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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

ERRNVPHGLFRVRUJ

MANUAL DE NEUROGENÉTICA A. Jiménez Escrig

ERRNVPHGLFRVRUJ DIAZ DE SANTOS

Reservados todos los derechos. «No está permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright.» © Adriano Jiménez Escrig, 2003 Ediciones Díaz de Santos, S. A. Juan Bravo, 3-A. 28006 Madrid España Internet: http://www.diazdesantos.es E-Mail: [email protected] ISBN: 84-7978-556-X84-7978-473-3 Depósito legal: M. 5.927-2003 Diseño de cubierta: Ángel Calvete Fotocomposición: FER, S. A. Impresión: Edigrafos, S. A. Encuadernación: Rústica-Hilo, S. L.

DIRECTOR ADRIANO JIMÉNEZ ESCRIG Hospital Ramón y Cajal. Universidad de Alcalá. Madrid

AUTORES MANUEL BARÓN RUBIO Fundación Hospital Alcorcón. Madrid [email protected] FRANCISCO JAVIER CAROD ARTAL Hospital Sarah. Brasilia. Brasil [email protected] JOSÉ MANUEL GOBERNADO SERRANO Hospital Ramón y Cajal. Universidad de Alcalá. Madrid [email protected] ADRIANO JIMÉNEZ ESCRIG Hospital Ramón y Cajal. Universidad de Alcalá. Madrid [email protected] ADOLFO LÓPEZ DE MUNAIN Servicio de Neurología y Unidad Experimental. Hospital Donostia ILUNDAIN Fundazioa. San Sebastián [email protected] MANUEL LOUSA GAYOSO Hospital Ramón y Cajal. Madrid [email protected] DAVID MAYO CABRERO Banco de Tejidos. Madrid [email protected] ANA PARDO VIGO Hospital Ramón y Cajal. Universidad de Alcalá. Madrid. [email protected]

ÍNDICE

Autores .............................................................................................................................................. VII Introducción ..................................................................................................................................... XI NEUROGENÉTICA BÁSICA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Generalidades de genética .............................................................................................. 3 Técnicas de biología molecular en investigación y diagnóstico .................................... 23 Animales transgénicos en neurología ............................................................................. 37 Terapia génica ................................................................................................................ 51 Programas informáticos de uso en genética ................................................................... 59 Recursos de genética en Internet .................................................................................... 67 La neurogenética desde el punto de vista del neurólogo clínico .................................... 83 Estrategias para el estudio genético molecular de una enfermedad neurológica ........... 89 NEUROGENÉTICA CLÍNICA

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

Miopatías hereditarias .................................................................................................... Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth ............................................................................ Polineuropatía amiloidea familiar .................................................................................. Heredoataxias ................................................................................................................. Genética de las demencias ............................................................................................. Genética de los movimientos anormales ........................................................................ Xantomatosis cerebrotendinosa ..................................................................................... Trastornos neurológicos paroxísticos.............................................................................. Genética de los accidentes cerebrovasculares ................................................................ Trastornos de la coagulación .......................................................................................... Enfermedades mitocondriales ........................................................................................

97 117 141 147 159 183 203 209 225 237 255

Listado de enfermedades neurológicas genéticas ......................................................................... 273 Secuencia histórica de la genética .................................................................................................. 277 Glosario ............................................................................................................................................. 283 Índice analítico ................................................................................................................................. 293 IX

Introducción

En el año 2001, con la finalización del Proyecto Genoma Humano, se ha culminado posiblemente la mayor empresa científica del siglo XX. La realización de este proyecto ha iniciado una nueva era de la medicina, caracterizada por una mayor precisión diagnóstica, que nos obligará a cambiar las actuales clasificaciones de las enfermedades y, sobre todo, un dramático avance en el conocimiento de la patogénesis de las enfermedades. Esto último va a abrir una enorme cantidad de nuevas vías terapéuticas de las que vamos a disponer en los próximos años. Entre todas las especialidades de la Medicina, la Neurología va a ser posiblemente la especialidad en la que esto va a tener más impacto. Por eso, en estos años, la especialidad de la Genética se ha ido introduciendo lentamente en nuestra práctica clínica y de investigación, hasta ocupar una parte muy importante de ella. La Genética presenta varias características que la diferencian de otras herramientas que utilizamos los neurólogos. En primer lugar, es una especialidad nueva, de la que apenas teníamos unos conocimientos básicos. En segundo lugar, es una especialidad en continuo cambio, por lo que el volumen de conocimientos nuevos que de ella recibimos muchas veces y que vamos a seguir adquiriendo en los próximos años, nos puede desbordar. En tercer lugar, es una especialidad multidisciplinaria, en la que están implicados médicos, bioquímicos, biólogos, etc. A pesar de ello, todo el mundo coincide en que la Genética está lo suficientemente asentada, y nos aporta tanto a nuestra práctica clínica, que merece la pe-

nar dedicarse a ella con suficiente profundidad. Por ello, se ha pretendido organizar un libro que tenga una utilidad práctica a quien lo lea. Los que no sean neurólogos, podrán encontrar una visión clínica de la especialidad que los clínicos muchas veces les solicitan. Los neurólogos, podrán introducirse en la especialidad y repasar o conocer temas que nos competen en nuestra práctica diaria con pacientes con transtornos neurogenéticos. Esperamos haber conseguido al menos alguno de los dos fines. Quisiéramos finalizar con una puntualización metodológica. La Genética, como cualquier otra ciencia, tiene su propio lenguaje, una jerga con términos como hibridación, anillamiento, desnaturalización, etc., que presenta dos tipos de dificultades. La primera, el desconocimiento que impone la novedad, que nos obliga a un esfuerzo adicional de aprender el significado de este lenguaje, hasta la fecha desconocido. Para ello, se han intentado describir los términos a medida que han ido apareciendo. Pero como esto no siempre ha sido posible, y en ocasiones puede parecer reiterativo, los términos más importantes se han explicado en un glosario incluido al final del texto. La segunda dificultad viene dada porque al ser la mayoría de los descubrimientos de origen anglosajón la terminología usada es casi siempre inglesa. Términos como primer, traducidos al español como cebador o iniciador, pueden tener un significado confuso, por lo que para conseguir la máxima claridad en las explicaciones del texto, inevitablemente se hace necesario utilizar el término en inglés o en ambos idiomas.

XI

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INTRODUCCIÓN

Otra aclaración necesaria es que el propósito del libro no es hacer una recopilación extensa del conocimiento actual de la Genética, algo por otra parte imposible de conseguir dada la extensión que está alcanzado esta disciplina, sino servir de

introducción para animar a los lectores a adquirir nuevos conocimientos, y al mismo tiempo darles una visión práctica que les ayude en su trabajo diario.

PARTE I

NEUROGENÉTICA BÁSICA

C APÍTULO

1

Generalidades de genética A. Jiménez Escrig

DE LOS EXPERIMENTOS DE MENDEL AL CONOCIMIENTO DE LA ESTRUCTURA DEL DNA Mendel (1822-1884), un monje austríaco que vivió y trabajó en Brun, realizó durante más de 20 años diferentes experimentos sobre la herencia de los caracteres en los guisantes. Mendel notó que los descendientes de determinadas plantas heredaban ciertas características de sus progenitores y decidió observar y cuantificar estas características. Eligió para sus experimentos el guisante, por la rapidez de sus ciclos reproductivos y la capacidad de seleccionar su polinización de forma artificial, y a lo largo de estos años observó y cuantificó la herencia de la altura, el color y posición de las flores, forma y color de las vainas, el color del guisante y la superficie de este, rugoso o liso. Mendel se quedó para explicar su teoría con estos dos últimos caracteres. A partir de estos experimentos, Mendel comunica en 1865 las llamadas leyes de Mendel, proponiendo que invisibles unidades internas de información originan los rasgos observables, y que estos factores, que luego se conocerán como genes, pasaban de una generación a la siguiente. La primera

de estas leyes, la de la independencia de los caracteres, señala que los mismos (color del fruto y superficie de este) se transmiten de forma independiente. Mendel cruzó guisantes verdes lisos y amarillos rugosos y obtuvo combinaciones diferentes (verdes lisos, verdes rugosos, amarillos lisos y amarillos rugosos). Señaló entonces que los caracteres se transmiten independientemente unos de otros. En la segunda ley de Mendel, Mendel cruzó guisantes con color de fruto verde y amarillo y obtuvo en la primera generación guisantes únicamente verdes, y en la segunda generación guisantes verdes (el 75%) y guisantes amarillos (25%). Habla entonces de que los caracteres se segregan pudiendo transmitirse a través de generaciones sin expresarse. A partir de lo anterior, Mendel sugirió la existencia de ciertas partículas, que llamó factores, que se transmitían de los progenitores, incluso señaló que debían ser dos por cada rasgo. Describió que estos factores interaccionaban entre ellos para dar lugar a las características del individuo, existiendo una herencia dominante y recesiva (el carácter verde es dominante y el amarillo recesivo), impidiendo la presencia de caracteres dominantes que se manifiesten los caracteres recesi3

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vos y trasmitiéndose los caracteres recesivos en el 25% de los casos. Además, describió la independencia de los caracteres frente a la teoría previa que señalaba que los caracteres podían mezclarse entre ellos. Por falta de aceptación y difusión, las teorías de Mendel permanecieron ocultas hasta 1900, en que de forma independiente de Vries, Von Tshermak y Correns describen de nuevo estas leyes y descubren sus escritos. A los caracteres heredados en los guisantes, Mendel los denominó factores de la herencia. La identidad de estos factores permaneció oscura hasta el siglo XX, cuarenta años después de los experimentos de Mendel, en que aparecieron nuevas técnicas que permitieron conocer el material contenido en los núcleos celulares. Estas nuevas técnicas fueron la construcción de microscopios más potentes y el descubrimiento de materiales de tinción que selectivamente teñían diferentes estructuras de las células. Al examinar con esto los núcleos celulares, se pudo visualizar unas estructuras alargadas con forma de bastoncillos que se denominaron cromosomas. Con el tiempo se vio que estos cromosomas podían diferenciarse por su tamaño y forma y, según esto, que usualmente las células contienen dos copias de cada cromosoma, llamándose a estas células diploides. Todas las células de un organismo van a contener el mismo número de cromosomas, que se duplica inmediatamente antes de cualquier división celular. Las células sexuales o germinales tienen la mitad de los cromosomas que las células no germinales o somáticas, llamándose células haploides, produciéndose por la fertilización una célula diploide llamada cigoto. Una vez que se conocieron los cromosomas, rápidamente apareció como obvio que podían comportarse como partículas o factores de la herencia descritos por Mendel. Lo anterior permitió conocer en 1905 que las células de los organismos femeninos contenían 2 cromosomas X, mientras que las células de los organismos masculinos contienen un cromosoma X y otro Y, siendo el sexo el primer carácter fenotípico al que se asignó una localización cromosómica específica. El análisis cuantitativo de los cromosomas mostró que están compuestos en un 40% por

DNA y en un 60% por proteínas. Inicialmente se pensó que estas proteínas eran las portadoras de la información genética por cuanto están formadas por 20 subunidades (los aminoácidos) diferentes, mientras que el DNA está formado sólo por 4 (las bases nitrogenadas), lo que permite mayor variabilidad de la información. Los experimentos de Avery, McLeod y McCarty, y posteriormente de Alfred Hershey y Martha Chase fijaron en el DNA la transmisión de los caracteres. HISTORIA DE LA INVESTIGACIÓN DEL DNA La historia de la investigación del DNA se inicia en 1868 cuando el biólogo suizo Friedrich Meischer, utilizando el núcleo de células obtenidas del pus de los vendajes quirúrgicos detectó una sustancia que contenía fósforo y que llamó nucleína. Meischer demostró que la nucleína consistía en una porción ácida, que luego se denominaría DNA, y una porción básica proteica que hoy conocemos como histonas. Aunque Miescher y otros que posteriormente le siguieron sospechaban que la nucleína podría jugar un papel en la herencia celular, se consideraba que la falta de diversidad en su estructura era una importante contradicción para esto. La primera evidencia del papel del DNA en la herencia fue aportada por Avery, McLeod y McCarty, que descubrieron que el DNA obtenido de una capa virulenta del streptoccoco pneumoniae transformaba en virulenta una cepa inactiva. Si este experimento fijaba la herencia en el DNA, todavía existía la posibilidad de que el agente transmisor de la herencia fuera el contenido proteico del ácido nucleico. La pregunta fue finalmente contestada en 1952 mediante el uso de un virus bacteriófago T2, que infecta las células bacterianas transmitiendo el material radioactivo, en un experimento conducido por Alfred Hershey y Martha Chase. Estos prepararon dos tipos de fagos, uno con DNA marcado con fósforo radioactivo y otro con proteínas de su cápsula marcadas con azufre radioactivo. El examen de las bacterias transfectadas reveló la presencia únicamente de fósforo

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GENERALIDADES DE GENÉTICA

radioactivo en las bacterias que se transmitía en sucesivas generaciones, por lo que se demostró que el DNA era el agente transmisor de la herencia. A pesar de que desde los años 50 se conocía que el DNA llevaba la información genética de una generación a la siguiente, la estructura del DNA y el mecanismo a través del cual se transmitía la información genética no se dedujo hasta 1953, en que James Watson, un genetista americano, y Francis Crick, un físico inglés, trabajando en la Universidad de Cambridge propusieron el modelo de doble hélice, un descubrimiento que se ha considerado la llave de la moderna biología molecular y biotecnología. Usando información derivada de diferentes estudios previos sobre la química y la estructura del DNA, Watson y Crick fueron capaces de ensamblar estos datos para producir este modelo. De estudios previos se conocía que el DNA es un polímero de subunidades de nucleótidos, cada uno formado por un azúcar (desoxirribosa), fosfato y una de cuatro bases nitrogenadas, purinas (adenina, guanina) o pirimidinas (timina, citosina). Un dato muy importante fue el descubrimiento de Erwin Chargaff (1940) de que las cuatro bases pueden encontrarse en diferente proporción en los distintos organismos, pero que el número de adeninas es igual al número de timinas, y el número de guaninas igual al número de citosinas. Los estudios de difracción de rayos X de Rosalind Franklin y Maurice Wilkins en Londres, mostraron un patrón de difracción característico del que se deducía que la molécula de DNA tenía dos periodicidades a lo largo de su eje, una periodicidad principal de 0,34 nm, y una secundaria de 3,4 nm. Con todo ello, Watson y Crick diseñaron su conocido modelo tridimensional, consistente en dos cadenas helicoidales de DNA enrolladas alrededor de un eje para formar una doble hélice que gira hacia la derecha. En este modelo las dos cadenas de DNA corren en dirección opuesta y son complementarias, apareándose mediante puentes de hidrógeno la adenina con la timina y la citosina con la guanina. Este apareamiento complementario de las bases asegura que cuando el DNA se replica se origine un duplicado exacto del molde previo.

CARACTERÍSTICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS De acuerdo con lo anterior, los ácidos nucleicos son polímeros constituidos por la unión de diferentes nucleótidos en una secuencia 5’,3’. La Figura 1.1 muestra la composición de los nucleósidos. El azúcar es una pentosa, ribosa en el RNA y desoxirribosa en el DNA. Las bases pueden ser purinas (adenina, guanina) y pirimidinas (citosina, timina en el DNA y citosina y uracilo en el RNA). La unión de una base y la pentosa se denomina nucleósido, y la unión de un nucleósido con un grupo fosfato se llama nucleótido. El grupo fosfato de los nucleótidos proporciona a la molécula el carácter ácido. A pH neutro el DNA tiene carga negativa, por lo que migrará hacia el polo positivo en la electroforesis. En la célula se encuentra en forma de sal asociado a proteínas básicas. Los ácidos nucleicos son estructuras polares. Esta polaridad, que los hace solubles en agua, deriva del modo en que se unen en una secuencia 5’,3’, lo que quiere decir que se conectan a través de enlaces entre el carbono 5’ de una pentosa y el 3’ de la siguiente, quedando siempre un enlace 5’ y un enlace 3’ libre en cada lado. Por convención, la secuencia de DNA siempre se lee en la dirección 5’,3’. La parte variable de la molécula es la secuencia de las bases (A,C,G,T). En el modelo de doble hélice, cada cadena es complementaria de la otra: una purina (adenina y guanina) siempre se opone a una pirimidina (citosina y timina). Citosina siempre es complementaria de la guanina, al formar 3 puentes de hidrógeno, y adenina es complementaria de timina al formar 2 puentes de hidrógeno (Figura 1.2). Además, se dice que tie-

Tabla 1.1.

Abreviatura de los ácidos nucleicos.

A G U Y M W D V

C T R K S B H N

Adenina Guanina Uridina T o C (Pirimidina) A o C (Amino) A o T (Weak) AGoT ACoG

Citidina Timina G o A (Purina) G o T (Keto) G o C (Strong) CGoT ACoT A C G o T (Any)

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Figura 1.1. Estructura de los ácidos nucleicos.

nen una disposición antiparalela, lo que significa que los enlaces fosfodiester de cada cadena van en una disposición opuesta: 5’ 3’ en una cadena y 3’ 5’ en la complementaria.

Figura 1.2. Uniones de las bases nitrogenadas.

Esta especificidad del apareamiento de las bases es la característica estructural más importante del DNA. Como cada nucleótido de la cadena es complementario del opuesto, puede servir de

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plantilla en la replicación de la cadena cuando la doble hélice se abre. Se dice por esto que la replicación de DNA es semiconservadora, porque por cada cadena de DNA que se forma una es nueva y la otra es la anterior. En la Figura 1.3 se muestra cómo se replica el DNA. Las dos hebras se separan por enzimas (helicasas). A las hebras separadas se van a unir proteínas (single stranded protein binding) que impiden que las hebras vuelvan a unirse y las colocan en una posición que las permite unirse a la polimerasa III, que cataliza la elongación de las hebras formadas. La polimerasa tiene también capacidad de exonucleasa (revisa la fidelidad de la copia y corrige los errores). Como la polimerasa siempre actúa en sentido 5’3’, en la hebra complementaria es necesario un primer para iniciar la síntesis. Una primasa, que es uno de los diversos polipéptidos

Figura 1.3. Propiedades de los ácidos nucleicos.

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que forman un grupo llamado primosoma, construye este primer. La polimerasa va a extender la hebra formando pequeños fragmentos (1.0002.000 bases) llamados fragmentos de Okazaki. Finalmente, una ligasa unirá estos fragmentos para completar la formación de la hebra. El máximo de absorción de luz del DNA es a 260 nm, lo que se utiliza para la medición de su concentración en un medio mediante espectrofotometría. Las uniones no covalentes de hidrógeno de las hebras complementarias son enlaces débiles. El DNA es estable a temperaturas fisiológicas porque es una molécula muy larga, pero las dos hebras pueden separarse (desnaturalización del DNA) por medio de reactivos relativamente débiles como NaOH, urea o formamida o por calentamiento. La temperatura media de fusión (Tm, temperatura de melting) es la tempera-

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tura a la que se desnaturaliza el 50% de una secuencia. Va a depender del contenido de bases de la secuencia, siendo mayor cuanto mayor es el número de C y G de la molécula por el triple enlace que forman. Las hebras aisladas son estables, pero al enfriarse vuelven a forman hebras dobles con sus complementarios (renaturalizacion). Si una cadena de DNA o RNA se pone en contacto con su complementario se unen. A este proceso se le conoce como hibridación. TRANSCRIPCIÓN DEL DNA Y FORMACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Sólo el 5% de la secuencia del genoma humano contiene secuencias que van a codificar una proteína. Esta secuencia no se encuentra de forma continua, sino que está interrumpida por fragmentos de DNA que no tienen la función de codificar.

Las secuencias del DNA que codifican proteínas se denominan exones, y las secuencias entre ellas se denominan intrones. La síntesis de una proteína se inicia por la copia de determinadas regiones de un gen en una molécula de RNA (mRNA o RNA mensajero) (Figura 1.4). La doble hélice se abre y se copia a un mRNA que contiene toda la información de la secuencia de DNA en un proceso que se denomina transcripción. El mRNA es un ácido nucleico de cadena única que presenta dos diferencias principales con el DNA. El glúcido es ribosa en lugar de desoxirribosa, y en segundo lugar, la base nitrogenada timina está reemplazada por el uracilo. Tras la síntesis del RNA se produce el splicing (empalme) de los exones de forma secuencial, desechándose el DNA correspondiente a los intrones. Mediante splicing alternativos, esto es, empalmándose ciertos exones en determinadas circunstancias y no empalmándose en otras, se pueden producir diferentes isoformas de determi-

Figura 1.4. Estructura de un gen y transcripción del DNA.

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Figura 1.5. Síntesis proteica.

nadas proteínas. Las anomalías en el splicing son la causa de determinadas enfermedades producidas por mutaciones en la zona de exón próxima al intrón o en el inicio del intrón, zona que se conoce como el aparato del splicing. El mRNA conteniendo la secuencia de codones correspondiente a la proteína, junto con las secuencias de inicio (AUG, que codifica la metionina) y stop (UAA, UAG o UGA), va a atravesar la membrana nuclear saliendo al citoplasma. Aquí es capturado por los ribosomas, que se encargan de unir de forma progresiva los aminoácidos unidos al tRNA (RNA de transferencia) complementario al mRNA en la secuencia correspondiente a la proteína. Este proceso se denomina traducción, por cuanto se traduce la secuencia de nucleótidos en una secuencia de aminoácidos. El ribosoma va a seleccionar el tRNA cuya tripleta de nucleótidos del tRNA contiene una secuencia complementaria (anticodon) de la del mRNA, y progresivamente va uniendo los aminoácidos que llevan

adheridos, formándose la proteína hasta que se alcanza el mensaje de parada en que el mensajero y la proteína son liberados (Figura 1.5). CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA La producción de RNA está regulada por una serie de proteínas reguladoras en un proceso que es crucial para controlar la diferenciación y desarrollo de las células de los organismos. El cuerpo humano tiene unos 100 trillones de células. Dentro de cada una de ellas, independientemente del tejido que formen, hay el mismo DNA y, por lo tanto, las mismas instrucciones genéticas que dicen que uno sea rubio o moreno, que tenga la piel clara u oscura, o tenga mayor riesgo o menor de sufrir una determinada enfermedad. El DNA dirige siempre la operación y decide dónde ha de ir el aminoácido en cuestión. Dispone para ello de un sistema de regulación para que

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no se descontrole el proceso. Entre el DNA y la proteína hay otro paso intermedio, otra molécula. Se trata del RNA mensajero que no es más que una copia de un gen, y cuya función es llevar el mensaje del DNA, que está en el núcleo, a las regiones del citoplasma donde se fabricarán las proteínas. Si todo este proceso se descontrola puede ocurrir una anomalía. Un simple fallo en una base (que en lugar de guanina, esté la citosina, por ejemplo) puede hacer que la célula siga produciendo una proteína cuando no debería hacerlo. Así, pueden desarrollarse enfermedades como el cáncer o alteraciones del desarrollo que pueden poner en peligro la vida del individuo. Todos los genes de un individuo están presentes en todas las células del organismo, pero solo van a transcribirse a mRNA y este traducirse en la síntesis de esa determinada proteína, lo que se conoce como expresión génica, en determinados tejidos y en función de que existan los necesarios estímulos para ello. La expresión génica es una función básica en la biología de los organismos pero solo se conoce de forma muy parcial, especialmente en organismos eucariotas. Por el descubrimiento de los mecanismos de expresión de las bacterias, Jacob y Monod recibieron el premio Nobel. En su trabajo, describieron la existencia de una región reguladora de una serie de genes vecinos y cuya función está relacionada, que llaman operón. En las bacterias, la presencia de un determinado nutriente, por ejemplo, la lactosa, induce la síntesis de enzimas que permiten su utilización, en este caso la β-galactosidasa, β-galactosidasa permeasa y β-galactosidasa transacetilasa. Los genes que codifican estas tres enzimas forman el operón de la lactosa (lac operón). Estos tres genes están regulados por un promotor situado en su final 5’, y se transcriben por un mRNA común. En condiciones normales estos genes están en una situación de baja actividad por la acción de un lac represor (proteína producto de un gen lac I) que inhibe la síntesis del lacmRNA. Cuando la proteína represora está unida a la región promotora/operada, la RNA polimerasa no se puede unir a la región promotora, bloqueándose la transcripción del mRNA y, por tanto, la expresión de los tres genes. En presencia de lactosa, esta se une al represor inactivándolo, lo que induce a la transcripción del mRNA (Figura 1.6).

MUTACIONES Y POLIMORFISMOS A medida que se fue conociendo el código genético se encontró que existen cambios en el DNA de unos individuos a otros. Se considera mutación a cualquier cambio en el DNA que pase de una célula a sus descendientes. Estos cambios aparecen por errores no reparados en las fases de duplicación o transcripción del DNA y se van a transmitir a la descendencia. Es preciso tener en cuenta que los 1,5 metros de DNA que contiene una célula están formados por 3.000 millones de pares de bases, densamente empaquetados en 23 pares de cromosomas, que tienen que duplicarse cada vez que la célula se divide. Diariamente se producen en un individuo varios miles de errores, pero existe un sistema de 20 enzimas diferentes encargadas de examinar la verosimilitud del DNA y de la eliminación de errores. Los mecanismos de reparación dependen de la existencia de dos copias de la información genética (una en cada cadena del DNA), lo que hace que las mutaciones sean relativamente raras, si bien son esenciales para la evolución de las especies. Se considera que a lo largo de la vida de un individuo van a aparecer 30 nuevas mutaciones, bien por errores durante la duplicación, o aún más frecuente, por la acción de factores ambientales, produciéndose delecciones, inserciones y sustituciones. Afortunadamente la gran mayoría de estos errores son inocuos para el organismo, ya que afectan a partes del DNA que no contienen instrucciones genéticas. Una proteína sin mutaciones recibe el nombre de «proteína salvaje», lo que se contrapone a proteína mutada. Según su tamaño, las mutaciones pueden ser voluminosas, si se producen cambios en la estructura del cromosoma (duplicaciones, delecciones y reordenamientos), o puntuales, si se producen cambios mínimos, generalmente en una sola base (inserciones, delecciones, sustituciones). Las inserciones y delecciones cambian la franja de lectura (ORF: open reading frame) del código genético, ya que al cambiar en una base, los codones del mRNA cambian a otros diferentes. Las sustituciones pueden ser con cambio de sentido (missense, si se cambia el aminoácido), sin sentido (nonsense, si se produce un codon de parada) y silente (silent, si el codon

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Figura 1.6. Regulación de la expresión génica en procariotas.

nuevo se traduce por el mismo aminoácido). Cuando la mutación se debe a un cambio en el número de repeticiones de una secuencia de DNA se habla de expansiones o reducciones. Las expansiones suelen presentar un aumento o disminución en el número de repeticiones en las sucesivas meiosis, por lo que se denominan mutaciones inestables o dinámicas. Existe un número de repeticiones en las que la probabilidad de que haya expansiones en la meiosis aumenta, llamándose a este número premutación (Tabla 1.2). Cuando una mutación aparece con una alta frecuencia en la población se denomina polimorfismo. Se considera un 1% como la cifra a partir de la cual se considera una mutación como un polimorfismo. Una definición más amplia de polimorfismo sería la de una mutación que se encuentra ampliamente repartida en la población.

Los polimorfismos pueden aparecer en los exones, originando cambios en la proteína de efecto variable o ser mutaciones silentes, o en intrones. Los polimorfismos pueden ser de varios tipos: un cambio en una base (SNP, single nucleotide polymorphism), ocurre con una frecuencia de 1/400 bases. Otros polimorfismos son de una determinada repetición de un doblete o triplete de bases (STR, short tandem repeat) o de una determinada secuencia más larga (microsatélites). Existe un polimorfismo puntual SNP cada 400 pares de bases aproximadamente. Estos SNP se están utilizando para la localización de genes en estudios de poblaciones por su próxima localización a los genes problema. Las diferentes formas posibles de una mutación se denominan alelos. Cuando en un gen existen varias mutaciones (o polimorfismos) la

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Tabla 1.2.

Ejemplos de diferentes mutaciones y su efecto sobre la proteína.

Secuencia salvaje

AGG TTA TCG TAA (CAG)n → Arg-Leu Ser-STOP

duplicaciones delecciones inserciones sustituciones

AGG TTA TCG TCG TAA (CAG)n → Arg-Leu-Ser-Ser-STOP AGG TTA TGT AAC (AGC)n → Arg-Leu-*Cys-Asn-(Ser) n-1 AGG TTA TAC GTA ACA (ACG)n → Arg-Leu-*Val-Thr-(Ser) n-1 AGG TTA ACG TAA (CAG)n → Arg-Leu-Thr-STOP AGG TAA TCG TAA (CAG)n → Arg-STOP AGG TTA TCC TAA (CAG)n → Arg-Leu-Ser-STOP

expansiones

AGGTTATCGTAA(CAG)n+20

configuración de los alelos presentes en un individuo se denomina haplotipo. Por locus (pl. loci) se entiende el lugar en un cromosoma donde se localiza un gen, pero el término puede ampliarse al lugar donde se localiza un alelo. El conjunto de genes de un organismo se denomina genotipo, y a la expresión del genotipo sumado a la interacción del ambiente se la llama fenotipo. Por expresión clínica se conoce a las manifestaciones clínicas de una mutación. La expresión clínica suele aparecer a una determinada edad, generalmente llamada edad de inicio de la clínica. En algunas enfermedades genéticas las manifestaciones clínicas aparecen en edades más precoces y generalmente con manifestaciones clínicas más severas en las sucesivas generaciones de los afectados. La explicación a este fenómeno de anticipación clínica, que se conocía desde antiguo, es la existencia de una mutación inestable, formada por repeticiones de tripletes, variables de un individuo a otro, que a partir de un determinado número de repeticiones se vuelven inestables, pudiendo aumentar el número de repeticiones o reducirse en la meiosis. Finalmente, se conoce como penetrancia el tanto por ciento de individuos en los que una mutación produce una determinada expresión clínica una vez rebasada la edad de inicio. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Las endonucleasas son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces in-

* Cambio en la ORF (missense) (nonsense) (silente)

ternucleotídicos del interior de la cadena cuando aparece una secuencia específica. Se producen por las bacterias, denominándose con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia y un número que señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa extirpe. Así, por ejemplo, la enzima HhaI, toma su nombre de que proviene del bacilo Haemophilus hemoliticus. Va a reconocer la secuencia ......GCGC......., rompiéndola en .....GCG y C..... Las endonucleasas de restricción se dividen en tres tipos generales: las de tipo I son aquellas que catalizan la metilación del DNA y la ruptura del DNA no metilado en una secuencia específica; las de tipo II, que son las habitualmente utilizadas en biología molecular, son las que solo poseen actividad nucleolítica; y las tipo III combinan metilación y ruptura. Las endonucleasas cortan el DNA generando extremos cohesivos o extremos romos, según queden restos o no en la cadena de DNA al cortar (Figura 1.7). Las enzimas de restricción son una herramienta de uso muy frecuente en el laboratorio. Existen 1.000 enzimas de restricción que reconocen unas 400 secuencias diferentes. Ejemplos del uso de enzimas de restricción son el reconocimiento de una determinada secuencia de DNA para detectar un polimorfismo, cortar el DNA en fragmentos más pequeños y fáciles de manipular, o la unión de un fragmento de DNA a un DNA viral para su clonación en una bacteria.

GENERALIDADES DE GENÉTICA

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RsaI reconoce la secuencia GTAC, corta la secuencia en GT y AC, con corte romo .............ACACCGTACACCTCC.......... .........ACACCGT ACCTCC.................. .............TGTGGCATGTGGAGG........ .........TGTGGCA TGGAGG................ SacI reconoce la secuencia GAGCTC, corta la secuencia en GAGCT y C, dejando un resto AGCT .............ACACCGTAGAGCTCC.......... .........ACACCGTAGAGCT CC................ .............TGTGGCATCTCGAGG......... .........TGTGGCATC TCGAGG................

Figura 1.7. Ejemplo de enzima de restricción con corte romo o con una cola. En el caso de la enzima SacI, el resto que queda sin complementar puede utilizarse para unir (ligar) este fragmento de DNA a otro que tenga un resto complementario (ej. unir un producto de PCR de DNA humano a un plásmido), produciéndose DNA recombinante.

PATRONES DE HERENCIA Las enfermedades genéticas pueden tener un origen cromosómico, mendeliano, multifactorial, mitocondrial o somático. Las enfermedades cromosómicas usualmente aparecen de novo, pero en algunos casos pueden seguir un patrón mendeliano modificado. Los trastornos de herencia mendeliana son aquellos que se producen por mutaciones en un solo gen; pueden ser dominantes, recesivos o ligados al X, estos últimos dominantes o recesivos. Los trastornos multifactoriales son aquellos que precisan la intervención de varios genes y a veces de trastornos ambientales para que aparezcan, siendo su patrón de herencia complejo. Ejemplos de herencia multifactorial en Neurología son la herencia de la esclerosis múltiple y posiblemente de la enfermedad de Alzheimer. Las alteraciones mitocondriales son debidas a cambios en el genoma mitocondrial y finalmente las alteraciones somáticas son las debidas a mutaciones en células somáticas y por lo tanto no son transmisibles a la descendencia. El dibujo del árbol genealógico es de importancia capital a la hora de trabajar con familias con enfermedades genéticas. En el dibujo del árbol se siguen unas convenciones que se muestran en la Figura 1.8. El examen del patrón mostrado en el árbol genealógico permite conocer el tipo de herencia. En el caso de afectación en dos o más generaciones se debe sospechar herencia dominante. En enfermedades autosomales recesivas, los padres son heterocigotos para el rasgo y los hijos afectados homocigotos. Cuando el sujeto presenta dos alelos diferentes se habla de heterocigotos compuestos. Cuando la herencia es

recesiva, lo habitual es encontrar además la existencia de consanguinidad. Algunas enfermedades recesivas pueden semejar un patrón de herencias dominante (pseudodominancia), si un individuo afectado (homocigoto para la enfemedad) tiene hijos (afectados ) con un portador heterocigótico. Este fenómeno suele aparecer en caso de alta frecuencia de un rasgo en una población o en caso de matrimonios consanguíneos. En caso de herencia ligada al X, se encuentra que las hembras se comportan como portadoras y los varones como afectados. En la herencia mitocondrial hombres y mujeres están afectados de forma similar

Figura 1.8. Normativa para el dibujo de árboles genealógicos.

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pero solo las mujeres transmiten la enfermedad (Figura 1.9). EL CÓDIGO GENÉTICO En los años 60, el código genético fue descifrado, describiéndose que cada triplete (codon) de nucleótidos codifica un determinado aminoácido. Como existen 20 aminoácidos y 64 posibles tripletes, la mayoría de los aminoácidos se codifican por varios tripletes diferentes, por lo que se dice que el código genético es un código degenerado. El código genético es universal, por cuanto el mismo triplete codifica por el mismo aminoácido en todos los organismos virus, bacterias, plantas, animales o el hombre. Además, existen ciertos tripletes que indican el final de la transcripción (codon de parada o stop codon) (Tabla 1.3).

Tabla 1.3. Código genético y abreviatura de cada aminoácido. Codon de RNA

Aminoácido Abreviatura

CGU, CGC, CGA, CGG AGA, AGG, CGA, CGC,CGG,CGU GAC,GAU AAC, AAU UGC, UGU GAA, GAG CAA, CAG GGA, GGC, GGG,GGU CAC CAU AUA, AUC, AUU UUA, UUG,CUA,CUC,CUG,CUU AAA, AAG AUG UUC, UUU CCA, CCC, CCG,CCU AGC,AGU,UCA, UCC, UCG, UCU ACA, ACC, ACG,ACU UGG UAC, UAU GUA, GUC, GUG, GUU UAA, UAG, UGA

alanina arginina aspartico asparagina cisteina glutamico glutamina glicina histidina isoleucina leucina lisina metionina fenilalanina prolina serina treonina triptofano tirosina valina stop

ala arg asp asn cys glu gln gly his ile leu lys met phe pro ser thr trp tyr val

A R D N C E Q G H I L K M F P S T W Y V

ORGANIZACIÓN DEL DNA EN LA CÉLULA

Figura 1.9. Patrones de herencia.

El DNA de las bacterias se encuentra formando una estructura en forma de asa. En los animales y plantas, se encuentra formando moléculas separadas, llamadas cromosomas. Estos son estructuras complejas que contienen DNA densamente empaquetado y unido a proteínas (histonas). Las proteínas son necesarias para el empaquetamiento y la estabilización del DNA y para regular la actividad de los genes en las células. El DNA se encuentra empaquetado en 46 cromosomas diferentes, 44 autosomas y dos cromosomas sexuales. En cada cromosoma pueden distinguirse los extremos o telómeros, donde se realiza la replicación, y el centrómero, donde el cromosoma se une al huso acromático en la mitosis. Los genes son fragmentos del DNA, es decir, son una secuencia de un número determinado de pares de bases. Pueden ser cortos (1.000 pb) o muy largos (cientos de miles). Los seres humanos tienen unos 30.000 genes, que se encuentran

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en todas las células del organismo, aunque no funcionan todos en cada una de las células: están inactivados allí donde no les toca trabajar, o, en lenguaje estricto, expresarse. Y expresarse significa lo siguiente: los genes, cuando se expresan, envían información para que se formen los aminoácidos, a partir de los cuales se formarán las proteínas (unas 100.000 diferentes). La discrepancia entre número de genes y número de proteínas se explica porque un gen puede originar diferentes formas de proteínas según varíe su splicing y, asimismo, varios genes pueden ser necesarios para que se forme una proteína. Finalmente, no todos los genes van a traducirse en proteínas, como por ejemplo el gen RNA ribosómico del cromosoma 1. Según el centrómero el cromosoma se divide en dos brazos, uno largo (q) y otro corto (p); el tratamiento con ciertos colorantes produce un patrón de bandas del cromosoma, claras y oscuras, diferenciándose según esto en secciones y subsecciones en un patrón definido que asigna a cada región una numeración. Una banda contiene 3-5 millones de pares de bases, en donde están codificados 20 a 50 genes. La cantidad de pares de bases que contiene un cromosoma por término medio (los hay de distintos tamaños) es de 120 a 150 millones. Toda esta información está contenida en un código de 4 letras (ACGT). De acuerdo con el modelo del DNA de Watson y Crick, el DNA puede copiarse indefinidamente por su complementariedad. EL GENOMA HUMANO Por genoma se entiende la secuencia de DNA de un organismo. En la actualidad se piensa que en el genoma humano hay unos 30.000 a 50.000 genes (todavía no se conoce el número exacto). Estos genes están codificados por el DNA (3.000 millones de pares de bases) que se encuentra densamente empaquetado en 23 pares de cromosomas (44 autosomas y 2 cromosomas sexuales). Cada cromosoma contiene un número variable de genes entre 500 y 1.500. Los genes constituyen solo el 25% del genoma, y están formados por una porción que codifica proteína o exones (que solo son el 10%) de los genes y otra porción

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que no codifica proteína o intrones. Utilizando el símil empleado por Matt Ridley en su libro Genoma, los exones equivalen al texto de una historia (gen) y los intrones a los «anuncios» que esta intercala. No debe pensarse que los intrones son un material inerte, por cuanto su presencia, aún cuando presenta la desventaja de una mayor necesidad de energía para la replicación y transcripción, representa una ventaja porque gracias al splicing alternativo permiten aumentar la diversidad de las proteínas (en más de un 30% de los genes humanos se produce splicing alternativo). Además, contienen elementos reguladores de la expresión del gen o promotores alternativos, especialmente en el primer intron, que generalmente suele ser el de mayor tamaño del gen, o pueden contener otros genes. Finalmente, los exones van a limitar el riesgo de recombinación de genes parálogos, reduciendo el riesgo de redistribuciones cromosómicas. Por genoma se entiende la totalidad del material genético de un organismo. El tamaño de un genoma no depende del número de genes que contenga ni de la complejidad del organismo. Por ejemplo, algunas amebas tiene un genoma 200 veces mayor que el humano. En el caso del hombre, está formado por 3.000 millones de pares de bases a las que hay que añadir las 16.600 contenidas en el DNA mitocondrial. Otros organismos como las bacterias tienen entre 1 y 5 millones de pares de bases, la mosca de la fruta tiene 140 millones, e incluso algunos tienen más que el humano como el ratón (3.300 millones) o incluso plantas (el guisante tiene 4.500 millones). En el genoma humano solo menos del 3% codifica genes expresados. El resto está formado por secuencias repetidas, regiones regulatorias o secuencias no codificantes cuya función se desconoce (Figura 1.10). Las proteínas codificadas por estos genes pueden agruparse en familias según similitudes, existiendo genes de estas familias en moscas, gusanos o plantas, aunque el número de familias se ha expandido en humanos. Esta expansión es particularmente evidente en genes de proteínas señales entre células (por ejemplo, los humanos tienen 30 factores de crecimiento fibroblástico, frente a 2 en el caso de la mosca) y especialmente en proteínas del sistema inmune (765 en el humano, frente a 140 en la

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Figura 1.10.

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Organización del genoma humano.

mosca y 64 en el gusano). Los otros genes son genes específicos de los vertebrados (7%), pero la gran diferencia entre estos y los organismos inferiores no está en el número de los genes sino en diferentes ensamblajes de las proteínas formadas por la creación de diferentes productos por splicing alternativo (un 60% de los genes humanos presentan dos o más splicing alternativos, frente a solo el 22% de los gusanos). Más del 50% del genoma humano corresponde a secuencia repetidas, la mayoría derivados del llamado DNA parásito o DNA basura, elementos transposables o transposonas, así llamados por su capacidad de propagarse por replicación e inserción de una nueva copia de ellos mismos en otra región del genoma. La mayoría de estas repeticiones representan reminiscencias de genoma antiguo, antes de la aparición de los mamíferos. La causa de que el DNA contenga una cantidad tan alta de DNA parásito no solo es un recuerdo de épocas pasadas sino que los transposomas influyen en la evolución del genoma y pueden mediar en la creación de nuevos genes. Existen 47 genes derivados de los transposomas, incluyendo los genes que codifican las telomerasas (enzimas encargadas de sintetizar la parte final del cromosoma, cuyo acortamiento es la causa del envejecimiento celular en las subsiguientes divisiones), la enzima de ensamblaje de las inmunoglobulinas y el receptor de las células T de segmentos de genes más pequeños, lo que genera una gran

diversidad de moléculas del sistema inmune. Las duplicaciones también son frecuentes en el genoma, apareciendo un 5% de la secuencia de este mediante duplicación de grandes bloques de más de 10 kb. La duplicación permite que una copia de un gen se localice en otra zona donde tenga otras funciones. Bacterias y retrovirus también han dejado una marca en nuestro genoma. Existen varios cientos de genes humanos que tienen una semejanza mayor con genes bacterianos que con las moscas, gusanos o levaduras. RECOMBINACIÓN Los cambios en el código genético que se producen en la reproducción sexual son la causa de la variabilidad genética del individuo. En los individuos de una misma familia los hijos heredan diversas combinaciones de los cromosomas de sus padres. Aparte de esta combinación, dentro de un mismo cromosoma puede existir información del cromosoma homólogo de su progenitor mediante el fenómeno de la recombinación genética. En este fenómeno, que ocurre durante la meiosis, los cromosomas se colocan en pares homólogos y pueden romperse, intercambiándose un mismo segmento de un cromosoma a su homólogo, recomponiéndose. Posteriormente, al separarse los cromosomas van a contener material genético del par homólogo (Figura 1.11). Es-

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Figura 1.11. Recombinación mediante crossing over en la meiosis.

ta forma de recombinación se conoce como crossing over (sobrecruzamiento). Este fenómeno origina que los cromosomas del descendiente no tengan la misma composición de genes que los parentales. La probabilidad de que entre dos genes exista un fenómeno de recombinación está en función sobre todo de la distancia entre ellos. Así, una frecuencia de recombinación de un 1%, llamada 1 cM (centimorgan, en honor a J. Morgan, que describió este fenómeno) ocurre entre dos genes separados 1 millón de pares de bases. Como la existencia de recombinación puede detectarse mediante estudios genéticos, el fenómeno de crossing over se ha utilizado para la localización de genes en los llamados mapas genéticos (mapas de frecuencia de recombinación de los genes de un segmento de cromosoma). Como aparte de la distancia hay otros factores que influyen de forma menor en la frecuencia de recombinación, como la distancia al centrómero, el tamaño del cromosoma, etc., los mapas genéti-

Figura 1.12. Recombinación de genes C, D y E entre cromosomas homólogos.

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cos no coinciden exactamente con los mapas físicos (mapas de distancia en pares de bases). Si dos genes están separados, con frecuencia aparecerán fenómenos de recombinación entre ellos, mientras que si los genes están muy próximos no existirá recombinación, diciéndose en este caso que se encuentran ligados. La frecuencia de recombinación se expresa con la letra griega θ y tiene un máximo de 0,5 (0,5, por lo tanto, indica que un gen y otro se encuentran en diferente cromosoma). Como ya se ha señalado, cuando dos genes están muy próximos no existe recombinación, y por lo tanto se transmiten ligados, lo que hace que uno de ellos pueda utilizarse como marcador de una enfermedad. Por el contrario, en genes no ligados cuando en la meiosis los cromosomas se han separado, cada uno va a ir a una de las células sexuales (ovocitos o espermatozoides) de forma independiente de los otros 23, un fenómeno que ya se describe en las leyes de Mendel como de la independencia de los caracteres. Así por ejemplo, el cromosoma 1 que vaya a un óvulo no influye para nada en la posible copia del cromosoma 5 que vaya a ese óvulo, y así con los otros 23 cromosomas. Ello hace que si un ovocito humano contiene 23 pares de cromosomas, el número de diferentes probabilidades generadas por la independencia de los caracteres es de 2 elevado a la 23 potencia (8.388.608 posibilidades). Como lo mismo ocurre para el espermatozoide, la probabilidad de que dos descendientes de unos individuos tengan igual información genética, salvo casos de gemelos univitelinos o de clonación, es nula.

mas 13, 18 y 22, en la delección del cromosoma 4 (S. de Wolf) o del cromosoma 5 (cri du chat). En ocasiones la trisomía puede no causar síntomas, en caso de que exista translocación balanceada, y en otras ocasiones cursa de forma oligosintomática, por existencia de mosaicismo somático. En estos casos, la anomalía ha aparecido en las primeras fases del desarrollo embrionario, por lo que no está presente en todas las células del individuo. Anomalías cromosómicas pequeñas no se observan en el cariotipo, pero originan alteración en varios genes vecinos, lo que se conoce como el síndrome de delección de genes contiguos. Ejemplo de este síndrome es la aparición de distrofia muscular de Duchenne junto con retinitis pigmentosa, enfermedad granulomatosa crónica y síndrome de McLeod. Mediante mecanismos de metilación puede eliminarse la expresión de un determinado cromosoma paterno o materno, fenómeno que se conoce como imprinting. Debido a este fenómeno, una misma alteración puede originar diferente manifestación según la anomalía genética se herede del padre o de la madre. Un ejemplo de ello es la alteración en el cromosoma 15 responsable de síndrome de Prader-Willi, cuando se hereda del padre y el síndrome de Angelman cuando se hereda de la madre. Una alteración similar es la disomía uniparental, en la que el individuo recibe los dos cromosomas de uno de los progenitores. Existen descripciones de este hecho como un individuo con fibrosis quística que ha heredado los dos genes de la madre portadora. ANÁLISIS DE LIGAMIENTO

ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Las alteraciones cromosómicas pueden producir defectos estructurales que se observen en el cariotipo. Estas anomalías pueden ser trisomías, delecciones, duplicaciones, inserciones, inversiones, isocromosomas, cromosomas en anillo y translocaciones. Estas anomalías generalmente originan alteraciones en múltiples genes, con anomalías somáticas, retraso mental, crisis epilépticas, aborto espontáneo o muerte neonatal. Las crisis epilépticas aparecen en un 5% de individuos con trisomía 21, y en otras trisomías como la de los cromoso-

La ocurrencia de que dos caracteres, debidos a dos genes diferentes, se trasmitan de forma independiente, como señaló Mendel, se debe a que están localizados en diferentes cromosomas o a que estando en el mismo cromosoma exista un fenómeno de recombinación. Lo contrario, esto es, la transmisión de los dos caracteres siempre juntos, se denomina ligamiento. El fenómeno de ligamiento indica por ello, que los dos genes se encuentran en el mismo cromosoma y además muy próximos (lo que reduce la probabilidad de que se separen por recombinación).

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Cuando en una familia se examina la herencia de un determinado carácter o una enfermedad y se compara con la herencia de otro, generalmente el segundo es un marcador polimórfico (determinada secuencia variable de unos individuos a otros, cuya localización en el genoma se conoce), podemos, con un cierto grado de probabilidad, saber si ambos caracteres están ligados. El estadístico que examina esto es el LOD score (logaritmo de odds, entendiéndose por odd, la probabilidad de que ambos caracteres estén ligados dividido por la probabilidad de que no exista ligamiento). Cuando se realiza un estudio para localizar un gen utilizándose marcadores repartidos por todo el genoma de un individuo, se considera que un lod score de 3 o mayor (una probabilidad de ligamiento, sobre ausencia de ligamiento de 1.000:1, que al usar varios marcadores, y por tanto, múltiples hipótesis, significa una probabilidad de ligamiento del 95%) indica ligamiento, mientras que un lod score de –2, indica ausencia de ligamiento, siendo el ligamiento indeterminado en los valores intermedios. El análisis de ligamiento se utiliza en genética para localizar genes responsables de enfermedades, a través del estudio de la segregación de la enfermedad de marcadores repartidos por todo el genoma. Este tipo de estudios ha permitido conocer la localización de un importante número de genes implicados en enfermedades humanas. Generalmente a través de estos estudios se determina la localización de un gen a una zona (locus) con un margen de 10-20 cM. Posteriormente, utilizándose marcadores de la zona, se va disminuyendo este margen de error, acotándose una zona de 1-2 cM, en la que existen entre 20 a 50 genes, que posteriormente son examinados por otros medios como expresión múltiple (examen del mRNA que se expresa por ese tejido) o genes candidatos (genes con funciones que intervienen en la patogenia del proceso en estudio) (Tabla 1.4). GENÉTICA DE LAS ENFERMEDADES COMPLEJAS Desde el punto de vista de la epidemiología, las enfermedades genéticas presentan una baja prevalencia, siendo el constituyente principal del

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Tabla 1.4. Pasos para realizar análisis de ligamiento. 1. Examen clínico de la familia, determinado el estado de afectación o no de cada individuo. 2. Examen del patrón de herencia. 3. Estudio de simulación de ligamiento para ver la potencia para un análisis de ligamiento de la familia (en función del n.° de individuos, n.° de generaciones y n.° de afectados). 4. Estudio del patrón de 400 marcadores polimórficos, repartidos de forma uniforme por todo el genoma separados 10 cM. 5. Análisis del lod score para cada marcador 6. Análisis de ligamiento con marcadores densamente espaciados de las zonas encontradas positivas para confirmar el ligamiento y acotamiento de la zona de este.

grupo llamado de trastornos huérfanos. Sin embargo, la genética constituye una de las disciplinas de mayor desarrollo en estos años. La causa de esta contradicción es que lo anterior se refiere a las enfermedades de herencia mendeliana, producidas por una única mutación, que una vez presente causa la enfermedad. Sin embargo, existen otras enfermedades con una influencia genética menos evidente, que no sigue las leyes de la herencia mendeliana (herencia autosomal o ligada al X, dominante o recesiva). Son las llamadas enfermedades complejas, que además son extraordinariamente frecuentes, constituyendo uno de los principales problemas de la Salud Pública en el momento actual. El ejemplo prototípico de lo anterior es la enfermedad de Alzheimer, en la que, existiendo una indudable influencia genética, los casos de herencia mendeliana, producidas por mutaciones en el gen de la presenilina o de la APP, solo explican el 5%. Se comprende entonces que el descubrimiento de los genes implicados en el resto de los casos tiene una importancia fundamental. El hecho de que el efecto de estos genes no sea fácil de evidenciar se debe a múltiples factores que explican el nombre de herencia compleja que se les atribuye (Tabla 1.5). Viendo las alteraciones listadas en la Tabla 1.5, se entiende la dificultad de ver el efecto de un gen si su penetrancia es muy reducida o si la misma mutación puede originar enfermedad de Parkin-

20 Tabla 1.5.

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Causas de herencia compleja.

• Penetrancia reducida. • Necesidad de contacto con un agente ambiental para que aparezca la clínica. • Heterogeneidad genética (varios genes pueden causar la misma enfermedad). • Pleiotropismo (la misma mutación produce diferentes manifestaciones clínicas). • Epístasis (el efecto de un gen depende de la acción de otros genes).

son en unos casos o de Alzheimer en otros. En caso de existir una influencia ambiental marcada, esta puede ser en un sentido u el contrario. Ejemplo de esto puede ser un efecto beneficioso del ejercicio o la dieta que haga que la enfermedad solo se manifieste en ausencia de esto, o, por el contrario, que sea necesario el contacto con un factor para que aparezca la enfermedad (p. ej., insecticidas y enfermedad de Parkinson en individuos acetiladores lentos). La metodología para discernir el efecto genético de enfermedades complejas incluye los estudios de agregación familiar, los estudios de gemelaridad y los estudios de adopción. Los estudios de agregación familiar consisten en examinar si la enfermedad es más frecuente en individuos de la misma familia o no. Sin embargo, la agregación familiar puede indicar contacto con una noxa común, incluso en los primeros años de vida. Aproximaciones para discernir este efecto son el examen de la edad de aparición del proceso (aparición a la misma edad indica causa genética, mientras que aparición a edad diferente pero en un periodo de tiempo similar indica causa ambiental), examen de individuos en varias generaciones, examen de adoptados y examen de sujetos de la misma familia nacidos en diferentes poblaciones. Los estudios de gemeralidad consisten en el examen de la aparición de un trastorno en gemelos monocigóticos respecto a gemelos dicigóticos. Como ambos tipos de gemelos comparten el mismo ambiente, la diferencia entre concordancia entre uno u otro tipo se deberá a influencias genéticas. Por causa de los factores enunciados en la Tabla 1.5, se deduce que la realización de estudios

de análisis de ligamiento para conocer los genes implicados en enfermedades de herencia compleja es más complicado que en las enfermedades de herencia mendeliana. A la reducida penetrancia, que dificulta conocer el estado de afectado o no, la heterogeneidad genética, que hace que puedan estudiarse individuos con enfermedades producidas por genes diferentes o la epístasis, se añaden otros factores que complican aún más estos estudios, como son la existencia de fenocopias en la misma familia (sujetos con la misma enfermedad pero de causa ambiental, dado que se trata de enfermedades muy comunes) o que al ser enfermedades de aparición tardía muchos individuos afectados estén muertos y sin posibilidad de acceso a su DNA para estudiar marcadores polimórficos. Por todo ello, los estudios sobre enfermedades complejas, a pesar de su utilidad, son extraordinariamente complicados y los resultados hasta ahora son todavía escasos. EL PROYECTO GENOMA HUMANO El Proyecto Genoma Humano comenzó a finales de los años ochenta con la intención de conocer en los siguientes veinte años la secuencia completa del genoma humano. La aparición de los métodos de secuenciación automática y el uso de robots y, sobre todo, el empuje que supuso aparición en 1998 de la competencia de la empresa privada Celera Genomic, con el consiguiente riesgo de que la información del genoma pudiera ser objeto de patentes, aceleró la consecución del este proyecto. El DNA usado en el proyecto genoma proviene de 5 voluntarios anónimos y, por tanto, al existir una variación de unos individuos a otros, no existe una secuencia «perfecta». El genoma humano tiene 3,2 gigabases, mucho más que cualquiera de los genomas secuenciados hasta la fecha y, además, la abundancia de regiones repetidas aumenta de forma adicional las dificultades porque pueden confundirse unas regiones con otras al ensamblarse las secuencias. Los cromosomas humanos contienen 55 millones de pares de bases (ch. 21) a 250 millones (ch. 1) y una secuencia habitual no excede de 500 pares de bases, por lo que, para ser secuenciados deben ser cortados

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mediante enzimas de restricción en fragmentos de menor tamaño que puedan ser secuenciados y posteriormente ensamblados de nuevo. La técnica utilizada para secuenciar el genoma humano consistió romper este en fragmentos de 100-200 kb, que se clonaron y posteriormente se rompieron en fragmentos menores que fueron secuenciados y posteriormente ensamblados (Figura 1.13). El 26 de junio de 2000, el presidente americano Clinton y el primer ministro ingles Tony Blair, anunciaron de forma simultánea el final de la consecución del primer borrador preliminar del Proyecto Genoma Humano. Debido a esto, en los últimos meses, con la consecución del Proyecto Genoma, hemos sido objeto de continuas noticias sobre la importancia de este hecho. Las anteriores

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dos décadas se han denominado la era del genoma, debido a que en ellas se han llevado a cabo proyectos que han permitido conocer la secuencia completa del genoma humano y de otros organismos como la mosca de la fruta (Drosophila megalonaster), la Escherichia coli, o la levadura. El Proyecto Genoma Humano puede estar terminado de forma completa, resolviéndose las ambigüedades finales, hacia el año 2003. Una vez conocida la secuencia del genoma, el paso siguiente es la identificación de los genes, los elementos reguladores, y posteriormente el conocimiento de la función de estos, así como el ensamblaje de las proteínas en el metabolismo del individuo, lo que se conoce como proteómica, y que es el objeto de trabajo de los biólogos durante la próxima década. Para la identificación de los genes, tres son los

Figura 1.13. Técnica utilizada para conocer la secuencia de un genoma. El cromosoma se trocea en fragmentos de DNA de 150 Kb (1), que se clonan en BACs lo que permite su replicación y estudio. Los fragmentos se localizan en el cromosoma (3), y posteriormente se vuelven a trocear en fragmentos menores (1.500 b) (4), que se secuencian (5). Una vez secuenciados los fragmentos se alinean mediante la secuencia de solapamiento (6) y finalmente se alinean de nuevo los fragementos del BAC en el cromosoma (7).

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métodos que permiten predecir que una secuencia genómica es un gen: buscar secuencias que corresponden a estructuras de los genes; buscar secuencias con similitudes entre diversos organismos, asumiendo que si esta estructura se ha conservados entre especies, tiene que tener alguna función; y en tercer lugar, si una secuencia se copia a mRNA, esto sugiere un papel activo de esta. Los tres métodos tienen sus desventajas y usualmente se utilizan en combinación. ¿Qué representa el Proyecto Genoma Humano para la Medicina y singularmente para la Neurología? Conocer el genoma humano representa el nacimiento de una nueva medicina, que en lugar de estudiar órganos, tejidos y funciones, examina el «libro de instrucciones» del organismo. En el genoma está solo pendiente de que seamos capaces de leer nuestro pasado evolutivo (mediante comparación de genes y pseudogenes, entre especies puede conocerse fenómenos de la evolución de la especie) y todas las instrucciones para que se genere un organismo. Además, el Proyecto Genoma ha simplificados los estudios de búsqueda genética lo que ha permitido conocer nuevos genes, incluidos genes implicados en enfermedades. También ha permitido conocer SNPs, que constituyen una herramienta muy útil para conocer la genética de estas enfermedades. Va a permitir conocer, mediante los estudios de proteómica, el metabolismo y, por tanto, la alteración que origina diversas enfermedades, y fi-

nalmente, va permitir diseñar nuevas drogas en función de nuevos genes conocidos.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA 1. Brook DJH. Molecular genetic for the clinician. Cambridge, Cambridge University Press, 1993. 2. Cravchik A, Subramanian G, Broder S, Venter J. Sequence analysis of the human genome. Implications for the understanding of nervous system function and disease. Arch Neurol, 2001 58: 1772-1778. 3. Passarge E. Color atlas of genetics. Sttutgart, Ed. Thieme, 1995. 4. Primrose SB. Principles of genome analysis. Oxford, Blackwell Science, 1998. 5. Primer on molecular genetics. U.S. Department of Energy, Washington DC, 1992. 6. Pulst, S-M. Genomes, neuroscience, and neurology. Arch Neurol 2001; 58: 1755-1756. 7. Ridley M. Genoma. La autobiografía de una especie en 23 capítulos. Madrid, Ed. Taurus, 2000. 8. Rosenberg R. Genomic neurology: A new beginning. Arch Neurol 58: 1739-1741. 9. Terwilliger JD, Ott J. Handbook of human genetic linkage. Londres, John Hopkins University Press, 1994. 10. Thompson JN, Hellack JJ, Braver G, Durica DS. Primer of genetic analysis. A problems approach. Cambrige, Cambrigde University Press, 1997. 11. Thompson JS, Thompson MW. Genética médica. Barcelona, Salvat, 1975. 12. Unveiling the human genome. The first draft 2001. Wellcome News supplement 4, 2001.

C APÍTULO

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Técnicas de biología molecular en investigación y diagnóstico A. Jiménez Escrig

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS El aislamiento de los ácidos nucleicos es el primer paso de la mayoría de los estudios de genética molecular. Existen múltiples métodos para la extracción y purificación de los ácidos nucleicos, utilizándose uno u otro en función del tipo de ácido nucleico (DNA, RNA total, RNA mensajero), la fuente del DNA (sangre completa, tejido fresco o congelado, tejido en parafina, hueso, etc.) y la utilización final (PCR, blotting, rtPCR…). En general, todos estos métodos siguen los siguientes pasos: lisis celular, inactivación de las nucleasas, separación del ácido nucleico de los restos celulares y, finalmente, precipitación y resuspensión para dejarlo a la concentración de trabajo. La lisis celular usualmente se consigue mediante mecanismos de desnaturalización (uso de detergentes, medios hipotónicos o calentamiento a 80-100°, que no afectan la estabilidad de los ácidos nucleicos). Estas condiciones desnaturalizantes usualmente también alteran las proteínas y producen inactivación de las nucleasas. Si quiere obtenerse RNA, se someterá la muestra a DNAsas libres de RNAsas, que pueden obtenerse comercialmente.

Una vez lisadas las células se mezcla la preparación con fenol-cloroformo. El fenol diluye las proteínas (el cloroformo diluye a su vez el fenol) por ser hidrófobas. Como los ácidos nucleicos, por su contenido en fosfato, son hidrófilos, van a diluirse en la fase acuosa formándose estas dos fases tras la centrifugación de la muestra (Figura 2.1). Finalmente la fase acuosa se pasa a otro tubo donde se mezcla con etanol absoluto produciendose un precipitado blanquecino (ácido nucleico), que se extrae mediante una pipeta Pasteur.

Figura 2.1. Separación de los ácidos nucleicos de las proteínas con fenol cloroformo y precipitación con etanol.

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EXTRACCIÓN DE DNA El DNA se extrae a partir de homogenizados de tejidos, de células sanguíneas o de restos celulares descamados, como células de la mucosa bucal o de folículos pilosos. Como la extracción se realiza por procesos muy similares, con ligeras variantes para cada proceso, en este apartado se revisará la extracción a partir de células sanguíneas por ser la técnica más utilizada para el diagnóstico clínico. Aún cuando el DNA puede extraerse de sangre coagulada o de restos de sangre, esto último usualmente en medicina forense, para diagnóstico generalmente clínico se busca aquellas técnicas que sean más rápidas, de mayor rendimiento y reproductibilidad, por lo que habitualmente se realiza una extracción de sangre en tubo de EDTA K u otro anticoagulante como heparina. Por la estabilidad del DNA una vez extraída la muestra, esta puede permanecer a temperatura ambiente durante varios días, por lo que la práctica habitual es mantener las muestras a temperatura ambiente o en nevera a 4° hasta que se proceda a la extracción. Existen técnicas que permiten extraer DNA de sangre congelada, pero para las técnicas más usuales se debe evitar la congelación porque va a producir hemólisis celular, lo que obliga a utilizar un protocolo de extracción algo más complejo. Dado que el DNA soporta bien la temperatura ambiente, en caso de precisarse envío a otro centro no son necesarias precauciones como congelación. Nosotros utilizamos un protocolo que en un primer paso va a extraer células sanguíneas de la sangre completa y en un segundo paso extrae el DNA de estas células. Una vez extraídas las células sanguíneas puede seguidamente extraerse el DNA, mantenerse las células a 4° si se va a extraer el DNA en los próximos días o congelarse a –20°, pudiéndose entonces realizar la extracción meses o años después. Una vez realizada la extracción, el DNA puede permanecer a temperatura ambiente, por lo que puede ser enviado a algún centro por correo ordinario, o bien almacenarse a 4° si se va a trabajar con él en un plazo breve, o almacenarse a –20° si se va a archivar.

El procedimiento referido en la Figura 2.2, realiza una extracción de 50-100 μg de DNA (para una PCR basta con 0,2 μg). Utiliza fenol cloroformo para separar el DNA de las proteínas. Por la toxicidad del fenol, se tiende a usar protocolos que lo sustituyen por proteinasa K. Además, muchos centros utilizan kits comerciales que permiten reducir el tiempo de la extracción para un número alto de muestras. EXTRACCIÓN DE RNA El RNA se extrae para ser utilizado en diferentes procedimientos como obtención de cDNA mediante rtPCR, estudios de expresión génica, etc. Los protocolos de extracción de

PROTOCOLO DE EXTRACCION DE DNA (ver Figura 2.2) Extracción de células • Se parte de 10-15 ml de sangre completa en EDTA (A). • Se mezcla la sangre con 10 ml de FICOLL y se centrifuga a 400 g durante 20 minutos. • Se extrae la fase celular (flecha) con una pipeta Pasteur (B). • Se centrifuga a 1.500 g y se retira el sobrenadante. Extracción de DNA • Se añade un tampón de lisis (150 mM ClNa, 20 mM EDTA, 0,5% SDS,100 mM Tris-HCl pH 7.5) (2 ml) al pellet de células (flecha), agitándose suavemente durante 15 minutos (C). • Se añade 1 volumen de fenol-cloroformo-isoamilico 1:1:25, se agita suavemente 3 minutos y se centrifuga a 1.000 g durante 15 minutos (D). • Se extrae la fase acuosa (flecha) con una pipeta (E). • Se añade a la fase acuosa 3 volumenes de etanol 100% (F) . • Al agitar suavemente comienza a aparecer un precipitado que se «pesca» con una pipeta Pasteur (G), pasando el precipitado a un tubo de Eppendorf (H). • Se deja evaporar el etanol y se diluye en 200 μL de agua.

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Figura 2.2. etanol.

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Extracción de células y DNA mediante extracción con fenolcloroformo y precipitación con

RNA son similares a los de DNA, con algunas particularidades, especialmente las destinadas a evitar la actividad de las RNAsas. Estas enzimas son bastante estables y activas por lo que es necesario extremar precauciones para evitarlas (uso de material estéril, tratamiento de los buffers con inhibidores de RNAsas, etc.). La lisis celular se realiza con sales de guanidina (tiocianato de guanidina), que inhibe las RNAsas. En general, debido a la menor estabilidad de RNA y la mayor dificultad de su extracción, esta generalmente se realiza mediante kits comerciales. ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Para determinados experimentos es necesario conocer de forma precisa la concentración de DNA de una determinada solución. Existen varias técnicas para esto, siendo las dos técnicas principales la cuantificación por comparación en electroforesis y la espectrofotometría. La técnica de comparación consiste en comparar

en un gel la concentración de una solución problema con la de una muestra cuya concentración conocemos. La espectrofotometría permite conocer la concentración de los ácidos nucleicos de una muestra mediante la medida de su absorción de luz. La absorbancia de los ácidos nucleicos es máxima a 260 nm. A esta longitud de onda una disolución con una concentración de 1 μg/ml presenta una absorbancia de 50 unidades ópticas si es DNA de cadena doble, 40 unidades ópticas si es RNA y 33 unidades ópticas si es DNA de cadena sencilla. Utilizando esta constante se puede conocer la concentración o la cantidad absoluta de una muestra problema según la fórmula: [DNA ] = 50 * absorbancia a 260 nm Como el máximo de absorbancia de las proteínas es a 280 nm, el cociente de absorbancias a 260/280 se utiliza para valorar la pureza del DNA de una disolución. Se consideran cifras óptimas de pureza aquellas que presentan un cociente de 1,7-2. Cocientes menores indican la presencia de proteínas en el medio y cocientes

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mayores indican la presencia de otras sustancias contaminantes como etanol. AMPLIFICACIÓN DEL DNA El DNA es una molécula de gran tamaño y por lo tanto nunca se trabaja con la molécula íntegra. En la práctica habitual, la propia técnica de extracción lo rompe en fragmentos de menor tamaño y posteriormente estos pueden someterse a enzimas de restricción que los fragmente aún más, en segmentos de un tamaño de trabajo según la técnica a utilizar. Sin embargo, la concentración de estos fragmentos es muy baja, por lo que es necesario aumentar su concentración hasta concentraciones de trabajo. Esto se lleva a cabo mediante técnicas de amplificación como la clonación o la PCR. La clonación de DNA en bacterias, no confundirla con la clonación de animales, consiste básicamente en la unión de un fragmento que se quiere amplificar a un plásmido mediante ligasas (endonucleasas de restricción que generan extremos cohesivos, que posteriormente se unen), introducción del plásmido en una bacteria (generalmente E. coli) y cultivo de la bacteria en un medio de cultivo durante 48 horas, lo que genera millones de copias del plásmido. Posteriormente se extrae el fragmento de DNA mediante lisis de las bacterias. Aunque la técnica de amplificación del DNA mediante clonaje se utiliza todavía en determinados casos, la PCR es, con mucho, la técnica habitual de amplificación por ser una técnica rápida, barata y sencilla de realizar. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La reacción en cadena de polimerasa se basa en la capacidad de poder replicar el DNA mediante el uso de polimerasas in vitro. Para hacer esta amplificación, es necesario de forma cíclica variar la temperatura de la reacción en tres fases (desnaturalización a 90-95° C; anillamiento: temperatura a la que los primers se unen, entre 45 y 65°; y elongación a 72° a la que la polimerasa

elonga la cadena utilizando como molde la muestra inicial). En la primera fase, la doble cadena de DNA se desnaturaliza en dos hebras; en la segunda fase los primers se unen a las cadenas desnaturalizadas; y en la tercera fase la polimerasa elonga la secuencia utilizando como molde la complementaria (Figura 2.3). La capacidad de las polimerasas de replicar el DNA se aprovechó al máximo cuando se descubrió una polimerasa en una bacteria que vive en aguas termales (bacilo Thermus aquaticus) capaz de resistir temperaturas de 95° C. Esto permite realizar la PCR sin tener que reponer la polimerasa después de cada fase de desnaturalización. Como cada fase de temperatura dura entre medio y un minuto, después de 30 ciclos, en dos o tres horas pueden obtenerse de 1 millón a 1.000 millones de copias de una muestra de DNA inicial (Figura 2.4). Para amplificar por PCR, es necesario preparar una reacción en un tubo de ensayo, que contenga: • • • • •

Muestra a amplificar. Taq polimerasa. Primers o iniciadores de la reacción. dNTPs. H2O, buffer de la reacción, magnesio.

Muestra a amplificar La muestra a amplificar se denomina template o molde. En teoría, con una sola molécula de DNA es suficiente para amplificar un fragmento por PCR, lo que hace que la PCR sea la técnica ideal para amplificar DNA en caso de que exista una muestra muy escasa. Sin embargo, el rendimiento en estos casos es bajo, siendo lo habitual que se utilice una cantidad de DNA mayor. El DNA puede tener un origen muy diverso: humano, lo más habitual es el DNA extraído de los núcleos de los leucocitos de una muestra de sangre, como se ha referido anteriormente, pero puede extraerse de cualquier material celular, como células descamadas de la mucosa bucal en la saliva, de la raíz del pelo, o células de cualquier órgano en materiales necrópsicos; viral, bacteriano u hongos, usualmente para diagnóstico micro-

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Figura 2.3. Fases de la PCR.

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Figura 2.4. Amplificación exponencial por PCR. En situación de plena eficiencia, después de 20 ciclos hay 220 copias (106) y después de 30 ciclos 230 (109).

biológico; animales y plantas, en aplicaciones en biología o en veterinaria. A pesar de la capacidad de amplificar de la técnica de PCR, lo ideal es tener la concentración óptima de template, con una concentración mínima de impurezas que puedan inhibir la reacción de PCR. Por esto, previamente a la PCR puede extraerse el DNA de las células que lo contienen. Para ello hay diversos métodos y kits comerciales diseñados para extraer el DNA del tejido correspondiente. Sin embargo, esto no es estrictamente necesario y existen protocolos que permiten hacer PCR introduciendo en la reacción células, sin el paso previo de la extracción. La extraordinaria capacidad de esta técnica de reproducir el DNA a partir de una muestra mínima es también su principal inconveniente. Si en la reacción se introduce otro DNA extraño puede ser amplificado, por lo que deben extremarse las medidas anticontaminación durante todos los pasos a seguir. Alguna de estas medidas incluyen: utilización de material autoclavado (puntas de pipetas, tubos) en todos los pasos; preparación de las reacciones en cabinas de flujo laminar; evitar contaminación cruzada de las muestras; introdu-

cir un control negativo al preparar las reacciones (una reacción de PCR sin template) para detectar contaminación. Preparación de la PCR Con las consideraciones anteriores prepararemos las reacciones que contienen (Figura 2.5): • H2O: es el medio en el que se van a realizar las reacciones. • Buffer: contiene los iones necesarios para que funcione la polimerasa. • dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP): son los nucleótidos que actuaran como ladrillos para construir el DNA. • Primers: hacen que la reacción comience en el sitio exacto. • Polimerasa: enzima termoestable (soporta temperaturas de hasta 100° sin desnaturalizarse) que se encarga de elongar el molde, produciendo su amplificación. • Template: muestra de DNA de la que se parte para realizar la amplificación.

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Buffer

El buffer usado usualmente 100 mM TrisHCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, se guarda concentrado 10 veces. Primers

Son fragmentos cortos de DNA (18-30 pares de bases), complementarios al segmento inicial y final del DNA que queremos amplificar, con una secuencia que es específica de ese segmento. Los primers se van a anillar (anneal) al DNA previamente desnaturalizado proveyendo un sitio de iniciación para elongar el DNA. Cada primer tiene una temperatura a la que el anillamiento es óptimo (temperatura de annealing) que está en función de la secuencia del primers. Existen diferentes fórmulas para calcular esta temperatura. La más sencilla: Tm = 2(AT) + 4(GC) calcula la temperatura de melting del primer, que es 5° superior a la de annealing. Para saber que secuencia debe usarse como primer existen unos programas que diseñan los primers más adecuados para una PCR. Los primers deben cumplir una serie de reglas para que sean capaces de amplificar de forma correcta. Deben ser:

Figura 2.5. Preparación de la PCR. Termociclador.

Todos estos componentes se mezclan en un tubo de 200-500 μL, de paredes finas para que pueda transmitir bien el calor, ocupando un volumen de 25-100 μL, y se introduce en un termociclador (aparato automatizado que va variando la temperatura).

• Específicos de la región en la que anillan, lo que quiere decir que esta secuencia solo se encuentra en ese punto del genoma. Para ello, mediante el programa BLAST se rastreará en las bases de datos de DNA en qué locus pueden anillar. • Tener una temperatura de annealing similar. • Tener un contenido de C y G entre 45-55%. • Debe tener una purina al principio y al final. • Su secuencia debe evitar anillamiento de un primer con otro. De acuerdo con lo anterior, el primer ideal debe contener una mezcla similar de nucleótidos (A,C,G,T), un contenido de C y G del 50% y aproximadamente 20 bases de longitud. Esto hace que la temperatura de melting sea de 56-62 °C.

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Magnesio

El magnesio es necesario para que actúen las polimerasas, siendo la concentración habitual 1,5 mEq/L. Determinadas reacciones pueden necesitar concentraciones mayores que aumentan el rendimiento. Un incremento innecesario de Mg puede originar amplificaciones inespecíficas.

Coadyuvantes de la reacción

En determinadas reacciones de PCR, especialmente en casos de productos con alto contenido de C y G, es necesario añadir ciertas sustancias que aumentan la especificidad o el rendimiento de la reacción. Algunos de estos coadyuvantes son el dimetilsulfóxido (DMSO) al 5-10%, glicerol al 5%, formamida, o seroalbúmina bovina (BSA).

N.° de ciclos

La reacción se realiza durante 26-35 ciclos. Un menor número de ciclos va a disminuir el rendimiento, lo que puede hacer que en ocasiones no se visualice producto. Un número mayor de ciclos no suele mejorar el rendimiento por saturación de los reactivos y a la vez puede generar amplificaciones inespecíficas. Una reacción habitual en 100 μL contiene: 10 μL 10X buffer. 6 μL de MgCl2 (1,5 mEq/L). 6 μL de mezcla de nucleótidos (150 μM). 4 μL primers (10 pmol/μL). 1 μL Taq DNA polimerasa (5 unidades/μL). 69 μL de agua. 4 μL de template (0,2 μg/μL) (30 a 36 ciclos).

La desnaturalización se realiza a partir de 90°, bastando generalmente 30 segundos. En el primer ciclo suele durar 5 minutos para asegurar una completa desnaturalización del template. La temperatura de annealing es aquella en la que el anillamiento es óptimo y no se producen uniones inespecíficas. Temperaturas por debajo de esta temperatura van a hacer que los primers se unan en otros lugares del DNA, originándose productos diferentes al que se busca (producto inespecífico) o incluso que no se produzca amplificación. La polimerasa actúa a 72° y es capaz de elongar unos 2.000 pares de bases por minuto, por lo que la extensión suele durar 30-60 segundos. Por ello, el programa usual de PCR contiene los siguientes pasos: Desnaturalización Anillamiento Extensión Extensión final 30-35 ciclos

94° 55° 72° 72°

30 segundos 30 segundos 30 segundos 3 minutos

Una vez realizada la reacción de PCR, habitualmente se detecta el DNA amplificado mediante la electroforesis de una alícuota de la reacción (3-10 μL) en un gel de agarosa. Variantes de la PCR son: long PCR: PCR en la que se amplifican secuencias largas (mayores de 23 kbases hasta 10 kbases) para lo que habitualmente se utiliza unas polimerasas especiales para ello. rtPCR: PCR realizada a partir de mRNA, que se transforma a cDNA mediante una transcriptasa inversa, y posteriormente el cDNA se amplifica con una polimerasa. PCR múltiple: PCR en la que se introducen múltiples primers, por lo que se obtienen múltiples productos. Touchdown PCR: PCR en la que se va decreciendo la temperatura de annealing a lo largo de ciclos sucesivos. Su objetivo es producir un producto muy específico en los primeros ciclos y tener un mayor rendimiento en los últimos ciclos (annealing más bajo).

Programa de PCR

ELECTROFORESIS DE DNA Los termocicladores presentan opciones para edición y almacenamiento del programa de temperaturas y número de ciclos (Figura 2.5).

El DNA es un ácido, con carga negativa, por lo que en presencia de un campo eléctrico va a migrar

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hacia el polo positivo. Si se pone en un medio poroso como son los geles, la velocidad de migración del DNA va a depender del tamaño de la molécula, siendo mayor cuanto menor son estas moléculas. Este es el principio de la electroforesis de DNA, técnica que permite separar el DNA en función de su tamaño (el n.° de pares de bases) y, por tanto, de visualizar un determinado producto de DNA. La electroforesis de DNA se realiza en una cubeta, en la cual se pone un gel poroso, previamente fabricado en el laboratorio con agarosa al 1-3% o acrilamida al 6-15%, en contacto con un buffer iónico, que transmitirá la corriente a través del gel y a la que se conecta una fuente de alimentación, que genera un voltaje entre 100 y 150 mV. En los pocillos del gel, se introduce el DNA junto con un medio denso que impide su difusión al buffer, y tras 30-60 minutos en presencia de la corriente eléctrica, se ha separado lo suficiente para que podamos visualizar las diferentes moléculas de DNA que existan en el medio cargado. Para visualizar este DNA se deberán utilizar diferentes medios de tinción o revelado como bromuro de etidio (sustancia que se intercala en la doble hélice del DNA y en contacto con una luz ultravioleta emite fluorescencia) o emisores radioactivos. En la Figura 2.6 se muestra cómo se realiza un gel de agarosa, el medio más corriente para visualizar ácidos nucleicos. Existen técnicas de electroforesis con condiciones especiales (SSCP: single strand conformation polymorphism o polimorfismo de conformación de hebra única) que permiten detectar la presencia de mutaciones en productos de PCR de un modo rápido. Se basan en la diferente conformación que adoptan los productos de PCR que difieren en una base, cuando se corren desnaturalizados en geles desnaturalizantes. En este tipo de geles puede diferenciarse un producto de PCR que difiera en una base por migrar a diferente velocidad, lo que indica la existencia de una mutación, que luego se confirmará por secuenciación del producto (Figura 2.7). ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN La capacidad de las enzimas de restricción de localizar una determinada secuencia específica

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para esa determinada enzima se ha utilizado en genética con varios fines. Uno de ellos es examinar si dentro de una secuencia de DNA existe una determinada subsecuencia, que puede ser una mutación o un polimorfismo. La técnica utilizada para ello consiste en incubar durante 2-4 horas, a una temperatura de 37° (u otras según la enzima), el DNA problema, con la enzima de restricción y un buffer. Si posteriormente corremos un gel, encontraremos diversos fragmentos, según la enzima haya encontrado o no la secuencia de corte (Figura 2.8). Las variantes que aparecen al examinar una secuencia de DNA tras digerirla con una enzima de este tipo se denominan polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). SECUENCIACIÓN DE DNA La técnica básica de secuenciación de DNA se basa en que dos secuencias que difieran en una sola base pueden discriminarse mediante un gel de poliacrilamida. Según esto, se pueden utilizar dos métodos cuyo fin es conseguir cadenas con una base de diferencia: el método de terminación de cadenas y el método de degradación química. El método de terminación, que es el más usado, consiste en realizar una reacción de amplificación de un fragmento de DNA en el que se introduce un «terminador» de una determinada base (p. ej., ddATP, o dideoxyadenina fosfato, que hace que la reacción de elongación de la polimerasa se detenga al introducirlo en la cadena de DNA, con lo que se consiguen todos los fragmentos de la secuencia que contengan la adenina). El terminador no contiene el grupo hidroxilo en posición 3’, lo que impide que se siga elongando la molécula, ya que este grupo es necesario para que a él se una el siguiente nucleótido. Generalmente se preparan 4 reacciones con un buffer, primer, template, la polimerasa, los dNTPs y en cada una de las reacciones se introduce un ddNTP diferente (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP). En la primera reacción, la ratio ddATP, dNTPs es tal que antes de que se incorpore el ddATP se incorporan otros dNTPs, lo que permite que haya una cierta elongación en

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Figura 2.6. Gel de agarosa. Se diluye agarosa al 1-3% en TAE* (A), y se calienta hasta la ebullición (B). Se vierte en un portageles con un «peine» C). Una vez polimerizado el gel se coloca en una cubeta con TAE al 1-3% (D). Se preparan las muestras de DNA que van a correrse en el gel mezclándolas con un buffer de carga** (E, F). Se cargan las muestras en el gel (H, G) y mediante una fuente eléctrica se genera un campo eléctrico (I), que hace que las muestras comiencen a desplazarse en el gel (J). Una vez que se han desplazado, se visualizan colocándolas en un transiluminador de luz ultravioleta a 320 nm (K). Finalmente se fotografía el gel para conservar una imagen definitiva (L). ** TAE (buffer que aporta el medio iónico necesario para crear una diferencia de potencial (Trizma base, a. acético glacial, EDTA). ** Buffer que fija el DNA al pocillo durante la carga y lleva 2 colorantes que permiten ver la migración del DNA (0,25% azul de bromofenol, 0,25% xylen cianol, 40% de sucrosa en agua).

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Figura 2.7. SSCP. Izquierda: individuo homociggótico para el polimorfismo T. Derecha: individuo heterocigótico, presenta dos bandas (T y C).

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de detección habitualmente se realiza a través de un sistema de fluorescencia, mediante un láser que excita la fluorescencia de aquellas moléculas de DNA en las que se ha producido la unión. La sonda de DNA está constituida por cDNA que se deposita en la matriz mediante técnicas de microinyección similares a las usadas en las impresoras de tinta o alternativamente oligonucleótidos, que mediante técnicas de síntesis, se han generando in situ en la matriz, utilizándose técnicas fotolitográficas como las usadas para grabar los circuitos microelectrónicos. Esto permite colocar hasta 400.000 sondas en una superficie de 20 μm2. Una vez que se produce la hibridación, el chip es escaneado mediante un láser de alta resolución que es capaz de emitir 25 millones de

las moléculas hasta que esta se detenga. Como la elongación es complementaria al template, la primera detención por un ddATP corresponde a una T en la secuencia. Posteriormente a las reacciones se corre un gel de poliacrilamida con las reacciones de secuencia colocadas en carriles diferentes. Cada banda que aparezca indicará una base en esa determinada posición (Figura 2.9). Debido a condiciones técnicas, para conseguir observar en un gel diferencias de una base, y por la concentración del producto resultante de las reacciones de secuencia es necesario utilizar isótopos de azufre radioactivo (S35). En los últimos años esto ha sido sustituido por sustancias que emiten luz fluorescente cuando son estimuladas por un láser (secuenciación automática), para lo que es preciso correr los geles en aparatos que emiten el láser y detectan la luz correspondiente (secuenciadores automáticos) (Figura 2.10). MICROARRAYS (CHIPS GENÉTICOS) Los microarrays o chips genéticos consisten en cientos de miles de secuencias cortas de DNA, llamadas sondas, en diferentes localizaciones previamente establecidas en una matriz. Su principio básico de funcionamiento es la unión altamente selectivas de los ácidos nucleicos con otros de secuencia complementaria. El sistema

Figura 2.8. Análisis de restricción. Producto de PCR del exón 6 del gen CYP27. Se examina la presencia o no de la secuencia .... cctaccgca.... o ... cctacagca.... El cambio de la c por la a produce un cambio de una Arg362Cys, causante de xantomatosis cerebrotendinosa. En presencia de la mutación se pierde el locus de restricción para el encima AvaI, que reconoce la secuencia CCGC. Derecha: Producto de PCR de 360 pares de bases Media: 3 bandas: superior-producto de PCR a 360 pbproducto de PCR en heterocigosis, media-250 bp e inferior-110 bp correspondintes al producto de PCR cortado.

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Figura 2.9. A) Reacciones de secuencia de un fragmento ACGAATCG. B) Gel de secuencia. El gel consta de 4 carriles para cada muestra, según el terminador usado, discriminando los productos en función de su longitud. El gel se corre desnaturalizado, por lo que solo se visualiza el producto de secuencia.

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pixeles, que son integrados en el ordenador en la respuesta correspondiente. La tecnología de microarrays se utiliza fundamentalmente para:

enfermedad o grupo de enfermedades como miopatías o demencias. El estudio de expresión de genes tiene como objeto la determinación cuantitativa de la cantidad de expresión de un amplio número de genes de un tejido a través del estudio de la abundancia de mRNA en el medio. Para ello se construyen microarrays que contienen secuencias características de un gen (llamadas partial sequence tags) en lugar de los microarrays utilizados para secuenciar que utilizan secuencias inespecíficas que contienen zonas solapables. Cuando un gen es activo, va a transcribirse en mRNA, por lo que los casos en los que existe hibridación a una de estas secuencias indican expresión de ese gen en ese tejido. La sensibilidad de esta técnica puede incrementarse mediante la sustracción del patrón de expresión en ese tejido respecto a otro tejido, lo que muestra que gen está activo en un tejido respecto a otro. Mediante esta técnica puede examinarse la expresión de decenas de miles de genes simultáneamente, lo que permite estudiar los procesos biológicos y sus patologías, dando lo que se ha llamado la imagen dinámica molecular de una célula. Esta tecnología de estudio de genes expresados mediante microarrays se utiliza hoy en día para valorar los genes expresados por las células de los tumores cerebrales, describiéndose diferentes patrones que van a presentar diferente respuesta a la quimioterapia.

• Secuenciación de DNA. • Análisis de mutaciones. • Estudios de expresión de genes.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

Figura 2.10. Secuenciador automático y cromatograma de una secuencia de DNA.

Para la secuenciación de DNA, los microarrays tienen sondas de 10-16 pares de bases con diferentes secuencias aleatorias. Puestas en contacto estas secuencias con la secuencia a examen se van a producir diversas hibridaciones, que convenientemente ordenadas nos van a permitir conocer la secuencia problema. El análisis de mutaciones sigue una técnica similar, pero en este caso las sondas del chip contienen secuencias con las diferentes mutaciones que interese estudiar. Se pueden examinar de este modo en un mismo test todas las mutaciones conocidas que puedan producir una determinada

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C APÍTULO

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Animales transgénicos en neurología A. Jiménez Escrig

Hasta hace unos años no se disponía de modelos animales para la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, salvo algunos modelos difíciles de obtener y mantener. Así por ejemplo, modelos animales semejantes a la enfermedad de Alzheimer en el humano son primates y perros añosos o incluso osos, pero la irregularidad en la aparición del proceso hace inviable su utilización para investigación, siendo su conocimiento meramente anecdótico. Además, en otras enfermedades hereditarias el único método para estudiar la regulación y la función de los genes de los animales era, hasta hace unos años, utilizar modelos animales con mutaciones espontáneas en estos genes, como por ejemplo el tembler mouse, ratón con polineuropatía semejante a la enfermedad de Charcot Marie Tooth producida por una mutación en el gen de la proteína PMP22. Desde los años setenta ha sido posible introducir fragmentos de DNA en las células procarióticas y eucarióticas in vitro e inducir la expresión de ese DNA extraño en estas células. El DNA puede ser introducido en las células mediante microinyección directa, electroforación de las membranas, bombardeo de las células o vectores virales. Aproximadamente una de varios

miles de células tratadas incorporaba el DNA, expresándose este bien como un cromosoma extra, bien integrado en los cromosomas celulares. Mediante estas técnicas, llamadas de transfección genética, pueden introducirse secuencias de DNA en células en cultivo, y la proteína producto del gen transferido puede recogerse en el medio de cultivo. Sin embargo, aunque la expresión del gen es fácil de investigar, la actividad del gen a nivel celular es más complicada de conocer por las complejas interacciones fisiológicas del animal completo, que es imposible simular en un cultivo celular1. Utilizándose animales transgénicos puede evaluarse el efecto de una mutación en un gen, en el ambiente genético completo del animal. Los animales transgénicos se utilizan en tres áreas principales: 1. Modelos de enfermedades humanas. Los animales transgénicos han permitido obtener modelos murinos de diferentes enfermedades. Estos modelos son fáciles de mantener, su fisiología es conocida desde hace años, lo que permite evaluarlos, siendo actualmente una herramienta vital para el estudio de los meca37

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nismos patogénicos de las enfermedades y la respuesta a los tratamientos experimentales2,3. La predictibilidad de la respuesta del modelo hace que baste con escasos animales para realizar estos estudios. Además, el uso de cultivos de células provenientes de estos animales permite reducir aún más el número de animales a utilizar. Finalmente, este método puede utilizar animales en los cuales se ha introducido más de un gen mediante apareamiento entre ellos. 2. Producción de proteínas. El uso de transgénicos puede permitir la producción de una proteína, hormona o factores de crecimiento. Para ello pueden utilizarse bacterias, cultivos celulares o animales. En estos últimos se utiliza el tejido mamario como órgano diana, lo que permite obtener de un modo continuado el producto del gen introducido. 3. Modificación de la anatomía y fisiología del animal. Mediante el gen introducido se pueden conseguir animales con mayor resistencia a enfermedades, mayor rendimiento de carne o leche, etc.

do introducirse con éxito en el genoma del animal receptor, pero generalmente con esta técnica se produce un alto grado de mosaicismo. Además, el tamaño de la secuencia transgénica es limitada y la secuencia viral adyacente puede interferir la expresión del transgén. Posteriormente han aparecido otras técnicas para producir transgenes. Estas incluyen transferir segmentos enteros de cromosomas (ratones transómicos) y transfección de gametos conjunta con fertilización in vitro. Actualmente, la técnica más utilizada es la de microinyección en el pronúcleo. Usando esta técnica se puede introducir una secuencia de hasta 50 kilobases que luego se expresará en las células somáticas y germinales. Los pasos para obtener un animal transgénico incluyen4: 1. La construcción del transgén. 2. La inserción del transgén en las células embrionarias. 3. La colocación del embrión con el transgén en el tracto reproductor de una rata pseudopreñada. 4. El análisis de los ratones obtenidos para ver si expresan el gen transfectado.

