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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS PRACTICA N° 1 TEMA: Establecimiento de un Laboratorio de Cultivo de tejidos y preparación de medios. OBJETIVO GENERAL: Identificar a un Laboratorio de Cultivo de tejidos y metodología de preparación de medios de cultivo. OBJETIVOS ESPECIFICOS: 1. Identificar las áreas del laboratorio 2. Reconocer los equipos y reactivos 3. Diseñar un laboratorio para el Cultivo de Tejidos 4. Reconocer los reactivos para soluciones stock MARCO TEÓRICO Según Roca y Mroginski (1991), el cultivo de tejidos como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para las células expresen su potencial intrínseco o inducido. El laboratorio de cultivo de tejido debe disponer de un área destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicación de las plantas producidas; esta área es especialmente necesaria en los laboratorios de investigación y en los de producción comercial. Organización del laboratorio: Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separados para las diferentes funciones que se desarrollan en la práctica, sin embargo, algunas funciones pueden desarrollarse en un mismo ambiente, las áreas principales son: 1. Área de preparación. Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también un espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico, y los reactivos químicos. 2. Área de lavado y esterilizado. Puede estar constituida por dos áreas conectadas entre sí y puede estar localizada dentro del área general de preparación. El área de lavado debe incluir por lo menos un lavado grande, botellas para el agua destilada, basureros para el material vegetal, inorgánico y de vidrio que se deseche. El área de esterilizado debe tener espacio para el autoclave vertical u horizontal. Esta área también puede incluir espacio para estufas, secadoras y un lavadero con agua caliente y fría. 3. Área de transferencia. En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de escisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la Elaborado por: Ing. Ivonne Vaca MSc.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión, o la construcción de cuartos de transferencia. 4. Área de incubación. Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o cámaras de crecimiento. El área de incubación debe tener una temperatura de (20-28 °C), iluminación variable 1000 a 5000 lux y humedad relativa (70-80 %). En el cuarto de incubación se instalan estanterías metálicas o de madera para colocar. Estas estanterías tiene medidas variables y puede tener de ancho 0,30 m y 1 m, de largo de acuerdo con el tamaño del cuarto y la altura de 1.80 a 2.20 m. esta área debe incluir además, un espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en oscuridad. Es necesario propiciar una buena distribución del aire en este cuarto para evitar zonas de recalentamiento por efecto de las luces. 5. Área de observación y examen. Generalmente los microscopios se localizan tanto en el área de incubación como en la de transferencia, pero opcionalmente pueden estar en un área separada. 6. Área de crecimiento. Las plantas que se regeneran se pueden acondicionar o aclimatar y luego trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas. Las áreas arriba se pueden considerar como el núcleo del laboratorio del cultivo de tejidos, pero además se deben contar con las siguientes instalaciones: 7. Áreas de cuarentena y control fitosanitario. El área de cuarentena sirve para la recepción de las muestras o plantas destinadas a la limpieza clonal. El área de control sanitario es donde se realizan las pruebas para comprobar la sanidad del material vegetal, especialmente de enfermedades causadas por virus, bacterias y hongos. 8. Área de oficina. En esta área se debe ubicar el mobiliario de oficina como escritorios, archivos y almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control del laboratorio, los catálogos y otros documentos. También se coloca en ella el equipo de cálculo o computación. Para la construcción del laboratorio de cultivo de tejidos se pueden utilizar estructuras ya existentes. Sin embargo, puede ser necesario levantar dichas estructuras, y en este caso se recomienda hacer una grande, así se facilita el diseño de las áreas 1 y 4 y el de la oficina, ajustándola en el espacio a los requerimientos inmediatos del laboratorio. Medios de cultivo Antes de realizar la asepsia del material vegetal que se va a introducir in vitro, es necesario disponer de Medios de Cultivo esterilizados y dosificados en recipientes adecuados. Una parte importante del cultivo in vitro son los Medios de Cultivo ya que en ellos se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales. Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una Elaborado por: Ing. Ivonne Vaca MSc.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro (Roca y Mroginski, 1991 y Pierik, 1987). Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento. Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo. Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida o con un agente gelificante como el agar (Roca y Mroginski, 1991 y Pierik, 1987). PROCEDIMIENTO Visita al laboratorio para identificar áreas, equipos, materiales y reactivos. Explicación de la elaboración De Soluciones Madre Del Medio De Cultivo Murashige y Skoog Para la realización del medio de cultivo MS se elaboran las siguientes soluciones Madre: Soluciones stock de nutrientes: ⁻ Stock de macronutrientes, ⁻ Stock de Calcio, ⁻ Stock de micronutrientes ⁻ Stock de hierro y EDTA Todas las soluciones se preparan sobre un 70% de agua del volumen final deseado, y sobre ella se van añadiendo uno por uno todos los componentes hasta su completa disolución. Posteriormente se ajusta el volumen final con agua y se almacenan. Usar 100 ml de la solución stock de macronutrientes para preparar 1 L de medio de cultivo MS. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG La elaboración de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre previamente realizadas. Además, se añade la fuente de carbono y el agente gelificante, que normalmente es agar. Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo la misma concentración de algunas sustancias, por ejemplo sales minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras como los reguladores de crecimiento. Tomando como base las sales minerales, vitaminas y fuente de carbono de Murashige y Skoog se pueden realizar múltiples medios de cultivo variando los reguladores de crecimiento o su concentración

