realizar los ajustes, se debe dejar transcurrir 10 a 15 minutos. Los gases que ingresen al biorreactor deberán pasar por el filtro estéril.

6.- Calibrar los instrumentos de medida para efectuar el análisis de los gases a la salida del biorreactor (analizador de O2 y de CO2). 7.- Trasvasar, en forma estéril, los tres erlenmeyers de inóculo a otro con salida lateral. 8.- Sembrar el biorreactor y aguardar 2 a 3 minutos 9.- Tomar 15 mL de muestra (descartar antes 2 o 3 mL) y tomar el tiempo CERO. Anotar en cada caso el volumen de muestra y el de descarte. 10.-Medir el porcentaje de O2 y CO2 en lo gases de salida del biorreactor

Análisis de las muestras 11.- 10 mL se centrifugan 10 minutos. Guardar el sobrenadante para determinar concentración de FCE y producto. Lavar (una vez) con agua destilada el pellet de levaduras, centrifugar, resuspender las células con más agua destilada y hacer peso seco a 105°C. 12.- Al resto de la muestra medirle: 12.1.- pH 12.2.- DO a 620. La muestra deberá diluirse de forma tal de obtener lecturas entre 0,1 y 0,6. 12.3.- Control de contaminación por observación microscópica. 13.- Repetir los pasos 9 a 12 cada hora. 14.- Finalizado el cultivo, medir el volumen remanente. Con este dato y los de volumen de muestra y lavado calcular el volumen de cultivo a la hora CERO, 1; 2, 3; etc. El volumen obtenido en cada caso será el utilizado para el cálculo de rO2

y rCO2 a los

correspondientes tiempos.

Resultados Los datos se volcarán en una tabla del siguiente formato y luego se harán las graficas correspondientes en función del tiempo

Hora

T

pH

DO620

X

S

Vextr

Vrem

rO2

rCO2

C.R.

I.- Graficar ln x vs. t. y DO vs. t. Calcular µmax . II.-1 Verificar si YX se mantuvo constante durante el cultivo. II-2 Calcular YX e yX globales. II-3 Calcular el consumo global de O2 y el CO2 total producido. Con estos valores calcular b e yCO2 respectivamente. III- Verificar si se cumplen los balances de carbono y de grado de reducción. ε+η+ξ=1 yx + yCO2 = 1

CULTIVO CONTINUO De los tres métodos usuales para el cultivo de microorganismos, batch, batch alimentado y continuo, es este último el que ofrece mayores posibilidades de control. Por sus características especiales permite controlar el proceso a un valor de velocidad específica de crecimiento (µ) prefijado de manera muy simple. Este punto es de suma importancia ya que el comportamiento de la mayoría de los microorganismos se ve afectado por el valor de µ al que están creciendo. Mediante el cultivo continuo es posible estudiar el efecto de variables como PH, temperatura, concentración de nutrientes, etc., a valores constantes el valor de µ, o bien, fijadas las anteriores, analizar el efecto de µ sobre la estequiometría del crecimiento. De este modo es posible separar los distintos efectos y obtener información valiosa para la mejora del proceso. Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y en un momento dado, normalmente antes que se agote el substrato limitante, se comienza a alimentar con medio de cultivo fresco a un caudal F (Fig. 1).

F, SR

F,S,X,P X P

S

Fig. 1

El volumen del cultivo se mantiene constante. El líquido que sale del biorreactor, a un caudal F tendrá células, y la concentración de nutrientes será menor que en el caudal de entrada debido a que en parte fueron consumidos por los microorganismos. Eventualmente se encontrará también algún producto(s) proveniente de la actividad metabólica de los microorganismos.

Una de las variables de operación fundamental en este tipo de cultivos es la velocidad de dilución, D, la cuál se define como la relación entre el caudal de alimentación, F, y el volumen de cultivo, V.