DESARROLLO DE LOS TRANSGÉNICOS En los años setenta se realizaron los primeros experimentos para construir ratones quimeras. Estas quimeras se forman por la introducción de células de una cepa de ratón en un embrión de ratón de otra cepa mediante agregación o por inyección en el embrión en fase de blastocisto. Se forma una quimera que va a contener rasgos de diferentes cepas. Otro tipo semejante de transferencia de genes consiste en transferir el núcleo entero de un embrión directamente en el ovocito enucleado de un animal de otra cepa. Estos animales transgénicos producidos sin utilizar técnicas de DNA recombinante representaron pasos muy importantes para conocer los mecanismos de regulación genética en mamíferos y el desarrollo de las técnicas de manipulación de los embriones. El siguiente paso en la evolución de la tecnología de transgénicos consistió en la infección mediante retrovirus de embriones de ratón en fase de preimplantación. La información viral pu-

Preparación del transgén de DNA El transgén a inyectar se produce mediante ingeniería genética. Utilizando enzimas de restricción y ligasas, que cortan y empalman fragmentos de DNA en los puntos que previamente se han seleccionado, los componentes de un gen pueden ser aislados y recombinados en un cassete del transgén o contruct. Generalmente, este construct contiene una región promotora, la región de refuerzo, el gen, una región de poliA y finalmente la secuencia polilinker que contiene las secuencias de reconocimiento de varias enzimas de restricción. Esta región de polilinker permite insertar el construct en una variedad de vectores para examinarlo o clonarlo (Figura 3.1). El construct se inserta en un plásmido y es clonado (copiado) mediante un E. Coli, obteniéndose millones de copias, que se diluyen en un medio de microinyección (p. ej., Tris-EDTA) a la concentración de trabajo (1-5 μg/ml). Gene-

ANIMALES TRANSGÉNICOS EN NEUROLOGÍA

39

Figura 3.1. Características del construct.

ralmente, antes de introducirse en embriones se examina la capacidad de expresión del construct en cultivos celulares, mediante transfección. Las dos técnicas principales para introducir un gen extraño en el embrión son la microinyección en el pronúcleo y el uso de células tronco embrionarias (Figura 3.2)5,6.

Microinyección pronuclear

Consiste en la introducción de una secuencia de DNA en un pronúcleo del óvulo fertilizado. La primera producción de un ratón transgénico usando microinyección en el pronúcleo se describió en 1980. Aunque el transgén se introdujo

Figura 3.2. Los dos métodos de construir transgénicos, mediante la implantación de células embrionarias modificadas genéticamente y mediante la inyección en el pronúcleo.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

en el genoma del ratón no se consiguió expresión del gen. En subsiguientes trabajos se describieron transgenes integrados en los que se consiguió expresión funcional. El primer cambio fenotípico visible en un ratón transgénico se describe en 1982 en animales que expresan la secuencia de la hormona de crecimiento de la rata. La microinyección pronuclear busca la introducción de una secuencia de DNA en un cromosoma de un ovocito fertilizado de mamífero en las horas siguientes a la fertilización de este. En este momento se pueden visualizar el pronúcleo masculino, de mayor tamaño, del femenino, más cerca de la superficie del oocito. El transgén puede introducirse en uno de estos núcleos, según en cual interese que se integre. El material introducido tiene que integrarse en el genoma del huésped antes de que se duplique el material genético en la primera división celular o se producirá un mosaicismo con un cierto número de células que no poseen el nuevo gen. El animal que se desarrolla después de recibir el DNA transgénico se denonima fundador de una nueva línea transgénica. Si las células germinales del fundador transmiten el transgén de una forma estable todos los descendientes del animal son miembros de una única línea transgénica. El DNA se integra en el genoma embrionario de una forma aleatoria respecto al locus cromosómico. Por ello es muy baja la probabilidad que en dos embriones que reciban el mismo transgén, este se integre en el mismo locus. Además, es imposible regular exactamente el número de copias de un transgén que puedan introducirse en un embrión, y cuántas puedan unirse juntas para integrar una única tira lineal de estos llamada concatemero6. Diversos estudios han demostrado las importantes diferencias en la expresión de un transgén específico en diferentes embriones debidas simplemente a diferente loci de integración. El número de copias del transgén que se han unido al genoma del fundador no influye apenas en el grado de expresión. El construct puede contener cDNA o intrones y exones, siendo en este último caso mayor la expresión por la modificación en el splicing que se produce7. Como el locus de integración del transgén es aleatorio, no es infrecuente que el transgén se inserte en una secuencia genética funcional, lo que

puede tener diferentes repercusiones, desde no tener consecuencias a ser letal. El DNA transgénico se inserta solo en uno de los cromosomas de un par, por lo que el genotipo del fundador suele denominarse hemicigótico en lugar de heterocigoto. Un genotipo homocigótico se consigue mediante apareamiento de dos individuos hemicigóticos. El éxito de las técnicas de microinyección requiere: 1. La construcción de un fragmento de DNA para ser inyectado. 2. La disponibilidad de un grupo relativamente grande de embriones en estado de pronúcleo. 3. Las técnicas de microinyección y transferencia del embrión a un útero receptor. La disponibilidad de embriones en fase de pronúcleo depende de una serie de factores como capacidad de ovulación, supervivencia de embriones a la microinyección, etc. Para la recolección de embriones, de forma sumaria, se induce superovulación mediante la inyección de gonadotropina coriónica, se produce un apareamiento monógamo, y a la mañana siguiente a este, se retiran los oviductos, extrayéndose los embriones. Posteriormente se separan e individualizan los embriones del acúmulo de células foliculares con lavados con hialuronidasa y se transfieren a una placa petri donde se realiza la microinyección8.

Técnica de microinyección

Las pipetas para microinyección suelen fabricarse a partir de un cristal capilar, teniendo 1 μm de diámetro interno, siendo diámetro de embrión de 85 mm. Para manipular el embrión se utiliza una pipeta de punta plana de 15-25 μm. Ambas pipetas se manejan con un micromanipulador que regula los movimientos en las tres dimensiones. Los embriones se colocan en la placa petri visualizándose con un microscopio con escasos aumentos. Tras seleccionar el embrión se punciona y penetra de forma uniforme a través de la zona pelúcida, membrana, citoplasma y membrana nuclear, inyectándose en el pronúcleo, tras lo que se retira suavemente la pipeta.

ANIMALES TRANSGÉNICOS EN NEUROLOGÍA

Después, el embrión inyectado se separa y se pasa a inyectar un segundo embrión, quedando los embriones inyectados en reposo durante unas horas en que se observa su viabilidad, y si son viables se transfieren a la rata huésped. Como rata huésped se utilizan ratas a las que se prepara mediante apareamiento con machos vasectomizados. Mediante cirugía se transfieren los embriones con una pipeta de 150 μm al infundíbulo del oviducto. El embarazo es aparente a las dos semanas de la transferencia de los embriones, apareciendo el parto a las tres semanas. Las técnicas de microinyección tienen la ventaja de su alta eficiencia, alrededor del 10-30% de los nacidos van a contener el inserto, y que permiten insertan largos fragmentos de DNA (hasta cientos de kilobases). Su principal desventaja es que el sitio de integración no puede predeterminarse, lo que hace impredecible el nivel de expresión del transgén, pues este está muy influenciado por este factor.

Uso de células embrionarias

Las células embrionarias se obtienen a partir del embrión en fase de blastocisto y una vez

Figura 3.3. Técnica de gene targeting.

41

transfectadas con un transgén, si se reimplantan en un blastocisto de 3 días se comportan como células totipotenciales que pueden colonizar el embrión y contribuir al soma y la línea germinal, originando un ratón quimera. Mediante esta técnica es posible introducir genes en un embrión, siendo su principal ventaja el que puede seleccionarse el lugar de implantación mediante técnicas de DNA recombinante que se muestran en la Figura 3.39. Para conseguir la integración del gen en su sitio homólogo, se fabrica un construct flanqueado por una larga secuencia de DNA homóloga a las secuencias que flanquean el gen. Mediante fenómenos de recombinación homóloga, el construct se va a intercambiar con el gen del ratón. El construct lleva además un gen que confiere resistencia a la neomicina a la célula y un gen de timidina kinasa. Poniendo las células transfectadas en contacto con neomicina, solo sobreviven aquellas en las que la transfección tuvo éxito (contiene el gen de resistencia a neomicina). Si después se añade al medio ganciclovir, aquéllas en las que ha habido recombinación al azar (y, por tanto, contienen todavía la kinasa) morirán por transformación del ganciclovir por la kinasa (Figura 3.3(2)). Si hubo recombinación homóloga, se pierde la kinasa, y por lo tanto el

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

ganciclovir no es letal para ellas (Figura 3.3(1)). Estas son las células que se reimplantarán a un blastocisto. Por cualquiera de los dos métodos, una vez que se ha producido el parto, se examinará mediante PCR, habitualmente de DNA extraído de la cola del ratón, y secuenciación del producto o análisis de restricción, si el experimento ha tenido éxito y el ratón es hemicigótico para el gen en cuestión. RATONES KNOCK-OUT En el caso de estudio de enfermedades recesivas, la técnica seguida habitualmente es la de producir ratones knock-out, que son ratones en los que se han inactivado los dos alelos de un gen4. Esta técnica, mediante la cual se evita la expresión del gen en cuestión, se utiliza además para estudiar la función de un determinado gen, ya que el fenotipo de los ratones knock-out indica esta función. Mediante la técnica descrita de gene targeting (Figura 3.3) se consigue un ratón quimera en el que se reemplaza el gen en cuestión por otro no funcionante. Posteriormente, el cruce de estas quimeras permite obtener el homocigoto no funcionante. MODELOS TRANSGÉNICOS DE ENFERMEDADES NEUROLÓGICAS Mediante las técnicas anteriormente citadas se han conseguido modelos animales de las principales enfermedades neurológicas que están permitiendo estudiar sus mecanismos patogénicos y ensayar terapias. Los principales modelos transgénicos actualmente existentes se muestran en la Tabla 3.1. Estos modelos animales reproducen la enfermedad humana, por lo que para entenderlos es aconsejable revisar esta previamente en el capítulo correspondiente. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Después de la identificación de las mutaciones causales en el gen de la APP (proteína pre-

Tabla 3.1.

Transgénicos en neurología.

AMILOIDOSIS Enfermedad de Alzheimer Polineuropatia amiloidea familiar Encefalopatía espongiforme TAUPATÍAS SYNUCLEOPATÍAS EXPANSIONES Ataxia de Friederich Corea de Huntington Otras heredoataxias OTRAS Esclerosis lateral amiotrófica

cursora de amiloide) varios grupos han producido ratones con diversos hechos de enfermedad de Alzheimer, usando cDNA o utilizando el gen completo. En el primer caso, existen tres modelos transgénicos principales de APP: con la proteína salvaje, con mutaciones como la V717F, y con fragmentos C terminales. Debido a dificultades técnicas en el manejo de un gen grande como el de la APP (300 Kb), inicialmente se ensayaron transgénicos con el cDNA y diferentes promotores, que no mostraron apenas lesiones anatómicas ni alteraciones fenotípicas, probablemente debido a que la presencia de intrones es necesaria para obtener una mayor expresión del gen. En 1995 el grupo Athena/Elan construyó un modelo que utilizaba el factor de crecimiento plaquetario como promotor e incluía el cDNA de la APP, con la mutación Val717Phe y los intrones 6, 7 y 8 del gen, que parece ser son necesarios para un correcto splicing del gen27. Con esto se conseguía una expresión mayor de APP, demostrándose mediante Southern blot ~ 40 copias del transgén insertadas en un único lugar, que se transmite de modo estable. El resultado fue un ratón que a partir de los 6 a 9 meses exhibe numerosas placas neuríticas, pérdida sináptica, astrocitosis y microgliosis. Este modelo conocido como el modelo Games, nombre de la primera autora de la publicación en que se describe, consigue por primera vez la aparición de placas seniles en transgénicos. Posteriormente, Karen Hsiao et al., han

ANIMALES TRANSGÉNICOS EN NEUROLOGÍA

desarrollado un transgénico de APP utilizando como promotor los elementos regulatorios del gen PrP, que es un gen de expresión neuronal solo y con el gen de la APP con las mutaciones L670N y M671L. Este modelo produce unos depósitos de Aβ40 5 veces mayor que el control, y de Aβ42 14 veces mayor que el control y muestra alteraciones en test de memoria y comportamiento28. Un tercer modelo desarrollado por Novartis, que combina las mutaciones L670N, M671L y V717F, muestra abundantes placas de amiloide29,30. Otro modelo de APP es el modelo que sobreexpresa el fragmento C-terminal de 100 residuos, diseñado para examinar la γ-secretasa y sus posibles inhibidores15,31. Este modelo no presenta depósitos extracelulares sino un incremento en el acúmulo intracelular de Aβ, sugiriendo que este contruct origina una desviación del péptido hacia esta vía. Todos estos modelos fabricados con cDNA han provisto de importantes evidencias sobre esta enfermedad, pero presentan importantes limitaciones, como son la admisión de importantes asunciones sobre el proceso de la enfermedad respecto a las isoformas (695, 751 y 770) y promotores de la APP (neuronal, glial, cerebral específico, etc.) utilizados para conseguir la expresión temporal y espacial de esta proteína, que además se expresa en altas dosis. Para conseguir una aproximación más parecida al modelo natural de la enfermedad, se utilizan modelos genómicos, en los que mediante la extrategia de gene targeting, se humaniza la Aβ del ratón y se inserta la mutación K670N/M671L. Con esto se consigue una expresión de APP humana a una dosis de 0,5 veces la proteína endógena, con aumento de la Αβ32. Otra aproximación genómica reside en la introducción en la línea germinal del ratón de todo el gen APP humano, de 300 kb con la mutación K670N/M671L, clonado en un cromosoma artificial de levadura (YAC). En este modelo se expresa la APP humana dos o tres veces en el ratón heterocigoto y 4 a 6 veces en el homocigoto, respecto a la forma del ratón, apareciendo depósitos cerebrales de amiloide a los 24 meses y 14 meses respectivamente, con alteraciones en las pruebas del memoria, como el laberinto de agua o de retención en tareas guiadas por el olor33.

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La distribución de las lesiones de los modelos animales del enfermedad de Alzheimer es similar entre todos los modelos, pero no es igual en todas las regiones, existiendo depósitos más marcados en las regiones más afectadas en la enfermedad humana. No obstante hay diferencias, como la mucho mayor producción de Aβ42 respecto a Aβ40 en ratones que expresan la mutación V717F, mientras que la mutación L670/ M671L origina similares proporciones de ambos péptidos. Posteriormente, se han fabricado varios modelos transgénicos que sobreexpresan presenilina 1, con la mutación M146L o M146V, encontrándose que aunque no se presentan depósitos de amiloide, aumentan selectivamente la cantidad de Aβ42 cerebral, lo que sugiere que las mutaciones en las presenilinas causan enfermedad de Alzheimer a través de una ganancia de función que incremente la producción de Aβ4217,32. Todos los modelos anteriormente referidos presentan placas seniles y en ciertos casos anomalías citoesqueléticas como neuritas distróficas. Sin embargo, su punto más débil es que no presentan ovillos neurofibrilares33 y aunque se ha demostrado deterioro en los test de comportamiento no se presenta un deterioro cognitivo franco. Respecto a los knock-out, la falta del gen de la APP, producida por un contruct que presenta una delección del promotor y el primer exón, muestra gliosis reactiva y alteraciones musculares, pero no alteraciones neuronales. La ausencia de alteraciones neuronales se explica por la suplencia de su función por proteínas análogas, lo que ha confirmado el hecho de que el ratón knock-out doble (APP y APPL-2) no es viable. El ratón knock-out homocigoto de presenilina fallece en los primeros minutos de vida presentando múltiples malformaciones esqueléticas y del sistema nervioso, por lo que se cree que la presenilina tiene una función en la diferenciación embrionaria semejante a los genes de la familia Notch34. Además, se han generado ratones transgénicos y knock-out para diferentes isoformas humanas de la apolipoproteína E37. En los últimos años se han llevado a cabo estudios con transgénicos para múltiples genes a través de cruces entre ellos. Los transgénicos dobles para

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presenilinas y APP desarrolla más placas que los modelos simples38,39. Por el contrario en transgénico de APP y knock-out de apolipoproteína E el número de placas es menor que en el modelo simple40. TRANSGÉNICO DE TAU Se han fabricado ratones transgénicos de tau, que sobreexpresan la isoforma, más pequeña de esta proteína41. Estos ratones y otros con la mutación P301L en isoformas mayores de tau42, presentan acúmulos argirófilos e inclusiones filamentosas tau positivas edad dependientes, en cortex y tronco, y especialmente en médula espinal, con hiperfosforilzación y reducción progresiva de la tau. Las raíces ventrales de segmentos espinales afectados mostraron degeneración axonal, y los restantes axones mostraron reducción de los microtúbulos y alteraciones en el transporte axonal. Como consecuencia de todo ello, los ratones mostraron debilidad muscular progresiva43,44,45,46. Esta es la primera vez que se ha producido patología de la tau en ratones. Además, la importancia de estos transgénicos estriba en que su cruce con transgénicos de APP permite aumentar la aparición de lesiones y detectar las dos patologías asociadas, como ocurre en la enfermedad humana47.

α-synucleína humana en su forma salvaje o con las mutaciones A53T y A30P. En el primer caso, la mosca ha desarrollado, al envejecer, en tan solo 7 días, lesiones de las neuronas dopaminérgicas con inclusiones similares a los cuerpos de Lewy y manifestaciones de daño neurológico con alteraciones en la respuesta de alerta. Estas alteraciones también se presentan si se transfecta la α-synucleína A53T y A30P. En este último caso las alteraciones eran más precoces y severas, lo que apunta a una mayor agresividad de esta mutación. Además del modelo en moscas, también existe un modelo transgénico murino de enfermedad de Parkinson, que expresa α-synucleína salvaje utilizándo como control el promotor del gen del factor de crecimiento plaquetario, que se expresa en todas las neuronas. Este ratón acumula inclusiones de α-synucleína51, aunque estas inclusiones no solo se encuentran en el citoplasma sino también en el núcleo. Este ratón presenta déficit dopaminérgico y alteraciones motoras compatibles con este déficit52. También existen ratones knock-out de synucleína, lo que permite conocer la función de esta. Estos ratones van a presentar déficits funcionales en el sistema nigrostriatal, lo que apunta a un papel de esta proteína en la función dopaminérgica. TRANSGÉNICO DE PROTEÍNA PRIÓNICA

TRANSGÉNICO DE SYNUCLEÍNA La técnica de introducir genes en genomas extraños, no solo se ha empleado para producir ratones u otros mamíferos transgénicos sino que puede extenderse a invertebrados, en los que el ciclo vital es más corto, permitiéndose detectar las lesiones secundarias a envejecimiento en menos tiempo, y además la capacidad reproductora es mayor, lo que permite aumentar el número de muestras para estudio. Por ello, se han introducido genes extraños en moscas, gusanos o incluso en levaduras y posteriormente se ha examinado el efecto de estos genes48,49,50. En el caso de la enfermedad de Parkinson uno de los modelos animales es el de la mosca Drosophila melanogaster, en la que se ha introducido el gen de la

Hsiao et al. han creado un ratón transgénico que sobreexpresa una proteína priónica mutada correspondiente a la P102L en el humano, causante de la enfermedad de Gertsmann-Straussler53. Este ratón desarrolla encefalopatía espongiforme entre los 50 y 410 días de vida, mientras que los controles que sobreexpresan la proteína priónica salvaje tardan más de 600 días. Si se inocula a otros ratones o hamsters homogenizados de cerebro de estos transgénicos, también desarrollan la encefalopatía, pero no si se inoculan con la proteína salvaje. Por el contrario, el ratón knock-out homocigoto no desarrolla enfermedad priónica tras inoculación, efecto que es dosis dependiente por cuanto los ratones heterocigotos muestran menor susceptibilidad que el salvaje54.

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Tabla 3.2. Nombre

Ratones transgénicos y knock-out de genes causantes de demencias. Transgen/promotor y regulador

Alteraciones de conducta

Alteraciones anatómicas

Ref.

V717F

APP695 cDNA V717F humano/PDGF-β humano

Alteración en test de memoria y aprendizaje

Depósitos de Aβ, placas neuríticas, pérdida sinapsis, astrocitosis y microgliosis

10

Tg2567

AP695 cDNA KM670/671NL humano/gen proteína prionica hamster

Alteraciones de memoria y visuoespaciales

Numerosas placas Aβ, daño oxidativo y de lípidos

11

APP23

APP751 cDNA humano KM670/671NL/promotor gen Thy-1 ratón

Alteraciones de aprendizaje edad dependiente examinadas mediante laberinto de agua y paradigma de evitación pasiva

Placas congofilas, angiopatía amiloide, respuesta glial masiva

12

APP695 V717I

APP695 cDNA con V717I humano/gen thy-1 ratón, con delección del elemento regulatorio específico del timo en intrón 3, promotor específico de la neurona

Descenso de exploración, aumento de neofobicidad, agresividad en los machos

Placas amiloide y angiopatía cerebrovascular: inicio 10-12 meses, distorsión de fibras colinérgicas

13

APP flamenca holandesa

APP770 cDNA con A682G humano APP770 cDNA con E693Q humano/gen thy-1 ratón

Aumento de agresividad, crisis epilépticas y muerte prematura

Descenso fragmentos producidos por α-secretasa APP y aumento de los β-secretasa. Niveles Aβ bajos sin formación de amiloide

14

APP/RK

APP cDNA con K687E, R684D/ratón thy-1 gen promotor

Reacción neofóbica, muerte prematura

Sin cambios en densidad o distribución del receptor NMDA. No alteraciones típicas de Alzheimer

13

APP-C100

APP695 cDNA carboxy terminal humano 100 aa./distrofina neural

Alteraciones en aprendizaje edad dependiente. Trastornos espaciales

Degeneración neuronal y sináptica neuronal, acumulaciones de lisosomas atípicos en el citoplasma e incremento de la concentración de neurofilamentos en axones amielínicos

15

PS1 M146L

PS1 humano cDNA (VRSQ-) con M146L/PDGF β-chain (fragmento1.4 kb Xba) rata

No alteraciones

No anomalías

16

PS1 M146V

PS1 cDNA (VRSQ-) humano con M146V/ PDGF β-chain (fragmento 1.4 kb Xba)

No alteraciones

No anomalías

16

PS1 Δexon9

cDNA (VRSQ-) PS1 humana con deleccion del exon 9/PDGF β-chain (1.4 kb Xba fragmento)

No alteraciones

PS1 A246E

cDNA PS1 humana con A246E/gen thy-1 ratón

17

No anomalías

16,17

18

(Continúa)

46 Tabla 3.2. Nombre

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Ratones transgénicos y knock-out de genes causantes de demencias (Continuación). Transgen/promotor y regulador

PS1 P264L

Gene targeting con Cre-lox, introduciendo P264L en el gen endógeno PS-1 de ratón

PS2 N141I

PS2 cDNA humano con N141I/promotor gallina β-actin

Tau P301L

Tau humana isoforma con 4 repeticiones conteniendo exón 10 y sin exones 2 y 3, con P301L/prión (MoPrP) ratón

Tau P301L

Alteraciones de conducta

Alteraciones anatómicas

Ref. 19

Incremento edad dependiente en Aβ42, con niveles más altos de Aβ insoluble

20

Alteraciones motoras y conductuales precoces y severas

Gliosis fibrilar en astas anteriores, degeneración, lesiones neuronales similiares a FTDP-17

21

Tau humana isoforma con 4 repeticiones, exons 2 y 3 con P301L/ratón Thy1.2 neuronaespecifica

Signos de degeneración walleriana, atrofia neurógena muscular, debilidad muscular

Cuerpos intraneuronales tau positivos, axones engrosados con neurofilamentos y esferoides tau +

22

Tau 3repeticiones

Tau humana isoforma con 3 repeticiones, wildtype/Prion Proteína Murina, MoPrP.Xho

Debilidad motora progresiva. Incapacidad para permacer de pie en una superficie inclinada

Acumulación de tau insoluble, astrocitosis y degeneración axonal

23

Tau 4repeticiones

Tau humana isoforma con 4 repeticiones, wildtype/ratón thy-1 cassette

Alteraciones motoras. Incapacidad para separar las patas traseras al ser izados por la cola

Degeneracion axonal en cerebro y médula espinal, astrogliosis y ubiquitinadas en acúmulos proteicos en axones dilatados

24

APP Knockout

gen APP ratón inactivado por delección de una secuencia de 3.8kb que codifica el promotor y el exón 1

No alteraciones

No anomalías

25

PS1 null

PS1 ratón cDNA, fragmento correspondiente a exones 1 a 3

Homocigotos fallecen a poco tiempo del parto. Heterocigotos normales

Alteraciones esqueléticas, malformaciones en neurogénesis, pérdida neuronal, hemorragias SNC

25

PS2 null

El exón 5 se reemplaza por un cassette bajo control del promotor PGK

No anomalías, sólo leve fibrosis pulmonar y hemorragias con la edad

26

ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA Los modelos transgénicos de esclerosis lateral amiotrófica son múltiples. El modelo más antiguo se obtuvo por la expresión de superóxido dismutasa (SOD) 1 con la mutación G93A, desarrollando alteraciones clínicas y patológicas semejantes

a la enfermedad humana55,56. Posteriormente, se han encontrado hallazgos similares en transgénicos con las mutaciones SOD1 G37R y G86R57. El ratón knock-out se desarrolla normalmente pero presenta aumento de pérdida de motoneurona en casos de daño del nervio, por lo que parece que la SOD juega un papel frente al stress.

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EXPANSIÓN DE POLIGLUTAMINAS Aunque el mecanismo por el cual las expansiones de CAG producen enfermedades no se conoce en la actualidad, los modelos transgénicos de estas expansiones nos han provisto de importantes informaciones58. En el caso de la enfermedad de Huntington, Mangiarini et al., han construido un transgénico usando un construct de 1,9 kilobases que incluye el promotor, exón 1 con 130 repeticiones de CAG y los 262 pares de bases del intrón 1 del gen de la huntingtina59. Este transgénico presenta deterioro neurológico progresivo con movimientos coreiformes, temblor y crisis epilépticas. Dado que este transgénico expresa solo una pequeña porción del gen, se cree que la expansión de un fragmento truncado carboxiterminal de la huntingtina con una expansión es suficiente para causar la enfermedad. Respecto a los knock-out, tres grupos independientes han encontrado que el homocigoto presenta retraso en el desarrollo y usualmente fallece en el octavo día. El heterocigoto presenta déficits cognitivos y aumento de la actividad motora. En ambos casos no se presentan las alteraciones motoras ni la anatomía patológica característica de la enfermedad, lo que indica que el trastorno se debe a una ganancia de función. Respecto a las heredoataxias dominantes, en la SCA1 existe un modelo transgénico mediante sobreexpresión del gen ataxina1 con 82 repeticiones, incluyendo la región reguladora del gen Pcp2. El ratón desarrolla ataxia y degeneración de las células de Purkinje, lo que indica que la expansión CAG es suficiente para originar ataxia. Los knock-out para la ataxina1 no desarrollan clínica alguna. Los modelos transgénicos han permitido conocer al menos en parte el papel de las inclusiones intranucleares en la patogenia de las enfermedades por expansiones60. Para ello, se ha generado un construct con el gen de la ataxina1 con 82 repeticiones y una mutación en la señal de localización nuclear (región del DNA que señala dónde se localiza la proteína), demostrándose que si las inclusiones no se localizan en el núcleo no va a aparecer la enfermedad. En un modelo que expresa ataxina1, con una delección en el segmento de agregación responsable de la

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aparición de inclusiones, no se presentan inclusiones pero si ataxia, lo que indica que las inclusiones no son necesarias para la aparición de la enfermedad. Un experimento similar conducido con el gen de la huntingtina, ha demostrado que la supresión de las inclusiones nucleares aumenta la muerte celular, lo que sugiere que la formación de inclusiones protege de las alteraciones que produce la mutación.

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C APÍTULO

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Terapia génica A. Jiménez Escrig

Desde que se reconoció al DNA como el soporte de la información genética a principios de los años cincuenta, se empezó a considerar que a través de su modificación podía existir un nuevo modo de intervención frente a la enfermedad. Después de 50 años, ya se dispone de la información y conocimientos necesarios para ello, y en este momento estamos al final de los primeros ensayos clínicos. El objetivo de la terapia génica es administrar a un grupo celular un gen funcional que genere la producción de una proteína que hasta el momento no se producía o era defectuosa. Aunque la terapia génica está aún en su infancia, ofrece sobre las terapias tradicionales el potencial de poder corregir de forma permanente las alteraciones genéticas y, por tanto, evitar el uso de tratamientos repetidos. Contra lo que a primera vista puede parecer, la terapia génica no solo es aplicable al tratamiento de enfermedades producidas por mutaciones en un gen, o mendelianas, sino también para el tratamiento de enfermedades adquiridas, como el cáncer o las derivadas de la arteriosclerosis, que tienen un impacto mucho mayor en la salud pública1-3. Los objetivos de la terapia génica son1: 1. El desarrollo de vectores apropiados para infectar células específicas.

2. El éxito de estos vectores para conseguir transferencia segura y eficiente en un alto porcentaje de células diana, insertándose en regiones apropiadas del genoma o persistiendo como episomas estables. 3. La regulación apropiada de estos nuevos genes mediante la administración de agentes o por señales propias del organismo. 4. El desarrollo de tecnología que cumpla los requisitos de coste efectividad. Los ensayos iniciales con terapia génica llevados a cabo se iniciaron en 1989, con el tratamiento de la deficiencia en adenosin deaminasa (ADA), un trastorno genético infrecuente que origina la destrucción prematura de los linfocitos T, produciendo una severa inmunodeficiencia combinada. Las estrategias para el tratamiento de este trastorno han sido la transferencia de la ADA a los linfocitos, o más tarde a la médula ósea de los enfermos4. En ambos casos la manipulación genética fue ex vivo, con células extraídas del paciente y luego nuevamente infundidas. Los resultados de este tratamiento han demostrado que es seguro y positivo. Se consiguió la transferencia genética, el gen no fue tóxico y fue funcionante. Aunque los resultados a largo plazo todavía no se conocen, lo conseguido hasta el momento ha servido para establecer el potencial 51

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

de esta terapia génica como una estrategia terapéutica. Una estrategia similar se ha utilizado para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar, una alteración secundaria a mutaciones en el receptor de las LDL. Para ello, se extraen hepatocitos del sujeto, transfectándose con un retrovirus portador del gen del receptor de las LDL y se infunden a través de la vena porta, reimplantándose en el hígado5. Los resultados han demostrado que el procedimiento es viable y seguro, pero la duración de la expresión génica fue demasiado breve, no existiendo un beneficio terapéutico real, lo que ha llevado a realizar nuevos intentos terapéuticos de terapia génica in vivo. Estos resultados iniciales han favorecido la corriente actual, favorable a la manipulación in vivo. Esta presenta, entre otras ventajas, que no precisa de las infraestructuras y técnicas necesarias para la extracción, manipulación y retorno de las células del paciente, siendo casi tan sencilla de administrar como cualquier fármaco. Un ejemplo de esta terapia es la manipulación del gen del canal del cloro responsable de la fibrosis quística. Utilizándose diferentes vectores, virales o novirales, se ha introducido el gen en el individuo in vivo. Uno de los problemas que aparece en esta enfermedad es que, a diferencia de las dos señaladas anteriormente, no se conoce cuál es el grupo celular diana de la terapia génica, dentro de las diferentes células de la vía aérea, para que esta sea lo más efectiva posible6-7. En el estado actual de la terapia génica no se ha conseguido todavía algo muy deseable, como es el control fisiológico de la expresión génica. En ausencia de este control, la estrategia actual es intentar una sobreexpresión del gen en cuestión. Como se ha visto anteriormente, en muchas enfermedades no es necesario suministrar el gen a todas las células del organismo. Incluso no es necesario muchas veces colocarlo en las células en las que se expresa. Un ejemplo de esto último es el tratamiento de la hemofilia mediante transferencia del gen del factor VIII a las células de la piel y el músculo8-9. Tampoco el tratamiento tiene que tener por objeto la restitución completa del déficit. En el ejemplo anterior, una recuperación de los niveles del factor X de un 10% es suficiente para que no haya alteraciones clínicas9.

Las células diana de la terapia génica pueden ser células somáticas, en cuyo caso la corrección solo repercute en el individuo; o células somáticas y germinales, en cuyo caso la terapia repercutirá en sus descendientes. La terapia puede estar destinada a curar a individuos enfermos o a evitar la enfermedad en individuos con mutaciones, pero aún en fase presintomática, incluso en útero10. VECTORES PARA TERAPIA GÉNICA La elección del vector para la introducción del gen depende de varios factores como11: • El tamaño de la unidad de transcripción (gen, promotor y regulador). • La célula diana. • La eficiencia de la transferencia. • La inmunogenicidad intrínseca al vector. • El potencial de carcinogénesis. • La capacidad de obtener niveles útiles del producto del gen. El material genético puede ser introducido en las células por dos tipos de vectores, virales y no virales12-14. Los vectores no virales son compuestos capaces de facilitar la entrada en la célula, como cationes lipídicos o partículas de oro. Mediante ellos se ha conseguido introducir DNA en células musculares, neuronas o glia. Sin embargo, debido a su mayor facilidad de manipulación, acceso y eficiencia, se prefiere hoy en día el uso de vectores virales. Estos son fundamentalmente adenovirus, virus asociados a adenovirus, herpes virus y retrovirus.

Adenovirus

Son DNA virus que originan infecciones respiratorias leves en mamíferos. Mediante técnicas recombinantes pueden obtenerse adenovirus que funcionen como vectores capaces de infectar a neuronas o glia. Su ventaja principal es que se pueden obtener títulos altos de DNA viral, del orden de 1012 PFU/ml. Su mayor limitación es que solo permiten genes de pequeño tamaño (7-8 kb)

TERAPIA GÉNICA

y que son altamente inmunogénicos. Esto último se ha conseguido disminuir mediante manipulación genética que reduzca la expresión de determinadas proteínas que originan la respuesta inmune, pero aún así, la respuesta producida reduce la expresión tisular y daña los tejidos. Se ha desarrollado una tercera generación de adenovirus que no contiene más DNA viral que la secuencia a introducir y el material para la replicación de esta. Estos vectores precisan de otro virus complementario, o helper virus, que provee las proteínas necesarias para empaquetar la secuencia. Estos vectores permiten insertar secuencias de hasta 37 kb y permiten una expresión prolongada (hasta 10 meses)15-19. Virus asociados a adenovirus (AAV) A diferencia de los adenovirus, los AAV no son patogénicos en humanos. El vector AAV contiene una unidad transcripcional con el promotor y transgenes y el DNA necesario para la replicación y empaquetamiento. Recientemente se han conseguido AAV que no precisan de helper virus para replicarse. Los AAV presentan una curiosa propiedad, como es la de que se integran en el cromosoma 19, lo que hace que puedan originar expresión estable de un transgén. Su principal inconveniente es la limitada longitud del material genético que pueden contener20-22. Herpes virus El herpes virus simple tipo 1 es un virus neurotrópico capaz de permanecer latente en las neuronas infectadas. Por ello, se han fabricado dos tipos de HSV-1. El primero contiene un genoma que no permite replicarse al deleccionarse algún gen imprescindible como el ICP4. Su principal ventaja, su neurotropismo, y que permite la transfección de genes de gran tamaño (hasta 150 kb), consiguiendo además títulos altos. Sin embargo, la citotoxicidad y la antigenicidad son cortapisas importantes para su uso, siendo preciso la eliminación de ciertos genes del genoma viral y su uso combinado con ciclosporina para evitar estas23-24.

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El segundo tipo de vectores HSV-1 son los amplicones HSV, un vector que contiene solo dos elementos virales no codificantes: el origen de replicación del DNA del HSV (oriS) y la secuencia de corte y empaquetado (secuencia «a»), lo que disminuye la toxicidad e inmunogenicidad 25-26. Retrovirus Los vectores retrovirales son retrovirus con delecciones en los genes necesarios para la replicación que se han reemplazado por los genes terapéuticos. Debido a la capacidad de los retrovirus de integrarse en el genoma, es posible una expresión a largo plazo, pero esto también puede ser una desventaja por la aparición de transformación celular y neoplasias. Como los retrovirus infectan células en división son buenos candidatos para terapia génica de los tumores pero no para células postmitóticas como las neuronas. Una excepción a esto son los virus lentivirales (como el HIV), capaces de penetrar en el núcleo de células mitóticamente inactivas y terminalmente diferenciadas como las neuronas, pero no se los conoce aún lo suficiente para ser empleados en terapia génica26-29. Los retrovirus se han empleado en ocasiones en una terapia en dos tiempos. En un primer tiempo, se transfectan con retrovirus células, para modificarlas, con el fin de que expresen genes terapéuticos; y en un segundo tiempo se implantan estas células modificadas en los tejidos donde producirán y secretarán estos factores, o bien desarrollarán conexiones apropiadas para liberar neurotransmisores. VÍA DE ADMINISTRACIÓN DEL VECTOR La entrada del vector puede realizarse de dos modos: mediante inyección estereotáxica en el tejido correspondiente, o bien mediante el uso de vectores con especificidad por este tejido. Esta especificidad puede ser: bien por el modo de entrada, bien porque el promotor sea a elementos de ese tejido. Esta es la llamada entrada in vivo o transferencia genética directa, llamándose in vitro a la implantación de células previamente transfectadas.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

TERAPIA GÉNICA EN ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS Los tratamientos actualmente en curso de las enfermedades neurodegenerativas se basan en la restauración de la función mediante el uso de fármacos que restituyen las anomalías bioquímicas existentes pero son incapaces de prevenir el progresivo deterioro de las neuronas implicadas. Mediante la terapia génica puede conseguirse, no solo lo anterior sino también la reparación de las células dañadas o la prevención del daño de las aún útiles. Esto último incluye una capacidad 1) neuroprotectiva, 2) neuroregenerativa, 3) neurotrófica, y 4) antiapoptótica. Enfermedad de Alzheimer Dada la existencia de un déficit colinérgico en la enfermedad de Alzheimer una de los posibles planteamientos terapéuticos es revertir este déficit mediante el aumento de la función colinérgica, incrementando la enzima colina acetiltransferasa en las áreas afectadas. El NGF promueve la supervivencia de las neuronas colinérgicas y estimula la producción de esta enzima, por lo que los injertos de fibroblastos modificados para producir NGF se ha visto que restauran y mejoran la supervivencia del eje septohipocampal, siendo esta una terapia potencial de este trastorno mediante terapia génica. Este tratamiento, actualmente en fase I de ensayo clínico, consiste en la obtención de fibroblastos de tejido subcutáneo y su transfección mediante un adenovirus en cuyo genoma se ha insertado el cDNA del NGF, lo que permite insertar este gen en el genoma de los fibroblastos. Estos fibroblastos se cultivan, incrementándose su número y posteriormente se introducen mediante cirugía esterotáxica en diversos puntos del cerebro basal30. Enfermedad de Parkinson Aunque aún en fase de experimentación, la terapia génica en la enfermedad de Parkinson se encuentra más desarrollada que en la enfermedad

de Alzheimer. Los tres modos de conseguir esta terapia son: el aumento de dopamina en el estriado, la neuroregeneración y la neuroprotección. Numerosos estudios han demostrado que es posible mejorar la producción de dopamina mediante el incremento de las enzimas implicados en la síntesis de esta. Además, se ha visto que en implantes en ratas con lesiones en sustancia negra, de células modificadas genéticamente para producir dopamina, estas son capaces de formar sinapsis y reducir los déficits motores. Estas células se comportan como las células obtenidas de la sustancia negra fetal, pero tienen la ventaja de evitar problemas éticos en su obtención y ser una fuente ilimitada31. En cuanto a la neuroprotección, múltiples factores de crecimiento, como el BDNF, CNTF, GDNF y el NTN promueven la viabilidad de las células dopaminérgicas presentando un potencial terapéutico32. Otra alternativa es el uso de genes capaces de estimular la retirada de radicales libres o evitar su formación, como la superóxido dismutasa, la glutation reductasa o la glutation peroxidasa. Finalmente, en este grupo de candidatos hay que incluir la proteína antiapoptótica bcl-233. Enfermedad de Huntington Yamamoto et al. han demostrado que la expresión continuada de la huntingtina mutada es necesaria para mantener las inclusiones intracelulares y los síntomas34. Por ello, una terapia diseñada para descender los niveles de proteína mutada mediante terapia antisense puede ser útil en esta enfermedad, como por ejemplo administrar en el estriado un antisense RNA a la huntingtina, pero este tipo de tratamiento tiene el inconveniente de que necesitaría ser administrado de forma permanente. Una reversión definitiva de la enfermedad puede conseguirse mediante el uso de quimeroplastos, oligonucleótidos de RNA/ DNA con dianas específicas, pero esta técnica no permite corregir una mutación larga como es este caso. Por ello, es necesario acudir al uso de factores neurotróficos como GDNF, BDNF o CNTF o a mecanismos antioxidativos o antiapoptóticos35-37.

TERAPIA GÉNICA

Enfermedad de motoneurona Potenciales terapéuticas genéticas de las enfermedades de motoneurona implican el uso de factores neurotróficos, evitar mecanismos oxidativos y la antiapoptosis. En ratones transgénicos se han implantado intramuscularmente injertos de mioblastos genéticamente modificados para secretar GDNF, observándose una reducción en la velocidad de progresión de la enfermedad38. No existen todavía ensayos en humanos de este tipo, salvo uno en el que se implantaron en el espacio intratecal células microencapsuladas, genéticamente modificadas para secretar CNTF, pero los resultados han sido negativos39-43. TERAPIA GÉNICA DE LOS TUMORES Los ejemplos de terapia génica descritos en las líneas anteriores tenían por objeto restaurar el gen defectuoso, con recuperación de la función. En el caso de los tumores, la terapia génica puede ser utilizada para conseguir la muerte de la célula neoplásica. La importancia de este resultado se ilustra porque actualmente tres cuartas partes de los ensayos sobre terapia génica son sobre tratamiento del cáncer. La razón de esto es obviamente la gran prevalencia de esta enfermedad sobre las enfermedades genéticas, mucho más raras. Además, los resultados sobre terapia génica del cáncer son aplicables a tumores diferentes de los que se ensayen inicialmente. A lo anterior se añade que algunos efectos secundarios de la terapia génica, como la aparición de inflamación, que son dañinos en la terapia de anomalías metabólicas, en el caso del cáncer se consideran beneficiosos por ayudar a la erradicación del tumor. Por último, uno de los problemas de la terapia génica en el estado actual de la ciencia es que sus efectos son transitorios, lo que la hace poco útil para los trastornos metabólicos, pero esto no es un inconveniente en el tratamiento del cáncer, por cuanto al erradicarse el tumor deja de ser necesaria. Existen diferentes estrategias para la terapia génica de los tumores. Se puede introducir un gen, como el p53, que regula el ciclo de división celular y es el asiento más frecuente de mutacio-

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nes de las células tumorales, con lo que se cesa el crecimiento tumoral. La proteína p53 controla la progresión de la fase G1 a la fase S (fase de replicación del DNA) del ciclo celular. El gen p53 se encuentra alterado en el 50% de los astrocitomas, siendo una de las alteraciones genéticas más precoces de los tumores. La proteína viral E1B-55K tiene la propiedad de inactivar p53 para activar la progresión del ciclo celular y evitar la apoptosis, preparando la célula infectada para la replicación del virus. Por ello, se ha usado un adenovirus mutante carente de E1B-55K para el tratamiento de los gliomas malignos. En células normales p53 está activo y detiene el ciclo celular o induce por apoptosis la muerte celular de las células infectadas, evitando la replicación viral. En cambio, en las células tumorales carentes de p53 el virus continua replicándose44. Los ensayos realizados hasta la fecha en gliomas han mostrado replicación intratumoral con necrosis del tumor, sin afectación de los tejidos adyacentes. Sin embargo, no se ha visto regresión completa del tumor en ningún caso, aunque este tratamiento combinado con quimioterapia aumenta de forma sensible la proporción de casos con regresión tumoral45. Otra estrategia antitumoral utiliza el uso de agentes antivirales como el acyclovir. Se trata del mismo mecanismo que hace que la terapia contra el herpes simple con acyclovir sea efectiva solo en las células infectadas. Así, las células sanas carecen de timidinkinasa, que es necesaria para que se active el acyclovir, que es una prodroga46. La estrategia de la timidinkinasa se ha utilizado no solo en el contexto antitumoral, sino también para evitar la reestenosis después de angioplastias coronarias. Durante el procedimiento se administra este gen a las células musculares locales y posteriormente la administración de ganciclovir evitará la proliferación muscular que lleva a la reestenosis47. TRATAMIENTOS ANTISENSE Cuando se conoce la secuencia de una determinada proteína, se puede diseñar un oligonucleótido que se una al correspondiente mRNA, inhibiendo la expresión de esa proteína48. Como la secuencia

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de DNA o mRNA que contiene la información de la secuencia de aminoácidos de la proteína se conoce como la hebra en sentido (sense strand), a la complementaria se le conoce como antisense o antisentido y a este tipo de tratamiento tratamientos antisense. Los tratamientos antisense pueden ser de dos tipos: mediante oligonucleótidos o mediante nucleótidos expresados. Los oligonucleótidos son fragmentos cortos, unos 18-30 pares de bases, que se fabrican mediante un sintetizador de DNA. Los nucleótidos expresados son aquellos que se fabrican mediante un vector de expresión viral como los descritos anteriormente. Este vector se administra al paciente y sus células fabrican el nucleótido antisense. Los dos puntos donde puede inhibirse la expresión de una proteína son a nivel de la transcripción del DNA a mRNA o en segundo lugar a nivel de la traducción. En el primer caso, el oligonucleótido se une al DNA de doble hélice, creando una triple hélice que previene que el código genético de este pueda leerse. En el segundo caso, la unión del oligonucleótido al mensajero evita la lectura de este en el ribosoma48. La terapia antisense parece especialmente útil para el tratamiento de enfermedades genéticas producidas por depósito de proteínas anómalas como las amiloidosis o en trastornos derivados de una ganancia de función como la esclerosis lateral amiotrófica. Sin embargo, en el momento actual es necesario para el desarrollo de esta terapia resolver problemas como son la dificultad de vehicular los oligonucleótidos al tejido diana, la destrucción de los oligonucleótidos por DNAsas de los tejidos, y su corta vida media en plasma. Una estrategia para evitar esto es remplazar el enlace fosfodiester por fosforotioato (compuesto de fósforo y azufre), que lo hace resistente a DNAsas, lo que aumenta la vida media o su administración unida a complejos DNA-proteínas o liposomas catiónicos. El DNA, tiene una estructura polar fácilmente soluble en agua, pero escasamente soluble en los lípidos de las membranas plasmáticas, y por lo tanto con difícil penetración en la célula. Para conseguir la incorporación a los tejidos de forma más específica, se han unido a ligandos de receptores de estos tejidos o a anticuerpos dirigidos contra células de un determinado tejido49.

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TERAPIA GÉNICA

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Programas informáticos de uso en genética A. Jiménez Escrig

La genética, como cualquier otra ciencia, utiliza la informática como herramienta con múltiples aplicaciones para su desarrollo. Aparte de los programas de uso general como procesadores de texto, bases de datos, hojas de cálculo, programas de gráficos o de estadística, navegadores y programas de correo electrónico, de los que no se va a tratar en este capítulo, existen diversos programas específicos para ser aplicados en genética que permiten realizar árboles genealógicos, estudiar secuencias de DNA, alinearlas, el diseño de primers, encontrar enzimas de restricción, realizar análisis de ligamiento, etc. Para conocer los programas más utilizados en genética e incluso descargarlos pueden visitarse las páginas web: • • • • • •

linkage.rockefeller.edu/soft/list1.html evalga.uv.es/scsie-docs/bioinformatica/tabla-sw2.html bir.biology.washington.edu/TechFee/proposal.html www.chembio.uoguelph.ca/josephy/software.htm www.cmbi.kun.nl/~kharen/Programs.htm www.biochem.ucl.ac.uk/~chen/mol_biol_sites.html

A continuación se muestran ejemplos de algunos de estos programas.

CYRILLIC Cyrillic es un programa que permite realizar árboles genealógicos, no mediante el dibujo sino mediante la introducción de los datos de los individuos de una familia. Los datos no solo se utilizan para el dibujo del árbol, sino que van a quedar almacenados en una base de datos, lo que nos permite luego localizar individuos, revisar sus datos clínicos o genéticos, etc. El programa también permite el dibujo de haplotipos, y en caso de detectar consanguinidad, lo dibuja de forma automática (doble línea). En el dibujo del árbol puede insertarse el número de la generación, nombre del individuo, fecha de nacimiento o fallecimiento, o texto libre. El gráfico puede exportarse a otros programas como Word o PowerPoint de Microsoft. La Figura 5.2 A muestra el árbol de una familia con polineuropatía amiloidea familiar. La Figura 5.2 B muestra el mismo árbol en dibujo circular. La Figura 5.3 muestra el árbol de una familia con parkinson familiar publicada por Mauri et al. (Neurología 5:45-47, 1990). Para hacer el análisis de ligamiento se recogieron los datos de 148 individuos, en 10 generaciones, mediante este programa. 59

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Figura 5.1. Página inicial del Cyrillic V2.00.

A

B

Figura 5.2. A) Árbol genealógico de una familia con polineuropatía amiloidea familiar (Muscle & Nerve, 1998; 21: 1478). B) La misma familia en árbol circular.

PROGRAMAS INFORMÁTICOS DE USO EN GENÉTICA

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Figura 5.3. Árbol genealógico de la familia con Parkinson familiar publicada por Mauri et al. (Neurología 1990; 5: 45-47). Ampliado hasta incluir individuos nacidos a partir de 1800.

Puede obtenerse una versión gratuita de prueba de Cyrillic en www.cyrillicsoftware.com. GENERUNNER Generunner es un programa de utilidades en genética molecular. Generunner nos va a permitir listar una secuencia de DNA, su complementario, encontrar una subsecuencia dentro de esa secuencia, ver las enzimas de restricción que cortan esa determinada secuencia, diseñar primers para PCR que amplifiquen un determinado segmento de esa secuencia, obtener la secuencia de lectura de una secuencia o alinear varias secuencias. Generunner puede obtenerse de forma gratuita en la dirección www.generunner.com. A continuación se ve un ejemplo de utilización de este programa, en el que se muestra el cDNA del gen CYP27 (xantomatosis cerebrotendinosa). En esta secuencia se ha buscado un fragmento de interés (GACTGTGCCT) que aparece señalada en diferente color y la secuencia de los aminoácidos del péptido (Figura 5.6). El programa también puede alinear secuencias diferentes para encontrar segmentos de identidad entre varias secuencias o una mutación en una secuencia. En el ejemplo siguiente (Figura 5.5)

el alineamiento de la secuencia del exón 6 del gen CYP27 en el individuo problema comparado con la secuencia de dos sujetos controles, muestra una mutación (T → G) causante de la enfermedad en este caso. A continuación, se busca cuáles son las enzimas de restricción que cortan en la región de interés, a fin de determinar si existe una enzima que permita examinar si la mutación origina la ganancia o pérdida de un locus de restricción para así estudiar la presencia de la mutación mediante PCR y análisis de restricción (Figura 5.7). El programa ha encontrado que la enzima de restricción AciI reconoce la secuencia CCGC (complementaria e inversa de la secuencia GGCG) que se pierde si aparece la mutación (GTGG). El programa muestra dónde corta la enzima y el número de cortes que existen en el fragmento. El programa no solo trabaja con secuencias de DNA sino también con péptidos. En este caso se pueden alinear, encontrar motivos, puntos de corte de peptidasas, puntos isoeléctricos, hidrofobicidad, composición, etc. Existen otros programas con funciones similares al Generunner como RSVC2000, DNATools o Genedoc. Estos programas pueden obtenerse generalmente a través de Internet (ver Capítu-

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Figura 5.4. Página inicial de Generunner.

Figura 5.5. Se han alineado tres secuencias correspondientes a pacientes con mutaciones del gen CYP27, exón 6, detectándose una mutación C → T en el 150-69a.

PROGRAMAS INFORMÁTICOS DE USO EN GENÉTICA

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Figura 5.6. Localización de la secuencia GACTGTGCCT en el gen CYP27. Parte inferior: secuencia de aminoácidos del CYP27.

Figura 5.7. Gen CYP27. Búsqueda mediante Generunner de las enzimas de restricción que reconocen secuencias dentro del fragmento GGAGTCTGCGCCTA. Esto permite seleccionar la enzima Aci I para examinar la presencia de la mutación R362C (CCGC → CAGC, perdiéndose el locus de restricción para esta enzima).

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Figura 5.8. Cromatograma de una secuencia de DNA, visualizada mediante el programa Chromas.

lo 6). STADEN es un paquete informático que realiza estas funciones y otras más complejas como encontrar las ORF de una secuencia, unión de contigs, búsqueda de mutaciones puntuales, alineamiento de secuencias, etc.

Para visualizar cromatogramas de secuencias de DNA pueden utilizarse pequeños programas como Abiview, o Chromas (www.technilysium. com.au/chromas.html) (Figura 5.8) que permiten examinar secuencias, editarlas, obtener las fran-

Figura 5.9. Dibujo de un plásmido lineal (izquierdo) y circular (derecho) con el programa Plasmid.

PROGRAMAS INFORMÁTICOS DE USO EN GENÉTICA

jas de lectura y exportarlas en formato texto, o FASTA. PLASMID es un programa sencillo que permite el dibujo de plámidos en forma lineal o circular, con los puntos de restricción definidos y los puntos de clonaje (Figura 5.9). Existen múltiples utilidades informáticas para análisis de ligamiento, de tipo paramétrico1 y no paramétrico. Dado el alto número de programas que puede utilizarse para este tipo de estudio, aconsejamos para conocer estos

1

Cuando se tiene en cuenta el modo de transmisión dominante o recesivo.

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programas visitar la pagina web del centro Rockefeller para análisis genético (http://linkage.rockefeller.edu/soft/list1.html), desde donde pueden descargarse un extenso número de aplicaciones para estudios de ligamiento. Finalmente, puede visitarse la página www.tigr.org, en donde se encuentran información y links para descargar de programas para búsqueda de genes en una secuencia como GENSCAN, VEIL, MORGAN, GENIE o FGENE.

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Recursos de genética en Internet A. Jiménez Escrig

Una de las realidades de la genética contemporánea es que su desarrollo no hubiera sido posible sin la existencia de Internet. A medida que el proyecto de conocer la secuencia del genoma humano fue tomando forma, se vislumbró la necesidad de conservar y difundir los datos mediante este medio. La enorme cantidad de datos que se iban a generar escapaba de la capacidad de almacenamiento de los sistemas clásicos. Se dice que las letras que componen el genoma humano puestas en un libro ocuparían el espacio de 300 guías telefónicas. Pero al problema de almacenamiento se añade la necesidad de disponer de un medio de búsqueda rápido y en constante actualización. En los primeros años, los CD-Rom podían hacer esto pero en seguida se vio que esta tecnología se desbordaba por el continuo fluir de nuevos datos. Pero, aún cuando lo anterior posiblemente sea lo más importante, Internet no solo ha servido en genética como medio de almacenamiento informático de la secuencia del genoma humano, sino que también se encuentran en ella otras bases de datos cuya utilización es de gran utilidad en genética molecular o a los clínicos, y es fuente de recursos de programas necesarios en la práctica diaria, desde programas para dibujo

de árbol genealógicos hasta programas para cálculos de análisis de ligamiento. Además de lo anterior, Internet sirve como medio de comunicación y discusión entre particulares interesados en determinados temas de la genética a través de los newsgroups y mailing list. A continuación se mostrarán cuales son los principales recursos utilizados en genética y sus aplicaciones. NEWSGROUPS Los newsgroups o grupos de noticias son una estructura a la que se pueden enviar, generalmente mediante e-mail, noticias o preguntas sobre un tema. Todos los que acceden al grupo de noticias van a ver estas noticias o preguntas, pudiendo hacer comentarios o respuestas que serán visualizadas y discutidas por el grupo. Los principales grupos de noticias sobre genética son mantenidos por la organización BIONET, que se listan a continuación: • bionet.diagnostics Discusión de problemas y técnicas en los campos del diagnóstico genético. 67

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• bionet.diagnostics.prenatal Discusión de problemas y técnicas en el diagnóstico prenatal. • bionet.genome.chromosomes Discusión sobre mapeo y secuencia de cromosomas. • bionet.molbio.gene-linkage Análisis de ligamiento. • bionet.molbio.methds-reagnts Reactivos y métodos de biología molecular. • bionet.software Software de ciencias biológicas.

PRINCIPALES BASES DE DATOS DE SECUENCIAS

MAILING LISTS

• DDBJ (DNA Databank de Japón) (www.ddbj.nig.ac.jp/)

Las mailing list o listas de correo son un mecanismo de contacto con colegas con intereses similares, que a diferencia de los newsgroup que se visualizan mediante conexión, la información se recibe por correo electrónico. Algunas de estas mailing list, su dirección para suscribirse, y el temario de estas son: • CCR-Announce-Request. ([email protected]) Información sobre mapeo, cultivos celulares, colecciones de DNA y otros tópicos similares. • FAMCAN-L. ([email protected]) Identificación, cuidados y manejo de pacientes y familiares con síndromes de predisposición a neoplasias. • HUM-MOLGEN.([email protected]) Sobre genética molecular humana. • Mx-DIAG-L. ([email protected]) Lista sobre aplicaciones de diagnóstico molecular en patología. • MGI-LIST, ([email protected]) De los laboratorios Jackson (ratones transgénicos, mutantes,..). • Rodent-research. ([email protected]) Anuncios, preguntas y discusión sobre materias relacionadas con el uso de roedores en la investigación biomédica.

Las tres bases de datos públicas principales que existen en la actualidad son: • EMBL (European Molecular Biology Laboratory, Cambridge, UK) (www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db/ebi/topem bl.html) • GenBank (NCBI, división de la NLM en el NIH, USA) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.h tm) (Figura 6.2)

Estas tres bases de datos colaboran entre ellas desde 1982. Cada una recoge y procesa nuevos datos sobre secuencias e información biológica relevante de investigadores de su región y se actualizan automáticamente cada 24 horas con los datos de las otras regiones. Por ello, contienen la misma información. En 1998 en la EMBL existían más de 1.200 millones de pares de bases y se estimaba que esta información se duplicaría en un año, por lo que la base de datos se dividió en 17 divisiones (humanos, virus, hongos, bacteriófagos, etc...). Otras bases de datos útiles son: • GSDB (www.ncgr.org/gsdb/gsdb.html) Colección de todas las secuencias del National Center for Genome Resources. • MITOMAP (infinity.gen.emory.edu/mitomap.html) Base de datos de genoma mitocondrial. • PIR (www.gdb.org/Dan/proteins/pir.html) Protein sequence database. • SWISS-PROT (expasy.hcuge.ch/sprot/sprot-top.html) Base de datos de proteínas derivada de translación de secuencias de DNA en la EMBL Nucleotide Sequence Database.

RECURSOS DE GENÉTICA EN INTERNET

BUSCADORES DE BASES DE DATOS Para rastrear una secuencia en las anteriores bases de datos utilizaremos las siguientes utilidades de búsqueda: • BLAST (www.nhi.org/blast) Buscador de una secuencia en bases de datos de genomas humano, de ratón, drosophila,ect. (ver ejemplo en las Figuras 6.11 y 6.12). • BCM Search Launcher (gc.bcm.tmc.edu:8088/searchlauncher/launcher.html) Mediante un único punto de entrada permite buscar una secuencia en múltiples bases de datos. Incluye un sistema de alineamiento de múltiples secuencias. • DBGET (www.genome.ad.jp/dbget/dbget.html) Sistema de búsqueda en múltiples bases de datos. • ExPASy (expasy.hcuge.ch/) Sistema de búsqueda en múltiples bases de datos, incluyendo SWISS-PROT y PROSITE, así como otras bases de datos cruzadas como DDBJ/EMBL/GenBank, OMIM, Medline. • GENOBASE (specter.dcrt.nih.gov:8004/) Sistema de búsqueda en múltiples bases de datos, incluyendo EMBL and SWISS PROT. • IGD (genome.dkfz-heidelberg.de/igd) (Integrated Genomic Database). Interconexión entre bases de datos de biología molecular y herramientas de análisis. • OWL (www.gdb.org/Dan/proteins/owl.html) Base de datos de proteínas no redundante, que une varias bases de datos. • SRS (Sequence Retrieval System) (www.ebi.ac.uk/srs/srsc/) Busca en bases de datos de biología molecular desde secuencias, estructuras, factores de transcripción y literatura. • WWW Entrez www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez) Permite buscar proteínas, ácidos nucleicos, Medline, estructuras-3D, genomas completos y bases de datos de mapas.

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BASES DE DATOS DE GENES, MARCADORES Y ENFERMEDADES Además de las bases de datos sobre secuencias de DNA o de proteínas, existen otras que pueden sernos útiles a la hora de buscar determinados datos como cuáles son las mutaciones descritas en una enfermedad o información sobre enfermedades genéticos. Estas bases de datos, su dirección y contenido son: • GeneCards (bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/) Base de datos de genes humanos, sus productos, funciones y su implicación en las enfermedades. • HGMP (www.hgmp.mrc.ac.uk) Links a bases de datos de enfermedades. • HGMD (www.uwcm.ac.uk/wcm/hgmd0.html) Base de datos sobre mutaciones de genes causantes de enfermedades. (ver ejemplo en las Figuras 6.3 a 6.5) • Encyclopedia of the Mouse Genome (www.informatics.jax.org/encyclo.html) Mapa genético de cada cromosoma de ratón. • GDB (Genome Database) (gdbwww.gdb.org/) Información sobre mapeo del genoma humano (marcadores, frecuencia en poblaciones, condiciones de PCR, etc.). • MGD (Mouse Genome Database) (www.informatics.jax.org/mgd.html) Base de datos sobre genoma del ratón. • OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) (www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/) Catálogo de genes humanos y de enfermedades genéticas (ver ejemplo en la Figura 6.1). • TBASE (www.gdb.org/bio/search-sf2/TBASE/tbase) Base de datos sobre animales transgénicos y knock-out. • Tumor Gene Database (www.biomedcomp.com/4d.acgi$cGetPage?tg db) Base de datos de genes asociados con tumorigenesis y transformación celular.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

OTRAS BASES DE DATOS Otras bases de datos de secuencias especializadas son:

• Baylor College of Medicine Human Genome Centre (gc.bcm.tmc.edu:8088/) Permite la búsqueda de datos de Baylor YACs y contigs y de otros datos sobre el genoma de otros centros.

• EPD (Eukaryotic Promoter Database) (gopher://gopher.gdb.org/77/.INDEX/epd) Informacion sobre promotores de eukariotas contenida en la EMBL Nucleotide Sequence Database.

• CHLC (Cooperative Human Linkage Centre) (www.chlc.org/) Información sobre mapas de marcadores CHLC y mapas integrados que combinan datos sobre mapeo de otros grupos.

• Molecular Biology Vector Sequence Database (biology.queensu.ca/~miseners/vector.html) Compilación de secuencias de vectores.

• ELSI (Ethical, Legal and Social Implications) (www.ncgr.org/elsi/scopenotes.hp.html) Información sobre los efectos del progreso de la biotecnología, especialmente el proyecto Genoma Humano en la sociedad y el individuo.

• ProDom (protein.toulouse.inra.fr/prodom.html) Compilación de dominios homólogos presentes en la base de datos SWISS-PROT. • PROSITE (expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html) Diccionario y base de datos de localizaciones de proteínas y patrones relacionadas con la SWISS-PROT. • REBASE (Restriction Enzyme Data Base) (www.neb.com/rebase/rebase.html) Información sobre enzimas de restricción, organismo de obtención, temperatura de uso, secuencia de reconocimiento y disponibilidad (ver ejemplo en la Figura 6.10). • TFD (Transcription Factor Database) (dapsas.weizmann.ac.il/bcd/bcd_parent/datab anks/tfd.html) Base de datos sobre elementos de reconocimiento de factores de transcripción. • Pythia ([email protected]) Servidor que permite la detección y análisis de secuencias repetidas. RECURSOS SOBRE PROYECTO GENOMA HUMANO Y DE RATÓN Existen múltiples recursos en Internet sobre el proyecto genoma humano. A continuación se listan algunos de estos recursos sobre mapeo genómico humano y de ratón, incluyendo YACs, STSs y otras utilidades para investigación del genoma.

• HGMP (UK MRC Human Genome Mapping Project Resource Centre) (www.hgmp.mrc.ac.uk/) Información y bases de datos sobre genes, marcadores genéticos y localización en mapas. • Introductory Human Genome Material (www.hgmp.mrc.ac.uk) Revisión no técnica sobre el proyecto Genoma Humano y temas relacionados, especialmente con fines educativos o legales. • MIT/Whitehead Centre for Genome Research (www-genome.wi.mit.edu/) Información sobre el mapa genómico humano y del ratón y sobre software para análisis del genoma. • Portable Dictionary of the Mouse Genome (mickey.utmem.edu/front.html) Compendio de información sobre el genoma de ratón extraida de varios recursos on-line o publicados. • SIGMA (System for Integrated Genome Map Assembly) (www.ncgr.org/sigma/intro.html) Herramienta de bases de datos gráfica para construir y ver mapas genómicos. • University of Utah (www.genetics.utah.edu//) Lista de colecciones de sequence tagged sites (STS), ordenadas por cromosomas. • Washington University EST (Merck) Database (genome.wustl.edu/est/est_general/est_ project_intro.html) Home page del proyecto EST (Expressed Sequence Tag).

RECURSOS DE GENÉTICA EN INTERNET

FUENTES DE REACTIVOS BIOLÓGICOS La mayoría de las compañías de biotecnología tienen su página web donde pueden encontrarse información sobre los productos o tutoriales. También puede encontrarse información sobre productos en la home page HUM-MOLGEN. Otras bases de datos sobre material de laboratorio son: • ATCG (Anderson’s Timesaving Comparative Guides on the Web) (www.atcg.com/aguide//atcghome.htm) Información sobre productos de biología y química. • Cedars-Sinai Molecular Genetics (www.csmc.edu/genetics/korenberg/korenberg .html) Fuente de recursos de YAC/BAC/PAC para mapeo genómico. • ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures) (gopher://gopher.gdb.org) Base de datos de líneas celulares, hibridomas y sondas de DNA, incluido el contenido del European Human Cell Bank. • E. coli Genetic Stock Center at Yale University (gopher://cgsc.biology.yale.edu/11/CGSC) Base de datos del genoma E. coli. • HyperCLDB (Cell Line Database) (www.ist.unige.it/cldb/indexes.html) Base de datos que contiene información sobre 3.000 líneas celulares humanas y animales. • IMAGE Consortium (Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expression) (www-bio.llnl.gov/bbrp/image/image.html) Consorcio de varios laboratorios internacionales para compartir y distribuir librerías de cDNA humano. • Jackson Laboratory Stocks (www.jax.org/) Colección de diversas cepas de ratones recombinantes o mutantes. UTILIDADES En Internet existen diversas utilidades para biología molecular, como:

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• ORF Finder (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) Encuentra la ORF de una secuencia. • Primer 3 (www2.no.embnet.uio.org/primer/primer3.cgi?) Utilidad para la detección de primers de una secuencia. • Nucleotide to Protein (EMBL) (www.ebi.ac.uk/contrib/tommaso/translate.html) Traslada una secuencia de nucleotidos en proteínas. • Web Cutter - Restriction Enzyme Mapping Utility (rna.lundberg.gu.se/cutter2/) Utilidad para encontrar la enzima de restricción que corta una determinada secuencia (ver ejemplo de las Figuras 6.6 a 6.9). • Forward and Reverse Translation (www.sanger.ac.uk/Software/Wise2/genewisef orm.shtml Traslada una secuencia de proteína en DNA genómico y viceversa.

FUENTES DE INFORMACIÓN GENERAL Finalmente, se muestran diversas fuentes de información sobre genética en general: • Academic Press Dictionary of Science and Technology (www.harcourt.com/dictionary/) Diccionario online. • BioComputing Hypertext Coursebook (www.techfak.uni-bielefeld.de/bcd/Curric/) Manuales sobre bioinformática. • Gene Cards: Diseases with a Genetic Association (bioinfo.weizmann.ac.il/cardsbin/listdiseasecards) Lista de enfermedades humanas ordenadas por cromosomas. • GeneTests (http:://www.genetests.org) Lista de test genéticos disponibles. • Genetic Linkage Analysis Home Page (lenti.med.umn.edu/linkage/linkage.html) Para buscar información sobre análisis de ligamiento.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Figura 6.1. Ejemplo de utilización de la OMIM en búsqueda de información sobre Parkinson familiar autosomal recesivo. Desde la página inicial del PubMed (A) se puede obtener la información del OMIM (B), en este caso sobre enfermedad de Parkinson recesiva (C) y cDNA del parkin (D).

• HUM-MOLGEN Home Page (www.informatik.uni-rostock.de/HUMMOLGEN/index.html) Foro de comunicaciones en Internet que trata de temas relacionados con la genética molecular humana. • LiMB (Lista de bases de datos de Biología Molecular) (gopher://gopher.nih.gov/) Contiene información sobre el contenido y mantenimiento de las bases de biología molecular. • Molecular Biologist’s Desk Reference (molbio.info.nih.gov/molbio/desk.html) Links a tablas con el código genético, propiedades de los aminoácidos, estructuras, nomen-

claturas, protocolos de biología molecular y servicios de bibliografía. • Mouse and Rat Research Home Page (www.cco.caltech.edu/~mercer/htmls/rodent_ page.html) Información sobre ratones, su biología, genomica, transgénicos, congresos, links a recursos similares, etc. • Pedro’s Biomolecular Research Tools (www.public.iastate.edu/~pedro/research_tool s.html) Página web muy completa con links a bases de datos moleculares, revistas de genética, tutoriales, centros de diagnóstico, etc.

RECURSOS DE GENÉTICA EN INTERNET

Figura 6.2. Secuencia del mRNA del gen Parkin obtenida de la base de datos del GenBank a partir del link desde la OMIM en la página web del Parkinson familiar autosomal recesivo.

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• The Resource for Molecular Cytogenetics (rmc-www.lbl.gov) Base de datos sobre sondas para hibridación in situ con fluorescencia (FISH). • University of Washington (www.pathology.washington.edu/cyto_page.html) Información sobre genoma y citogenética de humano y de ratón. • Virtual Library: Genetics (www.pathology.washington.edu/cyto_page.html) Una lista de recursos genéticos en Internet con links a cada uno. Aunque la lista anterior muestra la profundidad de datos sobre genética en Internet, quizás las páginas más útiles para los neurólogos son aquellas que contienen datos sobre clínica como la de OMIM o la de Genetests. El mejor método para conocer el contenido y manejo de las páginas anteriores es visitarlas personalmente. A continuación se muestran algunas de las utilidades de estas páginas mediante tres ejemplos. En el primer ejemplo, se busca información sobre la

enfermedad de Parkinson familiar y sobre los genes causales, su secuencia y sus mutaciones. Para ello se utilizan el PubMed, OMIM y HGMD. PubMed o base de datos bibliográfica de medicina, contiene los datos de 4.000 revistas desde 1966 hasta la actualidad (se actualiza semanalmente). OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), es una base de datos de las enfermedades genéticas. Resume los principales hallazgos moleculares y genéticos de la enfermedad. La selección buscada dispone de links a otras bases de datos, como la del GenBank, donde están todas las secuencias de DNA y proteínas de dominio público, lo que permite a su vez obtener las secuencias de los genes implicados, o las mutaciones descritas para este gen. HGMD (Human Gene Mutation Database) es una base de datos sobre las mutaciones de un determinado gen. Contiene además otros datos como el cDNA del gen o un esquema de gen y sus mutaciones. Las direcciones para acceder a estas bases de datos se encuentran en la información sobre recursos de genética listada anteriormente.

Figura 6.3. Página inicial de la HGMD.

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Figura 6.4. Página con las mutaciones del gen parkin.

En el ejemplo de la Figura 6.1 se muestra el resultado de examinar la OMIM para la palabra PARKINSON, recogiéndose varias entradas que son cada una de las formas de la enfermedad de Parkinson familiar. Se elige a continuación la primera entrada y puede verse la información correspondiente a la enfermedad de Parkinson secundaria a mutación en el gen de la parkina. En

el texto de esta página están los principales datos moleculares y clínicos de esta forma de enfermedad de Parkinson, y desde ella hay links a páginas que muestran la secuencia del gen de la parkina (Figura 6.2). Conocer la secuencia de un gen, cuál es la parte codificante (exones) y no codificante, dónde empiezan los exones y cuál es la secuencia de

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Figura 6.5. Mutaciones por cambio de sentido o sin sentido del gen parkin.

la proteína codificada es fundamental a la hora de examinar mutaciones. Estos datos se introducen en los programas y a partir de ellos se pueden obtener los primers para PCR, examinar la presencia de puntos de restricción, alinear con las secuencias obtenidas, examinar el cambio de aminoácido que produce una restricción, etc. En la Figura 6.2 se puede observar cómo se muestra esta información en la base de datos GeneBank, a la que se ha accedido a través de un link en OMIM. Una vez estudiada la secuencia del gen parkin, si hemos encontrado una mutación, generalmente interesa conocer la información previa sobre esta (descripciones previas, ect.). Para ello buscaremos la información en la HGMD. Nos conectaremos con la base de datos HGMD y en su página de búsqueda introduciremos la clave PARK2 (Figura 6.3) en la que se introduce el gen correspondiente, apareciendo un listado de las mutaciones descritas en ese gen, delecciones, expansiones, etc. Se muestran, en el caso de la parkina, las diferentes mutaciones y

las referencias bibliográficas donde las describen. Al introducir en el objeto de búsqueda la enfermedad, el nombre del gen o de la enfermedad (en el ejemplo de la Figura 6.3 PARK2, el número del gen en el OMIM o en el GDB) aparece un listado con las mutaciones, inserciones, delecciones, etc., causantes de la enfermedad (Figura 6.4). A partir de los links que existen en esta página podemos ir a conocer las mutaciones correspondientes. En el ejemplo de la Figura 6.5 las mutaciones por cambio de sentido. En el ejemplo siguiente (Figura 6.6) se quiere encontrar la enzima de restricción que corte la secuencia gctggctgaaac dentro de la secuencia del exón 8 de la presenilina 1 mediante la utilidad Webcutter. El programa Webcutter detecta que la enzima Cac8I reconoce esta secuencia. Posteriormente se examina si hay otros puntos de corte para esa enzima en el exón, a fin de ver qué productos vamos a obtener tras digerir con esta enzima el producto de la PCR. Seguidamente, usando REBASE se pueden conocer las principales características, protocolos, casas

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Figura 6.6. Homepage de WEBCUTTER, en la que se introduce la secuencia a examinar.

comerciales, etc., de una determinada enzima (Figura 6.10). Otros recursos genéticos de uso muy común son los buscadores en bases de datos, que permiten encontrar a qué organismo pertenece una determinada secuencia. En el ejemplo de la Figura 6.11 se ha introducido una secuencia (que corresponde a un primer utilizado para amplificar

el exón 9 de la presenilina 1) en la página del rastreador BLAST detectándose alineamiento con este gen (Figura 6.12). Mediante utilidades de este tipo se puede conocer a qué genoma pertenece una secuencia de DNA o de proteínas, encontrar genes ortólogos, buscar si otras proteínas tienen motivos análogos a los de nuestra secuencia, etc.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Figura 6.7. Resultado del programa. Se han encontrado dos enzimas que cortan este fragmento en la posición 3 y en la 5. Se muestra la secuencia que reconocen y se listan todas las enzimas que se han examinado.

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Figura 6.8. Se examina sólo la enzima Cacl para ver los puntos de corte que contiene el exón. En la Figura 6.9, se muestra el resultado de este examen.

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Figura 6.9. El programa muestra los puntos de corte de la enzima Cac8l en toda la secuencia.

Figura 6.10.

Resultado de la búsqueda de Cac8l en REBASE.

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Figura 6.11. En el buscador BLAST se ha introducido una secuencia (primer utilizado para amplificar el exón 9 de la presenilina 1) y se solicita la búsqueda en el genoma humano.

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Figura 6.12. El resultado de la búsqueda es un alineamiento con el gen de la presenilina 1, o con clones que lo contienen, no existiendo alineamiento en otros puntos del genoma humano.

C APÍTULO

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La neurogenética desde el punto de vista del neurólogo clínico A. Jiménez Escrig

La Neurología es posiblemente la especialidad médica en la que la genética ha irrumpido con más fuerza. Múltiples factores son la causa de esto. El alto número de enfermedades genéticas dentro de la especialidad hace que desde siempre haya existido mayor interés de los especialistas en Neurología por la genética desde el punto de vista clínico, en cuanto a patrones de herencia, pronóstico, etc. Además, la genética nos ha permitido clasificar entidades clínicas como las heredoataxias, en las que por el solapamiento de síntomas otras clasificaciones se muestran más débiles; ha ayudado a conocer la patogenia de procesos como las demencias o los parkinsonismos; y, finalmente, la terapia génica nos proveerá de armas terapéuticas para el tratamiento de tumores, procesos neurodegenerativos o enfermedades hereditarias. Todo lo anterior hace que sea necesaria una amplia formación en genética en nuestra especialidad y que un mínimo de conocimientos sobre la neurogenética sean imprescindibles para una correcta práctica diaria. Además, cuanto mayor sea nuestro conocimiento en genética, mayor será nuestra probabilidad de llegar a un correcto diagnóstico de muchos procesos neurológicos.

Como ya hemos señalado, con frecuencia el neurólogo clínico tiene que enfrentarse en su práctica médica a la evaluación de un paciente con una enfermedad hereditaria. En este caso, el primer paso para el estudio de una enfermedad genética siempre pasa por la realización del diagnóstico clínico más detallado y exacto posible. Posiblemente en el futuro, con el desarrollo de técnicas de diagnóstico genético masivo, como los microarrays, que permitan evaluar en un solo test múltiples enfermedades genéticas, esto no sea necesario, pero en el estado actual de las técnicas de diagnóstico genético es preciso aún una orientación precisa del test a realizar y para ello es necesario un diagnóstico clínico preciso. Existen diversos ejemplos que clarifican lo anterior. Si se examina un individuo por demencia familiar y se maldiagnostica una demencia frontal como enfermedad de Alzheimer, el estudio de mutaciones en el gen de las presenilinas y proteína precursora de amiloide será negativo, dando una falsa impresión de ausencia de una mutación conocida. Por ello, los pasos a seguir en el diagnóstico clínico para un correcto diagnóstico genético incluyen: 83

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

1. Una detallada historia clínica, exploración neurológica y realización de exploraciones complementarias. 2. El estudio de otros familiares afectados, que aporta generalmente informaciones valiosísimas para el diagnóstico genético y, por lo tanto, debe realizarse siempre que sea posible. Todos hemos sido víctimas alguna vez de información errónea sobre una enfermedad familiar de una persona transmitida por un informador. El caso más corriente es la frecuente confusión que los pacientes con temblor esencial sufren por parte de sus familiares respecto a que padecen enfermedad de Parkinson. Si no se examina al individuo podemos considerar una familia con temblor esencial, trastorno de alta prevalencia, como una familia con enfermedad de Parkinson familiar, algo mucho más raro. Además, el examen de familiares es también muy útil para evaluar el patrón de herencia, pues con una alta frecuencia permite encontrar nuevos casos entre individuos supuestamente asintomáticos, y al contrario, descartar como afectados casos que el informador consideraba afectados. Sin embargo, el examen de familiares no siempre es posible y desde luego no es sencillo. Deben tenerse en cuenta siempre en primer lugar las consideraciones éticas que conlleva este estudio: se van a examinar individuos asintomáticos, que pueden ser portadores de enfermedades que hasta ahora no conocían, que en muchas ocasiones viven a distancia del probando, o incluso no se encuentran en buena relación con él. Además, los individuos deben ser examinados por una misma persona o alguien de su grupo, a fin de que se realice un diagnóstico lo más uniforme posible, para lo que, en ocasiones, se requiere que se desplace el sujeto a examinar o el grupo examinador. Si esto no es posible, el diagnóstico deberá hacerse siguiendo un protocolo establecido previamente. Se realizará entonces un árbol genealógico que incluya no solo el estado de afectado o no de los individuos, sino también será necesario al menos reflejar la edad de los mismos (ya que pueden no haber alcanzado la edad de penetrancia de la enfermedad), la edad de inicio de la clínica, el grado de afectación y la velocidad de deterioro.

3. Ante la consideración de una enfermedad genética, la negación de antecedentes familiares no descarta la existencia de esta. Existen múltiples explicaciones a la ausencia de antecedentes familiares: a) desconocimiento de la enfermedad en casos de separaciones físicas de los padres o los hermanos; b) que los padres y hermanos no hayan alcanzado la edad de aparición de la enfermedad por fallecimiento antes de esa edad por otras causas; c) falsa paternidad; d) mutaciones nuevas. Tampoco la existencia de múltiples casos familiares es signo inequívoco de enfermedad genética, pues en casos de exposición ambiental familiar (p. ej., síndrome por aceite tóxico) pueden existir múltiples casos familiares. 4. Dada la necesidad de una alta precisión diagnóstica para indicar un correcto estudio genético, los estudios histopatológicos, biopsia o necropsia, tienen un enorme valor en este contexto. Ante la sospecha de una neuropatía amiloidea, la biopsia de nervio, o tubo digestivo que determine la presencia de amiloide y la constatación de que este amiloide es transtiretina, enfoca hacia el estudio de mutaciones en esa molécula. En el caso de una demencia familiar, existe solapamiento entre la clínica de tres entidades que pueden cursar de forma hereditaria: Alzheimer, demencia frontal y encefalopatía por priones, por lo que el estudio necrópsico puede ser muy útil para orientar el estudio genético molecular que se realice. Por situaciones como la anterior se entiende que deba perseguirse la confirmación histopatológica siempre que sea posible. Cuando ya se ha realizado un diagnóstico clínico, dada la baja incidencia de las enfermedades genéticas, en muchas ocasiones será necesario documentarnos sobre el proceso. Para ello se utilizarán los medios habituales, libros de consulta, revisiones en revistas, Medline, etc. Es aconsejable para esta documentación la consulta de la base de datos OMIM, al ser un medio en el que se recogen sistemáticamente los datos y se actualizan periódicamente, y permite en un corto espacio de tiempo hacerse una idea de los principales datos clínicos y moleculares del proceso a examinar.

LA NEUROGENÉTICA DESDE EL PUNTO DE VISTA DEL NEURÓLOGO CLÍNICO

Una vez que conozcamos la posibilidad de hacer un diagnóstico genético molecular, debemos decidir si este debe realizarse o no. Factores a favor de la realización de diagnóstico genético molecular son: 1. El estudio genético permite aumentar el grado de certeza diagnóstica del proceso: el caso del diagnóstico genético de la enfermedad de Huntington es de sobra conocido, pero esto puede aplicarse a otras enfermedades como la enfermedad de Alzheimer familiar, CADASIL, la demencia frontal, etc., lo que puede tener implicaciones en el tratamiento a seguir, pronóstico, etc. 2. El estudio genético puede ayudar a conocer el tipo de enfermedad dentro de un mismo grupo, como en el caso de las heredoataxias, en el que el diagnóstico molecular puede servir para conocer el tipo de ataxia, lo que permite inferir el pronóstico, aparición de nuevos síntomas, atribuir síntomas como la degeneración retiniana al proceso neurológico, etc. 3. El diagnóstico genético puede ayudar a detectar portadores asintomáticos, por lo que puede ofrecerse a los familiares del probando por si están interesados. En muchas ocasiones son estos individuos los que estimulan al médico que trata al probando a que encuentre la alteración genética causante que les permita a ellos conocer su riesgo de enfermar. El diagnóstico presintomático tiene dos contextos principalmente. El diagnóstico presintomático de un feto de riesgo y el de un individuo adulto. El primero habitualmente se realiza en Servicios de Genética e integra habitualmente a especialistas como el genetista y el ginecólogo. El segundo caso no infrecuentemente implica al clínico y es imprescindible que en su realización se sigan una serie de reglas, que se detallan más adelante. 4. El diagnóstico genético puede servir en enfermedades recesivas para determinar si un individuo que presenta un test bioquímico alterado es homocigoto, en cuyo caso va a desarrollar clínica, o es heterocigoto, por lo que no va a desarrollar clínica y su situación como portador es habitualmente de escaso riesgo. Ejemplo de esto es el caso de la enfer-

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medad de Wilson en el que los heterocigotos pueden tener niveles plasmáticos de ceruloplasmina y cobre sérico en límites patológicos, lo que originaría su diagnóstico erróneo si se usan estas determinaciones, y es preciso un estudio de la mutación causal para ver la homocigosidad. Pero también existen factores que pueden decidirnos para no realizar un estudio genético molecular a pesar de que este sea factible. No realizaremos este estudio si no va a aportar nada a la clínica o tratamiento del individuo, como por ejemplo en el caso de individuos en los que ya se conoce el diagnóstico por existir otros familiares afectados y el estudio molecular no aporte ninguna información adicional. Si ya nos hemos decidido a realizar el estudio genético molecular lo habitual es enviar la muestra a un centro de referencia. La muestra a enviar puede ser sangre, variando según el laboratorio, siendo lo más habitual enviar 10-15 ml de sangre en EDTA, a temperatura ambiente, pero también puede ser DNA ya extraído, u otro material como material biópsico. La realización de extracción de DNA y el almacenamiento de este en el propio centro para su envío posterior es deseable si se dispone de la infraestructura necesaria. Mandar una alícuota de este DNA en lugar de sangre completa, aparte de ser más sencillo desde el punto de vista del envío (basta un tubo de ensayo de 0,5-1,5 ml en un sobre de correos), permite almacenar el DNA y demorar el envío a nuestra conveniencia, y, finalmente, en caso de un primer resultado negativo disponer de muestra para estudiar otras mutaciones u otros genes. A la hora de realizar este envío es importante considerar el centro que va a realizar la determinación, valorando, aparte de la calidad del estudio, parámetros como coste de los estudios (en ocasiones pueden encontrarse centros donde un estudio se realice gratuitamente en el contexto de investigación) y la rapidez de la respuesta clínica (parámetro no sin importancia pues existe una importante demora diagnóstica por la tendencia de los laboratorios a recoger varias muestras a fin de examinar un número de ellas, lo que retrasa meses los resultados, con la consiguiente ansiedad de los implicados).

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Una vez que se recibe el diagnóstico molecular, si este es positivo debemos de nuevo documentarnos sobre la mutación encontrada, para lo cual lo más recomendable es utilizar la base de datos HGMD, que permite encontrar las mutaciones existentes en ese gen y las referencias bibliográficas sobre ellas. Naturalmente, se comunicará al paciente y se le informará sobre la posibilidad de realizar un diagnóstico a sus familiares asintomáticos. En el caso de que el resultado sea negativo, es preciso considerar varios puntos. En primer lugar, un resultado negativo puede servir para reorientar clínicamente al sujeto. Por ejemplo, un resultado negativo de Huntington puede reorientar a otras demencias que cursen con movimientos anormales, reexaminando al sujeto y en ocasiones indicando un test diferente, como la DRPLA o la coreoacantocitosis. Pero un resultado negativo no siempre descarta la enfermedad que se está estudiando, por lo que es preciso de nuevo documentarnos sobre la enfermedad y el estudio realizado. Es preciso valorar parámetros sobre el test realizado como: 1. Si se han examinado solo algunas mutaciones, generalmente las más comunes. 2. Si se ha estudiado toda la molécula o solo una parte de ella. 3. Cuál es la posibilidad de falsos negativos del test. Además, debe considerarse que en muchos casos no se conocen todas las posibles mutaciones causales, por lo que ante un test negativo, el test deberá ser repetido un tiempo después cuando la evolución de los nuevos conocimientos sobre el trastorno así lo aconsejen. CONSIDERACIONES ÉTICAS DE LOS ESTUDIOS GENÉTICOS Las enormes repercusiones que los resultados de un estudio genético pueden tener sobre la persona y sus familiares hace que deban extremarse la consideración de los aspectos éticos. Estos aspectos deben considerarse ante toda prueba diagnóstica, pero son aún más importantes en el caso del diagnóstico presintomático.