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS Elaboración De Soluciones Madre Del Medio De Cultivo Murashige Y Skoog Para la realización del medio de cultivo MS se elaboran las siguientes soluciones Madre: Soluciones STOCK

KNO3 NH4NO3

Stock nitratos 19 g 16,5 g En 100 mL

Stock Hialuros CaCl2.2H2O 4,4 g KI 8,3 mg CoCl2.6H2O 250 ug En 100 mL

Stock Sulfatos MgSO4.7H2O 3,7 g MnSO4.4H2O 169 mg ZnSO4.7H2O 86 mg CuSO4.5H2O 250 ug En 100 mL Stock PBMo KH2PO4 1,7 g H3BO3 62 mg Na2MoO4.2H2O 2,5 mg En 100 mL

Stock NaFeEDTA FeSO2.7H2O 278 mg Na2EDTA 372 mg En 100 mL De las soluciones: nitratos, sulfatos, hialuros, PBMo y NaFeEDTA; debe tomar 10mL para la formulación de 1L de medio MS. NOTA NaFeEDTA: cada componente se disuelve por separado, posteriormente se unen. Guardar en oscuridad.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ESTUDIANTE 1. Mandil con su nombre, cofia y mascarilla 2. Una toalla pequeña (25cm x25cm) codificada (con su nombre) 3. Cepillo para sus manos y uñas (individual) 4. Guantes de látex 5. Manual de la materia(digital o físico), libreta y esfero 6. Sus consultas INFORME Nº 1 Informe Individual: En su cuaderno, desarrolle los ejercicios de disoluciones. Diseño de:  Un laboratorio para Cultivo de Tejidos a gran escala.  Un laboratorio para Cultivo de Tejidos para investigación. Siempre debe presentar con bibliografía y citas bibliográficas, USE NORMAS APA

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS PRACTICA N° 2 TEMA: Fases del cultivo de tejidos (Protocolos de desinfección) OBJETIVO GENERAL: Identificar las fases del cultivo de tejidos (Protocolos de desinfección e introducción) OBJETIVOS ESPECIFICOS: 1. Identificar los reactivos útiles para la desinfección en función del explante seleccionado 2. Desarrollar un protocolo de desinfección sobre semillas dentro y fuera de cámara de flujo 3. Obtener embriones a partir de semillas para su siembra en medio de cultivo MARCO TEÓRICO Para introducir in vitro un material vegetal que se ha desarrollado en el exterior es imprescindible tomar una serie de medidas encaminadas a eliminar los posibles microorganismos que puedan estar establecidos sobre él. En primer lugar hay que seleccionar material vegetal en un adecuado estado de nutrición y libre de enfermedades y plagas. Si el material presentase algún problema habría que descartarlo o realizar los tratamientos adecuados (Roca y Mroginski, 1991 y Pierik, 1987). Una vez seleccionado el material vegetal, y previamente a la introducción in vitro, es conveniente someterle a una serie de tratamientos para reducir al máximo los microorganismos superficiales. Por ejemplo se pueden realizar aplicaciones periódicas de fungicidas y bactericidas sistémicos. Algunos microorganismos pueden tener una alta capacidad saprofítica que les permite colonizar rápidamente el medio de cultivo e imposibilitar el desarrollo del material vegetal (Roca y Mroginski, 1991 y Pierik, 1987). El paso previo a la instalación in vitro de un material vegetal es la asepsia superficial. El protocolo de este proceso dependerá de las características del tejido empleado. Para trabajar en condiciones asépticas, es recomendable realizar este proceso en una cámara de flujo laminar y emplear material estéril. El ambiente debe mantenerse limpio con la superficie de trabajo desinfectada con etanol al 70% antes y después de usarla. Se debe usar bata de laboratorio y lavarse bien las manos (Roca y Mroginski, 1991 y Pierik, 1987).

