• Author / Uploaded
• Pako Morales

Citation preview

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ÁREA ACADÉMICA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

ELABORÓ: Dra. Rosalinda Acosta Salinas Dr. Javier Piloni Martini QFB Julia Rodríguez Sosa

SEMESTRE: 1 Enero-Junio 2012

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

FECHA ELABORACIÓN: 08 de Junio de 2011

ELABORARON: NOMBRE

FIRMA

Dra. Rosalinda Acosta Salinas Dr. Juan Ocampo López Dr. Javier Piloni Martini Julia Ma. M. Rodriguez Sosa

VO. BO. ACADEMIA DE CIENCIAS MORFOFISIOLÓGICAS : NOMBRE Dra. Rosalinda Acosta Salinas Dr. Javier Piloni Martini QFB Julia Rodríguez Sosa Dr. Juan Ocampo López MC. Irma De la Rosa Rodríguez MVZ Samantha Jardón Xicotencatl Dr. Armando Zepeda Batista

FIRMA

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Dra. María Guadalupe Torres Cardona Dra. Maricela Ayala Martínez Dra. Deyanira Ojeda Ramírez Dr. Juan Carlos Hernández González

VO. BO. COORDINACIÓN DE LA LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA: Dra. Maricela Ayala Martínez

FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN: Julio 2012

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

ÍNDICE

Pág. Introducción

1

Medidas de seguridad en el laboratorio, taller y/o clínicas de la UAEH

2

Lineamientos de uso de laboratorios, talleres y/o clínicas de la UAEH

4

Practica 1. Bioseguridad

12

Práctica 2. Material y equipo de laboratorio.

26

Práctica 3. Preparación de soluciones.

32

Práctica 4. Medición de pH.

43

Práctica 5. Regulación del equilibrio ácido-base.

48

Práctica 6. Separación cromatográfica de aminoácidos

54

Práctica 7. Extracción y cuantificación de proteínas de la sangre

55

Práctica 8. Cinética de la enzima ureasa

60

Práctica 9. Reconocimiento de carbohidratos

74

Práctica 10. Aislamiento y cuantificación de DNA.

79

1

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

INTRODUCCIÓN La bioquímica pude definirse como la ciencia que estudia las bases químicas de la vida. Como la célula constituye la unidad estructural de los seres vivos, una definición funcional de la bioquímica sería la ciencia que estudia los componentes químicos de las células vivas, así como sus reacciones y procesos que intervienen.

La bioquímica de los ácidos nucleicos constituye el corazón de la genética molecular; la genética ha resultado crucial para dilucidar muchas áreas de la bioquímica. La fisiología y la bioquímica se sobreponen por completo. La inmunología utiliza numerosas técnicas de la bioquímica y viceversa. La farmacología requiere de un sólido conocimiento de la bioquímica, ya que casi todos los fármacos se metabolizan mediante reacciones catalizadas por las enzimas. Además de que cada vez más se utilizan criterios bioquímicos para comprender los aspectos básicos de la patología (estudio de la enfermedad).

Además de ha permitido entender el proceso de nutrición, así como manejo adecuado de esta para la formulación de alimentos mejorados que permiten una mayor producción de los productos pecuarios.

Estudiante del Programa Educativo de Medicina Veterinaria y Zootecnia, te invitamos a conocer y adentrarte en el apasionante mundo de la bioquímica.

2

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO, TALLER Y/O CLÍNICAS DE LA UAEH

I. Respetar la Normatividad Universitaria vigente. II. Los alumnos sólo podrán trabajar y permanecer en el laboratorio bajo la supervisión directa del profesor, de acuerdo al Artículo 20 del Reglamento de Laboratorios. En ningún caso el auxiliar o responsable de laboratorio, podrá suplir al maestro en su función. IV. Todo usuario trabajará con el equipo de seguridad que se requiera, (bata blanca, filipina, careta, mascarilla, cubre boca, cubre pelo, guantes de hule látex, zapato de piso, guantes quirúrgicos, guantes industriales y/o de asbesto. V. El usuario tendrá cuidado de no contaminar los reactivos o tomar alguno directamente con la mano. Existen muchos reactivos de los cuales se preparan soluciones diluidas, que son altamente corrosivos. En este sentido, el contacto con ellos deber ser reducido al mínimo con las manos, la nariz o la boca. Usar en todos los casos una perilla o propipeta para auxiliarte al tomar la cantidad deseada de reactivo. Manual de Ecología, Seguridad e Higiene. VI. Por ningún motivo pipeteará las soluciones con la boca, no debes “PIPETEAR” directamente del frasco que contiene al reactivo. Con esto, se evitará que los reactivos se contaminen y que los resultados de tu práctica (y la de los demás) se vean afectados. Para ello, toma sólo la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y NO DEVUELVAS EL RESTANTE al frasco de origen. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. VII. Si necesitas preparar una solución de un reactivo que desprende gases (como los ácidos o el amoniaco) HAZLO EN LA CAMPANA y no en las mesas de laboratorio. Activa los extractores. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. VIII. En caso de que alguna sustancia corrosiva te caiga en la piel o en los ojos, LAVA INMEDIATAMENTE la parte afectada al chorro del agua durante al menos 5 minutos y AVISA A TU PROFESOR. Si el derrame fue en una gran área de la piel y de la ropa, usa las regaderas que están ubicadas en el laboratorio. Manual de Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6 IX.

Cuando peses en la balanza cualquier producto químico hazlo en un pesafiltro o en 3

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

un recipiente adecuado, NUNCA en un trozo de papel. Además, procura no tirar el producto alrededor de la balanza ya que puedes dañarla. Si esto sucede límpialo inmediatamente con una brocha y/o con un trozo de tela limpio. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. X. Las sustancias que se manejan comúnmente en el laboratorio son altamente contaminantes. Como UNIVERSITARIOS tenemos gran compromiso con el cuidado del medio ambiente y en consecuencia debemos desecharlas de manera adecuada conforme a las indicaciones que te indique tu catedrático.NO DESECHES TUS SOLUCIONES, RESIDUOS O PRODUCTOS DIRECTAMENTE EN LA TARJA, utiliza los contenedores correspondientes al tipo de sustancia en particular. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. XI. Todo frasco, bolsa, caja o contenedor, deberán ser etiquetados. Por lo tanto cualquier sustancia con recipiente no etiquetado será desechada. Manual de Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6 XV. El usuario solicitará el equipo, herramienta, material y reactivos de acuerdo a las especificaciones del manual de prácticas, mediante el vale de laboratorio,Formato DLA009, y su identificación oficial de la U.A.E.H. XVI. Que el usuario que reciba el material sea el mismo que solicite durante el desarrollo y el que haga entrega al final de la práctica. XXX. Al concluir la práctica, deben dejar limpia el área de trabajo, así como el material y equipos utilizados. NO TIRES PAPELES Y/O BASURA A LAS TARJAS.

4

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

LINEAMIENTOS DE USO DE LABORATORIOS, TALLERES Y/O CLÍNICAS DE LA UAEH

A los usuarios del laboratorio (Alumnos): I. Respetar la Normatividad Universitaria vigente. II. Los alumnos sólo podrán trabajar y permanecer en el laboratorio bajo la supervisión directa del profesor, de acuerdo al Artículo 20 del Reglamento de Laboratorios. En ningún caso el auxiliar o responsable de laboratorio, podrá suplir al maestro en su función. III. Para asistir a sesiones de laboratorio, es requisito indispensable presentarse con bata reglamentaria (blanca y de manga larga), Taller bata de color y de manga larga portada adecuadamente, manual de prácticas correspondiente y con los materiales que no son específicos de los laboratorios XII.La entrada al laboratorio será a la hora exacta de acuerdo a lo Programado. XIII.El laboratorio no proporcionará manuales de prácticas a los usuarios, ya éstos serán suministrados por el catedrático de la materia correspondiente. XIV. Todo usuario trabajará con el equipo de seguridad que se requiera, (bata blanca, filipina, careta, mascarilla, cubre boca, cubre pelo, guantes de hule látex, zapato de piso, guantes quirúrgicos, guantes industriales y/o de asbesto. XV. El usuario tendrá cuidado de no contaminar los reactivos o tomar alguno directamente con la mano. Existen muchos reactivos de los cuales se preparan soluciones diluidas, que son altamente corrosivos. En este sentido, el contacto con ellos deber ser reducido al mínimo con las manos, la nariz o la boca. Usar en todos los casos una perilla o propipeta para auxiliarte al tomar la cantidad deseada de reactivo. Manual de Ecología, Seguridad e Higiene. XVI. Por ningún motivo pipeteará las soluciones con la boca, no debes “PIPETEAR” directamente del frasco que contiene al reactivo. Con esto, se evitará que los reactivos se contaminen y que los resultados de tu práctica (y la de los demás) se vean afectados. Para ello, toma sólo la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y NO DEVUELVAS EL RESTANTE al frasco de origen. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. XVII. Si necesitas preparar una solución de un reactivo que desprende gases (como los ácidos o el amoniaco) HAZLO EN LA CAMPANA y no en las mesas de laboratorio. Activa los extractores. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. 5