Con frecuencia se considera que ante un diagnóstico genético de un individuo enfermo, la indicación de una prueba genética puede considerarse un test diagnóstico más. Sin embargo, esto no es así por cuanto en este caso el diagnóstico que se realiza no solo implica al paciente sino también a sus familiares. Este factor es muy importante para tener en cuenta y debe ser considerado siempre a priori, antes de realizar el test y no cuando el médico ya dispone del resultado. Además, por supuesto es imprescindible la realización de un consentimiento informado antes del estudio. Pero donde este aspecto es primordial es en el caso del diagnóstico presintomático. En este caso, la práctica común es seguir las normas decididas para el diagnóstico presintomático de la enfermedad de Huntington, por cuanto ha sido esta enfermedad la de más volumen de diagnóstico presintomático lo que llevó a estudiar este hecho más en profundidad. La experiencia con esta enfermedad, es que en sujetos informados de un resultado positivo aparece una depresión severa en un 2% de los casos. Este trastorno no suele aparecer en los momentos iniciales sino tardíamente, en general cuando el sujeto comienza a experimentar síntomas de esta enfermedad. Siguiendo las normas para el estudio de individuos de riesgo establecidas para la enfermedad de Huntington, debe tenerse en cuenta que: 1. El diagnóstico presintomático nunca puede hacerse en menores de edad, por cuanto se considera que puede modificar el comportamiento de los padres y la sociedad hacia el menor, bien sobreprotegiendo, bien disminuyendo su posibilidades de desarrollo. 2. En individuos mayores de edad, el diagnóstico presintomático se realizará según un protocolo de diagnóstico presintomático que incluirá un consentimiento informado, una valoración psicológica y eventual apoyo psicológico previo al test, realizar el test en individuos que dispongan de otra persona de apoyo, y finalmente otra nueva valoración psicológica y apoyo psicológico después de conocerse los resultados de test. 3. Los individuos con resultados negativos pueden experimentar ansiedad, depresión o am-

LA NEUROGENÉTICA DESDE EL PUNTO DE VISTA DEL NEURÓLOGO CLÍNICO

bas, debido a sus experiencias previas o al resultado de la enfermedad en otros familiares. Un resultado negativo puede modificar la conducta futura. Otro aspecto a tener en cuenta en estudios genéticos es el de la confidencialidad, que debe ex-

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tremarse al máximo. Se preferirá la comunicación de los resultados oralmente y la entrega en mano del informe clínico, al envío por correo de los datos y, por supuesto, deben excluirse medios susceptibles de ser examinados por individuos diferentes al paciente, como el fax o el correo electrónico.

C APÍTULO

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Estrategias para el estudio genético molecular de una enfermedad neurológica A. Jiménez Escrig

El conocimiento de la estrategia utilizada para llegar a un diagnóstico genético es relevante para el clínico, por cuanto le ayuda a plantear el estudio genético clínico adecuado y a comprender este. Por test genético se entiende el análisis de DNA humano, RNA, cromosomas, proteínas o ciertos metabolitos, que permita detectar alteraciones relacionadas con un transtorno hereditario. Incluso la realización de una resonancia magnética craneal en individuos en riesgo de cavernomatosis familiar o CADASIL puede considerarse un test genético. El examen del DNA puede ser mediante el estudio del gen alterado en la enfermedad o mediante marcadores (RFLP o microsatélites) que se cohereden ligados al gen causal. La escasa incidencia de los transtornos hereditarios y los continuos cambios en la materia son la causa de que usualmente los test genéticos se realicen en centros especializados. Además, con frecuencia se requiere realizar múltiples test, o examinar a familiares adicionales. Los test genéticos pueden ser:

• Diagnósticos: para confirmar o descartar una determinada enfermedad en un individuo sintomático. • Predictivos (presintomáticos, p. ej., en la enfermedad de Huntington, o predisposición, p. ej., APOE). • De portadores. • Prenatales, a través de amniocentesis, examen de vellosidades coriónicas, test de sangre de cordón, biopsia de placenta o de piel del feto. • Preimplantación. • Neonatales. Cada uno de estos tipos de test presenta unas características especiales que se listan en la Tabla 8.1. La aproximación al diagnóstico genético molecular de un transtorno mendeliano se basa fundamentalmente en el tamaño del gen y en el número de mutaciones causales. En la Figura 8.1 se muestran de modo comparativo varios genes y sus mutaciones descritas para ilustrar las diferencias entre unas u otras enfermedades. A lo ante89

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Tabla 8.1.

Consideraciones de los test genéticos.

Test diagnóstico • Puede hacerse a cualquier edad. • Determina cambios en la actitud diagnóstica y terapéutica. • Presenta menos riesgos y costes que otras exploraciones. • Siempre tiene implicaciones reproductivas y familiares. • A veces se requiere más de un test para el diagnóstico. • No siempre el estudio del DNA es el mejor test para el diagnóstico. Test predictivo • Indicado desde el punto de vista médico (no de investigación), en caso de que la intervención sea capaz de mejorar o curar la enfermedad. • En ausencia de indicación médica, puede realizarse si ayuda a tomar decisiones de planificación vital. • Requiere de consejo genético y ayuda psicológica. • Nunca se realizará en menores de edad, si no hay posibildad de intervención médica. Examen prenatal • Debe conocerse previamente la mutación causal. • Los procedimientos tienen riesgo para el feto. Examen de preimplantación • Se realiza en pocos centros y en un número limitado de enfermedades. • Debido a su menor fiabilidad debe seguirse de examen prenatal. • Debe conocerse previamente la mutación causal.

rior, es preciso considerar la presencia de una mutación única y la existencia de enfermedades en las cuales aún no se conoce el gen alterado. De acuerdo con lo anterior, la aproximación al diagnóstico genético molecular puede categorizarse como sigue: 1. Enfermedades con gen y mutación conocidos: 1.1. Producidas por una mutación única o predominante. 1.2. Producidas por múltiples mutaciones: 1.2.1. En genes de pequeño tamaño. 1.2.2. En genes de gran tamaño. 2. Enfermedades en que el gen afectado se desconoce.

Existen algunas enfermedades que presentan particularidades diagnósticas como la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la distrofia facioescápulo humeral, o las delecciones de exones del parkin, que se detallarán en el capítulo correspondiente. A continuación se desarrollara el modo de estudio de cada una de estos grupos. El primer grupo (1.1) (Caso 1) producido por enfermedades producidas por una mutación única, está formado por mutaciones dinámicas (ver Tabla 8.1). En este tipo de enfermedades el diagnóstico es directo. Una vez que se sospeche la enfermedad se determina el número de repeticiones de la expansión por diferentes métodos (generalmente PCR, si bien la realización de la PCR de las expansiones presenta algo más dificultad por ser el fragmento rico en citosinas y guaninas) y según el rango se determina el estado de no afectado, rango de premutación, rango de mutación. En algunos casos, como la SCA6, la enfermedad está producida en la mayoría de las veces por una expansión, pero existen casos debidos a mutaciones puntuales en el gen CACNA1A, que deberán ser buscadas, en caso de que la determinación de la expansión sea normal, según el apartado 1.2.2. El segundo grupo (1.2.1), está formado por trastornos producidos por mutaciones en genes de tamaño pequeño o medio como la polineuropatía amiloidea familiar (TTR; 4 exones), Xanto-

CASO 1 Paciente de 69 años, presenta en los últimos 5 años movimientos discinéticos en boca y posteriormente en extremidades superiores, y refiere en el último año inestabilidad al andar con caídas. La exploración cognitiva es normal y no hay alteraciones neuropsiquiátricas. Como antecedentes refiere que su padre presentó movimientos similares de inicio alrededor de 70 años y que tiene un hermano diagnosticado de alteración de la personalidad paranoide. La paciente tiene 2 hijas sanas. Las exploraciones complementarias realizadas, analítica sanguínea y neuroimagen son normales. Tras informar a la paciente y a las hijas de las consecuencias futuras derivadas de los resultados, se realizó un estudio genético de enfermedad de Huntington, que mostró 42 repeticiones.

ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO GENÉTICO MOLECULAR…

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Figura 8.1. Longitud de diferentes genes y mutaciones descritas (TTR, polineuropatía amiloidea familiar; CYP24A1, xantomatosis cerebro tendinosa; PSEN1, enfermedad de Alzheimer; ATP7, enfermedad de Wilson; NOTCH-3, CADASIL). Tomado de la base de datos HGMD.

matosis cerebrotendinosa, 9 exones y presenilina 1, 12 exones. En este caso, el procedimiento habitual suele ser la búsqueda de las mutaciones más comunes, como son en nuestro medio las mutaciones Met30 y Tyr77 de la TTR, y caso de

que estas mutaciones sean negativas se examinará el gen mediante PCR y secuenciación de los exones en los que se hayan descrito mutaciones (2,3 y 4 de la TTR). Los casos 2 y 3 son ejemplos de este tipo de estudio.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Tabla 8.2. Enfermedades producidas por mutaciones dinámicas. Enfermedad

Triplete

Distrofia miotónica Retraso mental X-frágil SCA Ataxia de Friederich Corea de Huntington DPRLA S. de Kennedy

CTG CCG CAG GAA CAG CAG CAG

En el caso de genes de gran tamaño (grupo 1.2.2), como por ejemplo en la enfermedad de Wilson (ATP7, 21 exones), CADASIL (Notch-3, 37 exones) o la neurofibromatosis tipo 1 (neurofibro-

mina, 57 exones), el estudio inicial comprende de una parte la detección de mutaciones más comunes (por ejemplo, en el caso del CADASIL, el 70% de las mutaciones están localizadas en los exones 3 y 4 del gen Notch-3, por lo que el estudio debe iniciarse por la secuenciación de estos dos exones). Si este estudio inicial es negativo, puede ocurrir que el individuo a estudiar pertenezca a una familia suficientemente amplia para ser informativa, por lo qué mediante un estudio de haplotipos puede detectarse qué sujetos han heredado el haplotipo de riesgo y quiénes no. El estudio de haplotipos consiste en el determinar el genotipo de varios marcadores intragénicos o muy próximos al gen, lo que permite determinar los haplotipos (configuración de varios alelos) de los individuos y ver si existe un determinado haplotipo

CASO 2 Paciente de 57 años, consulta por dolores nocturnos en las extremidades inferiores y pérdida de fuerza en los últimos 2 años. Refiere que su padre y abuelo presentaron cuadro de pérdida de fuerza, permaneciendo en silla de ruedas en los últimos años de su vida. Las exploraciones complementarias mostraron un estudio electroneurográfico de nervio compatible con polineuropatía axonal. La biopsia de nervio mostró pérdida generalizada de axones, sin depósitos de amiloide. Se realizó biopsia rectal que mostró depósito de amiloide en la submucosa. Se practica estudio genético consistente inicialmente en amplificación por PCR del exón 2 de la TTR, y análisis de restricción enzimática con la enzima NsiI, a fin de descartar la mutación Met30, sin encontrarse esta mutación. Se realiza entonces estudio de la secuencia de los exones 2,3 y 4 de la TTR, mediante PCR y secuenciación, detectándose una mutación c → a en el exón 3. Este cambio produce un cambio de una Valina (TCT) por Tirosina (TAT) en el aminoacido 77 de la TTR. Como la secuencia de la mutación es reconocida por la enzima SspI (que reconoce la secuencia aatatt, cortando en ...aat y att....), se confirma la mutación mediante análisis de restricción. Un año después, una hermana del paciente comienza a presentar síntomas de polineuropatía. Se le realiza un estudio genético mediante análisis de restricción mediante la enzima SspI, detectándose también la mutación.

ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO GENÉTICO MOLECULAR…

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CASO 3 Mujer de 37 años con un cuadro de 3 años de evolución de deterioro cognitivo progresivo, manifestado fundamentalmente por depresión, apatía severa, alteraciones en las funciones ejecutivas y deterioro de memoria. Refiere como antecedente que su madre presentó una cuadro de alteración cognitiva de inicio en edad similar acompañada de temblor y rigidez, falleciendo a los 42 años. Las alteraciones complementarias realizadas, analítica sanguínea, TAC y SPECT cerebral no mostraron alteraciones. Se realiza estudio genético de enfermedad de Huntington que fue normal. Posteriormente se examinan mutaciones en el gen de la proteína tau, mediante secuenciación de los exones 9,10,12 y 13, sin encontrarse alteraciones. Se realiza entonces estudio de la presenilina 1, mediante secuenciación de los exones 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12. En la secuencia del exón 8, existe una mutación t → c, que genera un cambio de valina por alanina en el aminoácido 272 de la presenilina 1. Este aminoácido está conservado en la presenilina 1 de ratón, rata, mosca del la fruta y en la presenilina 2, lo que indica que su posición es importante para la función de esta molécula apuntando a la causalidad de la mutación.

CASO 4 Paciente de 52 años con antecedentes de cefaleas de características migrañosas, presentó en hace 4 años un episodio de inestabilidad que fue diagnosticado de ictus vertebrobasilar. En el momento actual ha presentado dos episodios isquémicos en el plazo de dos meses que le han dejado como secuelas deterioro cognitivo con predominio de transtorno frontal e incontinencia emocional. Presentaba antecedentes familiares de alteraciones isquémicas cerebrales en su padre y dos primos hermanos. Una resonancia magnética craneal mostró extensas lesiones isquémicas en sustancia blanca de hemisferios cerebrales y tronco cerebral. Con el diagnóstico de CADASIL, se realizó estudio de mutaciones en el gen NOTCH-3. Para ello se secuenciaron los exones 3 y 4 que presentan el 60% de las mutaciones descritas, y posteriormente el exón 11, con lo que se descartan el 90% de las mutaciones descritas.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

que se transmita con la enfermedad, lo que permite en primer lugar atribuir a ese gen la enfermedad, y en segundo lugar conocer el estado de portador o no de la mutación de los diferentes miembros de la familia. Si además de lo anterior queremos conocer cuál es la mutación causal, puede realizarse la secuenciación del gen. Para ello, pueden seguirse varias estrategias: PCR y secuenciación de los exones, PCR y detección de mutaciones mediante técnicas de detección de mutaciones como la SSCP, y secuenciar aquel o aquellos exones que presenten dos bandas en la SSCP, o extracción del mRNA del gen, bien de tejido afectado o de leucocitos y posterior obtención del cDNA y secuenciación de este en 3 o 4 fragmentos. El último supuesto (2) es el de aquellos casos de mutaciones no conocidas. Ejemplo de esto son familias con enfermedad de Alzheimer fami-

liar o enfermedad de Parkinson familiar, temblor esencial, etc... Estos casos tienen gran relevancia por cuanto son los que han permitido encontrar nuevos genes causales de enfermedades como las presenilinas o la α-synucleína, y posiblemente permitirán encontrar nuevos genes en el futuro. El trabajo con estas familias comprende la determinación de mutaciones conocidas previamente, como por ejemplo en caso de una familia con enfermedad de Parkinson, los genes α-synucleína, UCHL y parkin. Una vez excluidas mutaciones en estos genes, se examinará mediante estudio de haplotipos si se puede responsabilizar de la enfermedad a algún gen localizado en un loci conocido, 2p,4q y 4p en el caso de la enfermedad de Parkinson. Si esto continua siendo negativo, el siguiente paso será la realización de un estudio de búsqueda genética mediante análisis de ligamiento (ver Capítulo 1).

CASO 5 Paciente de 65 años, presenta enfermedad de Parkinson desde hace 15 años. En una visita de revisión se detecta también enfermedad de Parkinson en una hermana que la acompaña. Un interrogatorio y examen posterior detecta enfermedad de Parkinson en otra hermana y dos primas hermanas. Se realiza estudio de mutaciones conocidas de enfermedad de Parkinson mediante secuenciación del gen de la sinucleina, UCHL y parkin sin encontrarse anomalías. Como se considera que la familia puede ser útil para un estudio de búsqueda de un gen nuevo de enfermedad de Parkinson, se realiza un estudio de este tipo en el seno de un proyecto de investigación. Para ello, se examinan otros miembros de la familia, clasificándose su estado de afecto o no afecto. Una vez realizado un arbol genealógico completo y estado de afectación, se realiza un análisis de simulación de ligamiento que permite conocer cuál será el máximo LOD score que se podrá obtener en un estudio de búsqueda genómica con 400 marcadores repartidos por todo el genoma con la información que se dispone. En la Figura 2 se muestran los LOD score máximo, medio y mínimo para un marcador ligado y no ligado. En un tercer paso se empieza a examinar el LOD score calculado para los marcadores de loci conocidos de enfermedad de Parkinson (2p, 4q y 4p) y si no se encuentra ligamiento a estos marcadores se examinan marcadores repartidos por todo el genoma.

PARTE II

NEUROGENÉTICA CLÍNICA

C APÍTULO

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Miopatías hereditarias J. M. Gobernado Serrano

CONCEPTO DE MIOPATÍA Las miopatías son desórdenes en los que se alteran la estructura o función del músculo esquelético, que se manifiestan esencialmente por debilidad. En unos desórdenes, el defecto principal radica en el propio músculo (miopatías primarias), mientras que en otros la afectación muscular solo es el reflejo de un proceso morboso extrínseco, más extenso (miopatías secundarias).

mente se clasifican las enfermedades del músculo esquelético en dos grandes grupos: hereditarias y adquiridas (Tabla 9.1). CONCEPTO DE DISTROFIA MUSCULAR El término de distrofia muscular cubre un amplio grupo de desórdenes musculares hereditarios, clínica y genéticamente heterogéneos, que tienen como factor común de cohesión la presencia de debilidad y atrofia invariablemente progresivos, asociadas con cambios patológicos pe-

CLASIFICACIÓN DE LAS MIOPATÍAS Las miopatías pueden ser clasificadas atendiendo a distintos parámetros, tales como la edad de comienzo (congénitas, primera infancia, adolescencia, edad adulta); distribución de los musculatura afectada (ocular, facial, cuello, proximal o distal de las extremidades); asociación con otras manifestaciones sistémicas (cardiopatía, insuficiencia respiratoria, diabetes mellitus, etc.); todas ellas de importancia clínica, ya que proporcionan patrones de reconocimiento y guías útiles para orientar el diagnóstico clínico hacia el objetivo óptimo, que es intentar alcanzar un diagnóstico etiológico. En este último sentido, actual-

Tabla 9.1.

Clasificación de las miopatías.

Hereditarias • • • • •

Distrofias musculares. Miopatías congénitas. Miotonías y canalopatías. Miopatías metabólicas. Miopatías mitocondriales .

Adquiridas • • • •

Miopatías inflamatorias. Miopatías endocrinas. Secundarias a procesos tóxico/metabólicos. Miopatías asociadas con enfermedades sistémicas.

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culiares, conocidos como patrón distrófico, caracterizado por la degeneración y muerte de células o segmentos de fibras musculares, sustitución por tejido conectivo y graso, y signos de regeneración muscular. Son causadas por mutaciones patogenéticas situadas en diversos genes. Las mutaciones originan defectos o deficiencia de determinadas proteínas localizadas en distintos compartimentos celulares (Tabla 9.2). Los defectos bioquímicos actúan como mecanismos patogénicos primarios que destruyen el tejido por degeneración (apoptosis) y/o necrosis. Las mutaciones que determinan el defecto cuantitativo o funcional de estas proteínas, no sólo perturban el músculo esquelético, sino que también causan disfunciones en las células de otros tejidos, pudiendo dar lugar a manifestaciones multisistémicas. La mayoría de estas proteínas forman parte de complejos proteicos multifuncionales más extensos. El complejo distrofina-glicoproteína y los análogos constituidos por las integrinas y las caveolinas, son complejos proteicos dinámicos, asociados a la membrana sarcolémica (Figura 9.1), cuya misión principal es de comunicación, me-

Tabla 9.2. Cartografía celular de las proteínas relacionadas con las distrofias musculares. Proteínas de la matriz extracelular • Laminina-2. • Colágeno VI. Asociadas a proteínas de la membrana o transmembrana • Distrofina. • Sarcoglicanos. • Caveolina-3. • Integrinas α-5 y α-7. • Disferlina. Citoplasmáticas asociadas con proteasas citoplamáticas • Calpaina-3. Proteínas citoplasmáticas asociadas con organelas o sarcómeros • Titin. • Telethonina. • Fukutina. Proteínas situadas en las envolturas nucleares • Lamina. • Emerina.

diando la traducción en cascada de señales del exterior al interior de la célula. Juegan un papel esencial en los mecanismos de defensa celular y regulación del equilibrio entre supervivencia y muerte1. Las células eucariotas tienen una envoltura nuclear que separa el nucleoplasma del citoplasma y organiza las estructuras nucleares. Esta envoltura está constituida por una membrana externa, una interna, poros nucleares complejos y una lámina nuclear. Las membranas interna y externa se funden en los poros nucleares, que traspasan la doble membrana, participando en el transporte molecular entre núcleo y citoplasma. La membrana externa se continúa directamente con el retículo endoplásmico rugoso, que a su vez se comunica con las cisternas y espacio perinuclear, participando en el tráfico de moléculas hacia el aparato de Golgi. En la cara medial de la membrana interna se localiza la lámina nuclear donde se ancla la cromatina (Figura 9.2). En la membrana nuclear interna se han identificado 6 proteínas estructurales: proteína asociada a lamina (LAP1A, LAP1B y LAP2), receptor de lamina-B (LBR), MAN1 (antígeno humano localizado en la envoltura nuclear), emerina y nurina. Las laminas se componen de tres subtipos denominados A, B y C, siendo la lámina A y C variantes por el splicing alternativo de un mismo gen (LMNA). LAP1 y 2 y LBR interactúan con laminas y cromatina; LAP1A y LAP1B se unen a laminaA/C y B1, mientras LAP2 se asocia con lamina B1. La emerina forma con LAP2 y MAN1 una familia de proteínas2. Durante la mitosis las laminas A/C se colocalizan con la emerina, pero no con la lámina B ni LPA2. CLASIFICACIÓN DE LAS DISTROFIAS MUSCULARES Las distrofias musculares (DM) se han clasificado tradicionalmente atendiendo al modo de herencia (ligada al cromosoma X, autosómica dominante o recesiva), preferente distribución de la musculatura afectada (proximal o distal) y la edad de inicio de los síntomas (congénitas, primera infancia, adolescencia, etapa adulta); sin embargo, la marcada heterogeneidad fenotí-

MIOPATÍAS HEREDITARIAS

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Figura 9.1. Esquema del complejo distrofina-glicoproteína.

pica intrafamiliar hace muy difícil obtener una clasificación satisfactoria siguiendo estos parámetros. La eclosión de la biología genética y molecular acaecida en la última década ha permitido identificar las mutaciones patogénicas y las proteínas específicamente modificadas que causan diferentes formas de distrofias musculares. Estos hallazgos han dado lugar a profundos cambios en la categorización de estos desórdenes, a la vez que permiten realizar diagnósticos cada vez más precisos. Actualmente la clasificación de las distrofias musculares se fundamenta sobre criterios eclécticos, donde las nuevas bases moleculares adquieren una importancia considerable.

DISTROFIAS MUSCULARES CONGÉNITAS (DMC) Son un grupo heterogéneo de enfermedades musculares hereditarias, autosómicas recesivas, manifiestas al nacer o en la primera infancia; clínicamente se caracterizan por hipotonía, debilidad muscular y contracturas articulares. Se diferencias de las miopatías congénitas por mostrar un patrón distrófico en el examen patológico, mayor elevación sérica de los niveles de la enzima creatínkinasa (CK) y la frecuente afectación del sistema nervioso central. Se distinguen dos categorías, una sin alteración intelectual ni lesiones del SNC, y otra con retraso mental y cambios cerebrales estructurales.

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Figura 9.2. Núcleo celular.

DMC sin retraso mental En la mitad de los casos con DMC sin defecto intelectual, se ha demostrado una deficiencia de la cadena α2 de la laminina (merosina negativos) en las biopsias musculares, presentando el resto dicha proteína (merosina positivos). La laminina (merosina), se localiza en la lámina basal del músculo estriado y del nervio periférico, y está compuesta por una cadena pesada α2 ensamblada a dos cadenas ligeras β1 y γ1. El gen que codifica la laminina α2 está situado en el cromosoma 6q23. Los pacientes son homocigotos o heterocigotos compuestos, habiendo sido halladas varios tipos de mutaciones (delecciones, inserciones, nonsense y missense), localizados en el dominio G del terminal carboxilo o en el dominio rod-like de la proteína. La severidad de la enfermedad depende de la isoforma de laminina α2 expresada por el gen. Existe una cepa de ratones dy/dy con deficiencia de laminina α2, con una forma de DMC genotípica y fenotípicamente similar a la humana. El grupo humano con deficiencia en merosina es relativamente homogéneo, pero se han descrito casos con defectos parciales de merosina4 y una forma de deficiencia de merosina no ligada al gen de laminina α2, sino a

un marcador en el cromosoma 1q42. En la práctica, el diagnóstico se establece mediante tinciones histoquímicas sobre biopsia muscular. Actualmente es posible el diagnóstico prenatal5. Se han descrito otros casos de DMC sin retraso mental, clínicamente más heterogéneos, pero menos severos, sin deficiencia de merosina y otra forma merosina positiva con rigidez espinal, cuyo locus se sitúa en el cromosoma 1p35-366. DMC con retraso mental y lesiones cerebrales Los principales componentes de esta categoría son el tipo Fukuyama (9q31), que afecta a la población japonesa; la enfermedad músculo-oculo-cerebral, de origen preferentemente finlandés (1p32-34); y la enfermedad de Walter-Warburg de prevalencia caucasiana, con severa afectación visual, microftalmía e hidrocefalia, cuyo gen no ha sido identificado todavía. En otras tres variantes se ha descrito una deficiencia secundaria de merosina. En la enfermedad de Fukuyama se ha identificado una mutación en un gen situado en el cromosoma 9q31, que codifica la proteína fukutina,

MIOPATÍAS HEREDITARIAS

Tabla 9.3.

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Clasificación de las distrofias musculares.

Distrofias musculares congénitas, con signos clínicos desde el nacimiento (DMC) Sin afectación intelectual ni lesiones en el SNC: • Merosina negativas: mutación en el gen de la laminina-α2, 6q2; y 1q42. • Merosina positivas: mutaciones en 1q35-36. Con retraso mental y lesiones en el SNC: • DMC tipo Fukuyama (mutación en el gen de la «fukutina», 9q31). • Enfermedad músculo-óculo-cerebral ( 1p32-34). • Enfermedad de Walker-Warburg. Distrofias con clínica de inicio después del nacimiento Distrofinopatías (ligadas a mutaciones en el cromosoma X): • Distrofia muscular tipo Duchenne. • Distrofia muscular tipo Becker. • Otros fenotipos. DM tipo Emery-Dreifuss: • Ligado al cromosoma X (mutación en el gen de la «emerina»). • Dominante/recesiva (mutaciones en el gen de la «lamina»). Distrofia facio-escápulo-humeral (delección de unidades repetidas de 3,3Kb, en el 95%) Miopatías distróficas de las cinturas pélvica y cleido-escapular (limb-girdle): • Autosómicas recesivas. • Autosómicas dominantes. Miopatías distales Distrofia muscular oculofaríngea (PAB2) Distrofia miotónica

ampliamente detectada en la corteza cerebral y cerebelosa del feto, pero indetectable en los cerebros postnatales, por lo que se piensa que juega un importante papel en el control de la migración neuronal fetal7. La enfermedad de Walker-Warburg es clínicamente difícil de diferenciar de los casos severos de la de Fukuyama, siendo el elemento crucial para su diagnóstico la ausencia de las mutaciones descritas para esta última. DISTROFINOPATÍAS Las distrofinas constituyen una extensa familia de proteínas entre las que se incluyen la distrofina, utrofina o proteína relacionada con distrofina (DRP), distrobrevinas α y β y la proteína relacionada con distrofina-2 (DRP2). La distrofina se asocia, por su región N-terminal, con la proteína citoesquelética actina, por su región Cterminal con la sintrofinas, y por las regiones ri-

cas en cisteína se une a β-distroglicano (ver Figura 9.1). Las deficiencias primarias de distrofina, dan lugar a una deficiencia secundaria de todos los componentes del «complejo distrofinaglicoproteína» y a distintos fenotipos de distrofia muscular1. Las dos distrofias musculares principales asociadas con distrofina son la enfermedad de Duchenne y la distrofia muscular tipo Becker. Los estudios de genética molecular indican que ambas son el resultado de mutaciones dentro del extenso gen que codifica la distrofina. Aproximadamente dos tercios de las mutaciones, en ambas formas, son delecciones o supresiones de uno varios exones del gen. Distrofia muscular tipo Duchenne Es la miopatía más frecuente en la infancia y el desorden hereditario recesivo letal más común, ligado al cromosoma X. La clonación del

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gen de la distrofina y la identificación de su producto proteico han cambiado llamativamente el conocimiento sobre esta enfermedad. Afecta a 1/3.500 de los varones nacidos vivos. La edad de comienzo de los síntomas clínicos es alrededor de los 3 años, aunque la edad media de realización del diagnóstico se sitúa entre los 4-6 años, pasando a depender de silla de ruedas a la edad de 10 años. Un 15% de los pacientes desarrollan insuficiencia cardíaca, siendo una complicación tardía. El fallecimiento acaece sobre los 20 años. El cuadro clínico se caracteriza por debilidad y atrofia progresiva de la musculatura proximal con pseudohipertrofia de pantorrillas. La musculatura bulbar y ocular extrínseca permanecen respetadas. El músculo cardíaco presenta anomalías desde los 6 años de edad, llegando a afectarse en el curso de la enfermedad en el 95% de los pacientes. Las fibras musculares lisas también están comprometidas, manifestándose su disfunción por trastornos gastrointestinales (retraso en la evacuación gástrica, dilatación aguda de estómago, íleo paralítico) y urinarios. El retraso mental en grado moderado es un efecto pleotrópico del

gen del Duchenne, siendo la severidad mayor en aquellos de comienzo clínico más tardío, menor descenso de CK con la edad y mayor excreción urinaria de ciertos aminoácidos. La enfermedad se hereda con carácter recesivo ligada al cromosoma Xp21. Un tercio de los casos son consecuencia de nuevas mutaciones, lo que explicaría su alta prevalencia. Mediante la medida con Western-blot de la proteína sintetizada pueden identificarse el 95% de los portadores, apreciándose con este método que aproximadamente un 16% pueden clasificarse como nuevas mutaciones. Mediante análisis de marcadores de DNA del cromosoma Xq21, se ha demostrado que en la mayoría de los casos la mutación ocurre en el esperma del abuelo paterno. Se han detectado distintos tipos de mutaciones: puntuales (nonsense, frameshift) y grandes delecciones con supresión completa de exones. Actualmente el diagnóstico del Duchenne, en la práctica clínica, se realiza mediante inmunotinción o Western-blot, sobre cortes de biopsias musculares, para poner de manifiesto anomalías de la distrofina (Figura 9.3). El 60% de los pacientes tienen delecciones del gen de la distrofi-

Figura 9.3. Enfermedad de Duchenne, biopsia muscular. A. H&E, fibra muscular necrosada (centro). B. Inmunohistoquímica de distrofina, con ausencia de tinción. C. Distrofina, control. (Cortesía de la Dra. M. García-Villanueva, S. de Anatomía Patológica, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.)

MIOPATÍAS HEREDITARIAS

na, que pueden ser reconocidas, en un 98% de los casos, con PCR múltiple del DNA extraído de muestras de sangre. Las duplicaciones ocurren en un 6% y también pueden ser identificadas desde muestras de sangre. Sin embargo, no se dispone de métodos rutinarios para detectar las pequeñas mutaciones del gen de la distrofina8. Puede hacerse diagnóstico prenatal con células de líquido amniótico o biopsias de «villus coriónico», tanto para detectar a los afectados como, lo que quizás resulta más importante, los que no lo están. Distrofia muscular tipo Becker Afecta a 1/30.000 varones nacidos vivos y es causada habitualmente por formas alélicas con deficiencia moderada de distrofina, consistente en una traslación de distrofina de tamaño o cantidad anormal. Tiene todas las características del Duchenne, pero con un curso más moderado. Normalmente comienza en la primera década, pero en ocasiones los primeros síntomas se retrasan hasta la cuarta década. El patrón muscular y las pseudohipertrofias son superponibles al Duchenne, siendo más acentuadas las contracturas; sin embargo, estos niños mantienen la independencia más allá de los 15 años, pasando a depender de la silla de ruedas a los 20 o más años. Son frecuentes en la adolescencia los dolores y calambres musculares, sobre todo en relación con el ejercicio. En ocasiones, la insuficiencia cardiaca es más severa que la debilidad, habiéndose realizado algún trasplante cardiaco con éxito en estos pacientes. La distrofina no está ausente en el músculo esquelético, como en el Duchenne, sino reducida o anormal, requiriéndose para su diagnóstico una cuantificación mediante estudios con immunoblotting. Otros fenotipos de las distrofinopatías Hay algunas excepciones, generalmente anecdóticas, a los dos fenotipos tradicionales. Morrone et al. (1997)9, han descrito una familia con deficiencia de distrofina en la que los varones

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son asintomáticos. Figarella-Branger et al. (1997)10, describen pacientes con marcada intolerancia al ejercicio, dolor muscular y mioglobinuria con insuficiencia renal. También se han comunicado casos de comienzo muy tardío. DISTROFIA MUSCULAR TIPO EMERY-DREIFUSS La distrofia muscular de Emery-Dreifuss es una condición clínica y genética heterogénea. Típicamente, se caracteriza por inicio en la infancia o primera etapa de la adolescencia, contracturas en codos, tendón de Aquiles y músculos extensores del cuello, asociadas a debilidad y atrofia progresiva de distribución húmero-peroneal. Durante la vida adulta los individuos afectados invariablemente desarrollan bloqueos cardiacos o arritmias severas que requieren la implantación de marcapasos o desfibriladores, ocurriendo con frecuencia dilatación ventricular e insuficiencia cardíaca. Se conocen dos tipos de herencia: La forma más clásica tipo 1 es causada por mutaciones en el gen que codifica la «emerina» (STA), situado en el cromosoma Xq28, una proteína anclada en la membrana nuclear interna, proyectándose dentro del nucleosoma (ver Figura 9.2). La forma autosómica dominante tipo 2 está determinada por la mutación del gen que codifica la «lamina A/C» (LMNA) localizado en el cromosoma 1q11-q13. Las laminas A y C son dos proteínas de la envoltura nuclear, derivadas del splicing alternativo del gen de la LMNA, que están localizadas en la «lámina», una estructura multimérica asociada con la superficie nucleoplásmica de la membrana nuclear interna. Han sido identificadas mutaciones de este gen en 5 familias con un patrón de herencia autosómico dominante, que cumplían los criterios diagnósticos para Emery-Dreifus establecidos por el European Neuromuscular Center. Todos los afectados presentaban afectación cardíaca, incluyendo enfermedad en el sistema de conducción, arritmias ventriculares y cardiomiopatía dilatada, asociada con afectación de la musculatura esquelética, con debilidad y atrofia húmero peroneal, escápula alada, rigidez espinal y contracturas en

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codos y tendón de Aquiles con curso lentamente progresivo11. Varios miembros de una familia francesa mostraban sólo afectación cardíaca, sugiriendo que el espectro fenotípico de esta condición puede ser más amplio que el recogido en la primera descripción. Recientemente se ha descrito una mutación en este mismo gen que origina un cuadro clínico de distrofia muscular de las cinturas (limb-girdle) autosómico dominante tipo 1B; estos dos desórdenes son causados por mutaciones en el mismo gen que originan uno u otro fenotipo en función de las variaciones alélicas12. DISTROFIA FACIO-ESCÁPULO-HUMERAL O ENFERMEDAD DE LANDOUZY Y DEJERINE Es una miopatía autosómica dominante, con una distribución asimétrica inusual, como describe su enunciado. Su incidencia es de aproximadamente 1/20.000 personas de raza caucasiana. Puede causar una severa incapacidad en las primeras etapas de la vida o ser apenas identificable en adultos mayores. La mayoría de los casos sintomáticos se desarrollan durante la segunda década de la vida. En raras ocasiones puede asociar sordera por enfermedad coclear o ceguera por retinopatía exudativa y telangiectasias (síndrome de Coats) y poliposis intestinal. La primera manifestación suele ser dificultad para la elevación de los brazos por encima de la cabeza y las escápulas aladas. La afectación de la musculatura facial incluye a los orbiculares de los ojos y boca y músculos zigomáticos, estando respetadas la musculatura ocular extrínseca, músculos maseteros y musculatura faríngea. La porción inferior del trapecio y los pectorales están invariablemente afectados, pero no el deltoides. Los músculos del brazo se afectan más que los del antebrazo, que aparecen comparativamente pseudohipertróficos (efecto Popeye). La cintura pélvica se afecta tardíamente, pudiendo originar ligera lordosis e inestabilidad pélvica. La debilidad de los músculos pretibiales puede dar lugar a pies caídos con marcha en stepagge. En un elevado número de pacientes se observa un fenómeno común a las lesiones medulares con nivel D10, consistente en la elevación del ombligo al flexionar el cuello

(signo de Beevor). En las biopsias de estos pacientes se aprecian cambios distróficos asociados con una marcada inflamación perivascular. La distrofia facio-escápulo-humeral (DFEH), se produce cuando disminuye el número de las unidades alineadas repetidas, de 3,3 kilobases, denominadas D4Z4, situadas en la región subtelomérica del brazo corto del cromosoma 4 (4q35). Los individuos normales presentan de 10 a 100 repeticiones de este fragmento. Los enfermos con DFEH presentan 10 o menos copias de D4Z4, lo que hace que el fragmento de restricción que se genera por la enzima EcoR1 y se detecta por la sonda p13E-11 mida menos de 38 kb. Este fragmento, que se detecta por Southern-blot en los individuos normales, oscila entre 38 y 300 kilobases, mientras que en los pacientes con DFEH es usualmente menor de 34 kilobases, criterio que se utiliza para establecer el diagnóstico en ausencia de un ligamiento disponible. Fragmentos entre 34-38 kilobases dejan el diagnóstico en un terreno incierto. Los pacientes con fragmentos de dicha longitud se considera que tienen DFEH si presentan clínica compatible. Un 5% de los individuos con DFEH no se pueden detectar por este método posiblemente por translocaciones con otras regiones (por ejemplo, con la región 10q26) o heterogeneidad genética. Las delecciones mayores tienden a causar enfermedad más severa. Mediante la detección del fragmento acortado de DNA mutado es posible hacer el diagnóstico antenatal entre el 95 y 100% de los casos, dependiendo de la naturaleza precisa de la mutación de la DFEH de los padres13. La exacta naturaleza del producto del gen mutado o del gen proximal afectado no se conocen; ni tampoco la patogénesis molecular de la distrofia muscular, desorden coclear o retiniano. Se cree que la delección de este fragmento parece ser responsable de la enfermedad por un mecanismo denominado efecto de variación de posición, demostrado en otras especies, por el cual cambios en la eucromatina y heterocromatina de un locus determinado influye en la expresión de los genes adyacentes. Como la delección de esta región altera la eucromatina y heterocromatina de la región 4q35, se piensa que por este mecanismo influirían en genes próximos, que no presentan ninguna mutación. Se han postulado dos genes

MIOPATÍAS HEREDITARIAS

candidatos a ser afectados por este mecanismo: FISH region gene 1 (FRG1) y β-tubulin 4q (TUB4q). Otras hipótesis son la aparición de expresión de una ORF generada por la delección, con un gen tóxico, o que la longitud normal de repeticiones evite que los genes próximos al telómero dejen de expresarse14. El tratamiento sintomático de las escápulas aladas o el cierre incompleto de los párpados (lagoftalmos), que puede causar queratitis, deben ser contemplados. Igualmente, los exudados retinianos pueden ser susceptibles de fotocoagulación. La prednisona no proporciona beneficio. Un ensayo con Albuterol (un agonista-β2) produce un incremento de la masa muscular del 12%, no obstante su utilidad real está pendiente de confirmación15.

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de herencia y los defectos genéticos específicos, designando a los distintos subtipos, en la mayoría de los casos, por el nombre de la proteína defectuosa identificada y calificando de innominadas a las pendientes de identificar (Tabla 9.4)17. Distrofias musculares tipo limb-girdle autosómicas recesivas Hasta el momento han sido descritos nueve subtipos en los que ha podido mapearse a una localización genética. Siete se describen bajo el nombre del defecto que producen, mientras que otros dos se designan por los acrónimos LGMD2H y LGMD-2I (Limb-Girdle-Muscular-Dystrophy), en espera de que se les otorgue un nombre más específico.

DISTROFIA MUSCULAR DE LAS CINTURAS (LIMB-GIRDLE)

Sarcoglicanopatías

Constituyen una categoría diagnóstica dentro de las distrofias musculares, que tiene como elemento común el fenotipo clínico, caracterizado por debilidad y atrofia muscular progresiva que compromete preferentemente a los músculos de las cinturas crural y/o cleido-escapular y a los músculos proximales de las extremidades, con algunas excepciones. Bajo este patrón clínico común, existe una gran variedad de tipos de herencia, genes responsables, edad de comienzo y curso clínico. Con algunas excepciones, la musculatura bulbar y el corazón suelen estar respetados. La edad de comienzo puede ser variable, pero frecuentemente los primeros síntomas aparecen en el tránsito entre la adolescencia y la vida adulta. En la mayoría de las familias se presentan con carácter autosómico recesivo, pero hay formas hereditarias con patrón autosómico dominante, elemento que puede servir para el diagnóstico diferencial con las distrofinopatías que son recesivas ligadas al cromosoma X16. La variabilidad clínica y genética no permite una clasificación y descripción simple de este tipo de desórdenes. Aún a riesgo de no poder completar algunos vacíos existentes, actualmente parece más apropiado agruparlos atendiendo al tipo

Son el resultado de una mutación en cualquiera de los cuatro genes que codifican los sarcoglicanos (α, β, γ, δ), un complejo proteico heterotetramérico que ayuda a estabilizar la membrana plasmática al citotoesqueleto y proporciona apoyo para la asociación entre la distrofina y los distroglicanos (ver Figura 9.1). Este subtipo representa aproximadamente el 10% de los casos de distrofia de las cinturas de inicio en la adolescencia o en la edad adulta18. Las mutaciones más frecuentes afectan al gen α, localizado en el cromosoma 17q12-q21.33. Las mutaciones en el gen β-sarcoglicano, las segundas más comunes, se localizan en el cromosoma 4q12, habiéndose descrito preferentemente entre la población italiana. La mutación del gen γ-sarcoglicano se localiza en el cromosoma 13q13, causando formas infantiles muy severas que afectan sobre todo a familias gitanas del norte de África. Las mutaciones del gen δ se han descrito en Brasil y se localizan en el cromosoma 5q33. La edad de comienzo y severidad evolutiva está en relación inversa a la presencia de proteína residual. Para las formas con deficiencia completa la edad de comienzo oscila entre 3 y 15 años (media 8,5), necesitando silla de ruedas sobre la

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Tabla 9.4.

Clasificación de la distrofia muscular de las cinturas limb-girdle.

Autosómicas recesivas Sarcoglicanopatías (cuatro genes, α-17-q21, β-4q12, γ-13q13, δ-3q33). Calpainopatías (alteración de la calpaina 3, gen CAPN3,15q15.1-q21.2). Disferlinopatías (alteración de la disferlina, gen DYSF 2p13). Teletoninopatías (alteración en la telethonina, 17q11-12). Innominadas: LGMD2H y LGMD2I. Autosómicas dominantes Tipo 1A (mutación en el gen de la miotilina, 5q31). Tipo 1B (alteración de lamina A/C, 1q11-q21/1q11q23). Caveolinopatías (alteración de la caveolina 3, gen CAV3, 3p25). Tipo 1D (cromosoma 6q23). Tipo 1E (cromosoma 7q) . Miopatía tipo Bethlem (alteración colágeno VI α1 y α2, genes COL6A2 y 3, 21q22.3) (alteración colágeno VI α3, gen COL6A3, 2q37).

mitad de la segunda década. En los casos con deficiencia parcial se manifiestan al final de la adolescencia o en el período inicial de la vida adulta con una evolución más prolongada. Clínicamente, los individuos afectados presentan debilidad y atrofia de músculos proximales, intolerancia para ejercicio y calambres musculares, que pueden dificultar el caminar y correr, asociando a veces hipertrofia de pantorrillas. Los niveles de CK en el suero de estos enfermos, están ligera o moderadamente elevados. El diagnóstico se realiza mediante inmunotinción para sarcoglicanos en la biopsia muscular, que pueden estar reducidos o ausentes, y la realización de un inmunoblotting para distrofina, para descartar portadores de distrofinopatías en los casos normales para sarcoglicanos.

Calpainopatías

Es la más común de las distrofias de las cinturas. Está causada por una mutación genética simple. Las mutaciones tienen lugar en el gen que codifica la calpaina 3 (CAPN3), localizado en el cromosoma 15q15.1-q21.2. Han sido caracterizadas 97 mutaciones. No se conoce la función exacta de la proteína codificada, aunque parece participar en la homeostasis de la fibra muscular. La edad de comienzo es variable con un rango

entre 2 y 40 años, siendo la edad más común entre 4 y 15 años. El cuadro clínico asociado con las calpainopatías incluye dificultad para correr y tendencia a caminar de puntillas, junto con debilidad de la musculatura proximal (cintura cleidoescapular) en extremidades superiores, con escápula alada. Los músculos extensores de cadera y los abductores de los miembros inferiores, suelen estar respetados, apreciándose con frecuencia atrofia de pantorrillas. En el curso de la enfermedad pueden aparecer contracturas y escoliosis. La evolución es variable, estimándose entre 11 y 22 años el tiempo que transcurre entre el inicio de los síntomas y el confinamiento en silla de ruedas. Los niveles de CK en suero son normales o poco elevados. En esta entidad no es posible el diagnóstico por inmunotinción sobre muestras de tejido muscular, ya que la calpaina 3 es muy inestable, siendo necesario recurrir a la testificación directa de la mutación.

Disferlinopatías

Esta miopatía está causada por la mutación del gen DYSF, situado en el cromosoma 2p13, que codifica la disferlina, una proteína presente en las miofibrillas de la membrana plasmática. La mutación de este gen también causa una for-

MIOPATÍAS HEREDITARIAS

ma, poco frecuente, de miopatía distal conocida como Miopatía de Miyoshi, que afecta preferentemente a los músculos de la pantorrilla. Se han identificado 21 mutaciones en el gen de la disferlina, 16 en la que se introduce un codon de parada o mutaciones frameshift que dan lugar a alteraciones en la proteína codificada. Los síntomas se presentan entre los 17 y 23 años. Clínicamente, estos pacientes pueden presentar debilidad en los músculos proximales o distales17. Los niveles de CK en suero suelen ser elevados. En la biopsia muscular, junto al patrón distrófico, suelen observarse infiltrados inflamatorios, que pueden inducir a un diagnóstico erróneo de polimiositis. En aquellos pacientes con polimiositis que se muestran resistentes al tratamiento con esteroides debemos considerar esta alternativa diagnóstica. La investigación directa de la mutación mediante secuenciación es compleja, ya que el gen consta de 55 exones; es preferible utilizar para el diagnóstico rutinario la detección de disferlina mediante test bioquímicos sobre muestras de músculo.

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No nominadas (LGMD2H y LGMD2I)

Estas dos formas de distrofia muscular de las cinturas han sido descritas en la literatura, pero aún no les ha sido asignado un nombre específico, en espera de identificar la proteína codificada. En el subtipo LGMGD2H, la mutación ha sido localizada en el cromosoma 9q31-q32. Se inicia entre los 8 y 27 años, caracterizándose por debilidad de distribución proximal en extremidades inferiores y afectación de los músculos del cuello. La evolución es lentamente progresiva, no precisando de silla de ruedas hasta etapas tardías de la vida21. El subtipo LGMD2I ha sido descrito en una extensa familia consanguínea del norte de África. El gen responsable ha sido localizado en el cromosoma 19q13.3. Las manifestaciones clínicas se inician entre los 2 y los 27 años de edad, con dificultad para caminar e hipertrofia de pantorrillas, pudiendo asociarse más tarde escoliosis y contracturas. Los niveles de CK en suero pueden variar desde valores normales a muy elevados22.

Teletoninopatías Es una variante poco frecuente que sólo ha sido identificada en dos familias brasileñas. Se hereda con carácter autosómico recesivo, causada por mutaciones en un gen localizado dentro de un intervalo de 3 cM en el cromosoma 17q11-12. Este gen codifica una proteína sarcomérica denominada telethonina, que se acumula, junto con la α-actina, en las inmediaciones de la banda Z de las fibras musculares, sugiriendo su participación en el ensamblaje de las miofibrillas20. Los síntomas comienzan en los primeros años de la adolescencia, generalmente con dificultad para caminar, con tropiezos frecuentes por «pies caidos». La debilidad afecta a la musculatura proximal de miembros superiores y proximal y distal en los inferiores. La evolución es progresiva, pasando a depender de la silla de ruedas en un término medio de 18 años. La CK está elevada entre 4 y 17 veces sobre los valores normales y el diagnóstico se basa esencialmente en la ausencia de «telethonina», que se investiga mediante inmunohistoquímica.

Distrofias musculares tipo limb-girdle autosómico dominantes Son muy poco frecuentes. Aunque se han identificado varios genes causales, habitualmente se limitan a una sola familia; son, pues, un ejemplo de las denominadas «enfermedades privadas». Hasta el momento actual se han descrito 6 subtipos.

Tipo 1A (miotilina)

Las mutaciones se producen en el gen que codifica la miotilina, una proteína sarcomérica que se une a la α-actina y se localiza en la banda Z. Ha sido observada en miembros de varias generaciones de una única familia, con una mutación con cambio de sentido (missense). El gen está situado en el cromosoma 5q31. El cuadro clínico se presenta en el inicio de la vida adulta, con una edad media de presentación de 27 años, con de-

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bilidad progresiva de los músculos de las cinturas superior e inferior, pudiendo asociarse disartria, hiporeflexia y engrosamiento del tendón de Aquiles. Se ha apreciado fenómeno de anticipación, con incremento de la severidad de la enfermedad y descenso de la edad de comienzo en cada nueva generación. Los niveles de CK están elevados 1,6-9 veces. La investigación para miotilina, mediante inmunohistoquímica, es normal16.

fenotipos clínicos. La edad de comienzo de los síntomas es de alrededor de los 5 años, con calambres, debilidad proximal en extremidades e hipertrofia de pantorrillas. Los niveles de CK se han encontrado elevados entre 4 y 25 veces sobre los valores normales. La reducción de caveolina 3 en biopsias musculares, mediante inmunotinción, es diagnóstica para la enfermedad23.

Tipo 1D Tipo 1B (lamina A/C)

En los individuos con este subtipo de distrofia se han detectado mutaciones en el gen que codifica la proteína lamina A/C (LMNA), localizado en el cromosoma1q11-q21/1q11-q23, el mismo que causa la forma dominante de la distrofia muscular tipo Emery-Dreifuss, como ya comentamos precedentemente, constituyendo formas alélicas causadas por mutación en un mismo gen. El fenotipo manifestado por estos pacientes es variable, y en aproximadamente la mitad de los casos se inicia en la infancia con debilidad asimétrica de los músculos proximales de las extremidades inferiores; posteriormente pueden asociarse contracturas en los codos y tobillos en algunos casos. No se acompaña de contracturas vertebrales. Un aspecto clave en la clínica de estos pacientes es la presencia de arritmias cardíacas, que pueden llegar a desencadenar episodios sincopales y son causa potencial de muerte súbita. Los niveles de CK en suero son normales o ligeramente elevados12.

Se origina como consecuencia de mutaciones patogénicas localizadas en el cromosoma 6q23. Aparece antes de los 25 años de edad con miocardiopatía dilatada, defectos del sistema de conducción y debilidad de los músculos proximales de las extremidades. Los niveles de CK están elevados entre 2 y 4 veces. Al no estar identificada la proteína alterada, no se dispone de método inmunohistoquímico para su diagnóstico24.

Tipo E

Se conocen dos extensa familias con este subtipo autosómico dominante de distrofia muscular de las cinturas. Se relaciona con una mutación en el cromosoma 7q. Las manifestaciones clínicas se inician en la edad adulta por debilidad proximal en la cuatro extremidades, contracturas, disfagia y anomalía de Pelger-Huet en los leucocitos. Las cifras de CK se han encontrado elevadas entre una y tres veces por encima de las normales. No se dispone de diagnóstico inmunohistoquímico.

Caveolinopatías Miopatía tipo Bethlem

Esta variedad se relaciona con mutaciones en el gen que codifica la caveolina 3 (CAV3), situado en el cromosoma 3p25. Esta proteína forma parte de una familia entre las que se incluyen la caveolina 1 y 2. El papel fisiológico de la caveolina 3 se centra en el transporte de membrana de las fibras musculares. Se localiza en las membranas plasmáticas formando complejos con la distrofina y se asocia con glicoproteínas. Las mutaciones en el gen CAV3 pueden dar lugar a varios

Es el resultado de mutaciones en cualquiera de los tres genes que codifican las unidades alfa del colágeno VI (COL6A1, COLA2 o COL6A3), los dos primeros localizados en el cromosoma 21q22.3 y el tercero en el 2q37. Se piensa que la enfermedad se produce como consecuencia de una reducción del contenido del colágeno VI. Los primeros síntomas aparecen en la primera infancia, con hipotonía, contracturas y debilidad

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MIOPATÍAS HEREDITARIAS

de la musculatura proximal. En algunos casos la madre percibe disminución de los movimientos fetales durante el embarazo. Progresa de forma muy lentamente progresiva. Dos tercios de los pacientes no precisan silla de ruedas hasta la sexta década de la vida25. MIOPATÍAS DISTALES

Tabla 9.5.

Clasificación de las miopatías distales.

Entidades definidas • Miopatía distal de Welander (2p13). • Distrofia muscular tibial de Markesbery-Griggs-Udd (2q24-41). • Miopatía distal de comienzo tardío. • Miopatía distal de Nonaka (9p1-q1). • Miopatía distal de comienzo precoz de Laing (14q). Familias aisladas («enfermedades privadas»)

Genéricamente se definen como desórdenes musculares en los que la debilidad y atrofia predomina en los músculos distales de las extremidades. Esta definición tan amplia permitiría incluir entidades tan diversas y bien caracterizadas como la miositis con cuerpos de inclusión, la distrofia miotónica, los síndromes escápulo-humerales, miopatías congénitas como la nemalínica o el «central core», distrofias de las cinturas como las teletoninopatías, glucogenosis, como los defectos de la enzima desramificante o la deficiencia de la fosforilasa b kinasa, y anomalías en el metabolismo de los lípidos como la miopatía por depósito de lípidos. Se consideran miopatías distales estrictamente a los desórdenes distróficos musculares hereditarios en los que el patrón de afectación muscular, durante la evolución de la enfermedad, está restringido a la porciones acras de las extremidades y que tienen una genética molecular, fisiopatología e histopatología subyacentes características. Las miopatías distales hereditarias son raras, más frecuentes en los países nórdicos, aunque no se conoce su incidencia ni prevalencia real. Una consecuencia de la caracterización molecular de las miopatías distales ha sido que el mismo gen puede ser responsable de diversos fenotipos clínicos. Desde la descripción inicial de Welander en 1951, se han descrito 18 variedades distintas, que pueden agruparse en 4 subtipos, definibles por la forma de herencia, edad de comienzo, cuadro clínico, anatomía patológica y genética molecular (Tabla 9.5)26. La miopatía de Welander se hereda con carácter autosómico dominante, suele comenzar en la quinta década de la vida típicamente con debilidad para la extensión del dedo índice y extensores de muñeca en los miembros superiores, que

• Miopatía de comienzo en la edad adulta • Miopatía distal con pies cavos y arreflexia (19p13) • Miopatía distal con afectación de cuerdas vocales y musculatura faríngea (5q31). • Miopatía distal de comienzo muy tardío. • Miopatía distal de comienzo variable. Nuevos fenotipos • Miopatía distal de comienzo juvenil. • Miopatía distal finlandesa (2p y 2q). • Miopatía distal con fallo respiratorio. Otras formas • Miopatía distal relacionada con desmina (2q35). • Miopatía relacionada con desmina (11q). • Miopatía distal relacionada con desmina y cuerpos sarcoplásmicos. • Miopatía distal oculofaríngea.

lentamente se extiende a otros grupos extensores y flexores, para posteriormente afectar a músculos distales tanto del compartimento anterior como posterior de la extremidades inferiores, comenzando por los extensores del dedo grueso y del pie. Inicialmente puede ser asimétrica. La evolución es lentamente progresiva, permitiendo al paciente continuar su actividad laboral, no reduciendo su esperanza de vida. Los niveles de CK son normales o ligeramente elevados. El patrón electromiográfico es generalmente miopático; sin embargo, se han descrito casos con patrones mixtos que incluían potenciales de fibrilación y descargas pseudomiotónicas, atribuibles a la presencia de neuropatía asintomática de pequeñas fibras. En la biopsia muscular aparece un patrón distrófico típico, y en una minoría de las células, vacuolas con bordes delimitados y filamentos nucleares y citoplásmicos, de 15-19 nm, vistos con el microscopio electrónico. Esta mio-

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

patía ha sido relacionada con mutaciones en el cromosoma 2q13, cercana al locus de la miopatía de Miyoshi y la LGMD2B, aunque sin relación con el gen de la disferlina. La distrofia muscular tibial de MarkesberyGriggs-Udd, ha sido descrita en familias inglesas, francesas y finlandesas. Comienza después de los 40 años, siendo los músculos inicialmente afectados los del compartimento anterior de las piernas, extendiéndose después la debilidad a la musculatura más próxima. Las extremidades superiores no suelen afectarse. La progresión es más rápida que la observada en los pacientes con la forma de Welander. La CK es normal o ligeramente elevada. Con resonancia magnética se detecta degeneración grasa que afecta selectivamente a los músculos del compartimiento tibial anterior. El patrón histopatológico es distrófico y la presencia de vacuolas anilladas en el músculo conspicua, aunque no en todos los casos. Con microscopía electrónica se aprecian datos característicos de miopatía miofibrilar (focos de disrupción y fragmentación miofibrilar, cuerpos-Z, masas miofibrilares, etc.). Las inmunotinciones para desmina, distrofina, lamininas, espectrina, tau y β-amiloide, son negativas. El patrón de herencia es también autosomal dominante, habiéndose encontrado indicios que sitúan la mutación en algún lugar del cromosoma 2q31. La miopatía distal de comienzo precoz de Laing ha sido descrita en una familia de origen galés, con miembros afectos en cuatro generaciones. La debilidad se inicia por los músculos del compartimiento anterior de las piernas y los flexores del cuello, afectando después a los extensores de los dedos y ocasionalmente a la cintura cleido-escapular. Los síntomas aparecen entre los 3 y 25 años, progresando muy lentamente. La CK suele estar unas tres veces por encima de los valores normales. El músculo muestra cambios distróficos moderados, sin vacuolas. Se hereda con un patrón autosómico dominante y, a diferencia de las formas anteriormente descritas, el ligamiento genético se relaciona con el cromosoma 14q11. La miopatía distal de Nonaka, ha sido descrita en Japón, pero es una entidad ampliamente reconocida en los países occidentales. La debilidad se inicia a una edad media de 26 años, con un

rango entre 0 y 41 años, con debilidad para la extensión del dedo grueso y dorsiflexión del pie, ocasionando pies caídos con marcha en stepagge. La musculatura distal de las extremidades superiores puede llegar a afectarse, pero más levemente que las inferiores. Con la progresión de la enfermedad pueden comprometerse la musculatura proximal y los flexores del cuello, permaneciendo el cuádriceps relativamente respetado. La mayoría de los pacientes dependen de una silla de ruedas a los 10-15 años del comienzo de los síntomas. La CK está típicamente elevada. La resonancia magnética muestra remplazamiento graso. La biopsia muscular muestra un cuadro de distrofia muscular con prominentes vacuolas. Las vacuolas contienen un material granular basófilo, con actividad de fosfatasa ácida. El microscopio electrónico revela elementos de miopatía fibrilar. Estos patrones son superponibles a los casos descritos como «miopatía vacuolar respetando el cuádriceps» y «miopatía familiar con cuerpos de inclusión». Se hereda con un patrón autosómico recesivo, ligándose el trastorno genético con el cromosoma 9p1-q1. Miopatía distal con pies cavos y arreflexia, ha sido descrita por Servidei et al. (1999)27, a propósito de una familia. La debilidad se inicia entre los 15 y los 50 años, por los grupos musculares anteriores y posteriores de las piernas, asociándose disfonía y disfagia. Es común la presencia de anomalías esqueléticas como pies cavos. El curso evolutivo es muy variable. La CK está elevada entre 2 y 6 veces y en el músculo se aprecia un patrón distrófico con vacuolas de contenido basófilo. Se hereda con carácter autosómico dominante ligado al cromosoma 19q13. Miopatía distal con afectación de cuerdas vocales y faringe, en los miembros afectados de esta familia descrita por Feit et al. (1998)28, con sintomatología de inicio tardío entre 35 y 60 años, con debilidad asimétrica en los segmentos distales de las extremidades inferiores y musculatura de la mano, junto con disfagia, y con un curso moderadamente progresivo. Los niveles de CK son variables oscilando desde normal a elevaciones por encima de ocho veces. La biopsia muestra vacuolas. Se hereda con carácter autosómico dominante, ligada al cromosoma 5q-31.

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MIOPATÍAS HEREDITARIAS

Se están describiendo nuevos fenotipos, en familias con herencia autosómica dominante, como el de inicio juvenil y afectación de la musculatura anterior de las piernas, descrito por Zimprich et al. (2000)29, en Austria, o la familia inglesa con insuficiencia respiratoria, comunicada recientemente por Chinnery et al. (2001)30, etc., en las que el defecto genético, no ha sido localizado todavía. Se necesita conocer mejor los mecanismos genéticos y epigenéticos que determinan la distribución de la debilidad muscular y los patrones de pérdidas de miofibrillas. Algunas miopatías proximales con genética y bioquímica molecular bien definidas pueden presentar variantes con debilidad distal y una misma mutación genética puede causar distintos fenotipos clínicos. En el futuro, con el esclarecimiento definitivo de las bases moleculares, el concepto de miopatía distal pudiera quedar obsoleto.

Tabla 9.6.

Clasificación de las miotonías.

Enfermedades de los canales iónicos del músculo Enfermedades de los canales de cloro (7q35) Miotonía tipo Thomsen autosómica dominante Miotonía tipo Becker autosómica recesiva Enfermedades de los canales de sodio (SCN4A) Parálisis periódicas hiper o normokalémicas Paramiotonía congénita Miotonía de los canales de sodio (miotonía agravada por potasio) Miotonía fluctuante Miotonía con respuesta a acetazolamida Distrofias miotónicas multisistémicas hereditarias Distrofia miotónica tipo 1 (DM1 o Steiner clásico) ligadas a 19q13.3 Distrofia miotónica tipo 2 (DM2) ligadas a mutaciones en 3q21.3 Miopatía miotónica proximal (PROMM) Distrofia miotónica proximal con sordera (PDM) Familia de Minnesota con debilidad distal Distrofias miotónicas multisistémicas no ligadas a estos cromosomas

DISTROFIA MIOTÓNICA Genéricamente, los desórdenes miotónicos son condiciones hereditarias heterogéneas del tejido muscular que comparten o tienen de común la dificultad o enlentecimiento para la relajación debidas a descargas espontáneas. La reciente caracterización genético-molecular de los desórdenes miotónicos y de las parálisis periódicas ha permitido clarificar su clasificación y facilitar la correlación de distintos fenotipos con defectos moleculares específicos. Actualmente, las miotonías hereditarias se clasifican dentro de dos grandes grupos: los desórdenes de los canales iónicos del músculo y las distrofias miotónicas multisistémicas con herencia dominante (Tabla 9.6). Las distrofias miotónicas multisistémicas autosómicas dominantes incluyen, junto a la dificultad para la relajación (fenómeno miotónico), un patrón histopatológico con cambios distróficos. De acuerdo con la nomenclatura aprobada por la Organización para el Genoma Humano, se las clasifica en dos grandes grupos en función de la localización de la mutación. Se denomina DM1 a las formas causadas por mutaciones situadas en el cromosoma 19q13.3 y DM2 para las familias cuyas mutaciones se localizan en el cro-

mosoma 3q21.3, proponiendo utilizar las denominaciones DM3, DM4, etc., para futuras nuevas mutaciones. Dentro del grupo DM2, se distinguen tres fenotipos clínicos, probablemente en relación con variaciones alélicas. Hay familias en las que no han podido demostrarse alteraciones en ninguno de los cromosomas antedichos, por lo que cabe esperar el descubrimiento de nuevas mutaciones. Distrofia miotónica tipo 1. Enfermedad de Steiner Es un desorden autosómico dominante con una gran variabilidad de manifestaciones clínicas que oscilan desde miotonía asintomática con cataratas y ligera debilidad, hasta formas congénitas severas con hipotonía, disfagia, insuficiencia respiratoria y retraso mental. La DM1 habitualmente afecta a tejidos específicos, como la musculatura facial y distal de las extremidades con debilidad y atrofia, músculo liso gastrointestinal y uterino, sistema de conducción cardiaco, sistema endocrino con disfunción de gonadotropinas

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

y hormona del crecimiento y resistencia a la insulina, sistema nervioso con deterioro cognitivo y afectación ocular con catarata capsular posterior31. Esta enfermedad es causada por una expansión inestable de trinucleótidos repetidos que contienen citosina-timidina-guanidina (CTG)n, localizada en la región 3’ no traducida del cromosoma 19q13.3. Este gen codifica una kinasa serina-treonina (myotonic dystrophy protein kinase; MDPK), que regula varios procesos intracelulares mediante reacciones de fosforilación y desfosforilación. En esta enfermedad se produce el fenómeno de «anticipación», que consiste en que la edad de comienzo es cada vez más precoz para la siguiente generación y la sintomatología más severa. Este fenómeno se explica genéticamente por la expansión repetida inestable de CTG, cuya extensión es mayor para cada generación al nacer. Este hecho explica también la circunstancia de que todos los casos de distrofia muscular congénita son transmitidos por vía materna, ya que los oocitos maternos permanecen viables incluso cuando la expansión inestable ha alcanzado varios cientos de repeticiones, mientras que el gameto masculino con elevadas repeticiones es inviable o no fertilizante. Aunque la tendencia a la progresión de la expansión en sucesivas generaciones es la norma, existen observaciones con el fenómeno opuesto, con acortamiento de la longitud de la expansión repetida. El diagnóstico formal de la distrofia miotónica tipo 1 incluye cuatro pruebas primarias y dos secundarias (Tabla 9.7). El diagnóstico genético se realiza por la identificación de una elongación anormal de CTG repetidos en el cromosoma 19q13.3. El rango normal es de 5-37 repeticiones de CTG, pero en los pacientes con DM1 puede haber 50-2.000 repeticiones. En general, hay una fuerte correlación entre el grado de expansión y la severidad de las manifestaciones clínicas. Sin embargo, estudios recientes han evaluado la relación entre la longitud de CTGn repetidos en leucocitos y el comienzo de la clínica, hallando sólo una significativa correlación con expansiones relativamente pequeñas32. El análisis del DNA en leucocitos permite también identificar el riesgo de padecer la enfer-

Tabla 9.7.

Diagnóstico de la DM.

Pruebas principales para el diagnóstico de la DM1 • Tests para valorar el alargamiento anormal de (CTG) repetidos en 19q13.3. • Examen clínico directo para sistematizar afectaciones musculares y sistémicas. • Estudios electromiográficos para detectar miotonía subclínica. • Examen con lámpara de hendidura para detectar cataratas características. Pruebas secundarias para el diagnóstico de la DM1 • Medida de CK en suero (moderadamente elevada). • Biopsia muscular (patrón distrófico), sólo en casos seleccionados.

medad en otros miembros asintomáticos de la familia, con el consiguiente impacto para el consejo genético y la monitorización anticipada para detectar precozmente trastornos de conducción cardiaca, cataratas, alteraciones endocrinas o prevenir riegos anestésicos (apnea de comienzo retrasado) o hemorragia posparto. El tratamiento activo se limita al control sintomático de la miotonía, donde la mexiletina (400-600 mg) y la tocainida (1.200 mg) han demostrado más eficacia que la fenitoina y disopiramida. Distrofia miotónica tipo 2. Miopatía miotónica proximal (PROMM) Es un desorden hereditario multisistémico similar a la DM1. En cuadro clínico incluye herencia autosómica dominante, debilidad en la musculatura proximal, miotonía, cataratas y un tamaño normal de repeticiones CTG en el gen de la DM1. Los síntomas usualmente aparecen entre los 30 y 40 años de edad, no habiendo sido descritas formas infantiles ni congénitas. En octubre de 1997, el grupo europeo de enfermedades neuromusculares estableció unos criterios diagnósticos para distinguir el PROMM de otros desórdenes miotónicos (Tabla 9.8)33. Aunque no se han descrito formas congénitas de PROMM, sí se han observado niños con retra-

MIOPATÍAS HEREDITARIAS

Tabla 9.8. Criterios diagnósticos de la miopatía miotónica. Criterios de inclusión • • • • •

Debilidad predominantemente proximal. Herencia autosómica dominante. Repetición de CTG en gen de DM1 de tamaño normal. Miotonía en registro electromiográfico. Catarata capsular posterior semejante a la de DM1.

Datos de apoyo • Dolor muscular, temblor, debilidad fluctuante, rigidez, pseudohipertrofia de pantorrillas. • Hipogonadismo primario, Diabetes Mellitus asociada a resistencia a la insulina, hipotiroidismo, calvicie frontal. • Defectos de conducción cardiaca. • Sordera neurosensorial. • Deterioro cognitivo, hipersomnolencia, crisis. • Disfagia, estreñimiento. • Fasciculaciones intermitentes, hiperhidrosis, calambres dolorosos, con preservación de reflejos tendinosos profundos. Criterios de exclusión • Oftalmoplegia. • Debilidad predominantemente distal. • Presencia de atrofia desde el inicio de la enfermedad.

so mental. Alrededor del 15% de los pacientes tienen sintomatología neurológica (crisis, somnolencia, cuadros extrapiramidales, etc.), con alteraciones de la sustancia blanca en la resonancia magnetica cerebral. Los defectos cognitivos comprometen sobre todo a las funciones visioespaciales, correlacionándose con reducciones en el flujo cerebral regional, según se desprende de los datos proporcionados por la PET (tomografía de emisión de positrones). Un 7% presentan alteraciones del ritmo cardiaco (bradicardia sinusal, bigeminismo, taquicardia ventricular monomorfa, etc.). El hipogonadismo ha sido hallado en el 10% de los enfermos y de forma esporádica hipotiroidismo y resistencia a la insulina. Distrofia miotónina tipo 2. Familia de Minnesota Day et al. (1999)34 han descrito las características clínicas y genéticas de una familia, con una

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forma inusual de distrofia miotónica, seguida a lo largo de 5 generaciones. Las características clínicas de los miembros afectados fueron similares a las de la DM1, incluyendo miotonía, debilidad y atrofia distales, frente despejada, cataratas capsulares, infertilidad y arritmias cardiacas; sin embargo, el análisis genético no reveló alteraciones en la región correspondiente del cromosoma 19 ni en los que contienen los genes de los canales de sodio y cloro del músculo. La alteración genética de esta familia se ha ligado a marcadores en una región de 10 centimorgan situada en el cromosoma 3q. Esta familia comparte muchos de los datos descritos para el PROMM, pero se distingue por la significativa afectación de los músculos distales y la presencia de arritmias cardiacas severas. Distrofia miotónica tipo 2. Distrofia miotónica proximal (PDM) Ha sido descrita en una familia finlandesa seguida durante 4 generaciones35. Consiste en un desorden multisistémico autosómico dominante, caracterizado por distrofia muscular proximal de comienzo tardío, miotonía, cataratas, sordera e hipogonadismo en varones. En la familia inicial se descartó la existencia de anomalías relacionadas con el cromosoma 19q13.3, sin llegar a otra conclusión; no obstante, recientemente se ha descrito otra familia, de características superponibles, en la que la anormalidad genética está ligada al cromosoma 3q. Se piensa que tanto esta familia, como la descrita en Minnesota, podrían representar formas alélicas del PROMM.

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C APÍTULO

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Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth M. Lousa Gayoso

INTRODUCCIÓN HISTÓRICA La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) referida también como «atrofia muscular tipo peroneal» fue descrita en 1886, simultáneamente, por Charcot y Marie en Francia1,2 y por Tooth en el Reino Unido3. Poco tiempo después, los franceses Dejerine y Sottas, describen casos de una neuropatía hereditaria, cuya principal característica es la presencia de cambios morfológicos en los nervios periféricos, consistentes en una neuropatía hipertrófica intersticial en la cual las fibras nerviosas están rodeadas por una proliferación concéntrica de células, semejando el corte transversal de una cebolla, por lo que se conoce esta proliferación como «bulbo de cebolla». Inicialmente, esta neuropatía fue reconocida como una entidad específica nominada Enfermedad de Dejerine-Sottas o neuropatía hipertrófica hereditaria, en la que los nervios periféricos están marcadamente hipertrofiados; actualmente pertenece a la enfermedad de CMT tipo 3. La descripción clínica realizada por Charcot, Marie y Tooth se refería a una enfermedad hereditaria con debilidad distal en los miembros, preferencia en las extremidades inferiores (por eso

fue también conocida como «atrofia muscular peroneal»), de inicio en la niñez y en la adolescencia, asociada a deformidades en los pies, arreflexia, pérdida sensorial distal y de evolución lentamente progresiva. En 1968 Dyck y Lambert introducen los estudios de la conducción nerviosa, dando lugar a un mayor conocimiento de los procesos patológicos en los nervios periféricos, aportando criterios neurofisiológicos a la clasificación de la enfermedad de CMT. Desde entonces la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth es conocida también como una «Neuropatía Hereditaria Sensitivo Motora» (NHSM) y se hace referencia a dos grupos basándose en las velocidades de conducción de los nervios periféricos. El primer grupo NHSM I (desmielinizante), está caracterizado por unas velocidades de conducción nerviosas muy reducidas y en la biopsia del nervio periférico por la presencia de «bulbos de cebolla». El segundo grupo NHSM II (neuronal), se caracteriza por velocidades de conducción de nervios periféricos normales o moderadamente reducidas y en la biopsia del nervio periférico por la pérdida de axones con mínimos fenómenos de desmielinización. Estos dos grupos son genéticamente hete117

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

rogéneos con patrones hereditarios autosomal dominantes y recesivos, identificándose posteriormente un patrón hereditario ligado al cromosoma X (Tabla 10.1). La enfermedad de CharcotMarie-Tooth no es rara, afortunadamente la mayoría de estos pacientes pueden deambular y llevar una vida activa y productiva. Actualmente se acepta que la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, también conocida como Neuropatía Hereditaria Sensitiva Motora, es un grupo, clínica y genéticamente heterogéneo de neuropatías periféricas hereditarias, caracterizado por debilidad distal, atrofia, pérdida sensitiva e hiporeflexia. Es una de las enfermedades neurológicas degenerativas más comunes. La clasificación actual se basa en las características clínicas, neurofisiológicas (se distinguen dos tipos, si afecta primariamente a la mielina (CMT 1) o al axón (CMT 2)), así como en relación con las lesiones patológicas y patrón genético de la enfermedad. Así, según el patrón de herencia y estudios genéticos se han identificado mutaciones en varios genes de la mielina periférica: proteína periférica de mielina 22 (PMP22)4, proteína cero de mielina (P0)5, proteína de respuesta de crecimiento precoz 2 (EGR2)6,7, proteína relacionada con la miotubularina 2 (MTMR2)8, proteína del neurofilamento ligero (NEFL)9,10,11, gen regulador de la corriente del N-myc (NDRG1)12, proteína asociada a la diferenciación inducida por gangliósidos (GDAP1)13,14 y en relación con el cromosoma X, la conexina 32 (Cx32) (Tabla 10.1). La identificación de nuevos loci y distintos genes hacen que su clasificación esté en continua expansión. Los tratamientos empleados en esta enfermedad consisten en tratamientos sintomáticos15 ortopédicos-quirúrgicos para corregir sus alteraciones óseas-articulares-musculares16-18. Se realizan también ensayos con corticoides17 y tratamientos genéticos en animales de experimentación19,20.

nos y síntomas clínicos suelen variar entre las diferentes familias y también dentro de la misma familia, incluyendo a los gemelos homocigotos. Los síntomas pueden diferir desde una debilidad y atrofia severa de los músculos de las piernas y de las manos junto con deformidades óseas, a síntomas moderados o incluso a la ausencia de los mismos21. Los pacientes asintomáticos tienen una exploración neurológica normal, pero están alterados los estudios neurofisiológicos y análisis de DNA. La forma más frecuente de esta enfermedad es la CMT 1A. Herencia La enfermedad de CMT es un clásico ejemplo de «heterogeneidad genética»; esta se define como el fenómeno de mutaciones independientes, a nivel de diferentes genes (generalmente en distintos cromosomas) dando lugar a fenotipos o manifestaciones clínicas idénticas. En la NHSM tipo 1 la herencia puede ser: autosomal dominante (76% de los casos), recesiva, ligada al cromosoma X (dominante y recesiva) y puede haber casos esporádicos por nuevas mutaciones. En la NHSM II las formas de herencia pueden ser autosomal dominante o recesiva22. Prevalencia Las neuropatías hereditarias tienen una prevalencia entre 20-40 pacientes por cada 100.000 habitantes23,24,25: CMT tipo 1: 15 por 100.000. CMT tipo 1A: 10,5 por 100.000. CMT tipo 2: 7 por 100.000. Motivo de consulta

MANIFESTACIONES CLÍNICAS Introducción Las manifestaciones clínicas, así como las características genéticas son heterogéneas. Los sig-

Los pacientes con mayor afectación suelen consultar por presentar: alteraciones en la marcha, caídas frecuentes, torpeza para su movilidad y deformidades en los pies26. Otros pacientes son enviados al neurólogo por presentar velocidades de conducción en los nervios periféricos anómalas. Una vez

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ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

Tabla 10.1. CMT (Charcot-Marie-Tooth), NHSM (neuropatía hereditaria sensitivo motora), NHPP (neuropatía hereditaria por parálisis por presión), AD (herencia dominante), AR (herencia recesiva), X (herencia ligada al cromosoma X), HC (hipomielinizante congénita), PMP22 (proteína periférica de mielina 22), P0 (proteína cero de mielina), Cx32 (conexina 32), NEFL (neurofilamento Ligero), EGR2 (gen de respuesta de crecimiento precoz 2), MTMR2 (proteína relacionada con la miotubularina 2), NDRG1 (gen regulador de la corriente N-myc 1) y GDAP1 (proteina asocida a la diferenciación inducida por los gangliósidos), KIF1 B (kinesina), PRX (L-periaxina), SOX10 (SRY-BOX 10). Tipos de CMT

Herencia

Cromosoma/locus

Gen

Mecanismo

DESMIELINIZANTES o NHSM I CMT 1 A AD CMT 1 B AD CMT 1 C AD CMT X X NHPP AD

17p11.2-12 1q22-q23 Desconocido Xq13.1 17p11.2-12

PMP22 P0 Desconocido Cx32 PMP22

Duplicación Mutación puntual

AXONALES o NHSM II CMT 2 A CMT 2 B CMT 2 C CMT 2 D CMT 2 E

1p35-p36 3q13-q22 Desconocido 7p14 8p21

KIF1 B Desconocido Desconocido Desconocido NEFL

Mutación puntual

CMT DESMIELINIZANTE tipo 3 o NHSM III ( Dejerine-Sottas) CMT 3 AD(AR) 17p11.2-12 AD(AR) 1q22-23 AD 10q21-q21

PMP22 P0 EGR2

Mutación puntual Mutación puntual Mutación puntual

CMT DESMIELINIZANTE tipo 4 CMT 4 A AR CMT 4 B1 AR CMT 4B2 AR CMT 4 C AR CMT 4 D-Lom AR CMT 4 E AR CMT 4 R-Russe AR CMT 4 F AR

8q13-21. 11q22 11p15 5q23-33 8q24 10q21-22 10q23.2 19q13.

GDAP1 MTMR2 Desconocido Desconocido NDRG1 EGR2 Desconocido PRX

Mutación puntual Delección/inserc.

HIPOMIELINIZANTES CONGÉNITAS HC (CMT 4E) AD (AR) HC AD HC AD HC AD

10q21q-22 1q2223 17p11.2 22q13

EGR2 P0 PMP22 SOX10

AD AD AD AD AD

confirmado el diagnóstico clínico de un paciente conviene realizar un estudio familiar para diagnosticar nuevos casos y realizar el estudio genético, pudiendo establecer, así, el tratamiento ortopédicoquirúrgico y el consejo genético adecuado. Edad de comienzo La enfermedad suele manifestarse entre los 12 y 19 años. El comienzo suele ser insidioso du-

Mutación puntual Delección

Mutación puntual

Mutación puntual Mutación puntual Mutación puntual Mutación puntual Mutación puntual Mutación puntual Mutación puntual

rante varios años, con curso lentamente progresivo, pudiendo haber pacientes que nunca lleguen a identificar el inicio de su enfermedad. Los síntomas aparecen más frecuentemente en la primera y al inicio de la segunda década y a menudo son precedidos por un ligero retraso en el desarrollo. El caminar de puntillas en la niñez, a menudo, es la primera manifestación de la enfermedad. El paciente diagnosticado en la segunda o tercera década suele referir torpeza motora, di-

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

ficultad para correr y para la actividad física anormal comparada con la de sus compañeros. Algunos pacientes adultos antes del diagnóstico fueron sometidos a técnicas quirúrgicas-ortopedicas para corrección de las deformidades de sus pies. La penetrancia del fenotipo clínico es baja en la primera década pero se incrementa con la edad aunque la penetrancia es independiente de las alteraciones electrofisiológicas. Las posibilidades de que un paciente manifieste sus primeros síntomas después de la tercera década son muy escasas. Síntomas La principal queja son los frecuentes tropiezos del paciente al caminar, debido a sus pies caidos, con repetidas torceduras de tobillos por presentar debilidad para la dorsiflexión y eversión de los pies causada por atrofia de los músculos tibiales anteriores27. Los pacientes mayores frecuente-

Tabla 10.2. Causas de polineuropatías hereditarias. CMT Neuropatías hereditarias sensitivas y autonómicas Plexopatía braquial Neuropatía axonal gigante Amiloidosis S. de Chediak-Higashi Trastornos en la reparación del DNA Ataxia telangectasia Síndrome de Cockayne Xeroderma pigmentoso Ataxia de Friedreich Miopatías mitocondriales Enfermedades perixosomales Acumulación de ácido fitánico Xantomatosis cerebrotendinosa Porfirias Trastornos del metabolismo de las vitaminas E y B12 Leucodistrofias Metacromática De células globoides Adrenoleucomieloneuropatía Deficiencia de lipoproteínas Abetalipoproteína Enfermedad de Tangier

mente se quejan de dificultad para encontrar zapatos adecuados para sus pies deformados y con callos dolorosos en la cabeza dorsal de los metatarsos de los pies. Las úlceras por presión son raras. Los calambres en las piernas son habituales, principalmente después de largas caminatas28. Los calambres en las manos se presentan en los niños después de realizar largos periodos de ejercicios con las mismas, como escribir; lo mismo ocurre en los pacientes adultos cuando emplean de forma continuada sus manos28. El dolor de espalda, habitualmente se manifiesta con más frecuencia en los pacientes que presentan una marcha incorrecta por sobrecarga sobre los músculos paraespinosos. La queja más frecuente en relación con las manos es la dificultad para abotonar o desabotonar, manejar cremalleras y manipulación de pequeños objetos cuando se precisan movimientos finos de los dedos y también en el uso de utensilios (tenazas, tenedores, cucharas, cuchillos, lápices...). En las piernas suele haber menor tolerancia al frío, excesiva frialdad y cambios tróficos como pérdida del vello, edema y pérdida de coloración en la piel. Con menos frecuencia hay disminución de la temperatura en los músculos de las piernas, debida quizás a pérdida de masa muscular. En ocasiones la debilidad de la musculatura proximal de las piernas puede dificultar la deambulación y precisar silla de ruedas. Es extremadamente rara la dificultad respiratoria, aunque se debilite la musculatura axial. Hay correlación entre el grado de severidad, las velocidades de conducción y la edad de inicio de la clínica29. Marcha Las alteraciones de la marcha están directamente relacionadas con el grado de debilidad muscular y con las deformidades esqueléticas de los pies. Al principio el paciente camina con los pies en dorsiflexión y es incapaz de caminar sobre sus talones. Cuando la enfermedad progresa y los músculos tibiales anteriores se debilitan, los pies se caen a cada paso y el paciente es forzado a elevar las rodillas llevando los pies y dedos hacia arriba para no tropezar

ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

sobre los objetos (marcha en stepagge). El rápido descenso de los pies sobre el suelo al caminar produce un ruido característico de «palmada». Debilidad, atrofia y reflejos musculares La debilidad muscular afecta principalmente a la musculatura distal y se manifiesta en la marcha y en el manejo de los dedos de las manos. Esta debilidad se inicia en los músculos intrínsecos de los pies y asciende afectando a los músculos tibiales anteriores. Posteriormente, la parte distal de los gastronecmius y la porción distal de los músculos cuádriceps se debilitan. Así, los músculos de las piernas se atrofian y dan lugar a la apariencia de «piernas de cigüeña» o piernas de «botellas de champán invertidas». Sin embargo, la grasa subcutánea puede enmascarar la atrofia principalmente en las mujeres. La debilidad y la atrofia en los músculos de las manos tiene lugar en la fase tardía de la enfermedad, sin relación con la edad del paciente. La debilidad de los músculos de la eminencia tenar da lugar a una «mano de simio» por rotación del pulgar. La «mano en garra» se debe a la atrofia de la musculatura interósea, con semiflexión de los dedos de todas las articulaciones. Los reflejos musculares pueden ser normales al principio; luego la arreflexia se inicia por los talones, la rótula y finalmente en los miembros superiores.

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Hipertrofia de nervios En un 20-25% de los pacientes se pueden palpar nervios superficiales engrosados. Esta hipertrofia no está en relación con la edad ni con la severidad de los síntomas. Los más frecuentes son el nervio auricular en la zona lateral del cuello, el cubital sobre el canal cubital y el nervio peroneal cerca de la cabeza del peroné31,32. Alteraciones óseas Los pies cavos se caracterizan por pies cortos con arco anormalmente alto, pueden manifestarse en la primera década y están ausentes en algunos casos (Figura 10.1). Esta forma del pie se produce por atrofia y debilidad de la musculatura intrínseca del pie y ausencia de oposición de los músculos flexores y extensores. También se asocia una flexión plantar y una rotación interna del pie. En los casos avanzados hay una flexión de los dedos dando lugar a los dedos en martillo. En un 20% de los casos hay escoliosis moderada con progresión lenta. La cifosis juvenil es muy característica de la enfermedad de CMT. También puede existir displasia de cadera acompañada de dolor y cojera33.

Disfunción sensitiva y autonómica Los síntomas sensitivos raramente son referidos por el paciente; en casi todos los pacientes se encuentra una disminución de la sensibilidad distal en las piernas «en calcetín», con la sensibilidad posicional preservada y la vibratoria disminuida. Los miembros superiores no se afectan. Hay intolerancia al frío30 y disminución de la temperatura en las piernas; en casos avanzados y por deformidades en los pies se pueden presentar úlceras en los puntos de presión.

Figura 10.1. Pie cavo y dedos en martillo en un paciente con la duplicación 17p11.2.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

La función respiratoria no se afecta, ni el temblor acompaña a esta enfermedad, salvo en la forma de Roussy-Levy. Exploración física general No hay alteraciones asociadas a nivel de otros órganos ni sistemas. Curso y evolución La enfermedad de CMT es un proceso lentamente progresivo, estando su severidad en relación con el tiempo de evolución. En la tercera década la expresión clínica es completa. Correlación fenotipo-genotipo La mayoría de los pacientes con la enfermedad de CMT o NHSM habitualmente tienen los mismos síntomas clínicos. Las manifestaciones clínicas correspondientes a los tipos CMT 1A, CMT 1B y CMT 1C son idénticas. La CMT 1 tiene una herencia autosomal dominante, la CMT 1B es más severa que la CMT 1A. El tipo CMT X1 es dominante ligada al cromosoma X y los varones están mas afectados que las mujeres. En la forma recesiva ligada al cromosoma X, la CMT X2, las mujeres portadoras asintomáticas la transmiten a sus hijos. Hay diferencias importantes entre la CMT 1 y la CMT 2. En la forma autosomal dominante de CMT 2 los síntomas comienzan en la segunda década, y en ocasiones lo hacen en la sexta. La enfermedad de Dejerine-Sottas o CMT 3 es una neuropatía hipertrófica preferentemente autosómica recesiva, de inicio en la infancia con retraso en el desarrollo motor y marcha anormal. Se acompaña de estatura corta, labios anómalos y rasgos faciales toscos, de progresión lenta, precisando el paciente silla de ruedas en la segunda década34,35,36. Algunos casos de CMT tienen otras manifestaciones clínicas asociadas como paraparesia espástica, sordera37-39, atrofia óptica40, rasgos del síndrome de Marfan41 y ausencia de cejas.

ESTUDIOS NEUROFISIOLÓGICOS EN LA ENFERMEDAD DE CHARCOTMARIE-TOOTH El registro de la conducción nerviosa es una parte integral en el estudio de cualquier neuropatía42. Este tipo de estudios se emplea para establecer el diagnóstico de la enfermedad de CMT o Neuropatía Hereditaria Sensitivo Motora, también para los estudios familiares, así como para la clasificación de los distintos tipos de neuropatía (desmielinizante o axonal), pronóstico y grados de severidad26,43,44. Estas técnicas electrodiagnósticas consisten en el registro de señales bioeléctricas procedentes de los nervios sensitivos, motores y del músculo y se emplean para la interpretación de la patología subyacente. En las velocidades de conducción nerviosas (sensitivas y motoras), el nervio se estimula con una descarga eléctrica a través de la piel, dando lugar a un potencial eléctrico que se puede registrar a cierta distancia del lugar del estímulo directamente a nivel del nervio y en el músculo. El registro en el propio nervio se usa para medir las velocidades de conducción sensitivas, y en el músculo para las velocidades motoras. En los estudios de conducción sobre el nervio los parámetros medibles son la amplitud de la respuesta evocadas por el estímulo, motora y sensitiva y las velocidades de conducción a lo largo del nervio. La amplitud de la respuesta evocada motora, registrada en el músculo, después de estimular al nervio (potencial de acción motor compuesto) es proporcional al número de fibras musculares inervadas en el músculo estudiado. La amplitud de la respuesta evocada sensitiva es proporcional al número de axones sensoriales funcionantes. Las anomalías en el electromiograma reflejan pérdidas de axones motores. Patrones de neuropatía desmielinizante En ellas se incluyen a los siguientes tipos: CMT 1A, 1B, 3 (Dejerine-Sottas), Neuropatía Hereditaria por Parálisis por Presión, Neuropatía

ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

con plegamientos focales de la mielina y Neuropatía Hipomielinizante Congénita45. Patológicamente, este grupo se caracteriza por la presencia de fenómenos de desmielinización y remielinización, con formación de «bulbos en cebolla» (Figura 10.2). En todos los pacientes, estén o no asintomáticos, las velocidades de conducción motoras y sensitivas están enlentecidas: 9-38 m/sg, con latencias prolongadas y retraso en la onda F, desde los 4-6 meses de edad, progresando hasta los 5 años, estabilizándose durante el resto de la vida. La mejor edad para realizar este estudio es a los 5 años. La no progresión en el descenso de las velocidades después de esta edad se interpreta como una estabilidad en los defectos de la mielinización. El grado de retraso al nacimiento de las velocidades de conducción está en relación con la severidad de la enfermedad en la vida adulta. También hay una correlación entre la amplitud del potencial de acción muscular con el déficit clínico. La electromiografía no sirve en este caso para el diagnóstico.