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS PROCEDIMIENTO ASEPSIA SUPERFICIAL DE MATERIAL VEGETAL Se pueden considerar dos situaciones dependiendo que el explante que se va a emplear esté protegido en el interior de un órgano, como el embrión, o esté en contacto con el exterior, como brotes y yemas. Para los explantos en el interior de órganos hay que realizar los siguientes pasos: 1. Realizar una asepsia superficial del órgano con una solución de alcohol 70% (máximo 1min) 2. Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar el explante (ejemplo: embrión). 3. Colocar el explante en el medio de cultivo MS. Con un material vegetal en contacto con el exterior se puede seguir el siguiente protocolo (Vaca, 2008): 1. Obtener el explante más grande posible, hacer un lavado en una solución con jabón (cepillar de ser necesario o usar un esponja) para eliminar residuos provenientes de campo. 2. Lavar en agua corriente. 3. Cortar segmentos nodales o apicales de crecimiento activo y de un tamaño ligeramente superior al deseado. Eliminar las hojas, si las hay, y colocarlos en un recipiente con agua destilada. 4. Esterilización de los explantos en un recipiente estéril con alcohol al 70%, durante 1 minuto. 5. Esterilización de los explantos en un recipiente estéril con hipoclorito de sodio al 20% (v/v) o 1.2% i.a. + una gota de tween, durante 5-20 minutos. 6. Usted puede usar otras soluciones como: agua+yodo; agua+vinagre, entre otras. 7. Lavar los explantos con abundante agua estéril y depositarlos sobre papel de filtro para eliminar el exceso de agua. 8. Cortar una pequeña porción del extremo del explanto (por donde se cortó inicialmente) y clavar verticalmente la parte basal (inferior) en el medio de cultivo. 9. Etiquetar los recipientes con un código adecuado que identifique el medio de cultivo, el vegetal y la fecha. 10. Colocar los explantos en una cámara de crecimiento en oscuridad o a 25 ºC y 16 h de fotoperiodo.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ESTUDIANTE 1. Mandil con su nombre, cofia y mascarilla 2. Una toalla pequeña (25cm x25cm) codificada (con su nombre) 3. Jeringuillas 4. Manual de la materia, libreta y esfero 5. Cepillo para sus manos y uñas (individual) 6. Etiquetas de grupo e individuales estériles 7. Su consulta 8. Semillas varias 9. Material vegetal para su proyecto (explantes) 10. Gasas y cedazo pequeño 11. Esponjas suaves 12. Cepillo pequeño 13. Vinagre 100mL, jabón líquido, cloro 100mL, Agua oxigenada 100mL, yodo 100mL, Tetraciclina 1 cápsula, Fungicida 1g, 1 limón (grupal) INFORME Nº 2 Informe grupal (Presentación) Objetivos, metodología, resultados y discusión (Evaluación de al menos 3 variables de interés para la fase correspondiente. Seguimiento semanal. Presentar tablas de resultados, ANOVA, CURVAS DE SEGUIMIENTO SEMANALES, discusión). USAR FOTOGRAFÍAS Y VIDEO DE SUS CULTIVOS UNICAMENTE. Siempre debe presentar con bibliografía y citas bibliográficas, NORMAS APA