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

XVIII. En caso de que alguna sustancia corrosiva te caiga en la piel o en los ojos, LAVA INMEDIATAMENTE la parte afectada al chorro del agua durante al menos 5 minutos y AVISA A TU PROFESOR. Si el derrame fue en una gran área de la piel y XIX. de la ropa, usa las regaderas que están ubicadas en el laboratorio. Manual de Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6 XX. Cuando peses en la balanza cualquier producto químico hazlo en un pesafiltro o en un recipiente adecuado, NUNCA en un trozo de papel. Además, procura no tirar el producto alrededor de la balanza ya que puedes dañarla. Si esto sucede límpialo inmediatamente con una brocha y/o con un trozo de tela limpio. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. XXI. Las sustancias que se manejan comúnmente en el laboratorio son altamente contaminantes. Como UNIVERSITARIOS tenemos gran compromiso con el cuidado del medio ambiente y en consecuencia debemos desecharlas de manera adecuada conforme a las indicaciones que te indique tu catedrático.NO DESECHES TUS SOLUCIONES, RESIDUOS O PRODUCTOS DIRECTAMENTE EN LA TARJA, utiliza los contenedores correspondientes al tipo de sustancia en particular. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología. XXII. Todo frasco, bolsa, caja o contenedor, deberán ser etiquetados. Por lo tanto cualquier sustancia con recipiente no etiquetado será desechada. Manual de Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6 XIV. Todo usuario de laboratorio o taller, debe conocer la ubicación de los extintores, las puertas de emergencia, y la circulación del lugar en caso de emergencia. XV. El usuario solicitará el equipo, herramienta, material y reactivos de acuerdo a las especificaciones del manual de prácticas, mediante el vale de laboratorio,Formato DLA009, y su identificación oficial de la U.A.E.H. XVI. Que el usuario que reciba el material sea el mismo que solicite durante el desarrollo y el que haga entrega al final de la práctica. XVII. Los usuarios deberán revisar el equipo y material que se les proporcione, verificando que este limpio, ordenado, completo y funcionando, el cual deberá ser devuelto en las mismas condiciones. XVIII. Al devolver el equipo y material, el usuario deberá solicitar el vale de laboratorio Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H. 6

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

XIX. Cuando el material quede bajo la responsabilidad del usuario, el vale de laboratorio Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H., será retenido por el auxiliar hasta la devolución del material. XX. En caso de pérdida, ruptura o desperfecto del equipo o material de laboratorio, el usuario solicitará al auxiliar el vale de adeudo Formato DLA-010 el cual debe anotar el nombre y núm. de cuenta de todos los integrantes del equipo y ser respaldado con su identificación oficial de la U.A.E.H., se deberá reponer en un plazo no mayor a 15 días hábiles., para lo cual se retendrá el vale de adeudo y su identificación oficial de la U.A.E.H. XXI. Si el material adeudado no es repuesto en el plazo fijado, el o los usuarios responsables, no podrán continuar con la realización de las prácticas correspondientes. Control de adeudo Formato DLA-011. XXII. En caso de no cumplir con la reposición del material en el plazo establecido, el integrante del equipo o grupo, según sea el caso, serán dados de alta, en la aplicación del sistema de control de adeudos en laboratorios implementado en la U.A.E.H. XXIII. La acreditación de cada una de las prácticas que se realicen, estará sujeta a la evaluación que aplique el catedrático. XXIV. El usuario que realice práctica de recuperación deberá cumplir con lo estipulado en el punto III. XXV. Los alumnos que por indisciplina o negligencia pongan en peligro su integridad, la de sus compañeros, la del material o la de las instalaciones, serán sujetos a la sanción correspondiente prevista en el Reglamento de Laboratorios Artículo 36 y 38. Por la naturaleza de las cosas que existen en el laboratorio debes mantenerte alerta y sin distracciones (no corras, no se permiten equipos de sonido personales). TAMPOCO SE ACEPTAN VISITAS a las horas de laboratorio. XXVI. El usuario que incurra en alguna falta académica será sancionado de acuerdo a la Normatividad Universitaria vigente. XXVII. Queda estrictamente prohibido realizar cualquier tipo de actividad ajena al desarrollo de las tareas propias del laboratorio. XXVIII. Todo usuario deberá entrar y salir por los accesos autorizados, en orden y cuidando su integridad y la de sus compañeros. (Manual de Higiene, Seguridad y 7

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Ecología, Capitulo 1). XXIX. Los usuarios deben reportar cualquier anomalía o maltrato por parte del catedrático y del personal de laboratorio, al jefe de los mismos o en su caso a la Dirección de la escuela. XXX. Al concluir la práctica, deben dejar limpia el área de trabajo, así como el material y equipos utilizados. NO TIRES PAPELES Y/O BASURA A LAS TARJAS. XXXI. Al concluir la licenciatura, maestría o doctorado y realicen su trámite de titulación al solicitar su constancia de no adeudo de material, herramienta y/o equipo de laboratorios, clínicas y talleres, se realizara una donación en especie a las, clínicas, laboratorios y talleres correspondientes de acuerdo al Formato DLA-043, la cantidad de la donación será entre tres y cuatro salarios mínimos vigente en el estado de Hidalgo para ello es necesario entregar la nota y escribir en el formato el material donado, posteriormente el documento que se extienda se entregará a la Dirección de Laboratorios y Talleres donde se elabora y entrega la constancia de no adeudo. DEL USUARIO (CATEDRÁTICO/INVESTIGADOR): I. El catedrático/investigador es Responsable del desarrollo y del cumplimiento de los objetivos establecidos en su manual de prácticas o guías o proyecto de investigación (tesis). II. El catedrático/investigador que incurra en alguna falta académica será reportado a la Dirección de la Escuela, así mismo se elaborará el Reporte de Acción (oportunidad de mejora, acción preventiva o acción correctiva). III. El catedrático llenará aplique: Prácticas Formato primeros días del inicio del DLA-003, lo entregara al laboratorio y/o taller.

y entregará las Programaciones correspondientes según DLA-001, lo entregara al personal de laboratorio y/o taller los semestre, con tres copias. Proyecto de investigación Formato personal de laboratorio una hora antes de hacer uso del

IV. Para asistir a sesiones de laboratorio, es requisito indispensable presentarse con bata reglamentaria (blanca y de manga larga) y equipo de seguridad. V. La entrada al laboratorio será a la hora exacta de acuerdo a lo Programado, el catedrático que no inicie la práctica durante los primeros 10 minutos ésta será suspendida y tendrá que ser reprogramada. VI. Antes de realizar cualquier sesión práctica o experimento, el catedrático deberá informar a los alumnos las características del material y equipo a emplear, así como las 8

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

propiedades físicas, químicas y toxicas de las sustancias empleadas. VII. El catedrático deberá exigir el uso de bata reglamentaria (blanca y de manga larga) personalizada y portada adecuadamente, manual de prácticas correspondiente y con los materiales que no son específicos de los laboratorios. VIII. El catedrático deberá anotar los datos indicados en el libro de registro de prácticas (bitácora) de acuerdo a lo estipulado. Formato DLA-013 IX. El catedrático programará en coordinación con el Responsable de laboratorios la recuperación de prácticas. Formato DLA-035.1 X. El catedrático es corresponsable de la reposición del material de adeudo de los alumnos de su grupo. XI. El catedrático tiene la responsabilidad de que los desechos químico-biológicos sean depositados en los contenedores correspondientes. Manual de Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6 XII. El catedrático es responsable de supervisar a los alumnos desde el inicio, durante y al finalizar la práctica. Al inicio de esta verificar que realice la práctica programada, solicite lo necesario y cumpla con las medidas de seguridad, durante que hagan buen uso de los materiales, equipos y que no haya desperdicio de reactivos y al finalizar que dejen limpia el área de trabajo, bancos en el lugar y QUE NO DEJEN PAPELES Y/O BASURA EN LAS TARJAS. XIII. El catedrático deberá ser el primero y último en salir de los laboratorios, (NO ABANDONAR EL LABORATORIO HASTA QUE HAYA CONCLUIDO SU SESIÓN, NO DEBE DE CALIFICAR EXAMENES, NO REVISAR TAREAS, NO REVISAR TRABAJOS, NO REALIZAR ACTIVIDADES EN LAPTOPS, ETC. Recuerda que en la enseñanza experimental es necesario valorar las actitudes y la motivación en el trabajo grupal, ya que es en el laboratorio donde el alumno forma su actitud hacia el trabajo en equipo, lo cual se verá reflejado en su ejercicio profesional (Valdez, 2001). DEL AUXILIAR DE LABORATORIOS: I. El auxiliar de laboratorio está obligado a proporcionar el equipo, material y reactivos a los alumnos. Formato DLA-001 y Formato DLA-003 II. Auxiliar a los alumnos durante el desarrollo de la práctica, así como vigilar el buen uso de los materiales y equipo. III. Vigilar el cumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso de Laboratorios, así 9