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Patrón en la enfermedad CMT 2 o neuropatía axonal En ella se incluyen los siguientes tipos: CMT tipo 2, NHSM V, NHSM VI En este caso la lesión patológica consiste en una degeneración de los axones motores y sensitivos, más que una desmielinización y remielinización. Las velocidades de conducción son superiores a 40 m/sg o normales. Aquí está disminuida la amplitud de la respuesta motora (Potenciales de Acción Motor Compuesto) por una pérdida severa de las unidades motoras, en relación con el grado de debilidad y atrofia muscular. Al principio de la enfermedad la amplitud de los potenciales de acción sensitiva son normales, pero cuando la enfermedad progresa diminuyen proporcionalmente y con la progresión clínica pueden llegar a desaparecer. Las formas ligadas al cromosoma X, pueden ser desmielinizantes o axonales. MECANISMOS PATOGÉNICOS

Figura 10.2. Bulbo de cebolla. Nervio sural. Microscopía electrónica.

Las neuronas y muchas de las células de sostén del Sistema Nervioso Periférico, como las células de Schwann, no se dividen después de su diferenciación. El funcionamiento normal de las fibras de mielina depende de la estructura y del funcionamiento normal tanto del axón como de la misma vaína de mielina. La mielina está formada por múltiples capas de una estructura glicoproteica derivada y mantenida por la célula de Schwann, en contacto directo con el axón. Las proteínas constituyentes de la mielina, son la P0, principal componente de la mielina, la P1, equivalente a la proteína básica de la mielina del Sistema Nervioso Central, la P2, la PMP22, formada por cuatro exones, con cuatro dominios transmembrana implicada en la estabilidad de la mielina y la MAG (glicoproteína asociada a la mielina). La conexina 32 participa en la comunicación celular entre las células de Schwann. En el axón se encuentran los neurofilamentos ligeros (NF-L, 68 kDa), medios (NF-M, 160 kDa) y pesados (NF-H, 200 kDa) y los microtúbulos que

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Tabla 10.3. Genes identificados en CMT y su función. Neuropatía

Gen

Función

CMT 1

PMP 22 Cx32 P0 EGR2

Estructura/crecimiento de la mielina Formación de las hendiduras Proteína estructural de la mielina Induce la expresión de proteínas implicadas en el desarrollo y mantenimiento de mielina Alteración el la transcripción genética Detención celular y su diferenciación

MTMR2 NDRG1 CMT 2

NEFL KIF1B

CMT 3

PMP22, P0, EGR2

CMT 4

MTMR2, NDRG1, EGR2 GDAP1 PRX

HC

Estructura del neurofilamento ligero (interacciona con NF medio y pesado para formar los neurofilamentos) Transporte de precursores de la vesicula sinaptica por el axon a la sinapsis

Diferenciación neuronal en respuesta a gangliósidos Proteína del citoesqueleto

EGR2, P0, PMP22, SOX10

van a intervenir en el transporte axonal, y entre cuyas proteínas se encuentra la KIF1B. El estudio de la genética del CMT ha contribuido al conocimiento de estas proteínas y sus funciones. Así, hay varios tipos de CMT, unas son por alteraciones en la formación de la mielina y otras dependen de alteraciones a nivel de proteínas específicas de la mielina, como la Proteína Periférica de la Mielina 22 (PMP22) en CMT 1 y la Proteína cero (P0) en CMT 1B. Las que dependen de una herencia recesiva ligada al sexo (CMT X) presentan un defecto en la Conexina 32. En el caso del CMT1A, el más frecuente, existe una duplicación con incremento de la dosis génica, lo que afecta a la proliferación, forma y elongación de la célula de Schwann. Cuando existe una mutación puntual en la PMP22, parece que el mecanismo implicado es una alteración en el transporte intracelular de la PMP22 y acumulación de esta en el Golgi y retículo endoplásmico. La conexina 32 está localizada en la región paranodal y en las incisuras de Schrnidt-Lantermann, formando uniones o comunicaciones entre diferentes plieges de la mielina de una misma célula de Schwann, cuya función se altera o pierde en mutaciones de este gen. EGR2 es un factor de transcripción implicado en

la regulación de la mielinización. En caso de mutaciones en el gen EGR2 aparece hipomielinización debido a un bloqueo de la célula de Schwann en estadios precoces de mielinización. El papel del resto de los genes implicados se conoce menos, debido a haber sido descubiertos más recientemente. Su función y mecanismo de enfermedad se esquematizan en la Figura 10.346. Aunque la principal característica patológica y fisiológica del CMT1 es una desmielinización, los signos y síntomas clínicos, debilidad y pérdida sensorial, son probablemente producidos, más por una degeneración axonal, que por una desmielinización. ALTERACIONES PATOLÓGICAS EN LA ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIETOOTH Charcot-Marie-Tooth tipo 1 Todas las formas son de herencia autosómica dominante y se caracterizan por alteraciones a nivel de la mielina, de la célula de Schwann. Al inicio el número de fibras nerviosas no está reducido, pero muchas tienen vainas de mielina del-

ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

Figura 10.3.

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Esquema de las funciones de los genes implicados en el CMT.

gadas. También las fibras están muy separadas unas de otras al estar rodeadas de anillos incompletos formados por células de Schwann supernumerarias, dando lugar a nervios hipertróficos. La redundancia de las células de Schwann origina los «bulbos de cebolla»; estos también están presentes en otras neuropatías desmielinizantes adquiridas. La presencia de fenómenos de remielinización es debido a la presencia de nuevas células de Schwann en los segmentos de desmielinización. Neuropatía por parálisis por presión Neuropatía desmielinizante, los nervios presentan lesiones segmentarias de desmielinización y remielinización, originándose unos engrosamientos en la mielina visualizándose una imagen de salchicha o tomácula. Charcot-Marie-Tooth tipo 2 Degeneración axonal lentamente progresiva que afecta a los nervios periféricos; no se ven bulbos de cebolla sino pérdida de fibras mielínicas.

Enfermedad de Dejerine-Sottas o CMT tipo 3 Herencia recesiva, de inicio precoz y afectación neurológica más severa, que el tipo 1. Las lesiones patológicas son similares al tipo 1. Charcot-Marie-Tooth tipo 4 Herencia recesiva, neuropatía desmielinizante. Neuropatías hipomielinizantes congénitas CH (CMT 4E) Herencia dominante y recesiva, neuropatía desmielinizante o con vainas de mielina extremadamente delgadas. CLASIFICACIÓN DE LA ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH O NEUROPATÍAS HEREDITARIAS SENSITIVAS Y MOTORAS La clasificación de las neuropatías sensitivas y motoras está actualmente en continuo cambio.

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Como muchas otras enfermedades hereditarias, la clasificación clínica inicial se está complementando y reemplazando parcialmente por una clasificación genética. En la literatura genética se emplea el término Charcot-Marie-Tooth (CMT) y en las referencias clínicas se usa la terminología de Neuropatía Hereditaria Sensitivo y Motora (NHSM). El sistema de clasificación más empleado hasta ahora se basó en criterios clínicos, histológicos y neurofisiológicos. Así, las NHSM se dividen en siete formas (NHSM I a la VII), los tipos más comunes son los I, II y III; los otros son más raros (NHSM IV o síndrome de Refsum, NHSM V con paraparesia espástica, NHSMVI con atrofia óptica y NHSM VII con retinitis pigmentosa). La NHSM I se refiere a una neuropatía desmielinizante con velocidades de conducción nerviosas reducidas. La NHSM II es una neuropatía axonal con velocidades de conducción del nervio normales. La NHSM III es una neuropatía desmielinizante severa y de inicio en la infancia, actualmente se considera la forma más severa de CMT.

Basados en la identificación de los distintos genes implicados en este proceso se ha favorecido el término CMT, así el CMT 1 y 4 equivalen a la NHSM I y el CMT 2 a la NHSM II, pero no se corresponde con todos. Por lo tanto, la enfermedad de CMT es un grupo genéticamente heterogéneo de neuropatías hereditarias sensitivas y motoras caracterizadas por atrofia y debilidad progresivas, de afectación inicial en la musculatura distal. La clasificación empleada actualmente se basa en el tipo de neuropatía, axonal o desmielinizante y en la forma de herencia: autosomal dominante, autosomal recesiva y dominante ligada al cromosoma X (Tabla 10.1). En Europa predominan las formas dominantes. Los avances en genética molecular han confirmado la gran heterogeneidad genética del CMT, habiendo sido identificados más de 20 locus y 8 genes. La forma más frecuente de la enfermedad es la tipo CMT 1A, que se asocia con una desmielinización e hipertrofia a nivel del Sistema Nervioso Periférico (SNP), dando lugar a la formación

Figura 10.4. Severidad de la enfermedad según el tipo de gen implicado.

ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

de bulbos de cebolla y a unas velocidades de conducción reducidas. Está causada en la mayoría de los casos por una duplicación en el cromosoma 17p11.2 en la región que contiene el gen de la proteína periférica de la mielina 22 (PMP22). En caso de presentar una delección en este gen surge la Neuropatía hereditaria con susceptibilidad a la parálisis por presión (NHPP). La CMT 1B está causada por una mutación en el gen de la proteína 0 (P0) localizado en el cromosoma 10q21.1-q22.1. La segunda forma desmielinizante es el CMT X, causado por una mutación en el gen para la conexina 32. En el grupo CMT 1C se incluyen el resto de las formas dominantes desmielinizantes que aún no han sido ligadas a un gen. El CMT tipo 2 es la variante axonal, dominante o recesiva con velocidades de conducción normales o ligeramente reducidas y con disminución de la amplitud de los potenciales de acción motores. Se han descrito 7 formas dominantes (2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F y 2G), según los 2 genes y 5 loci que se conocen. En el caso del CMT 2A, se ha clonado en el cromosoma 1p35-p36, el CMT 2B en el 3q13-q22, el CMT 2C es desconocido, el CMT 2D en el 7p14 y el CMT 2G en el 3p13.1. El CMT 2E se produce por una mutación en el gen NEFL (8p21) y en el CMT 2F una mutación en la P0. La forma recesiva CMT2 AR A en el 1q21.2-21.3. El CMT tipo 3 o Dejerine-Sottas, tienen herencia dominante o recesiva. Los loci implicados son: 17p11.2-12, 1q22-23 y 10q21-q22, con mutaciones respectivas en los genes: PMP22, P0 y gen de la respuesta de crecimiento precoz (EGR2) responsable del desarrollo y mantenimiento de la mielina. Las CMT tipo 4 son desmielinizantes con herencia autosomal recesiva; los genes implicados o los loci conocidos son: CMT 4 A en el 8q1321.1 (GDAP1), CMT 4 B1 en el 11q22 con mutación en el gen de la proteína relacionada con la miotubularina 2 (MTMR2), CMT 4 B2 en el 11q15, CMT 4 C en el 5q23-q33, CMT 4 D-Lom en el 8q24 con mutación en el gen regulador del N-myc (NDRG1), CMT 4 E en el 10q21-22 con mutación en el gen EGR2, CMT 4 R-Russe en el 10q-23.2 y CMT 4 F en el 19q13.1-13.3. Los trastornos con hipomielinización congénita se consideran debidos a CMT 4E, con herencia

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autosomal dominante y autosomal recesiva por mutaciones en el EGR2; y autosomal dominante por mutaciones en la P0 y PMP22 y SOX10. SUMARIO DE LAS DISTINTAS FORMAS DE LA ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE- TOOTH CMT1 CMT 1A

Herencia autosómica dominante, cromosoma 17p11.2-p12. Mutación genética de la PMP22. Duplicación de un gen (2 copias de la PMP22) o delección, en este caso en la NHPP. Proteína PMP22

Predomina en las células de Schwann. Regula el crecimiento de los fibroblastos. Una sobreexpresión reduce la proliferación de las células de Schwann, detiene el crecimiento y produce apoptosis. Vías de síntesis: la mayoría de la PMP se retiene y degrada en el retículo endoplásmico, un pequeño porcentaje es transportado al aparato de Golgi glicosilado e incorporado al interior de la mielina. Representa un 2%-5% de la proteína de la mielina del Sistema Nervioso Periférico. Se localiza en la mielina compacta. Funciones: estructuración de la mielina y regulación del crecimiento y la diferenciación celular. La expresión de la proteína PMP22 está alterada en los nervios de la CMT 1A y en NHPP. La duplicación de la PMP22 aumenta la expresión de la PMP22 al inicio de la enfermedad, originando una diferenciación anormal de las células de Schwann.

Duplicación de la PMP22

Mutación: Duplicación segmentaria en un segmento del cromosoma 17 que contiene la PMP22. Ocurre por un alineamiento anormal durante la fase de meiosis. Da lugar a un total de 3 copias del segmento que la contiene.

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Epidemiología: Afectados por igual ambos sexos. Un 75% se inician en la 1.a década, un 10% en la 2.a década. Los síntomas iniciales son alteraciones de la marcha y deformidades en los pies. Clínica de neuropatía: Debilidad distal en pies y manos. Atrofia distal en los cuatro miembros, hipertrofia de pantorrillas en casos familiares. Hipoestesia moderada y/o ausente. Reflejos tendinosos disminuidos o ausentes. Engrosamiento de los nervios en un 20% de los casos. Progresión lenta con exacerbación ocasional durante el embarazo. Afectación severa en los casos de inicio temprano. La variante clínica Síndrome de Roussy-Levy cursa con neuropatía, ataxia y temblor. Contraindicaciones: Se han descrito emperoamientos, a veces severos, tras tratamientos con Vincristina.

Lesiones patológicas: reducción inicial de la producción de mielina con formación de bulbos de cebolla, con vainas de mielina más delgadas y descompactada (Asp37Val). 47,48

CMT 1A homocigotico

Mutación hemicigota PMP22 puntual y delección. Clínica: fenotipo severo para CMT 1 y NHPP.

CMT 1B

Genética: en la P0 están identificadas 60 mutaciones diferentes; en los exones 1,2,3,4,5 y 6. Las mutaciones más frecuentes están localizadas en los exones 2 y 3.

Neurofisiología: neuropatía desmielinizante Proteína P0

Velocidades de conducción de los nervios disminuidas global y uniformemente. Media entre 17 y 20 m/sg; rango entre 5 y 34 m/sg. Aparecen antes que los signos clínicos. Claramente manifestadas a los 2 años. No hay bloqueos en la conducción. Potenciales de acción mínimamente disminuidos por pérdida axonal. Latencias distales prolongadas desde el primer mes de vida. Respuesta prolongada a la onda F. Potenciales sensitivos, enlentecidos y de amplitud normal. Electromiograma con denervación distal. Potenciales evocados auditivos de tronco cerebral con disminución de la onda I. Lesiones patológicas: Excesiva producción de mielina al inicio, con formación de bulbos de cebolla.

Mutación puntual en la PMP22

Mutación con localización transmembrana de la PMP22. Menos frecuente en el primer lazo extracelular (Asp37Val). Clínica más severa que en la duplicación. Neurofisiología: neuropatía desmielinizante más severa que la duplicación, velocidad de conducción 15-20 m/sg

Es la proteína más abundante en la mielina del nervio periférico (50%)50. Se localiza en la mielina compacta. Está ausente en la mielina del Sistema Nervioso Central. Está en el pliegue extracelular y en citoplasma. Regula las células de Schwann; aumenta por el contacto axonal y se reduce por la falta de contacto axonal51. Variantes clínicas: Neuropatía de predominio axonal (CMT 2-P0) y polineuropatía con respuesta a esteroides. Neuropatía de predominio axonal52. Herencia dominante, descrita en familias japonesas y belgas. Comienzo entre los 37 y 61 años, con hipoestesia (85%), debilidad, calambres y fotofobia. Clínica: hipoestesia (100%) de predominio distal, sordera (45%), pupila de Adie (70%). Debilidad (80%) de predominio en piernas, hiporeflexia o arreflexia. Neurofisiología: Velocidades de conducción menores de 38 m/sg. Lesiones patológicas: pérdida axonal, fenómenos de regeneración y desmielinización segmentaria. Polineuropatía con respuesta a esteroides53. Herencia dominante, inicio después de los 50 años. Clínica: debilidad e hipoestesia distal de predominio en las piernas, hiporeflexia, progresión de 6 meses a 10 años, con respuesta a este-

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roides. Neurofisiología: velocidades de conducción enlentecidas. Lesiones patológicas: pérdida axonal y reducción de la mielina compacta CMT 1C

Herencia dominante, cromosoma y gen desconocidos. CMTX

CMT ligada al Cromosoma X: 1,2 y 3. Conexina 32: Función: formación de uniones54, 55. Localización: mielina no compactada Correlación clínica-genética56: Grado de severidad en relación con la pérdida función proteica. Fenotipo leve: mutación puntual (missenseVal84Ile). Velocidades de conducción inferiores a 40 m/sg. Fenotipo moderado: mutación puntual (missense), localizada en cualquier región de la proteína. Proteína presente en la membrana plasmática y en el citoplasma. Velocidades de conducción de 30-40 m/sg. Fenotipo severo-moderado: mutaciones (G12S, R142W, E186K, E208K). Proteína expresada en el citoplasma pero no en superficie celular57. Fenotipo severo: mutaciones con cambio de la ORF por delección o inserción; 175 cambio de ORF; stopcodon (Arg22). Proteína ausente en la membrana plasmática. Se inicia antes de los 10 años de edad. Neuropatía desmielinizante, con velocidades de conducción entre 10-37 m/sg. Mujeres con afectación moderada o asintomáticas. Clínica: Inicio en los varones antes de los 20 años con alteraciones de la marcha, debilidad y atrofia distal en manos y pies, hipoestesia (75%) comenzando por la propioceptiva, arreflexia aquilea (100%), rotuliana (90% en los varones y 50% en las mujeres), hipoacusia en la mutación Arg142Glu. En las mujeres los signos clínicos son moderados o están asintomáticas (50%). Neurofisiología: Moderadamente enlentecidas y asimétricas, con latencias distales prolongadas y pérdida axonal con ausencia de los SNAP en las piernas en un 70%. Existe variación intrafamiliar.

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Patología: desmielinización mixta y pérdida axonal, pocos bulbos de cebolla, grupos de regeneración (más que en el CMT1A), menor pérdida de axones mielínicos largos que en la CMT1A. Síndrome de Cowchock58: (cromosoma Xq24q26). Se inicia entre el nacimiento y los 5 años, neuropatía axonal con arreflexia, pérdida de sensibilidad y debilidad distal peroneal. Pies cavos y dedos en martillo, retraso mental (60%), sordera, velocidades motoras 33-56 m/sg y las sensoriales muy anormales. Patología: pérdida axonal y fenómenos de regeneración. Tipo 2; Recesiva: Cromosoma Xp22.2, de inicio en la 1.a década, debilidad distal59. Tipo 3; Recesiva: Cromosoma Xp26, de inicio en la 1.a década, debilidad distal.

Neuropatía hereditaria por parálisis por presión (NHPP)

Herencia dominante, cromosoma 17p11.2p12, delección en la PMP22. La delección ocurre en 85%, tiene lugar en la misma región del cromosoma 17p11.2-p12 donde se produce la duplicación en el CMT 1A. En raros casos se han identificado ocho mutaciones en la PMP22. Se produce una pérdida en la función de la PMP22 y su expresión está reducida en los nervios de la NHPP. Clínica: media de inicio a los 26 años (8-64 años), algunos pacientes permanecen asintomáticos. Los episodios de paresia se caracterizan por inicio agudo, indoloro, causados por traumas moderados o compresión (40%), ejercicio repetido, compresión local y al despertar (10%). Hay recuperación completa en un 50%, en días o meses con déficit motor severo en un 9%. La neuropatía suele ser asimétrica, motora con pérdida sensitiva, relacionada con parálisis por presión en un 62%. Los nervios más afectos son: mediano, radial, cubital, peroneo y plexopatía braquial, y menos frecuentemente, parálisis facial y de cuerdas vocales sin mediar presión. Algunos pacientes tienen pies cavos y escoliosis; los reflejos están habitualmente normales (62%).

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Neurofisiología: polineuropatía sensitivo-motora difusa, reducción de las velocidades de conducción sensitivas en miembros superiores y en menor grado las motoras, latencias motoras distales prolongadas. Patología: desmielinización segmentaria y engrosamientos focales y plegamiento de la vaina de mielina. CMT2

rada, arreflexia o hiporeflexia en piernas, pies cavos (100%), progresa a necesitar silla de ruedas en la 4.a década61. Neurofisiología: Axonopatía, velocidades de conducción ligeramente decrementadas, amplitud de los potenciales motores y potenciales sensitivos reducidas, denervación en músculos distales. Patología: Reducción del número de los axones mielínicos, especialmente los grandes, sin cambios mielínicos.

CMT 2 dominantes

CMT 2B

Neuropatía axonal, de herencia dominante. Prevalencia: 4 a 12 por 100.000 habitantes. Inicio: pico en la 2.a década, en ocasiones después de la 7.a década. Clínica: debilidad simétrica y distal, pérdida sensitiva distal y arreflexia aquilea. Velocidades de conducción: mayores de 38 m/ sg en el nervio mediano. Manifestaciones clínicas características:

Herencia dominante, cromosoma 3q13-q2262,63. Clínica: Inicio en la 2.a y 3.a década, úlceras en pies e infecciones, debilidad distal (100% en piernas y 50% en brazos), pérdida sensitiva simétrica y severa de preferencia en piernas, reflejos tendinosos normales con reducción de los aquíleos, deformidades en los pies en un 100% (pies cavos, dedos en martillo, acromutilaciones y úlceras), no dolor ni disfunción autonómica, fenotipo variable según familias, pocos pacientes precisarán silla de ruedas. Neurofisiología: Pérdida axonal, potenciales en nervio sural ausentes, reflejo H preservado, moderado enlentecimiento de las velocidades de conducción nerviosas. Patología: pérdida de axones mielinizados grandes y pequeños, degeneración axonal y regeneración, ocasionalmente bulbos de cebolla.

• CMT 2A (1p35-p36): debilidad inicial distal en las piernas. • CMT 2B (3q13-q22): pérdida sensitiva severa; acrodistrofia. • CMT 2C: afectación del nervio frénico y cuerdas vocales, inicio en la 1.a década. • CMT 2D (7p14): afectación inicial de las manos. • CMT 2E (8p21, NEFL): afectación de las piernas sobre las manos. • CMT 2G (3q13): debilidad proximal, temblor y diabetes mellitus. • CMT 2-F (1q22, P0): pérdida sensitiva severa, sordera y pupila de Adie. CMT 2A

Herencia dominante, cromosoma 1p35-p3660. Proteína: Kinesina; función: transporte anterógrado de las vesículas sinápticas precursoras. Epidemiología: familias Japonesas, Norteamericanas e Italianas61. Clínica: inicio entre 1 y 50 años, según familias, pies caídos, disfunción en la marcha, para correr y subir escaleras, debilidad distal (en piernas anterior y posterior), pérdida sensitiva mode-

CMT 2C 64

Herencia autosomal dominante. Clínica: inicio en la 1.a década, debilidad distal en manos y pies, se afectan los músculos intercostales, diafragmáticos, cuerdas vocales y progresa alterando la musculatura proximal y facial, arreflexia o hiporeflexia, reducción de la sensibilidad vibratoria. Neurofisiología: velocidades de conducción mayores de 50 m/sg (nervio mediano). CMT 2D

Herencia dominante, cromosoma 7p1365.

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Clínica: inicio entre 16 y 30 años, debilidad en manos, brazos y menos en piernas, hipoestesia distal en brazos y piernas, arreflexia en brazos e hiporeflexia en piernas. Neurofisiología: pérdida axonal con velocidades de conducción normales.

CMT 2E

Herencia dominante, cromosoma 8p21, gen del neurofilamento de cadena ligera (NEFL)66, en el que se ha encontrado una mutación Gln333Pro. La proteína del neurofilamento interviene en la organización del neurofilamento y se asocia con el crecimiento radial del axón. Epidemiología: familia rusa. Clínica: inicio en la 2.a y 3.a década, dificultad para caminar por debilidad en las piernas e hipoestesia distal, de predominio en las piernas, hiporeflexia, lenta progresión en años, pies cavos (100%) a los 20 años, hiperqueratosis ocasional. Neurofisiología: Pérdida axonal, disminución de los potenciales motores normales con velocidades de conducción normales o ligeramente reducidas.

CMT 2F

Herencia dominante, cromosoma 7q11-q2167. Epidemiología: familia Rusa (Vorenezh). Clínica: inicio entre los 15 y 25 años, debilidad distal y simétrica de predominio en las piernas, pies caídos, hiporeflexia e hipoestesia distal y simétrica de preferencia para el dolor y la temperatura, de lenta progresión. Neurofisiología: pérdida axonal, denervación distal, velocidades de conducción entre 42-58 m/sg, potenciales motores disminuidos o ausentes.

CMT 2G con velocidades intermedias

Herencia dominante, con dos loci descritos: 19p12-pl3.268, y 10q24.1-q25.169. Epidemiología: familia USA del medio-oeste, familia italiana 10q24, familia australiana 19p12.

Clínica: inicio 1.a y 2.a décadas, debilidad distal y simétrica en piernas y brazos, hipoestesia distal, temblor, lenta progresión (algunos nunca precisarán silla de ruedas). Neurofisiología: velocidades de conducción entre 25-50 m/sg, potenciales motores diminuidos o ausentes, potenciales sensitivos de baja amplitud. Patología: pérdida de axones grandes mielínicos, escasos bulbos de cebolla. CMT 2 recesivas

70,71,72,73

Comienzo en la niñez. Herencia recesiva. Debilidad distal y simétrica de inicio en las piernas. Hipoestesia moderada. Progresión lenta con debilidad severa y distal sobre los 20 años. Patología: pérdida axonal. CMT 2A, CMT 2B1

Cromosoma 1q21.2-q21.374 y 11p1575. Epidemiología; familia de Marruecos. Comienzo en la 2.a década. Clínica: debilidad distal y simétrica en los miembros, un 60% proximal, hiporeflexia en miembros inferiores, pies cavos (80%), cifoescoliosis (30%) con debilidad proximal. Neurofisiología: velocidades de conducción normales. Patología: disminución de axones mielinizados grandes, regeneración moderada. CMT2B, CMT2B2

Cromosoma 19q13.370. Epidemiología: familia de Costa Rica. Inicio entre los 28-42 años (media 34 años) Clínica: debilidad simétrica de pies y manos (66%) al inicio, luego debilidad simétrica y distal en piernas (100%) y brazos (80%), pérdida sensitiva distal y simétrica, preferentemente de fibras largas, arreflexia o anestesia.

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Neurofisiología: reducción de las velocidades de conducción motoras y sensitivas (30-65 m/sg en brazos), denervación distal. CMT con acrodistrofia

Epidemiología: familia turca, consanguínea. Inicio entre 7 y 10 años. Clínica: úlceras indoloras en pies, debilidad simétrica de predominio distal, atrofia distal, pérdida sensitiva distal y simétrica, arreflexia. Acrodistrofia (mutilaciones y úlceras en pies y manos)62, curso lentamente progresivo. Neurofisiología: la velocidades de conducción, cuando se obtienen, son normales con amplitudes disminuidas, denervación distal. Patología: axones mielínicos reducidos o ausentes, axones amielínicos reducidos en un 30%, aumento del colágeno endoneural. CMT con afectación piramidal (CMT 2C, CMT 4C2)

Cromosoma 8q21.3. Epidemiología: familia turca. Inicio a los 4-8 años. Clínica: dificultad para caminar al inicio, debilidad, atrofia y pérdida sensorial distal y simétrica, reflejos tendinosos vivos, excepto los aquíleos (ausentes), Hoffman y palmomentoniano vivos, curso progresivo. Neurofisiología: pérdida axonal Patología: pérdida axonal severa y fenómenos de regeneración ocasionales64.

CMT 4F: recesivos, 19q13. Clínica: debilidad generalizada de predominio distal, retraso en el desarrollo motor, comenzando a caminar a los 15-48 meses; desarrollo total de la enfermedad entre los 5 y 20 años; hipoestesia sensitiva severa, y para todas las sensibilidades de predominio distal, arreflexia, nervios engrosados en algunos pacientes; ocasionalmente: miosis, pupila perezosa, ptosis y nistagmus, cifoescoliosis, estatura corta, deformidades en los pies, rasgos faciales toscos y labios grandes; inicio antes de los 3 años, mínima progresión hasta la 2.a década5,78,13. Neurofisiología: velocidades de conducción muy enlentecidas (menores a 12 m/sg). Patología: bulbos de cebolla, nervios engrosados, fenómenos de hipomielinización, disminución del número de los axones largos mielinizados y reducción en el tamaño de los axones desmielinizados. Mutaciones del gen EGR2 : CMT1 y otros fenotipos: Cromosoma 10q21.1-q22.1. Genética: dominante o Recesiva7. Regula la proliferación celular, expresión asociada con la mielinización en el nervio periférico, interviene en el desarrollo y mantenimiento de la mielina del SNP. Hipomielinización congénita, CMT1 (Arg409Trp), Dejerine-Sottas (Arg359Trp)6,76,77. Clínica: CMT1, Dejerine-Sottas. CMT 4 Desmielinizante, herencia recesiva.

Dejerine-Sottas o CMT 3 CMT 4A

Neuropatía severa de inicio en la niñez y lentamente progresiva. Tipos genéticos: dominante recesivo y frecuentemente esporádicos. DSS-A: dominante, 17p11.2, PMP-22 mutación puntual. DSS-B: recesivos o dominantes, 1q22-q23, P0 mutación puntual. DSS-C: dominante de novo, 10q21, EGR276,77.

Herencia recesiva, cromosoma 8q13-q21.1. Recientemente se ha encontrado el gen causal, en una familia española, denominado proteína asociada a la diferenciación de gangliósido (GADP1)13,14. Inicio en la niñez, antes de los 2 años. Debilidad severa distal, rápidamente progresiva79. Velocidades de conducción enlentecidas (media de 29 m/sg).

ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

Desmielinización, bulbos de cebolla, hipomielinización, pérdida de axones mielínicos. CMT 4B 1

Herencia recesiva, cromosoma 11q22, alteración en la proteína relacionada con la miotubularina 2 (MTMR2), con distintas mutaciones80. Epidemiología: familias italianas y de Arabia Saudí. Inicio antes de los 4 años, con media en los 2 años. Clínica: debilidad simétrica, distal y proximal en los miembros inferiores; progresión lenta (los adultos suelen precisar silla de ruedas), ocasionales sincinesias faciales, pérdida sensitiva distal, arreflexia, pie equinovaro y labios engrosados. Neurofisiología: velocidades de conducción nerviosas entre 9 y 20 m/sg. Patología: pérdida de axones mielínicos, plegamientos irregulares y lazos redundantes de mielina (tomácula). CMT 4B 2

Herencia recesiva, cromosoma 11p1575,81. Epidemiología: familias Tunecina y Japonesa Inicio en las 1.a-2.a décadas, sin retraso en el desarrollo motor en la niñez. Clínica: debilidad al inicio en músculos anteriores de las piernas e intrínsecos del pie, posteriormente debilidad proximal, pérdida sensorial distal y severa, pies cavos y dedos en martillo. Neurofisiología: velocidades de conducción nerviosas enlentecidas (15-30 m/sg), pérdida de axones motores y sensitivos. Patología: plegamientos irregulares y lazos redundantes de mielina, desmielinización segmentaria, bulbos de cebolla, pérdida de axones mielinicos75,81. Existe otra forma de CMT con plegamientos focales de la vaina de mielina, de inicio juvenil con glaucoma.

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Epidemiología: genealogía alemana y argelina, pacientes suecos esporádicos. Clínica: inicio en la niñez (1-5 años) o en la adolescencia, escoliosis, pies cavos, retraso al caminar, debilidad distal y tardíamente proximal de preferencia en las piernas y lentamente progresiva, pérdida distal de sensibilidad profunda y arreflexia. Neurofisiología: velocidades de conducción enlentecidas (10-34 m/sg), latencias distales prolongadas y potenciales sensitivos ausentes o reducidos. Patología: neuropatía desmielinizante, pérdida severa de axones mielínicos grandes, zonas con mielina pequeña y engrosamientos focales, bulbos de cebolla y lesiones tipo tomácula.

CMT 4D tipo LOM (desmielinizante 82 y pérdida de audición)

Herencia recesiva, cromosoma 8q24, alteración del gen regulador del N-myc 1 (NDRG1), proteína en grandes cantidades en las células de Schwann; posibles funciones: diferenciación y detención del crecimiento celular y la señalización proteica entre el citoplasma y el núcleo. Epidemiología: gitanos de Lom, Bulgaria, Eslovenia, España e Italia. Clínica: de inicio entre 1-10 años, alteraciones de la marcha, deformidades en los pies con afectación severa sobre la 5.a década, atrofia de la lengua, debilidad de predominio distal, pérdida de sensibilidad distal para todas las modalidades, arreflexia, pies cavos (50%), escoliosis (20%), sordera en la 3.a década. Neurofisiología: velocidades de conducción lentas (9-20 m/sg), potenciales sensitivos ausentes o reducidos, denervación distal en las piernas, potenciales auditivos anómalos, hipoacusia sensorial. Patología: bulbos de cebolla, mielina descompactada, inclusiones en las células de Schwann, pérdida de axones, inclusiones axonales y alteraciones endoneurales.

CMT 4E (hipomielinizante congénita) CMT 4C

Herencia recesiva, cromosoma 5q23-q33.

Herencia recesiva, cromosoma10q21-22, mutación en el gen EGR2.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

CMT 4R-RUSSE

Herencia recesiva, cromosoma 10q22-q23. Epidemiología: familias rusas, gitanos españoles y rumanos. Clínica: inicio 8-16 años (media 11 años). Hipoestesia y debilidad distal y simétrica, areflexia, pies cavos y dedos en martillo (100%), manos en garra (80%), articulaciones neuropáticas. Neurofisiología: potenciales ausentes, velocidades de conducción disminuidas (30-35 m/sg). Patología: pérdida axonal, fenómenos de regeneración e hipomielinización. CMT 4F

Herencia recesiva, cromosoma 19q13.13q13.2. La proteína afectada es la Periaxina83. Esta proteína se localiza en el núcleo y en la membrana plasmática. Su función es interaccionar con las proteínas de la membrana que estabilizan la vaina de mielina. Epidemiología: familia libanesa, hispanos norteamericanos, norteeuropeos y vietnamitas. Clínica: similar a la de Dejerine-Sottas. Hipomielinizantes congénitas HC (CMT 4E), herencia dominante y recesiva, cromosoma 10q21q-22, gen EGR 2. HC, herencia dominante, cromosoma 1q22,23, gen P0. HC, herencia dominante, cromosoma 17p11.2, gen PMP22. HC, herencia dominante, cromosoma 22q13, gen SOX10. NHSM con alteraciones a nivel del SNC o nervios craneales NHSM 1 A, desmielinizante, herencia dominante, mutación en PMP-22. Pérdida de audición (bilateral) con polineuropatía sensitiva: herencia dominante, conexina31(proteína de membrana de la unión en la hendidura, se expresa en la cóclea y en el nervio ciático), cromosoma 1p35.1.

Clínica: pérdida de audición para frecuencias medias y altas de manifestación tardía, polineuropatía moderada y sensitiva, debilidad en pocos casos. Neurofisiología: enlentecimiento moderado motor y sensitivo, reducción mediana de los potenciales motores y sensitivos. Patología: lesiones desmielinizantes en un paciente.

NHSM 5 con manifestaciones piramidales Herencia dominante. Clínica: inicio en la 2.a década, debilidad distal de preferencia en miembros inferiores, neurona motora superior, espasticidad en algunos casos, respuesta plantar extensora y reflejos vivos (60%), hipoestesia distal y simétrica en piernas, lentamente progresiva. Neurofisiología: características de pérdida axonal. Patología: pérdida axonal.

Otras NHSM dominantes NHSM con atrofia óptica NHSM con sordera

NHSM recesivas NHSM y Agenesia del Cuerpo Calloso: síndrome de Anderman

Herencia recesiva, cromosoma 15q13-q15. Epidemiología: familias franco-canadienses. Clínica: debilidad severa y progresiva, pérdida sensitiva y arreflexia, retraso mental (psicosis atípica), crisis epilépticas, atrofia óptica, diplejia, ptosis e hipertelorismo. Neurofisiología: características de pérdida axonal, potencial sensitivos ausentes. Patología: agenesia del cuerpo calloso parcial o total (58%), axones dilatados con pocos neurofilamentos.

ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

NHSM con neuropatía óptica y/o pérdida de audición, recesiva y ligada al cromosoma X NHSM con sordera

Herencia recesiva. Clínica: debilidad simétrica y distal, hipoestesia propioceptiva en piernas, Romberg positivo, sordera sensitivo-neuronal congénita, retraso mental moderado, atrofia cerebelosa, signos piramidales y arreflexia. Neurofisiología: velocidades motoras disminuidas, potenciales sensitivos ausentes. Patología: ausencia de axones mielínicos grandes.

DIAGNÓSTICO GENÉTICO MOLECULAR DEL CMT En la práctica clínica habitual, el diagnóstico genético molecular del CMT se limita al examen de la duplicación 17p11, ya que esta es responsable del 75-90% de los casos. Por tratarse de una duplicación extensa, el diagnóstico de la duplicación difiere de otros estudios genéticos basados en búsqueda de mutaciones puntuales o expansiones. Siguiendo la referencia de la European Molecular Genetics Quality Network84, las pruebas para confirmar la existencia de la duplicación 17p11, pueden clasificarse en: 1. Métodos destinados a valorar la existencia de un fragmento duplicado: • Hibridación in situ con fluorescencia, (Fluorescence In Situ Hybridation, FISH). • Electroforesis en campo pulsado (Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE). 2. Métodos destinados a valorar la «dosis del gen»: • Southern-blot. • Estudio de marcadores polimórficos de la zona. • PCR del segmento de unión de los 2 fragmentos.

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Cada uno de estos métodos presenta ventajas e inconvenientes de orden técnico y diferente sensibilidad, lo que hace que no exista un acuerdo general sobre la prueba a utilizar para la determinación de la duplicación85. La FISH es una técnica citológica que se basa en el hallazgo de una banda adicional en el cromosoma 17 en el cariotipo de estos pacientes en la interfase, mediante la hibridación con una sonda específica de este segmento marcada con un compuesto fluorescente. Es preciso evaluar al menos 50 células y exige de un laboratorio equipado para citogenética. La electroforesis en campo pulsado es una técnica de electroforesis que permite estudiar fragmentos muy largos como el de la duplicación del CMT. Esta técnica se utiliza extensamente para el diagnóstico de CMT en los Estados Unidos, pero no es de uso habitual en Europa. La técnica de Southern-blot se utiliza con gran frecuencia para el diagnóstico del CMT. Mediante esta técnica, puede detectarse un efecto dosis (el individuo con duplicación muestra una banda de mayor intensidad que el control) o mediante digestión con las enzimas EcoRI y SacI, detectar un fragmento correspondiente a la unión de los fragmentos duplicados y, por tanto, que solo aparece en los individuos con duplicación. El uso de marcadores polimórficos (STR, tandem repeats) amplificados por PCR es la técnica más sencilla. Para realizarla basta amplificar mediante PCR un marcador de la zona de la duplicación y ver el genotipo que presenta. Si el individuo tiene 3 alelos, es, por tanto, portador de una duplicación. Como el individuo puede ser homocigoto para uno de los alelos, se deben utilizar 2 o 3 marcadores diferentes para aumentar la sensibilidad de la prueba. En caso de que el genotipo muestre 2 alelos, si uno de ellos amplifica en mayor proporción, esto indirectamente indica también duplicación. Una manera de aumentar la fiabilidad de esta técnica es realizar una PCR múltiple, amplificando un marcador de la región y un fragmento de otra zona que sirve como standard de la «dosis» (Figura 10.5). Otro medio es examinar con marcadores polimórficos varios miembros de la familia y ver si hay un haplotipo que se segregue con la enfermedad. Por último, recientemente se han desarrollado métodos que examinan mediante PCR larga la

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Figura 10.5. Determinación de la dosis de PMP22, mediante PCR múltiple con el marcador D17S955 y exón 9 de tau como control de standarización. Izquierda, producto de PCR del marcador D17S955, A: normal, B: HNPP; C: duplicación 17p11.2; derecha control (exon 9 de la tau).

existencia del fragmento de unión de la duplicación86. Sin embargo, esta PCR presenta mayores dificultades técnicas, y además, en el fragmento de unión existen polimorfismos que impiden su detección por esta técnica. En general, parece que con ella pueden detectarse el 70% de las duplicaciones. Además de conocer los posibles fallos de las diversas técnicas es preciso saber las particularidades derivadas de las técnicas usadas, como por ejemplo que para la técnica de FISH es necesario la correcta preservación de las células, generalmente a partir de sangre heparinizada y cultivo de células lo antes posible tras la extracción; y para las técnicas de Southern es necesario, aparte de utilizar mayor cantidad de DNA que la PCR, fragmentos de DNA de mayor longitud, por lo que se deben evitar métodos de extracción de DNA que produzcan excesiva fragmentación de este. Aproximación terapéutica al CMT La revisión del tratamiento del CMT incluye cuatro puntos: el tratamiento sintomático, la prevención de la degeneración axonal, la inmunomodulación y la terapia génica. El tratamiento sintomático incluye la utilización de calzado ajustado

para mejorar la marcha, la fisioterapia para reducir contracturas y deformidades articulares, el uso de prótesis antiequino y la corrección quirúrgico-ortopédica de las deformidades en los pies y la escoliosis. Además, en estos pacientes deben evitarse drogas potencialmente tóxicas para el sistema nervioso periférico y, por supuesto, el alcohol, por la existencia demostrada de mayores efectos secundarios en estos casos. La prevención de la degeneración axonal puede extenderse al uso en el futuro de factores neurotróficos, como la aplicación local de neurotrofin-3 mediante adenovirus87. A partir del estudio de Dyck et al.18, en el que se demostró que los pacientes con CMT mejoran con tratamiento con esteroides, tanto clínica como neurofisiológicamente, se conoce que este tratamiento puede mejorar a estos pacientes. Martini et al.88, han encontrado en un modelo animal de CMT 1B, una reducción de la desmielinización con terapia autoimune. Sin embargo, debido a la necesidad de aplicación crónica y la ausencia de estudios extensos, la terapia autoinmune no se aplica de forma habitual a estos pacientes. Actualmente, el uso de terapia génica mediante oligonucleótidos antisense se encuentra en fase experimental en modelos animales (ver Capítulo 4) para corregir el aumento de dosis génica.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

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C APÍTULO

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Polineuropatía amiloidea familiar A. Jiménez Escrig

La polineuropatía producida por depósito de material amiloide (PAF) es la segunda causa de polineuropatía hereditaria después de la enfermedad de Charcot Marie Tooth. Fue descrita por primera vez en 1947 por el médico portugués Corino de Andrade, que publicó una enfermedad conocida desde hace años en Povoa de Varzim, localidad próxima a Oporto, llamada en la zona «doença dos pezinhos» y que se hereda con un patrón autosomal dominante. Se considera una enfermedad dominante pura, por cuanto hay varias descripciones de individuos homocigóticos que no presentan agravamiento del cuadro clínico por este hecho1. El depósito de amiloide está constituido por una proteína fundamental, junto con otras proteínas que se agregan a este de forma inespecífica. Según la clínica, la PAF se clasificó en 4 tipos: tipo I, con polineuropatía axonal de predominio sensitivo y autonómico; tipo II, con síndrome de túnel del carpo predominante; tipo III, con polineuropatía axonal, nefropatía y úlcera gástrica; y tipo IV, con afectación de pares craneales y distrofia corneal. La tipo I y II están producidas por depósito de transtiretina (prealbúmina), la tipo III por depósito de apolipoproteína B, y la tipo

IV por depósito de gelsolina. Sin embargo, hoy en día esta clasificación ha sido abandonada, prefiriéndose una clasificación a partir de la proteína depositada y la mutación correspondiente. La forma más frecuente, con diferencia, es la producida por depósito de transtiretina. Esta proteína, también llamada prealbúmina, por cuanto en una electroforesis migra delante de la albúmina, tiene como función el transporte de la tiroxina y el acoplamiento con la retinol binding protein. Las mutaciones en el gen de la transtiretina (TTR) no originan ninguna alteración en la función de esta, pero favorecen su agregación y depósito en acúmulos que son tóxicos para los tejidos en los que aparecen originando diferentes alteraciones según el tejido involucrado. El mecanismo por el cual el depósito de amiloide es tóxico no se conoce con certeza, señalándose como hipótesis la afectación vascular e isquemia secundaria y la generación de radicales libres. En el sistema nervioso periférico, se añade la compresión de las fibras nerviosas por el efecto de ocupación de espacio de los depósitos de amiloide y el edema del endoneuro secundario al depósito de amiloide en los vasos y el intersticio del endoneuro que origina isquemia de las fibras nerviosas2. 141

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

La TTR está codificada por un gen localizado en el cromosoma 4, formado por 4 exones. Hasta la fecha se han descrito más de 50 mutaciones en este gen, existiendo una cierta correlación entre la clínica y velocidad de progresión y la localización de la mutación. Las mutaciones en el exón 2 son las más agresivas, originando polineuropatía de inicio en la tercera década de la vida. Las mutaciones en el exón 3 suelen tener una clínica de inicio más tardío, en la 5 o 6 década con síndrome de túnel del carpo, seguida de polineuropatía y afectación de otros órganos. Las mutaciones en el exón 4 originan miocardiopatía prominente. Esta distribución clínica no se cumple siempre. Posiblemente la variable que más influye en la agresividad clínica es la amiloidogenicidad que induzca la mutación, dependiendo esto de dos factores: el tipo de aminoácido de la mutación y la colocación de este en la periferia del asa que forma la hélice α. En nuestro país existen varias familias con PAF producidas por mutaciones Met30, Val71, Tyr77 y delección Val122 (Figura 11.1). La clínica de la PAF se produce por el depósito del material amiloide en diferentes órganos. El cuadro clínico se caracteriza por las manifestaciones de la toxicidad que producen estos depósitos. Generalmente comienza con polineuropatía que es axonal y de predominio sensitivo y autonómico, con disestesia e hipoestesia al dolor, arreflexia, y posteriormente afectación motora con arreflexia, déficit motor y atrofia muscular. La alteración autonómica produce precozmente impotencia e hipotensión ortostática, y en fases más avanzadas alteraciones en la micción, trastornos vasomotores con edemas y acrocianosis y diarrea. La afectación de otros órganos incluye miocardiopatía con alteración del ritmo cardíaco en fases iniciales, y posteriormente insuficiencia cardiaca3,4; síndrome nefrótico y posteriormente insuficiencia renal; opacidades en vítreo y cataratas5. También se ha descrito en pacientes con enfermedad de larga evolución artropatía de Charcot en rodillas y codos, que debe ser buscada6,7. En todos los casos la afectación del mediano en el túnel del carpo es precoz, por el depósito de amiloide en el ligamento transverso del carpo. En algunas formas la clínica se reduce a síndrome del túnel del carpo únicamente, y en otras esta alteración es la única presente durante años.

Figura 11.1. Paciente con PAF por mutación TTR Tyr77 con paraparesia, atrofia muscular y severas alteraciones tróficas en extremidades inferiores.

El diagnóstico de PAF se realiza en base al cuadro clínico de polineuropatía axonal sensitivo motora. El ECG suele revelar anomalías del ritmo como bloqueos de rama o bloqueo aurículoventricular.El ecocardiograma muestra datos de miocardiopatía restrictiva con alteración de la función sistólica y hipertrofia del septo8. Los antecedentes familiares de polineuropatía pueden ayudar al diagnóstico, pero estos antecedentes no siempre se conocen por el paciente, especialmente en casos de inicio tardío. En caso de sospecha clínica el diagnóstico puede confirmarse mediante determinación del material amiloideo en la biopsia o mediante el estudio genético. En el material de biopsia, el depósito de amiloide se visualiza como un material intercelular, basófilo, que se visualiza con el rojo congo, presentando birrefringencia. Una vez que se encuentra

POLINEUROPATÍA AMILOIDEA FAMILIAR

Figura 11.2.

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Estructura del gen de la TTR y mutaciones descritas en España.

material amiloide debe caracterizarse el tipo de proteína que lo genera mediante inmunohistoquímica con tinción del material con el anticuerpo correspondiente. La biopsia de estómago o recto puede demostrar material amiloideo, pudiendo realizarse el diagnóstico mediante este medio. Si esto no es posible, debe realizarse biopsia de nervio, que muestra afectación nerviosa axonal y depósito amiloideo. El material amiloide también puede observarse en otros tejidos, como en la biopsia de la grasa subcutánea abdominal, en la biopsia renal o en el músculo. Debido a que los depósitos de forma característica suelen ser parcheados, es preciso examinar diferentes segmentos de una biopsia antes de descartar la existencia de amiloide, y no es infrecuente la existencia de biopsias negativas en pacientes con PAF. Lo anterior, junto con la capacidad de realizar el diagnóstico en pacientes asintomáticos o en fases precoces, hace que sea el diagnóstico genético la determinación de elección para el diagnóstico de la PAF. Lo usual en este caso es el examen de las mutaciones descritas (Met30, Val70 y Tyr77 y ΔVal122 en nuestro país) mediante amplificación con PCR de los exones 2, 3 y 4 de la TTR y análisis de restricción enzimática. En caso de que este estudio sea negativo se realizará estudio de la secuencia de los exones 2, 3 y 4. Existen otras técnicas de diagnóstico mo-

lecular alternativas, como son la determinación de existencia de TTR mutada mediante ELISA en suero, con un anticuerpo específico que distingue una determinada mutación9. La otra técnica recientemente descrita es el uso de la espectrometría de masas, técnica de estudio de proteínas que permite detectar de un modo muy sensible el peso molecular de una proteína, que naturalmente cambia en caso de mutación9,10,11. La PAF solo tiene un tratamiento médico sintomático de control de las diarreas, mediante di-

Figura 11.3. Ecocardiograma bidimensional de una paciente con una mutación TTR Tyr77, que muestra hipertrofia del septo por depósito de amiloide.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

fenoxilato y evitando el fenómeno de sobrecrecimiento bacteriano, alivio del dolor mediante amitriptilina y control de la hipotensión ortostática mediante medias de compresión y mineralocorticoides. En fases avanzadas el paciente presenta severas alteraciones tróficas cutáneas con úlceras plantares que van a precisar cuidados locales para evitar la gangrena y alteraciones del ritmo cardiaco precisando marcapasos12,13. Se han ensayado algunos tratamientos como los antioxidantes, que disminuirían la toxicidad del amiloide, y la aféresis, que retiraría de la circulación la transtiretina anómala14, pero hasta la fecha no se ha probado que sean capaces de evitar la progresión del cuadro clínico, por lo que habitualmente el paciente va a fallecer en el curso de 10 a 15 años del inicio de los síntomas. El 90% de la TTR se produce en el hígado, produciendose el resto en humor vítreo y plexo coroideo. Por ello, el transplante hepático origina el cese de la producción de la TTR anómala, por lo que se utiliza como tratamiento de estos pacientes. Sin embargo, el transplante está asociado a una morbimortalidad importante, mayor en estos pacientes por la afectación cardíaca asociada y no siempre revierte la progresión de la clínica, por cuanto el depósito de TTR puede actuar como núcleo para el depósito de otras proteínas norma-

les15,16. Hay que tener en cuenta que la supervivencia tras el trasplante es del 82% en el primer año, y del 60% al quinto año17. Por ello se reserva el trasplante a aquellos casos de enfermedad de aparición precoz, con clínica en fases iniciales o moderadas y sospecha de curso agresivo18-21. La afectación cardiaca22, la alteración de esfínteres y la presencia de importante deterioro motor contraindican el trasplante23. Tampoco debe hacerse este en sujetos con caquexia, enfermedad de larga evolución o edad avanzada24. Es importante considerar el tipo de mutación y el grado de agresividad de esta en los familiares afectados previamente. Dado que el vítreo produce transtiretina, el trasplante hepático no frena el desarrollo de opacidades en el vítreo, por lo que en caso de que esta origine alteraciones es necesaria la vitrectomía25. En algunos casos de pacientes trasplantados el hígado de pacientes con PAF se ha trasplantado a otro paciente (trasplante en dominó), ya que los depósitos de amiloide van a aparecer muchos años después, fuera del rango de vida del trasplantado26-28. Las PAF por depósito de apolipoproteína B y por depósito de gelsolina son mucho más raras29,30. La primera está limitada a una familias descritas en EE UU, Alemania y Japón. Cursa

Figura 11.4. Lesiones nerviosas por amiloide. A. H&E muestra escasas lesiones amiloides. B. Aspecto del amiloide a mayor aumento. Material interfibrilar hialino. C. Birrefringencia del material amiliodeo con tinción con rojo Congo. D. inmunohistoquimíca positiva para TTR de la lesión amiloide.

POLINEUROPATÍA AMILOIDEA FAMILIAR

con polineuropatía axonal sensitiva, afectación renal y gástrica. La segunda está también limitada a familias en Finlandia y Japón31,32. Cursa con trastorno visual por depósito en la cornea, que lleva a la pérdida visual severa y afectación de pares craneales, especialmente nervio facial. Salvo casos excepcionales suele ser un trastorno benigno, pero la pérdida visual a veces obliga a la necesidad del trasplante de córnea. BIBLIOGRAFÍA 1. Ikeda S, Nakano T, Yanagisawa N, Nakazato M, Tsukagoshi H. Asymptomatic homozygous gene carrier in a family with type I familial amyloid polyneuropathy. Eur Neurol 1992; 32: 308-313. 2. Hanyu N, Ikeda S, Nakadai A, Yanagisawa N, Powell HC. Peripheral nerve pathological findings in familial amyloid polyneuropathy: a correlative study of proximal sciatic nerve and sural nerve lesions. Ann Neurol 1989; 25: 340-350. 3. Eriksson P, Backman C, Eriksson A, Eriksson S, Karp K, Olofsson BO. Differentiation of cardiac amyloidosis and hypertrophic cardiomyopathy. A comparison of familial amyloidosis with polyneuropathy and hypertrophic cardiomyopathy by electrocardiography and echocardiography. Acta Med Scand 1987; 221: 39-46. 4. Hongo M, Yamamoto H, Kohda T, et al. Comparison of electrocardiographic findings in patients with AL (primary) amyloidosis and in familial amyloid polyneuropathy and anginal pain and their relation to histopathologic findings. Am J Cardiol 2000; 85: 849-853. 5. Sandgren O. Ocular amyloidosis, with special reference to the hereditary forms with vitreous involvement. Surv Ophthalmol 1995; 40: 173-196. 6. Pruzanski W, Baron M, Shupak R. Neuroarthropathy (Charcot joints) in familial amyloid polyneuropathy. J Rheumatol 1981; 8: 477-481. 7. Shiraishi M, Ando Y, Mizuta H, Nakamura E, Takagi K, Ando M. Charcot knee arthropathy with articular amyloid deposition in familial amyloidotic polyneuropathy. Scand J Rheumatol 1997; 26: 61-64. 8. Hongo M, Ikeda S. Echocardiographic assessment of the evolution of amyloid heart disease: a study with familial amyloid polyneuropathy. Circulation 1986; 73: 249-256. 9. Almeida MD, Lopez-Andreu F, Munar-Ques M., Costa PP, Saraiva MJ. Transthyretin ALA 71: a new transthyretin variant in a Spanish family with familial amyloidotic polyneuropathy. Hum Mut 1993; 2: 420-421.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

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C APÍTULO

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Heredoataxias D. Mayo Cabrero

Las ataxias hereditarias son un grupo de enfermedades neurodegenerativas de clínica muy heterogénea, caracterizadas todas ellas por la presentación de alteración de la marcha tipo atáxica, disartria, disfagia, oftalmoplegia, signos extrapiramidales, etc. Actualmente se sabe que algunas ataxias tienen una base genética, siendo estas mutaciones dinámicas el tipo de mutación descrita como responsable de las ataxias hereditarias en la década de los noventa. Hasta el momento se han clonado los genes responsables de las ataxias de herencia dominante ataxia espinocerebelosa tipo I (SCA 1), tipo II (SCA 2), tipo III (SCA 3) o Enfermedad de Machado-Joseph, tipo VI (SCA 6), tipo VII (SCA 7), tipo VIII (SCA 8), tipo X (SCA 10), tipo XII (SCA 12), tipo XVII (SCA 17), la atrofia dentatorubropalidoluysiana (DRPLA) y de la forma recesiva ataxia de Friedreich. Se han localizado los genes responsables de las formas SCA 4, SCA 5.

CLASIFICACIÓN DE LAS ATAXIAS HEREDITARIAS La clasificación de Harding1 es la más aceptada actualmente y está basada tanto en criterios

clínicos como genéticos. Harding propuso una clasificación de ataxias hereditarias en 1983, en la que por primera vez se hace mención a la distinción entre ataxias de inicio tardío y ataxias de inicio temprano, tomando los 20 años como edad de diferencia entre unas y otras. A continuación se esquematiza la clasificación propuesta por Harding, incluyendo las formas de ataxias hereditarias, tanto de herencia dominante como de herencia recesiva cuyos genes han sido clonados en la actualidad. III. Trastornos congénitos de causa desconocida. III. Trastornos atáxicos con causa metabólica conocida. 1. Trastornos metabólicos: debidos a la deficiencia de alguna enzima metabólica, por ejemplo de la Ornitin transcarbamilasa. 2. Trastornos con déficit en la reparación del DNA: en este grupo se encuentra la ataxia telangiectásica. III. Trastornos atáxicos de etiología desconocida 1. Ataxias cerebelosas de inicio precoz (antes de los 20 años): • Ataxia de Friedreich. • Ataxia cerebelosa con reflejos conservados. • Otras formas raras. 147

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

2. Ataxias cerebelosas de inicio tardío (después de los 20 años): • ACAD tipo I: Ataxias autosómicas dominantes con atrofia óptica, oftalmoplegia, demencia y signos extrapiramidales; en este grupo se incluyen actualmente las formas SCA 1, SCA 2, SCA 3 y SCA 8. • ACAD tipo II: Ataxias autosómicas dominantes con degeneración retiniana, oftalmoplegia y con o sin signos extrapiramidales, grupo en el que se incluye SCA 7. • ACAD tipo III: Ataxia autosómica dominante pura en la que se incluye la forma SCA 6. • ACAD tipo IV: Ataxia cerebelosa dominante con temblor esencial y ataxia autosómica dominantes periódicas. Las recientemente clonadas SCA 10, SCA 12 y SCA 17, debido a la falta de datos clínicos, no han sido incluidas en la clasificación de Harding. INCIDENCIA Una estimación general cifra la incidencia de las ataxias dominantes en 1 afecto por cada 100.000 habitantes2. La incidencia de las ataxias hereditarias en España, según unos estudios realizados sobre población cántabra3, es de 10,6 pacientes por cada 100.000 habitantes. La ataxia de Friedreich es la ataxia hereditaria más frecuente con una incidencia de 4 afectados de cada 100.000 habitantes3. DEFECTO GENÉTICO: MUTACIONES DINÁMICAS Las mutaciones dinámicas son un tipo de mutación descrito recientemente consistente en la expansión del número de repeticiones de una pequeña secuencia de DNA, generalmente tripletes, por encima de un número de repeticiones determinado para cada patología; de tal forma que en población normal existe un número de repeticiones que constituyen el rango normal que no está

asociado a ninguna patología4,5. Este tipo de mutaciones tienen una serie de características: • En los individuos no afectos, con número de repeticiones dentro de un rango normal, la herencia de este número de repeticiones es estable, no existiendo incremento en el número de repeticiones de una generación a su filial. • En individuos portadores de la expansión la herencia del número de repeticiones es inestable, de tal forma que pueden sufrir variaciones en el número de repeticiones de una generación a su filial. Estas variaciones son generalmente un incremento en el número de repeticiones, aunque se han descrito disminuciones en el número de repeticiones. • En las enfermedades producidas por mutaciones dinámicas se ha descrito el fenómeno de anticipación genética que se define como una aparición de la enfermedad en una edad más temprana y de forma más severa conforme se desciende en una genealogía. Existe una relación inversamente proporcional entre el número de repeticiones y la edad de aparición y en ocasiones la severidad de estas enfermedades es mayor cuanto mayor es el número de expansiones. Para explicar esta inestabilidad de los alelos expandidos se ha propuesto que en las zonas con repetición de tripletes se originan unas estructuras hairpin, por apareamientos en la región de la expansión en la hebra de DNA que originan errores en la duplicación del DNA, produciéndose las expansiones de tripletes. La estabilidad de estas estructuras no es igual en todos los casos; por ejemplo, se ha descrito que las estructuras formadas en regiones de repetición CTG (enfermedad de Steiner y SCA 8) son más estables que las que se forman en regiones de repetición de tripletes CAG (enfermedades debidas a las poliglutaminas); esta diferencia se traduce en que las expansiones producidas en la distrofia miotónica o enfermedad de Steiner pueden ser más grandes que las que se producen en las SCAs, a excepción de SCA 86. ATAXIAS DOMINANTES SCAs En este grupo se encuadran las formas SCA 1, SCA 2, SCA 3, SCA 6, SCA 7, SCA 8, DR-

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HEREDOATAXIAS

PLA y las recientemente clonadas SCA 10, SCA 12, SCA 17. El defecto genético responsable de estos cuadros neurodegenerativos son las mutaciones dinámicas; en SCA 1, SCA 2, SCA 3, SCA 6, SCA 7 y SCA 12 el triplete que se repite es CAG, en SCA 8 es CTG y en SCA 10 el pentanucleótido ATTCT 7-17. CLÍNICA DE LAS ATAXIAS HEREDITARIAS DOMINANTES Las ataxias hereditarias se caracterizan por tener una clínica muy heterogénea7-17 con el único síntoma común de la ataxia de la marcha; estos pacientes presentan: Ataxia: Se define como trastorno del movimiento que se caracteriza por la torpeza e inseguridad en la marcha o en el manejo de extremidades; generalmente la dificultad de la marcha aumenta si se pide al paciente que cierre los ojos al caminar. Existen muchas causas que pueden causar una marcha atáxica, como enfermedades cerebelosas, pérdida de la sensibilidad posicional de las extremidades inferiores, etc. Y además pueden presentar otros síntomas neurológicos como: Dismetría: Hace referencia a la incoordinación de movimientos; para valorar la dismetría se

realiza la prueba dedo-nariz consistente en, partiendo de una posición de extensión completa del codo, con la parte superior del brazo en el plano horizontal, se indica al paciente que se toque la nariz con el dedo índice y vuelva a la posición inicial. La prueba se realiza a varias velocidades y se repite con los ojos cerrados. Disartria: Es un término genérico que se aplica a una serie de trastornos de la articulación del habla que reflejan una debilidad muscular, descoordinación, lentitud o rapidez de movimientos excesiva de los músculos de la fonación, resonancia y articulación. La disartria se debe a lesiones en el sistema nervioso central o periférico y se refiere a trastornos neurológicos de causa variable. Hay diversos tipos de disartria (cada tipo provoca unos sonidos claramente diferenciales). El tipo atáxico presente en alguno de estos pacientes se caracteriza por una fonación normal, temblor de voz, exceso de intensidad, una resonancia normal y una articulación característica consistente en interrupciones articulatorias irregulares y distorsión de consonantes y vocales. Disfagia: Se define como dificultad para la deglución y aparece en algunos de los pacientes con ataxias hereditarias; puede presentar dificultad para la deglución de alimentos líquidos o, en menor grado, para alimentos sólidos.

Tabla 12.1. Ataxias hereditarias producidas por mutaciones dinámicas. En la tabla se refiere la localización cromosómica, la secuencia que se repite y los rangos normales y patológicos para las distintas formas 7-17. (AF = ataxia de Friedreich) Gen

Localización

Secuencia

Rango normal

Rango patológico

SCA 1 SCA 2 SCA 3 SCA 6 SCA 7 SCA 8 SCA 10 SCA 12 SCA 17 DRPLA

6p23 12q24.1 14q32.1 19p13 13p12-13 13q21 22q13-ter 5q31-33 1p36 12p13

CAG CAG CAG CAG CAG CTG ATTCT CAG CAG CAG

6-44 15-31 12-40 4-18 4-35 15-35 10-22 7-28 29-42 6-35

49-82 36-63 55-84 21-33 337-300 90-200 920-4.200 66-78 47-52 49-88

X25 (AF)

9q13

GAA

7-15

200-1.000

150

MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Oftalmoplegia: Con este término se designa a la parálisis de los nervios oculares. Esta parálisis ha sido descrita en pacientes con ataxias hereditarias. Nistagmo: Es un movimiento oscilatorio repetitivo de los ojos, puede ser suave y sinusoidal o una combinación entre un desplazamiento lento y otro más rápido corrector. Alteraciones visuales: En SCA 7 se ha descrito degeneración retiniana, consistente en una pérdida progresiva de visión que termina en ceguera. Signos extrapiramidales (movimientos anormales): En las ataxias hereditarias se pueden observar movimientos anormales que pueden ser: • Corea: Se describe como movimiento rápido e involuntario de una o varias partes del cuerpo que no es estereotipado, se manifiesta como un fenómeno aleatorio. • Distonía: Se define como una postura anormal de una o varias partes del cuerpo, y comporta una contracción simultánea de músculos agonistas y antagonistas. • Temblor: Son movimientos rítmicos, periódicos, de una parte del cuerpo. En los pacientes con ataxia hereditaria se puede presentar temblor postural, que se observa claramente cuando las extremidades se sostienen en contra de la fuerza de la gravedad; también se han descrito en las ataxias hereditarias movimientos parkinsonianos que se caracterizan por la aparición de temblor cuando la extremidad u otra parte del cuerpo está en reposo; este temblor persiste con una postura mantenida, pero generalmente se atenúa con la acción. • Discinesia bucal: Se define como movimientos orobucolingüales que se caracterizan por movimientos de vaivén de la boca y de la lengua que persisten en un patrón estereotipado y repetitivo. Es característico que se produzcan movimientos de apertura y cierre de la boca, con colocación de los labios fruncidos y que en ellos se intercale la protusión intermitente de la lengua.

• Mioclonias: Se caracterizan por movimientos relampagueantes involuntarios de una zona del cuerpo; una contracción mioclónica se caracteriza por el desplazamiento brusco de una o varias partes del cuerpo en una sola dirección. Amiotrofia: Se define como atrofia muscular y puede aparecer en cuadros neurodegenerativos. Reflejos: Los reflejos son respuestas motoras involuntarias a estímulos sensitivos; estos pacientes pueden presentar reflejos patológicos específicos como el reflejo de Babinski, consistente en una extensión del dedo gordo generalmente asociado a un movimiento en abanico del resto de los dedos. Es aconsejable medir los reflejos de distensión muscular y los reflejos superficiales ya que estos pacientes pueden presentar reflejos patológicos. En la mayoría de estos pacientes la imagen obtenida con una Resonancia Magnética muestra una atrofia cerebelosa. La evolución de las ataxias hereditarias desde el inicio de la enfermedad hasta el fallecimiento de los pacientes es de 10-20 años. La atrofia dentatorubro palidoluysiana (DRPLA) se caracteriza por presentar una clínica muy heterogénea que puede confundirse tanto con la que presenta el corea de Huntington como con la descrita para las ataxias hereditarias dominantes18.

LESIONES NEUROPATOLÓGICAS EN LAS ATAXIAS DOMINANTES (SCAs) Se han descrito lesiones neuropatológicas en varias áreas del cerebro. En SCA 1 se ven afectados los tractos dentatorúbrico y olivopontocerebeloso, así como la parte superior de la médula. Los pacientes con SCA 1 presentan además atrofia de los nervios craneales (frecuentemente del III al XII par) y lesiones severas en las neuronas de Purkinje (cerebelo)19. En SCA 2 están afectados la oliva inferior, sustancia nigra, el cerebelo y los núcleos pontinos20.

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En SCA 3 se han detectado lesiones en los ganglios basales (pálido interno, núcleo subtalámico y sustancia nigra)21. Los pacientes con SCA 6 muestran una severa atrofia cerebelosa y una moderada degeneración de la oliva inferior19. En SCA 7 existe una afectación cerebelar, de las células granulares y del núcleo dentado; sin embargo, lo más llamativo de esta forma es la afectación de la retina donde se aprecia una temprana degeneración de los fotoreceptores de las células granulares y bipolares y posteriormente de las células del epitelio pigmentado de la retina22. En SCA 8 se describe una atrofia cerebelar tanto del vermis como de los hemisferios23. En las SCA 10, SCA 12, SCA 17 aún no hay suficientes datos. EXPRESIÓN DE LOS GENES: PROTEÍNAS Las proteínas codificadas por las ataxias hereditarias son de función desconocida, a excepción de la codificada por los genes SCA 6 y SCA 12. La proteína codificada por el gen SCA 6 es la subunidad α1A de canal de calcio dependiente de voltaje CACNA1A. Se ha descrito que mutaciones en este gen producen ataxia episódica. La proteína codificada por SCA 12 es una subunidad reguladora expresada en cerebro de la proteína fosfatasa 2 (PP2A). Las proteínas de función desconocida se nombran como ataxina1, la codificada por SCA 1; ataxina2, la codificada por SCA 2; ataxina3, la codificada por SCA 3; y ataxina7, la codificada por SCA 77-17. Todas estas proteínas se expresan en el cerebelo, la ataxina7, además, se expresa en la retina. La localización de estas proteínas en las células es nuclear. FISIOPATOLOGÍA DE LAS ATAXIAS HEREDITARIAS DOMINANTES Se ha postulado que la expansión se traduce en una ganancia de función de las proteínas codificadas por estos genes. El mecanismo de esta

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ganancia de función aún no está claro, si bien, se postula que la expansión confiere a las proteínas propiedades tóxicas. Para el estudio de la fisiopatología se han realizado estudios con modelos animales, demostrándose en ratones transgénicos que las expansiones CAG son la causa de la degeneración de las neuronas de Purkinje24. Los primeros estudios se realizaron en el corea de Huntington, donde mediante estudios con anticuerpos se observó la existencia de agregados intranucleares25; estos agregados también se observaron en SCA 1, SCA 2, SCA 3, SCA 7 y DRPLA26. Existen muchas hipótesis que intentan explicar la formación de estos agregados; se piensa que como consecuencia de la aparición de regiones ricas en glutaminas (codificada por el triplete expandido CAG), se producen interacciones covalentes con otras proteínas que dan lugar a estos agregados proteicos intranucleares27-29. Esta teoría ha sido probada in vitro30, aunque aún no se ha podido reproducir in vivo. Actualmente, no se sabe si estos agregados proteicos donde se ha detectado la presencia de ubiquitina, son la causa o el efecto del proceso patogénico. Los agregados han sido detectados en neuronas de tejidos no afectos en pacientes de SCA 731 y en tejidos periféricos en modelos animales para el estudio de la enfermedad de Huntington32. Estos dos hechos son indicativos de que la presencia de estos agregados no es suficiente para producir la muerte neuronal, hecho que se confirmó en estudios con ratones para SCA 1 y corea de Huntington33-34. Se ha postulado que puesto que estos agregados parece que no son los causantes de la patología, podrían ser un mecanismo de defensa de la célula frente a estas proteínas más que un mecanismo patogénico35. Por otro lado, se ha visto para ataxina 1 y huntintina, que cuando estas proteínas son transportadas al citoplasma no causan neurodegeneración34-36. Por tanto, el núcleo parece ser el lugar primordial donde se produce la degeneración. En resumen, se tienen datos sobre la fisiopatología de estas enfermedades aunque aún no se conoce dicha fisiopatología. El conocimiento de este proceso sería fundamental para elaborar estrategias de tratamiento para estas patologías.

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DIAGNÓSTICO MOLECULAR La muestra biológica utilizada para el estudio molecular suele ser sangre periférica, si bien, para diagnóstico prenatal, la muestra es vellosidades coriales. El DNA puede extraerse igualmente de cualquier tejido del paciente. Una vez extraído, el DNA se amplifica mediante la técnica de PCR. Esta técnica permite obtener múltiples copias de la región de DNA que se desea, en este caso de las regiones de los genes que contienen las expansiones. Los productos de PCR se analizan en geles de agarosa o/y acrimilamida y en función del número de repeticiones variará el tamaño del amplificado. De esta manera, un menor número de repeticiones rendirá un amplificado de tamaño menor. Existe una relación directa entre el tamaño del amplificado y el número de repeticiones. De esta forma, comparando el tamaño de los amplificados con un estándar de peso molecular conocido podremos determinar el número de repeticiones (Figura 12.1). TRATAMIENTO Hasta el momento no existe ningún tratamiento efectivo para estas enfermedades. El aná-

lisis genético es importante en estos pacientes para determinar la causa de su enfermedad y una vez tipificada la causa de su patología poder ofrecer en un futuro un tratamiento que podría ser distinto en función de su diagnóstico, ataxia de Friedreich, ataxias dominantes, enfermedades mitocondriales, etc. OTROS GENES Se han localizado otros genes responsables de ataxias hereditarias, SCA 4 en 16q22, SCA 5 en la región centromérica del cromosoma 1137-39. ATAXIA DE FRIEDREICH La ataxia de Friedreich es el primer cuadro patológico descrito de herencia autosómica recesiva debido a mutaciones dinámicas en la mayoría de los casos. El triplete expansionado es de tipo GAA localizado en el intrón 1 del gen X25. Esta expansión es causante de la ataxia de Friedreich en un 96% de los casos, el resto se deben a mutaciones puntuales en el gen X25 (9q13), que suelen dar lugar a un codon stop, traduciéndose en la aparición de proteínas truncadas. El rango normal de repeticiones GAA es de 8-23 repeticiones y repeticiones de 150-1.000 están asociadas con la enfermedad40. CLÍNICA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Figura 12.1. Gel diagnóstico de la ataxia autosómica dominante SCA 7, en el que se presentan cuatro pacientes, dos de los cuales 3 y 4 presentan la expansión CAG en el gen SCA 7.

La ataxia de Friedreich se caracteriza por la presencia de síntomas neurológicos y no neurológicos, así como por ser la ataxia hereditaria de aparición más precoz, generalmente en la primera o segunda década de vida. Pacientes con un bajo número de repeticiones (< 400) suelen comenzar la clínica en edades superiores a los 25 años21,41-43, existiendo una relación inversamente proporcional entre el número de repeticiones y la edad de inicio de la enfermedad como en el resto de las enfermedades producidas por mutaciones dinámicas.

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Dentro de los signos neurológicos, estos pacientes pueden presentar los mismos síntomas descritos para las ataxias de herencia dominante, pero a diferencia de estas, en la ataxia de Friedreich se ha descrito la presencia de sintomatología no neurológica como pie cavo, escoliosis, miocardiopatía hipertrófica (que suele ser la principal causa de fallecimiento de estos pacientes), atrofia óptica y sordera. Además, estos pacientes pueden presentar diabetes mellitus1,44.

Esta proteína presenta una localización mitocondrial y está asociada con las crestas y membranas mitocondriales47. La función de esta proteína se postula que es la regulación de la homeostasis en la mitocondria, regulando proteínas que participan en el metabolismo del hierro en la mitocondria.

LESIONES NEUROPATOLÓGICAS EN LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Los primeros estudios del papel de la frataxina en la mitocondria y de la fisiopatología en la ataxia de Friedreich se realizaron en levaduras, donde mutaciones en el gen YFH1 (yeast frataxin homologue 1) producían la no fermentación de fuentes de carbono y la reducción de la respiración46,48 y además eran más sensibles a agentes oxidantes49. En levaduras con mutaciones en el gen YFH1 el contenido en iones de hierro en la mitocondria era mayor que en la cepa salvaje, y además la concentración celular total de hierro en los mutantes era el doble que en la cepa salvaje49. El hierro participa en el metabolismo de los radicales libres en la mitocondria, y un exceso de hierro podría explicar el incremento de la sensibilidad frente al peróxido de hidrógeno y la posterior disfunción irreversible de la mitocondria ocasionada por el estrés oxidativo. Los efectos de la alteración en la frataxina también se manifiestan en el citoplasma donde se produce una inactivación de los ISC (iron-sulfur-cluster). La aconitasa libera el grupo ISC, trasformándose en IRE-BP1 (iron responsible element-binding protein), que se traduce en un incremento de la concentración de hierro, y parte de este hierro liberado será transportado a la mitocondria por los transportadores de hierro presentes en la membrana mitocondrial. La proteína ABC7 es la encargada de exportar los grupos ISC desde la mitocondria al citosol (Figura 12.2). En humanos se postula que el mecanismo es similar al observado en levaduras, de tal manera que el hierro acumulado en la mitocondria de los pacientes con ataxia de Friedreich se traduce en una alta sensibilidad al estrés oxidativo. Estos acúmulos de hierro se han observado en autopsias de pacientes de ataxia de Friedreich,

En la ataxia de Friedreich están afectados tanto el Sistema Nervioso Central, donde existe afectación cerebelar, como el Sistema Nervioso Periférico, donde se ha descrito afectación del ganglio de la raíz dorsal de los nervios, los cordones posteriores de la médula espinal y las fibras gruesas mielínicas de los nervios periféricos45. EXPRESIÓN DEL GEN: PROTEÍNA La proteína codificada por el gen X25 es la frataxina, una proteína de 210 aminoácidos. La expresión de esta proteína no se limita a las zonas del sistema nervioso donde se han detectado lesiones (cerebelo en el Sistema Nervioso Central y regiones del Sistema Nervioso Periférico citadas en el apartado anterior) sino que también se ha visto que esta proteína se expresa en tejidos ajenos al sistema nervioso, como es el caso del corazón y el páncreas, razón por la que los pacientes de ataxia de Friedreich presentan miocardiopatía hipertrófica y diabetes mellitus40,46. También se expresa en otros tejidos donde no se detectan alteraciones en los pacientes, como son hígado, músculo y timo. Todos los tejidos donde existe una alta expresión de esta proteína tienen en común el tener un gran número de mitocondrias46. El porqué las lesiones aparecen en unos tejidos y no en otros si la proteína se expresa en todos los mencionados es que sólo se producen lesiones en todos aquellos en los que las células muertas no se suplantan por células nuevas, como ocurre con las neuronas, células beta del páncreas o células del corazón.

FISIOPATOLOGÍA EN LA ATAXIA DE FRIEDREICH

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Figura 12.2. Esquema del proceso patogénico en la ataxia de Friedreich. En el esquema se aprecia el papel de la Frataxina en la regulación de la homeostasis en la mitocondria. Cuando la Frataxina está inactiva, se produce una inactivación de las proteínas mitocondriales ISCP (Iron-Sulfur Cluster protein), representado en el esquema por los complejos C I, CII, C III. Como consecuencia se produce la acumulación de hierro mitocondrial, que mediante las reacciones representadas en el esquema con oxígeno molecular generan radicales libres que son los responsables del estrés oxidativo.

en las mitocondrias de fibras musculares cardíacas e incluso en mitocondrias de células hepáticas50. DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH El diagnóstico se realiza de igual forma que las ataxias dominantes; después de la extracción de DNA, se amplifica la región que contiene la expansión GAA, y los productos de la reacción se analizan en geles de agarosa.

TRATAMIENTO DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH Hasta el momento no existe un tratamiento efectivo para la ataxia de Friedreich; estos pacientes son tratados con fármacos que actúan frente a la sintomatología que se presenta en esta enfermedad: se trata la diabetes mellitus en aquellos pacientes que la padecen, los problemas óseos como la escoliosis, los problemas cardíacos, etc. Recientemente se ha iniciado el tratamiento de estos pacientes con un análogo de la coenzima Q, la idebenona, para corregir las alteraciones

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oxidativas presentes en ellos. Este tratamiento se ha visto que aumenta la supervivencia de los ratones transgénicos y en humanos reduce las lesiones cardíacas, pero su capacidad de reducir los déficits neurológicos está aún por demostrar. ATAXIA PRODUCIDA POR DÉFICIT DE VITAMINA E Problemas asociados con el déficit de vitamina E causan trastornos neurológicos similares a la ataxia de Friedreich. Estas deficiencias pueden ser debidas a diferentes causas, como en el síndrome de malabsorción. Se ha descrito un déficit de vitamina E de herencia recesiva cuya causa no es la malabsorción de esta vitamina, sino mutaciones en el gen que codifica para la proteína de trasferencia del α-tocoferol (α-TTP) localizado en 8q13. Mutaciones en este gen causan cuadros clínicos indistinguibles de la ataxia de Friedreich y son igualmente de aparición temprana. La diferencia entre ambas patologías fenotípicamente idénticas, pero de causas distintas, es la presencia de niveles muy bajos de vitamina E en los pacientes con mutaciones en el gen α-TTP. Se han descrito varias mutaciones en el gen que son responsables del fenotipo común a la ataxia

Figura 12.3. Gel diagnóstico de ataxia de Friedreich, todos los pacientes son negativos para la expansión a excepción del que se representa en la calle 6.

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de Friedreich. En población mediterránea la mutación más frecuente es la delección de una adenina en la posición 744 del exón C51. No es la única mutación descrita, ya que hay mutaciones de diversa naturaleza, delecciones, inserciones y cambios de base. Esta patología tiene un tratamiento con vitamina E que puede ser efectivo impidiendo el progreso de la enfermedad. Es, por tanto, aconsejable el estudio del gen en aquellos pacientes que presenten un cuadro clínico compatible con una ataxia de Friedreich y no presenten mutación en el gen X25, y, además, en una analítica presenten déficit de vitamina E51. BIBLIOGRAFÍA 1. Harding AE, Hewer RL. The heart disease of Friedreich’s ataxia: a clinical and electrocardiographic study of 115 patients, with an anlysis of serial electrocardiographic changes in 30 cases. Q J Med 1983; 52: 489-502. 2. Gudmundsson K. The prevalence and occurrence of some rare neurological diseases in Iceland. Acta Neurol Scand 1969; 45: 114-118. 3. Polo JM, Calleja J, Combarros O, et al. Hereditary ataxias and paraplegias in Cantabria, Spain. An epidemiological and clinical study. Brain 1999; 114: 855-66. 4. Komure O, Sano A, Nishino N, et al. DNA analysis in hereditary dentatorubral-pallidoluysian atrophy: correlation between CAG repeat lenght and phenotypic variation and the molecular basis of anticipation. Neurology 1995; 45: 143-149. 5. Ranen NG, Stine OC, Abbot Mh et al. Anticipation and instability of IT-15 (CAG)n repeats in parentsoffspring pairs with Huntington’s disease. Am J Hum Genet 1995; 57: 593-602. 6. Sinden RR. Biological implications of the DNA structures associated with disease-causing triplet repeats. Am J Hum Genet 1999; 64: 346-353. 7. Kawaguchi Y, Okamoto T, Taniwaki M, et al. CAG expansion in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q 32.1. Nat Genet 1994; 8: 221-227. 8. Orr H, Chung M, Banfi S, et al. Expansion of an unstable trinucleotide CAG repeat in SCA type I. Nat Genet 1993; 4: 221-6. 9. Sampei K, Takamo H, Igarashi S, et al. Identification of the SCA type 2 gene using a diret identification of repeat expansión and cloning technique, DIRECT. Nat Genet 1996; 14: 277-84.

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C APÍTULO

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Genética de las demencias M. Barón y A. Jiménez Escrig

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Los factores genéticos han sido básicos para el desarrollo del conocimiento de la enfermedad de Alzheimer en los últimos años. Su importancia se manifiesta en el hecho de que, además de los casos precoces familiares de evidente causa genética, la presencia de antecedentes familiares es uno de los principales factores de riesgo para la enfermedad tardía1. Clínicamente no parece haber diferencias entre casos familiares y esporádicos2. En la genética de la enfermedad de Alzheimer existe diferencia entre los raros casos de aparición precoz con antecedentes familiares, en que se comporta como una enfermedad autosómica dominante, y la forma tardía, mucho más frecuente, en que la mayoría sigue un modelo de enfermedad compleja, poligénica3,4. Por este motivo se distinguen entre los factores genéticos relacionados con la enfermedad de Alzheimer precoz, causales, cuya alteración determina la aparición de la enfermedad, y los de la enfermedad de Alzheimer tardía, factores de susceptibilidad que favorecen el desarrollo de la enfermedad pero no la determinan (Tabla 13.1). En la enfermedad de Alzheimer familiar precoz aún no se han identificado los genes causales de, al menos, el 50% de los casos. Pero es en la

enfermedad de presentación tardía, que implica a la gran mayoría de los casos, donde el estudio genético resulta más complicado. En la enfermedad tardía, solo el alelo APOE-ε4 ha demostrado una relación inequívoca con su desarrollo, pero es únicamente un factor de riesgo: no es necesario ni suficiente para producir la enfermedad de Alzheimer. Así, en estudios epidemiológicos se estima que el 42-68% de los pacientes con enfermedad tardía no tienen un alelo APOE ε-45,6. Sin duda deben interaccionar otros factores ambientales y/o genéticos (otros loci de susceptibilidad para la enfermedad) en múltiples combinaciones posibles para favorecer su desarrollo. En este capítulo se repasan los métodos utilizados para la investigación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer, se describen los más importantes y se valora la influencia de la genética en la práctica clínica.

Métodos generales para el estudio de genes de susceptibilidad Las dos aproximaciones más habituales para encontrar loci de susceptibilidad son: a) los estudios de genes candidatos; y b) los de búsqueda genómica o aproximación posicional7. 159

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Tabla 13.1. Frecuencia y tipos de enfermedad de Alzheimer, según la edad de inicio. % Menores de 60 años:

5-10%

E. de Alzheimer PRECOZ ESPORÁDICA E. de Alzheimer PRECOZ FAMILIAR

2,5% 2,5% < 1%

Mayores de 60 años:

90-95%

E. de Alzheimer TARDÍA ESPORÁDICA

30% 50% 5% 2,5%

Enfermedad de Alzheimer TARDÍA FAMILIAR

En la aproximación a genes candidatos se estudian aquellos que se suponen relacionados con la enfermedad sin tener en consideración su localización subcromosómica. Se analiza la asociación de determinados polimorfismos de estos candidatos con la enfermedad, en estudios de casos y controles. Generalmente, un gen candidato se selecciona por su posible relación con la patogenia de la enfermedad. Así, se han propuesto genes relacionados con la apolipoproteína E (apoE), con otras proteínas encontradas en la placa senil o con diversos mecanismos propuestos como apoptosis, alteraciones oxidativas, neurotransmisión, metabolismo de la tau o la APP, inflamación, etc. La aproximación posicional es mucho más compleja pero permite encontrar nuevos genes que puedan ser propuestos como candidatos. Este método no selecciona un gen a priori, sino que analiza el ligamiento o la asociación entre la enfermedad y marcadores polimórficos distribuidos por el genoma. Los métodos de asociación utilizan muestras de casos y controles no relacionados o hermanos que no coinciden en cuanto a la enfermedad y analizan las diferencias en frecuencia alélica entre los individuos afectados y los no afectados. En cambio, los estudios de ligamiento usan familias amplias o parejas de hermanos afectados y buscan regiones genómicas en las que existe mayor concordancia entre los familiares afectados. Los resultados del ligamiento se analizan usando, bien métodos paramétricos, que especifican un modo de transmisión, la fre-

Gen

Presenilina Presenilina APP

APOE Desconocido APOE Desconocido

cuencia de los alelos y las penetrancias del locus de susceptibilidad encontrado, bien métodos no paramétricos, generalmente de modelo libre8. Estos métodos en general son costosos y de difícil interpretación. Para intentar mejorar su rendimiento, últimamente se están empleando estudios estadísticos más refinados9. Como ejemplos están la estratificación de los datos familiares10, los estudios de ligamiento condicionado, otros derivados de análisis de segregación oligogénica11, etc. Actualmente también se pueden buscar candidatos para su análisis posterior mediante el estudio de la diferente expresión de genes en cerebros con enfermedad de Alzheimer respecto a normales, especialmente utilizando nuevas tecnologías que permiten el estudio de expresión de una enorme cantidad de genes al mismo tiempo (microarray)12,13. Asimismo, se dispone de nuevas posibilidades en los estudios de búsqueda genética como la identificación de nuevos polimorfismos en genes candidatos de neurodegeneración14 o el conocimiento de una nueva generación de polimorfismos en nucleótidos aislados (SNP) que permiten utilizar mapas de alta densidad de polimorfismos y pueden ser una herramienta útil en el estudio genético de enfermedades complejas15. El conocimiento de estos polimorfismos nuevos permite abordajes estadísticos novedosos para estos estudios poblacionales de casos y controles, como el uso de frecuencias de haplotipo estimadas, en que el desequilibrio de ligamiento se explota para la asociación con la enfermedad, au-

GENÉTICA DE LAS DEMENCIAS

mentando su rendimiento16. En cualquier caso, este es uno de los campos de investigación más activos en la actualidad. Estudios de aproximación posicional. Regiones cromosómicas. Hasta el momento solo se han llevado a cabo cuatro estudios de búsqueda de todo el genoma en la enfermedad de Alzheimer tardía: dos estudios amplios por el mismo grupo de investigadores, el primero en 38 familias17; el último en 466 familias10, ambos utilizando métodos paramétricos y no paramétricos; un estudio utilizando análisis no paramétricos en parejas de hermanos afectados18; finalmente, otro de asociación en una muestra de casos y controles confirmados por autopsia19. Solo la región del cromosoma 19 en torno al locus de la APOE mostró ligamiento en todos los estudios. Las principales regiones en las que se encontró asociación o ligamiento son: 1. Cromosoma 19, donde se localiza la APOE y otros candidatos (calmodulina...). 2. Cromosoma 1217 donde se localiza el gen de la α-2 macroglobulina (A2M) o el del LRP (lipoprotein receptor protein), confirmado por otros estudios independientes20,21, y que recientemente se ha asociado a la variante con cuerpos de Lewy, sin relación con la APOE22. El pico de máximo ligamiento no es idéntico, pero esto probablemente se debe a uso de metodologías diferentes o a variaciones del propio método8. 3. Diversos loci en el cromosoma 10. Destaca un estudio que describe un nuevo locus en la región que codifica el enzima de degradación de insulina, que parece tener un papel en la degradación de Aβ23. También es interesante otro estudio que demuestra ligamiento en otra región del cromosoma 10 en pacientes con niveles plasmáticos altos de Aβ4224, en la misma localización que otro estudio de parejas de hermanos25. Probablemente, todos los ligamientos estén relacionado con el mismo locus de susceptibilidad. 4. Cromosoma 6p21.3, donde se localizan los loci del HLA y el TNF26,27. 5. Cromosoma 13q1228. 6. Cromosoma 910.