D=

F V

(1)

Teniendo en cuenta las unidades usuales de F (L. h-1) y de V (L), las de D serán de h -1. El valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del biorreactor por unidad de tiempo, así un valor de D= 0.25 h-1 indica que en una hora se renovó un 25 % del volumen de cultivo, o bien que al cabo de 16 h se habrá renovado cuatro veces el volumen de cultivo. Podría pensarse que luego de la renovación reiterada del volumen de cultivo ya no quedan microorganismos dentro del biorreactor, pero no es así; debe tenerse en cuenta que estos se están multiplicando activamente lo cual compensa las “perdidas” debidas a los microorganismos que son arrastrados fuera del biorreactor por el caudal de salida. Bajo ciertas condiciones ambos procesos se compensan de modo tal que la concentración de microorganismos se mantiene constante en el tiempo, es decir que se habrá alcanzado un estado estacionario. En estas condiciones también se mantendrán constantes en el tiempo las concentraciones de nutrientes, en particular la del substrato limitante del crecimiento, y la de producto(s). Balances de materia: De acuerdo al esquema de la Fig. 1 podemos plantear los siguientes balances de materia para la concentración de microorganismos ( X ) , de substrato ( S ) y de producto (P).

V.

dX = V .r − F . X x dt

V.

dS ~ −V . r = F .S −F .S R s dt

V.

dP = V .r − F .P P dt

(2)

(4)

(3)

Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P ya no varían con el tiempo, lo que equivale a igualar a cero las Ecs. (2), (3) y (4), de donde resulta: r

X

~ =D . X

(5)

~) r = D . (S −S S R

~ r =D . P P

(6)

(7)

~, P ~, S ~ representan las respectivas concentraciones en estado estacionario. La donde X Ec. (6) es válida para cualquier nutriente del medio de cultivo, sea el substrato limitante o no, ya que la misma surge de un balance de materia en el que no se ha hecho ninguna consideración con relación a la naturaleza del substrato considerado. Lo primero que debe destacarse en este tipo de cultivo es que permite determinar experimentalmente y de modo muy simple las velocidades de crecimiento, consumo de substrato y de formación de producto, tal como se desprende de las Eqs. (5), (6) y (7). Del mismo modo permite calcular los rendimientos. Por ej. Si suponemos que S representa a la fuente de carbono y energía, el rendimiento celular se calcula fácilmente: ~ X Y = ~) x / s (S − S R

(8)

De modo similar puede calcularse YP/S , o bien las velocidades específicas. Por ej. Para qs será:

qS =

~) rS D.(S R − S (9) = x x~

mientras que para la velocidad específica de crecimiento será:

µ=

~ rX D. X = ~ =D X X

( 10 )

La Ec. (10) es de suma importancia pues significa que en estado estacionario es µ = D, y como D puede ser variado a voluntad por el operador (variable de operación) resulta que el

cultivo continuo permite “ imponerle” externamente a los microorganismos el valor de µ al que deben crecer. El estado estacionario En el estado estacionario µ = D. ¿Cuanto tiempo demora el sistema en alcanzar este estado?. En rigor, la respuesta surge de la misma definición de estado estacionario, es decir cuando todas las variables del cultivo (X, S, P, concentración de O 2 disuelto y composición de la biomasa) no varían en el tiempo. El criterio práctico que se suele seguir es que, una vez fijado el valor de D, debe esperarse al menos 4.t R, donde tR se conoce como tiempo de retención medio y puede demostrarse que : tR = 1 / D Por tanto si se fija un valor de D= 0.15 h -1, habrá que esperar 26,7 hs. para suponer que se ha alcanzado el estado estacionario, lo que deberá ser corroborado experimentalmente midiendo las concentraciones de X, S, P hasta observar que no varían con el tiempo. Usualmente con 4.tR es suficiente.