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

como el Manual de Higiene Seguridad y Ecología. IV. En ausencia del Responsable del Laboratorios, puede suspender la práctica en caso de incumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso del Laboratorio. V. El auxiliar debe permanecer en su área de trabajo y realizar las actividades inherentes a su área. VI. Apoyará en las actividades académicas que encomiende la Dirección y el Responsable de laboratorios de la escuela, siempre y cuando no tenga prácticas asignadas. VII. Registrará en los formatos de limpieza DLA-025, DLA-026, DLA-027, DLA-028, DLA029, DLA-030 al DLA-031, las actividades realizadas por el personal de intendencia. VIII. En caso de pérdida, ruptura desperfecto o extravió de algún material, equipo e infraestructura, notificará de manera inmediata al Responsable del laboratorios. Formato DLA-017 IX. Es responsable de la custodia del material, equipo, sustancias e instalaciones, por lo que en caso de pérdida o desperfecto de algún bien se tendrá que deslindar responsabilidades de acuerdo con la Normatividad Universitaria. X. Preparará previamente el material, equipo y reactivos necesarios para elaborar las prácticas que ya están programadas correspondientes a los planes y programas de estudio vigentes. Formato DLA-041 XI. Será responsable de mantener el material y equipo en óptimas condiciones, así como el cubículo de laboratorio. Mantener vigente el inventario de equipo, material y reactivos. XII. Será responsable de reportar desperfectos o fallas en los equipos de laboratorio y solicitar el mantenimiento y/o acción necesaria para su funcionamiento al responsable de laboratorios. XIII. Elaborará y entregará el reporte mensual de actividades de su laboratorio al responsable de laboratorios. XXIII. Será responsable de verificar que el usuario registre en el vale de laboratorio y adeudo los datos correctos de acuerdo a la identificación oficial de la UAEH. XXIV. Vigilará que el catedrático se registre debidamente en la bitácora de uso al concluir su práctica.

10

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

DEL RESPONSABLE DE LABORATORIOS: I. Es el responsable del buen funcionamiento, mantenimiento y participar con la Dirección en las propuestas para actualización y desarrollo de los laboratorios. II. Supervisará permanentemente los laboratorios, asesorará a catedráticos, alumnos y personal de los mismos con la finalidad de lograr las metas planteadas. III. Recepcionará las programaciones Formato DLA-01, DLA-03, Servicio a Tesistas, alumnos y Profesores. Elaborará la calendarización, horario y control de prácticas Formato DLA-005 o DLA-006 IV. Vigilar el cumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso de Laboratorios así como el Manual de Higiene Seguridad y Ecología. V. Tiene la autoridad de suspender la práctica en caso de demora por parte del catedrático y/o alumnos o bien, incumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso del Laboratorio. VI. Elaborará y entregará a la Dirección el reporte mensual Formato DLA-016practicas, Formato DLA-016inv. VII. Elaborará y entregará relación de alumnos que tienen adeudos a la instancia correspondiente. Reposición de adeudos Formato DLA-018 VIII. Ingresará en la Captura en la “Aplicación Sistema de Control de Adeudos en Laboratorios”, a los alumnos que no realizaron la reposición de material en el tiempo establecido. Formato DLA-018 IX. Apoyará en las actividades académicas que encomiende la Dirección de la escuela. X. Elabora requerimiento semestral de material, equipo, reactivos y agua destilada necesarios para las prácticas correspondientes a los planes y programas de estudio vigentes, a la instancia correspondiente. Formato DLA-042. Nota: Los lineamientos de Uso de Laboratorios, Clínicas y/o Talleres de Institutos, Escuelas Superiores y Bachilleratos derivan del “Reglamento de Laboratorios, Manual de Seguridad, Higiene y Ecología y Documentos Institucionales. IMPORTANTE: Del reglamento de laboratorio capítulo II, artículo 20, tratándose de prácticas de asignaturas de planes y programas de estudio vigentes en que deberá de asistir el grupo, 11

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

este quedará a cargo del profesor titular del mismo, quien lo controlará y asesorará, en caso de que el profesor no asista, la práctica no podrá realizarse.

12

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

Bioseguridad

1

No. DE SESIONES:

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

1

5

INTRODUCCIÓN: La bioseguridad es un término que ha sido definido como las normas de comportamiento y manejo preventivo. En el laboratorio de bioquímica veterinaria existe un riesgo evidente de contaminación al que está expuesto el personal de salud (profesionales, estudiantes, investigadores, personal de limpieza, etc), al tratar con animales infectados o potencialmente infectados, en especial cuando el médico veterinario, está en contacto con sangre o hemoderivados, con agujas, jeringas e instrumental contaminado. Los límites entre lo accidental y lo prevenible pasan por el cumplimiento de las normas mínimas de bioseguridad hoy día consideradas universales.

Bioseguridad en el Laboratorio En el laboratorio existen elementos nocivos o potencialmente peligrosos como los productos biológicos provenientes de animales infectados y los reactivos químicos de diferente naturaleza como ácidos, productos cáusticos, volátiles como el éter, cloroformo, altamente tóxicos o cancerígenos como son: ácido clorhídrico y acrilamida por mencionar algunos.

13

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Un accidente ocurre por múltiples causas pero casi siempre se debe a errores humanos. Una vez que ocurrido el accidente su consecuencia puede ser grave, por lo tanto, es importante que el accidente no ocurra y para que esto sea así, importan nuestros hábitos de trabajo y el conocimiento que tengamos sobre el peligro, la seguridad y el respeto de las señales colocadas en los laboratorio, así como conocer las reglas del manejo de muestras altamente infecciosas.

Cuando ocurre un accidente en el laboratorio es conveniente, casi obligatorio saber qué es lo que hay que hacer porque el devenir de la salud de la persona o de las personas involucradas depende de los minutos en que se pone en práctica el auxilio correcto.

CONDUCTA A SEGUIR PARA EVITAR ACCIDENTES

1. Tener conocimiento de los elementos de riesgo al tratar animales infectados. 2. Conocer la forma de manejarlos. 3. Adoptar técnicas apropiadas de contención del riesgo. 4. Solicitar de los directivos los elementos necesarios para implementar dichas técnicas. 5. Aceptar con interés y entusiasmo todas las prácticas que la lógica y la experiencia señalan como convenientes. 6. No tomar decisiones basadas en tradiciones sin conocimientos científicos. 7. Exigir de las autoridades responsables del laboratorio la implementación de medidas de protección. En un laboratorio de bioquímica veterinaria nuestras manos tocan suciedad, material infeccioso y agarran reactivos altamente tóxicos y es muy común que se lleven a la boca, a los ojos o a la cara, los cuales son a su vez la causa de entrada de muchas infecciones, por lo que el laboratorio es un lugar no apto para el consumo de alimentos sólidos o líquidos.

14

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Un paso importante en la protección de nuestra salud es aceptar lo que denominamos la regla de los cuatro NO, a la que debemos considerar como la regla de oro de la bioseguridad.

- No fumar - No comer - No beber - No maquillarse

En el laboratorio se deben lavar las manos con jabón cuantas veces sea necesario y, si la tarea lo requiere, utilizar guantes. La posibilidad de infectarse por el manejo de material infectado como puede ser sangre, heces, orina o pus es muy alta por lo que se recomienda el uso de guantes para evitar los riesgos de contaminación. También es importante proteger los ojos de vapores químicos y salpicaduras de material infeccioso. Un laboratorio bien provisto debe disponer de campanas para manipular solventes y de un lavado especial para el enjuague de los ojos.

En un laboratorio donde se obtienen o llegan muestras, cuya peligrosidad se desconoce, requiere especial atención con relación al manipuleo de las mismas; por eso la segunda regla de oro de la bioseguridad es: considerar que todas las muestras son peligrosas y como tal tratarlas.

UNIFORME PROTECTOR

- El estudiante o investigador debe llevar bata abrochada. - En la toma de muestras se debe usar protectores de manos, nariz y boca. - Los guantes desechables se utilizarán una sola vez y se colocarán en bolsas destinadas a la incineración. 15

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

- El delantal y la bata, al terminar cada práctica, deben sumergirse en hipoclorito diluido si se manchara accidentalmente con sangre u otros materiales, frotar las manchas con hipoclorito diluido y enjuagar agua. - Al final de cada práctica se limpiara el área de trabajo con hipoclorito.

DISCIPLINA DEL PERSONAL 

Antes de comenzar las tareas, controlar el equipo y el área que debe estar desocupada de elementos innecesarios.



Las superficies de las mesas deben estar limpias y ordenadas.



Evitar el ingreso al laboratorio de personas que no se relacionen con las tareas que se realicen.



No ingresar artículos personales innecesarios al laboratorio.



No humedecer con la lengua etiquetas para rotular.



No llevarse a la boca dedos u objetos (lápices, lapicera, etc.).



Observar las normas generales de higiene y lavarse las manos: Después de manipular las muestras; al terminar la práctica; al salir del laboratorio.



No está permitido a los estudiantes guardar alimentos en la zona de trabajo.



Evitar las distracciones y permanecer en el lugar de trabajo.

PRÁCTICAS CORRECTAS

a) Las agujas deben colocarse en recipientes para la incineración y nunca reenvainadas. b) Proteger heridas existentes o lesiones cutáneas con el uso de guantes. c) Colocar los tubos y demás recipientes tapados en gradillas (nunca sobre la mesa). d) No pipetear con la boca. Utilizar pipetas o dispensadores automáticos.