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7. Cromosoma 21, locus de APP. Además de las infrecuentes mutaciones causales de enfermedad precoz, un estudio de ligamiento utilizando parejas de hermanos mostró una asociación significativa de este locus con enfermedad tardía29.

Mutaciones causales y polimorfismos de riesgo

De todos los posibles factores genéticos que se han intentado implicar en la etiopatogenia de la enfermedad de Alzheimer se resaltarán aquí algunos de los más significativos (Tabla 13.2): los tres genes causales de Alzheimer precoz, APP, PS-1 y PS-2; la APOE; genes relacionados con la APOE (otras variaciones en exones o en la región promotora, receptores, otras lipoproteínas); con el metabolismo de la APP (BACE, intrón de PS-1); con la inflamación (A2M, ACT, HLA, citocinas); con alteraciones mitocondriales; neurotransmisión (butirilcolinesterasa).

1. Proteína precursora de amiloide

En los años ochenta se intentó localizar el gen de la enfermedad en el cromosoma 21, dado que los pacientes con síndrome de Down, trisomía del cromosoma 21, presentan con mucha frecuencia la enfermedad de Alzheimer en edades medias de la vida30. Por otra parte, tras solubilizarse y conocerse la secuencia del Aβ, en 1987 se localiza el origen del Aβ en el cromosoma 21. Mediante hibridación con una sonda complementaria al Aβ se vio que esta se origina por la sección de una proteína de mayor tamaño, que llamaron proteína precursora de amiloide (APP; amyloid precursor protein) (Figura 13.1)31,32,33. En ese mismo año se describió un ligamiento a marcadores del cromosoma 21 en familias con enfermedad de Alzheimer34. Sin embargo, en un análisis posterior se vio que el ligamiento solo afectaba a alguna de las familias estudiadas33. Finalmente, en 1991, se demostró la existencia de mutaciones en la APP en pacientes con la enfermedad35. El número de familias que presentan mutaciones en el gen de la APP es reducido36, afec-

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Tabla 13.2. Genes de susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer. APOLIPOPROTEÍNAS APOE, APOA-IV, APO-CI, Apolipoproteína J RECEPTORES DE APOE: LRP, LDL, VLDL REGIÓN REGULADORA DE APOE: polimorfismos –491, -186, APO-E1 OTROS POLIMORFISMOS DE APOE: mutación Pittsburg RELACIONADOS CON EL METABOLISMO DE LÍPIDOS: Lipoproteín lipasa, paraxonasa ALTERACIONES OXIDATIVAS Y DEL METABOLISMO NEURONAL Citocromo p450D, óxido nítrico sintetasa 3,mieloperoxidasa, transferrina C2, dihidrolipoamida S-succiniltransfera, hemooxigenasa 1, feniletanolamina N-metil transferasa ALTERACIONES MITOCONDRIALES Mutaciones en complejos de transporte de electrones: complejo I, subunidad ND1, ND2, complejo IV, citocromo C oxidasa (subunidad 1,2), mutaciones puntuales: Mt5460, Mt4336, ARNr 12S RELACIONADAS CON Aβ BACE, cystatina C, intrón de la PS-1, intrón de la PS-2, catepsinas, precursor del NAC, α-quimotripsina, receptor de AGE, otros componentes de APP, proteína de unión a APP, enzima convertidora de angiotensina-I, dipeptilcarboxipeptidasa, proteína de la membrana espermática, enzima de degradación de la insulina INFLAMACIÓN Antiquimotripsina, α2-macroglobulina, β2-microglobulina, αBcristalina, proteína S100b, factores de crecimiento TGF β-1 CITOCINAS: IL-β, IL-α, IL6, TNFα HLA: HLA-2, HLA-DR APOPTOSIS Caspasas: caspasa 1 (enzima convertidora de IL-1β), otras caspasas: 3, 6, 7, 8, 10 Protooncogenes y factores de transcripción: BCL2, BAX Gen ligado a apotosis-2: NCKAP, receptor FAS CITOESQUELETO Proteína asociada a microtúbulos Neurofilamentos: componentes de alto, medio y bajo peso molecular Quinasas: ERK, SERK, GSK, MARK Fosfatasas: componentes de las fosfatasas: 2,3 NEUROTRANSMISIÓN Receptores muscarínicos (1-5), receptor nicotínico: subunidades α2,3,4,5,7 y β2,3,5, acetilcolinesterasa, butirilcolinesterasa, trasportador vesicular de acetilcolina, carnitina actetil transferasa, colinaacetiltransferasa, galanina, receptor de galanina,glutamina sintetasa, canales de potasio, receptor de serotonina 6, triptófano hidroxilasa, receptores de glutamato: 5,6, AMPA 1-4, Kainato 3-5, metabotrópico 3,8, NMDA-A,1,2A,2B,2C FACTORES NEUROTRÓFICOS BDNF, oncogén TRK, NGF: subunidades α, β, γ, receptores de NGF, NF-3, receptores neurotróficos de tirosina quinasa: tipos 1-4, neurotrofina-3 TRANSDUCCIÓN DE SEÑAL Calmodulina, quinasa dependiente de GMPc, activador de Fe65, V-Fos, factor transcripcional LBP-1c/CP2/LSF, receptor intramembrana G(o) OTROS POLIMORFISMOS RELACIONADOS CON LA PLACA SENIL Componente P del amiloide, ubiquitina, transtiretina OTROS MARCADORES DIAGNÓSTICOS δ-catenina, GAP-43, NOTCH-3, bleomicin hidrolasa, locus MN, metalotioneina 3, CRH (hormona de liberacion de corticotropina), fosforribosil glicinamida formil transferasa, metilentretrahidrofolato reductasa

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Figura 13.1. APP y enzimas que la cortan (α-, β- y γ-secretasas). β- y γ-secretasas cortan un fragmento que es amiloidogénico (Aβ) y α-secretasa corta la APP en fragmentos no amiloidogénicos.

tando solo al 5-10% de las formas familiares precoces. La mayoría de los pacientes manifiestan la enfermedad en torno a los 45-60 años. Todas las mutaciones descritas hasta el momento se encuentran en los exones 16 y 17, correspondientes a la secuencia del péptido Aβ, o en los nucleótidos cercanos. Como resultado de estas mutaciones se produce una acumulación excesiva de Aβ42-4337,38, que favorece la formación de placas neuríticas.

2. Presenilinas 1 y 2

Tras conocerse la existencia de mutaciones en la APP, se vio que existían familias con enfermedad de Alzheimer familiar que no presentaban mutaciones en este gen. En 1992 se obtuvo un ligamiento de algunas de estas familias a marcadores en el brazo largo del cromosoma 1439,40,41. Tras el estudio de varios candidatos y la utilización de marcadores cada vez más próximos, en 1995, Sherrington et al.42 describieron un nuevo gen que denominaron S182, como responsable de estas formas precoces de enfermedad. Posteriormente, tras ser rebautizado como PS-1 por el Alzheimer’s Disease Collaborative Group43, Rogaev et al.44 describieron su secuen-

cia, estructura genética y formas de transcripción alternativas. Pronto se describieron múltiples mutaciones en todos los dominios de la proteína, aunque parece haber un agrupamiento en el dominio transmembrana 243. Hasta el momento se han descrito en torno a 12045. La mayoría son mutaciones puntuales que provocan un cambio en la estructura primaria de la proteína, y no parecen relacionarse específicamente con la edad de aparición o con formas clínicas determinadas. Existen dos excepciones: una mutación que provoca un codon de parada46,47, y la conocida como Δ9 por la delección del exón 9, que se asocia con más frecuencia con paraparesia espástica y depósitos de amiloide diferentes de los habituales en la enfermedad de Alzheimer48. Poco después del descubrimiento de la PS-1 se produjo el de la PS-2 en el cromosoma 1, mediante la búsqueda de secuencias homólogas a la PS-1 en el genoma humano43,49. El número de mutaciones descrito por este gen es mucho menor (6 hasta la fecha) y se da solo en un número muy reducido de familias, como las conocidas familias alemanas del Volga y una italiana50. Recientemente se ha descrito una mutación (D439A) en la presenilina 2 en un paciente español51.

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IDE, uPA, neprilisina

Figura 13.2. Esquema de la degradación de Aβ y el papel de las proteínas cuyos polimorfismos influyen en la enfermedad de Alzheimer. ApoE y α2-M vehiculan Aβ al receptor LRP que la internaliza. Las citocinas van a incrementar la reacción inflamatoria a nivel de la placa senil, y posiblemente también aumentan la degradación de APP. Recientemente, se incluyen en este esquema las proteínas implicadas en la degradación del amiloide: insulin degrading enzyme (IDE), uPlaminogen activator y neprelisina, localizados en el cromosoma 10.

3. Apolipoproteína E

A diferencia de las mutaciones referidas previamente, responsables de formas familiares precoces de la enfermedad de Alzheimer, en general excepcionales, la APOE se ha relacionado con formas tardías (mayores de 65 años), tanto familiares como esporádicas. En la enfermedad de Alzhemier precoz familiar su influencia ha dado lugar a resultados contradictorios, siendo evidente los que no están relacionados con mutaciones en las PS o la APP52. La APOE se codifica en el cromosoma 19. Este gen es polimórfico con tres alelos codominantes (APOE-ε2, ε3, ε4) que codifican las tres principales isoformas de la proteína apoE, E2, E3 y E4, que determinan seis fenotipos plasmáticos (E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4)53. Las tres isoformas difieren por la sustitución de uno o dos aminoácidos en los residuos 112 y 158, de forma que la E2 tiene cisteína en ambos, la E4 arginina en ambos, y la E3 cisteína en el 112 y arginina en el 158. En gene-

ral, el alelo más frecuente es el ε3, seguido del ε4 y, por último, ε2, en proporción variable entre las diversas poblaciones54. Se ha visto que en la enfermedad de Alzheimer, especialmente en formas tardías familiares y esporádicas, el alelo ε4 está sobrerrepresentado, incluso invirtiendo la proporción habitual55. Así, los individuos que poseen al menos una copia de este alelo presentan un riesgo superior a aquellos que no presentan ninguna copia. El papel de la APOE en la enfermedad de Alzheimer no está claro. La diferente relación de riesgo en función del sexo, más evidente en mujeres56, la existencia de un efecto de dosis57 o el hecho de que parece adelantar la edad de inicio en enfermedad tardía58, evidencian su relación con el proceso neurodegenerativo. Sin embargo, se ha visto asociación de E4 con otros procesos degenerativos, especialmente otras demencias, como la vascular o la enfermedad de Pick58,59,60, lo que sugeriría que el genotipo ε4 sería un factor de riesgo para demencia, de forma global, y no

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específico para enfermedad de Alzheimer. Aun así, existen estudios que no muestran estas asociaciones, y en cualquier caso nunca han sido tan significativas. Al contrario de lo que sucede con las mutaciones que causan las formas familiares de enfermedad de Alzheimer precoz, la presencia de ε4 no implica la aparición segura de la enfermedad. La constatación de sujetos sanos en edades avanzadas con APOE-ε4, así como la existencia de enfermos sin este genotipo61, implica que algunos de los pacientes APOE-ε4 posiblemente no estén relacionados con la enfermedad y, por otra parte, hace que el valor predictivo de este test en estudios clínicos sea suficientemente bajo como para que no esté recomendada su utilización rutinaria62. El papel de la APOE parece relacionado más con la edad de aparición de la enfermedad que con su desarrollo en sí 63. En estas circunstancias su verdadero papel sería adelantar la edad en la que aparece enfermedad. Por otra parte, parece que se puede asociar a otros factores genéticos que podrían favorecer su expresión o su mecanismo de acción, como la asociación con nuevos polimorfismos en otros genes o en el mismo gen de la APOE o en su región promotora, o en los de sus receptores. También pueden actuar conjuntamente con factores ambientales. Así, se conoce que existe más riesgo de enfermedad de Alzheimer tras traumatismo craneoencefálico en pacientes con el polimorfismo ε-464. 3.1. Polimorfismos relacionados con APOE

Dada la indiscutible asociación de la apoE con la enfermedad de Alzheimer se han intentado relacionar otros polimorfismos relacionados bien por su función, en otras apolipoproteínas o en receptores, bien por localizarse en o en torno al propio gen APOE.

Genes relacionados por su función

Se han buscado polimorfismos en genes que codifican otras lipoproteínas como, por ejemplo,

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la APO-CI, que además está en desequilibrio de ligamiento con APOE-ε465 o la APOA-IV, uno de cuyos polimorfismos, que determina cambios en la proteína (360Gln/His) se ha relacionado con enfermedad de Alzheimer; la presencia del alelo 2 (His) confería más riesgo en un estudio66 pero no en otros67. Los estudios en los genes de los receptores de lipoproteínas han dado resultados contradictorios. No se ha demostrado asociación de forma consistente entre polimorfismos de los genes de VLDL-R o LDL-R con la enfermedad de Alzheimer. El gen de la LRP, situado en el cromosoma 12 cercano a la A2M, parece ser un buen candidato, y de hecho se han relacionado al menos dos polimorfismos con la enfermedad de Alzheimer, un tetranucleótido trialélico en la región 5’ (83, 87 y 91 pb) y un polimorfismo bialélico en el exón 3 (T/C)68, aunque con resultados contradictorios tanto positivos en uno reciente en población japonesa69, como negativos en diversas poblaciones70,71, incluida la nuestra72. Un estudio reciente utilizando el análisis de haplotipos para valorar los dos polimorfismos de LRP sugirió un haplotipo de más riesgo (concretamente el 91-C), en el límite de la significación73. La lipoproteinlipasa, que interviene en el transporte de lípidos desde las lipoproteínas a las células, también presenta dos mutaciones que se han asociado a la enfermedad de Alzheimer74.

Polimorfismos cercanos a la APOE

En relación con la propia APOE se han estudiado de forma específica polimorfismos en la región promotora o en los exones de la propia APOE. El papel de la región regulatoria de la expresión de apoE ha sido recientemente revisada75. Diversos polimorfismos en estas regiones favorecen una mayor o menor expresión de la proteína, interviniendo en la patogenia de la enfermedad. Así, entre otros, se ha relacionado con la enfermedad un cambio G → T en la región promotora, posición –186, en el TATA box Th1/E47cs76. Por otra parte, los homocigotos AA para el polimorfismo A/T en posición –491, en la región reguladora del gen de APOE, también se han relacionado con un mayor riesgo para la enfermedad

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quizás relacionado con una alteración en la expresión de apoE77; es más, los homocigotos TT parecen tener un riesgo reducido78. La secuenciación de una región de 5,5 kb en torno al locus de la APOE ha identificado 22 SNP y 31 haplotipos diferentes. De estos, 15 haplotipos incluyen la región previa al exón 1 y, por tanto, pueden alterar la transcripción. Desde este punto de vista, no sería un polimorfismo puntual sino haplotipos específicos los que se asociarían a diferentes niveles de expresión de la proteína79. Entre las mutaciones exónicas destaca la APOE Pittsburgh. Se trata de una mutación puntual en el exón 3 de la APOE, consistente en una sustitución 2912T → C, que determina un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína (P28L). Esta mutación se da siempre asociada al genotipo APOE-ε4 (APOE-ε4P). En un estudio multicéntrico estadounidense los portadores de un alelo APOE-ε4P tenían un riesgo de enfermedad de Alzheimer cinco veces superior al de los APOE-ε4 sin la mutación80. Esto sugería que diversas modificaciones de la proteína podrían conferir mayor poder patógeno a la apoE4, explicando, en parte, la existencia de sujetos APOE-ε4 sanos. Estos resultados no se han confirmado en nuestra población.

4. Polimorfismos relacionados con la APP Intrón de PS-1

Se ha relacionado un polimorfismo T → G en el intrón 9 de la PS1 con un riesgo aumentado de padecer la enfermedad de Alzheimer; pero estos datos al estudiarlos han sido contradictorios en otras poblaciones81. Enzima convertidora de amiloide β

La BACE (β-secretasa) es el paso limitante en el procesamiento de la APP en su vía amiloidogénica. Por tanto, su gen es un buen candidato para la etiología de la enfermedad de Alzheimer. Se han descubierto dos polimorfismos en este gen pero ninguno parece influir en el riesgo de la enfermedad82.

5. Proteína tau

A pesar de su importancia patogénica no se ha encontrado una relación concluyente entre la enfermedad de Alzheimer y alteraciones genéticas en la proteína tau83,84, a diferencia de la demencia frontotemporal.

6. Genética mitocondrial

En el Alzheimer tardío se ha sugerido una participación de alteraciones genéticas mitocondriales, tanto por la relación del metabolismo energético con la patogenia como por el posible mayor riesgo de herencia por vía femenina. Se han propuesto diversas alteraciones en la última década, desde el trabajo de Lin85 hasta el más reciente de Qiu86, generalmente relacionadas con genes de la cadena respiratoria. Sin embargo, no se ha llegado a resultados concluyentes, en parte por la dificultad del estudio del DNA mitocondrial (heteroplasmia, pseudogenes, etc.).

7. Inflamación

Se han buscado polimorfismos relacionados con la enfermedad de Alzheimer en los genes que codifican algunos de los mediadores inflamatorios que podrían intervenir en su patogenia, especialmente los localizados en regiones cromosómicas de riesgo para la enfermedad, antes descritos. Así, la fase II del «National Institute of Mental Health Alzheimer’s Disease Genetics Initiative» (NIMHADGI) encontró una posible relación de la enfermedad con una delección en la A2M, en el cromosoma 1287 y una región en el cromosoma 6p21.3, donde se localizan los loci del HLA y el TNF26,27. α1-antiquimotripsina

La posible asociación de al menos dos polimorfismos de ACT con la enfermedad de Alzheimer ha mostrado resultados controvertidos. Así, una mutación A → G en posición +1252 se relacionó con un mayor riesgo88: algunos estudios en

GENÉTICA DE LAS DEMENCIAS

otras poblaciones han confirmado estos datos89, a diferencia de otros90,91. α2-macroglobulina

La A2M está ligada a la LRP funcionalmente y por su proximidad en el cromosoma 12, por lo que muchos estudios de asociación analizan polimorfismos en ambos genes. Una delección de un pentanucleótido del gen de la A2M (genotipo A2M-2) se ha asociado con un mayor riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer sin que se relacionase con la edad de inicio ni con el genotipo APOE. Este estudio de asociación familiar92 no ha sido confirmado en otros poblacionales93. También se ha sugerido que otro polimorfismo funcional (G/A → 1000Val/Ile), se relaciona con la enfermedad94. Estudios recientes en otras poblaciones no encuentran asociación con estos polimorfismos72,71.

Polimorfismos del HLA

La presencia de HLA-A2 no se ha relacionado con mayor riesgo de enfermedad de Alzheimer pero sí con una edad más temprana de inicio. Esto ha sido confirmado en poblaciones de distinto origen95,96,97. El HLA de clase II se ha asociado con menos consistencia. En un estudio, los genotipos HLADR1, 2 o 3 se mostraban como factores de riesgo de la enfermedad, mientras que los 4 y 6 eran factores protectores98. En otro, la asociación se estableció con el genotipo HLA-DRB1*0399.

Citocinas

Factor de necrosis tisular

Aunque el TNFα se ha relacionado con la patogenia de la enfermedad y sus niveles están aumentados en LCR en los pacientes100, no se había encontrado relación de ningún polimorfismo de este candidato con la enfermedad hasta un reciente estudio del NIMHADGI101. Estudiaron

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tres polimorfismos, –308 promotor, cuyo alelo 2 se asocia a enfermedades autoinmunes, –238 promotor y el microsatélite TNFα, cuyo alelo 2 se asocia a mayor secreción de TNF, formando un haplotipo, 2-1-2, significativamente asociado a la enfermedad de Alzheimer.

Interleucinas 1

Las IL-1 forman una familia de al menos tres polipéptidos estructuralmente relacionados, IL1α, IL-1β y antagonista del receptor de IL-1, codificados por genes diferentes, todos agrupados en el cromosoma 2q14-q21102. Un polimorfismo en el gen de la IL-1β (C → T en posición +3953) que da lugar a un aumento muy significativo de sus niveles, y otro de la región reguladora 5’ de IL-1α (C → T en posición –889) se han relacionado con distintas enfermedades inflamatorias. El genotipo 2,2 de IL-1α se ha relacionado con riesgo aumentado de enfermedad de Alzheimer103,104 y parece influir en la edad de inicio de la enfermedad105,106. Los pacientes homocigotos para el alelo 2 de ambos, IL-1α e IL-1β, parecen tener aún mayor riesgo103. En un estudio se ha visto que este polimorfismo de IL-1α influye porque acelera la progresión de la enfermedad107. Sin embargo, no ha demostrado relación con la enfermedad de Alzheimer en otra población105. No se han estudiado otros polimorfismos, sobre todo de IL-1β, uno de los principales mediadores de la respuesta inflamatoria crónica. Interleucina 6 Se ha estudiado un polimorfismo de IL-6, una repetición en tandem flanqueando la región 3’, cuyo alelo C parece reducir los niveles de esta proteína. Su presencia se ha relacionado con un menor riesgo de enfermedad de Alzheimer y aumento de la edad de inicio108; este efecto parece ocurrir solo en los casos que presentan la delección de A2M109. Otro polimorfismo de IL-6 (–176, promotor) también modifica la acción del polimorfismo antes descrito, aunque no es factor independiente de riesgo110.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

La genética de la enfermedad de Alzheimer en la práctica clínica Con una frecuencia cada vez mayor los familiares de los pacientes con enfermedad de Alzheimer preguntan sobre los riesgos de que la enfermedad sea hereditaria. Con los conocimientos actuales no es posible en la mayoría de los casos dar una respuesta completa a esta pregunta, pero sí podemos orientar según lo que se ha expuesto anteriormente. Lo primero que debemos investigar es si han existido otros casos en la familia. En el caso de que nos encontremos con una forma hereditaria dominante (varios miembros en la familia, inicio precoz), se puede orientar al paciente a un centro especializado en el estudio genético de la enfermedad de Alzheimer, para investigar mutaciones en los genes de la APP, PS-1 y PS-2. Este tipo de estudios, dada la rareza de estas familias (aproximadamente el 1-2% de los casos de enfermedad de Alzheimer), únicamente se realizan en pocos centros, habitualmente en el contexto de proyectos de investigación, más que de asistencia clínica. Si los estudios genéticos de un familia de este tipo dieran como resultado la existencia de una mutación causal, es posible entonces, con relativa facilidad, estudiar otros miembros de la familia, ya que su estudio no sería buscar todas la posibles mutaciones sino aquella que se ha encontrado en esa familia. Nos encontramos en este caso con una situación similar a la del diagnóstico genético de otras enfermedades neurológicas, del tipo del corea de Huntington. Hay que diferenciar si el estudio genético se hace a un paciente con síntomas clínicos, en cuyo caso es una prueba de diagnóstico más o si se hace a un familiar sin síntomas clínicos que quiere conocer su situación futura (diagnóstico presintomático). En este caso es preciso un completo consentimiento informado y una evaluación psicológica y eventual apoyo posterior a la comunicación del resultado. Pero la situación más frecuente es la información a familiares de pacientes con enfermedad de Alzheimer, de aparición senil, con o sin antecedentes familiares. En el caso de ausencia de antecedentes familiares, aunque el riesgo está aumentado, este aumento es en el ámbito de poblaciones, y a nivel individual el aumento de riesgo

no es predecible. Si existen antecedentes familiares, pero no un patrón hereditario, sino otro u otros individuos en la familia con enfermedad de Alzheimer, si la edad de aparición es tardía (a partir de los 65 años), hay aumento de riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer, pero no cuantificable en la actualidad. Para tranquilidad de los pacientes, cuanto mayor es la edad de aparición de la enfermedad de Alzheimer, menor es el riesgo familiar, por cuanto al ser la incidencia de enfermedad de Alzheimer mayor con la edad, cuando más longevos son los familiares más probabilidad hay de tener varios casos esporádicos en la misma familia. Conclusión A pesar de los recientes avances, la genética de la enfermedad de Alzheimer de inicio tardío está aún en sus inicios. Los métodos empleados en la detección de posibles regiones genómicas relacionadas con la enfermedad pueden permitir el análisis de nuevos genes candidatos, alguno de los cuales podría ser un factor de riesgo signifi8 cativo . Es esencial, por tanto, la búsqueda de familias con la enfermedad, que permita ampliar los estudios de aproximación posicional101. Por otra parte, los estudios de genes candidatos deben realizarse en distintas poblaciones dado que la variabilidad genética y ambiental modifican la influencia que pueda tener un genotipo concreto en la enfermedad de Alzheimer111. TAUPATÍAS Se conocen como taupatías las patologías en las que la lesión patológica esta formada por filamentos tau positivos112 . La patología de la tau es el nombre atribuido a la patología molecular de los ovillos neurofibrilares y otros agregados de proteína tau, que son la lesión que aparece en diversos procesos, más de 20, cuyo listado aparece en la Tabla 13.3. Estas patologías incluyen la enfermedad de Pick, la demencia frontal o frontotemporal, la parálisis supranuclear progresiva y la degeneración corticobasal. Además, pueden encontrarse lesiones tau positivas asociadas a otras

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Tabla 13.3. Tipos de taupatías. Taupatías primarias Demencia frontal, enfermedad de Pick. Degeneración corticobasal (CBD). Parálisis supranuclear progresiva (PSP). Demencia con granos argirófilos. Taupatías secundarias Enfermedad de Alzheimer. Gertsmann-Straussler. Demencia pugilística. Niemann-Pick tipo C. Parkinson postencefalítico.

alteraciones, o taupatías secundarias como en la enfermedad de Alzheimer. En los últimos años se han descrito algunas familias con defectos genéticos en el gen de la tau con diversas manifestaciones clínicas y patológicas113. El conocimiento de la genética de las taupatías es relevante por dos motivos. En primer lugar, por cuanto, al igual que en el caso del resto de las enfermedades neurodegenerativas, la caracterización y detección de mutaciones causales de moléculas como el Aβ, tau, proteína priónica o α-synucleína, acaecida en los años recientes, se ha constituido como una herramienta fundamental para conocer y clasificar la enfermedades degenerativas, constituyéndose estas proteínas como marcadores básicos de los procesos en los que aparecen. En segundo lugar, nos va a ayudar a conocer los mecanismos básicos de estas patologías y, por tanto, a abrir la posibilidad de desarrollar nuevas terapias para ellas. La proteína tau es una proteína asociada a microtúbulos, que son los encargados del transporte intraneuronal, implicada en su ensamblaje y estabilización114. La proteína tau está codificada por un gen de 100 kb localizado en el brazo largo del cromosoma 17, formado por 14 exones, generándose seis isoformas diferentes por empalme o splicing alternativo de 352 a 441 aminoácidos. La proteína tau tiene un dominio de unión a microtúbulos formado por secuencias repetidas, así llamadas porque tienen una secuencia de aminoácidos casi similar. Las diferentes isoformas de proteína tau pueden tener en la región carboxiter-

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minal 3 o 4 regiones de secuencias de 31 o 32 aminoácidos imperfectamente repetidas (Figura 13.3). Esta región es la que se une a microtúbulos, por lo que se conoce como el dominio de unión a microtúbulos. La cuarta repetición se produce cuando se incluye en el splicing el exón 10. La cantidad de tau 3R y 4R varía con el desarrollo, pero en el individuo adulto normal la relación es de 1/1. Asimismo, la proteína presenta diferentes puntos de fosforilización, regulándose su función por fosforilización. La fosforilización anormal de la proteína va a alterar la función de esta, produciéndose agregación de proteína tau y la desestabilización de los microtúbulos, con la consecuente muerte celular115,116. La hiperfosforilización y la fosforilización anormal son las principales anomalías bioquímicas de la proteína tau. No se conoce bien si la hiperfosforilización o la fosforilización anormal es suficiente para la formación de filamentos pareados helicoidales, ya que no se ha conseguido obtener estos con tau fosforilada recombinante, y sí en cambio si se añade a estos glicosaminoglicanos sulfatados como la heparina o el heparan sulfato. Este último se ha detectado en las neuronas en estadios precoces de degeneración neurofibrilar. Como los glicosaminoglicanos sulfatados estimulan también la fosforilización de la tau a través de determinadas proteinkinasas, la presencia precoz de heparan sulfato en las neuronas podría primero producir hiperfosforilización de la tau, produciendo alteraciones en su unión a microtúbulos y

Figura 13.3. Estructura de la proteína tau, mostrándose las secuencias repetidas (R) y los puntos principales de fosforilización.

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a mayor concentración generar su agregación en neurofilamentos. La proteína tau es una molécula extendida con escasa estructura secundaria, pudiendo la unión a glicosaminaglicanos inducir o estabilizar una conformación de tau que aproxime la regiones con repeticiones, favoreciendo la polimerización en filamentos. Las isoformas de tau con tres regiones repetidas se ensamblan en filamentos pareados helicoidales, mientras que las isoformas con cuatro regiones se ensamblan en filamentos rectos y su movilidad en SDS-PAGE se enlentence por fosforilización. La proteína tau se expresa fundamentalmente en el sistema nervioso, en las neuronas y en menor proporción en los oligodendrocitos117,118. Dentro de las neuronas, se expresa fundamentalmente en los axones. No parece que la función de la proteína tau sea fundamental, por cuanto el ratón knock-out para este gen es viable, presentando únicamente cambios menores como reducción del tamaño de los microtúbulos en los axones de pequeño calibre119. Anatomía patológica Por patología de la tau se entiende la agregación intraneuronal de la proteína asociada a microtúbulos tau formando filamentos anormales120. A nivel óptico, los filamentos de tau pueden aparecer con diferentes conformaciones: ovillos neurofibrilares, hilos del neuropilo, neuritas distróficas de las placas seniles y cuerpos de Pick. Con microscopía electrónica, el material filamentoso de la degeneración neurofibrilar es helicoidal, recto o girado, según el trastorno degenerativo en el que aparezca121. Si se homogeniza tejido nervioso que contenga inclusiones de tau patológica y se observa su patrón de electroforesis mediante la técnica de Western-blot, pueden encontrarse también diferentes patrones de migración según la patología de base: dobletes de alto peso (tau 64 y 69) en la PSP y CBD, dobletes de bajo peso (tau 55,64) en la enfermedad de Pick o una banda aislada de 60 kDa en la distrofia miotónica (Figura 13.4)122,123. La demencia frontal familiar, la parálisis supranuclear progresiva y la degeneración cortico-

Figura 13.4. Estructura del exón e intrón 10 de la proteína tau y disposición del aparato de splicing. Las mutaciones en el exón generan alteraciones en la función de la proteína tau. Las mutaciones en el intrón producen alteraciones en el splicing, con aumento de las isoformas que contienen este exón.

basal, son las taupatías más frecuentes. La primera se constituye como la principal taupatía hereditaria, mientras que, salvo excepciones, las dos últimas son esporádicas, si bien existen en ellas determinadas influencias genéticas, por cuanto el polimorfismo de la tau A0 o el haplotipo H1 se encuentra sobrerepresentado en estos procesos126,127. Con el redescubrimiento de las demencias frontales por el grupo de Lund y Manchester, se impulsó el estudio genético de estos pacientes, encontrándose inicialmente familias con ligamiento al cromosoma 17 y posteriormente con mutaciones en el gen de la proteína tau. Estas mutaciones se encuentran solo en los exones que codifican el dominio de unión a microtúbulos (9, 10, 12 y 13), salvo un caso recientemente descrito con una mutación puntual en el exón 1129. Clínica de las demencias frontales familiares El fenotipo de la demencia frontal familiar es amplio, presentándose generalmente inicialmente con trastornos de la personalidad y de la conducta y déficit ejecutivo prominente, apareciendo en los años siguientes anomalías en los movimientos oculares, trastornos del habla, parkinsonismo y disfagia. La edad de aparición y veloci-

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dad de progresión varía de unas mutaciones a otras, existiendo formas muy agresivas en las que el inicio puede estar en la tercera década. Según la clínica pueden diferenciarse dos formas: aquellas con clínica de demencia prominente y aquellas con clínica de trastorno del movimiento prominente (Tabla 13.4)130. La prevalencia de mutaciones en la tau en diferentes poblaciones con demencia frontal varía entre el 17% en una serie holandesa, al 6% en una serie americana. La mutación más frecuente es la P301L. La presencia de historia familar de demencia aumenta esta prevalencia al 10-50%. Cuando la anatomía patológica es positiva para taupatía, se van a encontrar mutaciones en la tau en casi el 100%. Sin embargo, hay que tener en cuenta que hay formas sin mutaciones en la tau, como las familias con demencia frontal, en las que se encuentra ligamiento al cromosoma 17, sin mutaciones en la tau, en las que puede existir

un gen causal próximo a la tau, o las taupatías con deplección de las 6 isoformas de tau, en las que no se ha encontrado mutaciones en la tau y se piensa pueden deberse a una alteración a nivel de la regulación postranscripción en el mRNA de tau o un incremento en la degradación de la tau, o familias con demencia frontal y esclerosis lateral amiotrófica en las que se ha encontrado ligamiento a un locus en el cromosoma 9q21-q22, con miopatía de cuerpos de inclusión y Paget, con ligamiento al cromosoma 9p13.3-p12 y otra familia con demencia frontal con ligamiento a un locus en la región pericentromérica del cromosoma 3. Polimorfismos en la proteína tau Los polimorfismos genéticos no tienen repercusión patológica causal, esto es, su presencia no determina la presencia de enfermedad pero sí

Tabla 13.4. Clínica de las mutaciones de la proteína tau. P = parkinsonismo, A = afasia, M = enfermedad de motoneurona, P.S.=placas seniles.

Mutación

Edad inicio

Años evol.

Clínica

K273T I260V G2727V

46

4-16

Desinhibición, agresión, hiperoralidad, roaming

N279K DelK280 L284L P301L P301S S305N S305S E10+3 ga E10+12 E10+13 E10+14 E10+16

32-52

5-19

Parkinsonismo+alteración personalidad

+

51 50 25 29-38

9-20 4-16 10-20

Anomia, alteración visuoespacial, alt. Conducta Desinhibición, agresión, hiperoralidad FTD/CB; crisis epilépticas Alteración de personalidad, memoria

+

+

49

10

Demencia

+

45 39-66

13 4-15

Cambio personalidad, desinhibición Alteración personalidad y funciones ejecutivas

+

11

S320F

53

15

12

V337M G389R

42-68

12

13

G389R R406W

EXON 9

10

45-75

P

A

Alteración personalidad

P.S.

+

+ + +

+ +

+ Alteración personalidad

M

+

+

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pueden estar asociados a una predisposición a desarrollar la enfermedad, como por ejemplo el polimorfismo de la apolipoproteína E ε4, o estar ligados a mutaciones que sí son causantes de un determinado trastorno. Conrad et al. identificaron en 1997, un año antes de que se conociera el papel de las mutaciones en la proteína tau como causa de taupatías, un polimorfismo formado por secuencias repetidas (tandem repeats) en la proteína tau que influenciaba la aparición de PSP. Este polimorfismo localizado en el intrón 9 del gen de la tau, llamado A0, corresponde a la existencia de 11 repeticiones. Se encuentra en un 95% de las PSP y solo en el 57% de la población normal. En pacientes con enfermedad de Alzheimer se encuentra en la misma proporción que en la población normal (50%)124. Recientemente, se ha encontrado la asociación de la PSP con determinados polimorfismos tipo SNP de los exones 2, 3, 9 y una delección de 289 pares de bases en la región que flanquea el exón 10. Estos polimorfismos conforman diversos haplotipos, encontrándose el haplotipo H1 sobrerepresentado en la PSP y degeneración corticobasal (93% PSP, 78% de controles)126. Otro haplotipo en la proteína tau, formado por cuatro SNP en los exones 1, 4A y 8, en su forma haplotipo A se presenta en el 98% de las PSP en homocigosis, por lo que se considera que su presencia tiene una sensibilidad del 98% para el diagnóstico de esta entidad (con una especificidad solo del 67%, ya que también se ve en 33% de los controles)127. Taupatías secundarias La patología de tau ocurre en todos los cerebros humanos sistemáticamente con la edad, al menos en la región del hipocampo, donde en sujetos mayores de 75 años se encuentra siempre. La patología de tau también se encuentra en otras demencias, singularmente la enfermedad de Alzheimer, que supone la causa más frecuente de demencia. La patología de la tau de la enfermedad de Alzheimer se tiñe por todos los anticuerpos antitau existentes en la actualidad128. En esta enfermedad la patología de la tau está enteramente limitada a las neuronas.

Relación fenotipo-genotipo en la demencia frontal La proteína tau esta codificada por un gen formado por 14 exones localizado en el cromosoma 17. Los exones 6, 8 y 14 no se codifican, mientras que los exones 2, 3 y 10 lo hacen de forma alternativa. Esto hace que puedan existir 6 isoformas diferentes de tau según se incluyan o no estos exones (Figura 13.5). Las mutaciones conocidas hasta la fecha causantes de demencia frontal, se encuentran localizadas en los exones 9, 10, 11, 12 y 13. Estas mutaciones pueden clasificarse en mutaciones que aparecen en exones que siempre se expresan (9, 11, 12 y 13), mutaciones en el exón 10 y mutaciones en la región de splicing del exón 10. Los dos primeros tipos de mutaciones van a producir alteraciones en la capacidad de la proteína tau de estabilizar los microtúbulos o van a disminuir su capacidad de ser degradada. El último tipo altera el splicing del exón 10 en la traducción del gen, produciendose por esta causa una mayor proporción de proteína tau que contiene la región codificada por este exón (4R). Como los exones 9, 10, 11 y 12, codifican las región de tau de las secuencias repetidas, cuando no se codifica el exón 10 la proteína contiene 3 secuencias repetidas, y cuando se codifica, 4 secuencia repetidas. Las alteraciones anteriormente descritas pueden determinarse mediante electroforesis de proteínas con la técnica de Western-blot. A partir de un fragmento de tejido cerebral homogenizado y examinado con dicha técnica, tras la tinción con diferentes anticuerpos antitau, aparecen varias bandas de un tamaño aproximado de 55, 64, 69 y 74 kDa. Si se desfosforilizan, se pueden reconocer 6 bandas que se corresponden con las 6 isoformas de tau obtenidas mediante técnicas recombinantes. La banda de 55 kDa corresponde a la isoforma de menor peso molecular, y la banda de 74 kDa a la isoforma más larga (Figura 13.5). La técnica anteriormente descrita permite clasificar las diversas taupatías según el patrón electroforético, lo que indirectamente indica el mecanismo implicado en la taupatía. Las taupatías secundarias presentan un patrón de cuatro bandas, lo que nos señala que existe un

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Figura 13.5. Estructura del gen de la proteína tau e isoformas generadas por el splicing alternativo de los exones 2, 3 y 8. Panel derecho inferior, bandas que generan estas isoformas en el Western blot, y patrón de bandas de según patologías.

incremento de tau no específico. Con el envejecimiento normal, así como en el síndrome de Down, Parkinson-demencia de la isla de Guam, Nieman-Pick tipo C, Gertsmann-StrausslerScheinker con cestas y en la Seattle familiy tipo A se produce un patrón de bandas similar, que por tanto contiene las 6 isoformas de tau. Las taupatías producidas por alteraciones en el splicing del exón 10 presentan 2 bandas de 64 y 69 kDa y una menor de 74 kDa ya que se producen por incremento de tau con 4 secuencias repetidas. Este patrón también se observa en la parálisis supranuclear progresiva y en la degeneración corticobasal. La enfermedad de Pick tiene otro patrón diferente formado por 2 bandas de 55 y 64 kDa, generada por tau con tres repeticiones únicamente.

dos helicoidales con un diámetro de 8-20 nm y una periodicidad de 80 nm. El resto son filamentos rectos. Filamentos similares se encuentran en el síndrome de Down, Parkinson demencia de la isla de Guam, Nieman-Pick tipo C y en las demencias frontales producidas por mutaciones en los exones 9, 12 y 13 y en la región codificante del exón 10. Filamentos rectos y filamentos pareados se encuentran en la enfermedad de Pick y en la parálisis supranuclear progresiva. Los filamentos de tau de la degeneración corticobasal y de la demencia frontal por alteraciones en la región del exón 10 implicada en el empalme de la tau son filamentos girados con una periodicidad de 90-130 nm, semejando una goma a la que se da vueltas (twisted ribbon-like). ENFERMEDADES POR PRIONES

Morfología de los filamentos Mediante microscopía electrónica e inmunomicroscopía electrónica pueden distinguirse tres tipos morfológicos de filamentos de tau. En la enfermedad de Alzheimer el 95% de los filamentos de tau están en la forma de filamentos parea-

El termino prion fue acuñado por Prusiner para definir la existencia de una proteina infecciosa. Esta proteina va a generar diversas patologías en humanos y animales, de causa hereditaria, infecciosa o desconocida (Tabla 13.5). También conocidas como encefalopatías espongiformes

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Tabla 13.5. Tipos de enfermedades por priones. Animales Scrapie. Encefalopatía espongiforme bobina. Encefalopatía transmisible del visón. Prionopatías en felinos. Prionopatía en alce o ciervo. Humano Esporádicas(90%): Creutzfeldt-Jakob. Adquiridas: Iatrogénicas (CJ) . Kuru. Nueva variante. Hereditarias Creutzfeldt-Jakob. Gertsmann-Straussler-Scheinker . Insomnio fatal familiar.

por la característica lesión cerebral, se prefiere el término enfermedades por priones, por cuanto no siempre aparece espongiosis. Estructura del gen de la proteína priónica La proteína priónica (PRNP) está codificada por un gen localizado en el cromosoma 20, que contiene 2 exones131. El exón 2 codifica los 253 aminoácidos de la proteína madura. La PRNP es una proteína glicosilada que se encuentra unida a la superficie de la neurona mediante un glicosilfosfatidilinositol. Los niveles más altos de expresión están en las neuronas, pero también se expresa en pulmón, corazón, páncreas y leucocitos132. No se conoce de forma clara su función, aunque hay evidencias de que está implicada en la función sináptica y en la captación de cobre133. Debido a la existencia de un gen paralogo, el gen PRND, que codifica una proteína llamada doppel, que tiene una homología de un 25% con la región carboxi terminal de la PRNP, el ratón knock-out PRNP, presenta un fenotipo normal o escasamente sintomático (ataxia o alteraciones de sueño)134. Generalmente, los ratones atáxicos presentan menos expresión de la proteína doppel, que los ratones normales. Por otra parte, estos ra-

tones knock-out no desarrollan enfermedad cuando se les inocula proteína priónica. Entre los aminoácidos 51 y 91 de la PRNP existe una secuencia de ocho aminoácidos (PH(K)KKK(-)WKE) que se repite 5 veces132. El gen PRNP tiene al menos 4 polimorfismos dentro de la región codificante: una delección de 24 pares de bases en la región de los octapéptidos repetidos y los cambios M129V, N171S y E219K135. De todos estos, el que mejor se conoce es el M129V, estando actualmente en investigación el papel de los otros polimorfismos en la susceptibilidad y el fenotipo de la enfermedad. La conformación de la proteína PRNPsc difiere según el paciente sea homocigoto para Met o Val, en el polimorfismo 129 (Met: tipo 1, que migra a 21 kDa; Val: tipo 2, que migra a 19 kDa). En diferentes formas de encefalopatías por priones, el polimorfismo 129 influye en la susceptibilidad a la infección. De los estudios realizados en individuos con kuru, Creutzfeldt Jakob iatrogénico y nueva variante de encefalopatía espongiforme, se deduce que los heterocigotos tienen los mayores tiempos de incubación y entre los homocigotos, los que los son para metionina tienen mayor susceptibilidad para desarrollar la enfermedad y menores tiempos de incubación. En algunas formas familiares, la existencia de homocigosidad en el polimorfismo 129 se asocia a un inicio más precoz y un curso más agresivo136. La nueva variante solo se da en sujetos homocigotos para metionina. Las frecuencias de los polimorfismos 129 Met y Val difieren en diferentes poblaciones. En la población caucasiana, la frecuencia del alelo Met es del 66% y del Val del 34%. Por el contrario, en Japón el alelo Met tiene una frecuencia del 96%. Sin embargo, esto no se asocia con una mayor incidencia de Creutzfeldt-Jakob en esta población137. Creutzfeldt-Jakob familiar La frecuencia de casos familiares está en diferentes series entre el 4 y el 15%, aunque probablemente esta cifra sea una estimación inferior a la real por la existencia de casos no detectados por la frecuente presencia de datos atípicos. La

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clínica y supervivencia es generalmente similar a la de las formas esporádicas, si bien presenta un inicio 12 años antes y una progresión 18 meses más larga (mediana 4 meses, media 7, 8; 90% de fallecidos al año). Desde hace años se conocía la existencia de focos de mayor incidencia, como el de los judios libaneses, con una incidencia media anual de 43 casos por millón, o en Chile. De acuerdo con la HGMD, existen 26 mutaciones diferentes en el gen PRNP (Figura 13.5). La mutación E200K es la más frecuente entre las descritas, comprendiendo un 70% de los casos familiares. Tiene una alta prevalencia en la población eslovaca (incidencia anual de 100 casos/millón) y en comunidades judias de orígenes de Túnez y Libia. Mediante un estudio de haplotipos originados por marcadores microsatélites adyacentes al gen PRNP y el polimorfismo 129, se han descrito tres formas: la «eslovaca», de eslovacos y polacos; la «mediterránea», de los judíos tunecino, libios y también españoles, chilenos e italianos; y una tercera forma presente en Japón y Alemania. El haplotipo mediterraneo se considera que apareció en la andalucía árabe antes del siglo XV, posiblemente en una persona judía, y se extendió por el Mediterraneo después de la expulsión de los judíos de España138,139. El fenotipo de la mutación E200K es indistinguible de las formas esporádicas, presentando como és-

Figura 13.5.

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tas variabilidad clínica y en la edad de presentación (desde la 4.a a la 9.a década, si bien generalmente aparece antes de los 60 años). La mutación D178N es la segunda más frecuente. Clínicamente se presenta como Creutzfeldt-Jakob cuando el polimorfismo 129 es valina (y como insomnio fatal familiar cuando el polimorfismo 129 es metionina) con alteraciones de memoria, ataxia, mioclonias y alteraciones visuales. La patología revela la existencia de espongiosis, pérdida neuronal y astrocitosis en corteza y ganglios basales, difiriendo de las formas esporádicas solo en su inicio más precoz y en la duración más prolongada. Existen algunas formas de Creutzfeldt-Jakob familiar secundarias a inserciones adicionales en la región de octapéptidos repetidos. En estos casos no se han encontrado evidencias de mutaciones inestables en las sucesivas generaciones como ocurre en las repeticiones de tripletes, pero, en general, la enfermedad aparece antes y la duración es mayor cuanto mayor es la longitud del inserto (1 a 4 insertos: inicio a 6-7.a década, duración 5 meses; 7 a 9 insertos: inicio a los 30, duración de la enfermedad 120 meses). En estos últimos, la enfermedad sigue un curso crónico, con clínica atípica como disfasia y alteraciones de la personalidad (ver formas familiares atípicas); asimismo, la patología varía de forma importante

Mutaciones causantes de enfermedades por priones familiares.

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incluso dentro de la misma familia, con espongiosis focal o difusa. Esta variabilidad sugiere que estos insertos largos producen un efecto variable en la conformación de la proteína140. Gertsmann-Straussler-Scheinker (GSS) Esta variante de enfermedad por priones familiar fue descrita en 1928 por Gerstmann, y posteriormente se describieron otros casos adicionales por los tres autores en 1938. Es una forma familiar de encefalopatia por priones, de inicio en la 3-5.a década, caracterizada clínicamente por inicio por ataxia predominante, y más tardíamente demencia progresiva, similar a la forma atáxica del Creutzfeldt-Jakob. Las típicas descargas periódicas del EEG están ausentes. El rango de la duración de la clínica es de 2 a 10 años (media 3 años)141. Existe también frecuente variabilidad intrafamiliar, y en algunos casos la enfermedad asemeja la paraparesia espástica familiar o las heredoataxias. Histológicamente se observa escasa espongiosis en el neocortex, junto con extensos depósitos de amiloide en los hemisferios cerebrales y cerebelosos, en forma de numerosas placas multicéntricas y tipo kuru. Estas extensas placas son rojo Congo positivas, y en ausencia de tinción específica para priones, estos casos pueden confundirse con enfermedad de Alzheimer142. El tejido de estos pacientes es infectivo, como se ha demostrado por el desarrollo de encelalopatía en primates tras la inoculación de material de pacientes. La mutación P102L fue la primera mutación descrita en el gen PRNP, y es la más frecuente en el GSS, incluyendo la familia original descrita por Gerstmann. Insomnio fatal familiar Es un trastorno autosomal dominante, caracterizado por degeneración neuronal limitado a determinados núcleos talámicos, cursando con insomnio progresivo y demencia. Se origina por la presencia de una mutación Asp178Asn en el gen PRNP, cuando el aminoácido en la posición

129 es metionina; la misma mutación origina Creutzfeldt-Jakob, cuando el aminoácido en esta posición es valina. Clínicamente cursa con insomnio progresivo durante meses o semanas, disautonomía (hipertermia, hipersudoración, miosis y alteraciones de esfínteres) y ataxia. Posteriormente aparece un estado de sopor, disartria, temblor, alucinaciones y mioclonias, con preservación cognitiva hasta fases avanzadas, terminando en coma, falleciendo a los 9 meses. La edad de inicio está entre 37 y 61 años y la duración de la clínica entre 7 y 25 meses, con una media de 13 meses. El EEG suele mostrar enlentecimiento difuso en lugar de descargas periódicas143. En el examen del cerebro se encuentra degeneración neuronal severa, con astrocitosis reactiva limitada a los núcleos anterior y dorsomedial del tálamo, sin espongiosis. Se ha conseguido transmitir este proceso al ratón, presentando los ratones lesiones similares a los humanos144. Otras formas de enfermedades familiares por priones Aparte de las anteriormente descritas, existen otras formas descritas en pocas familias como la forma con prominentes alteraciones psiquiátricas, descrita en 11 miembros de 5 generaciones de una familia francesa. La enfermedad aparece entre los 21 y 34 años, con episodios de manía y muchos años después demencia. La histología muestra atrofia de la capa molecular del cerebelo, con placas tipo kuru y multicéntricas. La espongiosis es poco prominente y está limitada a la periferia de las placas. La enfermedad se produce por la presencia de 8 octapéptidos en la región de octapéptidos del gen PRNP, en presencia del alelo metionina 129145. La enfermedad por priones de curso lento se ha descrito en una familia brasileña de 9 miembros, con demencia frontal, con agresividad, hiperoralidad y esterotipias verbales y parkinsonismo. El estudio histológico mostró cambios espongiformes, pérdida neuronal y gliosis mínima, con inmunohistoquímica para prión restringida al cerebelo y putamen146.

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C APÍTULO

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Genética de los movimientos anormales A. Jiménez Escrig

ENFERMEDAD DE HUNTINGTON (EH) La redacción inicial de la EH ya señalaba su naturaleza hereditaria. Huntington describió una familia que su padre, médico como él, había tenido ocasión de seguir, relatando que «uno o más de los descendientes, casi invariablemente, sufren la enfermedad si llegan a vivir hasta la edad adulta. Pero si por alguna circunstancia un descendiente vive sin padecer la enfermedad, el hilo se rompe y los nietos y bisnietos del afectado original pueden quedar seguros de estar libres de la enfermedad»1. En los primeros años del siglo XX, con el redescubrimiento de las leyes de Mendel, la EH fue rápidamente considerada un prototipo de herencia mendeliana de una enfermedad humana, usándose el término de «corea hereditaria» para distinguirla de otras formas de corea. Es un trastorno de herencia autosomal dominante con una prevalencia de 4-7 casos/100.000 habitantes en los países occidentales, 5,3 casos/100.000 en nuestro país2, causada por la expansión inestable polimórfica del triplete CAG localizado en la región codificante de un gen que se ha denominado IT5 (4p16.3), que codifica una proteína de 348 kDa llamada huntingtina. La historia de la

genética de la EH viene marcada por ser una de las primeras enfermedades a las que se aplicaron las técnicas de análisis de ligamiento para encontrar el gen causal. En 1983 Gusella et al. iniciaron un estudio de este tipo en la extensa familia localizada en el lago Maracaibo, con la fortuna de que en los primeros 13 marcadores estudiados ya se encontró ligamiento3. Este hallazgo hizo crecer la esperanza de que pronto se localizaría el gen de la enfermedad, pero hubieron de pasar 10 años hasta que se encontró la mutación causal. Cuando se conoció y secuenció, este gen formado por 67 exones, en el exón 1, 18 codones después del primer codon ATG, existe una región formada por tripletes CAG, polimórfica (esto es, varía de unos individuos a otros)4. El valor normal de repetición del triplete CAG está entre 11 y 27. A partir de 36 pueden aparecer alteraciones clínicas. Entre ambos valores, se denomina alelo premutado, inestable o intermedio, porque puede evolucionar a la mutación en las próximas meiosis (Tabla 14.1)5-7. Existe una correlación estadística clínico-molecular fundamentada en la relación entre el número de repeticiones y la edad y forma de presentación y expresión de la enfermedad, por lo 183

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Tabla 14.1. Rango de expansión CAG en la EH. 11-27 ( rango normal). 27-35 (premutación): zona inestable. Algunos individuos presentaran expansión en la meiosis, por lo que sus descendientes pueden desarrollar la enfermedad. 36-39: rango de baja penetrancia. Desarrollo de la enfermedad tardío. Algunos individuos no desarrollan la mutación. > 40: penetrancia de enfermedad del 100%. > 60: formas juveniles.

que entre 36 y 39 repeticiones el individuo puede no desarrollar la enfermedad, incluso a edades mayores de 80 años (riesgo de penetración disminuido). Raramente, las repeticiones pueden llegar a más de 75, aunque se han descrito hasta 1968. La definición de los rangos de normalidad y anormalidad ha sido objeto de considerable discusión por la existencia de zonas de solapamiento entre ambos rangos. En la interpretación de estos resultados hay que considerar que si el alelo en rango intermedio no proviene del progenitor afectado, seguramente no está asociado a la enfermedad. Además, existe otra repetición CCG inmediata a la repetición CAG en dirección 3’, que puede variar entre 7 y 12 repeticiones, lo que si no se tiene en cuenta puede confundir la interpretación de los casos límite entre un resultado normal y anormal9. Esta repetición fue incluida en los estudios iniciales, lo que es preciso conocer a la hora de interpretar estos. Curiosamente, el número de repeticiones CCG no se distribuye de forma aleatoria en sujetos con EH, siendo más frecuentes las repeticiones más altas en estos sujetos. Hay que tener en cuenta que, como en otras mutaciones inestables, existe un grado de inestabilidad somática, con un mosaicismo tisular por la presencia de un diferente número de expansiones en los diversos tejidos10,11. El conocimiento de la genética molecular de la EH ha permitido explicar fenómenos descritos años atrás en esta enfermedad, como son: 1) la anticipación, que se produce por un incremento del número de repeticiones en meiosis sucesivas. La generalización de este fenómeno es la exis-

tencia de una mutación inestable o dinámica; 2) la herencia por línea paterna responsable del 80% de los casos de la forma juvenil acinética de la EH, debido a la mayor tendencia a la expansión de repeticiones en la espermogénesis respecto de la oogénesis12; 3) la presencia de mutaciones espontáneas, que hace unos años se consideraba excepcional (0.1% de los casos, según Bundey), se ha visto que puede llegar a aparecer hasta en un 3% de los casos incidentes13. En todos los casos documentados hasta la fecha como nuevas mutaciones, el padre portaba un alelo en el rango intermedio, lo que no indica que los alelos en rango intermedio sean más frecuentes en el varón sino que la expansión a un rango de repeticiones que genere la enfermedad es mucho más frecuente en la meiosis en el varón que en la mujer14. A este respecto, Rubinsztein et al. (1994) han investigado la evolución de la EH mediante estudio de la expansión CAG de 5 diferentes poblaciones humanas y 10 diferentes especies de primates. Con simulación computerizada, han encontrado que los alelos humanos se han expandido a partir de un triplete más corto de un primate antecesor, mostrando una inusual asimetría en su longitud. Concluyen que el elemento fundamental es una tendencia hacia la formación de alelos con mayor número de repeticiones, lo que lleva a un aumento continuo en la incidencia de EH15. La naturaleza dinámica de la mutación hace que este tipo de mutaciones presenten la particularidad que debe tenerse en cuenta a la hora del consejo genético, que a diferencia de mutaciones puntuales, en las que los sujetos libres de la mutación no tienen riesgo de transmitir esta, en el caso de mutaciones dinámicas existe riesgo de trasmitir la enfermedad por los parientes de sujetos con la enfermedad, que pueden ser portadores de alelos en rango de premutación. Evidencia de este riesgo ha sido descrita en el estudio de Golberg et al. (1995), que compara la inestabilidad genética de los alelos intermedios en individuos asintomáticos parientes de casos con EH, encontrando aumento de repeticiones en las meiosis en el 41% respecto de un 8% del grupo control (no-EH)16. Estos autores señalan que los alelos en este rango tienen tendencia a la expansión en ambos grupos, pero que existen factores genéticos adicionales que favorecen la expansión en el grupo de EH.

GENÉTICA DE LOS MOVIMIENTOS ANORMALES

Al igual que en otras mutaciones inestables como la distrofia miotónica, existe una correlación, si bien no completa, entre el número de repeticiones CAG y el fenotipo. La correlación es especialmente manifiesta entre la edad de aparición precoz y las formas clínicas juveniles y la existencia de un número alto de repeticiones. En cambio, en las formas medias de repetición, la edad de aparición está dentro de un amplio rango, lo que pone de manifiesto que otros factores genéticos o ambientales influyen en la edad de aparición y expresión de la EH. No se ha encontrado correlación entre la existencia de sintomatología psiquiátrica predominante o neurológica predominante y el número de repeticiones. La rapidez de progresión de la sintomatología también parece independiente del número de repeticiones, lo que explica que estudios previos no encontraran relación entre la edad de aparición de los síntomas clínicos y la tasa de deterioro. Las formas homocigotas, aunque raras, no presentan una clínica más severa ni diferente. La existencia de un número mayor de 36 tripletes aparece en el 100% de los casos afectados, por lo que en caso de no encontrarse esta, debe considerarse un error de laboratorio u otras enfermedades alternativas como la atrofia dentado rubro pálido luisiana u otros coreas17. Relación entre la expansión CAG y la EH La identificación de la mutación causal de la EH ha supuesto un paso formidable en la clarificación de la genética de la enfermedad y más aun en el diagnóstico, pero hasta la fecha no ha originado avances significativos en el conocimiento de los hechos que van a producir las lesiones responsables de la EH. La expansión CAG puede ejercer su efecto a nivel del DNA, RNA o de la proteína codificada, si bien parece que en todas las enfermedades producidas por una expansión CAG la traslación de la proteína es necesaria para la producción del daño (ratones transgénicos que expresan mRNA de longitud completa, pero no la proteína por inclusión de un codon de terminación, son fenotípicamente normales a los 8 meses).

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La función normal de la huntingtina aún no se conoce, ni tampoco a través de qué mecanismos la huntingtina lleva a una pérdida tan selectiva de las neuronas medias del estriado, existiendo varios mecanismos propuestos. La huntingtina se localiza en las neuronas de múltiples estructuras cerebrales. A nivel subcelular, la forma salvaje está localizada en el citosol en regiones somatodendriticas, por lo que se cree está relacionada con los microtúbulos. La forma mutada tiene una localización mayoritaria en el núcleo. Existen importantes evidencias de que la expansión CAG va a originar una «ganancia de función» de la proteína huntingtina, si bien se desconoce si esta ganancia es por aumento de una función ya existente o por la aparición de una función nueva18. Diversos trabajos experimentales apoyan una ganancia de función mediante un mecanismo de desinhibición de la apoptosis (la apopxina, responsable de la proteolisis de las proteínas, clave para el inicio de la apoptosis, también lo hace sobre la huntingtina, y esta capacidad de proteolisis es mayor cuanto mayor es el número de repeticiones) y/o en la interacción con otras proteínas. Uno de estos mecanismos involucra la vía de la degradación de las proteínas a través de la vía ubiquitina/proteasoma. Los proteosomas, son complejos que contienen peptidasas que cortan las proteínas ubiquitinadas en sus aminoácidos constituyentes, estando posiblemente implicados en la degradación de la huntingtina. En la EH, los agregados de poliglutamina están ubiquitinados, lo que sugiere una degradación por esta vía. Estos agregados pueden llevar a la muerte celular por un mecanismo de apoptosis. La huntingtina interacciona con diversas proteínas como la HAP-1 (Huntingtin associated protein 1)19 y con la HIP-1 y –2 (Huntingtin interacting protein 1 y 2)20,21, GAPDH (glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa) y calmodulina. La unión huntingtina HAP-1 aumenta y, por el contrario, la unión a HIP-1 disminuye a medida que aumenta la longitud de las repeticiones. HAP-1 parece estar implicada en el tráfico a través de las membranas vesiculares, y HIP-1 parece ser una proteína del citoesqueleto o tener una acción proapoptótica22,23. HIP-2 es una enzima involucrada en el complejo de degradación microsomal, y GAPDH se une a fragmentos de huntingtina alterando la

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producción de energía por la célula, lo que lleva a la depolarización neuronal24. La alteración en la membrana puede aumentar la entrada de calcio en la célula y la muerte celular. En este momento la huntingtina forma complejos con la calmodulina. La forma salvaje puede originar complejos en función del calcio existente, pero la forma mutada lo puede hacer de forma independiente al calcio. De forma subsiguiente, estos complejos van a producir daño celular por mecanismos excitotóxicos. No existe un modelo animal natural de EH25. Usando marcadores cercanos al gen IT5 se ha definido un locus homólogo (Hdh) en el cromosoma 5 del ratón. Barnes et al., utilizando el homólogo Hdh, encontraron un gen en el cromosoma 5 con una identidad de la secuencia del 86% a la secuencia humana a nivel de DNA, y del 91% a nivel de la proteína26. El Hdh posee una repetición CAG imperfecta que codifica solo 7 glutaminas consecutivas. La falta de expansiones largas del CAG en el ratón es consistente con la ausencia de un modelo murino de EH. Sin embargo, el conocimiento de la estructura del gen Hdh ha permitido crear modelos transgénicos de EH. Nasir et al. generaron uno de estos modelos creando una disrupción en el exón 5 del Hdh por recombinación homóloga. Los homocigotos de este modelo fallecieron en el 8.° día de vida embrionario, pero el heterocigoto es viable, presentando un aumento de la actividad motora y déficits cognitivos. El estudio neuropatológico encontró pérdida neuronal en el núcleo subtalámico27. Este estudio mostró que el gen Hdh es esencial para el desarrollo postimplantación y que juega un papel importante en la función de los ganglios basales. Los estudios de este y otros modelos murinos de EH han encontrado una escasa tendencia a la expansión, lo que significa que otras zonas del genoma juegan un papel en la inestabilidad de las secuencias repetitivas. Guía para el diagnóstico genético de la EH En el diagnóstico de la EH existe una circunstancia muy común en las enfermedades genéticas que es la realización de un diagnóstico posible en

sujetos asintomáticos sin que exista un tratamiento preventivo o curativo28. Dada la alta frecuencia de la EH dentro de la frecuencia de las enfermedades genéticas, y que fue una de las primeras enfermedades genéticas en las que el diagnóstico presintomático fue posible, es la entidad en la que el diagnóstico presintomático ha sido más debatido y, por lo tanto, de la que existe más experiencia sobre su realización, por lo que se considera el modelo a seguir en todas las enfermedades de estas características. Inicialmente este diagnóstico se realizaba mediante estudios de ligamiento que presentaban importantes dificultades (necesidad de un árbol familiar informativo, necesidad de colaboración de familiares del paciente, etc.). El descubrimiento del gen causal de la enfermedad ha simplificado los procedimientos a seguir pero en absoluto los ha obviado. En este contexto, nos encontramos con dos circunstancias posibles: 1. Confirmación de la sospecha diagnóstica de EH. 2. Test predictivo de individuos asintomáticos. La realización del diagnóstico en cualquiera de estas dos circunstancias debe realizarse dentro de un protocolo de consejo genético y psicológico. Son circunstancias que se consideran especialmente: 1. El estudio de individuos presintomáticos con un 25% de riesgo (p. ej., nieto de un afectado) cuando el padre vive y no desea ser examinado. 2. El examen de menores de edad. 3. Los test prenatales con información parcial. La primera consideración a la hora de realizar el diagnóstico molecular de la EH es que es esencial antes de realizarlo advertir que de sus resultados se derivan implicaciones genéticas sobre los familiares en conjunto, aparte de las implicaciones clínicas. La segunda consideración es que solo los síntomas clínicos de la enfermedad deben de ser considerados a la hora de hacer un diagnóstico sintomático y que la práctica de un diagnóstico molecular en presencia de síntomas atípicos debe ser considerada diagnós-

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tico presintomático y, por lo tanto, atenerse a las normas de este29. COREA HEREDITARIA BENIGNA La existencia de un corea de inicio precoz, no asociado a deterioro intelectual y como entidad diferente a la EH, ha sido debatido durante años hasta que los estudios moleculares han permitido conocer la respuesta. Existen descripciones clínicas de diversas familias con esta clínica (corea sin deterioro intelectual) con herencia con un patrón autosomal dominante. Presentan corea con afectación de cara, cabeza y miembros superiores, en ocasiones acompañada de distonía axial, sin deterioro intelectual ni alteraciones mentales, si bien la gran repercusión social que esta alteración del movimiento conlleva puede originar alteraciones afectivas o de aprendizaje por esta causa. Esto ha hecho que se haya propuesto abandonar el término «benigno» por el de «corea hereditario sin demencia». En nueve familias estudiadas a nivel molecular por este trastorno no se han encontrado expansiones del triplete CAG por encima de los límites normales. COREOACANTOCITOSIS El término neuroacantocitosis se refiere a una serie de enfermedades neurológicas asociadas a acantocitos en la sangre. Cuando estas manifestaciones incluyen corea se habla de coreoacantocitosis. Se trata de una alteración de diversas causas, que puede heredarse ligada al cromosoma X (síndrome de McLeod) o de forma autosomal recesiva o dominante. En las neuroacantocitosis se han tipificado dos entidades distintas según la presencia o no de alteraciones en los lípidos, cursando las primeras fundamentalmente con ataxia (abetalipoproteinemia o Síndrome de Bassen-Kornzweig o con aprebetalipoproteinemia), y las segundas con transtornos extrapiramidales (con ausencia de anticuerpos anti-Kell o síndrome de McLeod y coreoacantocitosis ligada al cromosoma 9q21). En esta última, una de las alteraciones más características de este transtorno es la presencia

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de discinesias orofaciales mutilantes, con vocalizaciones involuntarias y tics que pueden ser inicialmente confundidas con la enfermedad de Guilles de la Tourette. Además, se presenta corea de extremidades, disartria, disfagia, amiotrofia y areflexia, epilepsia, miopatía con elevación de la CK, neuropatía, demencia, distonía, parkinsonismo, parálisis supranuclear progresiva y apraxia de la apertura palpebral. La anatomía patológica revela pérdida neuronal en caudado, putamen, globo pálido y tálamo. Rubio et al., han realizado un estudio de ligamiento en 11 familias con este trastorno, encontrando ligamiento en todas ellas a una región de 6 cM del cromosoma 9q21, y posteriormente se han identificado mutaciones causales en un gen denominado CHAC 30. Se trata de un gen de 250 kb y 73 exones, siendo uno de los genes más grandes identificados hasta la fecha, que codifica una proteína involucrada en la localización de proteinas en el transGolgi31. Las alteraciones que pueden llevar al diagnóstico son: la presencia de elevación de la CK, y la presencia de acantocitosis (que debe buscarse específicamente mediante el examen de la sangre en fresco o con test de provocación, como la incubación en medio salino hipotónico). La resonancia magnética muestra atrofia del núcleo caudado indistinguible de la de la enfermedad de Huntington e hiperseñal en el estriado. Debe diferenciarse del síndrome de McLeod, que presenta una clínica similar pero se hereda ligado al cromosoma X, y, por tanto, presenta un riesgo de recurrencia en la descendencia mucho mayor (50% de las hijas van a heredarlo, frente a un riesgo casi nulo en la descendencia en caso de CHAC, ya que es una enfermedad recesiva). ATROFIA RUBRODENTADOPÁLIDO LUISINANA (ARDPL) La ARDPL es una alteración con diferentes manifestaciones clínicas, producida por una expansión polimórfica del triplete CAG en el gen B37 localizado en el cromosoma 12. El tamaño de la repetición varía entre 7 y 23 en individuos normales, y muestra expansiones habitualmente entre 49 y 75, en los pacientes con este transtorno. Esta mutación es rara en Europa, habiéndose

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descrito sobre todo en sujetos japoneses. Clínicamente, cursa con demencia, coreoatetosis, ataxia y epilepsia mioclónica, generalmente de inicio antes de los 20 años y fallecimiento antes de los 40 años. Debe sospecharse en casos con clínica de EH, con crisis epilépticas y mioclonias, especialmente si hay un valor normal de la expansión del gen IT5. DISTONÍA Hasta la fecha se distinguen 13 tipos diferentes de distonías hereditarias que se nominan como DYT1 a DYT13. Sus características principales se muestran en la Tabla 14.2. Seis de estas

Tabla 14.2. Clasificación molecular de las distonías. Herencia

Localización

DYT1

AD

9q3

DYT2

AR

–

DYT3

lig X

Xq13.1

DYT4 AD distonía laríngea

9q34

DYT5 AD Respuesta a Ldopa

14q22.1

Producto del gen ATP-binding proteín (torsina A)

GTP cyclohidrolasa I

DYT6 AD 8p21 distonía mixta (generilzada y focal) DYT7 distonía focal

AD

18p

DYT8 AD paroxística no cinesogénica

2q33

DYT9 AD paroxística con ataxia

1p21

DYT10 AD paroxística cinesogénica

16p11

DYT11 AD Distonía mioclonica

7q21

DYT12 AD 19q distonía-parkinson de comienzo agudo DYT13 AD distonía mixta

1p36

receptor dopamina D2

Figura 14.1. Localización de la delección GAG responsable de la DYT1.

distonías son distonías primarias (DYT1, 2, 4, 6, 7 y 13) y se heredan de forma dominante con baja penetrancia, excepto las DYT2, 3 y 5b. Los genes causales se han identificado en tres de ellas (DYT1,5 y 11) y localizado en 8, no habiéndose encontrado todavía en la DYT2 y DYT4. Desde las primeras descripciones de la distonía hace casi un siglo, se sospechó que esta tenía un origen genético, siendo más común en judíos de origen del este europeo. Se especuló inicialmente sobre una herencia autosomal recesiva, debido, como los estudios moleculares han demostrado, a su patrón dominante con baja penetrancia (30-40%). En 1989 Ozelius et al. describieron el primer locus de la distonía (DYT1), estudiando una gran familia francocanadiense no judía. Un año después se confirmó este ligamiento en 12 familias judías. En estas familias el inicio era a los 14 años y el comienzo fue en extremidades en el 85%32. Desde la descripción de este estudio se señaló que estas familias judías presentaban un haplotipo común, lo que apoya la existencia de un desequilibrio de ligamiento, y que la enfermedad se debía a un único fundador. Además, dada la existencia de desequilibrio de ligamiento entre marcadores relativamente espaciados, esto indica que la mutación se ha producido en fechas recientes. Risch et al. han calculado por ello que la mutación debió producirse hace 350 años, posiblemente en Lituania o Bielorrusia y que la alta prevalencia de la enfermedad en la población judía Ashkenazi (1:3.000 a 1:9.000; 5 a 10 veces más alta que la prevalencia habitual) se debe al gran crecimiento que tuvo esta población en el siglo XVIII33. En 1997 se identificó el gen DYT1, al identificar una delección GAG heterocigota en uno de los cuatro genes candidatos. Esta es la única mutación descrita hasta la fecha en el DYT1, tanto en individuos judíos como de otras etnias34.

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El hecho de que haya individuos con clínica similar a la DYT1, pero que no presentan la delección GAG apunta a la existencia de otras mutaciones en el mismo gen, pero hasta la fecha no se han encontrado. La delección produce la pérdida de un ácido glutámico en la porción carboxiterminal de una proteína de 332 aminoácidos denominada torsina A, una proteína con capacidad de unirse al ATP, con semejanza con las proteínas de la superfamilia de las heat shock protein/ClpATPasas. Estudios de expresión han descubierto que se encuentra ampliamente distribuida, expresándose intensamente en sustancia negra, núcleo dentado, células de Purkinje, protuberancia, tálamo y cortex frontal. La expresión parece restringida a neuronas, estando tanto en el núcleo como en el citoplasma. La intensa expresión en la sustancia negra indica que va a originar una disfunción en la transmisión dopaminérgica35. La delección GAG en la torsina A aparece sobre todo en individuos con distonía generalizada de inicio precoz y generalmente en miembros inferiores (menores de 25 años, o con un familiar de inicio a esa edad). Su baja penetrancia dificulta el consejo genético, El riesgo genético teórico de otro caso, con una penetrancia de 40%, es de 20% en casos familiares, y 10% en casos aislados, pero en la práctica el riesgo es aún menor. La distonía de inicio tardío es más compleja genéticamente que la DYT1. En 1997 se encontró un segundo locus (DYT6) en el cromosoma 8 en dos familias Mennonitas y otro (DYT7) en una familia alemana con distonía focal, con tortícolis de inicio tardío36. El tipo DYT4 que se utilizaba para incluir los cuadros dominantes no ligados a los anteriores loci, se reserva ahora para una familia australiana con ligamiento al 9q34, y el DYT2 se utiliza para incluir los casos recesivos. Las familias DYT6 y DYT13 muestran edad de inicio y clínica mixta (50% de los casos precoces; distonía focal y generalizada), afectación de extremidades, cervical y craneal con una penetrancia del 30% (Tabla 14.2). Distonía con repuesta a levodopa (DYT5) Descrita como de inicio en la infancia con distonía que afecta a la marcha, posteriormente

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su descripción clínica se ha ampliado con distonía de extremidad superior, parkinsonismo de inicio en el adulto, distonía oromandibular, distonía que remite espontáneamente y distonía, no solo con fluctuación diurna sino también en relación con el ejercicio. En todos estos casos la respuesta a dosis bajas de levodopa es excelente37. En la DYT5 existe una forma recesiva, muy infrecuente, secundaria a una mutación en el gen de la tiroxin hidroxilasa, y un forma más frecuente autosomal dominante con una penetrancia muy baja (30%), secundaria a mutaciones en el gen GTP ciclohidroxilasa I (GCH1). Esta enzima cataliza la sintesis de tetrahidrobiopterina, cofactor de la tiroxin hidroxilasa. Se han encontrado mutaciones en el gen GCH1 en el 40-60% de los casos dominantes. Como recientemente se ha encontrado una delección heterocigota del exón 3 en una familia con DYT5, es preciso examinar los casos sin mutaciones mediante técnicas que evaluen la dosis génica, a fin de descartar la presencia de estas delecciones38. Todos estos cuadros deben considerarse en el diagnóstico diferencial de las mutaciones por parkina. Para ello se tendrá en cuenta que la presencia precoz de discinesias favorece esta última.

Distonía mioclónica (DYT11) Aunque las mioclonias pueden existir en otras formas de distonía, en este caso son la alteración prominente, iniciándose en la primera o segunda década de la vida, de forma esporádica o familar dominante con penetrancia incompleta. Además, estos pacientes presentan una excelente respuesta al alcohol. En 1999 se encontró una mutación (Val54Ile) en el receptor D2 de la dopamina39. Sin embargo, esta mutación no se ha encontrado en otras familias, en las que recientemente se ha localizado un segundo gen (ε-sarcoglicano)40. El descubrimiento de este último gen ha permitido conocer que este trastorno es alélico con las mioclonias esenciales, y que por fenomenos de imprinting la penetrancia baja mucho cuando el origen de la mutación es materno.

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Distonía-parkinsonismo de inicio rápido (DYT12) Es un trastorno autosómico recesivo, caracterizado por distonía, disartria y parkinsonismo de inicio muy brusco en horas o días, en jóvenes o adultos jóvenes, en ocasiones con depresión, con mala respuesta a levodopa, generalmente no progresivo. Es un transtorno autosomal dominante en el que se ha encontrado ligamiento a un marcador en el cromosoma 19 en dos familias41. ENFERMEDAD DE WILSON (EW) Es una transtorno de herencia autosomal recesiva que se presenta con una prevalencia de 3 casos/100.000 habitantes, lo que corresponde a una frecuencia de portadores de 1/90 con clínica neurológica y hepática secundaria al depósito de cobre en los diversos tejidos. Aunque se conoce desde 1948 la presencia de una alteración en el metabolismo del cobre en la EW, la disminución en los niveles de cobre sérico y de la proteína transportadora de este, son solo fenómenos secundarios. El descubrimiento del gen responsable de la EW ilustra las técnicas de detección de genes responsables de enfermedades hereditarias. Inicialmente, se localizó encontrándose ligamiento con el gen de la estearasa D, una enzima del hematíe en el cromosoma 13. Posteriormente, se descubrió el gen mediante técnicas de clonaje posicional y de búsqueda de homología con un gen recientemente descubierto causante de otra anomalía en el metabolismo del cobre, como la enfermedad de Menkes. El primer estudio positivo de ligamiento de la alteración genética que produce la EW se debe a Frydman, que en 1985 estudió una larga familia con individuos afectados en 2 generaciones, con 27 marcadores, encontrando un LOD de 3.21 para una θ de 0.06 para el ligamiento de la EW con el locus de la estearasa D (ESD)(13q14)42,43. Este ligamiento se confirmó en un estudio posterior, pero en 1990 Houwen, estudiando 17 familias de origen norteeuropeo, no encuentra ligamiento con el locus ESD, asignando el gen a una región más distal entre la región 13q14 y 13q2144. Tres años más

tarde Tanzi et al. utilizando secuencias de DNA de zonas de unión a metales pesados para identificar clones homólogos de cDNA, encuentra que uno de estos clones se mapeaba mediante PCR y Southern-blot a un YAC y cosmid contig que contenían los límites de la región 13q14-13q21 (locus de la EW). Este clon se localizó en un contig adyacente a un marcador que detectaba un desequilibrio de ligamiento respecto a la EW en 120 familias. El cDNA detectó un mRNA de 7,5 kb que se expresaba fuertemente en cerebro e hígado45. El análisis de la secuencia mostró una proteína de membrana con una secuencia homóloga a las ATPasas con un sitio de fosforilización y dos sitios posibles de unión con el cobre (gen ATP7B). Una mutación puntual (Lys → Arg) se evidenció en el 85% de los sujetos con EW, y solo en el 15% de la población normal46. Se trata de un gen que abarca una región de aproximadamente 80 kb en el cromosoma 13, que codifica un producto de 7,5 kb, altamente expresado en el hígado. Basándose en su secuencia de nucleótidos, la reproducción de la estructura de la proteína codificada corresponde a una ATPasa transportadora de cobre tipo P. Este gen es homólogo en un 62% al gen alterado en la enfermedad de Menkes, siendo la función del gen de la EW la salida del cobre de la célula, y la del gen de la enfermedad de Menkes la entrada del cobre en la célula47,48. En las descripciones iniciales, una única mutación apareció en el 22% y 31% de ciertos grupos étnico, lo que favorecía la existencia de un fundador común. Sin embargo, posteriormente se ha visto que el número de anomalías causales del gen ATP7B (delecciones, mutaciones puntuales e inversiones) descritas hasta la fecha superan la treintena, y mediante estudio de haplotipos se piensa que todavía quedan al menos 20 por identificar49. Como la EW es un transtorno de herencia autosomal recesivo, la mayoría de los sujetos afectados son heterocigotos compuestos, con diferente mutación en cada alelo, lo que complica aún más la investigación de la mutación causal. Los individuos heterocigotos van a presentar anomalías menores en el metabolismo del cobre, sin desarrollar la enfermedad. Al igual que en muchas otras enfermedades genéticas, en la EW existe una clínica con variable edad de aparición, afectación hepática o

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cerebral predominante, en relación con el grado de alteración funcional que produzca la anomalía genética. Existen varios modelos animales de EW, como la rata LEC (Long Evans Cinnamon) que presenta una delección parcial en el gen homólogo al ATP7B50,51 con clínica de hepatitis aguda a los 4 meses del nacimiento, el ratón «Tx milk» y el modelo de «toxicosis canina por cobre»52,53. El cobre es un elemento traza que tiene un papel fundamental en el metabolismo de los seres vivos, como cofactor de proteínas involucradas en los mecanismos de oxidación reducción, como la superóxido dismutasa, la citocromo oxidasa, la dopamina β-hidroxilasa, la lysil oxidasa y la ceruloplasmina. Debido a esta acción, es esencial en la defensa de radicales libres, la respiración celular, la neurotransmisión, la síntesis de tejido conectivo y el metabolismo del hierro celular. En el humano se absorbe en el intestino proximal, siendo transportado por la circulación portal ligado a la albúmina hasta el hígado. El hígado, y específicamente el hepatocito, juega un papel de pivote en el metabolismo del cobre. La mayoría del cobre es extraído de la circulación portal por el hepatocito mediante una proteína todavía no conocida, por lo que solo una pequeña parte (50 μg/24 horas) es eliminado por la orina. En el hepatocito, el cobre se asocia a ligandos intracelulares como el glutation y la metalotioneina, es utilizado como cofactor de diferentes proteínas y es transportado a la vía de síntesis de proteínas secretadas para su incorporación a la ceruloplasmina, en donde parece intervenir la ATP7B, posiblemente en el aparato de Golgi. Un fallo en la incorporación de cobre a la ceruloplasmina es la causa de los bajos niveles de ceruloplasmina sérica en la EW, al ser mucho menor la vida media de esta apoproteína sin cobre. La otra ruta de exportación de cobre es la excreción biliar. Al no existir reabsorción biliar de cobre la vía biliar es la principal vía de eliminación del cobre del organismo. Dado que la principal alteración metabólica en la EW es la alteración en la excreción biliar de cobre y el consiguiente acúmulo en el hepatocito, se piensa que la ATP7B juega en el trans-Golgi un papel en el tráfico interno del cobre en el hepatocito54. Aún cuando hoy en día es posible el diagnóstico molecular de la EW, la existencia de

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múltiples mutaciones y en diversos exones del gen, hacen que este diagnóstico sea complejo y no esté todavía generalizado, por lo que se siguen utilizando los test diagnósticos clásicos de esta enfermedad. Sin embargo, la detección de la EW con estos test no está exenta de errores. La ceruloplasmina sérica puede estar descendida en un 20% de los portadores heterocigotos y en otras patologías como en presencia de malabsorción o cirrosis hepática y, por el contrario, aumentada en un 5% de los pacientes con EW, especialmente en casos de ingesta de anticonceptivos o hepatitis aguda. La determinación de cobre en orina de 24 horas exige que no haya alteraciones en la recolección de la orina. La determinación de cobre hepático exige la realización de una biopsia hepática, y además puede estar aumentada en presencia de colestasis. Finalmente, la evaluación de la presencia de un anillo de Kayser-Fleischer, aparte de ser dependiente de la experiencia del evaluador, puede no presentarse especialmente en edades precoces. Pese a ello, si bien hasta que las técnicas de detección de mutaciones en el DNA progresen lo suficiente para que sean utilizadas como técnicas de detección de esta enfermedad, el diagnóstico de la EW reside aún en las técnicas clásicas. Sin embargo, cuando se realiza el diagnóstico de EW en un sujeto, es preciso hacer el estudio de sus familiares, que en muchas ocasiones pueden estar asintomáticos55,56. Dada la toxicidad de los tratamientos que se utilizan para esta enfermedad, y la frecuente existencia de alteraciones en los niveles de ceruloplasmina en sujetos heterocigotos, hoy en día es obligado utilizar en este contexto técnicas de biología molecular. Para ello, la técnica usual es la amplificación por PCR y secuenciación de los exones 1 a 21 del gen ATP7B. La mutación más frecuente es la His1069Gln, que se ha descrito en el 10-40% de los casos, en poblaciones de Norteamérica, Rusia, Japón, Gran Bretaña, Holanda y Suecia, así como en la cuenca Mediterránea57,58. En nuestro país solo se ha descrito una mutación, en una extensa familia de Gran Canaria59. Esta mutación, Leu708Pro, es rara en otras series de pacientes con esta enfermedad. Finalmente, relacionado con la EW, se ha descrito una anomalía denominada aceruloplasminemia. Se trata de una trastorno autosomal rece-

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sivo, producido por mutaciones en el gen de la ceruloplasmina60,61. La clínica de estos pacientes difiere de la EW, manifestándose por diabetes mellitus, degeneración retiniana y diversos síntomas neurológicos como demencia, síndrome rígido-acinético y distonía focal. Los sujetos tienen niveles indetectables de ceruloplasmina, con depósitos hepáticos normales de cobre y aumentados de hierro. La resonancia magnética cerebral muestra hipointensidad en T2 en ganglios basales, producida por el depósito de hierro. Se trata de un transtorno raro, pero su reconocimiento tiene gran importancia por cuanto el tratamiento con desferrioxiamina previene la progresión de las alteraciones, e incluso las revierte en parte. TEMBLOR ESENCIAL (TE) El TE constituye uno de los transtornos neurológicos más frecuentes. Utilizando estimaciones conservadoras, se presenta en un 1,2-2% de los adultos mayores de 60 años, siendo su prevalencia unas 20 veces más frecuente que la EP. Se considera una enfermedad familiar, aunque los estudios realizados hasta la fecha presentan importantes sesgos, como son la ausencia de definición de temblor, falta de examen de los casos secundarios, o ser estudios hospitalarios no comunitarios. Entre todos estos, destaca el realizado en Suecia por Larson y Sjogren62. En los 210 casos incluidos en este estudio, la edad de inicio (media: 20 años) mostró alta correlación intrafamiliar, sin evidenciarse anticipación. Con 2 excepciones, el temblor se presentaba al menos en 4 generaciones, con un patrón autosomal dominante. En 15 casos presumiblemente homocigotos, no existían diferencias con los heterocigotos. Aparte de los estudios epidemiológicos de agregación familiar de TE, existen descripciones de familias en las que se evidencia una transmisión genética del trastorno. El modo de herencia en estas familias se considera autosómico dominante, si bien existen algunas dudas metodológicas para considerar que esto ocurra en todos los casos, como son la posibilidad de que se cometa un sesgo de selección al considerar solo familias

con transmisión autosómica dominante, más fácil de detectar que familias con transmisión autosómica recesiva. Como en las familias actualmente descritas, existen individuos con temblor con padres no afectados, la explicación a este hecho puede ser: 1. Herencia autosómica dominante con penetrancia reducida o dependiente de la edad. 2. Herencia autosómica dominante con expresión no recogida. 3. Herencia autosómica recesiva. 4. Modelo multigénico. Es importante aclara todos estos hechos por cuanto pueden originar errores estadísticos en la realización de estudios de ligamiento para localizar el locus del TE. Respecto a la primera circunstancia, Rantacorpi et al. han encontrado que a los 40 años, el 89% han desarrollado TE, y a los 65 años el 100%63. Larson y Sjogren señalan cifras similares62. El segundo aspecto que confirman los diferentes estudios de Luois, Ottmon64 y Jankovic65, es que los datos referidos por los familiares no son válidos para considerar si un individuo está o no afecto de temblor, siendo necesario el examen de los sujetos implicados para evitar errores de clasificación. Algunos estudios han señalado la presencia de anticipación en el TE, si bien otros autores señalan que este hecho se debe más a un sesgo de estimación al hacerse el diagnóstico antes en casos en que la presencia de temblor familiar es conocida en otros miembros de la familia. Hasta ahora se han realizado múltiples intentos de identificar el o los genes implicados en el TE. Varios genes candidatos como el 9q32-34 (locus de la distonía de torsión) o el 19q (parálisis periódica con ataxia), han sido excluidos. El fracaso de estos estudios contrasta con la alta prevalencia del transtorno y su patrón hereditario y sugiere que el TE es una enfermedad genéticamente muy heterogénea. Recientemente, se ha localizado un gen del TE familiar en un estudio realizado en 17 familias islandesas con TE, en el brazo largo del cromosoma 1366. La evaluación de este locus en otras poblaciones permitirá confirmar la heterogeneidad del TE.