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS PRACTICA N° 3 TEMA: Germinación aséptica de semillas in vitro OBJETIVO GENERAL: Identificar morfogénesis en el cultivo aséptico de diversas semillas OBJETIVOS ESPECIFICOS: 4. Identificar las fases del cultivo de tejidos. 5. Identificar los reactivos útiles para la desinfección en función del explante seleccionado 6. Desarrollar un protocolo de desinfección sobre semillas dentro y fuera de cámara de flujo 7. Escarificar semillas y obtener embriones a partir de semillas para su siembra en medio de cultivo MARCO TEÓRICO Para introducir in vitro semillas es imprescindible tomar una serie de medidas encaminadas a eliminar los posibles microorganismos que puedan estar establecidos sobre él. En primer lugar hay que seleccionar material vegetal en un adecuado estado de nutrición y libre de enfermedades y plagas. Si el material presentase algún problema habría que descartarlo o realizar los tratamientos adecuados (Roca y Mroginski, 1991 y Pierik, 1987). El proceso de germinación de semillas es la recuperación de la actividad biológica de la semilla, y requiere el cumplimiento de una serie de condicionantes ambientales favorables: un sustrato húmedo, disponibilidad de oxígeno, temperatura adecuada para los distintos procesos (Pierik, 1987). En la germinación de semillas se da la absorción de agua, lo cual desencadena cambios metabólicos como la respiración, la síntesis de proteínas, la movilización de reservas. También tiene lugar el proceso de división y alargamiento celular del embrión, que rompe las cubiertas seminales cuando emerge la radícula (Smith, 2000). La germinación de semillas no siempre es posible, hay especies que no son capaces de germinar, pues sus semillas permanecen en estado de latencia durante cierto tiempo, hasta que finalmente pierden la capacidad de germinar (Pierik, 1987). Para la germinación aséptica de semillas de diferentes especies para cultivo in vitro, se debe realizar protocolos de desinfección necesarios para introducirlos en medios de cultivo. Dichos protocolos se debe realizar obligatoriamente para eliminar cualquier fuente de contaminación de las semillas (Smith, 2000). PROCEDIMIENTO ASEPSIA SUPERFICIAL DE MATERIAL VEGETAL Se pueden considerar dos situaciones dependiendo que el explante que se va a emplear esté protegido en el interior de un órgano, como el embrión, o esté en contacto con el exterior, como brotes y yemas. Para los explantos en el interior de órganos hay que realizar los siguientes pasos: Elaborado por: Ing. Ivonne Vaca MSc.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS ⁻ Realizar una asepsia superficial del órgano con etanol al 70 %. ⁻ Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar el explante. ⁻ Colocar el explante en el medio de cultivo MS. EJEMPLO DE: Preparación del explante 1. - Colocar aproximadamente 10 semillas en una gasa (8x8 cm). Gire la tela alrededor de las semillas y colocar en un tubo. 2 - . Enjuague durante 2-3 min en alcohol al 70 % 3 - . Añadir (cloro 20 % 20 ml + 80 ml de agua + 2 gotas de Tween - 20) 4. - Agitar durante 15 min. 5. - Enjuagar las semillas tres veces en agua estéril usando un vaso de precipitación 6.- Quitar las semillas del tubo cultivo, colocarlas en una caja petri estéril y colocarlas en el medio. Una espátula estéril es útil para la siembra de pequeñas semillas de zanahoria, y las pinzas se pueden utilizar para semillas grandes. 7.- Envuelva la unión de la tapa y el tubo de ensayo con parafilm. Colocar las semillas en la plataforma de cultivo para el crecimiento. Usted debe desarrollar un adecuado protocolo de desinfección, para sus semillas. Evaluando diferentes tiempos de exposición y concentración de sus soluciones. MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ESTUDIANTE 1. Mandil con su nombre, cofia y mascarilla 2. Una toalla pequeña (25cm x25cm) codificada (con su nombre) 3. Manual de la materia, libreta y esfero 4. Cepillo para sus manos y uñas (individual) 5. Etiquetas de grupo e individuales estériles 6. Cinta masking 7. Fósforos 8. Marcador 9. Cuchillo 10. Semillas de papaya, durazno, ciprés, limón (10 semillas), varios cítricos 11. Semillas Varias 12. Cedazo pequeño metálico y gasas. 13. Material y reactivos para desarrollar su protocolo de desinfección (Vinagre 100mL, jabón líquido, cloro 100mL, Agua oxigenada 100mL, yodo 100mL, Tetraciclina 1 cápsula, Fungicida 1g, 1 limón (grupal)) 14. Material vegetal para su proyecto (explantes) INFORME Nº 3 Informe grupal (Presentación) Objetivos, metodología, resultados y discusión (Evaluación de al menos 3 variables de interés para la fase correspondiente. Seguimiento semanal. Presentar tablas de resultados, ANOVA, CURVAS DE SEGUIMIENTO SEMANALES, discusión). USAR FOTOGRAFÍAS Y VIDEO DE SUS CULTIVOS UNICAMENTE. Siempre debe presentar con bibliografía y citas bibliográficas, NORMAS APA Elaborado por: Ing. Ivonne Vaca MSc.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS PRACTICA N° 4 TEMA: Morfogénesis: Rizogénesis, brotación y callogénesis OBJETIVO GENERAL: Evaluar la respuesta morfológica de diferentes explantes en medio MS, por medio de cultivo in vitro OBJETIVOS ESPECIFICOS: 1. Seleccionar explantes y aplicar un protocolo de desinfección adecuado. 2. Sembrar en un medio de cultivo. 3. Evaluar el establecimiento y tipo de morfogénesis del explante MARCO TEÓRICO La micropropagación en papa se utiliza principalmente para la producción de semilla, para la colección y la distribución de germoplasma a través del mundo y para el hallazgo de clones de interés en la agricultura. Para este propósito, se utiliza como material de inicio plantas libres de virus. Los métodos de propagación usados se dirigen a producir una gran cantidad de plantas en el tiempo más corto posible. Sin embargo, los inconvenientes principales en la producción de semilla de papa mediante las técnicas del cultivo in vitro se han presentado en el traslado y plantación desde la fase de aclimatización a condiciones de campo (Pierik, R. 1987) Muchos países o regiones carecen de áreas libres de vectores que permitan la producción de tubérculos semilla de alta calidad; por lo tanto, la tecnología de los microtubérculos se presenta como un componente importante en la producción de semilla. En este sentido, los microtubérculos pueden también proveer una solución en países donde la disponibilidad de semilla de alta calidad es requerida debido al incremento de las nuevas áreas de siembra. La tuberización es un proceso fisiológico complejo, regulado por muchos factores, que incluyen los ambientales, hormonales, suplemento de nitrógeno, densidad de inóculo, fuente de explante, cultivar y concentración de sacarosa. Sin embargo, es posible suministrar fuentes de carbono externas para producir suficientes carbohidratos con el fin de promover el crecimiento celular y la subsecuente regeneración. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de microtubérculos in vitro. Entre ellas está la técnica de los BIT (Pierik, R. 1987; Roca y Mroginski, 1991) PROCEDIMIENTO Explante: a. Lavar la superficie con agua y jabón (fuera de campana de extracción). b. Tomar una parte del explante que contenga el brote del ojo de papa y llevar a la campana de extracción. c. Inmersión en alcohol al 95% por 30 segundos del explante. d. Posteriormente sumergir el explante durante 15 minutos en hipoclorito de sodio 10 %. Elaborado por: Ing. Ivonne Vaca MSc.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS e. Enjuagar tres veces con agua estéril. f. Retirar el tejido quemado con bisturí y pinzas, sembrar solamente la parte interna del explante en medio MS. g. Colocar los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo con fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 de oscuridad a una temperatura de 24-26 ºC. h. Observar su desarrollo, anotar las apariencias y cambios que van sufriendo los explantes. NOTA: Separar los frascos con explantes necrosados y contaminados. Autoclavar y lavar. MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ESTUDIANTE 1. Mandil con su nombre, cofia y mascarilla 2. Una toalla pequeña (25cm x25cm) codificada (con su nombre) 3. Manual de la materia, libreta y esfero 4. Cepillo para sus manos y uñas (individual) 5. Cinta masking 6. Etiquetas de grupo e individuales estériles 7. Fósforos 8. Cuchillo 9. Marcador 10. Material y reactivos para desarrollar su protocolo de desinfección 11. INDIVIDUAL: Usted debe poner a brotar tubérculos de papa, melloco, oca, mashua u otros; al menos, 15 días antes de la práctica. Coloque sus tubérculos en una cámara de humedad (en un contenedor con algodón humedecido). 12. Material vegetal para su proyecto (explantes) INFORME Nº 4 Informe grupal (Presentación) Objetivos, metodología, resultados y discusión (Evaluación de al menos 3 variables de interés para la fase correspondiente). Seguimiento semanal. Presentar tablas de resultados, ANOVA, CURVAS DE SEGUIMIENTO SEMANALES, discusión. USAR FOTOGRAFÍAS Y VIDEO DE SUS CULTIVOS UNICAMENTE. Siempre debe presentar con bibliografía y citas bibliográficas, NORMAS APA