16

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Equipo de emergencia 

Botiquín de primeros auxilios



Camilla



Ropa protectora



Desinfectantes



Señalización



Máscaras anti-gas

Primeros auxilios

Quemaduras provocadas por el fuego 

Hacer rodar a la víctima y cubrirla con una frazada para apagar el fuego.



Si está inconsciente, colocarle la cabeza hacia atrás para facilitar la respiración.



Si no respira, iniciar la respiración boca a boca.



Colocar una compresa fría sobre la zona quemada.



Pedir ayuda.

Quemaduras provocadas por sustancias químicas 

Quitar la ropa de la zona afectada.



Lavar con abundante agua dependiendo de la sustancia.



Pedir ayuda, indicando el nombre de la sustancia que provocó la quemadura.

Derrames de ácidos 

Lavar con abundante agua dependiendo del ácido.



Neutralizar la acidez de la piel con bicarbonato de sodio, durante 15 o 20 minutos.



Pedir ayuda.

17

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Derrames de Bases 

Lavar con abundante agua.



Aplicar sobre la zona afectada solución saturada de ácido bórico o solución de ácido acético al 1%.



Pedir ayuda.

OBJETIVO GENERAL: Conocer y aplicar las medidas de bioseguridad para trabajar en el laboratorio de bioquímica veterinaria.

OBJETIVOS ESPECIFICOS: 1.- Indicar los principios de la bioseguridad y explicar los factores de riesgos que inciden en un laboratorio bioquímica veterinaria. 2.- Identificar y explicar las normas de bioseguridad para evitar poner en riesgo la salud de los estudiantes durante el trabajo en el laboratorio de bioquímica veterinaria.

. PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: 1.- Los alumnos entregaran el cuestionario al profesor para revisarlo. 2.- Se revisara el cuestionario donde participaran los alumnos y el profesor. 3.- Los alumnos revisaran las instalaciones del laboratorio de bioquímica veterinaria como son: regaderas, tarjas, campana de extracción, conocer la nomenclatura de los colores de tuberías, conocer las etiquetas de los reactivos (ácidos y bases), la ubicación de los extinguidores, revisar que material existe en el botequín de primeros auxilios, etc.

18

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS: MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN

ESPECIFICACIONES

REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES 1 Frasco de ácido clorhídrico (cualquier presentación)

1

EQUIPO CANTIDAD |

Frasco de Hidróxido de sodio (cualquier presentación)

DESCRIPCIÓN Campana extracción

ESPECIFICACIONES

OBS.

OBS. Los alumnos no ocuparan el reactivo, solamente revisaran las indicaciones y el manejo que deben de tener para su uso en las practicas 3 y 4 además revisaran el código de peligrosidad que tiene reportado el HCl Los alumnos no ocuparan el reactivo, solamente revisaran las indicaciones y el manejo que deben de tener para su uso en las practicas 3 y 4 además revisaran el código de peligrosidad que tiene reportado el NaOH OBS.

de

CUESTIONARIO: 1.- Qué es la bioseguridad.

19

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

2.- Cuales son los principios de la bioseguridad. 3.- Cuales son las medidas de bioseguridad que debe de tener un alumno de bioquímica veterinaria en el laboratorio. 4.- Cuales son los elementos de protección personal que deben de tener los alumnos en el laboratorio de bioquímica veterinaria. . 5.- Cual es el proceso de bioseguridad que se le debe dar a las muestras biológicas después de ser analizadas en el laboratorio de bioquímica veterinaria. .7.- Que diferencia existe entre los siguientes términos: esterilización y desinfección. II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: El presente tiene como objetivo servir como guía para las academias y los alumnos sobre los contenidos de un informe de prácticas, cuál es el significado de cada apartado y que habilidades desarrollará el alumno con cada uno de estos. El reporte de prácticas deberá contener los siguientes elementos: A) Carátula de la práctica.- Tiene como finalidad dar a conocer los datos generales del alumno, a modo de hacerlo fácilmente identificable. Los datos que debe contener son los siguientes: a. Nombre del Instituto (Instituto de Ciencias Agropecuarias - UAEH) b. Materia (Bioquímica) c. Carrera (MVZ) d. Grupo 2. e. Número de equipo: X f. Nombre de los integrantes del equipo, g. Práctica No. ____. “Nombre de la Práctica” h. Nombre del Profesor i. Fecha

20

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Dentro el contenido de cada práctica deberá llevar: B) Título y número de la práctica. El alumno escribirá el nombre de la práctica correspondiente a la sesión, así como el número de la práctica realizada y la fecha. C) Objetivos En ellos se expresa la intención de las actividades a desarrollar en la práctica para el aprendizaje de los conceptos. Son las expectativas que se pretenden alcanzar durante el desarrollo de la práctica, por lo que el estudiante escribirá los objetivos que están en el manual de prácticas, y además podrá plantear otros objetivos que a su juicio crea que puede alcanzar con las actividades desarrolladas en a práctica. Se expresan en infinitivo, y siempre en relación con el aprendizaje del alumno. En este apartado el alumno ubica hacia donde enfoca las actividades que desarrolla,

D) Introducción Describe los Conocimientos Antecedentes que existen sobre el tema, los Fundamentos teóricos en los que se basan las técnicas y metodologías empleadas y el Estado del Arte del tema en estos momentos, para lo cual el alumno debe utilizar material diferente al ya proporcionado por el profesor.

Se sugiere una extensión

entre 1 –3 cuartillas. En el texto se debe hacer referencia a la bibliografía consultada de la siguiente manera. (Autor-año). El alumno puede conocer y explicar los conocimientos teóricos requeridos de manera previa para comprender la práctica. Algunas academias prefieren que el alumno consulte la bibliografía y la use en la discusión, por lo que esta parte se puede omitir del informe. E) Material y Métodos E.1) Material: Consiste en un listado de los equipos, material, reactivos, medios de cultivo y organismos empleados, así como las cantidades necesarias de cada uno por equipo de alumnos. 21

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

El alumno conoce el material a emplear así como el que se requiere que él aporte para el desarrollo de la práctica. Puede servirle para establecer sus requerimientos en caso de que él aplique las técnicas en su vida profesional. E.2) Métodos: Describe el procedimiento que se realizó en el laboratorio, en orden secuencial y con las cantidades, rangos, unidades, etc. precisas que se emplearon. Puede incluirse un diagrama de bloques del procedimiento general para que el alumno tenga una comprensión global del proceso que se realizó. A juicio de la academia el alumno no escribirá el material y métodos si estos ya vienen descritos en la práctica, a menos que se hayan hecho modificaciones. F) Resultados En este apartado se deben reportar los datos obtenidos durante el desarrollo de la práctica, observaciones, etc. los cuáles pueden expresarse como tablas, gráficas, fotografías o dibujos, según indique el instructivo de la práctica. Se debe insistir al alumno sobre reportar los datos numéricos deben reportarse usando el sistema internacional de medidas, se debe hacer uso adecuado de las abreviaturas, y cada gráfica o figura que se incluya en el reporte deben de estar numeradas y llevar un título breve (de un párrafo) que explique lo que se desea representar. El alumno demuestra el desarrollo de habilidades manuales e intelectuales como manejo de equipo y material, representación gráfica de datos, elaboración de tablas y manejo y calculo de datos. G) Análisis de resultados Aquí el alumno interpretara los resultados obtenidos durante el desarrollo de la práctica. Hará una evaluación de los posibles factores que intervinieron para que el resultado esperado se alcanzara, no se hubiera conseguido o se alcanzara de forma parcial. En esta parte el alumno desarrolla capacidades como: inducción, deducción, comparación y expresión escrita.

22

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

H) Discusión de resultados Este apartado se puede desarrollar junto con el de Análisis de Resultados, solo que en este caso se revisa el significado de los resultados en términos de los fundamentos teóricos, de sus aplicaciones y de los objetivos que se plantearon al inicio de la práctica. También se Interpretan los resultados obtenidos, y se justifican las desviaciones de los datos o resultados esperados, se confrontan ideas y se pueden formular hipótesis, así como se analiza cómo el desarrollo de esa práctica le sirve en su capacitación profesional. En el reporte, esta sección debe de contener la síntesis del análisis realizado por todos los estudiantes, la comparación de resultados con otros equipos, así como con los reportes bibliográficos, en los que se sustenta la práctica. En ello el alumno desarrolla habilidades de análisis, de síntesis, comparación de expresión escrita, etc. I) Conclusiones Indica si se cumplieron o no los objetivos de la práctica, como resultado del análisis y discusión de resultados. Son puntuales en su expresión.

J) Recomendaciones El alumno propondrá modificaciones a la práctica para alcanzar los objetivos de planteados de otra manera o propuestas de cómo lograr los objetivos de una manera más eficiente, a sea que se alcanzaran o no los objetivos, y analiza que otros objetivos diferentes a los académicos son necesarios implementar. K) Aplicaciones El estudiante puede aplicar lo aprendido en su vida diaria y profesional, esto requiere de investigación bibliográfica.  De esta manera en el informe el alumno vincula los conocimientos teóricos y prácticos con su preparación profesional.