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ENFERMEDAD DE PARKINSON Aunque desde las descripciones iniciales de la enfermedad de Parkinson se pensó que podía tener un componente genético, es a partir del extenso trabajo de Mjönes (1949), en que este componente se constata por primera vez. Sin embargo, este trabajo fue muy criticado, debido a que se realizó en una época en que la enfermedad de Parkinson todavía no estaba nosológicamente delimitada como se entiende hoy en día, por lo que algunos sujetos inicialmente considerados como afectados posteriormente se consideraron no afectados, lo que cambiaba las conclusiones iniciales. Esto generó una corriente de opinión favorable a considerar que la enfermedad de Parkinson era una enfermedad de causa exclusivamente, o al menos predominantemente ambiental, en base a diferentes estudios de casos y controles sobre la presencia de antecedentes familiares de enfermedad de Parkinson en pacientes con la enfermedad y, sobre todo, en base a la existencia de estudios de gemelaridad sobre la concordancia de enfermedad en gemelos univitelinos (genética) o bivitelinos (ambiental), favorables a esta última hipótesis. En los últimos años esta corriente de opinión ha cambiado debido a la revisión metodológica de estos trabajos, en los cuales no se había examinado a sujetos considerados como no afectos y que fueron incorrectamente clasificados. Además, algunos de los sujetos no afectos, evaluados unos años después, han desarrollado la enfermedad de Parkinson. A esto se ha unido la información aportada por la tomografía de emisión de positrones, que ha detectado afectación presintomática en sujetos considerados como no afectos. La reevaluación de los estudios con todos estos datos favorece la hipótesis de un componente genético en la enfermedad de Parkinson. De acuerdo con lo anterior, en la enfermedad de Parkinson existe de un lado una agregación familiar, con más sujetos afectados por la enfermedad en familias de pacientes con enfermedad de Parkinson que en la población general, sin un claro patrón de herencia, lo que traduce la existencia de mecanismos genéticos de aumento de susceptibilidad a padecer la enfermedad (herencia compleja), posiblemente de forma poligénica,

y de otro lado la existencia de familias con enfermedad de Parkinson con un patrón de herencia autosomal dominante o menos frecuentemente recesivo. Estas familias con enfermedad de Parkinson hereditaria son raras, presentándose en menos de un 5% de los casos, pese a lo cual están siendo objeto de una exhaustiva investigación por ser clínica y anatomopatológicamente indistinguibles de las formas esporádicas. Dados los avances de la genética molecular, la localización de genes causales de la enfermedad es una fuente de hipótesis causales que pueden ser aplicables también al conocimiento de la patogenia de la enfermedad en las formas esporádicas. Debemos entonces distinguir dos formas de enfermedad de Parkinson hereditario: las producidas por mutaciones en ciertos genes, y que presentan herencia mendeliana, y aquellas en las que existen un componente hereditario del tipo herencia compleja. De las segundas se ha hablado respecto a su importancia y dificultad de estudio en el Capítulo 1 de esta monografía. Respecto a las primeras, existen múltiples familias descritas con enfermedad de Parkinson hereditario, con una distribución geográfica universal. En este momento de acuerdo con la OMIM existen 8 formas diferentes (Tabla 14.3). Entre ellas, la más conocida es la descrita por Golbe et al., en Norteamérica, de origen italiano, en la que hay afectados a ambos lados del Atlántico y en varias generaciones, lo que descarta la existencia de un factor ambiental67. El gen responsable de la enfermedad fue localizado mediante técnicas de ligamiento en el brazo largo del cromosoma 4 (4q21-23) y unos meses después identificado como el gen de

Tabla 14.3. Formas de enfermedad de Parkinson familiar. Nombre

Tipo de herencia

Locus/gen

PARK1 PARK2 PARK3 PARK4 PARK5 PARK6 PARK7 PARK8

AD AR AD AD AD AR AR AD

4q21-23/α-synucleina 6q25-q27/parkin 4p14/UCLH 4p15 2p13 1p36-p35 1p36 12p11.23-q13.1

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la α-synucleína, que codifica una proteína presináptica involucrada en la plasticidad neuronal68. En este gen se ha identificado una mutación causal (Ala53Thr), en la familia italoamericana antes referida y en tres familias no relacionadas de origen griego. En otra familia de origen bávaro se ha identificado una mutación diferente (Ala30Pro)69, pero se han excluido mutaciones en este mismo gen en otras 13 familias europeas con enfermedad de Parkinson y en amplias series de individuos con enfermedad de Parkinson esporádica70. Todavía es pronto para conocer porqué mecanismo esta mutación lleva al daño neuronal selectivo que existe en la enfermedad de Parkinson. Se han propuesto diferentes mecanismos, como son que la presencia de alanina pueda favorecer la adopción de una estructura secundaria β-plegada sobre la α-hélice, lo que la predispondría a la agregación. Curiosamente, un derivado de la α-synucleína de 35 aminoácidos es uno de los principales constituyentes de las placas seniles de la enfermedad de Alzheimer, y además, la α-synucleína, que tiene múltiples lugares de unión para Aβ, se expresa fuertemente en lugares donde las placas seniles son más abundantes, lo que permite explicar nexos de unión entre ambas enfermedades71. Posteriormente al descubrimiento de la α-synucleína, se han encontrado otros genes o loci implicados en la génesis de la enfermedad de Parkinson en algunas familias. Se pueden diferenciar dos formas hereditarias: una autosomal dominante, producida por mutaciones en el gen de la α-synucleína (Ala53Thr y Ala30Pro), en el gen de la UCLH (ubiquitina carboxiterminal l α hidrolasa)72 o por genes aún no determinados localizados en las regiones 2p13 (PARK3)73 y 4q15

Figura 14.2.

(PARK4)74, y las formas recesivas o juveniles, producidas por mutaciones en el gen llamado parkin (PARK2)75 y 2 formas recientemente descritas ligadas a marcadores en la región 1p36 (Tabla 14.2)76. De todas estas, las más comunes son las secundarias a mutaciones en el parkin77. Una particularidad de esta forma es que algunos casos son secundarios a delecciones o duplicaciones de un exón, lo que no permite detectarlas por las técnicas usuales de PCR y secuenciación, requiriendo para su diagnóstico de técnicas de PCR cuantitativa, que permita conocer la «dosis» de gen (Figura 14.2). La clínica de los individuos con PARK1 es similar a las formas esporádicas, apareciendo cuerpos de Lewy en la sustancia negra, si bien la enfermedad es más agresiva, con una edad de aparición más joven (45 años de media) y una supervivencia inferior (9 años desde el diagnóstico)68. Las otras dos formas dominantes descritas hasta la fecha de formas dominantes (PARK3 y PARK4) se caracterizan por un inicio en edades jóvenes (35 años de media) y la aparición de demencia. Las formas recesivas se caracterizan por su inicio muy precoz (20-40 años), la aparición precoz y severa de discinesias y distonía. En el caso de mutaciones del parkin no se encuentran cuerpos de Lewy en la necropsia75. No se conoce cuál es la función de la α-synucleína, una de las proteínas más abundantes y ubicuas del Sistema Nervioso Central. La expresión de α-synucleína está disminuida en la sustancia negra de pacientes con enfermedad de Parkinson esporádica en las fases iniciales de la enfermedad, lo que va a favor de un papel importante en la α-synucleína en la patogénesis de esta enfermedad. Se ha hipotetizado que las mutacio-

Estructura del gen parkin, mutaciones puntuales y delecciones y duplicaciones de exones.

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nes en la α-synucleína van a alterar la estructura secundaria de la proteína, con ubiquitinación y agregación o que, alternativamente, la mutación impediría la eliminación de la proteína por la vía de la ubiquitinación, agregándose y acumulándose77. Estos acúmulos podrían interferir con el transporte normal de las proteínas sinápticas, formándose depósitos que dañarían la célula78. La parkina es una proteína de 465 aminoácidos similar a la ubiquitina, que recientemente se ha señalado funciona como ligando de las proteínas ubiquitinadas y el sistema de degradación 26 proteosoma. La parkina actúa como péptido ligando en este mecanismo, por lo que mutaciones o delecciones en esta proteína van a alterar la degradación de proteínas por esta vía79. El descubrimiento de los genes causantes de la enfermedad de Parkinson está llevando a clarificar los mecanismos de desarrollo de esta enfermedad. La alteración en estos pacientes está en el sistema de degradación de proteínas. Las proteínas celulares están en una situación de continuo recambio, lo que se utiliza para la regulación de su función y a su vez evita el acúmulo de cambios como oxidación o desnaturalización. La célula marca la proteína que debe destruirse por una organela celular (26 proteasoma) mediante una señal que consiste en pegarle un pequeño péptido, la ubiquitina. Esto se realiza en varios pasos, iniciándose con la activación de la ubiquitina por la E1, la formación de un complejo de varias ubiquitinas, por la E2 y la transferencia de este complejo a la proteína sustrato que quiere destruirse por la conjugación de E2 y E3. Finalmente, la proteína sustrato marcada con el complejo de ubiquitinas se une al proteasoma, donde es degradada a péptidos menores, separándose y recomponiéndose la ubiquitina por la E4. E1 a E4 son una familia de múltiples proteínas (Figura 14.2). Parkin pertenece a la familia de las E3 y UCHL a la familia de E4 (Figura 14.3)80. Además de la implicación de parkin y UCHL en el parkinson familiar, los cuerpos de Lewy de pacientes con enfermedad contienen abundante ubiquitina, lo que indica que esta vía de degradación también se encuentra implicada en las formas esporádicas. Además, los cuerpos de Lewy contienen α-synucleína y parkina, y la α-synucleína es un sustrato de la parkina.

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Existen otras múltiples familias con enfermedad de Parkinson en las que no se ha encontrado la mutación en la α-synucleína u otros genes conocidos y que siguen un patrón de herencia compleja. En diferentes estudios se ha visto que los sujetos parientes en primer grado con enfermedad de Parkinson tienen un riesgo entre 3 y 6 veces mayor de desarrollar la enfermedad. En estas, se han evaluado diferentes genes candidatos, por estar relacionados con el metabolismo de la dopamina, con los mecanismos de oxidación, regeneración neuronal, o con el metabolismo xenobiótico, como son el gen que codifica la glutation hidroxilasa, tiroxina hidroxilasa, transportador de dopamina (DAT1), BDNF, catalasa, proteína precursora de amiloide, superóxido dismutasa y debrisoquina-4-hidroxilasa, citocromo P450 2D6, citocromo P450 1A1, N-acetiltransferasa, sin encontrarse anomalías responsables82. Asimismo, diversos polimorfismos conocidos evaluados hasta la fecha, como los de los genes de la MAO-A, MAO-B, DRD2, no han dado resultados uniformes que permitan aclarar su implicación en el proceso de susceptibilidad a desarrollar la enfermedad, por lo que todavía queda un importante trabajo por hacer para aclarar qué genes están implicados y cuál es la relevancia de estos en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. Las diferencias entre los diversos estudios se han explicado por la existencia de una heterogeneidad en la causa genética de la enfermedad entre diferentes poblaciones, o bien por la existencia de diversos factores ambientales que permitirían revelar estos genes solo en las poblaciones expuestas a estos factores. Recientemente se ha encontrado un riesgo relativo de padecer enfermedad de Parkinson en individuos con el alelo apoE4 y el alelo 1 del polimorfismo del promotor de la α-synucleína NACP-Rep1. Según lo anteriormente señalado, ¿cuándo y cómo debe realizarse un estudio genético a un sujeto con enfermedad de Parkinson familiar? Las formas familiares autosomal dominantes son muy raras. En caso de encontrarnos con una de estas formas, se examinará el gen de la α-synucleína, inicialmente la mutación Ala57Thr, y si esta es negativa mediante secuenciación del gen (7 exones). Pero las formas más comunes que vamos a encontrar son formas recesivas juveniles o formas

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Figura 14.3. Degradación de proteínas por la vía ubiquitina-26 proteosoma.

esporádicas juveniles, en las que es preciso estudiar el gen del parkin. En estos casos, como hay múltiples mutaciones, no existiendo una mutación frecuente, se realizará la secuenciación de los 12 exones del gen. Sin embargo, como se ha señalado anteriormente, con este procedimiento pueden escaparse un número importante de mutaciones producidas por delecciones en heterocigosis, que no se detectan por este procedimiento, exigiendo la realización de PCR cuantitativa. OTROS TRASTORNOS DEL MOVIMIENTO Degeneración asociada a pantotenato kinasa

La pantotenato kinasa 2 (PKAN2; 20p12.3) es una enzima regulador de la síntesis de la coenzima Q, esencial para el metabolismo de los ácidos grasos. Su deficiencia produce un cuadro anteriormente conocido como enfermedad de Hallervorden-Spatz, pero debido a la implicación de ambos autores en el programa de eutanasia de la Alemania nazi, se ha reemplazado este epóni-

mo por el de degeneración asociada a PKAN2. Es un trastorno autosomal recesivo que se presenta en la infancia o adolescencia, caracterizado por rigidez progresiva, movimientos coreicos, deterioro mental y, en ocasiones, epilepsia, y anomalías oculares (nistagmus, oftalmoplejia y atrofia óptica). La alteración patológica consiste en una coloración marronacea del globo pálido, secundaria al depósito de hierro, que en la resonancia magnética craneal en T2 se aprecia como una atenuación de señal, con una hiperintensidad del globo pálido interno, lo que resulta en una imagen conocida como «ojo de tigre»83. Enfermedad de Fahr

La calcificación idiopática de los ganglios basales es un trastorno infrecuente que cursa con distonía progresiva, parkinsonismo, ataxia, disfagia y alteraciones neuropsiquiátricas de inicio entre los 30 a 60 años. En algunos casos, únicamente se presenta con distonía focal. A pesar de la presencia de calcificaciones no se detectan anomalías en el metabolismo del calcio o fósforo. La neuroimagen detecta calcificaciones, prin-

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cipalmente en el tálamo, pero también en putamen, caudado y sustancia blanca. La herencia es autosomal dominante, habiéndose detectado un locus en el cromosoma 14q, con existencia de anticipación en la edad de inicio84.

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ses, parciales o generalizadas, y posteriormente desarrollo de coreatetosis, con un patrón autosomal dominante89.

Enfermedad de Gilles de la Tourette Síndrome de Aicardi-Goutieres

Es una encefalopatía severa familiar, de inicio en la edad neonatal y que produce el fallecimiento o la supervivencia con graves secuelas. Cursa con microcefalia, calcificaciones intracraneales, espasticidad, distonía y anomalías visuales. Con frecuencia se asocia a linfocitosis aséptica del líquido cefalorraquídeo y elevación del α-interferón en el suero y líquido cefalorraquídeo. La herencia es autosomal recesiva, habiendose identificado un locus en el cromosoma 3p2185.

Geniespasmo hereditario

Trastorno tambien conocido como mioclonia o temblor familiar de la mandíbula, se caracteriza por episodios de temblor de la mandíbula y el labio inferior, de inicio generalmente en la infancia, pudiendo mejorar con la edad. La herencia es autosomal dominante, con heterogenidad genética, habiendose identificado un locus en una familia británica86.

Discinesias paroxísticas

Se trata de un grupo de trastornos en los que hay distonía de aparición periódica, estando el paciente libre de síntomas la mayor parte de su vida. Pueden ser inducida por movimientos bruscos (cinesogénicas: generalmente esporádicas, de muy breve duración, segundos o minutos), stress, cafe o alcohol, o fatiga (no cinesogénicas: generalmente familiares, duran minutos o horas)87. Estas últimas pueden ser también desencadenadas por el ejercicio o añadir al cuadro clínico paraparesia espástica. En las formas cinesogénicas se ha localizado el gen responsable88 Estas mutaciones han sido descritas en familias con convulsiones a la edad de 3 a 12 me-

La enfermedad de Gilles de la Tourette es un trastorno de inicio en la infancia caracterizado por tics motores involuntarios y tics vocales. Estudios de familias y gemelos han detectado un alto grado de transmisión genética, especialmente cuando se consideran afectados individuos con tics motores crónicos. La concordancia en gemelos monocigotos es del 53% (73% si se incluyen tics crónicos) mientras que para dicigóticos es del 8%90,91. Estudios de análisis de segregación indican una herencia autosomal dominante, con penetrancia reducida, si bien estudios recientes indican un modo de herencia complejo92,93. Además, este síndrome tiene tendencia a cosegregarse con varios trastornos neuropsiquiátricos, especialmente el trastorno obsesivo compulsivo y trastornos de hiperactividad94. Hasta la fecha, los estudios de búsqueda genómica efectuados en familias extensas han resultado negativos, posiblemente por el uso de modelos autosomales dominantes y la dificultad de adscribir casos oligosintomáticos. Existen estudios que han encontrado asociación con genes de receptores de dopamina, pero sus resultados no han sido replicados95,96. BIBLIOGRAFÍA 1. Siemers E. Huntington disease. Arch Neurol 2001; 58: 201-203. 2. Burguera JA, Solis P, Salazar A. [Estimate of the prevalence of Huntington disease in the Valencia region using the capture-recapture method]. Rev Neurol 1997; 25: 1845-1847. 3. Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, et al. A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington’s disease. Nature 1983; 306: 234-238. 4. Huntington Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell 1993; 72: 971-983. 5. ACMG/ASHG statement. Laboratory guidelines for Huntington disease genetic testing. The American

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C APÍTULO

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Xantomatosis cerebrotendinosa A. Jiménez Escrig

La xantomatosis cerebrotendinosa (XCT) es una infrecuente enfermedad de depósito autosomal recesiva, producida por el acúmulo de colestanol (y en menor grado del colesterol) en la mayoría de los tejidos. Las manifestaciones clínicas relacionadas con la localización de los depósitos, son acúmulos de colestanol en las vainas tendinosas (xantomas) especialmente en el tendón de Aquiles, cristalino (cataratas) y daño neurológico de causa aún no bien conocida (bien por efecto deficitario por la anomalía metabólica, bien por toxicidad del producto sobre la mielina)1,2. La causa del trastorno es la deficiencia en actividad en la enzima CYP27 (27α-hidroxilasa), una enzima mitocondrial miembro del citocromo P450, que introduce un grupo hidroxilo (-OH) en el carbono 27 del anillo esteroideo en las síntesis de ácidos biliares3,4. La deficiencia completa de esta enzima produce una reducción en la síntesis de ácido cólico, no produciéndose ácido quenodeoxicólico5,6. Como la síntesis de ácidos biliares se regula por la retroalimentación que genera la reabsorción de estos en el ciclo enterohepático, la ausencia de inhibición (de la enzima 7α-hidroxilasa) origina un aumento de la síntesis de precursores de ácidos biliares y, simultáneamente, la

producción de colestanol, que va a ser la responsable del cuadro clínico. El cuadro clínico usualmente se manifiesta en la infancia tardía o en la adolescencia con retraso en la escolarización y diarrea producida por la deficiencia de ácidos biliares7,8. En las tercera década de vida aparecen cataratas progresivas9-12, que precisan ser extirpadas cinco a diez años después. Como usualmente no se diagnostica y trata la enfermedad en esta fase, en la cuarta década de vida se inician alteraciones del sistema nervioso, que pueden ser polimorfas, variando incluso en individuos con mutaciones en el mismo punto de la molécula. Las alteraciones neurológicas más usuales son: deterioro cognitivo, con demencia con prominentes manifestaciones frontales (apatía, alteraciones en la iniciativa, manifestaciones neuropsiquiátricas, con menor afectación de memoria y orientación)13,14, ataxia y piramidalismo. El sistema nervioso periférico también se afecta usualmente con polineuropatía axonal15 o desmielinizante16-20. Se han descrito también epilepsia21, formas espinales puras22, caracterizadas por piramidalismo progresivo y formas caracterizadas por parkinsonismo23-27. 203

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Otras manifestaciones incluyen osteoporosis (la enzima CYP27 también interviene en la 25hidroxilación de la vitamina D)28-31 y aterosclerosis aumentada32. Las exploraciones complementarias muestran alteración en diversos estudios neurofisiológicos: retraso en las velocidades de conducción nerviosa y disminución del potencial de acción del nervio, en caso de existir polineuropatía. Los potenciales evocados son la técnica neurofisiológica más sensible para detectar alteraciones y la más precoz en mostar mejoría con el tratamiento33. Existe escasa experiencia con la estimulación magnética transcraneal, pero también parece más sensible que el estudio de conducción nerviosa. En las pruebas de imagen suele verse atrofia cerebral y cerebelosa en la TAC, y sobre todo alteraciones en la resonancia magnética, con atrofia cerebral y lesiones desmielinizantes, con hiperintensidad de la vía piramidal en T2 y, sobre todo, extensas lesiones hiperintensas en las sustancia blanca cerebelosa, dibujándose unas lesiones que son patognomónicas de este proceso (Figura 15.1)34-40. Es importante tener en cuenta que los xantomas tendinosos (Figura 15.2) no siempre se visualizan externamente41,42, por lo que su presencia en modo alguno es necesaria para el diagnóstico, pero en estos casos pueden evidenciarse mediante ecografía, tomografía computerizada o resonancia magnética43,44.

La 27α-hidroxilasa es una enzima mitocondrial codificada por un gen localizado en el brazo largo del cromosoma 2, formado por 9 exones45. Existen más de 37 mutaciones descritas hasta ahora, habiéndose descrito mutaciones sin sentido, mutaciones con cambio de sentido, delecciones, mutaciones intrónicas e inserciones. En nuestro país se han descrito al menos 8 familias con este proceso46-48. En este último estudio se han examinado las mutaciones causantes de la enfermedad en familias españolas (Figura 15.3). Todas estas mutaciones son mutaciones puntuales, una de ellas intrónicas48. Esta última produce una alteración en el splicing del exón, originando una delección del exón 7 y un stop codon 16 aminoácidos más tarde en el exón 849. El diagnóstico molecular se realiza mediante la determinación de colestanol en plasma50-55. En pacientes heterocigotos puede existir también aumento de colestanol, por lo que puede ser necesaria la determinación genética56,57. En estos casos la práctica habitual es amplificación por PCR y posterior secuenciación del gen en tres fragmentos, exón 2, exón 3 a 5 y exón 6 a 9. La XCT es de las pocas enfermedades de depósito que tiene tratamiento58-60. En efecto, el aporte exógeno de ácido quenodeoxicólico (Quenobilan®, 250 mg t.i.d) que inhibe la enzima 7α-hidroxilasa revierte las alteraciones metabólicas61-64. Este tratamiento previene la progre-

Figura 15.1. Resonancia magnética craneal característica de este proceso, con lesiones hiperintensas en T2 en cerebelo y vía piramidal.

XANTOMATOSIS CEREBROTENDINOSA

Figura 15.2. Xantoma en el tendón de Aquiles.

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sión del deterioro y la aparición de cataratas. Sin embargo, el grado de respuesta de las diferentes manifestaciones es diferente. Las diarreas responden espectacularmente; los xantomas revierten parcialmente, por cuanto tienen una parte fibrosa que va a permanecer. La clínica neurológica solo revierte si la sintomatología es leve o lleva poco tiempo de instauración, pero usualmente las alteraciones mentales van a permanecer o incluso progresar. Por ello, es deseable la realización de un diagnóstico lo más precoz posible que permita instaurar un tratamiento que evite la aparición de lesiones irreversibles. Usualmente, es preciso añadir a este tratamiento un inhibidor de la 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A reductasa (HMGCoA)64,65. Este último va a reducir aún más los niveles de colestanol al reducir la síntesis de colesterol y además previene la aterosclerosis acelerada.

Figura 15.3. Estructura del gen CYP27, y mutaciones descritas en España

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C APÍTULO

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Trastornos neurológicos paroxísticos A. López de Munain, A. Sáenz, A. Ayerdi y J. F. Martí Massó

INTRODUCCIÓN La Neurología, como otras ramas de la Medicina moderna, vive un cambio que la enfrenta a una creciente capacidad predictiva para muchas enfermedades degenerativas que constituyen ya el principal problema de salud pública en las sociedades desarrolladas. Ello ha sido posible gracias al extraordinario desarrollo de la Biología molecular y al conocimiento de la estructura del genoma humano. En este proceso de interacción entre la investigación clínica y la básica, el conocimiento de los fenotipos es muy importante. Una parte significativa de los trastornos neurológicos presentan un fenotipo transitorio, paroxístico, por lo que una adecuada historia clínica y la correcta interpretación de las pruebas complementarias son fundamentales para orientar los estudios moleculares. Presentamos en una aproximación heterodoxa, agrupados para su consideración conjunta, varios trastornos neurológicos paroxísticos. Los recientes descubrimientos moleculares, en muchas de estas entidades, avalan la agrupación de estas entidades, que mayoritariamente presentan un sustrato molecular semejante1. Existen otros trastornos neurológicos paroxísticos secundarios a

alteraciones del metabolismo mitocondrial o a glucogénesis que no serán objeto de esta revisión. Con ello rescatamos ideas que ya fueron esbozadas hace ahora un siglo por un clásico de la Neurología como William Gowers, quien en su obra On the borderlands of Epilepsy2, vinculaba a un fondo etiopatogénico común a las migrañas y las epilepsias. EPILEPSIAS El carácter hereditario de la epilepsia se conoce desde antiguo, pero sólo muy recientemente se han podido comenzar a establecer las bases genéticas de los síndromes epilépticos. Consideraremos en este apartado los grandes síndromes epilépticos generalizados y parciales, así como una breve reseña sobre las epilepsias sindrómicas de las que se conoce su sustrato molecular.

Convulsiones febriles Las convulsiones febriles constituyen la forma de epilepsia situacional más frecuente de la infan209

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cia, afectando al 2-5% de los niños en los países occidentales3. Aparecen entre los 3 meses y los 6 años acompañando la fiebre de origen extraneurológico. Sólo un 9% de los niños que experimentan este tipo de crisis tienen más de 3 crisis a lo largo de la vida, y entre un 2-7% tienen una epilepsia posterior4, cuya aparición se relaciona con la duración de la convulsión febril5. Hasta el momento se han identificado 5 loci cromosómicos relacionados con la aparición de convulsiones febriles, pero aún no se ha descubierto ningún gen6-9. Epilepsia de ausencias infantiles y juveniles La epilepsia de ausencias infantiles (EAI) se caracteriza por una breve alteración del nivel de conciencia acompañada de un patrón electroclínico característico de punta-onda a 3 Hz en el EEG. Aunque existen estudios de gemelos con elevada concordancia que avalan el papel genético, no existe un patrón claro de herencia mendeliana. Hasta el momento, se han identificado tres loci relacionados con la aparición de ausencias. Tabla 16.1. Epilepsias generalizadas de base genética.

Síndrome epiléptico Epilepsia mioclónica juvenil (EMJ)

Epilepsia de ausencias infantiles (EAI)

Epilepsia de ausencias juveniles (EAJ) EMJ/EAI/IGE*

Convulsiones febriles

*

IGE= epilepsia generalizada idiopática

Localización cromosómica 6p 8q24 15q14 5q GABA1 2p CACNB4 1p 3p14.2-p12.1 8q24 5q34 21q22.1 3q26 14q23 2q36 18 8q13-q21 19p13 2q23-24 5q14-q15

El primero, situado en el cromosoma 1p, asocia un cuadro de ausencias que evoluciona a una epilepsia mioclónica juvenil posterior10. El segundo se localiza en la región 3p14.2-p12.1 para una familia con clara transmisión dominante y elevada penetrancia, pero con múltiples fenotipos (algunos presentan ausencias y otros crisis generalizadas tónico-clónicas)11. El tercer locus está situado en el cromosoma 8q24 y se trata de familias con ausencias que luego desarrollan crisis de gran mal en edad adulta12. Cuando la edad de inicio del cuadro es posterior a los 12 años se denominan ausencias juveniles, y se diferencian de las anteriores por la menor frecuencia de crisis y una asociación más frecuente con crisis generalizadas tónico-clónicas. Epilepsia mioclónica juvenil y otras epilepsias generalizadas convulsivas La epilepsia mioclónica juvenil (EMJ) se caracteriza por sacudidas mioclónicas matutinas y crisis generalizadas tónico-clónicas de aparición en la adolescencia y muy sensibles al alcohol o la deprivación de sueño. De todos los síndromes epilépticos de base genética la epilepsia mioclónica juvenil es la más conocida y frecuente. El patrón de herencia más frecuente es dominante, con una penetrancia incompleta, y se han descrito varios subtipos clínicos en base a los tipos de crisis en los probandos y en sus familiares13. Los estudios de ligamiento han establecido un locus en el brazo corto del cromosoma 6 cercano al locus HLA14, en la región 8q15 y en la región 15q14 que contiene la subunidad α-7 del receptor colinérgico nicotínico neuronal (CHRNA7)16 y donde se ha localizado una variante de epilepsia frontal autosómico dominante (EFNAD). Recientemente se han descubierto mutaciones en un gen GABA del cromosoma 5 en una gran familia canadiense con una epilepsia mioclónica juvenil típica con herencia dominante17. Epilepsia autosómico dominante frontal nocturna La epilepsia frontal nocturna autosómica dominante (EFNAD) se caracteriza por crisis moto-

TRASTORNOS NEUROLÓGICOS PAROXÍSTICOS

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Tabla 16.2. Epilepsias parciales de base genética. Localización cromosómica Proteína codificada

Síndrome epiléptico Convulsiones neonatales familiares benignas Convulsiones infantiles familiares benignas Convulsiones infantiles familiares benignas y coreoatetosis paroxística Epilepsia generalizada con crisis febriles plus

Epilepsia frontal nocturna autosómica dominante

Epilepsia lateral temporal autosómica dominante Epilepsia familiar temporal de origen mesial Epilepsia parcial familiar con foco variable Epilepsia benigna con paroxismos rolándicos Epilepsia rolándica autosómica dominante con dispraxia del habla Epilepsia rolándica con distonía paroxística inducida por el ejercicio y calambre del escribiente

ras nocturnas de aparición en racimos (con un promedio de 8 crisis por noche) y corta duración (habitualmente menos de 1 minuto), de carácter fundamentalmente motor (distónicas, tónicas o hipercinéticas), frecuentemente precedidas de un aura que puede ser sensitiva (parestesias locales o generalizadas), sensorial (alucinaciones auditivas, vértigo), psíquica (miedo, déjà vu) o autonómica (taquicardia, dificultad respiratoria). La EFNAD se transmite con un patrón autosómico dominante, se inicia en la infancia o adolescencia y presenta una importante variabilidad inter e intrafamiliar del cuadro18. En las familias que presentan ligamiento con el cromosoma 20q13.3, se han identificado mutaciones en el gen que codifica la subunidad α 4 del receptor nicotínico colinérgico neuronal (CHRNA4) en varias familias de orígenes diferentes19-22, pero el trastorno parece ser genéticamente heterogéneo, pues la mayoría de las familias no presentan ligamiento con este gen y recientemente se han descrito mutaciones en el gen que codifica la subunidad β2 del receptor nicotínico en varias familias23-25.

20q13.3 8q24 19q 16p12-q12.1 19q31.1 2q21-q33 5q34 20q13.3 15q24 1p21 10q23 ¿? 2q 22q11-q12 15q14 ¿?

Canal de potasio (KCNQ2) Canal de potasio (KCNQ3) Subunidad β1 del canal de sodio Subunidad α1 y α2 del canal de sodio Subunidad γ2 del receptor GABA Subunidad α4 del receptor nicotínico neuronal Subunidad β2 del receptor nicotínico Epitempina

16p12-11.2

Epilepsia familiar temporal La epilepsia familiar temporal constituye un síndrome clínica y genéticamente heterogéneo26, con tres entidades diferenciadas, ambas transmitidas con herencia autosómica dominante. La epilepsia lateral temporal autosómica dominante o epilepsia parcial con síntomas auditivos, cursa con crisis parciales simples visuales (imágenes simples), auditivas (zumbido, ruido de maquinaria), o afásicas, frecuentemente con generalización secundaria, que aparecen frecuentemente en las primeras horas del sueño. Las crisis son muy poco frecuentes y responden bien a los fármacos antiepilépticos, aunque con frecuencia reaparecen al suspender la medicación. No suele haber estupor postcrítico, aunque es frecuente que los pacientes refieran cefalea después de las crisis. El EEG intercrítico habitualmente es normal, aunque puede detectarse actividad epiléptica a nivel temporo-occipital, generalmente unilateral. La neuroimagen es normal. El gen identificado recientemente en familias americanas, noruegas y españolas, codifica para una nue-

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

va proteína de función desconocida y localización sináptica, denominada epitempina27-29, pero existe heterogeneidad genética. La epilepsia familiar autosómica dominante del lóbulo temporal o epilepsia familiar mesial30, se caracteriza por la presentación con fenómenos psíquicos (déjà vu, miedo), autonómicos (náuseas, taquicardia), o sensoriales (sensación de movimiento, distorsiones complejas de imágenes o sonidos) y predominan las crisis parciales complejas, a veces con automatismos oroalimentarios. Al igual que en la epilepsia lateral temporal autosómica dominante, las crisis se inician en la juventud, son poco frecuentes, y responden bien a los fármacos antiepilépticos, aunque recurren si se suspende el tratamiento. El EEG intercrítico y la neuroimagen son normales. Se desconoce la localización cromosómica de esta entidad. Epilepsia parcial con foco variable Este es un síndrome epiléptico familiar, de herencia autosómica dominante, cuya característica más remarcable es la diferente localización del foco epiléptico en cada miembro de la familia, aunque cada individuo parece tener un único foco epiléptico. La mayoría de los pacientes presentan crisis de origen frontal o temporal, aunque en algunos casos, el origen es centroparietal u occipital. El síndrome tiene una baja penetrancia, y la expresividad es muy variable, de forma que mientras que algunos pacientes tienen un escaso número de crisis a lo largo de su vida y con muy buena respuesta a los fármacos antiepilépticos, otros presentan una epilepsia refractaria con crisis muy frecuentes. La neuroimagen es normal en todos los casos. El trastorno es genéticamente heterogéneo con dos loci descritos en los cromosomas 2q31 y 22q11-q1232. Epilepsias parciales benignas de la infancia La epilepsia benigna de la infancia con paroxismos rolándicos (EBPR) y la epilepsia benigna de la infancia con paroxismos occipitales (EBPO) son dos formas de epilepsia parcial con una clara

predisposición familiar, pero con un patrón de herencia complejo que dificulta la identificación de genes implicados en su aparición. La EBPR se caracteriza por crisis generalmente nocturnas, con hipertonía o sacudidas clónicas de hemicara y miembro superior acompañada de salivación y ruidos guturales, que se inicia en la infancia y con una evolución benigna hasta su desaparición en la adolescencia. Se acompaña de un patrón electroencefalográfico típico, con puntas y ondas agudas centro-temporales que parecía transmitirse con un patrón autosómico dominante33, lo que no pudo ser confirmada en estudios posteriores34,35. Recientemente se ha establecido un ligamiento de este patrón electroencefalográfico con el cromosoma 15q14, en la misma región en la que se ha establecido un ligamiento con algunas familias con epilepsia mioclónica juvenil36. La EBPO se caracteriza por crisis motoras precedidas de síntomas visuales y seguidas con frecuencia de migrañas, de inicio en la infancia y curso benigno, con desaparición espontánea en la adolescencia, y un patrón electroencefalográfico típico con descargas paroxísticas occipitales. Se trata de un síndrome peor estudiado, pero se ha descrito una familia con un patrón de herencia dominante, al menos del trazado electroencefalográfico37. Guerrini et al. describieron una familia consanguínea, con un síndrome autosómico recesivo de inicio en la infancia, en el que se asocia epilepsia rolándica, distonía paroxística inducida por el ejercicio y calambre del escribiente38. Encontraron un ligamiento con el cromosoma 16p12-11.2, en la misma región en la que se sitúa el síndrome de convulsiones infantiles y coreatetosis paroxística autosómica dominante, por lo que ambas entidades podrían ser variantes alélicas39. Epilepsia con paroxismos rolándicos y dispraxia del habla Scheffer et al. describieron una familia con un síndrome epiléptico que se asemeja a la epilepsia rolándica benigna, con un claro patrón autosómico dominante con elevada penetrancia y posible anticipación, y que asociaba dispraxia

TRASTORNOS NEUROLÓGICOS PAROXÍSTICOS

oral y del habla con deterioro cognitivo en las últimas generaciones40. Podría tratarse de un trastorno alélico con la epilepsia benigna con paroxismos rolándicos con algunas familias que presentan un fenotipo intermedio41. Epilepsia con convulsiones neonatales e infantiles benignas Ambos tipos se transmiten con herencia dominante y se diferencian en la edad de inicio. Mientras que las convulsiones neonatales familiares benignas comienzan en la primera semana de vida y suelen desaparecer antes de la sexta, las convulsiones infantiles familiares benignas aparecen entre el cuarto y el duodécimo mes de edad. Ambas se caracterizan por la presencia de crisis tónicas generalizadas o focales con una evolución benigna, sin alteración del desarrollo físico ni mental. Los pacientes con convulsiones infantiles familiares benignas no presentan crisis después de los 2 años de edad42, mientras que los que presentan convulsiones neonatales familiares benignas tienen un riesgo de entre un 10 y un 15% de sufrir crisis epilépticas en la edad adulta. Se han identificado 2 genes situados en el cromosoma 20q13.3 y en el cromosoma 8q24 que codifican la síntesis de canales de potasio (KCNQ2 y KCNQ3)43-45, homólogos del KCNQ1, uno de los genes implicados en la aparición del síndrome de QT largo46. Se ha descrito una familia con convulsiones neonatales benignas, en la que algunos pacientes presentaban una edad de inicio algo más tardía de lo habitual en este síndrome, aunque más precoz que lo descrito en las convulsiones infantiles benignas (entre la primera semana y el cuarto mes de vida), en la que no se ha podido establecer un ligamiento con el cromosoma 20 ni con el 8, lo que indica que existe al menos un tercer locus implicado en la aparición de este síndrome47. En cuanto a las convulsiones infantiles benignas, se ha establecido un ligamiento con el cromosoma 19q48. Szepetowski et al. describieron 5 familias con convulsiones infantiles benignas asociadas a coreoatetosis paroxística, encontrando un ligamiento con la región centromérica del cromosoma 1649 en la misma región donde se ha

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localizado recientemente la epilepsia rolándica autosómica recesiva con distonía paroxística inducida por el ejercicio y calambre del escribiente50. En estas familias ligadas al cromosoma 16, los individuos afectados presentan, además de convulsiones infantiles benignas, episodios de coreoatetosis que se inician hacia los 10 años de edad, y que son completamente distintas de las crisis epilépticas que presentaron en los primeros meses de su vida. Tomita et al. han encontrado un ligamiento en la misma región en 8 familias con coreoatetosis paroxística, en las que casi la mitad de los pacientes habían sufrido crisis epilépticas afebriles en su infancia51, lo que parece sugerir que tanto el fenómeno epiléptico como el disquinético son variedades fenotípicas con un mismo mecanismo patogénico. Otros síndromes epilépticos de base genética con crisis parciales Scheffer y Berkovic describieron varias familias australianas con un síndrome epiléptico denominado epilepsia generalizada con crisis febriles plus (GEFS +), transmitido con un patrón autosómico dominante con una elevada penetrancia, en el que son posibles varios fenotipos: unos pacientes presentan crisis febriles típicas, que aparecen exclusivamente con la fiebre entre los 3 meses y los 6 años de edad; la mayoría de los pacientes tienen crisis febriles que se extienden más allá de los 6 años de edad asociadas a crisis generalizadas tónico-clónicas afebriles; por último, algunos pacientes presentan crisis febriles asociadas a otros tipos de crisis epilépticas (ausencias, mioclónicas, atónicas, crisis parciales de lóbulo temporal) o un síndrome mioclónicoastático52,53. Wallace et al. encontraron una mutación en el gen SCN1B que codifica la subunidad β1 del canal de sodio dependiente de voltaje situado en el cromosoma 19q31.1 en estas familias australianas54. Posteriormente, se han descrito 2 familias francesas y una franco-canadiense con el mismo fenotipo clínico, en la que se excluyó la existencia de mutación en este gen, estableciéndose un ligamiento con el cromosoma 2q21q33, en una región donde se sitúan 4 genes que

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codifican diferentes isoformas de la subunidad α de canales de sodio dependientes de voltaje55. El gen ha sido finalmente identificado en las familias francesas, que presentan 2 mutaciones que se segregan con la enfermedad en el gen SCN1A que codifica la subunidad α1 del canal de sodio neuronal activado por voltaje56. Un tercer locus de GEFS + se acaba de descubrir en el cromosoma 5q34 en el gen que codifica para la subunidad γ2 del receptor GABA. La correlación fenotípica de las mutaciones en este gen es muy amplia57,58. Desde el punto de vista clínico, no existen grandes diferencias entre las familias australianas ligadas al cromosoma 19, y las francesas, ligada al cromosoma 2. La penetrancia parece ser algo mayor en las ligadas al cromosoma 2. En algunos pacientes franceses se apreció un retraso mental, que no se ha descrito en las familias australianas. En lo que se refiere a la fenomenología de las crisis asociadas a las crisis febriles, en todas las familias hay pacientes con crisis generalizadas de distintos tipos, pero mientras que en 2 pacientes franceses se describen crisis parciales hemiclónicas o versivas que sugerían un origen frontal, en las familias australianas un paciente presenta crisis parciales temporales, pero no hay ninguno con crisis frontales. MIGRAÑAS La migraña es el trastorno neurológico paroxístico más frecuente que afecta hasta un 12% de hombres y cerca de un 25% de mujeres en la vida adulta. Se distinguen formas con o sin sintomatología neurológica acompañante. La sintomatología neurológica o aura que precede o acompaña a la cefalea suele de ser visual, sensitivo-motora o incluso afásica. En general, las formas sin aura son mucho más frecuentes (2:1). La condición hereditaria de la migraña ha sido puesta de manifiesto por casi todos los estudios epidemiológicos que muestran una fuerte agregación familiar de casos de migraña. Los análisis del patrón de segregación no son concluyentes, aunque existe una mayoría que se inclinan por un patrón dominante con una penetrancia variable ligada al sexo o a otros factores, sin descartar una

posible herencia maternal en algunos casos59-61 y la importancia de los factores ambientales. Por todo ello se puede decir que la migraña es un síndrome de etiología poligénica y multifactorial, incluyéndose las migrañas aisladas y las migrañas sindrómicas insertas en cuadros neurológicos más complejos. Migrañas no sindrómicas Las bases moleculares de las migrañas no sindrómicas son aún mal conocidas y sólo se han determinado dos loci y un gen de la variante de migraña conocida como migraña hemipléjica familiar (MHF) en la que el fenotipo es muy característico, con crisis de dolor acompañadas de deficit de fuerza hemicorporal con trastorno de lenguaje o incluso de conciencia acompañante y el patrón de herencia autosómico dominante con una penetrancia casi completa62. La mayoría de familias con MHF presentan mutaciones en un gen en el cromosoma 19 que codifica para una subunidad del canal de Ca++ neuronal63,64. Mutaciones en este gen provocan además una forma de ataxia episódica de la que se hablará más adelante y una forma de ataxia progresiva autosómico dominante en función del tipo y localización de la mutación65-67. Existen al menos otros dos loci de MHF en el cromosoma 1, en las regiones 1q31 y 1q21-23 donde se encuentran algunos genes candidatos ligados a subunidades de canales de Ca++y K+, sin que hasta el momento existan mutaciones detectadas en estos genes68,69. Existe al menos un locus autosómico adicional aún no localizado69, además de dos loci en el cromosoma X en Xq242870 y en Xq13 en la vecindad del gen GJB que codifica para la conexina 3271. Migrañas sindrómicas Además de la migraña aislada, la cefalea migrañosa puede formar parte de síndromes neurológicos más complejos de base genética. El más conocido de ellos es el síndrome CADASIL debido a mutaciones en el gen Notch3, donde la migraña es una de las primeras manifestaciones

TRASTORNOS NEUROLÓGICOS PAROXÍSTICOS

en la tercera o cuarta década de la vida precediendo las lesiones vasculares y el deterioro cognitivo característicos de esta entidad transmitida con herencia autosómico dominante72,73. Existe otro síndrome denominado HERNS que agrupa migraña, con retinopatía, nefropatía e ictus cuya localización cromosómica está en la región 3p21.1-p21.374,75. Algunos pacientes con cavernomatosis familiares cuyo locus está en el cromosoma 7q11.2q21 presentan ataques de migraña homolaterales a la lesión y que pueden alertar sobre su existencia en un contexto familiar adecuado76. Lo mismo se puede decir de la enfermedad de RenduOsler, cuyos loci cromosómicos se han localizado en los cromosomas 9q33-34, 3p22 y 12q77-79. En la angiopatía amiloidea por mutaciones en el gen de la proteína precursora del β-amiloide en el cromosoma 21 o en el de la transtiretina se han descrito migrañas como síntoma acompañante80,81. Se ha descrito igualmente una migraña asociada a una vestibulopatía familiar autosómico dominante y a cuadros de distonía paroxística desencadenada con el ejercicio, aunque en estos casos pueden ser manifestaciones alélicas de diferentes fenotipos paroxísticos causados por alteraciones en un único gen82. Otros estudios han analizado el posible papel de la herencia mitocondrial en las migrañas, cuyos resultados han sido en general pobres, con excepción de las migrañas que se inscriben dentro de los síndromes de encefalomiopatía mitocondrial como el MELAS o el MERFF, entre otros83. La migraña está presente en un buen número de pacientes con la mutación A3243G, aunque esta mutación no está presente en casos esporádicos de migraña con o sin aura84,85. No es descartable que estas u otras mutaciones o polimorfismos no detectables en sangre periférica puedan ser factores de riesgo de migrañas o de sus complicaciones como el infarto migrañoso. Además de los genes causativos, hay un gran número de estudios de asociación de la migraña con alelos de diferentes genes que podrían explicar algunas de las manifestaciones acompañantes de la migraña. Así, el polimorfismo del alelo 1 del gen receptor dopaminérgico DRD2 se asocia a las manifestaciones vegetativas características de las crisis de migraña que presentan algunos

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pacientes86. El polimorfismo NcoI del mismo gen se asocia a los síntomas ansioso-depresivos asociados en estos pacientes87. La variante alélica T102C del gen 5-HT2A se ha asociado con un mayor riesgo para sufrir migraña con aura al igual que variante del gen MTHFR88-89. ATAXIAS PAROXÍSTICAS Las ataxias episódicas (AE) hereditarias constituyen un grupo de trastornos paroxísticos cuya importancia es desconocida por confundirse en ocasiones con los cuadros de vértigo paroxístico. En la denominada AE tipo 1 los episodios de ataxia duran unos minutos y se asocian a mioquimia con un estado interictal normal90. En la AE tipo 2, los episodios de ataxia se combinan con la presencia de un nistagmus interictal y responden favorablemente a la acetazolamida91. Ambos tipos comienzan en la infancia o adolescencia y se transmiten con herencia dominante. La ataxia episódica tipo 1 se debe a mutaciones en un canal de K+ cerebral, mientras que la ataxia tipo 2 se debe a mutaciones en el gen de la MHF que codifica para un canal neuronal de Ca++92,93. Este trastorno es alélico de la ataxia progresiva denominada SCA6 debida a mutaciones dinámicas en este mismo gen, mientras que la ataxia episódica y la migraña hemipléjica familiar se deben a mutaciones puntuales en este gen. Algunos pacientes con AE tipo 2 presentan además migraña o epilepsia94,95. VÉRTIGOS PAROXÍSTICOS El vértigo es un trastorno paroxístico, generalmente esporádico, que puede ser debido tanto a disfunciones laberínticas o centrales que pueden ser episódicas o constituir un cuadro crónico. No resulta fácil muchas veces para los pacientes describir si los síntomas son de tipo vertiginoso, atáxico o una mezcla de ambos. Dentro de los vértigos paroxísticos de presumible base genética se incluyen dos tipos. El primero ha sido descrito en familias de Carolina del Norte, y por asociar ataxia, ha sido denominado AE tipo 396.

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Figura 16.1. Solapamiento clínico entre diversos trastornos neurológicos paroxísticos.

El segundo tipo que tambien asocia ataxia se ha denominado AE tipo 4, y ha sido descrito en una gran familia canadiense de religión menonita97. A diferencia de las AE episódicas tipo 1 y 2, en estos cuadros el vértigo descrito como ilusión de rotación del entorno o del propio paciente es el rasgo fenotípico principal. Además del vértigo, los pacientes presentan tinnitus y, a diferencia del tipo anterior, no presentan anomalías en los movimientos de persecución ocular lenta, no responden a la acetazolamida ni tampoco presentan mioquimia interictal. DISQUINESIAS PAROXÍSTICAS Las disquinesias paroxísticas son un grupo heterogéneo de trastornos del movimiento caracterizados por la aparición recurrente de breves

episodios de movimientos involuntarios anormales. Clásicamente se clasifican como disquinesias paroxísticas inducidas por el ejercicio o movimiento y las no inducidas por el movimiento98. Dentro de las primeras se distinguen las que se producen como consecuencia de un breve movimiento brusco o las desencadenadas como consecuencia de un ejercicio prolongado. Existe un tipo adicional recientemente descrito de disquinesia familiar con mioquimia de locus desconocido hasta la fecha99. Las disquinesias hipnogénicas descritas originalmente por Lugaresi y Cirignotta100, corresponden mayoritariamente a formas de epilepsia frontal nocturna autosómica dominante, pero existen casos no ligados a ninguno de los loci cromosómicos relacionados con la EFNAD, por lo que la existencia de una verdadera disquinesia nocturna de naturaleza no epiléptica permanece abierta.

TRASTORNOS NEUROLÓGICOS PAROXÍSTICOS

Disquinesia paroxística inducida por el movimiento

Las secundarias a un movimiento que actúa como desencadenante fueron descritas por Kertesz101, siendo el estímulo muy variado; desde un leve movimiento a un ejercicio más prolongado o un cambio en la intensidad o ritmo de ejecución del movimiento. Los ataques pueden ir precedidos de una sensación de alerta en muchos pacientes y afectan clásicamente a un hemicuerpo, afectando al lenguaje en ocasiones, pero sin alteración del nivel de alerta. En los casos en lo que se puede sospechar una agrupación familiar, el patrón de herencia es autosómico dominante. A medio camino entre este cuadro y las convulsiones infantiles está el síndrome de convulsiones infantiles y calambres descrito en niños y ligado a un locus en el cromosoma 16p12-q12, donde pudiera encontrarse un gen común a ambos trastornos. Lance describió una forma de disquinesia relacionada con el ejercicio en la que los ataques que duraban de 5-30 minutos se desencadenaban tras un ejercicio prolongado y después de un período de latencia tras terminar el ejercicio de 1015 minutos102. Los antiepilépticos no son útiles, aunque en algún caso la acetazolamida puede ser efectiva. Este es un trastorno más raro que el anterior y al menos en una familia que combina distonía y migraña el ligamiento con el cromosoma 2q se ha excluido, lo que sugiere una naturaleza diferente103.

Disquinesia paroxística no relacionada con el movimiento

Este trastorno fue originalmente descrito por Mount y Reback en pacientes que sufrían una serie de ataques de coreoatetosis donde el desencadenante era el alcohol o la fatiga y que podían durar varias horas en familias con un patrón de transmisión autosómico dominante104. Los ataques tendían a provocar distonía más que corea, y los períodos libres de ataques eran mucho más prolongados que en el tipo anterior. Algún paciente podía mostrar alguna alteración distónica de carácter interictal constante o la pre-

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sencia concomitante de mioquimia, siendo la tendencia hacia la disminución de la sintomatología con el paso del tiempo105. Se ha descrito una familia alemana que a la clínica descrita asocia parestesias periorales, visión doble, cefalea, mioclonías generalizadas y pérdida de conocimiento inducidas a veces por alcohol, stress o fatiga. En algunos casos se asocia una paraparesia espástica, en un interesante caso de mezcla de semiología paroxística y progresiva106. Los pacientes con distonía no inducida por ejercicio no suelen responder a los anticomiciales y, en cambio, algunos sí lo hacen a la L-dopa. Al igual que en otros trastornos por déficit dopaminérgico, los pacientes se benefician del sueño y existen cambios en la presencia de metabolitos de la L-dopa en el LCR. Se ha descubierto un locus cromosómico en la región 2q107, pero la familia alemana referida presenta ligamiento con la región cromosómica 1p106. TEMBLOR El temblor definido como movimiento rítmico de la cabeza, el tronco o las extremidades alrededor de un eje no es exactamente un fenómeno paroxístico como los demás pero comparte algunas de sus características más importantes. No nos referiremos al temblor de reposo de baja frecuencia y elevada amplitud característica de los síndromes parkinsonianos sino el temblor de elevada frecuencia y baja amplitud que conocemos como temblor de actitud o temblor esencial. Es el movimiento anormal más frecuente, con una prevalencia de entre el 0,3 y el 1,7% en población normal y hasta del 10,2% en población mayor de 65 años. En entre un 17 y un 70% de casos según las series existe al menos un familiar de primer grado afectado108. No parece que existan características fenotípicas que diferencien los casos familiares de los esporádicos. En algunas familias, el temblor cosegrega con otros trastornos neurológicos como la distonía o el calambre del escribiente, con migraña o con vértigo episódico109,110 con un patrón de herencia sugestivo de transmisión dominante con penetrancia incompleta. Existe incluso una variante de temblor paroxístico de carácter familiar111. Desde el pun-

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to de vista genético se han descrito ligamientos con la región 3q13 en una muestra islandesa (FET1)112 y con la región 2p22-25 (ET2)113. Se han descartado en otros estudios asociación con el gen DYT1, el gen PARK-2 o con el gen de la MHF. Es probable que exista una gran heterogeneidad genética en este trastorno y que el temblor pueda ser una manifestación fenotípica alélica de mutaciones en genes causantes de otras patologías del movimiento. TRASTORNOS NEUROMUSCULARES PAROXÍSTICOS Parálisis periódicas

Las parálisis periódicas se caracterizan por un rasgo clínico común, que es la debilidad episódica de las extremidades, habitualmente durante el período de descanso tras un ejercicio. Esta debilidad puede ser asimétrica y durar horas o incluso días afectando a la musculatura proximal y de miembros inferiores antes que a la distal o a los miembros superiores. Se distinguen formas hipercaliémicas, hipocaliémicas o normocaliémicas dependiendo de los niveles de K+ sérico durante los ataques114. La forma hipercaliémica (PPHK) o adinamia episódica hereditaria de Gamstorp se transmite de forma autosómica dominante sin predominio de sexos. Se inicia en la infancia con episodios recurrentes de debilidad muscular que duran desde unos minutos a una hora, con recuperación completa, pudiendo repetirse varias veces en un día. Los ataques de debilidad se desencadenan por el descanso tras un ejercicio, la ingesta de potasio o el estrés. La tasa de K+ sérico durante el ataque sube hasta 5-7 mmol/L y sólo raramente llega a afectar la función cardíaca. En el EMG algunos casos presentan miotonía y otros no. La elevación de K+ sérico durante los ataques sólo se produce en el 50% de los individuos. Existe una gran variabilidad fenotípica entre las familias e incluso entre los miembros de una misma estirpe. Los ataques de adinamia se pueden tratar con gluconato cálcico y acetazolamida. La evolución es hacia una mitigación de la sintomatología con el paso del tiempo, aunque en algunos

pacientes pertenecientes a familias concretas se desarrolla una leve miopatía proximal. La variante normocaliémica (PPN) o de Poskanzer se parece a la anterior en casi todos los aspectos clínicos, pero el K+ es normal durante los ataques. Comienza en la edad infantil, dando lugar a las crisis de más larga duración (días a semanas) que ceden tras la administración de infusiones hipertónicas de ClNa. La realidad de esta entidad es discutida, toda vez que al menos una familia con esta variedad presenta un sustrato molecular similar a la variante hipercaliémica, y en algunos casos la ingesta de sales de K+ desencadena los episodios de parálisis. La variante hipocaliémica (PPHP) o de Cavaré-Westphal es la más frecuente, con una prevalencia estimada de 1 caso/100.000 habitantes. Clínicamente es más leve que las anteriores y se transmite igualmente con herencia autosómica dominante, con un predominio femenino de 3:1, aunque las mujeres padecen formas más leves. Existen descripciones de casos aparentemente esporádicos. Los ataques se inician en la 1.a o 2.a década de la vida y los desencadenantes más habituales son la ansiedad, la ingesta de carbohidratos y, en menor medida, el descanso tras el ejercicio. Con el paso de los años puede desarrollarse una leve miopatía próximal. Se pueden tratar los ataques con la administración de potasio por vía parenteral y oral, con acetazolamida y se aconseja evitar la alimentación rica en grasas e hidratos de carbono. La paramiotonía congénita (PC) de Von Eulenburg es un trastorno neuromuscular transmitido con herencia autosómica dominante que se caracteriza por la presentación de ataques de miotonía inducida por frío, asociada o seguida de un cierto grado de debilidad muscular. Aparece durante el ejercicio, se agrava con él y se hace presente en la cara, el cuello y las manos de manera predominante. Algunos pacientes presentan ataques de parálisis hipercaliémica concomitante. Otra forma clínica del mismo trastorno es la llamada miotonía fluctuante, que se inicia desde el nacimiento y persiste sin grandes cambios hasta que en la adolescencia comienzan a aparecer los ataques de debilidad con hipercaliemia. Existe aún una variedad clínica denominada miopatía por defecto en el canal de sodio (MCS), que se

TRASTORNOS NEUROLÓGICOS PAROXÍSTICOS

presenta clínicamente en forma de una miotonía en ocasiones etiquetada como congénita (forma de Thomsen), que se diferencia de la paramiotonía congénita típica en que el frío no es el desencadenante y no presentan ataques de debilidad con hipercaliemia. Tanto la PPHK, la PC como la MCS se deben a mutaciones en el gen que codifica la subunidad α del canal del Na+ (SCN4A) localizado en la porción larga del cromosoma 17. Existen mutaciones específicas para cada variante clínica e incluso para aquellas familias con solapamiento de ambos cuadros115. Algunas familias presentan mutaciones en un gen que codifica para una subunidad de un canal de K+ (MiRP-2, MinK related peptide)116. El gen relacionado con la variante hipocaliémica se localiza en la región q31-32 del cromosoma 1 y codifica la síntesis de la subunidad α-1 del canal del Ca++ sensible a la dihidropiridina (CACNL1A3)117. Se han descrito algunas familias asociadas a mutaciones en el gen SCN4A118 e incluso con el gen MiRP-2116. Un tipo especial de parálisis diskaliémica es el síndrome de Andersen, que presenta como rasgos fenotípicos característicos la parálisis periódica y una dismorfia facial119. El gen se localiza en el cromosoma 17q23 y codifica para un canal de K+120. Recientemente se ha publicado la existencia de cosegregación de parálisis periódica, temblor u epilepsia en una familia española121. También se ha publicado una revisión de las correlaciones fenotípicas de las diferentes mutaciones122.

Miotonías congénitas

Las miotonías congénitas son miopatías caracterizadas por la presencia constante de miotonía acompañada de un desarrollo muscular pseudohipertrófico y de una miopatía escasamente progresiva. La miotonía se desencadena con el ejercicio y mejora a lo largo de este. La fuerza puede estar algo disminuída. Son trastornos poco frecuentes, con una incidencia de 1-2 casos cada 100.000 habitantes. Existe una variedad dominante (forma de Thomsen), que aparece en la infancia precoz y que no provoca grandes trastor-

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nos, y una forma recesiva (forma de Becker), de aparición un poco más tardía con mayor presencia de pseudohipertrofia muscular y con una evolución respecto a la debilidad algo menos favorable. La CK sérica puede estar ligeramente elevada especialmente en los casos recesivos. No existen trastornos electrocardiográficos123. El diagnóstico es fundamentalmente clínico y se establece con los otros trastornos miotónicos no distróficos. La biopsia muscular puede mostrar una hipertrofia de fibras con otros cambios miopáticos inespecíficos. No está indicado un tratamiento en las formas leves. En los casos más intensos pueden usarse fármacos antimiotónicos como la fenitoína, la quinina, la procainamida o el mexiletine, sin olvidar posibles efectos de estos fármacos sobre la conducción atriventricular. Ambas formas se deben a mutaciones en el gen que codifica los canales musculares del Cl–, localizado en la porción larga del cromosoma 7124. CRISIS DE PÁNICO La inclusión de un trastorno psiquiátrico en esta revisión representa un anticipo de lo que es el inicio de la confluencia de saberes entre la psiquiatria y la neurología. La revolución molecular, que ha traido consigo el conocimiento de las bases biológicas de trastornos típicamente psiquiátricos como la enfermedad bipolar o la esquizofrenia, está renovando las bases metodológicas y conceptuales de la psiquiatría, acercándola a los presupuestos de la neurología125. Dentro de los trastornos de ansiedad, una manifestación claramente paroxística la constituyen las crisis de pánico. Las crisis de pánico se caracterizan por ataques de pánico repetidos, miedo anticipado de ataques futuros con evitación de situaciones potencialmente desencadenantes. Es un trastorno crónico que afecta hasta a un 3,5% de la población126. El conocimiento de las bases biológicas de este trastorno procede de estudios de segregación clásicos con gemelos que demostraron la existencia de esta asociación, aunque fuertemente influenciada por los condicionantes externos. Una estimación de la magnitud de este riesgo lo situa en el doble del existente para el caso de la migraña.

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Los primeros datos que sugirieron la participación de un sistema neuroquímico concreto en la génesis de las crisis de pánico proceden de experimentos farmacológicos que mostraban un papel de los agonistas de la colecistoquinina (CCK) en el desarrollo de las crisis de pánico127. Se han localizado dos genes relacionados con el metabolismo endógeno de la CCK en los cromosomas 4p16.2-p15 y 11p15.4 y aun se han localizado dos loci adicionales relacionados con este trastorno128,129.

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CONCLUSIONES Clínicamente, todos estos trastornos tienen en común la existencia de una sintomatología paroxística y la normalidad interictal. Como se puede apreciar en la Figura 16.1, existen numerosos casos de solapamiento entre diferentes síndromes, a veces dentro de la misma familia. También comparten factores precipitantes como el stress, el frío, el cansancio, el ayuno, la fiebre, el alcohol o la falta de sueño. Todo ello refuerza la existencia de un continuum fenotípico que es preciso explorar con la ayuda de la herramienta molecular. Los datos preliminares sugieren una participación importante de diferentes subunidades de los múltiples canales iónicas que se expresan de manera ubicua a lo largo de todo el sistema nervioso. Tambien, desde el punto de vista terapéutico, estos trastornos comparten una respuesta positiva a diferentes agentes como la acetazolamida o diferentes antiepilépticos. El mejor conocimiento del sustrato molecular de estos trastornos nos permitirá un mejor uso de estos fármacos y el diseño de nuevas moléculas más eficaces y específicas.

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C APÍTULO

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Genética de los accidentes cerebrovasculares J. M. Gobernado Serrano

INTRODUCCIÓN A pesar del considerable desarrollo que se ha producido en el conocimiento de la patogénesis de las enfermedades cerebrovasculares en la última década, el ictus cerebral sigue siendo la tercera causa más común de mortalidad en los países occidentales1. El tratamiento clínico del ictus agudo continúa siendo esencialmente sintomático, y aunque van emergiendo algunas intervenciones farmacológicas de probado beneficio, una significativa proporción de pacientes permanecen incapacitados o mueren. Existe actualmente unanimidad en que la manera más eficaz de luchar contra el ictus cerebral es reducir su incidencia mediante acciones preventivas. Sin embargo, la prevención efectiva depende en gran medida de la identificación de los factores de riesgo y la posibilidad de modificarlos. Los principales factores riesgo de enfermedad cerebrovascular están bien definidos (edad, hipertensión arterial, etc.); no obstante, en e1 40-50% de los pacientes no es posible identificar una causa obvia, siendo los factores genéticos probablemente responsables de una proporción significativa, tal y como ha podido deducirse, en décadas pasadas,

a través de los estudios epidemiológicos, investigaciones sobre modelos animales y ejemplos de desórdenes monogénicos de enfermedad cerebrovascular e ictus. En la última década, con la eclosión de la biología molecular, se ha producido un renovado interés por el conocimiento de las causas genéticas de las enfermedades cerebrovasculares. Estos esfuerzos han proporcionado evidencia de que los factores genéticos pueden jugar un papel directo como causa específica de ictus o actuar como base de susceptibilidad para algunos tipos de ictus u otros factores de riesgo vascular. Sin embargo, como veremos a continuación, el problema no es sencillo. Los neurólogos conocemos que el ictus no es una enfermedad única y que una amplia variedad de procesos pueden dar lugar al mismo fenotipo clínico vascular; por ejemplo, la oclusión aterotrombótica de una arteria, la disección de una arteria, un evento cardioembólico o un estado de hipercoagulabilidad, pueden producir cuadros isquémicos cerebrales clínicamente indistinguibles; lo mismo ocurre si consideramos las causas de hemorragia intracerebral o subaracnoidea. Estas diferencias son incluso más significativas 225

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cuando se consideran las etiologías genéticas del ictus. Así, por ejemplo, los procesos subyacentes de la arterioesclerosis son significativamente diferentes de los que causan displasia fibromuscular o fibrilación auricular. Si consideramos la hemorragia intracerebral, las bases genéticas de la angiopatía amiloide son notablemente distintas del gen que causa los angiomas cavernosos o de las mutaciones genéticas que determinan las deficiencias de los factores de coagulación o que causan estados de hipocoagulabilidad. Por otra parte, las dificultades pueden incrementarse notablemente si tenemos en cuenta los distintos mecanismos y vías a través de los cuales la herencia puede influir en el desencadenamiento del ictus cerebral. Por ejemplo, factores de riesgo como la hipertensión arterial, diabetes mellitus o la ateroesclerosis, tienen una herencia muy compleja, pudiendo cada uno de ellos ser causado por la mutación de más de un gen o ser debidos a mutaciones simultáneas en dos o más genes que producen el mismo fenotipo. El Proyecto Genoma Humano, que ha establecido la identidad y secuencia de todos los genes del DNA humano, y los potentes medios de que dispone actualmente la genética molecular, están intentando desvelar el complejo entramado de las bases genéticas de muchos procesos morbosos, y particularmente del ictus. En este ambicioso intento se emplean diversos métodos, entre los que se incluyen análisis de ligamiento, distribuciones alélicas y estudios de asociación2. En desórdenes poligénicos también se está utilizado con relativo éxito test no paramétricos como los de desequilibrio de transmisión (TDT)3. Los estudios basados en familias son, a menudo, preferidos a los estudios tipo caso-control, porque evitan la dificultad de averiguación de poblaciones apropiadas de casos y controles4. EPIDEMIOLOGÍA DE LA GENÉTICA DEL ICTUS Una historia familiar de enfermedad cerebrovascular e ictus, a menudo se percibe como un factor de riesgo. Si el ictus es un desorden genético, los estudios epidemiológicos pueden detectar agrupamientos familiares de afectados. Para inten-

tar buscar una determinada asociación entre historia familiar e ictus, se aplican tres tipos de estudios de epidemiología genética: estudios de poblaciones, estudio de familias y análisis de gemelos. El estudio prospectivo Framingham ha establecido que el antecedente de ictus o enfermedad coronaria en la historia de los padres se asocia con un incremento de riesgo para ictus en sus descendientes tres veces mayor 5. Una historia materna de ictus es un predictor independiente para ictus en varones de mediana edad en Suecia6. Hay pocos datos concernientes a gemelos y enfermedad cerebrovascular, aunque el estudio de la «National Academy of Sciences Research Council», halla tasas de concordancia del 3,6% para gemelos dizigóticos y del 17,7% para monozigóticos7. También se ha observado que ictus e infarto de miocardio coexisten más frecuentemente en gemelos idénticos8. Recientemente se ha puesto de manifiesto que en gemelos idénticos y no idénticos sanos, los mecanismos de activación de los sistemas hemostáticos están claramente controlados por factores genéticos que pueden jugar papel en la enfermedad vascular9. CLASIFICACIÓN Los procesos cerebrovasculares de tipo genético, pueden ser clasificados de acuerdo con su complejidad en: • Desórdenes monogénicos simples. • Desórdenes monogénicos con heterogeneidad genética. • Desordenes poligénicos. • Desórdenes multifactoriales. Dentro de cada tipo precedente, atendiendo a la condición que determina el acontecimiento vascular cerebral, pueden considerarse tres subtipos fisiopatológicos: embólicos, trombóticos e isquémicos y hemorrágicos. Atendiendo al sistema esencialmente comprometido por los trastornos genéticos, se les agrupa en: • Desórdenes del sistema homeostático. • Desórdenes del tejido conectivo.

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• Vasculopatías. • Desórdenes hereditarios de los vasos de pequeño diámetro. • Desórdenes metabólicos. • Canalopatías. • Miscelánea. Todas estas agrupaciones son tentativas incompletas y a menudo artificiales, ya que en unos casos el mismo proceso es consecuencia de varios mecanismos y compromete a más de un sistema, y en otros no se dispone todavía de la información básica suficiente, pero se mantiene por su utilidad práctica. Desórdenes monogénicos se refieren a aquellos que son producidos por una mutación simple en un único gen, dando lugar a un fenotipo definido, siendo ejemplos demostrativos las deficiencias de proteína C y S, la Neurofibromatosis tipo I o el CADASIL. Desórdenes monogénicos con heterogeneidad genética, incluyen aquellos causados por mutaciones en diferentes genes, produciendo el mismo fenotipo; como por ejemplo el síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV o la Hiperhomocisteinemia. Desorden poligénico, se refiere a los que son causados por mutaciones simultáneas (o polimorfismos) en dos o más genes. Los desórdenes complejos mixtos. Son aquellos que están compuestos por varias condiciones distintas, unas hereditarias y otras ambientales no hereditarias; un buen ejemplo es la ateroesclerosis, que en muchos casos es el producto final de la interacción de varias condiciones hereditarias, como la hipertensión, diabetes o dislipemia, con factores ambientales como la dieta, el sedentarismo o el tabaco. En algunos casos, un síndrome ictal específico, puede ser a la vez monogénico, poligénico y participar de rasgos complejos multifactoriales; incluso se piensa que algunos síndromes pueden ser causados por defectos genéticos diferentes en cada familiar. Todo esto nos permite imaginar la gran dificultad que tienen que afrontar los estudios genéticos, cuando abordan una enfermedad particularmente heterogénea, desde el punto de vista clínico y etiológico, como es el ictus cerebral.

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DESÓRDENES MONOGÉNICOS Y POLIGÉNICOS HUMANOS ASOCIADOS CON ICTUS ISQUÉMICO CEREBRAL Son poco frecuentes, pero han sido descritas varias entidades, con herencia mendeliana, causadas por mutaciones en un gen único o varios genes, con cuadros ictales prominentes10. Este tipo de posibilidad debe ser considerado, sobre todo, en el diagnóstico diferencial de pacientes menores de 45 años con ictus, en los que faltan los factores de riesgo cerebrovascular más comunes y particularmente en aquellos con historia familiar de ictus. En este último caso, los episodios ictales coexisten con otras manifestaciones sistémicas características fenotípicas de la enfermedad, que facilitan su identificación. Los infartos cerebrales son el resultado de uno o varios mecanismos fisiopatológicos que pueden ser influenciados por la mutación patogénica del gen, incluyendo enfermedad de las grandes arterias, enfermedad de los pequeños vasos, cardioembolismo, desórdenes hematológicos, citopatías mitocondriales, canalopatías o enfermedades del tejido conectivo. En general, la enfermedad arteriosclerótica de los grandes vasos es la responsable del 30% de los ictus isquémicos, la oclusión de los vasos de menor calibre del 20% y en otro 30% la causa suele ser tromboembólica. En la Tabla 17.1 se consignan las principales entidades asociadas con ictus cerebrales isquémicos en los que han sido demostrada una base monogénica o poligénica. Enfermedad de grandes arterias Algunos desórdenes metabólicos, pueden lesionar las paredes de los vasos extra o intracraneales de grueso calibre, dando lugar secundariamente a ateroesclerosis y tromboembolismo atero-arterial y trombosis o hipoxia por hipoperfusión hemodinámica. Algunos ejemplos de desordenes genéticos simples capaces de desencadenar este proceso fisiopatológico son las dislipemias familiares, la homocisteinuria o la anemia de células falciformes. En estas dos últimas, el accidente vascular cerebral puede tener su origen tanto en la lesión arterial como en una tendencia protrombótica, por lo que serán con-

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Tabla 17.1. Desórdenes genéticos humanos asociados con ictus isquémico cerebral. Desórdenes de la coagulación Deficiencia de proteína C (monogénica, AD, 2q13-q14). Deficiencia de proteína S (monogénica, AD, 3p11.1-q11.2). Resistencia a la proteína C activada –factor V Leiden– (monogénica, AD, 1q23). Deficiencia de antitrombina III (monogénico, AD, 1q23-25). Anemia de células falciformes (monogénico, AR, 11p15.5). Síndrome de Sneddon familiar (AD). Desórdenes del tejido conectivo Neurofibromatosis tipo I (monogénico, AD, 17q11.2). Síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV (monogénico con heterogenidad genética, AD, 2). Síndrome de Marfan (poligénico, AD, 15q21.1 y 3p24.2-p25). Vasculopatías Displasia fibromuscular (AD, alteración genética no conocida). Enfermedad moya-moya familiar (poligénica, AD, 3p24.2-p26 y 17q25). Desórdenes metabólicos Enfermedad de Fabry (monogénica, XR, Xq21.3q22). Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis lactica e ictus –MELAS– (monogénica con heterogenidad genética, AD, DNA mitocondrial). Homocisteinuria (monogénica, AR, 21q22.3). Hiperhomocisteinemia (monogénica con heterogenidad genética, AD, 1p36.3). Enfermedades hereditarias de vasos de pequeños diámetro Arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía –CADASIL– (monogénica, AD, 19q12). Desórdenes de etiología desconocida Migraña hemiplégica familiar (poligénica, AD, 19p13, gen canal del calcio y 1q). Endoteliopatía hereditaria con retinopatía, nefropatía e ictus –HERNS– (AD, gen no identificado). AD = autosómica dominante; AR = autosómica recesiva; XR = recesiva ligada al cromosoma X. (Modificada de Hademenos et al., 200111.)

templadas más adelante en la sección específica dedicada a los desordenes hematológicos. Las dislipemias hereditarias se asocian con arterioesclerosis prematura e ictus a edades más tempranas (< 65 años). Aunque esta relación está mejor referida y definida para la isquemia coronaria, el ictus cerebral isquémico precoz está descrito en la hipoalfalipoproteinemia familiar en la forma homocigota de la hipercolesterolemia familiar, hiperlipidemia tipo II y IV y la enfermedad de Tangier10. Enfermedad de pequeños vasos Este es un término radio-neuropatológico, utilizado para referirse a las lesiones cerebrales

estructurales causadas por la estenosis u obstrucción de las arteriolas de pequeño calibre, que suplen la sustancia blanca periventricular, la sustancia blanca profunda y los ganglios basales. La alteración de estos vasos origina dos tipos de síndromes distintos, aunque a menudo solapados: el estado lacunar o infartos lacunares múltiples y cambios difusos de la sustancia blanca fácilmente identificables en la resonancia magnética (RM) cerebral. Estas lesiones pueden ser asintomáticas u originar defectos cognitivos asociados con signos neurológicos focales. Los factores habitualmente más relacionados con estos fenotipos clínicos han sido la edad avanzada y el antecedente de hipertensión arterial o diabetes mellitus de larga duración; no obstante, han sido identificados varios desórdenes

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causados por la mutación patológica de un gen único, que cursan también con este fenotipo clínico, en ausencia de los factores de riesgo antedichos más comunes, como son la arteriopatía cerebral autosomal dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL) y la enfermedad de Fabry. El CADASIL es una enfermedad familiar genética y clínicamente homogénea, que se hereda con un patrón autosómico dominante. Ha sido descrita en muchas regiones de Europa y Norteamérica. El fenotipo clínico se caracteriza por episodios de perfil ictal de localización subcortical que ocurren en la edad media de la vida, en ausencia de los factores de riesgo cerebrovascular normalmente reconocidos. Es común registrar en la historia clínica cuadros de migraña y de trastornos psiquiátricos previos a los episodios ictales. En etapas más tardías de la enfermedad, se suman al cuadro clínico parálisis pseudobulbar por afectación piramidal bilateral, dificultades para la deambulación por rigidez, manifestaciones extrapiramidales en la mitad inferior del cuerpo y deterioro cognitivo progresivo por afectación de los circuitos fronto-tálamo corticales y de las redes de comunicación interhemisféricas e interlobares subcorticales, con enlentecimiento psíquico y motor, alteraciones de la atención, dificultades para la programación, organización y ejecución de tareas secuenciales e incontinencia urinaria, manteniéndose relativamente preservadas en las primeras fases la memoria y el lenguaje. Algunos pacientes presentan crisis epilépticas. La esperanza de vida media de estos pacientes es de alrededor de 65 años. La RM cerebral ponderada en T2 y densidad protónica, muestra cambios de señal confluentes en la sustancia blanca periventricular y profunda de los hemisferios cerebrales (leucoaraiosis) en relación con desmielinización, pérdida de oligodendrocitos y axones e incremento de la glia astrocítica. También suelen detectarse infartos lacunares en ganglios basales, sustancia blanca y tronco cerebral, como lesiones de menos de 2 mm hiperintensas respecto a la señal líquido cefaloraquídeo, consecuencia de la obstrucción de arteriolas de pequeño calibre12. En general, la extensión de los cambios es proporcional a la edad y se correlacionan con el nivel de incapacidad y el

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grado de deterioro cognitivo13. Estos cambios son constantes en todos los pacientes sintomáticos pero, en menor grado, se hallan también en individuos todavía asintomáticos, siendo las lesiones axonales muy precoces en esta enfermedad, según se deduce de los datos recogidos con espectrospía-RM14. La patología subyacente consiste en la afectación de la capa media de los vasos de pequeño calibre, con engrosamientos concéntricos de la pared arterial, un extenso depósito de material granular eosinofílico en la media y reduplicación de la lámina elástica interna. En la sustancia blanca cerebral se aprecia una palidez difusa y focal con tinciones para mielina, con destrucción axonal y gliosis. Los lóbulos frontales, parietales y occipitales son los más afectados y de forma simétrica. Estos cambios se acompañan de múltiples infartos en la profundidad de la sustancia blanca, tálamo y ganglios basales en diversos estadíos de evolución. Con microscopía electrónica los vasos muestran acúmulos parcheados de gránulos osmiófilos, en cerrada asociación con destrucciones focales de la musculatura vascular lisa. La naturaleza exacta de este material no se conoce, pero se acepta que representa condensaciones anormales del citoplasma de la musculatura lisa15. Estos cambios vasculares no están limitados a las arteriolas cerebrales, habiéndose descrito en vasos de nervios periféricos, piel, músculo y vísceras, aunque con lesiones destructivas menos acusadas. Esta enfermedad es causada por mutaciones dentro del gen Notch-3, localizado en el cromosoma 19p13.1. Se piensa que este gen codifica un receptor proteico transmembrana, que contiene varias copias repetidas alineadas de un factor de crecimiento epidérmico, actuando como un potente «señalizador» durante el desarrollo embrionario, siendo desconocido su papel en la vida adulta. El diagnóstico genético puede realizarse por la secuenciación directa del gen Notch-3, demostrando mutaciones missense, que incluyen pérdida o ganancia de un residuo de cisteína. La mayoría estas mutaciones están localizadas en los exones 3 y 416, y en menor medida en el exón 1114. Al ser un gen de gran tamaño, si la familia es «informativa», puede hacerse el diagnóstico de

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la enfermedad mediante análisis de ligamiento. Joutel et al. (2000) han hallado que pueden ocurrir mutaciones espontáneas en algunos individuos, un dato de especial interés a la hora de seleccionar las pruebas diagnósticas apropiadas para testar mutaciones del Notch-3 en poblaciones con ictus17. La enfermedad de Fabry es un desorden metabólico hereditario recesivo, ligado al cromosoma X, causado por la deficiencia del enzima lisosomal α-galactosidasa A. Puede causar indistintamente ictus isquémicos o hemorrágicos cerebrales, más comunes en el territorio vertebrobasilar e isquemia coronaria, generalmente a partir de la cuarta década de la vida. Forman también parte del fenotipo clínico, la presencia de angioqueratomas cutáneos, parestesias dolorosas en las porciones distales de las extremidades y afectación renal con proteinuria. Fisiopatológicamente, el dato más destacable es la acumulación de trihexosidoceramida en las capas íntima y media de los vasos sanguíneos, obstruyendo su luz y dando lugar a ictus cerebral o isquemia coronaria. En la RM ponderada en T2, inicialmente se aprecian cambios de señal en la sustancia blanca periventricular e infartos lacunares asintomáticos, indicativos de afectación de arteriolas de pequeño calibre. Con el tiempo se afectan arterias de mayor diámetro dando lugar a infartos corticales con clínica neurológica focal. La mutación responsable de la enfermedad de Fabry ocurre en el gen que codifica dicho enzima, cartografiado en el cromosoma Xq21.3q22. Desórdenes del tejido conectivo Pueden originar tanto episodios cerebrales isquémicos como hemorrágicos, al provocar lesiones sistémicas en el árbol vascular de distinta naturaleza, tales como aneurismas, oclusiones arteriales, fístulas arteriovenosas y disecciones arteriales. Las tres enfermedades más representativas, aunque poco frecuentes, son la Neurofibromatosis tipo I, el síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV y el síndrome de Marfán. La neurofibromatosis tipo I o enfermedad de von Recklinghausen, tiene una prevalencia de

1/4.000 habitantes y se caracteriza principalmente por la presencia de neurofibromas y manchas de color «café con leche» en la piel, asociándose con frecuencia a tumores cerebrales de estirpe glial. Los cuadros isquémicos suelen producirse por oclusiones vasculares secundarias a la proliferación fibrosa de la íntima. Se hereda con carácter autosómico dominante y el gen responsable (NF1) ha sido identificado en la banda q11.2 del cromosoma 17. No se conoce la función de la proteína que codifica, la neurofibromina18. El síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV se caracteriza, entre otras alteraciones, por laxitud osteoaticular y lesiones vasculares, como disecciones arteriales espontáneas y formación y rotura de aneurismas en arterias de tamaño medio, que originan cuadros ictales isquémicos o hemorrágicos. Se hereda con carácter autosómico dominante. La causa es la deficiencia de síntesis de colágeno tipo III, producida por mutaciones en el gen COL3A1, localizado en el cromosoma 219. Se ha investigado la presencia de mutaciones en este gen en series de aneurismas «idiopáticos», encontrándose solo en raras ocasiones. El síndrome de Marfán, es un desorden del tejido conectivo que afecta a 1/10.000 habitantes. El cuadro clínico incluye, entre otros, disección y dilatación aórticas, con roturas espontáneas. Las disecciones pueden extenderse a las arterias carótidas comunes. Se hereda con carácter autosómico dominante y es causado por mutaciones missense, inserciones y delecciones en el gen que codifica la fibrilina-1, localizado en el cromosoma 15q21.1 inicialmente, habiéndose cartografiado un segundo locus causante de la enfermedad en el cromosoma 3p24.2p2520,21. Vasculopatías Las dos condiciones prototipo de este apartado son la displasia fibromuscular y la enfermedad de Moyamoya. La displasia fibromuscular, es una vasculopatía congénita, no inflamatoria, que causa infartos renales y cerebrales a través de la oclu-

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sión de arterias de gran calibre. Es más común en el género femenino y se manifiesta fundamentalmente por hipertensión arterial e ictus cerebrales en niños y adultos jóvenes entre 30 y 50 años. En ocasiones provoca también la aparición de aneurismas. Se hereda de manera autosómica dominante, con una prevalencia dentro de las familias afectadas del 11%. No se conocen, por el momento, las bases genéticas de la enfermedad22. En la enfermedad de Moyamoya se producen oclusiones de las arterias de gran calibre que constituyen el polígono de Willis en la base el cráneo. Es causa tanto de ictus isquémicos como hemorrágicos en niños y adultos. Las formas familiares de Moyamoya se heredan con carácter autosómico dominante y son, desde el punto de vista genético, heterogéneas, habiéndose detectado familias con mutaciones ligadas al cromosoma 3p24.2-p26 y otras cuyo locus estaba situado en el cromosoma 17q2523,24. Citopatías mitocondriales Constituyen un grupo de desórdenes hereditarios multisistémicos, causados por mutaciones patogénicas en el DNA mitocondrial (mtDNA), que frecuentemente se asocian con patología del sistema nervioso central. Son objeto de otro capítulo de este libro, donde son tratadas en extensión, limitándonos aquí a dejar una breve reseña sobre un síndrome que asocia frecuentemente ictus cerebrovasculares. Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y episodios ictales (MELAS), es una citopatía mitocondrial, con un patrón de herencia materna, que afecta por igual a los descendientes de ambos géneros. Suele tratarse de pacientes de talla corta con episodios de vómitos en la infancia, cuyo cuadro clínico, como el propio enunciado indica, se caracteriza por: a) encefalopatía con crisis, episodios de migraña recurrente con aura y alteraciones cognitivas tardías; b) acidosis láctica con fibras «ragged-red» en la biopsia muscular; y c) episodios ictales cerebrales antes de los 40 años de edad, atribuidos a cambios hemodinámicos. El 80% de los casos de MELAS presentan una mutación puntual el mtDNA A3243G, pero

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se han descrito otras familias con mutaciones A3251G y T3271C. Miscelánea La Migraña hemipléjica familiar es un subtipo autosomal dominante, poco frecuente, de migraña con aura, en la que los ataques de cefalea se asocian con hemiparesia. Los estudios epidemiológicos sobre migraña han puesto de manifiesto una alta tasa de concordancia para migraña en gemelos monocigoticos respecto a dicigóticos, más notable para migraña con aura. Estos datos sugieren que los factores genéticos influyen en ambos tipos de migraña, pero más significativamente en la migraña con aura25,26. En el 50% de las familias con migraña hemipléjica familiar se han localizado anomalías genéticas situadas sobre los cromosomas 19p13 o 1q. Dado que hay familias que no presentan anormalidades en estas localizaciones, hay que esperar, por lo menos, una tercera mutación. En el gen candidato del cromosoma 19, denominado CACNA1A, se codifica la subunidad α1A de los canales de calcio dependientes de voltaje del tipo P/Q. Algunos estudios sugieren que el gen CACNA1A también está relacionado con las formas más comunes de la migraña con aura27. DESÓRDENES MONOGÉNICOS Y POLIGÉNICOS HUMANOS QUE CAUSAN ICTUS HEMORRÁGICOS Los ictus hemorrágicos cerebrovasculares ocurren como consecuencia de la rotura de un vaso cerebral y representan aproximadamente el 17% de todos los ictus. Las hemorragias intracerebrales representan aproximadamente el 10% de todos los accidentes vasculares, y las hemorragias subaracnoideas el 7%. Algunos desordenes genéticos han sido relacionados con ambos subtipos de hemorragia, sumarizándose en la Tabla 17.2. Parte de ellos ya han sido contemplados en el apartado correspondiente a los ictus isquémicos genéticamente determinados (Tabla 17.1), ya que comparten la posibilidad de manifestarse de ambas formas.

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Tabla 17.2. Desórdenes genéticos humanos asociados con ictus hemorrágicos. Hemorragia intracerebral Hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, variante holandesa (monogénica con heterogenidad genética, AD, gen APP cromosoma 21, mutaciones en codones 693 y 692). Hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, variante islandesa (monogénica, AD, sustitución simple en el gen de la cystatina C, cromosoma 20p11.2). Angiopatía amiloide cerebral (bases genéticas desconocidas, endoglina cromosoma 9?). Malformaciones vasculares. Cavernomas cerebrales (poligénica, AD, 7q11.2-q21, 7p15-13 y 3q25.2-27). Malformaciones arteriovenosas: • Síndrome de Rendu-Osler-Weber 1 y 2 (poligénica, AD, 9q y 12q). • Malformación venosa familiar (monogénica, AD, 9p). Hemorragia subaracnoidea Ehlers-Danlos (monogénico con heterogenidad genética, AD, cromosoma 2). Síndrome de Marfan (poligénico, AD, 15q21.1). Enfermedad renal poliquística (poligénica, AD, 16p13.3, 4q13-23 y 6p21.1-p12). Modificada de Hademenos et al., 200111.