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS PRACTICA N° 5 TEMA: Fertilización in vitro y cultivo de gametos OBJETIVO GENERAL: Cultivar gametos y fecundar óvulos in vitro OBJETIVOS ESPECIFICOS: 1. Rescatar óvulos y polen, establecer un correcto protocolo de desinfección para su siembra in vitro. 2. Seleccionar polen para la fertilización in vitro. 3. Evaluar el establecimiento de los explantes. MARCO TEÓRICO A veces, el polen no puede germinar sobre el estigma de la flor aunque éste se halle receptivo. Este hecho puede deberse a limitaciones genéticas o fisiológicas. Estas barreras se denominan de prefertilización o precigóticas y pueden ser eludidas mediante las técnicas de polinización in vitro (Roca y Mroginski, 1991). Frente a todas estas limitaciones, las técnicas de cultivo in vitro y manipulación de células aisladas resultan apropiadas para lograr el proceso completo de desarrollo del embrión y del endosperma y la obtención de semillas normales. Una de esas técnicas, desarrollada por Kanta y colaboradores (1962), demostró que en algunas especies de Papaveráceas los granos de polen tenían la capacidad de germinar in vitro, directamente sobre los óvulos en cultivo. A partir de la misma, surgen una serie de metodologías que se conocen en general como técnicas de polinización in vitro (Pierik, R. 1987; Roca y Mroginski, 1991). PROCEDIMIENTO Con un material vegetal saneado se puede seguir el siguiente protocolo: ⁻ Seleccionar flores en una etapa adecuada. ⁻ Esterilización de los explantos en un recipiente estéril. ⁻ Lavar los explantos con abundante agua estéril y depositarlos sobre papel de filtro para eliminar el exceso de agua. ⁻ Rescatar ovarios y polen, sembrar. ⁻ Etiquetar los recipientes con un código adecuado que identifique el medio de cultico, el vegetal y la fecha. Colocar los explantos en una cámara de crecimiento en oscuridad o a 25 ºC y 16 h de fotoperiodo.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ESTUDIANTE 1. Mandil con su nombre, cofia y mascarilla 2. Una toalla pequeña (25cm x25cm) codificada (con su nombre) 3. Manual de la materia, libreta y esfero 4. Cinta masking 5. Etiquetas de grupo e individuales estériles 6. Fósforos 7. Marcador 8. Flores de cucarda 9. Flores de floripondio 10. Flores de chocho o fréjol 11. Otras muestras de flores 15. Cedazo pequeño metálico y gasas. 16. Material y reactivos para desarrollar su protocolo de desinfección 17. Material vegetal para su proyecto (explantes) INFORME Nº 6 Informe grupal (Presentación) Objetivos, metodología, resultados y discusión (Evaluación de al menos 3 variables de interés para la fase correspondiente. Seguimiento semanal. Presentar tablas de resultados, ANOVA, CURVAS DE SEGUIMIENTO SEMANALES, discusión). USAR FOTOGRAFÍAS Y VIDEO DE SUS CULTIVOS UNICAMENTE. Siempre debe presentar con bibliografía y citas bibliográficas, NORMAS APA BIBLIOGRAFÍA   