Toda revisión bibliográfica que se cite en un reporte o escrito, debe de indicar adelante de la cita o al final del párrafo cual fue la fuente bibliográfica, como ya se menciono con anterioridad. 23

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

L) Cuestionario Debe ser diseñado por los profesores de forma breve, tomando en cuenta los puntos clave de la práctica, y con el fin de evaluar la relación de los conceptos teóricos utilizados en esa práctica en particular. En las respuestas deberá citarse la bibliografía consultada. El cuestionario puede auxiliar a conducir el análisis y discusión de resultados. En este apartado el alumno desarrolla capacidades como búsqueda de información, desarrollo de memoria, expresión escrita y capacidad de síntesis. M) Glosario Se usa para explicar, definir palabras técnicas usadas en la práctica, acerca de los conceptos fundamentales en relación con la práctica. Las habilidades desarrolladas son muy similares a las del cuestionario. N) Referencias bibliográficas Cuando se cita se hace referencia a los trabajos de otros autores. Esto se hace con el fin de evidencian el conocimiento aportado, probar la validez y confiabilidad de un experimento, así como en la orientación la investigación o métodos a seguir. Además esto permite que quien lea el reporte pueda tener la posibilidad de contar con las misma fuentes y en su caso verificar o constatar datos. El profesor debe de evaluar si el alumno esta realmente citando bibliografía consultada y es coherente con el texto reportado. Existen muchas formas de citar las referencias, pero en el área científica la costumbre es citar las referencias en el cuerpo del texto, anotando los datos del autor y fecha de publicación, después de que se alude por escrito a las ideas o información obtenida, Ejem. Bagarazzi et. al. (1998). Pero al final del escrito se incluye la referencia completa en orden alfabético.

24

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Ejemplo de artículos en revistas: Bagarazzi ML, Boyer JD, Ayyavoo V, Weiner DB, 1998, Nucleic acid-based vaccines as an approach to immunization against human immunodeficiency virus type-1. Curr Top Microbiol Immunol. 226: 107-143. Ejemplo de tesis: De Baets B., “Oplosseb van vaagrelationele vergelijkingen: een ordetheorethishe benadering”, Ph. D. thesis, University of Gent, (1995). Ejemplo de libros y manuales: Li, Xia and Nancy B. Crane. Electronic Style: A Handbook for Citing Electronic Information. 2nd ed. Medford, New Jersey: Information Today, 1996. Ejemplo de fuentes electrónicas, como paginas web: Glantz, Stanton, John Slade, Lisa A. Bero, Peter Hanauer, Deborah E. Barnes. The Cigarette Papers. San Francisco, Calif: UC Regents.1996.(En línea) disponible: http://galen.library.ucsf.edu/tobacco/cigpapers/. 15 March 2000.

Ejem. (de fuentes electrónicas, artículos en línea). Zilber, J. & Niven, E. (2000). Stereotypes in the news: media coverage of African-Americans in Congress. Harvard International Journal of Press Politics. 5:32-49. Revisado en el 15 de marzo de 2000 del World Wide Web: http://muse.jhu.edu/journals/ harvard_international_journal_of_press_politicsv005/ 5.lzilber.html.

III.- BIBLIOGRAFÍA Asomoach-Baah, A. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio. Tercera edición. Ginebra (Suiza). pp. 1-223. Villegas, L. H. H., Núñez A. V. N. y Padilla R, C. (2007). Laboratorio de bioseguridad nivel 3 y 4. Rev. Mex. Patol. Clin. 54(4):177-186. Funes, E. F., Panozo M. A. y Cardozo S. T. (2005). Bioseguridad y seguridad química en laboratorio. Primera edición. Editorial poligraf. Cochabamba-Bolivia. pp 1-115. Bets, A.O. and York, C.J.: Viral and ricketcial Infection of Animals. Accademic Press, Neww York and London, 1996. Burleson, F. G., Chambers, T. M., Wiedbraule, D. L,: Virology a Laboratory Manual. Academic Press. New York, 1992. 25

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS, OFICINA SANITARIA PANAMERICANA: Prueba de Anticuerpos Fluorescentes para Rabia. Nota técnica No. 8, Rev. 2 Atlanta, Georgia, E.U.A., 1967. Coll, Morales J.: Técnicas de Diagnóstico en Virología. Ediciones Díaz de Santos, S.A., Madrid (España), 1993 Cottral, G.E.: Manual of Standardized Methods for Veterinary Microbiology. Cornell University Press, Ithaca and London, 1978 Cunningham, C.H.: Virología Práctica Acribia, Zaragoza (España), 1971. Davis, D.D., Dulbeco, R., et al: Tratado de Microbiología. Salvat, 1983. Fenner, F., et al.: Veterinary Virology. Academic Press., USA, 1987. Fenner, White: Virología Médica. Prensa Médica Mexicana., S.A., 1981. Habel, K., Salzman, N.P.: Fundamental Techniques in Virology. Academic Press. New York, 1969. Larski, Virología para Veterinarios. Ediciones científicas “La Prensa Médica Mexicana “, S.A., 1980. Michael, Thrusfield: Epidemiología Veterinaria. Acribia, Zaragoza (España), 1990. ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACION, Red de COOPERACIÓN Técnica entre Laboratorios de Investigación y Diagnostico Veterinario. Oficina Regional para America Latina y el Caribe. ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Técnicas De Laboratorio Aplicadas a la Rabia. Serie de Monografías No. 23 Washington 6, D.C., E.U.A., 1959. Quin, P.J., Markey, B.K., Carter, M.E.: Clinical Veterinary Microbiology. Wolfe Publishing, 1994. Wayne, M., Mekk A.H., Willeberb, P.: Epidemiología Veterinaria, Principios y Métodos. Acribia, Zaragoza (España), 1977. Mohanty, S.B.: Virología veterinaria. Interamericana, 1981.

26

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

Material y equipo de laboratorio.

2

No. DE SESIONES:

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

1

5

INTRODUCCIÓN: En la actualidad se cuenta con una gran variedad de materiales y equipos de laboratorio, que son usados para la toma de muestra así como para el análisis de las mismas. Por este motivo es indispensable que el estudiante se familiarice con dichos materiales y equipos para identificar el uso de los mismos así como su adecuada utilización con el fin de evitar un daño en el equipo que repercutiría de manera económica en el diagnostico, ya que el mal uso de este puede causar su deterioro durante el manejo y tomando en cuenta que se trata de materiales y equipos costosos, esto repercutiría de forma económica sobre el laboratorio. Además es importante conocer el uso correcto del material y equipo con el que cuenta cualquier laboratorio. De esta manera, los errores humanos que puedan afectar el trabajo se verán minimizados. Otra parte sumamente importante y que muchas veces se le resta valor es la preparación del material, ya que muchas veces el procesamiento adecuado de la muestra dependerá de la forma en la que se ha preparado los materiales, por este motivo en esta práctica el estudiante deberá de preparar material que será usado en los diversos laboratorios y se familiarizará con los equipos indicando el uso de los mismos.

27

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

OBJETIVO GENERAL: Conocer el material de vidrio y equipo con el que cuentan los diversos laboratorios del Área Académica (AA) de Medicina Veterinaria y Zootecnia (MVZ). OBJETIVOS ESPECIFICOS: Identificar el uso y cuidados que se deben de tomar para la preparación y manejo de los diversos materiales y equipos con los que cuenta el AA de MVZ. PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: Los estudiantes conocerán y aprenderán el manejo y fundamento de los equipos básicos del laboratorio: Como son potenciómetro, centrifugas, , lavando preparando y analizando el equipo utilizado en uno de los laboratorios del PE de MVZ. Los estudiantes entregarán un reporte describiendo el uso y cuidados de los equipos y materiales del laboratorio asignado y la firma de liberación de horas por algunos de los responsables del laboratorio. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS: MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 1 pieza Matraz Erlenmeyer 1 pieza

Matraz aforado

1 pieza

Pipeta graduada

1 pieza

Pipeta volumetrica

1 pieza

Probeta

1 pieza

Vaso de precipitado

ESPECIFICACIONES OBS. No importa capacidad No importa capacidad No importa capacidad No importa capacidad No importa capacidad No importa capacidad

la la la la la la

28

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

1 pieza 1 pieza

Bureta. . Tubo de ensaye.

REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN

EQUIPO CANTIDAD 1 pieza 1 pieza 1 pieza 1 pieza 1 pieza 1 pieza 1 pieza 1 pieza

Semestre: 1 No importa capacidad No importa capacidad

la la

ESPECIFICACIONES OBS.

DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS. Centrifuga Parrilla eléctrica Autoclave Potenciómetro Campana de flujo laminar Ultracongelador Balanza granataria Balanza analítica

CUESTIONARIO: ¿Cuál es la diferencia entre las pipetas volumétricas y las gradadas? ¿Cuál es el uso de los matraces y qué tipo de matraces existen? ¿Cuál es el fundamento, por el cual podemos medir el pH de una sustancia con el potenciómetro? ¿Cuál es el fundamento, por el cual podemos medir la concentración de una sustancia con el espectrofotómetro? ¿Cuál es la diferencia entre espectrofotómetro y fotocolorímetro? ¿Para qué usas la balanza analítica y para que la granataria? ¿Cómo conviertes g a rpm?