Hemorragias intracerebrales Angiopatías amiloides Existen dos formas mortales de hemorragia intracerebral hereditaria, una descrita en Holanda y otra en Islandia. La Hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis-tipo holandés es debida a una mutación en el gen de la proteína precursora de amiloide (APP), localizado en el cromosoma 21. En los miembros afectos se producen las hemorragias entre los 40 y 50 años28. La Hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis-tipo islandés es causada por una mutación en el gen que codifica la cystatina C (un inhibidor de la proteasa de serina) situado en el cromosoma 20p11.2, apareciendo las hemorragias cerebrales, en los miembros afectados más precozmente que en la forma holandesa, entre los 20 y 30 años. En ambas, la fisiopatología es semejante, debilitándose la pared de los vasos al depositarse sustancia amiloide en las arteriolas corticales y leptomeníngeas29. La angiopatía amiloide cerebral, no relacionada con los síndromes antes citados, es una causa cada vez más reconocida de hemorragia lobar, generalmente esporádica, en las personas mayores (> 65 años), habiéndose encontrado una asociación entre la presencia de la forma alélica ε4

de la apolipoproteina E y la incidencia de hemorragia, semejante a la observada para la forma esporádica de la enfermedad de Alzheimer, desconociéndose si se trata de un factor determinante de riesgo o un marcador de anticipación30. En el 8% de los pacientes con hemorragia intracraneal esporádica, frente al 2% de los controles, ha sido hallada una inserción de 6 bases en el gen de la endoglina, proteína relacionada con el factor de crecimiento transformante -β (TGF-β), que juega papel en el desarrollo y remodelación vascular. La alteración de la endoglina reduce la respuesta del endotelio al TGF-β, originando enfermedad vascular31. El gen de la endoglina está situado en el cromosoma 9 y ha sido implicado también en la Telangiectasia hemorrágica hereditaria, una enfermedad genéticamente determinada que causa estructuras microvasculares anómalas, como malformaciones arteriovenosas y dilataciones vasculares32. Malformaciones vasculares Las malformaciones vasculares cerebrales son una causa común de hemorragia cerebral, epilepsia y focalidad neurológica. Incluyen un grupo heterogéneo de lesiones distinguibles por su cuadro radiológico y neuropatología. Las tres entidades más típicas son las malformaciones ca-

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vernosas cerebrales, las malformaciones arteriovenosas y las malformaciones venosas familiares. Las malformaciones cavernosas cerebrales consisten en espacios alineados de células endoteliales (cavernas) ocupados por sangre o trombos en diversos estados de organización, faltando la arquitectura de la pared vascular madura. Se encuentran rodeadas por componentes gliales reactivos y restos de hemorragias previas. Clínicamente se manifiesta por crisis epilépticas o defectos neurológicos focales, consecuencia de las hemorragias locales recurrentes y de la expansión de la lesión. Angiográficamente las cavernas están excluidas de la circulación, por lo que no son visibles en las arteriografías cerebrales, pero sí son identificables en la TAC y RM cerebrales. En un mismo sujeto pueden existir múltiples cavernomas. Se hereda con carácter autosómico dominante. Pude ser causada por mutaciones en genes situados sobre los cromosomas 7q, 7p15-13 y 3q25.2-27. El producto del gen anormal CCM1, del cromosoma 7q11.2-q21, ha sido recientemente identificado como una proteína «truncada», aparentemente relacionada a las vías de señalización Rev/Ras, que juegan papel en la diferenciación celular33,34. Las malformaciones arteriovenosas se presentan típicamente como lesiones solitarias, excepto con la rara excepción del enfermedad de Rendu-Osler Weber o telangiectasia hemorrágica familiar, relacionada con el gen de la endoglina antes señalado. Se ha descrito otra forma relacionada con el gen activador de receptores semejantes a la kinasa, situado en el cromosoma 12, que también se expresa en el endotelio celular, asociado con el sistema TGF-β. Se piensa que los defectos genéticos en estas enfermedades, originan una anormalidad en los códigos de señalizaciones, afectándose la morfología vascular. Una forma rara de malformación venosa familiar es causada por la mutación de un único nucleótido en el gen Tie-2. Se identifican, tanto en RM como por arteriografía, adoptando, a veces, una morfología peculiar en forma de medusa. Aunque las malformaciones vasculares cerebrales son poco frecuentes e incluso algunas lesiones son adquiridas, su detección precoz puede permitir, en algunos casos, su obliteración dismi-

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nuyendo el riesgo de hemorragia. En los individuos con historia familiar de malformación vascular, su investigación estaría justificada. Hemorragias subaracnoideas La hemorragia subaracnoidea es normalmente debida a la rotura de un aneurisma. Los estudios epidemiológicos han demostrado agrupamientos familiares en alrededor del 15% de los casos. Estudios basados en comunidades han puesto de manifiesto que para familiares en primer grado de los afectados el riesgo para hemorragia subaracnoidea es 5 veces mayor que para la población en general. Esta asociación es independiente de la presencia de otras enfermedades hereditarias, como la enfermedad poliquística renal, que también puede asociarse con hemorragia subaracnoidea. Han sido identificados numerosos genes candidatos para las formas familiares de aneurismas intracraneales/hemorragia subaracnoidea. Uno de ellos es el de la α-1 antitripsina (A1AT), un potente inhibidor de la elastasa. Aunque existen diversos polimorfismos de este gen, se consideran más importantes las variantes alélicas S y Z. La forma alélica S se asocia con una reducción en los niveles de A1AT del 40%, mientras que la del alelo Z se acompaña de una reducción de del 85%. Algunos autores sugieren que los estados de deficiencia para A1AT, tanto para hetero como homocigotos, son factores de riesgo para aneurismas intracraneales. La enfermedad poliquística renal se caracteriza por la presencia de múltiples quistes en ambos riñones. Es una una enfermedad poligénica que se transmite con carácter autosómico dominante. Aproximadamente en el 5% de los pacientes se detecta la presencia de aneurismas intracraneales. Se diferencian dos tipos de enfermedad poliquística renal genéticamente distintos: ARPKD y ADPKD, siendo esta segunda forma la más común. Se han identificado tres mutaciones responsables para la ADPKD, para la variante 1, localizada en el cromosoma 16p13.3 (ADPKD-1) y para la variante 2, en el 4q13-23 (ADPKD-2), no habiéndose identificado todavía el gen de la variante ADPKD-3. El gen que codifica la forma ARPKD ha sido localizado en el cromosoma

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6p21.1-p1235,36. La investigación sistemática, mediante angio-RM, de aneurismas intracraneales en estos pacientes, es una práctica necesaria. DESÓRDENES GENÉTICOS MULTIFACTORIALES DEL ICTUS Muchos casos de ictus representan desórdenes multifactoriales o transmisiones complejas, en los que los patrones clásicos de herencia no pueden ser demostrados y los factores de riesgo más comunes para el ictus, tales como la hipertensión arterial, el tabaquismo o la diabetes mellitus, fracasan al considerar amplios segmentos de población con riesgo de ictus isquémicos. Se estima que en alrededor del 69% de los casos no pueden ser invocado estos factores, mientras que los estudios epidemiológicos prueban la influencia de factores genéticos en el riesgo de ictus. Esta etiología genética refleja la influencia de muchos diferentes loci, que modulan diversos mecanismos fisiopatológicos. El espectro de enfermedades alélicas es probablemente amplio, confiriendo cada gen individual un riesgo relativamente pequeño; sin embargo, la influencia de un gen aislado puede ser todavía considerada importante por varias razones. En primer lugar el ictus isquémico esporádico es un desorden común y la población potencial susceptible del riesgo elevada, incluso para variantes genéticas que solamente confieren un modesto incremento de riesgo. En segundo lugar, a nivel individual la penetrancia de un gen puede depender de cierta permisividad subyacente, incrementándose el riesgo por la presencia de varios genes de forma aditiva o por la interacción del gen modulando otros factores de riesgo ambientales, tales como el tabaco o la dieta. A menudo, tales combinaciones son sinérgicas, multiplicando el incremento de riesgos. El efecto modulador de los genes sobre la lesión orgánica final o su extensión, provocada por los factores de riesgo convencionales, puede ser significativa. Algunos individuos con hipertensión arterial desarrollan enfermedad de las arteriolas sin ninguna evidencia de arterioesclerosis en los grandes vasos; mientras otros, en circunstancias aparentemente similares, pueden presentar ambos patrones, indicando la existen-

cia de factores subyacentes moduladores importantes. Actualmente, la mayoría de las causas que determinan estos diferentes patrones son desconocidas, aunque en algunos casos se ha podido demostrar que los factores genéticos pueden predisponer a que factores de riesgo convencionales, como la hipertensión arterial, determinen patrones lesionales individuales37,38. VALORACIÓN DE LAS CAUSAS HEREDITARIAS DE ICTUS El primer paso en la evaluación de un paciente con ictus, en el que sospechamos una etiología hereditaria, es la elaboración de una historia familiar completa. No es suficiente con preguntar al paciente o probando si existe algún otro miembro de la familia que haya padecido un ictus. Se requiere la construcción de un árbol genealógico familiar en el que se incluyan todos los parientes consanguíneos, cubriendo 2-3 generaciones, obteniéndose posteriormente una detallada historia de cada miembro registrado. Este proceso a menudo revela otros afectados que previamente no habían sido reconocidos como tales. Posteriormente, debemos intentar confirmar esta información a través de registros médicos. Hay otros aspectos del examen físico y pruebas de laboratorio que pueden proporcionar ayuda en la investigación de una posible etiología hereditaria en un ictus. Muchos síndromes vasculares hereditarios producen anormalidades en la piel (Sneddon, neurofibromatosis, Fabry, etc.), en el fondo de ojo, rasgos faciales, etc., que deben ser valorados cuidadosamente. Los análisis específicos de sangre pueden ayudar a identificar procesos hereditarios relacionados con el ictus, mediante la detección de defectos de la coagulación, dislipemias, elevación de los niveles de ácido láctico o alteraciones inmunológicas. La neuroimagen, especialmente la resonancia magnética, es también de gran importancia en estos casos. Puede proporcionarnos información definitiva sobre el tipo de ictus (isquémico o hemorrágico) y sobre su etiología, mediante la detección de aneurismas, hemangiomas cavernosos, malformaciones vasculares, vasculitis u otros procesos estructurales como las lesiones

GENÉTICA DE LOS ACCIDENTES CEREBROVASCULARES

Tabla 17.3. Pruebas prácticas iniciales ante la sospecha de ictus cerebral hereditario. Pruebas de laboratorio Estudios de hemostasia (ver capítulo correspondiente). Homocisteína. Acido láctico. Colágeno vascular. Lipidograma. Electroforesis de la hemoglobina. Investigación de actividad α-galactosidasa en leucocitos. Pruebas de imagen RM cerebral convencional y Angio-RM. Arteriografía en casos selecionados. Otras pruebas Examen de fondo de ojo. EKG y Holter. Tests de DNA. Biopsia de piel.

3.

4.

5.

6.

7. 8.

9.

que acompañan a la neurofibromatosis. En la Tabla 17.3, se ofrece un listado de las pruebas más comúnmente utilizadas.

10.

CONCLUSIONES

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Cada vez hay mayor evidencia sobre la frecuencia e importancia de los factores genéticos en la etiología y patogenia de la enfermedad cerebrovascular a través de diversas vías. Los factores genéticos resultan particularmente importantes en la etiología de varios factores clásicos de riesgo, incluyendo la hipertensión, diabetes o dislipemias. A media que van progresando los conocimientos sobre la acción e interacción de genes específicos y mecanismos de enfermedad, se abren razonables esperanzas de poder detectar la población con riesgo y anticiparse preventivamente al desarrollo de la enfermedad.

11.

13.

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15.

16.

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C APÍTULO

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Trastornos de la coagulación A. Pardo Vigo

La hemostasia es un sistema básico que mantiene la fluidez de la sangre y la integridad de los vasos sanguíneos. Consiste en un entramado altamente coordinado de más de 100 proteínas que incluyen: factores procoagulantes, inhibidores, componentes fibrinolíticos, plaquetas y endotelio vascular. El mecanismo fisiológico del sistema hemostático consiste, por una parte, en prevenir la pérdida de la sangre de los vasos intactos, lo cual se consigue por la existencia de una serie de interacciones reguladas de forma precisa entre: • Componentes de la pared del vaso. • Plaquetas circulantes. • Proteínas del plasma. Además, está encaminado a detener la hemorragia que se produce cuando un vaso es lesionado formando un coágulo en el lugar de la herida. En dicha herida vascular, estos componentes inician una rápida y eficaz coagulación sanguínea, resultando en la inmediata formación de un primer coágulo plaquetario, que es estabilizado por un coágulo secundario de fibrina. El proceso se localiza principalmente sobre la superficie de la membrana de las plaquetas activadas que exponen los fosfolípidos, a los cuales se fijan y for-

man complejos los factores de coagulación, permitiendo que sus centros activos reaccionen unos con otros. De esta manera, durante el proceso de coagulación, por medio del complejo tenasa (factor VIIIa, factor IXa, Ca++ y fosfolípidos) se logra la activación del factor X (factor Xa) para que el complejo protrombinasa (factor Va, Xa, II, Ca++, fosfolípidos) de lugar a la activación del factor II (IIa) para la formación final de Fibrina. Este proceso está regulado por una serie de componentes de la hemostasia y por mecanismos de autocontrol que limitan la formación del coágulo al lugar de la herida y previenen la formación de coágulos sistémicos. La alteración de este proceso, bien por defectos hereditarios o adquiridos o ambos, ocasionan una gran variedad de fenotipos hemorrágicos o trombóticos. La mayoría de los desordenes hemorrágicos son monogénicos, causados por un defecto genético en un único gen correspondiente a los factores de coagulación. Dentro de las alteraciones hemorrágicas, las más significativas son: • Hemofilia A (factor VIII). • Hemofilia B (factor IX). • Enfermedad de von Willebrand (EvW) (factor vW). 237

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Las deficiencias de otros factores de coagulación: I, II, V, VII, X, XI, XII y XIII son muy raras, al menos en la población blanca, en la cual la consanguinidad es menos común. En cambio, en el tromboembolismo hereditario, solamente pocas familias muestran un defecto genético monogénico, como por ejemplo antitombrina (AT), proteína C y proteína S. En la mayoría de las familias se observan polimorfismos comunes en varias proteínas de la coagulación, lo cual predispone a padecer procesos tromboembólicos1. Los dos polimorfismos «protrombóticos» mejor conocidos son: la mutación del factor V 506Q Leiden2 y la mutación de la Protrombina G 202103. Los heterocigotos de estas alteraciones presentan un incremento del riesgo para padecer trombosis de 3 a 7 veces4 y la frecuencia de estos polimorfismos en la raza blanca es aproximadamente del 2-8%. En los últimos 15 años han sido reveladas las secuencias de la mayoría de los genes de las proteínas involucradas en la hemostasia. El conocimiento detallado de la estructura de los genes fue un prerrequisito para el desarrollo de las proteínas recombinantes utilizadas ahora en el tra-

Tabla 18.1. Localización cromosómica de los factores de la coagulación. Fibrinógeno Cadena alfa Cadena beta Cadena gamma

4q 23-32 4q 23-32 4q 23-32

Factor II Factor V Factor VII Factor VIII Factor IX Factor X Factor XI Factor XII

11p 11 1q 21-25 13q 34 Xq 28 Xq 27 13q 32 4q 35 5q 33

Factor XIII Subunidad A Subunidad B

6p 24-25 1q 31-32

Factor von Wilebrand Antitrombina III Proteína C Proteína S

12p 1q 22-25 2q 13-14 3p 11-1

tamiento de las alteraciones hemorrágicas y trombóticas. La determinación de los defectos genéticos subyacentes facilita los estudios sobre la correlación fenotipo-genotipo y la relación entre estructura-función, lo cual conduce a un mejor entendimiento de la patofisiología de los desordenes y de la función de las proteínas de la hemostasia. DESÓRDENES HEMORRÁGICOS Hemofilia A Es el más común de los defectos hemorrágicos severos hereditarios en los humanos, afectando aproximadamente a 1 de cada 5.000 varones nacidos. El fenotipo de un deficiente (o ausente) en factor VIII/COAG es debido a un defecto en el gen del factor VIII. Los individuos afectados presentan hemorragias de grado variable, predominantemente en articulaciones y músculos. La severidad y frecuencia de los síntomas hemorrágicos se correlacionan con la actividad del factor VIII presente en el plasma. El gen del factor VIII se sitúa en el final del brazo largo del cromosoma X en la banda Xq28. Tiene 186 kb y 26 exones, siendo uno de los genes más largos conocido hasta el momento5,6. La inversión en el intrón 22 del gen del factor VIII representa la causa del 40 al 50% de los casos severos de hemofilia A7,8, pero se han detectado otras mutaciones afectando al gen del factor VIII. En general, una mutación puede ser detectada en más del 90% de los casos. En un estudio de 147 pacientes, el 37,4% presentó como anormalidad genética la inversión del intrón 22, el 32% una mutación puntual, el 9,5% una pequeña delección, el 5,4% una gran delección, y el 1,4% una pequeña inserción. En un 11% de pacientes, no pudo identificarse la mutación. En la hemofilia A leve la mayoría de los pacientes presentaron mutaciones missense9.

Correlación fenotipo-genotipo

Está demostrado que el riesgo de formar inhibidor es altamente dependiente del tipo de defec-

TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN

239

Figura 18.1. Reguladores de la hemostasia.

to genético del factor VIII. Así, severos defectos moleculares en los genes, como grandes delecciones, inversión en intrón 22 y mutaciones nonsense, que causan una completa ausencia de la proteína del factor VIII, presentan riesgo de más de 7 a 10 veces para la formación de inhibidor que los defectos genéticos como pequeñas delecciones, mutaciones missense o mutaciones en los lugares de unión que resultan en la pérdida de función pero no en ausencia completa. La presencia de pequeñas cantidades de proteína de factor VIII (menos de 0,01 U/ml) protegen contra el desarrollo de inhibidores y se asocian con fenotipos menos graves que en la hemofilia A severa10. Este fenómeno explica las observaciones de los hematólogos ante diversos pacientes que estando diagnosticados de Hemofilia A severa raramente presentan problemas de sangrado. Actualmente, existen trabajos que sugieren que mutaciones para trombofilia, como el polimorfismo común del factor V Leiden, puede mitigar el fenotipo de la hemofilia11,12. Esto constituye un aspecto muy interesante en cuanto a la realización de análisis sistemáticos sobre las mutaciones en la hemofilia. No todos los fenotipos hemofilia-like son debidos a mutaciones dentro del gen del factor VIII. Dos ejemplos de tales fenotipos hemofilialike causados por mutaciones en otros genes son: EvW 2N y la deficiencia combinada de factor VIII y factor V. En la EvW 2N13,14 está afectado el sitio de unión en la molécula del FvW para el

factor VIII. La falta de esta unión provoca una disminución de la vida media del factor VIII/Coag de 12 horas a 1 hora. La deficiencia combinada de factor VIII y factor V15 está causada por mutaciones en un gen llamado endoplasmatic reticulum-Golgi intermediate compartment protein (ERGIC53; proteína del compartimento intermedio del retículo endoplasmático-Golgi). La proteína codificada por este gen se cree que tiene una función de ayuda involucrada en el proceso de secreción del factor V y factor VIII. Hemofilia B El gen presenta 8 exones, y está localizado en el brazo largo del cromosoma X en la banda Xq2716. Se han detectado mutaciones en todas las partes del gen excepto en el sitio poliA17. En esta enfermedad, la inmensa mayoría de las mutaciones son debidas a variaciones en un único nucleótido, el 68% son mutaciones missense y el 14% son mutaciones nonsense. Solamente el 3% de los defectos genéticos son delecciones o reordenamientos complejos.

Correlación fenotipo-genotipo

De igual manera que en la hemofilia A, la incidencia de la formación de inhibidor depende del tipo de mutación presente. Mutaciones nonsense

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

y especialmente grandes delecciones se asocian con la formación de inhibidor18, mientras que este prácticamente está ausente en pacientes con mutaciones missense. De todas formas la incidencia de inhibidor en la hemofilia B es del 3%19 (mucho más bajo que en la hemofilia A). Las razones para justificar esta diferencia no son fácilmente entendibles, aunque se cree que la diferente proporción de mutaciones null (70% en hemofilia A vs. 20% en hemofilia B) y la homología del factor IX con los otros factores de la coagulación vitamina K-dependientes contribuyen a este fenómeno. El pronóstico y la erradicación de los inhibidores por terapia de tolerancia inmune en estos pacientes es peor 20. El fenotipo factor IX Leiden representa un tipo de pacientes que sufren de severa a moderada hemofilia B hasta la pubertad, después de la cual los niveles de factor IX se incrementan significativamente. Los defectos genéticos de los pacientes con este fenotipo están relacionados con la región del nucleótido 40 de la secuencia promotora.21 Se cree que estas mutaciones afectan a regiones importantes para unirse a hormonas esteroideas, tales como andrógenos que incrementarían la expresión del factor IX22. Recientemente se descubrieron tres variantes de factor IX (Ala10Val, Ala10Thr y Asn9Lys) que revelan una predisposición genética para sangrar durante la TAO (terapia anticoagulante oral), atribuible a una sensibilidad incrementada a la warfarina23-25, debido a que en presencia de estas variantes existe una desproporcionada disminución de la actividad del factor IX próxima a la que se observa en la hemofilia B. Como consecuencia estos pacientes sufren de hemorragias en los inicios de la TAO, algunas veces incluso antes de alcanzarse los rangos terapéuticos correspondientes al INR. Al suspender la TAO los niveles de factor IX retornan a la normalidad.

Enfermedad de Von Willebrand

Es la alteración hemorrágica congénita que ocurre con más frecuencia en los humanos, con una prevalencia estimada de más de 1%26. La clínica es altamente heterogénea. Más del 80% de

los pacientes presentan una deficiencia cuantitativa leve (EvW tipo 1), del 15 al 20% presentan una alteración cualitativa media del factor vW (EvW tipo 2), y solamente una pequeña proporción, el 1% muestran una EvW severa (tipo 3) que se caracteriza por una casi completa deficiencia de factor vW27. Las funciones del FvW implican interacciones plaqueta-pared vascular y portadora de la molécula de factor VIII; por tanto, los fenotipos clínicos de sangrado pueden resultar de una alteración de la hemostasia primaria o secundaria o una combinación de ambas. Los síntomas más comunes incluyen hemorragias mucocutáneas, epístaxis, hemorragia gastrointestinal y menorragias; sin embargo, en la EvW severa tipo 3, pueden observarse hemártrosis similares a las que se ven en la hemofilia A. El FvW está codificado por un gen de 52 exones localizado en el cromosoma 1228. Existe un pseudogen del FvW con un 97% de homología en los exones 23-24, localizado en el cromosoma 22. Actualmente existen técnicas suficientes para el análisis del gen del FvW sin interferencias con este pseudogen29. Se conocen un gran número de mutaciones dentro del gen del FvW afectando a varios dominios, lo cual ha permitido entender mejor la variación de fenotipos de la EvW.

Correlación fenotipo-genotipo

La EvW es altamente heterogénea, tanto a nivel genotipo como fenotipo. Los fenotipos de la EvW hereditaria se clasifican en 3 categorías. El tipo 1 y 3 se refieren a la parcial o virtualmente completa deficiencia del FvW; el tipo 2 se refiere a la anormalidad cualitativa del FvW. El tipo 2 se subdivide, además, de acuerdo a los cambios presentes en los diferentes parámetros del laboratorio, en tipo con disminución de la función dependiente de las plaquetas junto con ausencia de multímeros de alto peso molecular (tipo 2A) o sin ausencia de estos grandes multímeros (tipo 2M), con afinidad incrementada por las GpIb de las plaquetas (tipo2B) y por disminución de la afinidad por el factor VIII (tipo 2N)30. El tipo 2 A presenta una serie de subtipos desde II-A hasta II-H, los cuales están caracteriza-

TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN

dos por el incremento de la proteolisis de los multímeros del FvW en el plasma, así como defectos de dimerización y multimerización. La forma de herencia puede ser autosómica dominante, como en el tipo 1 y muchos del tipo 2 (p. ej., subtipo 2 A-IIA, 2B), o autosómica recesiva, como todos los tipo 3 y algunos pacientes tipo 2 (p. ej., subtipo 2N, 2 A- IIC). La EvW tipo 2 es un perfecto ejemplo de cómo los defectos moleculares que están agrupados en ciertas regiones del gen dañando funciones particulares de la proteína, causan distintos fenotipos correspondientes a la región del defecto molecular31. El subtipo más común de la EvW tipo 2 es el 2A. Todos los fenotipos de esta categoría tienen una deficiencia de los grandes multímeros hemostáticamente efectivos. Esto sugiere que estas mutaciones facilitan la proteolisis y el subsecuente aclaramiento del FvW de la circulación (subtipo IIA). Otras mutaciones causan un defecto de multimerización (defectos de ensamblaje y secreción de grandes multímeros) (subtipo IIC) o defectos de dimerización (subtipo IID). El fenotipo del subtipo 2B se caracteriza por un incremento de la afinidad del FvW por la GpIb de las plaquetas. Las mutaciones que causan este fenotipo están localizadas en el dominio A1 y agrupadas alrededor de los residuos 514542, los cuales se cree que son esenciales para el lugar de unión a la GpIb-alfa32. El fenotipo 2M se refiere a la disminución de la función dependiente de las plaquetas sin alteración del patrón multimérico. Las mutaciones que producen este fenotipo están principalmente localizadas en la región carboxi-terminal del dominio A1. El mecanismo patológico de estas mutaciones es incierto, aunque se especuló que estas mutaciones causan un cambio conformacional que interfiere con el lugar de unión para la GpIb. El fenotipo 2N tiene un interés particular, ya que se caracteriza por un defecto selectivo que afecta a la unión del FvW con el factor VIII, mientras que las otras funciones del FvW de la hemostasia primaria son normales. Consecuentemente, el factor VIII no puede formar complejos con el FvW, lo cual conlleva un aclaramiento rá-

241

pido del factor VIII de la circulación, resultando así en una marcada disminución del nivel del factor VIII. Antes de la descripción de este subtipo (1989)33, la mayor parte de los pacientes eran diagnosticados erróneamente de hemofilia A media. Este fenotipo se hereda como un rasgo autosómico recesivo y es causado por mutaciones en los exones 18 a 20. La EvW tipo 3 es la más severa, ya que estos pacientes tienen en su plasma o plaquetas cantidades indetectables de FvW. Este desorden se hereda como un rasgo autosómico recesivo, y ambos alelos del gen del FvW están normalmente afectados por severos defectos moleculares como grandes delecciones etc. La EvW tipo 1, que muestra una disminución del FvW pero una función normal es el fenotipo menos conocido. Aunque es muy común, solo en muy pocos casos se encontraron defectos genéticos. Este fenotipo tiene una gran asociación con sujetos del grupo O, el cual se conoce que es un determinante genético importante de los niveles de antígeno de FvW en el plasma34. Su herencia es autosómica dominante.

Relación estructura-función

El FvW es sintetizado por las células endoteliales y por los megacariocitos como una gran proteína precursora de 2813 aminoácidos. Consiste en varios dominios homólogos en un orden determinado D1-D2-D’-D3-A1-A3-D4-B1-B2C1-C2, donde el dominio D1-D2 forman un propéptido (Figura 18.2)32. Cada molécula de FvW representa un monómero, dos de los cuales se unen covalentemente por su C terminal en dímeros en el retículo endoplásmico. Estos dímeros son procesados a grandes multímeros en el aparato de Golgi y postGolgi. La multimerización sucede en el segmento amino terminal de la molécula del FvW y requiere al propéptido (dominio D1-D2), el cual es escindido durante el proceso. Parte del FvW es secretado de las células endoteliales al plasma como grandes multímeros de alto y muy alto peso molecular (500 a 20.000 kDa), pero la mayoría de los multímeros del FvW están almacenados en los cuerpos de Weibel-Palade para que su

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Figura 18.2. Estructura del factor von Willebrand.

secreción sea regulada. El patrón multimérico típico que se encuentra en el plasma es el resultado de un proceso de proteolisis por una metaloproteasa específica. La deficiencia constitucional de esta metaloproteasa se ha demostrado recientemente que juega un importante papel en la etiología y patogénesis de la púrpura trombótica trombocitopénica (PTT) familiar35. Varios dominios del FvW contienen sitios involucrados en los procesos de dimerización y multimerización, así como en las interacciones con diferentes proteínas relativas a la función del FvW en la hemostasia. Estas funciones son, principalmente, asegurar la hemostasia primaria promoviendo la adhesión plaqueta-plaqueta y plaqueta-endotelio, así como servir de portador para la molécula del factor VIII. Como ya se mencionó anteriormente, para una normal multimerización se requiere el propéptido del factor vW, así como los dominios D’ y D3 amino terminales de la molécula madura del FvW. En estos mismos dominios se determina la unión con el factor VIII (lo cual parece que viene determinado por presentar una apropiada conformación tridimensional para unirse de esta manera al factor VIII). Los dominios A1 y A3 son los responsables de la interacción con el colágeno.

Deficiencias de otros factores de la coagulación La hemofilia A y B, así como la EvW, representan los desórdenes hemorrágicos clásicos. La herencia de las hemofilias está ligada al cromosoma X, lo cual causa afectación en los varones. La gran heterogeneidad de la EvW en los fenotipos para el tipo 1 y 2 sigue un patrón autosómico dominante. En cambio, la mayoría de las otras alteraciones hemorrágicas son muy raras, principalmente debido a que son autosómicas recesivas y, por tanto, solo producen clínica hemorrágica relevante cuando existe homocigosidad (a menudo asociadas a consanguinidad). El tipo de sangrado varía desde muy grave (riesgo para la vida) hasta sangrado medio.

Afibrinogenemia congénita (deficiencia total de FG) Tiene una incidencia 1 o 2 casos por un millón de individuos. Los síntomas hemorrágicos pueden ser muy severos y generalmente están presentes desde los primeros días de la vida (sangrado por cordón umbilical)36.

TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN

Deficiencia de los factores vitamina K-dependientes II, VII y X Pueden presentarse como una única deficiencia o como una deficiencia combinada de todos los factores vitamina K-dependientes. La incidencia del déficit de factor VII es de 1:500.000. El déficit de factor II y factor X han sido descritas en muy pocas familias. Menos de 20 familias en todo el mundo han sido descritas con una deficiencia combinada hereditaria de todos los factores vitamina K-dependientes. El fenotipo varía considerablemente respecto a la tendencia hemorrágica, respuesta a la sustitución de la vitamina K y presencia de anormalidades esqueléticas, sugiriendo heterogeneidad genética. El defecto genético responsable para esta condición puede ser una mutación en la enzima gamma-carboxilasa o en un complejo de una proteína de la vitamina K 2,3-epoxidoductasa. Esta alteración puede estar asociada con hemorragia severa, a menudo intracraneal, en el período perinatal en el cual ya existe una deficiencia natural de vitamina K37. Como parte del Complejo Protrombinasa, el factor V está integrado en la conversión de la protrombina en trombina por activación del factor X. La deficiencia congénita de factor V es muy rara; presenta una incidencia de aproximadamente 1:1.000.000 de individuos. El fenotipo hemorrágico puede ser muy severo, y se han descrito hemorragias intracraneales38. Llamativamente, pacientes con deficiencia media de factor V pueden presentar mayor riesgo para padecer fenómenos trombóticos debido a un fenotipo pseudohomocigótico para la resistencia a la proteína C, aunque el polimorfismo factor V Leiden solamente esté presente en estado heterocigoto39. Recientemente se descubrieron las bases moleculares de un especial fenotipo de deficiencia combinada de factor V y factor VIII. Deficiencia de factor XI Es una glicoproteína dimérica que participa (factor XIa) en las fases tempranas de la vía intrínseca de la coagulación activando al factor IX. La deficiencia de factor XI produce un fenotipo de sangrado extremadamente variable, que es es-

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pecialmente común en los judíos de ascendencia Ashkenazi, con una frecuencia estimada de 8%40. Han sido descritas numerosas mutaciones en el gen del factor XI (mutaciones nonsense en el exón 5 y una mutación missense en el exón 9). Sorprendentemente, el nivel de factor XI puede no estar directamente relacionado con la tendencia hemorrágica, por esta razón hay que prestar enorme importancia a la historia de hemorragia del propio paciente. Incluso los heterocigotos con un nivel de factor XI de 30-50% de actividad, pueden presentar un sangrado excesivo41. Deficiencia de factor XIII Constituye un componente esencial del paso final de la formación del coágulo. Tiene dos subunidades A y dos subunidades B que forman un tetrámero no covalente. La actividad del factor XIII está mediada por las subunidades A que catalizan la unión cruzada entre las cadenas alfa y beta de la fibrina. La deficiencia de factor XIII presenta una prevalencia de 1:5.000.000 de individuos y puede ser muy severa, con manifestaciones clínicas como hemorragia umbilical, hemorragia intracerebral y hemártrosis en edades más tardías42. DESÓRDENES TROMBÓTICOS La trombofilia se define como la tendencia a desarrollar coágulos en las venas o arterias. La herencia de la trombofilia afecta tanto a los hombres como a las mujeres, y en sucesivas generaciones (incluyendo la transmisión hombre a hombre), sugiriendo, por tanto, una herencia autosómica dominante con penetrancia incompleta. Actualmente se acepta que la trombofilia familiar es una enfermedad oligogenética. En dichas familias los pacientes con dos defectos genéticos tendrán fenómenos trombóticos más frecuentemente y más tempranos en su vida que sus parientes que solo presenten un único defecto. Koeleman et al. informaron que el defecto en dos locus (factor V Leiden y un alelo defectuoso para la proteína C eran los causantes de la trombofilia observada en 6 familias). Estos hallazgos

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Tabla 18.2. Estados trombofílicos hereditarios. Deficiencia de ATIII, Anormalidades en el sistema de la proteína C y S: • Deficiencia proteína C. • Deficiencia proteína S. • Trombomodulina anormal. RPCA: Factor V Leiden. Hiperprotrombinemia: variante protrombina G20210A. Disfibrinogenemia. Anormalidades en el sistema fibrinolítico: • Hipo/displasminogenemia. • Elevación PAI-1. • Deficiencia de t-PA. Hiperhomocisteinemia. Deficiencia cofactor-II de la heparina. Aumento de glicoproteína rica en histidina. Deficiencia factor XII.

explicaban las observaciones previas sobre la frecuencia, mucho más alta del alelo del factor V Leiden entre probandus sintomáticos de las familias deficientes en proteína C, que la esperada sobre las bases de su frecuencia en esta población y de una familia con clínica secundaria a deficiencia en proteína C con individuos portadores obligados asintomáticos (ausencia de otros defectos genéticos). En los países occidentales la trombofilia se ve más frecuentemente en el contexto de trombosis venosa que ocurre en gente joven, con episodios de repetición, historia familiar importante de trombosis y rara presentación en ausencia de factores de riesgo conocidos. Desde hace mucho tiempo se considera que la trombosis venosa es una enfermedad multifactorial. Los tromboembolismos arteriales o venosos son alteraciones frecuentes, con una incidencia de 5 a 10 casos por 1.000 individuos por año43,44, constituyendo una de las causas más comunes de morbimortalidad en el mundo occidental. Ambos procesos trombóticos son ejemplos de una enfermedad compleja, en la cual múltiples vías biológicas contribuyen al riesgo del desarrollo de dicha enfermedad (presión sanguinea, coagulación, inflamación, aterogénesis, flujo sanguíneo). La formación de un trombo oclusivo es el episodio crítico en la fase aguda de ambas enfermedades. La enfermedad trombótica puede ser clasificada, en términos amplios, como aquella

que ocurre en el sistema venoso de baja presión y lenta circulación, o la que sucede en el sistema arterial donde la corriente sanguínea y la presión son altas. No obstante, existen diferencias básicas entre la trombosis arterial y la venosa, tales como la composición del trombo (rico en plaquetas el arterial y en fibrina el trombo venoso) y la presencia en el trombo arterial de daño de la pared vascular (ateroma). Aunque la patogénesis de la trombosis venosa y arterial es suficientemente diferente como para considerarlas por separado, las distinciones no son absolutas, y hay mecanismos subyacentes comunes. Se han descrito muchos factores de riesgo procoagulantes genéticos y adquiridos, y se ha demostrado que el balance entre los complejos procesos coagulante (promueven la formación del coágulo) y anticoagulante (previenen la formación del coágulo) del sistema de la hemostasia juegan un papel clave en la patogénesis de la enfermedad tromboembólica. Este equilibrio sirve para prevenir una generación de trombina excesiva cuando la coagulación ha sido puesta en marcha y está determinado por los niveles (funcionales) de todos los factores de la coagulación y los factores fibrinolíticos, con incremento de los niveles de los factores de coagulación y disminución en los niveles de ambos factores fibrinolíticos e inhibidores naturales, siendo el balance procoagulante. La alteración de la hemostasia es central en la patogénesis de todas las trombosis, aunque difieran en su naturaleza dependiendo de su localización. Los factores de riesgo adquiridos se utilizan en el sentido más amplio e incluyen una serie de cambios tales como: parto, terapia hormonal, cirugía, inmovilización prolongada, dieta y tabaco; y por alteraciones intercurrentes tales como: diabetes mellitus, hipertensión, hiperhomocisteinemia, neoplasias, dislipemia, y por cambios locales en la pared vascular. Uno o más de estos factores de riesgo están presentes en el 33% de los pacientes que presentan una trombosis por primera vez (Grupo Leiden del Estudio de Trombofilia). La trombofilia es una tendencia a formar trombos que está determinada genéticamente. Las alteraciones tromboticas hereditarias pueden ser agrupadas en 4 categorías principales basadas en la etiología de los trastornos: I) deficiencias o

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alteraciones cualitativas de los inhibidores naturales de la coagulación; II) trastornos de la lisis del coágulo; III) defectos metabólicos; y IV) alteraciones de los factores de la coagulación. El papel de los mecanismos inhibidores para prevenir la oclusión venosa se estableció después de la identificación de la relación entre deficiencias hereditarias en Antitrombina, Proteína C y Proteína S y la trombosis venosa durante los años 60 y 70. Hasta 1990, se creyó que los factores de riesgo hereditarios eran derivados fundamentalmente de las mutaciones habidas en genes únicos (AT, proteína C y proteína S), pero el descubrimiento de la asociación de los polimorfismos frecuentes (mutación del factor V Leiden y la mutación de la Protrombina) con una predisposición a la trombosis cambió esta visión. Todavía en el momento actual está poco claro el papel que juega en las anormalidades protrombóticas el efecto procoagulante derivado del incremento de los niveles de los factores de la coagulación (VIII, IX y XI). El estudio genético debe comprender la relación existente entre el genotipo y el fenotipo funcional, y entre el fenotipo funcional y el fenotipo clínico. Actualmente, ya conocemos que mutaciones en genes diferentes (a menudo de las proteínas de la vía de la anticoagulación) pueden producir un mismo fenotipo clínico y que portadores de la misma mutación genética pueden tener diferentes fenotipos clínicos (trombosis venosa profunda, tromboembolismo pulmonar, tromboflebitis superficiales, trombosis venas cerebrales, trombosis mesentérica o trombosis retiniana). De igual forma, sabemos que familias con deficiencias de proteína C, S o AT presentan penetrancia incompleta en los portadores de la mutación y gran dependencia de la presencia de otros factores de riesgo (edad…). Alteraciones trombóticas monogénicas Las tres clásicas alteraciones en un único gen que causan enfermedad tromboembólica hereditaria afectan a los inhibidores de la coagulación AT, proteína C y proteína S, siendo responsable

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cada uno aproximadamente de un 5% de la trombosis familiar45. Generalmente, el fenotipo se hereda como un rasgo autosómico dominante con penetrancia incompleta y gran dependencia de la presencia de otros factores de riesgo, el entorno ambiental o bien otras mutaciones. La mayoría de los pacientes clínicamente afectados son heterocigotos para el defecto genético subyacente; la homocigosidad es muy rara. Se observan portadores de un alelo de la enfermedad que están asintomáticos, mientras que, por otra parte, existen en estas mismas familias individuos que tienen procesos trombóticos y que, en cambio, no son portadores de la mutación familiar46-48. Antitrombina (AT) Es el más importante inhibidor directo de la actividad proteinasa de la coagulación de la sangre. Existen una gran variedad de mutaciones en el gen de la AT encontrados en pacientes con deficiencia de AT y trombosis. Proteína C Es un zimógeno vitamina K-dependiente que en su forma activa inactiva a los factores Va y VIIIa, reduciendo eficazmente la generación de trombina. La prevalencia de la deficiencia de proteína C en la población normal es llamativamente alta, con aproximadamente 1,5 por 1.000 individuos que presentan una mutación en el gen de la proteína C. Proteína S Actúa como un cofactor de la proteína C y aumenta la unión de la proteína C a la superficie de los fosfolípidos cargados negativamente en el proceso de inactivación del factor Va y VIIIa. Las bases moleculares para la deficiencia de proteína S hereditaria son altamente heterogéneas, con un amplio espectro de mutaciones que producen efectos variados sobre la expresión clínica de los fenotipos trombóticos.

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Polimorfismos genéticos y trombosis venosa. Resistencia a la proteína C activada (RPCA). Factor V Leiden Recientemente, un número de polimorfismos en los genes de la hemostasia que representan riesgo para tener enfermedad tromboembólica han sido descubiertos. La era de los polimorfismos comenzó con el descubrimiento por Dahlbäck et al., en 199349, del fenotipo de RPCA/factor V G1691A (sensibilidad reducida a la acción de la proteína Ca), como causa frecuente de trombosis familiar y como factor de riesgo prevalente para padecer trombosis en la población general. Las bases moleculares de RPCA se conocen como factor V Leiden. Específicamente, la mutación existente en este caso es una sustitución de adenina por guanina en el nucleótido en la posición 1691 del exón 10 del gen del factor V, produciendo un cambio en el aminoácido de una arginina por glutamina en el residuo 506 (factor V Leiden). Esta variante de factor V Gln 506 es activado por la trombina, pero es menos rápidamente inactivado por proteína Ca que el factor V Arg 506, y se asocia con un incremento (7 veces) para padecer trombosis en los heterocigotos, y (80 veces) en los homocigotos4. Posteriores análisis del mecanismo patológico de la trombosis revelaron que el factor V no solo tiene actividad procoagulante sino también función anticoagulante, sirviendo como cofactor en la degradación del factor VIIIa por la proteína Ca (y proteína S), y esta función anticoagulante solamente se puede llevar a cabo sobre un factor V intacto y, en cambio, el factor V Gln506 no puede ser activado en esta posición, y por tanto no puede ser cofactor eficaz en la degradación del factor VIIIa (aunque realmente esta función de cofactor anticoagulante del factor V está aún por definir)50. Hay una frecuencia bastante alta del factor V G1691A en la raza blanca (5%). En general, los polimorfismos pueden diferir en su efecto en las diferentes expresiones fenotípicas de la trombosis venosa, por ejemplo, el factor V Leiden es un factor de riesgo para la trombosis venosa profunda, trombosis de los senos venosos cerebrales, trombosis venosa superficial, trombosis vena porta, pero no para el tromboembolismo pulmonar primario. Los facto-

res ambientales sin duda también pueden influir, el uso de contraceptivos orales incrementa el riesgo (30 veces más) en los pacientes portadores del factor V Leiden o de la protrombina G20210 A51. No está claro si el factor V G1691A aumenta el riesgo de recurrencia después de un primer episodio de trombosis. Estudios posteriores indicaron que la sensibilidad del plasma a la proteína Ca está posiblemente influenciada también por otros alelos del factor V (alelo R2, R485K) o por otros alelos de los grupos sanguíneos NO-O (vía sus efectos sobre los niveles del factor VIII), describiéndose RPCA en ausencia de factor V Leiden y con incremento del riesgo para la trombosis venosa. Hay trabajos sobre pacientes con cambios en los nucleótidos, resultando en una substitución alternativa en los aminoácidos en el factor V Arg306 (Thr y Gln)52,53. La inactivación del factor Va por la proteína Ca tiene lugar de forma secuencial en Arg 506, seguida por Arg 306 y Arg 679. La rotura en la Arg 306 resulta en la pérdida de aproximadamente el 70% de la actividad de cofactor, y la rotura en Arg 679 es responsable aproximadamente del 30% de la actividad de cofactor54-57. In vitro, la rotura de Arg506 no tiene un efecto directo como actividad de cofactor, pero su activación en este punto es necesaria para la subsecuente inactivación en los sitios Arg 306 y Arg 679. Un haplotipo llamado HR2 definido por corte para una enzima de restricción en el exón 13 y una única variación de secuencia en el exón 16, está aumentado en pacientes heterocigotos para el factor V Leiden que presentan severa RPCA (al parecer en pacientes con factor V Leiden la presencia del haplotipo HR2 incrementa el riesgo para la trombosis)58 y a su vez, la presencia de HR2 presenta un factor de riesgo medio para la trombosis. La trombosis venosa profunda es el problema clínico más frecuentemente asociado con RPCA congénita59,60. Sin embargo, los pacientes con esta alteración muestran una penetrancia altamente variable para la trombosis, con individuos que nunca tuvieron procesos trombóticos y otros que desarrollaron fenómenos trombóticos recurrentes desde muy jóvenes.

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Protrombina

Factor XIII

La protrombina o factor II, es un zimógeno vitamina K-dependiente que es producido por el hígado y que tiene un papel clave en su forma activada (trombina) en la conversión del fibrinógeno en fibrina. Existe poca literatura relativa a la protrombina y la trombosis venosa antes de 1996, momento en el cual se identificó un polimorfismo común que aumenta el riesgo de trombosis venosa. Consiste en una sustitución en la región 3’ no trasladada de la protrombina en el nucleótido 20210, G por A3, identificada por secuenciación en la región 5’ y 3’UT del gen en 28 pacientes con historia familiar de trombosis, que cursa con niveles elevados en el plasma del factor II (> 115 U/dl) sin que todavía esté clara la causa del incremento de la concentración de dicho factor. El 18% de estos pacientes presentó el alelo 20210 A comparado con el 1% de los controles. El grupo de estudio de trombofilia Leiden confirmó el incremento de riesgo para la trombosis venosa de este polimorfismo. La prevalencia en la población blanca es del 2% (más alta en el sur de Europa que en el norte)3. Los resultados de varios estudios confirman que este alelo A es un factor de riesgo para la trombosis venosa, incluyendo trombosis de venas cerebrales. Todavía existe poca información sobre el riesgo de tromboembolismo recurrente en los portadores del alelo de protrombina 20210 A. En general, se admite que dicho polimorfismo confiere un débil riesgo para la trombosis cuando el defecto es aislado, pero su efecto es mucho más importante cuando está combinado con otros factores de riesgo. Existen estudios claros en los cuales la presencia de factor V Leiden y protrombina G20210 A confieren un riesgo aumentado de recurrencia de trombosis, y en estos pacientes con ambos alelos de riesgo el tratamiento con anticoagulantes orales debe ser mucho más prolongado, después del primer episodio de trombosis. Se ha descrito en varias mujeres la presencia de una mielopatía aguda y trombosis venosa recurrente asociada a estrógenos y el alelo de proteína 20210 A. En este estudio también se detectaron en la misma paciente niveles de factor VIII elevados (280 U/dl)61.

Es una transamidasa compuesta por 4 subunidades 2A (lugar activo) y 2B (portador de la molécula) de estructura tetramérica de 320 kDa. El papel principal del factor XIIIa es estabilizar los polímeros de fibrina incrementando de forma importante las fuerzas físicas y químicas del coágulo; una deficiencia de factor XIII se asocia con hemorragias severas. La trombina activa el aminoácido 37 del péptido de la subunidad A. Más de 20 mutaciones han sido descritas en el gen de la subunidad A, que relaciona la deficiencia de factor XIII por disminución o ausencia de la subunidad A. Además, han sido descritos 4 polimorfismos comunes en Val34Leu, Pro564Leu, Val650Ile, y Glu651Gln. El grupo de Catto fueron los primeros en investigar una mutación puntual G a T (Val34Lue) en el exón 2 de la subunidad-alfa del gen del factor XIII en relación a los desórdenes vasculares, demostrando que la posesión del alelo Leu protege contra la enfermedad aterotrombótica y la trombosis venosa, pero parece que está involucrada en la patogénesis de la hemorragia intracerebral. De hecho, estos autores encontraron en un estudio entre 642 pacientes con enfermedad cerebro vascular, que 62 de estos pacientes con hemorragia intracraneal primaria presentaban una prevalencia más alta del alelo Leu62. Esto apoya la hipótesis de que el factor XIII Val34Leu juega un papel en la estabilidad del coágulo de fibrina, y que la posesión de dicho alelo protege contra la enfermedad trombótica pero incrementa el riesgo de hemorragia.

Gen que codifica el receptor endotelial de la proteína Ca (EPCR)

Es una proteína transmembrana expresada en las células endoteliales de los grandes vasos, que junto con la trombomodulina, está involucrada en la activación de la proteína C, constituyendo este receptor un importante componente de la vía anticoagulante de la proteína C63. El gen del EPCR contiene 4 exones y presenta varios sitios polimórficos. Actualmente se cree que el alelo que codifica esta mutación es poco frecuente, lo cual

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dificulta la investigación de su asociación con el riesgo trombótico. Trombomodulina Se puede esperar que la variación en el gen de la trombomodulina pueda predisponer a la trombosis, dada la enorme importancia que tiene en la vía de anticoagulación dependiente de la proteína C en el mantenimiento de la fluidez de la sangre. La trombomodulina es un proteínglicano de aproximadamente 100 kDa, intercalado en la membrana endotelial. Su función como receptor de trombina transforma la especificidad de la trombina unida y pierde de esta manera su función procoagulante y adquiere una gran capacidad para activar a la proteína C. Se han identificado varios cambios en la codificación de las

Figura 18.3. Metabolismo de la homocisteína.

secuencias en familias estudiadas para la mutación del gen de la trombomodulina64. Sin embargo, hay información limitada de los efectos de estos cambios genéticos sobre la función y, además, las familias estudiadas fueron demasiado pequeñas como para poder deducir información decisiva sobre su relación con la trombosis. El polimorfismo común, C/T codificado para Ala455Val, parece que no está asociado con trombosis. Al parecer, los cambios genéticos que alteran la función o expresión de la trombomodulina son probablemente mutaciones privadas. Factor VIII Los niveles incrementados de factor VIII fueron asociados con trombosis en varios estudios. El Estudio de Trombofilia de Leiden demostró

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que el nivel de factor VIII/COAG por encima de 150 IU/dL se asocia con riesgo aumentado65. Esto fue confirmado en una serie de pacientes con trombosis inexplicables sin marcadores de inflamación. Hay evidencia de que los niveles de factor VIII pueden estar determinados genéticamente. El grupo sanguíneo y el FvW son determinantes bien conocidos del nivel del factor VIII y muestran estrecha relación familiar. OTROS GENES FUERA DE LOS FACTORES DE LA HEMOSTASIA Entre los factores que potencialmente interaccionan con los determinantes genéticos de la hemostasia está el nivel de homocisteína en sangre. Hiperhomocisteinemia Es un aminoácido azufrado no proteinogénico generado dentro del organismo que constituye un intermediario esencial en el metabolismo de la metionina y cisteína. Las interconversiones entre metionina y homocisteína son claves, por una parte para la metilación de proteínas DNA, RNA y neurotransmisores. Por otra, su remetilación a metionina hace posible la síntesis de folato imprescindible para el crecimiento celular. La homocisteína (Hcy) representa el punto de inserción de dos vías metabólicas: la transulfuración a cisteína, que es catalizada por la cistationina beta-sintasa (CBS), que requiere vitamina B6 (conversión de metionina en sulfato) y la remetilación de la homocisteína de nuevo a metionina66. Las reacciones importantes de la vía metabólica del folato implican la conversión de metilentetrahidrofolato a metiltetrahidrofolato por acción de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). El metiltetrahidrofolato producido en esta reacción es uno de los grupos metil utilizados en la conversión de metionina a homocisteína por la enzima metionina sintasa (MS), actuando como cofactor la vitamina B12. Esta enzima es de interés especial, ya que en esta reacción se regenera el tetrahidrofolato, el cual es necesario para la síntesis endógena, tanto de las purinas como de las pirimidinas. La existencia de una deficiencia

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en metionina sintasa debido a una deficiencia de cobalamina, provocará que el tetrahidrofolato no se regenere, por lo cual el metiltetrahidrofolato se acumulará y se producirá anemia megaloblástica. También es importante tener en cuenta que si existe una deficiencia en MTHFR, habrá un aumento de metilentetrahidrofolato y una deficiencia de metiltetrahidrofolato, pero no habrá una de deficiencia de tetrahidrofolato, por lo que los pacientes con deficiencia de MTHFR no tienen anemia megaloblástica. La homocisteína total en plasma se refiere a la homocisteína y al conjunto de derivados disulfuro que se encuentran en el plasma. Aproximadamente, sólo el 1-2% se encuentra en forma de homocisteína, el 75% de la Hcy se encuentra unida a proteínas, principalmente albúmina, a través de enlaces disulfuro, y el resto en forma de homocistina (no unida a proteína). Los principales mecanismos de regulación metabólica de la homocisteína en los diferentes tejidos implican a los dos sistemas enzimáticos señalados anteriormente, junto con la concentración de sustratos (dependiente de dieta, edad, sexo, etc.). La interpretación de las causas de hiperhomocisteinemia son difíciles de determinar porque los niveles de homocisteína en plasma resultan de la interacción de varios factores, tanto genéticos como epigenéticos, incluyendo el sistema de vida67. Existen una serie de causas genéticas que dan lugar a hiperhomocisteinemia. La deficiencia homocigótica de CBS es el origen de la homocisteinemia severa con hipermetioninemia (homocisteinuria congénita), en la cual los pacientes afectados pueden tener niveles de homocisteína plasmática tan altos como 400 mmol/L y sufren retraso mental severo, anormalidades esqueléticas, ectopia lenticular y enfermedad vascular prematura (arterial y venosa). Se han descrito más de 92 mutaciones causantes de esta enfermedad68. Existe una clara asociación entre las mutaciones y el fenotipo presente (la mutación I278T da lugar a una forma leve de enfermedad, mientras que la mutación G307S se asocia a la forma más severa). Se han descrito asimismo mutaciones y polimorfismos en los genes implicados en la vía de remetilación, que también causan hiperhomocisteinemia, en general

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más leve, pero que están asociados con una mayor afectación en los portadores, tanto de defectos del tubo neuronal en su descendencia como de enfermedades cerebrovasculares. La hiperhomocisteinemia puede ser el resultado de alteraciones genéticas y/o adquiridas, dando lugar a una de las anormalidades protrombóticas más comunes en la población general. El gen de la MTHFR contiene un polimorfismo común, C677T, que puede potencialmente interaccionar con los genes de polimorfismos hemostáticos. Hay una gran variabilidad clínica en pacientes con deficiencia grave de MTHFR. Actualmente existen numerosos trabajos sobre la asociación entre la hiperhomocisteinemia y la enfermedad trombótica en los que se demuestra que los pacientes con hiperhomocisteinemia presentan más frecuentemente fenómenos trombóticos que los enfermos sin esta alteración. Los factores nutricionales como la deficiencia en ácido fólico y vitaminas del grupo B, unido a la ligera hiperhomocisteinemia originada por polimorfismos en varios genes implicados en la remetilación, afecta entre un 15-20% de la población general y la predispone a padecer enfermedades cardiovasculares. MANEJO DE PACIENTES CON TROMBOFILIA HEREDITARIA Se debe realizar estudio de evaluación para la trombofilia en: • • • • • •

Trombosis en < 45 años. Trombosis recurrentes. Trombosis en lugares inusuales. Historia familiar de trombosis. Abortos de repetición. Familiares en primer grado de pacientes con anormalidades genéticas documentadas.

La investigación del laboratorio tiene que incluir: • Niveles plasmáticos de AT, proteína C y S. • RPCA (funcional). Una prueba anormal debe confirmarse con examen genético. • Tiempo de trombina (Disfibrinogenemia).

• Niveles de homocisteína. • Hipo/displasminogenemia. Las pruebas de laboratorio se realizarán fuera del episodio trombótico y de tratamiento anticoagulante (heparina disminuye AT, ACO no varían o disminuyen la proteína C y S), ya que los niveles de diferentes proteínas pueden verse afectadas. Durante el embarazo y la inflamación aguda, los niveles de proteína C pueden estar reducidos debido al incremento de los niveles de C4b-unido a proteína. Por otro lado, las condiciones que modifiquen el APTT y tiempo de protrombina afectarán las pruebas de RPCA. En estos casos se realizarán las pruebas basadas en DNA para establecer definitivamente la presencia de factor V Leiden. BIBLIOGRAFÍA 1. Lane DA, Grant PJ. Role of hemostatic gene polymorphisms in venous and arterial thrombotic disease. Blood 2000; 95: 1517-32. 2. Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994; 369: 64-67. 3. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3’-untranslated region of the prothrombin gene is asociated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996; 88: 3698-3703. 4. Rosendaal FR,Koster T, Vandenbroucke JP, Reitsma PH. High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden/activated protein C resistance. Blood 1995; 85: 1504-08. 5. Toole JJ, Knopf JL,Wozney JM, et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophiliac factor. Nature 1984; 312: 342. 6. Vehar GA, Keyt B, Eaton D, et al. Structure of human factor VIII. Nature 1984; 312: 337-342. 7. Naylor JA, Green PM, Pizza CR. Gianelli factor Analysis of factor VIII mRNA reveals defects in everyone of 28 haemophilia A patients. Hum Mol Genet 1993; 2: 11-17. 8. Lakich D, Kazazian HH Jr, Antonarakis SE, Gitschier J. Inversions disrupting the factor VIII gene as a common cause of severe hemophilia A. Nat Genet 1993; 5: 236-241. 9. Schwaab R, Oldenburg J, Schwaab U, et al. Characterization of mutations within factor VIII gene of 73 unrelated mild and moderate haemophiliacs. Br J Haematol 1995; 91: 458-464.

TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN

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C APÍTULO

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Enfermedades mitocondriales F. J. Carod Artal

FISIOLOGÍA MITOCONDRIAL Las mitocondrias son organelas presentes en el citoplasma de las células cuya función es la síntesis de energía en forma de ATP. Los ácidos grasos libres y los carbohidratos son los principales substratos energéticos de la mitocondria. Los primeros son transportados a la mitocondria y degradados a acetil-CoA mediante un proceso llamado beta-oxidación. El piruvato procedente de la glucolisis atraviesa la membrana mitocondrial desde el citoplasma y es descarboxilado a acetil-CoA. La acetil-CoA es oxidada a agua y CO2 en el ciclo de Krebs, liberándose hidrogeniones que reducen el NAD y FAD a NADH y FADH2. La cadena respiratoria mitocondrial se localiza en la membrana interna mitocondrial y consta de cinco complejos unidos por transportadores de electrones como la ubiquinona y el citocromo c. La cadena respiratoria transfiere electrones en la forma de iones hidrógeno del NADH y FADH2. Este flujo de electrones se canaliza en reacciones redox, siendo el oxígeno el aceptor final del hidrógeno liberado. La energía obtenida en estas reacciones genera un potencial eléctrico y un gradiente de pH a través de la membrana interna mitocondrial. La energía libre se utiliza para

bombear protones a través de la membrana en tres lugares específicos de la cadena. El gradiente electroquímico resultante conduce a la síntesis de ATP mediante el complejo V de la cadena respiratoria. Esta producción de ATP desde la reducción de oxígeno, conocida como fosforilación oxidativa (OXPHOS), es lo que genera la energía necesaria para la función de la célula1. Desde un punto de vista bioquímico, las enfermedades mitocondriales se pueden clasificar en cinco tipos: defectos de transporte de substrato, defectos de la utilización del substrato, defectos del ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs), defectos de la cadena respiratoria y defectos del acoplamiento fosforilación-oxidación (Tabla 19.1).

INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA MITOCONDRIAL Existen dos sistemas genéticos en las células del ser humano: el genoma nuclear y el mitocondrial; ambos determinan genéticamente las enzimas y proteínas necesarias para la producción de energía en las mitocondrias. La mayor parte de las proteínas mitocondriales (casi un 90%), incluyendo muchas subunidades de los complejos de la cadena respiratoria, son codificadas por el 255

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Tabla 19.1. Clasificación bioquímica de las enfermedades mitocondriales. Defectos en el transporte mitocondrial del substrato: • Deficiencia de carnitina. • Deficiencia de carnitin-palmitoil transferasa. Defectos en la utilización del substrato: • Defectos en la oxidación de los ácidos grasos. • Defectos en la oxidación del piruvato. • Síntesis de cetonas. Defectos en el ciclo del ácido cítrico. Defectos en la cadena respiratoria: • Deficiencias aisladas de los complejos I a IV. • Deficiencias múltiples de complejos. Defectos del acoplamiento fosforilación-oxidación: • Deficiencia del complejo V (ATP sintetasa). • Enfermedad de Luft.

DNA nuclear (DNAn), se traducen en el citoplasma y posteriormente se transportan a las mitocondrias. La transcripción y la traducción del DNA mitocondrial (DNAmt) está regulada por factores codificados por el DNAn, en un proceso conocido como comunicación intergenómica. Los defectos del DNAn que afecten a la síntesis de las proteínas mitocondriales (enzimas, traslocasas y proteínas estructurales), a su importación desde el citosol o a la comunicación intergenómica, tendrán un patrón de herencia mendeliana. El primer DNA mitocondrial humano fue secuenciado en 19812; desde entonces, más de 100 reordenamientos de DNAmt y unas 50 mutaciones han sido descritas. El DNAmt es una molécula circular de doble cadena que contiene 16.569 pares de bases y 37 genes. Los genes mitocondriales codifican 13 subunidades proteicas esenciales para los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, 2 RNAs ribosomales (RNAr) y 22 RNAs de transferencia (RNAt). El resto de las subunidades del sistema de fosforilación oxidativa (unas 67) son codificadas por genes nucleares. Existen varias diferencias con respecto al DNA nuclear. Casi todo el DNAmt es codificante, ya que carece de intrones entre los genes, por lo que una mutación al azar es muy probable que

afecte a una secuencia con significado funcional. La única región no codificante del DNAmt es la del bucle D (D-loop) donde se sitúan los promotores; su longitud es un 7% del DNAmt. El espacio entre un gen y otro es muy pequeño en el DNAmt, ya que las secuencias codificantes están contiguas o bien separadas por una o dos bases3. El DNAmt se hereda exclusivamente por vía materna, ya que el escaso DNAmt del esperma es degradado activamente tras la fertilización del oocito. Cada célula contiene cientos de mitocondrias en cuyo interior existen entre 2 y 10 copias de DNAmt. En una célula existen varios cientos o miles de copias de DNAmt (poliplasmia). En un órgano o tejido normales todas las copias de DNAmt son idénticas (homoplasmia). Una vez que se produce una mutación en el DNAmt del oocito, esta se va a transmitir al azar a las generaciones sucesivas. Los individuos afectos de una enfermedad mitocondrial a menudo son portadores de una mezcla de DNAmt original con una cierta proporción de DNAmt mutado, situación llamada heteroplasmia. La heteroplasmia parece guardar relación con la naturaleza no aleatoria de la replicación del DNAmt, que se debe a dos factores: el secuestro del DNAmt en agregados llamados nucleoides y la segregación no al azar de las mitocondrias durante la citocinesis. La heteroplasmia determina el efecto de una mutación en una determinada célula o tejido, ya que las células con mayor proporción de DNAmt mutante van a mostrar mayor disfunción. Un ejemplo de heteroplasmia es el efecto diferencial sobre las células del músculo liso, que explicaría los episodios semejantes a ictus que suceden en un grupo de individuos con MELAS y no en todos ellos. Cada tejido tiene una sensibilidad diferente ante una mutación del DNAmt, en dependencia de las necesidades energéticas. En una única célula, la proporción de DNAmt mutado debe exceder un valor crítico antes de que exprese un defecto de la cadena respiratoria mitocondrial. En el individuo afecto, la cantidad de DNAmt mutado debe superar un valor mínimo para que produzca manifestaciones clínicas. Estos dos hechos constituyen el llamado efecto umbral. Esta proporción crítica entre el DNAmt mutado y nativo puede variar en diferentes fenotipos y explicaría

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

por qué una única mutación (por ejemplo, la T8993G) puede dar lugar a un síndrome de Leigh de herencia materna (MILS) o a una neuropatía con ataxia y retinitis pigmentaria (NARP) según se supere o no una cifra crítica de mutación del 90%3. Durante el proceso de división celular la proporción de DNAmt mutado puede ir cambiando en las células hijas, situación conocida como segregación mitótica, pudiendo modificarse también su expresión fenotípica. Los tejidos postmitóticos como las neuronas, las células músculoesqueléticas y cardíacas y los órganos endocrinos, se afectan clínicamente con frecuencia, ya que pueden portar grandes cantidades de DNAmt mutado. Dentro de un mismo individuo, la cantidad de DNAmt mutado puede variar enormemente de un tejido u órgano a otro. Estas peculiaridades de la genética mitocondrial explican que individuos portadores de la misma mutación (por ejemplo, la mutación A3243G), expresen diferentes fenotipos como MELAS, síndromes de diabetes y sordera aislados, cardiomiopatía aislada o miopatía ocular, cuando la cantidad de DNAmt mutado sobrepase el umbral patogénico en un único tejido4. La proporción de mitocondrias mutantes puede cambiar con la edad; así, por ejemplo, el DNAmt con delecciones se incrementa con la edad en los tejidos en el síndrome de KearnsSayre. El DNAmt acumula mutaciones con el tiempo a una velocidad mucho mayor que el DNA nuclear, y presenta una tasa de mutaciones entre 10 y 100 veces mayor que este. Estas mutaciones pueden producir polimorfismos asintomáticos, ya que se sabe que el DNAmt es altamente polimórfico y dos individuos normales pueden diferir hasta en 60 pares de bases. Sin embargo, cuando las mutaciones afectan a áreas funcionalmente importantes pueden dar lugar a síndromes clínicos floridos. La alta tasa de mutaciones del DNAmt puede ser potenciado por la exposición del DNAmt a los radicales libres que se generan en la membrana interna mitocondrial durante el proceso de fosforilación oxidativa. El DNAmt tiene un sistema de reparación menos eficiente que el DNA nuclear y carece de histonas, por lo que está sin protección, lo que también contribuye al acúmulo de mutaciones por vía materna.3

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EPIDEMIOLOGÍA Chinnery et al.5 identificaron una prevalencia mínima de enfermedades mitocondriales de 6,57 por cada 100.000 adultos en el noreste de Inglaterra. Esta cifra puede ser comparable a la prevalencia de la enfermedad de Huntington (6,4/100.000) siendo mayor que la distrofia de Duchenne (3,2/100.000) o la distrofia miotónica (5/100.000). La prevalencia de adultos asintomáticos se ha estimado en 7,59/100.000, por lo que la prevalencia mínima de individuos (con y sin síntomas) portadores de mutaciones de DNAmt sería de 12,48/100.000. La mutación A3243G en el gen del RNAtLeu es la mutación puntual más común en Finlandia, habiéndose observado en 1/7.000 habitantes6. Esta mutación se ha encontrado en un 14% de los casos de miocardiopatía hipertrófica aislada, en un 6,9% de los individuos con infartos occipitales aislados, y en un 7% de los pacientes sordos con historia familiar de hipoacusia6. Las mutaciones más frecuentemente descritas en Inglaterra5 han sido la G11778A (45%) y la G3460A (26%) correspondientes a la neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL), seguidas de la mutación A3243G (11%) y de las delecciones (8%). Existen diferencias étnicas que pueden contribuir a las variaciones en la prevalencia de las mutaciones del DNAmt. Así, la mutación T14484C es la causa más común de enfermedad de Leber en familias francocanadienses y, en cambio, es muy rara en Finlandia7. Desde un punto de vista epidemiológico, se estima que un 0,5-1,5% de los casos de diabetes en la población general puedan ser debidos a la mutación A3243G8. Más de 50 mutaciones puntuales patogénicas y unos 100 tipos de reordenamientos (delecciones, duplicaciones) se han descrito en el DNAmt (Tabla 19.2). Las mutaciones conocidas del DNAmt suponen un 40% de los casos de enfermedades mitocondriales del adulto, y tan solo un 10% de la infancia; el resto se desconocen. Las más frecuentes son la A3243G (MELAS), G8344A (MERRF), A11778G (NOHL) y T8993G (NARP). Las dos primeras corresponden a mutaciones puntuales en los genes de RNAt, y las dos últimas son mutaciones puntua-

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Tabla 19.2. Manifestaciones clínicas de las enfermedades mitocondriales. A. Defectos en el DNA nuclear • Defectos en genes codificantes de proteínas mitocondriales. • Defectos en la comunicación intergenómica: – Múltiples deleciones del DNAmt. – Depleciones de DNAmt. • Defectos en la importación de proteínas mitocondriales B. Defectos en el DNA mitocondrial • Mutaciones puntuales en genes codificantes de proteínas: – Neuropatía óptica hereditaria de Leber. – NARP/MILS. – Intolerancia al ejercicio. – Necrosis estriatal bilateral. • Mutaciones puntuales en genes de RNA-t: – MELAS. – MERRF. – Síndromes de overlap MELAS/MERRF. – Miopatía. – Combinaciones variables multisistémicas de cardiomiopatía, miopatía, OEP, disfunción endocrina, encefalopatía y sordera neurosensorial. • Mutaciones puntuales en el gen para el RNA-r de 12 s: – Sordera inducida por aminoglucósidos • Reorganizaciones del DNA mitocondrial (duplicaciones/deleciones únicas): – Síndrome de Kearns-Sayre. – Oftalmoplejía externa progresiva. – Síndrome de Pearson.

les de genes estructurales. Por ello, se piensa que muchos síndromes neurológicos, en la infancia, sean causados por anomalías en los genes nucleares relacionados con el sistema de fosforilación oxidativa, y serán comentados en el apartado correspondiente4. ABORDAJE DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES MITOCONDRIALES Las mutaciones patogénicas del DNAmt se asocian con una gran variedad de manifestaciones clínicas, tanto multisistémicas como sindrómicas (Tabla 19.3). Ante el diagnóstico de sospecha de una enfermedad mitocondrial, las pruebas complementarias a ser valoradas son las siguientes:

Determinación de ácido láctico Suele estar elevado en los pacientes con miopatía mitocondrial y diversas encefalomiopatías. En los pacientes con NARP, los niveles de lactato suelen ser normales. Se recomienda medir el lactato en sangre arterial mejor que en sangre venosa. A veces, los niveles de lactato pueden estar

Tabla 19.3. Manifestaciones clínicas de las enfermedades mitocondriales. Sistema nervioso: Neuropatía óptica. Sordera neurosensorial bilateral. Ataxia. Episodios vasculares cerebrales. Cefalea vascular. Demencia/retraso psicomotor. Psicosis/depresión. Crisis convulsivas/mioclonías. Neuropatía periférica. Miopatía proximal/OEP. Ocular: Retinitis pigmentaria. Cataratas. Atrofia óptica. Oftalmoplejía externa, ptosis palpebral. Cardiovascular: Defectos de la conducción cardíaca, Bloqueo cardíaco, Síndromes de pre-excitación, Cardiomiopatía (hipertrófica, dilatada), Endocrino-metabólico: Acidosis metabólica. Diabetes mellitus. Hipotiroidismo. Hipoparatiroidismo. Hipogonadismo. Deficiencia aislada de GH. Disfunción pancreática exocrina. Pérdida pondoestatural y talla baja. Gastrointestinal: Hepatopatía. Pseudo-obstrucción de colon. Renal: Defectos tubulares renales. Síndrome de Toni-Debré-Fanconi. Hematológico: Anemia sideroblástica. Pancitopenia. Piel: Lipomas múltiples.

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

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aumentados en LCR y ser normales en sangre; en cambio, en un sujeto normal el lactato en LCR es menor que en sangre. Un valor normal en sangre no excluye el diagnóstico de enfermedad mitocondrial. La relación lactato/piruvato puede ser también útil (valor normal < 20); un cociente lactato/piruvato mayor de 25 se considera patológico y un valor mayor de 50 sugiere un bloqueo de la cadena respiratoria1. Enzimas musculares Suelen ser normales o discretamente elevadas en la mayoría de las miopatías. Normalmente se encuentran valores altos de CK de las depleciones de DNAmt. Biopsia muscular Las fibras rojo rasgadas (ragged-red) (FRRs) son un hallazgo característico en la biopsia muscular cuando se usa el tricrómico de Gomori modificado por Engel y Cunningham, y expresan un cambio morfológico secundario a una fosforilación oxidativa defectuosa. Las FRRs son fibras que forman hendiduras artefactuales cuando se corta el músculo congelado, tiñéndose de color rojo intenso en su periferia, como expresión del acúmulo de mitocondrias a nivel subsarcolemal (Figura 19.1). Las mitocondrias teñidas en las FRRs son generalmente citocromo c oxidasa (COX) negativas, y en algunos síndromes como la oftalmoplejía externa progresiva (OEP), las fibras COX negativas pueden observarse en mayor frecuencia que las FRRs9. Las FRRs aparecen en las delecciones y en las mutaciones puntuales del DNAmt que codifica los RNAt. En cambio, no se observan en las mutaciones puntuales de los genes del DNAmt que codifican proteínas estructurales, como es el caso de los síndromes NARP y MILS. Las FRRs no son específicas de las enfermedades mitocondriales, ya que pueden aparecer en una proporción de un 1% en las biopsias musculares de sujetos ancianos, y en proporciones mayores en algunas miopatías como la miopatía por cuerpos de inclusión.

Figura 19.1. Biopsia muscular evidenciando fibras rojo-rasgadas con la tinción tricrómico de Gomori.

La succínico deshidrogenasa (SDH) es la tinción oxidativa más sensible y específica en patología mitocondrial, pues tiñe intensamente el acúmulo subsarcolemal de mitocondrias (Figura 19.2).

Figura 19.2. Biopsia muscular. Tinción SDH mostrando proliferación de mitocondrias a nivel subsarcolemal.

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

La SDH es muy útil para visualizar la proliferación endotelial en las células endoteliales de los vasos en los individuos con MELAS. La tinción COX identifica el complejo IV de la cadena respiratoria, por lo que una tinción normal COX puede observarse en deficiencias aisladas de otros complejos. Los sujetos con MELAS expresan FRRs en la biopsia muscular donde la actividad COX es positiva, a diferencia de los sujetos con OEP o síndrome de Kearns-Sayre, que muestran una actividad COX negativa. En los casos de miopatía infantil fatal por déficit de citocromo c oxidasa, todas las fibras musculares son citocromo c oxidasa negativas1.

Hallazgos de neuroimagen La tomografía cerebral puede mostrar calcificaciones de los ganglios basales en los síndromes MELAS y Kearns-Sayre. La alteración difusa y central de la substancia blanca se ha descrito en algunos pacientes con Kearns-Sayre10. La resonancia magnética de encéfalo puede evidenciar áreas de hiperintensidad en secuencias T2 en putamen, globo pálido y caudado en el síndrome de Leigh. En otros síndromes se ha descrito leucoencefalopatía (MNGIE), atrofia cortical y cerebelar (MERRF) y áreas de isquemia en las regiones posteriores de los hemisferios cerebrales (MELAS).

Microscopía electrónica Estudio bioquímico La microscopía electrónica evidencia alteraciones ultraestructurales en la morfología de las mitocondrias con pérdida de crestas, formaciones de crestas circulares o en espiral y presencia de inclusiones paracristalinas de naturaleza proteica situadas en el interior de las crestas mitocondriales o en el espacio intermembrana, y glóbulos osmiofílicos hiperdensos de naturaleza lipídica (Figura 19.3). Estos hallazgos no son específicos pues también pueden observarse en algunas otras miopatías, como la distrofia miotónica y la distrofia de Duchenne.

Es útil para caracterizar los defectos de la cadena respiratoria mitocondrial. Defectos parciales combinados de la cadena respiratoria conteniendo subunidades codificadas por el DNAmt sugieren mutaciones en el DNAmt. Sin embargo, algunos defectos del DNAmt pueden cursar con un estudio bioquímico normal. La técnica ideal requiere músculo fresco, siendo preferible al cultivo de fibroblastos, o al estudio de músculo congelado. Estudio molecular

Figura 19.3. Microscopía electrónica mostrando inclusiones paracristalinas.

Las técnicas más empleadas son el Southern blot y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el estudio de delecciones y mutaciones puntuales. Las pruebas de screening en sangre periférica son adecuadas para detectar las mutaciones más comunes de los RNAt (MELAS y MERRF) y para algunas mutaciones puntuales en genes estructurales (NARP y Leber). Sin embargo, el estudio molecular de DNA muscular puede ser necesario para estudiar múltiples delecciones, grandes delecciones como el síndrome de Kearns-Sayre y las OEPs (cuyo estudio a veces puede ser negativo en sangre por la segregación mitótica), y para estudiar la mutación puntual MELAS en sujetos oligosintomáticos y en sus familiares.

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

SÍNDROMES CLÍNICOS POR MUTACIONES EN EL DNAmt Miopatías mitocondriales La miopatía infantil fatal es una forma congénita grave que se manifiesta ya desde el nacimiento y se caracteriza por hipotonía y debilidad generalizada, dificultad para la succión, insuficiencia respiratoria, retraso psicomotor, acidemia láctica grave y fibras rojo rasgadas. Ocasionalmente se asocia a una cardiomiopatía o a un trastorno renal conocido como síndrome de Fanconi. Las formas más graves suelen ser fatales y producen la muerte por parada cardiorespiratoria en el primer año de vida. La miopatía infantil fatal se ha asociado con defectos de los complejos I, II, III y IV de la cadena respiratoria, con deficiencias de la piruvato decarboxilasa (PDC), con mutaciones ligadas al cromosoma X en el gen de la subunidad E1α de la PDC, con mutaciones en el gen nuclear SCO2 necesario para ensamblar el complejo IV, y con depleciones graves de DNAmt por defecto de la comunicación intergenómica que producen un descenso en la actividad de todos los complejos de la cadena respiratoria11. Cuando la depleción no es tan grave, el desarrollo puede ser normal en los primeros doce meses de vida, apareciendo en ese momento una debilidad muscular progresiva y un aumento de enzimas musculares; la supervivencia puede alcanzar hasta el tercer año de vida. Existen otras miopatías mitocondriales benignas de la infancia por déficit de citocromo c oxidasa con mejoría espontánea conforme avanza la edad, con desaparición de las FRRs y recuperación de la actividad COX. La intolerancia al ejercicio y la debilidad muscular proximal de los miembros son las quejas de inicio en un 25% de los pacientes con miopatía mitocondrial. El inicio de los síntomas sucede generalmente antes de los 20 años de edad, y son inespecíficos como debilidad de predominio proximal e intolerancia al ejercicio. Durante la actividad física puede aparecer cefalea y naúseas, debilidad muscular y mialgias. En ocasiones se detecta acidosis metabólica en sangre. Las enzimas musculares (CK) suelen ser normales o

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discretamente elevadas. El EMG muestra un patrón miopático, de predominio proximal, aunque a veces los cambios observados pueden ser mínimos12. La intolerancia al ejercicio asociada a mioglobinuria recurrente, mialgias y calambres, precipitada por diversos factores como el stress metabólico, la fatiga, fiebre o la ingesta de alcohol o grasas es otra forma de manifestación de las miopatías mitocondriales. Se manifiesta en forma de brotes, de inicio generalmente en la adolescencia. Este fenotipo es la forma de presentación de la deficiencia de carnitin-palmitoil transferasa II (CPT II). La mioglobinuria recurrente asociada con intolerancia al ejercicio y debilidad muscular se ha asociado también con una serie de defectos génicos como delecciones múltiples en el DNAmt13 y microdeleciones en el gen de la COX III14. Algunas miopatías mitocondriales son debidas a defectos definidos en el transporte del substrato, como la deficiencia de CPT II, el déficit de carnitina muscular, y ocasionalmente por deficiencia de PDC. También se han descrito miopatías con deficiencias aisladas de cada una de las enzimas de la cadena respiratoria mitocondrial y con defectos múltiples de los complejos. Las miopatías mitocondriales suelen ser esporádicas, pero en ocasiones se asocian con talla baja, cardiomiopatía o diabetes1. La asociación de cardiomiopatía y miopatía mitocondrial se ha descrito con mutaciones puntuales del tipo C3254G, A3260G, C3303T que afectan al gen del RNAtLeu(UUR) (herencia materna) y con mutaciones en los nucleótidos A8344G del gen del RNAtLys y en el nucleótido A4317G (correspondiente al RNAtIle)15. En otros casos puede aparecer un síndrome de OEP o bien síntomas de encefalomiopatía como crisis, ataxia o sordera neurosensorial. Con menor frecuencia se han descrito mutaciones puntuales esporádicas, delecciones únicas y duplicaciones del DNAmt, como sucede en las formas asociadas a la OEP1. Recientemente, se ha descrito una miopatía mitocondrial de inicio tardío en la vida en sujetos mayores de 65 años, debido a delecciones múltiples del DNAmt, que cursa con debilidad proximal moderada, fatigabilidad y FRRs en la biopsia muscular16.

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Oftalmoplejía crónica externa progresiva La oftalmoplejía crónica externa progresiva es la forma más común de presentación de las miopatías mitocondriales, pudiendo suceder en más de un 50% de los casos. Se caracteriza por ptosis palpebral, a veces de inicio unilateral o asimétrica, y una restricción progresiva de la mirada en todas las direcciones, que se hace más evidente con la evolución de la enfermedad. La ptosis puede ser el primer síntoma; la oftalmoplejía puede cursar con diplopia, debilidad miopática proximal e intolerancia al ejercicio. La OEP puede permanecer como un síndrome aislado de curso lento y relativamente benigno. En algunos pacientes la progresiva aparición de síntomas no musculares pueden empeorar el pronóstico, como es el caso de la miocardiopatía o la ataxia. Las enzimas musculares pueden ser normales o estar discretamente elevadas. El EMG evidencia un patrón miopático y la biopsia muscular objetiva FRRs citocromo C oxidasa negativas17,18. Generalmente, la OEP se debe a grandes delecciones de varios miles de pares de bases que aparecen de forma esporádica y no se transmiten a la descendencia, pues se piensa que estas mutaciones se generan en las células somáticas o durante el proceso de replicación del DNAmt en los oocitos18. Existen también casos debidos a duplicaciones parciales, mutaciones puntuales de herencia materna (las descritas en MELAS y MERRF y en los síndromes de overlap) y delecciones múltiples de origen nuclear con un patrón de herencia mendeliana dominante o recesiva. Un 15% de los pacientes con OEP pueden expresar una mutación puntual A3243G para el gen RNAtLeu(UUR)19. Se han descrito varias familias portadoras de OEP autosómica dominante20,21 con varios loci identificados en los cromosomas 10q 23.3-24.3, en familias finlandesas, y 3p14.1-21.2 en familias italianas. Otros síntomas descritos en estas familias han sido: trastornos psiquiátricos, ataxia, hipogonadismo, hipoacusia, cataratas y neuropatía periférica20,21. Existe otra forma de OEP autosómica recesiva asociada a una cardiomiopatía hipertrófica grave que provoca el fallecimiento en la adolescencia22.

Síndrome de Kearns-Sayre El síndrome de Kearns-Sayre (SKS) se define clínicamente como un trastorno mitocondrial caracterizado por oftalmoplejía externa progresiva (Figura 19.4) y retinopatía pigmentaria de inicio antes de los 20 años de edad, asociado al menos a uno de los siguientes criterios clínicos menores: ataxia, bloqueo de conducción cardiaca y aumento en la concentración de proteínas en el LCR23. El 50% de los adultos presentan disfagia. Se han descrito otras anormalidades como debilidad muscular proximal (90% de los casos), sordera neurosensorial (95%), anomalías endocrinas (intolerancia a la glucosa, hipotiroidismo, hipoparatiroidismo, deficiencia aislada de hormona de crecimiento), talla baja y retraso mental. Un 80% de los pacientes presentan una única gran delección en el DNAmt entre 2.000 y 9.000 pares de bases24; con menor frecuencia duplicaciones, y en casos aislados, se ha descrito una mutación puntual G3249A en el gen que codifica el RNAtLeu25. Las delecciones suelen ser casos esporádicos que se generan por una mutación en el cigoto que afecta a las células somáticas, pero no a las germinales23,24. Existe acidosis láctica en sangre en un 80% de los casos. La biopsia muscular muestra FRRs, fibras COX negativas y variación en el tamaño de las fibras musculares. A veces, el estudio de Southern blot en DNAmt de sangre periférica puede ser negativo, siendo necesario el estudio de músculo para el diagnóstico molecular. Los exámenes de neuroimagen, tomografía o resonancia, pueden mostrar atrofia cortical cerebral y cerebelar. En ocasiones se han descrito lesiones hipe-

Figura 19.4. Síndrome de Kearns-Sayre. Oftalmoparesia y ptosis palpebral.

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

rintensas en secuencias T2 bilateralmente en tálamo, tronco y substancia blanca subcortical9. La muerte puede suceder en la tercera o cuarta década de la vida. El síndrome de Pearson es otro ejemplo de enfermedad mitocondrial por delecciones a gran escala en el DNAmt en múltiples tejidos, de inicio en el primer año de vida. Clínicamente cursa con anemia sideroblástica refractaria al tratamiento, vacuolización de las células precursoras de la médula ósea, crisis pancitopénicas y disfunción pancreática exocrina con diabetes insulinodependiente y síndrome de mala absorción. La muerte se produce en la infancia en la mayor parte de los niños afectos, pero aquellos con fenotipo leve y los que sobreviven al fallo de la médula ósea, a menudo desarrollan un fenotipo de SKS en la adolescencia1. Tanto el SKS como muchos casos de OEP con FRRs suelen ser esporádicos, debido a delecciones en el DNAmt. En ambos síndromes se han descrito deficiencias de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial I, II, III, IV y I+IV23,24. Encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios stroke-like: MELAS El acrónimo MELAS hace referencia a un síndrome de encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios semejantes a ictus (stroke-like)26. Los síntomas clínicos pueden aparecer en la infancia o adolescencia, y se caracterizan por la presencia de accidentes cerebrovasculares en adultos jóvenes, antes de los 40 años de edad, episodios recurrentes de acidosis láctica y presencia de fibras rojo rasgadas en la biopsia muscular. Se consideran criterios diagnósticos menores la presencia de cefalea de características vasculares, vómitos, crisis epilépticas y demencia27. El síndrome MELAS puede tener una expresión fenotípica variable y presentar talla baja, sordera, diabetes, cardiomiopatía hipertrófica o dilatada, OEP, y retinopatía pigmentaria. También se han descrito infartos corticales occipitales aislados, con episodios de ceguera cortical,

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hemianopsia o hemiparesia, siendo a veces la primera manifestación clínica. La evolución es la mejora espontánea, persistiendo un déficit secuelar28. Con frecuencia pueden detectarse niveles de lactato elevados en sangre y en LCR. En algunos casos puede aparecer una polineuropatía periférica sensitivomotora. El EMG puede ser normal o miopático. La biopsia de músculo evidencia FRRs. La tinción con SDH muestra proliferación mitocondrial en los vasos sanguíneos. Los exámenes de neuroimagen muestran calcificación de los ganglios basales, atrofia cortical en cerebro y cerebelo, gliosis de substancia blanca y áreas de isquemia focal que no siguen un territorio vascular definido, afectando más a la corteza que a la substancia blanca y de predominio en la región parietooccipital posterior. Los estudios bioquímicos de la cadena respiratoria suelen mostrar deficiencias del complejo I, y con menor frecuencia una alteración de la subunidad III de la citocromo C oxidasa y de los complejos I y III29. El síndrome MELAS tiene una herencia materna y se asocia a una serie de mutaciones puntuales, siendo la más frecuente (80%) la A3243G en el gen del RNAtLeu(UUR) 30. Otras mutaciones descritas en este gen han sido: A3252G, T3271C (con una edad de aparición de los síntomas más tardía), T3291C y A3260G. Otros genes descritos con mutaciones puntuales asociados a MELAS han sido los que codifican RNAtPhe, RNAtVal, RNAtCys, ND1, ND4, ND5, COX III y ATP-asa 61,4. Este tipo de mutaciones pueden aparecer también en los familiares por línea materna, ya sean asintomáticos u oligosintomáticos. La heterogeneidad clínica es manifiesta, siendo raro encontrar en una misma familia más de un individuo con el fenotipo completo. Existe un grupo de pacientes con la mutación A3243G que pueden presentar OEP, sordera o diabetes aisladamente. La cantidad de DNAmt mutado es mucho más alta en músculo que en sangre; a veces no se detecta la mutación en sangre y solamente el estudio de DNA muscular consigue detectar la mutación. También se ha descrito un síndrome de superposición MELAS/MERRF31,32, asociado a mutaciones 3243 RNAtLeu (UUR), T8356C RNAtLys y T7512C RNAtSer (UCN).

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Encefalopatía mioclónica con fibras rojo rasgadas: MERRF La encefalopatía mioclónica con FRRs (MERRF) es una de las entidades con mayor variabilidad fenotípica, tanto entre individuos de una misma familia como en la evolución de los síntomas. Habitualmente se inicia en la infancia o la adolescencia, con crisis mioclónicas y mioclonías fotosensibles que pueden seguirse de crisis generalizadas y un síndrome cerebelar progresivo. Una combinación variable de otros síntomas como demencia, sordera neurosensorial, atrofia óptica, neuropatía periférica, talla baja y lipomas pueden aparecer33. Suele existir acidosis láctica, hiperproteinorraquia y aumento del lactato en LCR. La biopsia muscular evidencia FRRs y numerosas fibras COX negativas. Los exámenes de neuroimagen muestran atrofia cerebral y cerebelar. Diversas subunidades de los complejos I, III y IV pueden estar implicados en este síndrome. La mutación puntual con herencia materna descrita con mayor frecuencia en el MERRF es la substitución de A por G en el nucleótido 8344 del gen que codifica el RNAtLys, seguida de las mutaciones C8356T y G8363A del mismo gen34. Dado que la mutación se segrega en sangre en proporciones casi similares a las del músculo, la búsqueda de la mutación en sangre periférica tiene un buen rendimiento diagnóstico. También se han descrito familias con síndromes de superposición MELAS/MERRF31, así como un síndrome MERRF/OEP, ambos asociados a una mutación en el nucleótido A3243G con clínica de epilepsia, mioclonías, sordera neurosensorial, retinopatía y oftalmoparesia35. Otros fenotipos asociados a la mutación A8344G son la lipomatosis múltiple simétrica con epilepsia mioclónica, el síndrome de Leigh36, y el síndrome de Ekbom37 (ataxia cerebelosa, mioclonías fotosensibles, lipomas y deformidades esqueléticas). También se han descrito casos de epilepsia mioclónica con FRRs asociadas a múltiples delecciones de DNAmt38. Neuropatía sensitiva con ataxia y retinitis pigmentaria: NARP Este síndrome se caracteriza por una neuropatía sensitiva, ataxia y retinopatía pigmenta-

ria. Otros hallazgos clínicos son debilidad miopática proximal, retraso en el desarrollo y demencia39. Los niveles de lactato suelen ser normales. El NARP está asociado a una mutación puntual en el nucleótido 8993 del gen de la subunidad 6 de la ATPasa mitocondrial (complejo V de la cadena respiratoria). Se trata de una mutación heteroplásmica que da lugar a este síndrome con una carga mutacional de un 7090%. Una carga mutacional mayor del 90% da lugar al síndrome de Leigh de herencia materna40. Síndrome de Leigh de herencia materna: MILS (Maternal Inheritance Leigh Syndrome) El síndrome de Leigh de herencia materna, conocido por el acrónimo MILS, se inicia entre los primeros seis meses y el año de vida y tiene un curso evolutivo rápido, con detención del desarrollo psicomotor y regresión, conduciendo a la muerte en los primeros años de vida. Clínicamente se caracteriza por retraso psicomotor, hipotonía grave, ataxia, retinopatía y otros signos de tronco como nistagmus y oftalmoplejía41. Habitualmente se detecta hiperacidemia láctica. La biopsia muscular no evidencia FRRs. La resonancia magnética muestra áreas de hiperseñal bilaterales y simétricas en ganglios de base, tálamo y tronco de encéfalo. Una de las mutaciones del DNAmt (8993) es la misma que en el NARP, pero la proporción de DNA mutado supera en el MILS más del 90%39; en este caso son frecuentes las crisis. Dado que esta mutación se segrega en los tejidos fetales, puede realizarse un diagnóstico prenatal mediante biopsia coriónica. Una mutación diferente en el mismo gen (T9176) se ha descrito en la necrosis estriatal bilateral. Otras mutaciones puntuales de herencia materna descritas en el síndrome de Leigh afectan a los nucleótidos A8344G (ARNtLys) y A1644T (ARNtVal). También se han descrito delecciones únicas de naturaleza esporádica en el síndrome de Leigh. Una variante del síndrome de Leigh más benigno, de inicio en la edad adulta tardía, se ha descrito por una mutación puntual en el gen del RNAtVal 42.