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Arinucci, L. M.; Uscitti, M. R.y Bedini, W. A. Morfogénesis in vitro de leguminosas forestales nativas de la República Argentina. Revista de la Facultad de Agronomía de La Plata, 2004, vol. 105, no. 2, p. 27-35. Fernández, K. 2010. Micorrización in vitro e in vivo de plántulas de papa (Solanum tuberosum var. Alfa). Cultrop vol.31 no.2 La Habana abr.-jun. 2010 Huang, T.; Shaolin, P.; Gaofeng, D.; Lanying, Z. y Gengguang, L. Plant regeneration from leaf-derived callus in Citrus grandis (pummelo): Effects of auxins in callus induction medium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2002, vol. 69, p.141146. Pérez, E. M.; Ramírez, R.; Núñez, H. G. y Ochoa, N. Introducción al cultivo de tejidos vegetales. Universidad Autónoma de Aguas Calientes, Apoyado por el Fondo para la Modernización de la Educación Superior, FOMES, 1999, p. 179. Pierik, R. 1987. Horticulture, Agricultural University. Wageningen, The Netherlands.

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MANUAL DE PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS     

Popielarska, M.; Slesak, H. y Goralski, G. Histological and SEM studies on organogenesis in endosperm-derived callus of kiwifruit. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 2006, vol. 48, no. 2, p. 97–104. Roca, W y L. Mroginski 1991. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Publicación CIAT No 151. Cali. SMITH Roberta (2000); Plant tissue culture: Aseptic Germination of seeds, Academic Press; California-EEUU Tavares, L. F.; Magalhaes, J. r.; Ariano, M. P. y José, A.R. Indirect organogenesis of rice explants from meristematic region of shoot tips. Bras. Agrociência, 2004, vol.10, no.2, p. 203-207 Vaca, I. 2008. Incremento del número de brotes de babaco (Vasconcellea x Heilbornii cv Babaco) in vitro mediante la interacción de reguladores de crecimiento para la regeneración de plantas completas. ESPE – IASA 1.

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