29

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1).

III.- BIBLIOGRAFÍA: Rosas, G.B y Rico, PJ.L. 1998. Bases químicas e introducción al manejo de muestras biológicas. Subcomisión de capacitación y Área de bioquímica y Genética de MVZ. FES Cuautitlán, UNAM, México. Skoog, D.F. y West, D.M. 1984. Análisis instrumental. 2a Ed. Interamericana. México. Alquicira, CJA; Barrón, G.M.C.; García, L.E; Ocampo, L.J. Manual de Prácticas de Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. FES Cuautitlán, UNAM, México.

30

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

Preparación de soluciones

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

3

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

No. DE SESIONES:

1

5

INTRODUCCIÓN: Las soluciones se definen como mezclas homogéneas de dos o más sustancias; sus componentes son el soluto (lo que se va a disolver) y el solvente (donde se disuelve el soluto). Por lo general, el soluto se encuentra en menor cantidad y proporción con respecto al solvente. A nivel de laboratorio es muy importante saber preparar soluciones de todo tipo, ya que el estado líquido es el más adecuado para trabajar, puesto que es difícil efectuar reacciones entre sólidos y gases sin contar con una gran cantidad de equipo en el laboratorio. Los líquidos se mezclan con bastante rapidez. Pueden medirse exacta y rápidamente con equipo volumétrico. El disolvente más común es el agua tomándola como un disolvente típico. Examinaremos el proceso de disolución. Las moléculas de agua son muy polares por lo que atraen a otras moléculas polares y a los iones. Por ejemplo, si un cristal de cloruro de sodio NaCl se introduce en agua, los iones de la superficie cristalina atraen a las moléculas polares del agua y gradualmente lo rodean separándolos de los iones superficiales, por lo tanto los iones se hidratan y ya no se quedan sujetos al cristal; gradualmente se desplazan del cristal a la solución. Esta separación iónica se denomina disociación. Si los líquidos son completamente solubles entre sí, entonces son miscibles como 31

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

el agua y el alcohol, sin embargo, si no se disuelve entre sí son inmiscibles, como el vinagre y el aceite.

SOLUCIONES EMPIRICAS La relación que existe entre el peso del soluto y el peso del solvente recibe el nombre de concentración. De acuerdo con la concentración una solución puede ser:  Solución diluida. Aquella que contienen una cantidad relativamente pequeña de soluto por unidad de volumen, es decir la cantidad de soluto es menor con relación a la cantidad de solvente.  Solución concentrada. Aquella que contiene una cantidad relativamente grande de soluto y éste sigue siendo soluble en el solvente.  Solución saturada. Es aquella en la cual la sustancia disuelta se encuentra en equilibrio con la sustancia no disuelta, es decir, al agregarse gran cantidad de soluto, éste no se disuelve, se asienta en el fondo del recipiente.  Solución sobre saturada. Aquella que contiene mayor cantidad de soluto que la saturada, es decir, existe exceso de soluto y al añadirle más, se cristaliza parte del que ya estaba disuelto. Para disolver dicha cantidad de soluto, la temperatura debe de ser mayor a la ambiental lo cual hace que la solución al enfriarse se inestable.

SOLUCIONES VALORADAS Existen varios métodos para determinar con exactitud la concentración de una solución acuosa:  Solución porcentual (%) Representa los gramos del soluto presentes en 100 partes de solución

(g o mL), pudiendo ser la concentración en porcentual en masa y

volumen.  Solución molar (M) Es el peso molecular (PM) del soluto, expresado en gramos (moles) por cada 1000 mL de solución (ó 1 L). 32

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

M = moles / 1000 mL  Solución normal (N) Es el número de equivalentes del soluto para cada 1000 m L de solución.

N = Equivalentes químicos / 1000 m L El número

de equivalentes se obtiene dividiendo el PM entre el número de

valencias de las sustancias en cuestión, el cual corresponde al número de H + o OHintercambiables.  Solución molal (m). Son los moles de soluto por cada 1000 g de solvente (o1 Kg.)

M = moles/ 1000 g

Ejemplos de preparación de soluciones Porcentuales (%)

(V/V) Preparar 100 ml. de una solución de alcohol al 40 %. Se toman 40 ml de alcohol + 60 ml de agua destilada (volumen total = 100 L.)

(P/V) Preparar 300 ml de una solución de alcohol de NaCl al 0.9 % 0.9 ------- 100 ml X ------- 300 ml Se pesan 2.7 g de NaCl y se afora a 300 ml

33

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Molares (M) = moles / 1000 ml. Preparar 1 L. de NaCl al 1 M Determinar PM del soluto: Na (23) + Cl (35.5) = 58.5 g. Esto representa Como se requiere de una solución 1M y 1 L de la misma, 58.5 g. de NaCl se disuelve en 1000 ml. De solución. Preparar 350 ml de NaOH al 0.1 M Determinar PM del soluto: Na (23) + O (16) + H (1) = 40 g 40 g ------------- I M X

------------- 0.1 M

X=4g

4 g -------------- 1000 ml X

------------- 350 ml

X = 1.4 g.

Normal (N) = equivalentes químicos /1000 ml. Preparar 1 L. de H2SO4 al 1 N  Como se trata de un reactivo líquido, se requiere conocer la densidad que en este caso es de 1.53 g/ml y la pureza que es de 95%  Determinar PM del soluto: H (1 x 2) + S (32)+o (16 x 4) = 98 g  Determinar el número de equivalentes químicos. Como esta sustancia tiene como fórmula 2 H, el PM se divide entre dos: 98/2 = 49 g, lo cual corresponde a 49 equivalentes por cada litro.  Recordando que la densidad es D = m/V, donde m = masa y V =volumen y como el reactivo es líquido, requerimos tomar un volumen determinado por ello V= m/D, 34

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

sustituyendo: V= 49 g/1.53 g/ ml, tenemos que V= 32 ml  La mayoría de los ácidos tienen un grado de pureza menor al 100% por lo tanto, para preparar una solución con 100 % de pureza se realiza el siguiente cálculo: 32 ml x 100 /95 = 33.7 ml. Esto significa que se deben de tomar 33.7 ml del reactivo y se afora a 1000 ml. Es importante aclarar que tratándose de ácidos concentrados se debe de vaciar primero una cantidad de agua antes de agregar el reactivo para posteriormente aforar al volumen requerido. Preparar 500 ml de NaOH al 0.1 N  Al tratarse de un sólido no requerimos densidad ni pureza  Al determinar el PM del soluto: Na (23) + O (16) + H (1) = 40 g  La fórmula posee un solo OH por ello el número de equivalentes = 40 g. Dado que se requiere de una solución 0.1 N: 40 g ----------- 1N X

------------ 0.1 ml

X=4g

4 g ------------ 1000 ml X= 500 ml X= 2 g  Se pesan 2 g. de NaOH y se afora en 500 ml. Para la preparación de reactivos se debe de saber el manejo de sustancias y líquidos. Las sustancias corrosivas son de uso delicado y deben de manejarse con precaución, pues al entrar en contacto con

la piel o la piel pueden producir

quemaduras.

RECOMENDACIONES  Nunca se vierta agua en ácido o álcali concentrado. Vierta siempre 35

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

lentamente el ácido en el agua, al mismo tiempo que se mezcla.  Nunca se pruebe un reactivo químico.  Si su piel tiene contacto con cualquier reactivo sólido o líquido, lávese inmediatamente con abundante agua.

OBJETIVO GENERAL: Conocer los diferentes tipos de soluciones empleadas en la práctica veterinaria, tanto en la alimentación de los animales, como para el análisis de muestras y el tratamiento y manejo de los animales OBJETIVOS ESPECIFICOS: Preparar diversas soluciones y realizar ejercicios de diluciones, así como conocer algunas medidas de precaución en la preparación de dichas diluciones.

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: Los estudiantes identificarán las presentaciones comerciales de los reactivos necesarios para la preparación de soluciones dentro del laboratorio. Realizarán ejercidos de soluciones que se proponen en este manual y realizaran los cálculos para preparar una solución porcentual, molar y normal para ser usada en el laboratorio de bioquímica o histología. Prepararan algunas soluciones necesarias en el laboratorio entre las que se encuentran las soluciones porcentuales, molares y normales soluciones necesarias en alguno de los laboratorios del PE de MVZ. Además prepararán las soluciones que se requieran durante las semanas de prácticas conjuntas que se requieran en los ranchos asignados. Los estudiantes entregarán un reporte describiendo que tipos de soluciones prepararon y cuáles fueron los cálculos realizados.