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

Varios defectos bioquímicos conocidos pueden manifestarse como un síndrome de Leigh, entre ellos los déficits de los complejos I (19%), II (39%) o IV (14%) de la cadena respiratoria mitocondrial, los déficit de la piruvato deshidrogenasa (10%) ligada al cromosoma X, además de las mutaciones puntuales del DNAmt comentadas anteriormente (18%)43. El síndrome de Leigh debido a mutaciones nucleares se comenta en ese apartado específico. Existen otras encefalomiopatías precoces de inicio en la infancia asociadas a mutaciones puntuales del DNAmt y a delecciones, que no se han encuadrado en un fenotipo definido y que combinan proporciones variables de signos y síntomas encefalomiopáticos. Neuropatía óptica hereditaria de Leber La neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL) se manifiesta por una pérdida de la agudeza visual bilateral abrupta o subaguda de aparición durante la segunda o tercera década de la vida, de predominio en varones. Otros síntomas asociados en forma variable son ataxia, trastornos de la conducción cardíaca (síndromes de pre-excitación), neuropatía periférica, distonía y síndrome piramidal44. En este síndrome no existe acidosis láctica en sangre ni fibras rojo rasgadas en la biopsia muscular. La pérdida visual es central e indolora, y su progresión sucede por término medio en unos cuatro meses, siendo el intervalo medio de afectación de un ojo al otro de dos meses. Una vez desarrollado el cuadro clínico, la recuperación visual es muy pobre, pudiendo evolucionar a atrofia óptica. Numerosas mutaciones puntuales en genes estructurales del DNAmt han sido descritas en la neuropatía óptica de Leber, como las que afectan a los genes que codifican las subunidades ND1, ND2, ND4, ND5, ND6, citocromo b y COX I. Tres mutaciones afectando a genes del complejo I (G11778A, G3460A y T14484C) explican el 90% de los casos44. La mutación del gen ND4 en el nucleótido 11778 es la más frecuentemente descrita; su posible mecanismo patogénico podría ser un defecto en la interacción del complejo I con las deshidrogenasas dependientes de NAD. A pesar

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de que la herencia es materna, un 40% de los pacientes con la mutación G11778A tienen una historia familiar negativa. La gravedad del Leber parece depender de varios factores como el grado de penetrancia, la presencia de una segunda mutación secundaria en el DNAmt y la afectación extraocular. Cuanto mayor es la carga mutante del DNAmt, mayor es la frecuencia de amaurosis en varones. La variante que cursa con distonía guarda asociación con las mutaciones G14459A y T14596A en el gen de la subunidad ND6 del DNAmt45. Sordera neurosensorial Entre las formas recesivas de sordera destaca el síndrome de Wolfram46, que cursa con diabetes mellitus juvenil y atrofia óptica progresiva, de inicio generalmente en la adolescencia. Otros síntomas descritos son anosmia, ataxia, deterioro cognitivo, diabetes insípida, incontinencia urinaria y síndrome piramidal. Los síntomas cerebelares, ataxia y nistagmus, pueden afectar al 50% de los casos. Dos subtipos se han descrito ligados al cromosoma 4: el tipo 1, la forma más frecuente, se debe a una alteración en una proteína llamada wolframina. Su prevalencia se ha estimado entre 1 y 7 casos por cada 100.000 individuos. Los estudios bioquímicos evidencian anemia, trombocitopenia y disminución de leucocitos. La resonancia de encéfalo muestra atrofia cortical. La mutación puntual A3243G para el RNAtLeu33 puede producir un síndrome de sordera neurosensorial aislada, cuya intensidad aumenta con la edad. Su frecuencia se estima en un 7% de todos los pacientes con pérdida sensorial por línea materna. La edad de inicio oscila entre la segunda y la quinta década. También puede asociarse diabetes, cardiomiopatía y MELAS. El síndrome HAM (sordera, ataxia y mioclonus) se asocia con otra mutación puntual en el DNAmt, de herencia también materna. Lipomatosis simétrica múltiple La lipomatosis simétrica cursa con múltiples lipomas de distribución simétrica localizados alre-

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dedor del cuello, hombros y región proximal de los miembros47. Un 90% de los individuos presentan una polineuropatía axonal sensitivomotora48; en un 50% de los casos se asocian otras manifestaciones como miopatía, ataxia, atrofia óptica, pérdida auditiva o signos piramidales. Desde un punto de vista genético la lipomatosis múltiple se asocia con delecciones únicas de DNAmt, múltiples delecciones del DNAmt y, en ocasiones, con mutaciones puntuales del nucleótido A8344G y menos frecuentemente del G8363A47. Desde un punto de vista bioquímico este síndrome se ha asociado con una disminución de la actividad COX. Mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy (MNGIE) Este síndrome mitocondrial se caracteriza por una neuropatía periférica sensitivomotora (90%), miopatía, oftalmoparesia externa y ptosis (100%), encefalopatía y síntomas gastrointestinales (100%) en forma de episodios recurrentes de naúseas, vómitos, diarrea y gastroparesia con pseudoobstrucción49. El fenotipo puede cursar con talla baja, sordera (60%), degeneración retiniana y diverticulosis en duodeno y yeyuno. La clínica suele iniciarse antes de los 20 años de edad en el 75% de los casos, con un rango de edad entre los 5 meses y los 43 años. En el LCR se observa un incremento de proteínas. El aumento de lactato puede observarse en un 65% de los individuos. La neuropatía es axonal, de predominio sensitivo y distal. El EMG muestra unas amplitudes disminuidas en los nervios sensitivos y motores; en algunos casos se ha observado una neuropatía de predominio mielínico con disminución de las velocidades de conducción y dispersión temporal. La resonancia magnética de encéfalo muestra una leucoencefalopatía en el 100% de los individuos. Los defectos bioquímicos encontrados han sido del complejo I, IV y de múltiples complejos. Se ha descrito un patrón de herencia autosómico recesivo asociado a una mutación sin sentido en el cromosoma 22q13.32 en el gen que codifica la timidina fosforilasa50. Esta enzima juega un papel en la homeostasis del pool de nucleótidos de la

célula. Otros tipos de mutaciones encontradas con menor frecuencia son delecciones múltiples sin duplicaciones en el DNAmt, inserciones y mutaciones puntuales. Neuropatía atáxica sensitiva con disartria y oftalmoparesia: SANDO (Sensory Ataxic Neuropathy Disarthria and Opthalmoparesis) El acrónimo SANDO hace referencia a un síndrome constituido por una neuropatía atáxica sensitiva, disartria y oftalmoparesia51. La neuropatía es de predominio sensitivo, y clínicamente produce una pérdida de la sensibilidad vibratoria y palestésica en extremidades inferiores. El EMG evidencia unas respuestas sensitivas reducidas o ausentes en miembros. El análisis genético-molecular ha mostrado delecciones múltiples de DNAmt. En otros individuos se han descrito variantes de este síndrome, con neuropatía sensitiva con lipomas simétricos múltiple37 y neuropatía sensitiva con OEP y epilepsia mioclónica52. SÍNDROMES CLÍNICOS POR DEFECTOS EN EL DNA NUCLEAR Las mutaciones conocidas en el DNAmt suponen un 40% de los casos de las enfermedades mitocondriales del adulto. En la infancia la proporción de casos conocidos atribuidos a mutaciones del DNAmt es mucho más baja, habiéndose estimado en un 10%. Eso significa que una gran proporción de casos, especialmente en la infancia, pueden ser debidos a alteraciones en los genes nucleares relacionados con el sistema OXPHOS de fosforilación oxidativa, que no han sido identificados todavía3,4. El descubrimiento de varios genes nucleares de herencia mendeliana relacionados con el sistema OXPHOS ha mudado el panorama de la genética mitocondrial. Se han propuesto cuatro grupos de defectos génicos nucleares relacionados con las enfermedades mitocondriales: defectos en componentes estructurales de los complejos de la cadena respiratoria (fundamentalmente de subunidades de los complejos I y II), anoma-

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lías en los factores implicados en el ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria, alteraciones en los factores implicados en las redes metabólicas que influyen en la biogénesis de la mitocondria, incluyendo el OXPHOS, y defectos en aquellos factores que controlan la estabilidad del DNAmt4. Defectos de genes nucleares que codifican componentes estructurales y enzimáticos de los complejos de la cadena respiratoria El complejo I (NADH-CoQ reductasa) es el mayor de los que integran la cadena respiratoria. Consta de 35 polipéptidos, de los que tan sólo 7 son codificados por el DNAmt. La deficiencia aislada del complejo I es una causa relativamente frecuente de enfermedades mitocondriales y su defecto génico puede originarse tanto en el DNAmt como en el DNA nuclear. Se han descrito mutaciones en genes nucleares situados en los cromosomas 11 y 5, que codifican respectivamente subunidades de los complejos I y II de la cadena respiratoria. El cuadro clínico por déficit aislado de complejo I se debe a una mutación en una subunidad proteica de 23 kDa, que se codifica en el cromosoma 11q13, pudiendo dar lugar a una encefalopatía progresiva con acidosis láctica, hipotonía, retraso en el desarrollo y muerte en el periodo neonatal por fallo cardiaco, superponible a un síndrome de Leigh. La forma miopática cursa con debilidad muscular e intolerancia al ejercicio de inicio en la infancia o adolescencia. El complejo II (succinato-CoQ reductasa) consta de 4 polipéptidos y es el único complejo de la cadena respiratoria que es codificado completamente por el genoma nuclear. Las mutaciones del complejo II, sobre todo de la subunidad A en el cromosoma 5p15, pueden dar lugar también a un síndrome de Leigh en recién nacidos y a un síndrome miopático con mioglobinuria e intolerancia al ejercicio en adultos jóvenes1,4. Una familia con síntomas clínicos de inicio en la cuarta década de la vida, de atrofia óptica, ataxia y miopatía proximal, se ha descrito debido a una mutación de un gen que codifica una subunidad del complejo II53.

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Los defectos mitocondriales pueden influir en la patogénesis de ciertos tumores. Los paragangliomas son tumores neuroectodérmicos, un 1050% de los cuales se heredan de modo autosómico dominante. Los paragangliomas hereditarios tipo 1 y tipo 2 presentan mutaciones en los genes SDHD y SDHC que codifican la subunidad más pequeña del complejo II, encargada de anclar dicho complejo en la membrana mitocondrial interna54. El déficit de CoQ10 o ubiquinona se manifiesta en la infancia y cursa con mioglobinuria recurrente, afectación del SNC (retraso psicomotor, ataxia, crisis) y presencia de FRRs y acúmulo de lípidos en la biopsia muscular. Existe un aumento de ácido láctico y CK en sangre. Otro fenotipo asociado al déficit de CoQ10 es la ataxia cerebelar familiar con crisis convulsivas y síndrome piramidal en ausencia de mioglobinuria. Estos síndromes responden bien al tratamiento sintomático con CoQ1055. El complejo III, llamado CoQ-citocromo c oxidorreductasa, está compuesto por 11 subunidades, de las que tan solo una está codificada por el DNA nuclear. Diversas formas clínicas se han descrito en relación a la deficiencia de este complejo: encefalomiopatía infantil fatal, encefalomiopatía de la infancia tardía, miopatía con intolerancia al ejercicio y cardiomiopatía fatal de la infancia. También se han descrito mutaciones en genes que codifican otras enzimas mitocondriales que participan en el transporte mitocondrial o en las vías metabólicas, como la CPT II y la subunidad E1α de la piruvato decarboxilasa (PDC)1. Defectos de genes nucleares que codifican factores implicados en el ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria Los defectos de la actividad citocromo c oxidasa (COX o complejo IV) son el trastorno bioquímico más común observado en las enfermedades mitocondriales. En la infancia, el déficit de COX puede manifestarse como un síndrome de Leigh y otros fenotipos como cardiomiopatía grave y otras encefalomiopatías. Los defectos del complejo IV pueden deberse a mutaciones de los

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

genes del DNAmt que codifican RNAt, pero también pueden tener su origen en mutaciones de las subunidades de la COX codificados por genes nucleares. En la actualidad, los defectos de COX de origen nuclear identificados se deben a mutaciones en los factores de ensamblaje de la enzima; no se han identificado aún mutaciones que afecten directamente a las subunidades de la COX de origen nuclear. La proteína SURF-1 es un factor de ensamblaje localizado en el interior de la membrana mitocondrial implicado en las fases iniciales de la formación de la citocromo c oxidasa, cuyo gen se localiza en el cromosoma 9q34. El estudio de las mutaciones SURF-1 han puesto de manifiesto que esta es la causa más común de síndrome de Leigh, hasta en un 75% de los casos56. Mutaciones en otros genes de ensamblaje de la COX llamados SC01 y SC02 (encargados de facilitar la incorporación de las subunidades I y II a la holoproteína) se han descrito en casos de miopatía y cardiopatía fatal infantil11. En una familia con clínica de leucoencefalopatía de inicio precoz, recesiva, se ha aislado una mutación sin sentido en el gen COX10, que codifica una enzima (hem A-farnesyltransferasa) que participa en la génesis del grupo prostético de la COX57. Defectos en la importación de proteínas mitocondriales Las proteínas que son codificadas por el DNA nuclear precisan de un péptido guía en su porción aminoterminal, para ser transportadas desde el citoplasma a la mitocondria. Una variante de la acidemia metilmalónica, originada por una mutación de un péptido guía de la metilmalonilCoA mutasa, se ha descrito. Se caracteriza clínicamente por retraso psicomotor, hipotonía, hepatomegalia, vómitos, insuficiencia respiratoria y coma58. Defectos de la comunicación intergenómica a. Depleciones de DNAmt Diversas se han descrito siguiendo una herencia probablemente autosómica recesiva. Las for-

mas graves tienen un porcentaje de depleción del 98%, mientras que las más leves exhiben tan sólo un menor número de copias del genoma mitocondrial. Se postula que puedan ser debidos a un defecto en un gen nuclear responsable por la replicación del DNAmt en fases precoces del desarrollo. Estos fenotipos incluyen hepatopatías infantiles graves con acidosis láctica y miopatías congénitas e infantiles con acidosis láctica, FRRs e insuficiencia respiratoria. b. Delecciones múltiples de DNAmt Varias familias han sido descritas portando diversos fenotipos con un patrón de herencia mendeliano dominante y recesivo. Se han observado múltiples delecciones diferentes del DNAmt, destacando entre ellas las OEPs de herencia autosómica dominante (OEPad) ligadas a los cromosomas 10q, 4q y 3p20,21. Mutaciones en el traslocador del nucleótido adenina tipo 1 (ANT) se han observado en las OEPs familiares ligadas al cromosoma 4q. El gen defectivo en la OEPad ligada al cromosoma 10q codifica una proteína llamada Twinkle que tiene actividad helicasa y puede ser crítica para el mantenimiento de la integridad del DNAmt. Esta proteína se sitúa junto con el DNAmt en complejos nucleoproteicos llamados nucleoides mitocondriales. Las mutaciones de Twinkle se han observado en un 17% de las familias con OEPad. Una mutación en la polimerasa γ, la única polimerasa del DNAmt ha sido observada en varias familias con OEP4. También se ha descrito una mutación en el gen que codifica la enzima timidina fosforilasa (la enzima defectiva en el síndrome MNGIE) en un grupo de pacientes con múltiples delecciones de DNAmt, por lo que se postula que un metabolismo anormal en el metabolismo de la timidina podría afectar la replicación del DNAmt50. Los déficits de ANT1, Twinkle y timidina fosforilasa pueden considerarse como síndromes de ruptura del DNAmt, y están implicadas en el control del pool de nucleótidos de la célula, sugiriendo un mecanismo patogénico común, como por ejemplo la disminución de los ácidos nucleicos que podrían afectar la integridad estructural del DNAmt.

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

TRATAMIENTO No existe en la actualidad un tratamiento farmacológico efectivo para las enfermedades mitocondriales. Ciertas medidas sintomáticas pueden mejorar la calidad de vida de estos pacientes; entre ellas, la mejora de la nutrición, la corrección quirúrgica de la ptosis palpebral mediante una tarsorrafia en los casos graves de OEP, el implante de marcapasos ante un bloqueo cardiaco y los tratamientos sintomáticos de las crisis convulsivas y de la acidosis metabólica60. La terapia metabólica se basa en el aporte de substancias antioxidantes y aceptoras de radicales libres y en una serie de medidas preventivas generales, entre ellas evitar el uso de substancias tóxicas para la mitocondria, como alcohol y tabaco, barbitúricos, ciertos antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas mitocondriales (tetraciclinas, cloramfenicol) y algunos antiepilépticos que inhiben la cadena respiratoria (fenitoína) o interfieren en el metabolismo de la carnitina (valproato). La hipertermia y el ejercicio intenso, especialmente el anaeróbico, deberían evitarse60. Diversos aceptores de electrones y antioxidantes, como la vitamina C (1-2 g/día), menadiona/ vitamina K3 (10-20 mg/día), vitamina E (1 g/día), y los cofactores de la cadena respiratoria como la tiamina (300 mg/día), riboflavina (100-300 mg/ día), coenzima Q (150-300 mg/día), así como el dicloroacetato (25 mg/Kg cada 12 horas) han mostrado un beneficio temporal en casos anecdóticos y en estudios abiertos60. El fármaco más ampliamente utilizado, la coenzima Q, no ha mostrado hasta el momento una clara eficacia. Su uso es beneficioso únicamente en los casos aislados de ataxia familiar por deficiencia de CoQ10, en donde su administración mejora el cuadro clínico55. Dos recientes ensayos clínicos con carnitina en pacientes con OEP y otras miopatías ha mostrado resultados antagónicos; algunos autores recomiendan su administración en pacientes con debilidad muscular debido a su ausencia de efectos secundarios61,62. La terapia física y el ejercicio aeróbico mediante contracciones musculares isométricas han mostrado tener un efecto beneficioso, mejorando la capacidad aeróbica, disminuyendo los niveles de lactato y mejorando la fuerza muscular. El

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ejercicio aeróbico en los pacientes con miopatía mitocondrial evita la pérdida progresiva de la condición física, que a su vez reduce la actividad oxidativa mitocondrial; también puede aumentar el número de mitocondrias y la actividad enzimática, frenando el deterioro de la función mitocondrial ligada a la edad63. La terapia génica será la herramienta terapéutica del futuro mediante diversas técnicas como la introducción de genes modificados en las mitocondrias y la inhibición de la replicación de DNAmt mutado4. Sin embargo, estas técnicas aún no están desarrolladas en la actualidad. CONSEJO GENÉTICO El consejo genético en las enfermedades mitocondriales es difícil debido a la complejidad de la herencia mitocondrial principalmente por la heteroplasmia y la segregación mitótica, ya que no nos permiten predecir cómo se segregan en los diferentes tejidos las mutaciones heteroplásmicas de DNAmt. Existen dos tipos de mutaciones del DNAmt: reordenamientos (delecciones y duplicaciones) y mutaciones puntuales. La mayoría de las delecciones son esporádicas y no se transmiten a la descendencia, mientras que las mutaciones puntuales del DNAmt se heredan casi exclusivamente por vía materna, afectándose varones y mujeres, aunque solamente las hijas las transmitirán a los miembros de la siguiente generación. Los pacientes con neuropatía óptica de Leber suelen portar DNA mutante (mutación homoplásmica). En cambio, las mutaciones puntuales en los genes de los RNAt son heteroplásmicas y los individuos afectos portan cantidades variables de DNA nativo y mutado. Así, una mujer con una mutación heteroplásmica del DNAmt y una carga alta de DNAmt mutado puede transmitir una cantidad pequeña de DNA mutado a un hijo (que será asintomático u oligosintomático) y, en cambio, una alta carga de DNAmt mutante a otro de los hijos (quien puede desarrollar un fenotipo clásico). Teóricamente, conforme aumente la cantidad de DNAmt mutado en la madre, mayor será el número de descendentes afectos. Sin embargo, no es posible establecer una clara co-

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

rrelación entre la carga de DNAmt mutado en la madre y el riesgo de afectarse la descendencia64. Las mutaciones que se producen en el DNAmt de la línea germinal materna se transmiten a las generaciones sucesivas. La extrema variabilidad en la segregación del genoma mitocondrial entre los descendientes puede ser debida, en parte, a la reducción y subsecuente proliferación del genoma mitocondrial en el oocito en desarrollo, fenómeno conocido como cuello de botella mitocondrial. El cuello de botella que tiene lugar en la replicación mitocondrial durante la oogénesis y la segregación durante la embriogénesis permite una enorme amplificación de genomas portadores de una nueva mutación. Para una misma carga mutacional materna, existe una frecuencia mayor de descendientes afectos para la mutación A3243G MELAS que para la A8344G MERRF. Cuando la carga de DNAmt mutado supera el 20% en la mutación A3243G, existe un 50% de probabilidades de afectarse los descendientes; en cambio, cuando la carga mutante es inferior a un 20%, las probabilidades son de un 20%. En el caso de los individuos portadores de la mutación G8344A MERRF, cuando la carga de DNAmt mutante en sangre materna es inferior a un 40%, el riesgo de transmisión estimada es menor de un 5%65. El uso de diversos tests genéticos para detectar delecciones y mutaciones del DNAmt de cualquier tejido se está extendiendo en los últimos años. El diagnóstico prenatal mediante amniocentesis, análisis de vellosidad coriónica y diagnóstico genético preimplantación son diversas opciones existentes para la prevención de las mutaciones mitocondriales. Un estudio de Southern blot o de PCR negativos en el primer trimestre del embarazo, en sangre de cordón umbilical durante el nacimiento, o en sangre periférica en el primer año de vida hacen improbable la transmisión de una enfermedad mitocondrial. Sin embargo, no excluye la posibilidad de una transmisión de niveles bajos de DNAmt mutado que pudiese causar una enfermedad mitocondrial tardía en la vida. Por otro lado, una contaminación con sangre materna puede dar un falso positivo en un estudio de PCR de muestras de sangre fetal o de células obtenidas por amniocentesis66. Por ello, se recomienda el uso combinado de

análisis de Southern blot y PCR en el diagnóstico prenatal. En la actualidad, la fertilización in vitro de oocitos donados por una mujer sana puede ser una opción terapéutica para aquellas pacientes que deseen tener hijos. Las técnicas de trasferencia nuclear y citoplásmica en oocitos de donante pueden ser de utilidad en el futuro67. BIBLIOGRAFÍA 1. Nardin RA, Johns DR. Mitochondrial dysfunction and neuromuscular disease. Muscle Nerve 2001; 24: 170-191. 2. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 1981; 290: 457-465. 3. Chinnery PF, Turnbull DM. Mitochondrial DNA and disease. Lancet 1999; 354 (supl I): 17-21. 4. Zeviani M, Klopstock T. Mitochondrial disorders. Curr Opin Neurol 2001; 14: 553-560. 5. Chinnery PF, Johnson MA, Wardell TM, et al. The epidemiology of pathogenic mitochondrial DNA mutations. Ann Neurol 2000; 48: 188-193. 6. Majamaa K, Moilanen JS, Uimonen S, et al. Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes: prevalence of the mutation in an adult population. Am J Hum Genet 1998; 63: 447-454. 7. Mackey DA, Oostra RJ, Rosenberg T, et al. Primary pathogenic mtDNA mutations in multigeneration pedigrees with Leber hereditary optic neuropathy. Am J Hum Genet 1996; 59: 481-485. 8. Maassen J, Kadowaki T. Maternally inherited diabetes and deafness: a new diabetes subtype. Diabetologia 1996; 39: 375-382. 9. Bonilla E, Sciacco M, Tanji K, et al. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain Pathol 1992; 2: 113-119. 10. Chu BC, Terae S, Takahashi C, et al. MRI of the brain in the Kearns-Sayre syndrome: report of four cases and a review. Neuroradiology 1999; 41: 759764. 11. Papadopolou LC, Sue CM, Davidson MM, et al. Fatal infantil cardioencephalomyopathy with COX deficiency and mutations in SCO2, a COX assembly gene. Nat Genet 1999; 23: 333-337. 12. Petty RK, Harding AE, Morgan-Hughes JA. The clinical features of mitochondrial myopathy. Brain 1986; 109: 915-938. 13. Ohno K, Tanaka M, Sahashi K, et al. Mitochondrial DNA deletions in inherited recurrent myoglobinuria. Ann Neurol 1991; 29: 364-369.

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A PÉNDICE

I

Listado de enfermedades neurológicas hereditarias

Enfermedad citogénica

Gen

Localización

Aceruloplasminemia Achromatopsia Adenilosuccinasa, deficiencia de Adrenoleukodistrofia Albinismo ocular, tipo 1 Alzheimer, enfermedad de, familiar, inicio precoz Alzheimer, enfermedad de, familiar, inicio precoz Alzheimer, enfermedad de, familiar, inicio precoz Amiloide polineuropatía, familiar Amiloidosis, cerebroarterial, tipo Dutch Amiloidosis, tipo Finlandes Angelman, síndrome de Apnea, postanestésica Ataxia con deficiencia de vitamina E Ataxia episódica, tipo 2 Ataxia episódica/miokimia, síndrome de Ataxia de Friedreich Ataxia-telangiectasia Atrofia Girata Atrofia muscular espinal, HEXB-related Atrofia muscular espinal tipo 1 Autismo, sucinilpurinemia Biotinidasa, deficiencia de Brunner, síndrome de Canavan, enfermedad de CADASIL Ceroido lipofuscinosis, neuronal tipo 1, infantil Ceroido lipofuscinosis, neuronal tipo 2, clásica infantil tardía Ceroido lipofuscinosis, neuronal tipo 3, juvenil Ceroido lipofuscinosis, neuronal tipo 5, variante tardía infantil

CP CNGA3 ADSL ABCD1 OA1 PSEN1 PSEN2 APP TTR APP GSN UBE3A BCHE TTPA CACNA1A KCNA1 FRDA ATM OAT HEXB SMN1 ADSL BTD MAOA ASPA NOTCH-3 PPT CLN2 CLN3 CLN5

3q21-q24 2p11.2-q12 22q13.1 Xq28 Xp22.3 14q24.3 1q31-q42 21q21.3-q22.05 18q11.2-q12.1 21q21.3-q22.05 9q34 15q11-q13 3q26.1-q26.2 8q13.1-q13.3 19p13 12p13 9q13-q21.1 11q22.3 10q26 5q13 5q12.2-q13.3 22q13.1 3p25 Xp11.23 17pter-p13 19p13.2-p13.1 1p32 11p15.5 16p12.1 13q21.1-q32

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Enfermedad citogénica

Gen

Localización

Charcot-Marie-Tooth, neuropatía, ligado al X 1, dominante Charcot-Marie-Tooth, neuropatía tipo 1A Charcot-Marie-Tooth, neuropatía tipo 1B Charcot-Marie-Tooth, neuropatía tipo 2A Charcot-Marie-Tooth, neuropatía tipo 4A Charcot-Marie-Tooth, neuropatía tipo 4B Coroideremia Cockayne, síndrome de tipo 2, tardío Coffin-Lowry, síndrome de Ceguera de colores, deutan Ceguera de colores, protan Ceguera de colores, tritan Ceguera nocturna, congénita estacionaria Ceguera nocturna, congénita estacionaria, ligado al X, tipo 2 Conos distrofia, progresiva Conos distrofia tipo 3 Conos –bastones, distrofia tipo 3 Conos –bastones, distrofia tipo 2 Cowden, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Dejerine-Sottas, enfermedad de, P(0) Dejerine-Sottas, enfermedad de, PMP22 Dementia, frontotemporal, con parkinsonismo Dentatorubropallidoluysian atrofia Doyne honeycomb retinal distrofia Duchenne, muscular distrofia Distonía, progresiva, con variación diurna Emery-Dreifuss muscular distrofia Epilepsia, benigna neonatal, tipo 2 Epilepsia, benigna neonatal, tipo 1 Epilepsia, nocturna frontal, tipo 1 Epilepsia, progresiva mioclonica tipo 1 Epilepsia, progresiva, con retraso mental Esclerosis lateral amiotrófica, deficiencia de SOD1 Fenilcetonuria Fenilcetonuria por deficiencia de dihydropteridine reductasa Fenilcetonuria por PTS, deficiencia de Fukuyama, muscular distrofia congénita Gerstmann-Straussler, enfermedad de GM2-gangliosidosis, AB variante GM2-gangliosidosis, juvenil, adulto Holoprosencefalia tipo 2 Holoprosencefalia tipo 3 Huntington, enfermedad de Hidrocefalia, ligado al X Hyperekplexia y paraparesia espástica Hipomielinización, congénita Insensibildad al dolor, congénita, con anhidrosis Insomnio fatal familiar Juberg-Marsidi, síndrome de Kallmann, síndrome de Kanzaki, enfermedad de Krabbe, enfermedad de

GJB1 PMP22 MPZ KIF1B GDAP1 MTMR2 CHM ERCC6 RPS6KA3 OPN1MW OPN1LW OPN1SW GNAT1 CACNA1F CORD6 GUCA1A ABCA4 CRX PTEN PRNP MPZ PMP22 MAPT DRPLA EFEMP1 DMD GCH1 EMD KCNQ3 KCNQ2 CHRNA4 CSTB CLN8 SOD1 PAH QDPR PTS FCMD PRNP GM2A HEXA SIX3 SHH HD L1CAM GLRA1 MPZ NTRK1 PRNP ATRX KAL1 NAGA GALC

Xq13.1 17p11.2 1q22 1p36 8q13-q21 11q22 Xq21.2 10q11 Xp22.2-p22.1 Xq28 Xq28 7q31.3-q32 3p21 Xp11.23 17p13-p12 6p21.1 1p21-p13 19q13.3 10q23.3 20pter-p12 1q22 17p11.2 17q21.1 12p13.31 2p16 Xp21.2 14q22.1-q22.2 Xq28 8q24 20q13.3 20q13.2-q13.3 21q22.3 8pter-p22 21q22.1 12q24.1 4p15.31 11q22.3-q23.3 9q31-q33 20pter-p12 5q31.3-q33.1 15q23-q24 2p21 7q36 4p16.3 Xq28 5q32 1q22 1q21-q22 20pter-p12 Xq13 Xp22.3 22q11 14q24.3-q32.1

APÉNDICE I: LISTADO DE ENFERMEDADES NEUROLÓGICAS HEREDITARIAS

Enfermedad citogénica

Gen

Localización

Leber, amaurosis congénita, tipo I Leber, amaurosis congénita, tipo II Leber, amaurosis congénita, tipo III Lesch-Nyhan, síndrome de Lhermitte-Duclos, síndrome de Leucodistrofia metacromatica Lisencefalia, ligado al X Lisencefalía, tipo 1 Lowe, síndrome de Machado-Joseph, enfermedad de MASA, síndrome Migraña hemipléjica familiar Retraso mental, ligado al X no especifico Retraso mental, ligado al X, Retraso mental, ligado al X, tipo FRAXE NAGA, deficiencia de, leve Neuropatía, congénita hipomielinante, tipo 1 Neuropatía, recurrente, con parálisis por presión Niemann-Pick, enfermedad de, tipo A Niemann-Pick, enfermedad de, tipo C Nodular heterotopia, bilateral periventricular Norrie, enfermedad de Oguchi, enfermedad de, tipo 1 Oguchi, enfermedad de, tipo 2 Parkinson, enfermedad de Parkinson, enfermedad de, juvenil, autosomal recesiva Parkinson, enfermedad de, tipo 1 Paraplegia espástica Paraplegia espástica tipo 2 Paraplegia espástica tipo 4 Phosphoribosyl pyrophosphate sintetasa Pseudo–Zellweger, síndrome de Refsum, enfermedad de Refsum, enfermedad de, infantil Retinitis pigmentosa, autosomal recesiva Retinitis pigmentosa, autosomal recesiva Retinitis pigmentosa, autosomal recesiva Retinitis pigmentosa, autosomal recesiva, RLBP1 Retinitis pigmentosa, digenica Retinitis pigmentosa, peripherin Retinitis pigmentosa, rhodopsin Retinitis pigmentosa tipo 14 Retinitis pigmentosa tipo 2, Ligado al X Retinitis pigmentosa tipo 3, Ligado al X Retinoschisis Sandhoff, enfermedad de SCA tipo 1 SCA tipo 10 SCA tipo 12 SCA tipo 2 SCA tipo 6 SCA tipo 7 Schindler, enfermedad de

GUCY2D RPE65 CRX HPRT1 PTEN ARSA DCX PAFAH1B1 OCRL MJD L1CAM CACNA1A RABGD1A OPHN1 FMR2 NAGA EGR2 PMP22 SMPD1 NPC1 FLNA NDP SAG RHOK UCHL1 PARK2 SNCA L1CAM PLP1 SPG4 PRPS1 ACAA PHYH PEX1 CNCG1 PDE6B PDE6A RLBP1 ROM1 RDS RHO TULP1 RP2 RPGR RS1 HEXB SCA1 SCA10 PPP2R2B SCA2 CACNA1A SCA7 NAGA

17p13 1p31 19q13.3 Xq26-q27.2 10q23.3 22q13.31-qter Xq22.3-q23 17p13.3 Xq26.1 14q24.3-q31 Xq28 19p13 Xq28 Xq12 Xq28 22q11 10q21.1-q22.1 17p11.2 11p15.4-p15.1 18q11-q12 Xq28 Xp11.4 2q37.1 13q34 4p14 6q25.2-q27 4q21.3-q22 Xq28 Xq22 2p24-p21 Xq22-q24 3p23-p22 10pter-p11.2 7q21-q22 4p12-cen 5q31.2-q34 4p16.3 15q26 11q13 6p21.1-cen 3q21-q24 6p21.3 Xp11.3 Xp21.1 Xp22.2-p22.1 5q13 6p23 22q13 5q31-q33 12q24 19p13 3p21.1-p12 22q11

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276

MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Enfermedad citogénica

Gen

Localización

Segawa, síndrome de Sialidosis Sjögren-Larsson, síndrome de Sordera, autosomal dominante tipo 11, neurosensorial Sordera, autosomal dominante tipo 15 Sordera, autosomal dominante tipo 2 Sordera, autosomal dominante tipo 3 Sordera, autosomal dominante tipo 5 Sordera, autosomal dominante tipo 8 Sordera, autosomal dominante tipo 9 Sordera, autosomal dominante no sindromica sensorineural, tipo 1 Sordera, autosomal recesiva tipo 3 Sordera, autosomal recesiva tipo 1 Sordera, autosomal recesiva tipo 2, neurosensorial Sordera, autosomal recesiva tipo 4 Sordera, autosomal recesiva tipo 9 Sordera, ligado al X tipo 1, progresiva Sordera, ligado al X tipo 3, conductiva Stargardt, enfermedad de tipo 1 Startle, enfermedad de/hyperekplexia, autosomal dominante Talasemia/retraso mental, síndrome de , tipo 2 Tay-Sachs, enfermedad de Tiamina-uraciluria Tirosinemia, tipo II Tirosinemia, tipo III Usher, síndrome de, tipo 1B Usher, síndrome de, tipo 2 Xantomatosis Cerebrotendinosa X frágil, síndrome de Waardenburg, síndrome de, tipo I Wilson, enfermedad de Wolfram, síndrome de

TH NEU1 ALDH3A2 MYO7A POU4F3 KCNQ4 GJB2 DFNA5 TECTA COCH DIAPH1 MYO15A GJB2 MYO7A SLC26A4 OTOF TIMM8A POU3F4 ABCA4 GLRA1 ATRX HEXA DPYD TAT HPD MYO7A USH2A CYP27A1 FMR1 PAX3 ATP7B WFS1

11p15.5 6p21.3 17p11.2 11q13.5 5q31 1p34 13q11-q12 7p15 11q22-q24 14q12-q13 5q31 17p11.2 13q11-q12 11q13.5 7q31 2p23-p22 Xq22 Xq21.1 1p21-p13 5q32 Xq13 15q23-q24 1p22 16q22.1-q22.3 12q24-qter 11q13.5 1q41 2q33-qter Xq27.3 2q35 13q14.3-q21.1 4p16.1

A PÉNDICE

II

Secuencia histórica de la genética

420 a.C. Sócrates (470?-399 AC), especula por qué los hijos no siempre se parecen a los padres. 400 a.C. Hipócrates (460-377 AC) determina que la contribución del padre a la herencia está en el semen. Por analogía, postula que debe existir un fluido similar en la mujer, ya que los hijos presentan rasgos de los padres en proporción similar. 320 a.C. Aristóteles (384-322 AC), rechaza la teoría de Hipócrates y señala que la herencia solo proviene del padre. El semen determina la forma del hijo, mientras que la madre solo provee el material del que el hijo está hecho. Sugiere que las hijas se originan por interferencia de la sangre materna. 1000

Los hindúes observan que ciertas enfermedades aparecen en un contexto familiar.

1100-1400 En Europa la teoría dominante es que los organismos vivos aparecen por generación espontánea a partir de seres no vivos. 1610

Robert Hooke observa la estructura celular del corcho. Sin embargo, hasta 200 años más tarde no se considera que el hombre está formado por componentes más pequeños.

1630

William Harvey llega a la conclusión de que animales y plantas se reproducen de una manera sexual similar. Los machos presentan el polen o esperma y las hembras los óvulos. Sin embargo, hasta 200 años después no se observa el primer cigoto de un mamífero.

1650

Francesco Redi ataca la idea de la generación espontánea mostrando que las larvas provienen de las moscas y las moscas provienen de las larvas.

1859

Charles Darwin (1809-1882) da la hipótesis de que las poblaciones animales se adaptan al ambiente en un proceso que el llama «selección natural». Refiere que solo las criaturas que mejor se adaptan al ambiente sobreviven para reproducirse.

1865

Gregor Mendel (1822-1884), presenta sus leyes de la herencia en la Sociedad de Ciencias Naturales de Brunn, Austria. 277

278

MANUAL DE NEUROGENÉTICA

1868

Fredrich Miescher, un biólogo suizo, aísla el ácido nucleico del pus de los vendajes de las heridas. Meischer no estaba investigando la herencia sino tratando de identificar sustancias químicas del interior de las células. Aunque solo habían pasado 3 años desde la conferencia de Mendel, se tardaron más de 75 años hasta que uno y otro hallazgo se relacionaron en común.

1871

Se aísla el DNA del esperma de una trucha encontrada en el río Rhin.

1883

August Weismann, fisiólogo alemán, señala que el padre y la madre contribuyen igualmente a la herencia, que la reproducción sexual genera nuevas combinaciones de factores hereditarios y que la herencia se porta en los cromosomas.

1883

El inglés Francis Galton acuña el término «eugenia» como la ciencia de mejorar la condición humana a través de «apareamiento juicioso».

1884

Fallece George Mendel sin recibir el reconocimiento científico de su descubrimiento. Él mismo señaló antes de morir: «ya llegará mi hora».

1900

Las teorías de Mendel son redescubiertas por tres científicos: Hugo de Vries, Erich Von Tschermak, y Carl Correns, cada uno de ellos trabajando independientemente, cuando buscan la bibliografía que apoyará sus descubrimientos, que ellos pensaban eran originales.

1900

William Sutton observa un par de cromosomas homólogos en células de saltamontes.

1902

Walter Sutton sugiere que los factores de la herencia de Mendel están localizados en los cromosomas. Después de observar los movimientos de los cromosomas durante la meiosis, desarrolla la teoría cromosómica de la herencia. Además, descubre que los cromosomas están en parejas y que las células sexuales reciben solo un cromosoma de cada pareja. Estos hallazgos corroboran las leyes de Mendel de que los factores genéticos se segregan y que se distribuyen de forma independiente. Sutton llama por primera vez a estos factores genéticos genes.

1905

Edmund Wilson y Nellie Stevens proponen la idea de que los cromosomas X e Y determinan el sexo, señalando que un cromosoma Y determina a los machos, y dos copias del cromosoma X a las hembras.

1909

Archibald Garrod, a partir de la observación clínica de una familia con alcaptonuria (artritis, orinas rojizas, aumento de ácido homogentísico), señala que se debe a un error innato del metabolismo de causa genética. Esto es, que un gen produce una enzima.

1910

Thomas Hunt Morgan prueba que los genes se encuentran en los cromosomas. Trabaja sobre la mosca de la fruta, en la Universidad de Colombia, localiza varios genes en cromosomas, y demuestra la existencia de genes ligados al sexo, y la existencia de genes ligados entre ellos. Utiliza el fenómeno de crossing over para determinar la localización de los genes.

1913

Alfred H. Sturtevant, un becario de Morgan, construye el primer mapa génico mediante el análisis de los resultados de cruzar moscas de la fruta con 6 diferentes factores mutantes, recesivos y ligados al X, siguiendo cada mutación y calculando el porcentaje de recombinación.

1917

Sewall Wright, un genetista que trabajaba en Harvard, tras analizar durante dos años la herencia del color de la piel de cobayas, ratones, conejos, caballos y otros mamíferos, describe que el color de la piel requiere pasos bioquímicos que siguen un orden temporal fijo, sugiriendo que cada paso está mediado por una enzima específico diferente.

1921

Hermann J. Muller, otro becario de Hunt Morgan, escribe un artículo que es sorprendentemente futurista, concibiendo los genes como partículas de tamaños ultramicroscópicos pero con una estructura compleja de diferentes partes.

APÉNDICE II: SECUENCIA HISTÓRICA DE LA GENÉTICA

279

1927

Hermann Muller demuestra que los rayos X pueden causar mutaciones en la mosca de la fruta, 1.500 veces más frecuentemente que en circunstancias normales. Este descubrimiento provee a los científicos de un medio para inducir mutaciones, una herramienta muy importante para el estudio de los genes.

1928

Fredrick Griffiths describe que un tipo rugoso de bacteria cambia a un tipo liso cuando un factor transformante desconocido presente en los tipos lisos se añade. Oswald Avery identifica este factor transformante como DNA.

1928

Lewis Stadler muestra que la radiación ultravioleta también causa mutaciones.

1928-35 Linus Pauling describe las leyes de la física que gobiernan como «los átomos están distribuidos en las moléculas». También describe la anemia de células falciformes como «una enfermedad molecular». 1933

T.S. Painter describe que con microscopía pueden encontrarse diferencias entre los cromosomas y relaciona la recombinación genética por fenómenos de intercambio de material entre los cromosomas.

1938

Se comienzan a estudiar las proteínas y el DNA mediante cristalografía de rayos X.

1941

George Beadle and Edward Tatum, con sus experimentos en la Neurospora, un moho que crece en el pan, desarrollan la hipótesis de «un gen-una enzima»: cada gen se traduce en una enzima. Examinaron mohos dañados con rayos X que no son capaces de crecer en el medio de cultivo, pero sí crecen si se añade una determinada vitamina, por lo que deduce que los rayos X han dañado el gen correspondiente.

1944

Oswald Avery demuestra que el DNA es el factor transformante de Mendel, pero su teoría es rechazada por la creencia de que el DNA es una molécula demasiado sencilla para contener toda la información genética del individuo.

1944

Frederick Sanger utiliza un nuevo método llamado «cromatografía» para determinar la secuencia de aminoácidos de la insulina bovina.

1947

Barbara McClintock, una genetista americana, describe por primera vez los elementos transposables o genes saltarines.

1950

Erwin Chargaff establece que el DNA puede tener una secuencia tan específica como las proteínas, rechazando la teoría de que el DNA era una «sustancia estúpida», que no tenía especificidad. Estos datos fueron usados tres años más tarde para determinar la estructura del DNA.

1951

James Watson, un biólogo posdoctoral experto en genética de bacteriófagos, se mueve al laboratorio Cabendish, en Cambridge, para realizar experimentos de uso de rayos X y estudiar la estructura de las proteínas.

1951

Joshua Lederberg y Norton Zinder muestran que las bacterias pueden intercambiar genes por un método indirecto, que él llama transducción, en el que un virus extrae fragmentos de DNA de una bacteria y lo transporta a otra.

1952

Alfred Hershey y Martha Chase realizan un experimento en el que demuestran que es el componente nucleico del DNA y no las proteínas, las portadoras de la herencia. Para ello transfectan bacterias con un fago marcado con P32 y otras con S35. Observan que en las subsecuentes generaciones solo hay P32.

1952 Mediante microscopía electrónica se detectan estructuras intracelulares como los ribosomas. 1952 Jean Brachet sugiere que el RNA juega un papel en la síntesis de proteínas.

280

MANUAL DE NEUROGENÉTICA

1953

Utilizando un modelo de papel y metal, un equipo liderado por James Watson y Francis Crick, incluyendo a Maurice Wilkins y Rosalind Franklin, describen el modelo de doble hélice del DNA.

1957

Francis Crick y George Gamov postulan la «hipótesis secuencial» en la que la secuencia de DNA especifica la secuencia de proteína, y sugieren que la información genética fluye en una dirección solo, del DNA al mRNA, y de estos a la proteína, dentro de lo que se ha llamado el «dogma central de la biología».

1957

Matthew Meselson y Frank Stahl demuestran el mecanismo de replicación del DNA.

1958

Coenberg descubre y aísla la DNA polimerasa, la primera enzima utilizado para fabricar DNA en un tubo de ensayo.

1959

Francois Jacob y Jacques Monod establecen la existencia de regulación genética con funciones de control localizadas en el cromosoma que llaman represor y operón.

1961

Marshall Nirenberg construye una hebra de mRNA formada solo por uracilo, llamada poly-u y descubre que UUU es el codon de la fenilalanina, primer paso para descifrar el código genético.

1966

Marshall Nirenberg y Heinrich Mathaei descifran el código genético, demostrando que las secuencias de tres nucleótidos (codon) determina los 20 aminoácidos.

1970

Howard Temin y David Baltimore, trabajando independientemente, aíslan la «transcriptasa inversa», una enzima de restricción que corta el DNA es sitios específicos. En sus trabajos describen cómo el RNA viral que infecta la bacteria huésped usa esta enzima para integrarse en el DNA del huésped.

1970

Torbjorn Caspersson y L. Zech publican el primer método para teñir cromosomas en un patrón de bandas.

1972

Paul Berg aísla y emplea una enzima de restricción para cortar el DNA. Además, utiliza una ligasa para pegar dos moléculas de DNA y formar una molécula de DNA circular, obteniendo la primer molécula de DNA recombinante.

1973

Por primera vez se transfiere DNA de un ser vivo a otro. Stanley Cohen y Annie Chang de Stanford University y Herbert Boyer de UCSF unen secciones de DNA viral y bacteriano con la misma enzima de restricción, creando un plásmido con resistencia a antibióticos dual. Después unen este DNA recombinante con el DNA de la bacteria, creando el primer organismo con DNA recombinante.

1974

En el Proceedings of the National Academy of Sciences se publica un trabajo de Stanley Cohen y Herbert Boyer en el que se demuestra la expresión de un gen extraño implantado en una bacteria mediante DNA recombinante. Cohen y Boyer mostraron que el DNA se puede cortar con una enzima de restricción y reproducir mediante la inserción del DNA recombinante en la E. coli.

1976

J. Michael Bishop y Harold Varmus, virólogos de UCSF, demuestran que los oncogenes pueden aparecer en los cromosomas animales y que las alteraciones en su estructura o expresión pueden originar la aparición de tumores

1977

Genentech, Inc., describe la producción de la primera proteína humana producida en una bacteria, la somatostatina, siendo la primera vez que una gen recombinante se utiliza para clonar una proteína.

1977

Bill Rutter y Howard Goodman aíslan el gen de la insulina en la rata.

APÉNDICE II: SECUENCIA HISTÓRICA DE LA GENÉTICA

281

1977

Walter Gilbert y Allan Maxam en la Universidad de Harvard desarrollan un método para secuenciar DNA usando productos químicos en lugar de enzimas.

1978

Científicos de la Universidad de Stanford transplantan un gen de mamífero por primera vez.

1978

David Botstein et al. encuentran que cuando una enzima de restricción se aplica al DNA de diferentes individuos, los fragmentos resultantes difieren de una persona a otra. Estas variaciones se denominan «polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción o RFLP».

1981

Científicos de la Universidad de Ohio producen el primer animal transgénico transfiriendo genes de una animal a otro.

1981

Mary Harper et al. mapean el gen de la insulina. Ese año, el mapeo por hibridización in situ comienza a ser el método usual de mapeo.

1983

El estudio de una extensa familia de Venezuela con enfermedad de Huntington demuestra que los afectados tienen un patrón de RFLP diferente y característico.

1985

Kary Mullis en Cetus Corporation en Berkeley, California, descubre una técnica para multiplicar una secuencia específica de DNA in vitro, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En 1993 recibirá el premio Nobel por este descubrimiento.

1987

Hoffman y Brown aíslan la proteína distrofina, causante de la distrofia muscular de Duchenne.

1987

Cann, Stoneking y Wilson, siguiendo las mutaciones en el DNA mitocondrial, datan el origen del hombre a un antecesor africano.

1988

Wexler, Conneally y Gusella asocian la enfermedad de Huntington a un locus en el cromosoma 4.

1990

Primer paciente tratado con terapia génica.

1996

Se completa el mapa genético del ratón y la secuencia del genoma de la levadura.

1997

Se secuencia el genoma de la E. coli.

2000

Toni Blair y Bill Clinton, en una conferencia conjunta vía satélite, anuncian la finalización del primer borrador de la secuencia del genoma humano.

Glosario de términos

Adenina (A): Base nitrogenada, miembro del par de bases A-T (adenina-timina). ADN mitocondrial: DNA codificante de 13 polipéptidos que se hospedan en las mitocondrias en vez de en el núcleo. Por ello se hereda sólo de la madre. ADN recombinante: Secuencia de DNA original formada por la combinación de dos moléculas de DNA no homólogas. Affected sib-pair: Test para el ligamiento entre un marcador de un locus y un locus mutado que considera los genotipos de dos o más descendientes afectados. Agregación familiar: La tendencia de un rasgo a agruparse en familias. Evidencia genética en la causa de la enfermedad. Alelo: Cada una de las diferentes formas alternativas de un mismo locus genético. Alelo dominante: Alelo cuyo efecto fenotípico se expresa tanto si el organismo es homocigoto como heterocigoto para ese alelo. Alelo recesivo: Alelo cuyo efecto genotípico se expresa sólo en la situación de homocigosis. Alelos codominantes: Par de alelos alternativos que son completamente expresados en el heterocigoto. Alteraciones monogénicas: Alteraciones hereditarias ocasionadas por la mutación de un alelo de un único gen (p. ej.: Distrofia muscular de Duchenne, retinoblastoma, etc.). Comparar con alteraciones poligénicas. Alteraciones multifactoriales o multigénicas: Ver alteraciones poligénicas. Alteraciones poligénicas: Alteraciones génicas resultado de la acción combinada de alelos de más de un gen (ejemplo: alteraciones de corazón, diabetes y algunos cánceres). Aunque tales alteraciones son heredadas, dependen de la presencia de simultánea de varios alelos. De este modo los patrones hereditarios son normalmente más complejos que los de las alteraciones monogénicas. Comparar con alteraciones monogénicas.

Aminoácido: Molécula que se combina para formar proteínas. La secuencia de los aminoácidos en una proteína y consecuentemente su función, viene determinada por el código genético. Amplificación: Producción de copias adicionales de una secuencia de DNA. Amplímero: Oligonucleótido pequeño (15-25 bases) que sirve como cebador para la amplificación del DNA. Ver cebador. Análisis de asociación: Método de análisis genéticos que compara la frecuencia de alelos entre individuos afectados y no afectados. Un alelo se considera asociado con la enfermedad si dicho alelo aparece en una frecuencia significativamente alta entre los individuos afectados. Análisis de conformación de hebra única (singlestranded conformation, SSCP): Método utilizado para detectar variaciones en las secuencias de DNA en un gen de interés. Se basa en el hecho de que hebras individuales de DNA que difieren en su secuencia en una base migrarán de un modo diferente en un gel de electroforesis. Análisis de ligamiento: Método estadístico para detectar ligamiento entre diferentes loci utilizando familias. Análisis multipunto: Análisis de ligamiento que considera tres o más loci. Análisis de la secuencia de bases: Método, en ocasiones automatizado, para determinar la secuencia de bases. Análisis de segregación: Método de análisis genéticos que evalúa cuándo un patrón observado de los fenotipos de familias es compatible con un modelo de herencia explícito. Animal knock-out: Animales que han sido sometidos a ingeniería genética para contener una mutación nula (mutación cuyo resultado es la ausencia completa del producto génico funcional) en un gen de interés. Animal transgénico: Animal cuyo genoma ha sido modificado para contener un nuevo DNA aplicado externamente.

283

284

MANUAL DE NEUROGENÉTICA

Anticipación: Suceso en el que un rasgo heredado incrementa su gravedad progresivamente (manifestándose cada vez síntomas más severos, mayor riesgo de recurrencia y/o edad más temprana de ataque) sobre sucesivas generaciones. Antígeno: Molécula cuya forma dispara la producción de anticuerpos que la reconocerán y se unirán a ella. Arrayed library (librerías ordenadas): Clones recombinantes primarios individuales (hospedados en fagos, cósmidos, YAC, u otro vector), que son situados en un orden de dos dimensiones en placas. Cada clón primario puede ser identificado por identificación de la placa y de la localización del clón (fila y columna) en dicha placa. Arrayed libraries de clones pueden usarse para diversas aplicaciones, incluida el examen de un gen específico o una región genómica de interés, así como para un mapa físico. La información recogida de los clones individuales de varios ligamientos genéticos y mapas físicos analizados entra dentro de una base de datos y se utiliza para construir mapas físicos y genéticos simultáneamente; los identificadores de clones sirven para relacionar los mapas de distintos niveles. Comparar con biblioteca, biblioteca genómica. Autorradiografía: Procedimiento en el que se expone una placa radiográfica a una membrana que contiene una sonda marcada radiactivamente para su localización. Autosoma: Cromosoma no involucrado en la determinación sexual. El genoma humano, que es diploide, consiste en 46 cromosomas, de los cuales 22 pares son autosomas y el par restante son los cromosomas sexuales (cromosomas X e Y). Bacteriófago: Virus que infecta a bacterias. Banco de clones: Ver biblioteca genómica. Base nitrogenada: Molécula que contiene nitrógeno con las propiedades químicas de las bases. Biblioteca: Colección de clones cuya relación con los demás puede ser establecida por mapas físicos. Comparar con biblioteca genómica, arrayed library. Biblioteca genómica: Colección de clones fabricada desde un conjunto de fragmentos superponibles generados aleatoriamente de DNA representando el genoma entero de un organismo. Comparar con biblioteca, arrayed library. Biotecnología: Conjunto de técnicas biológicas desarrolladas a través de investigación básica y aplicadas ahora para la investigación y desarrollo de productos. En particular, el uso de la industria de DNA recombinante, fusión de células y nuevas técnicas de bioprocesamiento. Cariotipo: Microfotografía de los cromosomas de un individuo concertadas en un formato estándar mostrando el número, tamaño y forma de cada clase de cromosomas. Se utiliza en mapas físicos de baja re-

solución para relacionar cromosomas gruesos anormales con las características de enfermedades específicas. Cariotipo de flujo: Uso de la citometría de flujo para analizar y/o separar cromosomas en base a su contenido de DNA. cDNA: ver DNA complementario. Cebador (primer): Secuencia corta de DNA, que aparea con una hebra de DNA y proporciona un extremo 3’ terminal libre, en el que comienza la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos la DNA polimerasa. Célula eucariote: Célula que posee una membrana conteniendo al núcleo y otras organelas. Células somáticas: Cualquier célula en el cuerpo excepto los gametos y sus precursores (→ cuyo gen no puede contribuir sobre posteriores generaciones). Células no germinales. Centimorgan (cM): Unidad de medida de la frecuencia de recombinación. Un centimorgan equivale al 1% de probabilidad de que un marcador situado en un locus genético sea separado de un marcador situado en un segundo locus debido al sobrecruzamiento en una generación individual. En seres humanos, 1 centimorgan equivale, de media, a 1 millón de pares de bases. Centrómero: Región especializada del cromosoma donde las fibras del huso acromático se enganchan durante la división de la célula. Cistrón: Segmento de DNA correspondiente a una cadena polipeptídica, más las señales de iniciación y parada. Citometría de flujo: Análisis de material biológico por detección de la luz absorbida o propiedades fluorescentes de células o fracciones subcelulares (p. ej., cromosomas), pasando por una estrecha corriente de rayos láser. Se produce un perfil de absorbancia o fluorescencia de la muestra. Un dispositivo de clasificación automática, usado para fraccionar las muestras. Citosina (C): Base nitrogenada, miembro del par de bases G-C (guanina y citosina). Clon: Una unidad de un grupo de células genéticamente idénticas de organismos derivados de un antecesor común. Clonación: Proceso mediante el que se producen un número grande de fragmentos idénticos de DNA, normalmente para generar una sonda para un gen específico. Clonación posicional (genética inversa): El uso de técnicas de mapeo molecular para identificar un gen, determinando su posición exacta en el genoma, normalmente en ausencia de información alguna sobre su función. Clones: Grupo de células procedentes o derivadas de un antecesor único.

GLOSARIO DE TÉRMINOS

Clones recombinantes: Clones que contienen moléculas de DNA recombinante. Ver técnicas de DNA recombinante. Clones solapados: Ver biblioteca genómica. Código genético: Secuencia de nucleótidos, codificada en tripletes (codones) a lo largo del mRNA, que determina la secuencia de aminoácidos en la síntesis de proteínas. La secuencia de DNA de un gen puede utilizarse para predecir la secuencia del mRNA y, gracias al código genético, predecirse la secuencia de aminoácidos. Codon: Secuencia de tres nucleótidos que especifica un determinado aminoácido. Contig map: Mapa que representa el orden relativo de una biblioteca ligada de pequeños clones solapados que representan un segmento cromosomal completo. Contigs: Grupos de clones que representan regiones solapadas de un genoma. Cosegregación: La tendencia de dos alelos a permanecer juntos durante la meiosis. Cósmido: Vector de clonación construido artificialmente que contiene el gen cos de fago lambda. Los cósmidos pueden ser empaquetados en fagos lambda para infectar dentro de E. coli. Esto permite clonar fragmentos de DNA más grandes (superiores a 45 kb) que los que pueden ser introducidos dentro de bacterias huésped por vectores de tipo plásmidos. Cromosoma artificial de levadura (YAC): Vector utilizado para clonar fragmentos de DNA (superiores a 400 Kb). Se construye a partir de los telómeros, centrómero y secuencias de los orígenes de replicación necesarios para la replicación en las células de levadura. Comparar con vector de clonación, cósmido. Cromosomas: Estructuras genéticas de autorreplicación existentes en las células, que contienen el DNA celular que lleva en su secuencia de nucleótidos el orden lineal de los genes. En procariontes, el DNA cromosomal es circular y el genoma íntegro está en un único cromosoma. El genoma en eucariontes consiste en un número de cromosomas cuyo DNA está asociado con diferentes tipos de proteínas. Cromosomas homólogos: Par de cromosomas que contienen la misma secuencia génica lineal, cada uno procedente de un parental. Cromosomas sexuales: Los cromosomas X e Y en los seres humanos, que determinan el sexo de un individuo. Las hembras tienen dos cromosomas X en sus células diploides, mientras que los machos poseen un cromosoma X y otro Y. Los cromosomas sexuales componen el vigésimotercer par de cromosomas en un cariotipo. Comparar con autosoma. Crossing-over: Ver sobrecruzamiento. Delección: Mutación resultado de la pérdida de un segmento de DNA del gen.

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Deriva genética: Cambios acumulados sobre la frecuencia génica en sucesivas generaciones debido a las fluctuaciones del azar. Esto puede ocasionar que determinados alelos desaparecieran de la población. Desequilibrio de ligamiento: Situación en la cual la frecuencia de un determinado haplotipo en una población no es igual al producto de su respectiva frecuencia alélica. La asociación entre alelos de diferente loci en la población. Desnaturalización: Proceso de paso del estado de doble hebra al de hebra sencilla. Desoxirribonucleótido: Ver nucleótido. Diploide: Conjunto completo de material genético, consistente en pares de cromosomas (un cromosoma de cada conjunto parental). La mayoría de las células animales, excepto los gametos, tienen su conjunto de cromosomas diploide. El genoma humano, que es diploide, tiene 46 cromosomas. Comparar con haploide. Disyunción meiótica: Separación de las cromátidas hermanas (un cromosoma y su réplica) durante la meiosis. DNA (ácido desoxirribonucléico): Molécula que contiene la información genética. El DNA es una molécula de doble cadena, que posee uniones débiles entre los pares de bases de nucleótidos. Los cuatro nucleótidos del DNA contienen las bases: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Las pares de bases se forman tan solo entre A y T y entre G y C. De este modo, la secuencia de base de cada cadena individual puede ser deducida de su pareja. DNA complementario (cDNA): DNA generado a partir de un mRNA utilizando una transcriptasa inversa. DNA exógeno: DNA originado fuera de un organismo. DNA recombinante: Molécula de DNA producida por la inserción de un trozo de DNA en otra molécula de DNA. Doble hélice: Forma que dos cadenas lineares de DNA adoptan cuando están unidas. Dominio: Porción discreta de una proteína, que posee función propia. La combinación de dominios en una proteína determina su función completa. E. coli (Escherichia coli): Bacteria común que ha sido estudiada intensamente por genetistas debido a su pequeño tamaño genómico, a que carece de patogenicidad, y a su facilidad de crecimiento en el laboratorio. Efecto epigenético: Cambio que puede heredarse en la expresión de un gen que no está asociado a alteraciones en la secuencia de DNA del gen (por ejemplo, un gen puede ser inactivado por la metilación de su DNA). Efecto fundador: Cuando un pequeño grupo de individuos se separa de la población para fundar una nueva colonia, los genes de ese pequeño grupo no serán representativos frente a aquellos genes de la población

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original. De este modo, la frecuencia alélica en las siguientes generaciones variará enormemente de las frecuencias alélicas de la población original. Electroforesis: Método de separación de grandes moléculas (como fragmentos de DNA o proteínas) de una mezcla de moléculas similares. Una corriente eléctrica pasa a través del medio que contiene la mezcla, y cada tipo de molécula viaja a través del medio una diferente proporción, dependiendo de su carga eléctrica y tamaño. La separación se basa en estas diferencias. Los geles de agarosa y acrilamida son comúnmente el medio usado para la electroforesis de proteínas y ácidos nucleicos. Endonucleasas: Enzimas que hidrolizan moléculas de DNA de doble hebra atacando en lugares del interior de la molécula. Para ello han de reconocer secuencias específicas en el DNA, donde realizaran el corte. Las bacterias contienen alrededor de 1.000 endonucleasas que reconocen y cortan en 400 secuencias de DNA diferentes. Ver lugar de corte de enzimas de restricción. Enfermedades monogénicas: Enfermedades en las que se encuentra afectado un solo gen. Enzima: Proteína que actúa como catalizador, aumentando la velocidad de las reacciones bioquímicas, pero no altera la dirección ni la naturaleza de la reacción. Enzimas de restricción: Enzimas bacterianas que reconocen una secuencia específica de nucleótidos en un DNA de doble hebra, rompiendo ambas cadenas. Se denominan también endonucleasas de restricción. La rotura se produce en un lugar dentro o próximo al de reconocimiento. Epístasis: Forma de interacción genética en la cual un gen altera o suprime la expresión fenotípica de otro gen no alélico (por ejemplo, si existe una mutación nula en un gen que se requiere previamente en una vía metabólica, cualquier gen que funcione después en dicha vía será enmascarado. Equilibrio de Hardy-Weinberg: Fenómeno por el cual, en ausencia de mutación, migración, selección natural o deriva genética, y bajo un apareamiento aleatorio, la distribución de la frecuencia de los genotipos AA, Aa y aa quedan constantes como p2, 2pq y q2, respectivamente(donde p y q son las frecuencias de los alelos A y a en la población). EST: Expressed sequence tag. Secuencia parcial de una molécula de RNA mensajero que representa una secuencia de DNA expresada. Eucarionte: Célula o organismo con membrana plasmática, núcleo y citoplasma. Eucariontes incluye todos los organismos excepto virus, bacterias y algas azules y verdes. Comparar con procariontes. Ver cromosomas. Exón: Porción de un gen que se traduce a una proteína. Exonucleasas: Enzima que rompe nucleótidos secuencialmente desde los extremos libres de un substrato lineal de ácidos nucleicos.

Expresión génica: Proceso por el cual la información del código genético se convierte en estructuras presentes y funcionales en la célula. Genes expresados incluye aquellos que son transcritos a mRNA y después traducidos a proteínas y aquellos que son transcritos a RNA pero no traducidos a proteínas (p. ej., rRNA y tRNA). Expresión pleiotrópica: Situación en la cual un alelo tiene más de un efecto fenotípico. Fago: Virus cuyo huésped natural son las células bacterianas. Familia de densidad elevada: Familia que contiene múltiples individuos afectados, frecuentemente en varias generaciones. Familias de genes: Grupos de genes relacionados que sintetizan productos similares. Fase: Combinación particular de alelos que sucede en un mismo cromosoma en un individuo con doble heterocigosidad. Fenocopia: Cuando el ambiente provoca un fenotipo similar al producido por una mutación genética. Fenotipo: Apariencia u otra característica de un organismo, que resulta de la interacción de su constitución genética con el ambiente. FISH (hibridación fluorescente in situ): Sistema de mapeo físico que utiliza tinción con fluoresceina para detectar hibridación de sondas en cromosomas metafásicos y en la cromatina interfásica somática. Franja de lectura (open reading frame; ORF): Secuencia de codones que determina la lectura de bases en grupos de tres, empezando con el codon de iniciación. Gameto: Célula reproductiva madura masculina o femenina (espermatozoide u óvulo) con número haploide de cromosomas (23 en humanos). Gen: Secuencia de nucleótidos del DNA que codifica una proteína. Incluye regiones anteriores y posteriores a la región codificante, así como secuencias interpuestas (intrones) entre segmentos codificantes (exones). Gen estructural: Gen que codifica para la secuencia de aminoácidos de un producto proteico. Genética inversa: Proceso de identificación de un gen en base a su localización cromosómica. Ver clonaje posicional. Genoma: Conjunto completo de factores hereditarios de un organismo contenido en los cromosomas. Genotipo: Constitución genética de un organismo. Conjunto de genes de un individuo que pueden o no expresarse. Guanina (G): Base nitrogenada, miembro del par de bases G-C (guanina y citosina). Haploide: Conjunto individual de cromosomas (la mitad del total del material genético), presente en el óvulo y espermatozoide de animales y en el óvulo y polen en plantas. Los seres humanos tienen 23 pa-

GLOSARIO DE TÉRMINOS

res de cromosomas en sus gametos. Comparar con diploide. Herencia mendeliana: Herencia en la cual los rasgos son controlados por un gen individual y siguen el patrón de herencia de las leyes de segregación de Mendel. Heterocigosidad: La presencia de diferentes alelos en uno o más loci en cromosomas homólogos. Heterocigoto: Situación en la que los alelos de un gen particular son diferentes. Heterocigoto compuesto: Organismo que es heterocigoto para dos diferentes (mutados) alelos en un locus individual. Heterogeneidad alélica (también heterogeneidad intralocular): Forma de expresión genética en la cual alelos mutantes diferentes en el mismo locus inducen el mismo fenotipo «enfermo». Heterogeneidad genética: Situación en la cual distintos genes mutados producen el mismo fenotipo. Heterogeneidad no alélica( también heterogeneidad interlocus): Situación en la cual alelos mutados de distintos loci inducen el mismo fenotipo mutador. Heteroplasmia: Condición en la cual una célula contiene mitocondrias diferentes genéticamente. Hibridación: Proceso de unión por complementación de pares de bases entre dos hebras sencillas de DNA, DNA y RNA o RNA con y sin sentido. Hibridación cruzada: Unión de una sonda de DNA específica con otro DNA blanco como consecuencia de la homología entre el blanco y la sonda. Hibridación en filtro: Hibridación que se realiza incubando una preparación de DNA desnaturalizado inmovilizado sobre un filtro de nitrocelulosa con una solución de RNA o DNA marcado. Hibridación in situ: Uso de sondas de DNA o RNA marcadas para localizar secuencias complementarias dentro de una célula. Homeobox: Pequeña extensión de nucleótidos cuya secuencia de bases es virtualmente idéntica en todos los genes que la contienen. Ha sido encontrado en muchos organismos desde moscas hasta seres humanos. En la mosca, un homeobox parece que determina cuando grupos particulares de genes tienen que expresarse durante el desarrollo. Homocigoto: Situación en la que los alelos de un gen particular son iguales. Homologías: Semejanzas en el DNA o secuencias de proteínas entre individuos de la misma especie o de especies diferentes. Homoplasmia: Condición en la cual la célula contiene mitocondrias y/o cloroplastos genéticamente iguales. Impronta génica (imprinting): Diferente expresión de un gen dependiendo del progenitor que lo transmita. Interfase: Periodo en el ciclo de las células donde el DNA es replicado en el núcleo. Este periodo viene seguido de mitosis.

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Intrón: Porción de un gen que no se traduce a proteína, aunque se transcriba a RNA. Secuencia interpuesta, no codificante. Kilobase (Kb): 1.000 pares de bases de DNA o 1.000 bases de RNA. Ligamiento: Tendencia de los genes a heredarse juntos como resultado de su localización en el mismo cromosoma. Se mide en forma de porcentaje de recombinación entre loci. La proximidad de dos o más marcadores (p. ej., genes, marcadores RFLP) en un cromosoma; cuanto más juntos estén los marcadores, menor será la probabilidad de su separación durante los procesos de reparación y replicación del DNA (fisión binaria en procariontes, mitosis o meiosis en eucariontes), y por tanto aumenta la probabilidad de que se hereden juntos. Localizar: Determinación de la posición inicial (locus) de un gen o de otro marcador en un cromosoma. Locus (pl. loci): Lugar en un cromosoma donde se localiza un gen. LOD scores (log odds scores): Estadístico calculado en análisis de ligamiento, utilizada como medida de probabilidad de ligamiento. Este parámetro se calcula como el logaritmo de la ratio de la probabilidad de observar un patrón de rasgos si existe ligamiento respecto a la probabilidad de observar ese patrón si no se presenta el ligamiento. Lugar de corte de enzimas de restricción: Secuencias de DNA específicas, en las cuales una enzima de restricción específica realiza un corte. Algunos de estos lugares se encuentran de manera frecuente en el DNA (por ejemplo, cada varios cientos de pares de bases), y otros de manera menos frecuente, por ejemplo, cada 10.000 pares de bases). Mapa físico: Mapa de la localización de marcadores identificables en el DNA (p. ej.: lugares de corte de enzimas de restricción, genes, etc.) independientemente de su herencia. La distancia se mide en pares de bases. En el genoma humano, el mapa físico de baja resolución es el patrón de bandas en los 24 distintos cromosomas. Los mapas físicos de alta resolución nos dan la secuencia completa de nucleótidos de los cromosomas. Mapa genético: Ver mapa de ligamiento. Mapa de ligamiento: Mapa de la posición relativa de los loci en los cromosomas, determinada en la base de la frecuencia en que los loci se heredan juntos. La distancia se mide en centimorgans (cM). Mapa de restricción: Disposición lineal de los lugares de un DNA donde rompen diversas enzimas de restricción. Mapa de transcripción: Mapa genómico que aporta información sobre la localización física de secuencias de DNA expresadas (expressed sequence tags), así como secuencias de la región de expresión.

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Mapeo de genes: Determinación de la posición relativa de genes en una molécula de DNA (cromosoma o plásmido), y de la distancia, en unidades de ligamiento o en unidades físicas, entre ellos. Marcador: Localización física identificable en un cromosoma (p. ej.: lugar de corte de una enzima de restricción, genes, etc.) cuya herencia puede ser monitorizada. Los marcadores pueden estar localizados en regiones de DNA (genes) o algún segmento de DNA sin función codificante, pero cuyos patrones de herencia pueden ser determinados. Ver RFLP. Material genético: Ver genoma. Megabase (Mb): Unidad de longitud para fragmentos de DNA equivalente a un millón de nucleótidos y aproximadamente a 1 cM. Meiosis: Proceso de dos divisiones celulares consecutivas que se da en los progenitores diploides de los gametos. Se forman finalmente cuatro células hijas tras la segunda división meiótica, cada una con un número haploide de cromosomas. Metafase: Estado en meiosis o en mitosis durante el cual los cromosomas están alineados a lo largo del plano ecuatorial de la célula. Método shotgun: Clonación de fragmentos de DNA generados de forma aleatoria de un genoma. Ver biblioteca, biblioteca genómica. Microsatélite: Tipo de polimorfismo del ADN, consistente en una pequeña secuencia de pares de bases que se encuentra en la forma de tandem repeats (dos o tres pares de bases con n repeticiones), un número variable de veces. Son utilizados en genética como marcadores para el análisis de ligamiento. Modelo oligogenético: Situación en la cual muchos genes con efectos moderados interaccionan para generar el fenotipo observado. Modo de herencia poligénico: Situación en la cual un número elevado de genes con pequeños efectos interaccionan para producir el fenotipo observado. Molécula de DNA recombinante: Combinación de moléculas de DNA de diferente origen que se unen mediante técnicas de DNA recombinante. Multifactorial: Rasgo que está influenciado por múltiples factores genéticos y/o múltiples factores ambientales. Mutación: Cualquier cambio de la secuencia de DNA genómico. Mutación en el aparato de splicing (splice donor site): Mutación que sucede entre un exón y un intrón, donde el siguiente exón debería unirse. Mutación que interrumpe la formación de productos génicos funcionales por romper el splicing de dicho gen. Mutación frameshift: Alteración en la lectura de una parte de un gen debido a la inserción o delección de una o más pares de bases (pero no un múltiplo de tres). Este tipo de mutaciones normalmente conducen a proteínas no funcionales.

Mutación germinal: Mutación que se da en las células germinales o en las células que están destinadas a convertirse en células germinales. Mutación missense: Mutación que altera un codon, tal que este codifica un nuevo aminoácido. Mutación nonsense: Mutación que altera un codon generando un codon de parada. Mutación nula: Mutación que provoca la pérdida completa de la funcionabilidad del producto génico. Mutación pseudodeficiente: Mutación que aparenta causar un fenotipo deficiente, el cual, en realidad es normal. Mutación regulatoria: Mutación en un gen regulatorio, como por ejemplo un gen encargado de la regulación de la expresión de otros genes. Mutación somática: Mutación que sucede en cualquier célula somática, por lo que no podrá ser heredado. Mutagénesis: Cualquier proceso que induzca un cambio en el material genético. Northern blot: Técnica en la que se inmoviliza RNA sobre un soporte sólido tras su separación electroforética, de acuerdo con su tamaño, para una posterior hibridación. Núcleo: Organela celular exclusiva de células eucariontes que contiene el material genético. Nucleótido: Subunidad de DNA o RNA consistente en una base nitrogenada (adenina, citosina, guanina o timina en DNA; adenina, citosina, guanina o uracilo en RNA), una molécula de fosfato, y un glúcido (desoxirribosa en el DNA y ribosa en el RNA). Miles de nucleótidos se unen para formar una molécula de DNA o de RNA. Ver DNA, par de bases, RNA. Open reading frame (ORF): Ver franja de lectura. Ortólogo: gen propio de esa especie. En sentido más amplio, genes funcionalmente equivalentes (p. ej., presenilina 1 de ratón y humano. Por el contrario, paralogo. Par de bases (bp): Par de A con T o C con G en una doble hélice de DNA. Paralogo: gen con secuencia similar, que por lo tanto codifica una proteína con la misma función, en el genoma de un mismo individuo (p. ej., presenilina 1 y presenilina 2). Penetrancia: La proporción de individuos con un genotipo específico el cual se manifiesta al nivel fenotípico. Pirimidina: Componente básico que se encuentra en ácidos nucleicos, de doble anillo, que posee nitrógeno. Las pirimidinas en DNA son citosina y timina, y en RNA citosina y uracilo. Plásmido: Pequeño trozo de DNA circular extracromosómico y autorreplicante que se encuentra en algunas bacterias. Polimerasa, DNA o RNA: Enzimas que catalizan la síntesis de ácidos nucleicos sobre moldes de áci-

GLOSARIO DE TÉRMINOS

dos nucleicos preexistentes formando RNA desde ribonucleótidos o DNA desde desoxirribonucleótidos. Polimorfismo: Cambio en un alelo de un gen que tiene una frecuencia mayor del 1% de la población. Primer: Pequeña cadena de polinucleótidos a la cual nuevos desoxirribonucleótidos pueden ser añadidos por la DNApolimerasa. Procarionte: Célula u organismo que carece de núcleo. Las bacterias son procariontes. Comparar con eucarionte. Ver cromosomas. Producto génico: Material bioquímico, RNA o proteína, resultado de la expresión de un gen. La cantidad de producto génico es utilizado para medir la actividad del gen. Promotor: Secuencia de DNA a la que se una la RNApolimerasa y que se utiliza para comenzar a transcribir el DNA molde en RNA. Proteasa: Enzima que parte proteínas. Proteína: Gran molécula compuesta de una o más cadenas de aminoácidos en un orden específico. El orden viene determinado por la secuencia de bases de nucleótidos y por el código genético. Las proteínas se requieren para la estructura, función y regulación de las células, tejidos y órganos, y cada proteína tiene funciones únicas. Ejemplos de proteínas son las hormonas, enzimas y anticuerpos. Proyecto Genoma: Investigación y trabajo tecnológico desarrollado para lograr el mapeo y secuenciación de algunos o de todos los genomas de los seres humanos y de otros organismos. Purina: Componente básico que se encuentra en ácidos nucleicos, con forma de anillo independiente que contiene nitrógeno. Las purinas en DNA y en RNA son adenina y guanina. Rasgo complejo: rasgo que tiene múltiples determinaciones, las cuales pueden ser genéticas, ambientales, o ambas. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Técnica enzimática para crear entre 105 y 107 copias de una secuencia de DNA. Reasociación de DNA: Emparejamiento de hebras sencillas para formar una doble hélice. Recombinación: Proceso por el cual la progenie presenta una combinación de genes en los cromosomas diferentes de la de los padres. En organismos superiores, esto ocurre por crossing over. Región o secuencia reguladora: Secuencia de DNA que controla la expresión de un gen. Renaturalización: Reasociación de hebras sencillas complementarias desnaturalizadas de un DNA de doble hebra. Replicación del DNA: El uso de una molécula de DNA existente, la cual actúa como molde, para la síntesis de una nueva cadena de DNA. En humanos y en

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otros eucariontes, la replicación se da en el núcleo de las células. Resolución: El grado de detalle en un mapa físico de DNA, alineados de bajo a alto. RFLP (restriction fragment length polymorphim): Variación entre individuos en los tamaños de los fragmentos de corte de DNA de las enzimas de restricción. Secuencias polimórficas que resultan en RFLPs se utilizan como marcadores en ambos mapas físicos y de ligamiento genético. RFLPs son, en ocasiones, causadas por mutaciones, originándose nuevos lugares de corte. Ver marcadores. Ribonucleótido: Nucleótido que contiene ribosa. Ver nucleótido. Ribosomas: Pequeños componentes celulares compuestos por especializados RNA ribosomales y por proteínas. En ellos se da la síntesis proteica. Ver ácido ribonucleico (RNA). Rigurosidad: Condiciones de hibridación que aumentan la especificidad de la unión entre una sonda y el fragmento inmovilizado. El aumento de la temperatura o el descenso de la fuerza iónica producen un aumento de la rigurosidad. RNA (ácido ribonucleico): Molécula de ácido nucleico que se encuentra en el núcleo y citoplasma de las células. Juega un importante papel en la síntesis de proteínas y en otras actividades químicas de la célula. La estructura del RNA es similar a la del DNA. Existen varias clases de moléculas de RNA: RNA mensajero, RNA ribosomal, RNA transferente y otros pequeños RNAs, cada uno con diferente función. RNA mensajero (mRNA): RNA que sirve como molde para la síntesis proteica. Ver código genético. RNA ribosomal (rRNA): Clase de RNA que se encuentra en los ribosomas de las células. RNA transferente (tRNA): Clase de RNA que posee estructuras con tripletes de nucleótidos que son complementarios a los tripletes de nucleótidos en la secuencia de un mRNA. El papel de los tRNAs en la síntesis de proteínas es unirse a aminoácidos y transferirlos a los ribosomas, donde las proteínas se van formando de acuerdo al código genético que transporta el mRNA. Secuencia complementaria: Secuencia de bases de ácidos nucleicos que pueden formar una estructura de doble hélice por unión de pares de bases. La secuencia complementaria de GTAC es CATG. Secuencia conservada: Una secuencia de bases en una molécula de DNA (o una secuencia de aminoácidos en una proteína) que ha permanecido incambiable a lo largo de la evolución de las especies. Secuencia de bases: El orden de las bases nucleicas en una molécula de DNA. Secuencia de DNA: Orden relativo de pares de bases, ya sea en un fragmento de DNA, en un gen, en un cro-

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mosoma, o en el genoma entero. Ver análisis de secuencia de bases. Secuencias dinámicas: secuencias de repeticiones de tripletes inestables (secuencias de DNA compuestas de pares de bases repetidas en tripletes) que tienden a expandir su número en sucesivas generaciones. Secuencias de tandem repeat: Múltiples copias de la misma secuencia de bases en un cromosoma. Son utilizadas como marcadores en los mapas físicos. Secuencia salvaje. Secuencia de la población. Secuencia que no contiene mutaciones. Secuenciación: Determinación del orden de nucleótidos (secuencia de bases) en una molécula de DNA o RNA, o el orden de aminoácidos de una proteína. Señal de terminación: Codon que indica a la maquinaria de síntesis proteica de la célula que ha de terminar la síntesis de proteínas. Sequence tagged site (STS): Pequeña secuencia de DNA (de 200 a 500 pares de bases) que tiene única ocurrencia en el genoma humano y cuya localización y secuencia de bases son conocidas. Es detectable por PCR, y son útiles para la localización y orientación de mapas y datos de secuencias presentadas por diferentes laboratorios, y sirve como marcador en el desarrollo de mapas físicos del genoma humano. Expressed sequence tags (ESTs) son STSs derivados de cDNAs. Sinténico: Localizado en el mismo cromosoma. Sobrecruzamiento: La ruptura durante la meiosis de un cromosoma materno y otro paterno, el intercambio de las correspondientes secciones de DNA y la posterior unión de los cromosomas. En este proceso puede originarse un intercambio de alelos entre los cromosomas. Comparar con recombinación. Sonda: Fragmento o secuencia de DNA o RNA que híbrida con una secuencia complementaria de nucleótidos en otro ácido nucleico o molécula blanco de hebra sencilla. Sondas de oligonucleótidos alelo específicas (ASO): Sondas cortas (20-25 nucleótidos) de hebra sencilla que difieren en un único nucleótido y que reconocen mutaciones puntuales en un DNA blanco. Southern blot: Técnica en la que se transfiere el DNA que previamente se ha separado por electroforesis a un soporte inmóvil y se liga al soporte como hebra sencilla, de forma que puede hibridar con otras moléculas. Splice site: Unión entre un intrón y un exón en el ARN mensajero. El corte para expulsar el intrón ha de realizarse en dicho lugar. TDT: transmission disequilibrium test: Test que considera padres que son heterocigotos para un alelo problema para evaluar que alelo se transmite afectando a la descendencia. Técnicas de DNA recombinante: Procedimiento utilizado para unir segmentos de DNA en un medio fuera

de la célula u organismo. En condiciones apropiadas, una molécula de DNA recombinante puede entrar en una célula y replicarse allí, de manera autónoma a la célula o después de integrarse en algún cromosoma de la célula. Técnicas de ingeniería genética: Ver técnicas de DNA recombinante. Telómero: Extremo final de los cromosomas. Estas estructuras especializadas intervienen en la replicación y en la estabilidad de las moléculas lineares de DNA. Ver replicación del DNA. Terapia de génica: Inserción de un DNA normal en células para corregir un defecto genético. Timina (T): Base nitrogenada, miembro del par de bases A-T (adenina-timina). Tipo salvaje: Genotipo y fenotipo predominante de un organismo dado que se encuentra en la naturaleza y en el laboratorio. Transcripción: Síntesis de una copia de DNA desde una secuencia de DNA (un gen). Es el primer paso en el proceso de expresión de un gen. Comparar con translación. Transcriptasa inversa: Enzima que sintetiza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA. Transfección: Proceso de captura de un DNA extraño por el organismo huésped. Transformación: Proceso de manipulación química o eléctrica de células huésped para hacerlas capaces de aceptar un DNA extraño. Translación: Proceso por el cual el código genético que transporta el mRNA dirige la síntesis de proteínas desde aminoácidos. Comparar con transcripción. Translocación: Cambio de material genético entre cromosomas. Unidad de recombinación: Unidad de medida utilizada para medir la distancia entre genes en un mapa genético. Una unidad de recombinación equivale a una frecuencia de recombinamiento de un 1% entre dos genes. Uracilo (U): Base nitrogenada que sólo se encuentra en el RNA. Esta base es capaz de formar un par de bases con adenina. Vector: Virus, plásmido o cósmido que transporta un DNA extraño a un organismo hospedador. Vector de clonación: Molécula de DNA procedente de un virus, plásmido o la célula de un organismo mayor, en los cuales se integra otro fragmento de DNA de tamaño apropiado, sin que se pierda la capacidad de autorreplicación del vector. Estos vectores introducen DNA extraño en las células huésped, donde se replica en grandes cantidades. Ejemplos son: plásmidos, cósmidos, YACs (cromosoma artificial de levadura). Los vectores son frecuentemente moléculas recombinantes que contienen secuencias de DNA procedentes de varias fuentes.

GLOSARIO DE TÉRMINOS

Vector de expresión: Pequeño plásmido que contiene un lugar de clonaje múltiple flanqueado por una o dos secuencias promotoras. Estos promotores se requieren para transcribir los fragmentos de DNA insertados en el lugar de clonaje múltiple. Vector lanzadera: Pequeño plásmido capaz de producir transfección en células procarióticas y eucarióticas. Virus: Entidad biológica no celular que puede reproducirse sólo dentro de una célula huésped. Poseen una molécula de ácido nucleico rodeada por una cubierta proteica. Algunos virus animales están rodeados

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también por membrana. Dentro de la célula infectada, el virus utiliza la capacidad de síntesis de la célula huésped para producir virus hijos. VNTRs: variable number of tandem repeats (también minisatélites): Tipo de polimorfismo debido a la variedad en el número de repeticiones en tándem de ciertas secuencias de DNA de tamaño moderado en regiones no codificantes. Se utiliza como marcador genético en análisis de ligamiento. Western-blot: Técnica por la que las proteínas separadas por electroforesis se llevan a un soporte sólido donde reaccionan con otra molécula marcada.

Índice analítico

α-2-macroglobulina 161, 167 acantocitosis 187 aconitasa 153 Aicardi-Goutieres, síndrome de 197 Alzheimer, enfermedad de 13, 19, 37, 42, 54, 83, 84, 85, 94, 159-168, 169, 172, 232 Andersen, síndrome de 219 Angelman, sindrome de 18 annealing, temperatura de 29, 30 anticipación 12, 148, 184 antisense 54, 55, 136 ataxia 47, 83, 85, 92, 147-157, 176, 203, 215 ataxia telangectasia 120 ataxina 47, 151 APP 42, 83, 160,161, 215, 232 APOE 89, 159, 165 apolipoproteína B 144

disferlina 98, 106 displasia fibromuscular 230 disquinesias 150, 197, 216-217 distonia 150, 188-190 -con respuesta a levodopa 189 -mioclónica 189 -parkinsonismo de inicio rápido 190 distrofia muscular 97-98 -cinturas, ver limb-girdle -congénita 99-101 -distal 109-111 -facioescápulohumeral 104-105 -limb-girdle 105-109 -miotónica 111-113, 170 distrofina 98, 101, 102, 106 distroglicano 98, 101 Duchenne, distrofia muscular de 18, 101

BLAST 9, 69, 77 Becker, distrofia muscular de 103 Bethlem, miopatía de 108

Ehler-Danlos 230 EGR2 118, 119, 124, 132 emerina 98, 103 Emery-Dreyfuss, distrofia muscular de 103, 108 epilepsia 209-214 -de ausencias 210 -mioclónica 210 -frontal 210 -temporal 211 -parcial 212, 213 electroforesis 5, 25, 30, 135, 152 espectrofotometría 7, 25

CADASIL 85, 89, 90, 214, 229 calpaína 98, 106 caveolina cavernoma 233 Charcot-Marie-Tooth 37, 90, 117-140 Chediak-Higashi, síndrome de 120 Coats, sindrome de 104 Cockayne, sindrome de 120 colágeno 108 conexina-32 118, 119, 123, 124, 129 consejo genético 86, 186 convulsiones febriles 206 convulsiones neonatales 213 corea 150, 187, 188 Corino de Andrade 141 Creutzfeldt-Jakob 174-176 cromosomas 4, 10, 14, 16, 18 cystatina C 232 degeneración corticobasal 168, 173 Dejerine-Sottas, enfermedad de 117, 122, 132 demencia frontal 168, 173

Fabry, enfermedad de 230 Factor V Leiden 246, 247 Fahr, enfermedad de 196 fibras rojo rasgadas 259 fitánico, ácido 120 fragmentos de Okazaki, 7 frataxina 153 Friedreich, ataxia de 147, 148, 152-155 fukutina 98, 100 Fukuyama, ver distrofia muscular congénita GDAP1 118, 119, 132 gelsolina 144

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MANUAL DE NEUROGENÉTICA

geniospasmo hereditario 197 Gerstmann-Straussler-Scheinker 44, 173, 176 gene targeting 41, 42, 43 haplotipo 12,173, 175 hemofilia 230-240 herencia compleja, 13, 19, 193, 227 HERNS 215 hibridación 8 hipomielinizante congénita, neuropatía 134 histonas 4, 14 HLA 167 homocisteina 249 Huntington, enfermedad de 47, 54, 85, 86, 89, 151, 183-187 idebenona 154 imprinting 18, 189 insomnio fatal familiar 176 Kerns-Sayre, síndrome de 257, 262-263 KIF1 B 119, 124 kinesina 130 knock-out 42, 43, 44, 47, 69 Laing, miopatía distal de 110 lamina 98, 103, 108 laminina 98 Landouzy-Dejerine, ver distrofia facioescápulo humeral Leber, neuropatía óptica de 265 Leigh, síndrome de 264 leucodistrofia 120 leyes de Mendel, ver Mendel ligasa 7 lipomatosis 265 LOD score 19 LRP, 161 Marfan, síndrome de 122, 230 Markesbery-Griggs-Udd, miopatía distal de 110 McLeod, sindrome de 18, 187 MELAS 215, 231, 257, 260, 262, 263 Mendel 3, 18 MERFF 215, 257, 260, 262, 263 merosina 98, 100 microarray 33, 83, 160 migraña 214-215, 231 miotonía 111-113, 219 miotilina 107 miopatía 97-115 Miyoshi, miopatía de 107 Moyamoya, enfermedad de 231 MTMR2 118, 119, 124, 133 músculo-óculo-cerebral, sindrome 100 mutaciones dinámicas, ver mutaciones inestables mutaciones inestables, 11,12, 47, 90, 112, 148, 183 NARP 264 NDRG1 118, 119, 124, 133 NEFL 118, 119, 124, 131 neurofibromatosis, 230 Neuropatía axonal gigante 120

Nonaka, miopatía distal de 110 nurina 98 oftalmoplejia externa progresiva 262 Okazaki, framentos de 7 OMIM 69, 74, 84, 193 operon 10 P0, proteína de mielina-0 118, 119, 123, 124, 128 pánico 219 pantotenato kinasa-2 196 parálisis periódica 218-219 parálisis por presión, susceptibilidad a 122, 127, 128, 129 parálisis supranuclear progresiva 168, 173 parkina 189, 193, 194 Parkinson, enfermedad de 20, 54 , 74, 84, 94, 193, 203 PCR 23, 24, 26, 76, 135, 143, 152, 191 Pick, enfermedad de 168, 173 PMP22, proteína de mielina periférica-22 118, 119, 123, 124 polimerasa 7, 26, 28 polimorfismo 11 Prader-Willi, sindrome de 18 premutación 11, presenilina 77, 83, 92, 163 primasa 7 primer xi,7, 26, 59, 61, 71, 76 prion 44, 84, 173-176 proteasoma 185, 195 proteómica 21 protrombina G20210A 247 Proyecto Genoma xi, 20, 70, 226 PRX 119 pseudodominancia 13, quimeroplastos 54 ragged-red, ver fibras rojo rasgadas recombinación 15, 16 Recklinghausen, enfermedad de von, ver neurofibromatosis Refsum, síndrome de 126 Rendu-Osler-Weber, enfermedad de 233 replicación de DNA 7 restricción 12, 21, 31, 38, 59, 61, 70, 71, 76,104, 143 sarcoglicano 98, 105 SNP 11, 22, 160 Sneddon, sindrome de 234 SOX-10 119, 124 splicing 8, 9, 15, 169, 204 SSCP 31 Steiner, enfermedad de 92, 111-112, 148 synucleina 44 Tangier, enfermedad de 120 tau 44, 166, 168-173 telethonina 98, 107 tembler mouse 37 temblor 150, 192, 217 temperatura de melting 7, 29 termociclador 30 Tourette, enfermedad de Gilles de la 197

ÍNDICE ANALÍTICO TTR 92, 141, 215 transfección 37 transtiretina, ver TTR trisomía 18

Wilson, enfermedad de 85, 92, 190 Walter-Walburg, ver distrofia muscular congénita Welander, miopatía distal de 109 Von Willebrand, enfermedad de 240-242

ubiquitina 185, 195 utrofina 98, 101 vitamina E, déficit de 155 vértigo 215

xantomatosis cerebrotendinosa 61, 91,120, 203 xeroderma pigmentoso 120

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