PARTE EXPERIMENTAL Microorganismo y condiciones de cultivo Los géneros Rhizobium, Shinorhizobium y Bradyrhizobium en relación simbiótica con plantas leguminosas infectan las raíces de las mismas y estimulan la producción de nódulos, dentro de los cuales las bacterias fijan Nitrógeno (bacterias diazótrofas) y la planta responde entregando a la bacteria nutrientes orgánicos que produce durante la fotosíntesis. La cepa 2011 de Sinorhizobium meliloti, que es capáz de colonizar y nodular plantas de alfalfa es la que utilizaremos para realizar el experimento de cultivo continuo bajo dos condiciones de limitación: - limitado en Carbono, donde esperamos obtener los mayores rendimientos en biomasa y – limitado en Nitrógeno, donde esperamos obtener rendimientos menores ya que estamos frente a un exceso de fuente de Carbono y hay formación de producto extracelular, el exopolisacárido. Las condiciones bajo las cuales se realizarán los cultivos serán: T=30°C pH (controlado automáticamente)=6.8 D (velocidad de dilución)= 0.10 h-1 La velocidad de agitación se mantendrá a un valor tal que asegure alrededor de 25% de oxígeno disuelto en el cultivo (esta condición es sólo para asegurarnos que el cultivo no se limite en Oxígeno). La concentración de O2 disuelto se medirá continuamente empleando un electrodo polarográfico Ingold (Wilmington, MA, USA). Los pasos a seguir son: Preparar los reactores. Chequear todo el sistema de mangueras para agregado de medio de cultivo, de álcali, de antiespumante, entrada y salida de gases, toma de muestra, inoculación, etc.. Preparar el medio de cultivo y esterilizarlo dentro del biorreactor (30 minutos, 121 oC) junto con los electrodos de pH y oxígeno disuelto. Conjuntamente esterilizar los reservorios con medio fresco que se emplearán para alimentar el reactor.

Realizar todas las conexiones necesarias (eléctricas y de tubería), llevar los reactores a temperatura y calibrar el electrodo de oxígeno disuelto. Inocular el reactor con aproximadamente 50 ml de un cultivo de Sinorhizobium meliloti crecido durante 12-18 h en frascos agitados en agitador rotatorio. Calibrar el caudal de las bombas peristálticas a un valor tal que satisfaga el valor de D preestablecido. Nota: los cultivos deben conducirse al mismo valor de D para su posterior comparación. Los cultivos serán chequeados periódicamente (una o dos veces por día). Se determinará: el contenido de O2 y CO2 en los gases de salida del reactor, que el valor de pH y de O2 disuelto sean los requeridos, los caudales de aire y medio fresco que están ingresando al reactor y el consumo de álcali. Se tomarán muestras (alrededor de 30 ml) a las que se les determinará: densidad óptica (650 nm), peso seco por duplicado y se conservarán congeladas muestras de los sobrenadantes de los cultivos para luego determinar en los mismos la concentración residual de fuente de carbono y de nitrógeno. También se deberán tomar muestras de los reservorios para determinar la concentración real de glucosa utilizada en la alimentación de los reactores. Estas determinaciones se realizarán hasta obtener condiciones de estado estacionario en los parámetros medidos y calculados. Durante las dos semanas de curso se llevarán a cabo cultivos bajo 2 condiciones de limitación diferentes: 1er. semana: Cultivo limitado en C (glucosa) 2da. semana: Cultivo limitado en N (amonio) Medios de cultivo El medio mínimo definido que se utilizará para realizar el C. C. será el medio de Evans, que limitado en C tiene la siguiente composición:

glucosa KCl

5.0 g 0.3725 g

NaH2PO4.2H2O

0.78 g

(NH4)Cl

2.675 g

Na2SO4

0.142 g

ácido cítrico

0.21 g

MgCl2.2H2O

0.127 g

Oligoelementos

5 ml

H2O csp

1000 ml

El medio que se empleará para la condición de limitación por Nitrógeno tiene los mimos nutrientes pero la concentración de glucosa se triplicó (15 g.l -1) y la de (NH4)Cl se bajó a 0.8 g.l-1 .

CULTIVO DISCONTINUO ALIMENTADO (BATCH ALIMENTADO) Otro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento (µ) del microorganismo. El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa. ESQUEMA

F(t) SR(t)

Vf, Xf VR = Vf - V0 V0, X0, S0

RESERVORIO

BOMBA BIORREACTOR

Donde F(t): caudal de alimentación Sr(t):concentración de sustrato de la alimentación Vf: volumen final de trabajo Vo: volumen al inicio de la alimentación Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que V o, Xo y So son las condiciones finales de dicho batch. Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la concentración de sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se utilizará el sistema más simple, es decir F=cte y Sr=cte. PRODUCCION DE BIOMASA: ECUACIONES Y DISEÑO El cultivo puede describirse matemáticamente. La resolución de las ecuaciones así obtenidas permitirá calcular la evolución de la biomasa durante el cultivo, la velocidad específica de crecimiento, y la productividad. Asimismo se podrán determinar parámetros de diseño, tales como F y Sr. Para estudiar la evolución de X durante el cultivo se deben plantear las ecuaciones de balance de materia. Sustrato acumulación = suministro - consumo