36

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS: MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 6 piezas Matraces Erlenmeyer 6 piezas Matraz erlenmeyer 6 piezas Probetas 6 piezas Matraz aforado 6 piezas Matraz aforado 4 piezas Pipeta graduada 2 piezas

Pipeta volumétrica

4 piezas

Pipeta graduada

2 piezas

Pipeta volumétrica

6 piezas Espátula 3 piezas Piseta 3 piezas Piseta REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 500 g Hidróxido de sodio 1000 mL Etanol 500 g Cloruro de sodio 1000 mL Ácido sulfúrico 500 g Bicarbonato de sodio 500 mL Glicerol 500 g Hidróxido de potasio 500 g Cloruro de potasio 1000 mL Ácido clorhídrico 100 g Rojo de fenol EQUIPO CANTIDAD DESCRIPCIÓN 2 piezas Balanza analítica

ESPECIFICACIONES OBS. 500 mL 1000 mL De vidrio de 500 mL 500 mL 1000 mL De vidrio de 5 mL de capacidad De vidrio de 5 mL de capacidad De vidrio de 10 mL de capacidad De vidrio de 10 mL de capacidad De acero inoxidable 250 mL 500 mL ESPECIFICACIONES OBS. Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo ESPECIFICACIONES OBS. Capacidad máx: 200 g Lectura: 0.0001 g Reproducibilidad: 0.00015 g Linealidad: ± 0,2 mg 37

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

CUESTIONARIO: 1. ¿Por qué razón crees que las soluciones valoradas son más utilizadas en el Laboratorio de Bioquímica? 2. Da un ejemplo cotidiano de soluciones empíricas. 3. Explica porque el HCl 1M y 1 N se preparan exactamente de la misma manera, a diferencia de lo que ocurre con el H 2SO4. 4. Investiga que tipo de soluciones son las más usadas en la práctica veterinaria. 5. Realiza los siguientes ejercicios:

Porcentuales 1) Si mezclamos 12 g de acetona en 60 g de agua. Calcule la concentración en v/v. Densidad de acetona pura 0.962 g/ml y densidad del agua 1.0g/ml. 2) Calcule cuántos gramos se necesitan para preparar 25 ml de una solución de bicarbonato de sodio al 1.9 / 100ml. 3) Calcule cuantos ml necesita tomar para preparar una solución al 3% de rojo de fenol para un volumen de 2 litros a partir de una solución al 20 % de rojo de fenol. 4) Diga cuantos gramos hay en una solución 24 % en peso de etanol 5) Calcule el porcentaje en peso de una solución que contiene 32.4 g de hidróxido de sodio (NaOH) en 1500 g de agua.

Molar 1) Calcule cuentos gramos necesita disolver para obtener una solución con 4.2 moles /l de cloruro de potasio 2) Calcule el número de milimoles contenidas en 62 g de NaCl 3) Calcule cuantos gramos se necesitan disolver para obtener una solución al 0.5 moles /l de NaOH. 4) Cuántos gramos de KOH se necesitan para preparar 700 mil de una solución que contiene 2 moles /l (PM = 56)

38

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

5) Calcular cuántos moles están presentes en una solución de KCl al 33 %. 6) Calcular cuantas moles hay en 13 g de NaOH (PM = 39) 7 Calcule el peso molecular de una solución X a la que se le agregó 45 g de un soluto x y qué en términos de molaridad representa 1.5 moles /1.

Molal 1) Determine la molalidad de una solución de glicerol (C 12 H22 O11) que contiene 1.2 molas /l con una densidad de 1.106 g/ml PM0 342 2) Se mezclan 25 g de NaCl en un litro de agua, siendo la densidad de la mezcla 0.962 g/ml. Expresar concentración en molalidad.

Normal 1) Calcule la normalidad de una solución de 3.3 molas / 1 de H 2SO4 2) Calcule el número de equivalentes contenidos en una solución de hidróxido de sodio (NaOH) al 0.05 N disuelto en 800 ml. 3) Calcule el volumen que necesitamos tomar de una solución ácido clorhídrico al 8 N para preparar 3 litros de ácido clorhídrico al 1.2 N

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica uno) III.- BIBLIOGRAFÍA: Sienko, M.J y Plane, R.A. 1980. Química teórica y descriptiva. Editorial Agular Hess, G. G. y Uno, K. 1998. Química General Experimental. CECSA, México. Farías, M.G. 1988. Química clínica. 9ª. Edición. El Manual Moderno, México. Alquicira, CJA; Barrón, G.M.C.; García, L.E; Ocampo, L.J. Manual de Prácticas de Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. FES Cuautitlán, UNAM, México.

39

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

Medición de pH

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

4

No. DE SESIONES:

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

1

5

INTRODUCCIÓN: Disociación del agua Aunque la molécula de agua es neutra, una pequeña cantidad de esta molécula puede ionizarse, de acuerdo al siguiente equilibrio químico: H2O + H2O

H3O+ + OH-

Por lo que de la reacción de disociación de dos moléculas de agua se forman iones hidronio (H3O+) e iones hidroxilo (OH-). Como todas las reacciones reversibles, la ionización del agua puede describirse mediante una constante de equilibrio de la siguiente forma a 25°C. Keq = [H+][OH-] [H2O]. Si el valor de Keq se ha determinado mediante la determinación de la conductividad eléctrica del agua (en donde los portadores de corriente, los iones, provienen de la disociación del agua), y es de 1.8 X 10 -16, y la concentración molar del agua pura en un litro de agua es de 55.5M (1000/18). Entonces: la constante de disociación del agua o producto iónico del agua a 25°C, Kw = [H+][OH-] = 1.0 X 10-14 M2. pH. Por lo tanto en agua pura a 25°C la concentración de protones (H +) e hidroxilos (OH-) es 40

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

+

-

Semestre: 1

-7

igual [H ] = [OH ] = 1.0 X 10 M. El pH es el cálculo de la concentración de protones a partir del producto iónico del agua, se considera que es una forma de medir químicamente de la acidez o alcalinidad (basicidad) de una sustancia. El pH o potencial hidrógeno se deriva de la siguiente formula: pH = log 1/[H+] = -log [H+], por lo tanto el pH de define de forma matemática como el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno [H +]. La escala de acidez se construye en función de la constante de equilibrio de disociación ácida (Ka) del agua, cuyo valor es de 0.0000001, y se puede expresar de forma abreviada por medio de su logaritmo decimal o base 10:

log 0.0000001 = -7 (esto es por los siete ceros). Al multiplicar esta función por -1, se obtiene un valor positivo: -log 0.0000001 = 7. Por lo tanto, el pH o potencial de hidrógeno del agua pura a 25°C tiene dicho valor, 7 y se considera neutra, en tanto que aquellas soluciones con un valor menor a 7 se consideran ácidas y las arriba de 7 básicas en tanto que cuando al agua se le añade un ácido o una base, estos niveles varían, esto es debido a que el ácido aporta H+ por ionización o los consume en el caso de las bases.

OBJETIVO GENERAL: Medir el pH de diversas sustancias, utilizando el potenciómetro.

OBJETIVOS ESPECIFICOS: Ajustar el pH de diversas soluciones requeridas en el laboratorio donde el estudiante preste sus servicios.

41

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA:

1. Determinar y ajustar el pH de las diversas soluciones que se requieran en el laboratorio al cual el estudiante este asignado usando el potenciómetro y tiras reactivas de pH, dependiendo del caso. 2. En el caso de dos soluciones hacer la medición con tiras y potenciómetro y compara la medición obtenida entre las tiras reactivas y el potenciómetro. 3. Analiza él porque de la diferencia de pH de las soluciones medidas. 4. Ajustar el pH a 8.0 de la solución reguladora de Tris-HCl 1M, para lo cual utilizarán NaOH 5 N o HCl 10 N según sea el caso.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:

MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 6 piezas Vaso de precipitado 6 piezas

Vaso de precipitado

6 piezas

Pipeta graduada

6 piezas

Pipeta graduada

ESPECIFICACIONES De vidrio de 250 mL capacidad De vidrio de 500 mL capacidad De vidrio de 5 mL capacidad De vidrio de 10 mL capacidad Acero inoxidable

OBS. de de de de

6 piezas Espátula REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS. 50 piezas Tiras reactivas para medir pH 300 g Hidróxido de sodio Grado reactivo 500 mL Ácido clorhídrico Grado reactivo

42

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

5 muestras equipo

por Muestras que los alumnos quieran medirle a pH

EQUIPO CANTIDAD 2 pieza

DESCRIPCIÓN Potenciómetro

Semestre: 1 Los alumnos medirán pH a las diferentes muestras traídas al laboratorio usando tiras reactivas y potenciómetros para realizar una comparación entre los dos métodos

ESPECIFICACIONES

OBS.

Rango de pH: -2 a 16 Rango de temperatura: -9 a 120 °C Resolución de pH: 0.01 Resolución de temperatura: 0.1°C Exactitud de pH: ±0.01 Calibración automática Electrodo de vidrio

2 pieza

Balanza analítica

Capacidad máx: 200 g Lectura: 0.0001 g Reproducibilidad: 0.00015 g Linealidad: ± 0,2 mg

CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el fundamento del cambio de color en las tiras reactivas usadas durante esta práctica? 2. ¿Cuál es el fundamento por el cual el potenciómetro es capaz de medir el pH? 3. Explica que entiendes por solución amortiguadora y menciona alguna. 4. ¿Cuál es la importancia de estudiar el pH para en la práctica veterinaria?