(1)

d(S. V) µx V = F SR − dt Yx/s

En este caso el volumen no es constante, como ocurre en cultivos en batch o en continuo. Por lo tanto la expresión (1) quedará:

(2)

V

dS dV µx V +S = F.S R − dt dt Yx/s

La condición final del batch es S = 0, pues, como se intenta controlar µ, S no puede ser saturante (recordar a Monod). Si S~ 0, dS/dt = 0, con lo que (2) se transforma en

(3)

F . SR -

µx V Yx/ s

=0

de aquí, y recordando que rx = µ . X

(4)

F . SR =

rx V Yx/ s

esta ecuación indica que la velocidad de producción de biomasa se acomoda a la velocidad de suministro de sustrato, es decir que rx puede controlarse “externamente”, modificando F y/o Sr. La ecuación (3) es en realidad un límite superior ya que dados µ, X y V, cualquier par de valores F, Sr que satisfagan la condición

(4)

F . SR ≤

µ xV Yx/ s

harán que la velocidad de crecimiento esté limitada por la velocidad de alimentación. Esta ecuación (3) será muy útil en el momento de diseñar la alimentación. Biomasa La velocidad de acumulación de biomasa será:

(5)

d(xV) d (xV) = µ x V o bien = rx V dt dt

o, reordenando, (6)

rx =

1 d(xV) V dt

Si se reemplaza en (4) se obtiene (7)

F . SR =

1 d (x V) Yx/s dt

que indica que la velocidad de acumulación de biomasa depende de la velocidad de alimentación de sustrato. Integrando (7), se llega a (8) X V = xo Vo + Yx/s F SR t

Uno de los objetivos planteados es conocer cómo varía la concentración de biomasa con el tiempo. En cultivo en batch, al ser V = cte, X.V es proporcional a X. En BA V no es constante, sino que varía con el tiempo (F = dV/dt). Integrando se tiene (9)

V = Vo + F t

reemplazando en (8) y despejando X, se tendrá

X=

(10)

x o Vo Y FS t + x/s R Ft + Vo Ft + Vo

expresión que describe la variación de X con t a lo largo del cultivo alimentado. Puede darse el caso en que el aumento de V sea tal que haya un efecto de dilución que provoque la disminución de la concentración de biomasa. Así, puede ocurrir que la concentración final alcanzada sea menor que la inicial, pero no así la cantidad total X.V. DISEÑO Se desea obtener una concentración final de biomasa Xf, con un volumen final Vf. El volumen total adicionado durante el BA será: (11)

Vf - Vo = F.t

donde tf es el tiempo total de alimentación. Cuando t = tf, la ecuación (8) se transforma en

(12)

XfVf = XoVo + Yx

s

SR F.tf

Reemplazando (11) en (12), y despejando Sr queda

(13)

SR =

X f V f − X oVo Yx s (V f −Vo )

La ecuación (13) permite calcular la concentración de sustrato limitante en el reservorio. Resta calcular F, cuyo valor debe ser tal que satisfaga la ecuación (4). En particular, para t = 0 (inicio de la alimentación )será:

(14)

F SR≤

µo X oVo Yx

``

s

El valor de tf se calcula a partir de la ecuación (11). NOTA: µo puede ser igual a µmax si la alimentación se inicia el final de la fase exponencial del batch. Debe destacarse que si F.Sr fuera mayor que la velocidad de consumo de sustrato, habría una acumulación de sustrato en el medio, y el crecimiento no sería limitado. Es interesante conocer la variación de µ durante el batch alimentado. Recordando el balance de materia para la biomasa

d ( xV ) 1 d ( xV) = µxV ⇒ µ = dt xV dt

d ( xV ) = Yx s FS R dt Por lo tanto se obtiene

(15)

µ = Yx s FS R

1 xV

Si se reemplaza (8) en (15), será

(16)

µ=

FS R Yx

s

X oVo + FS RYx s t

expresión que indica que µ disminuye con t a lo largo del batch alimentado.

Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t), dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.