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1) 43

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

III.- BIBLIOGRAFÍA Lehninger, A. (1998). Bioquímica. Ed. Reverté, S.A., Barcelona Orozco, F. (1993) Análisis químico cuantitativo. Ed. Porrúa. México. Alquicira, CJA; Barrón, G.M.C.; García, L.E; Ocampo, L.J. Manual de Prácticas de Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. FES Cuautitlán, UNAM, México.

44

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

Regulación del equilibrio ácido-base

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

5

No. DE SESIONES:

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

1

5

INTRODUCCIÓN: El sistema de regulación ácido base protege al organismo contra las modificaciones de pH debidas principalmente a la continua formación de diversos ácidos producidos en el curso del metabolismo; de hecho, el pH del líquido extracelular es muy constante, entre 7.35 y 7.45. En los mamíferos la vida es incompatible con valores de pH de la sangre menores de 7 o mayores de 8. La mayoría de las sustancias degradadas en el organismo producen CO2 como producto final, el cual se combina con el agua y forma ácido carbónico (H2CO3) en gran cantidad, hasta 20 o más moles de ácido por día, equivalente a 2 litros de HCl concentrado. Como el ácido carbónico tiene la enorme ventaja de ser eliminado en forma de CO2 a través de la respiración, se facilita el mantener constante la composición de los compartimientos líquidos de los animales. En el metabolismo, además se producen otros ácidos fijos no volátiles, como el ácido sulfúrico, los ácidos acetoacético y β-hidroxibutírico, ácido úrico y el fosfórico. En tales casos el H + del ácido no volátil es neutralizado de inmediato por el ión bicarbonato (HCO 3-) para convertirse en ácido carbónico y por fin en CO 2 y H2O. Se evita la acidez, pero baja la cantidad de HCO3- disponible, así como la capacidad amortiguadora de las células.

Mecanismos de regulación del equilibrio ácido-básico

45

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1 -

El sistema amortiguador mas efectivo en los mamíferos es el formado por el H 2CO3/HCO3

, pues el organismo dispone de cantidades casi ilimitadas de H2CO3 proveniente de la hidratación del CO2 metabólico, Este sistema amortiguador no es el único presente en el organismo, las proteínas plasmáticas y celulares, la hemoglobina del glóbulo rojo y los fosfatos intra y extracelulares intervienen también en los procesos de neutralización. Los aniones totales de las sales amortiguadoras combinables con H + son el primer sitio de defensa contra una alteración producida por exceso de acidez. Como es difícil de valorar la suma de todos los amortiguadores corporales, incluyendo los cationes de las células y hasta de los huesos, con la práctica se hacen cálculos basados en el pH de la sangre, el contenido de CO2 total de la sangre completa o del plasma y el hematocrito. La influencia del mecanismo de intercambio de iones para mantener el pH de los líquidos orgánicos se ejemplifica de manera característica por el intercambio de aniones entre los glóbulos rojos y el plasma. Así, al aumentar el CO 2 en el plasma se combina con el agua, y forma ácido carbónico, H2CO3, y aumenta la acidez, la salida de HCO 3- al plasma aumenta su alcalinidad y neutraliza la mayor acidez (descenso de pH) generada por la elevación de H2CO3, al aumentar inicialmente la tensión de CO 2 en el plasma

En el mecanismo de regulación respiratoria del pH participan los cambios de volúmenes respiratorios y la frecuencia del número de respiraciones, pues afectan al transporte de oxígeno en la sangre, el efecto amortiguador de la hemoglobina y la eliminación del ácido carbónico (en forma de CO2) a través de los pulmones. La cantidad de CO 2 liberado del plasma, en los pulmones, aumenta a medida que crecen la velocidad y profundidad de las respiraciones. A su vez, el pH y la pCO 2 en la sangre influye en la amplitud y frecuencia de los movimientos respiratorios: una elevación en la concentración sanguínea del H2CO3 se refleja en una mayor presión de pCO 2 en la sangre y una disminución del pH; ambos factores, a través del sistema nervioso central, estimulan los movimientos respiratorios y así eliminan más CO2 por los pulmones; con ello baja progresivamente la pCO2 en la sangre, sube el pH y desaparece el estímulo de los

46

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

movimientos respiratorios; estos ajustan su frecuencia y amplitud y se expulsa menos CO2, disminuyendo a la concentración del producto hidratado H2CO3. Se restablece así la relación [HCO3-]/ [H2CO3] normalmente 20 a 1 y se mantiene el pH sanguíneo; éste se puede calcular aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbach para el par amortiguador (pK del ácido carbónico, 6.1; relación HCO3-/ H2CO3, 20:1).

Los riñones son reguladores efectivos del equilibrio ácido-básico por su capacidad para eliminar los ácidos fijos, o sea los H +; mientras éstos se excretan se combinan con el -

HCO3 impidiendo así cambios importantes en el pH. Los ácidos fijos producidos en el metabolismo son cerca de 100 mEq diarios; el riñón los elimina el mismo tiempo que recobra la reserva alcalina (los HCO 3-) para que el organismo siga contando con capacidad amortiguadora. El filtrado glomerular en condiciones normales tiene un pH de 7.4; el pH de la orina varía de 4 a 8, de acuerdo con las necesidades del organismo. El ajuste en el pH urinario depende de la disponibilidad de ácidos fijos, H +, necesarios para acidificar la orina o la de HCO3- necesario para alcalinizarla.

OBJETIVO GENERAL: Comprender las actividades reguladoras del pulmón y del riñón para mantener el equilibrio ácido-base en condiciones tendientes a romperlo.

OBJETIVOS ESPECIFICOS: Observar la variación de la concentración de pH en la orina de un individuo que ha realizado ejercicio muscular intenso, y otro que ha ingerido una carga de bicarbonato de sodio. PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: Primera parte 1. Un alumno por equipo desayunará y comerá normalmente evitando beber jugos ácidos. 47

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

2. Tomará 250 ml de agua una hora antes de la práctica. Vaciará la vejiga y descartará esa orina. 3. Tomará 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase. 4. Orinará en un frasco Gerber y medirá el pH con el potenciómetro. 5. Ingerirá 250 ml de agua. 6. Realizará ejercicio muscular intenso, como por ejemplo, subir y bajar escaleras varias veces. 7. Obtendrá muestras de orina cada 15 minutos recolectadas en los frascos Gerber y se determinará el pH hasta completar 5 determinaciones. Segunda parte 1. Un alumno por equipo ingerirá 250 ml de agua antes de la práctica. Vaciará la vejiga y decantará esa orina. 2. Tomará 250 ml de agua inmediatamente antes de la práctica. 3. Orinará en un frasco Gerber y medirá el pH de esta muestra con el potenciómetro. 4. Tomará 250 ml de agua con 7.5 g de bicarbonato de sodio. 5. Obtendrá muestras de orina cada 15 minutos midiendo el pH, hasta completar 5 muestras.

RESULTADOS Registre los resultados de cada uno de los experimentos en los siguientes cuadros: Experimento 1 Muestra

Tiempo

Experimento 2 pH

Muestra

Tiempo

pH

48

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS: MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 15 piezas Vaso de precipitado 6 piezas

Probeta

2L Agua para beber REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 500 g Carbonato de sodio EQUIPO CANTIDAD DESCRIPCIÓN 2 piezas Potenciómetro

ESPECIFICACIONES OBS. De vidrio de 100 mL de capacidad De vidrio de 100 mL de capacidad

ESPECIFICACIONES Grado reactivo ESPECIFICACIONES

OBS.

OBS.

Rango de pH: -2 a 16 Rango de temperatura: -9 a 120 °C Resolución de pH: 0.01 Resolución de temperatura: 0.1°C Exactitud de pH: ±0.01 Calibración automática Electrodo de vidrio

2 piezas

Balanzas analíticas

Capacidad máx: 200 g Lectura: 0.0001 g Reproducibilidad: 0.00015 g Linealidad: ± 0,2 mg

CUESTIONARIO: 1. Menciona cuales son los 4 sistemas amortiguadores que se encuentran en los vertebrados. 2. Describe brevemente el control respiratorio del equilibrio ácido básico 3. Describe los mecanismos renales que regulan el equilibrio ácido básico

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1)

49

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

III.- BIBLIOGRAFÍA Bohinski, RC.1998. Bioquímica. Reverté, S.A., Barcelona Laguna, J.Y. Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México. Lehninger, A 1998. Bioquímica. Omega, Barcelona.

50

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

Separación cromatográfica de aminoácidos

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

6

No. DE SESIONES:

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

1

5

INTRODUCCIÓN: OBJETIVO GENERAL: OBJETIVOS ESPECIFICOS: PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS: MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN

ESPECIFICACIONES OBS.

REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN

ESPECIFICACIONES OBS.

EQUIPO CANTIDAD

ESPECIFICACIONES OBS.

DESCRIPCIÓN

CUESTIONARIO: II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1) III.- BIBLIOGRAFÍA

51

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

Extracción y cuantificación de proteínas de la NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

sangre

7

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

No. DE SESIONES:

1

5

INTRODUCCIÓN: Las proteínas son macromoléculas compuestas por aminoácidos, unidos entre sí por enlaces peptídico, el tipo de aminoácidos que componen una proteína va a determinar sus propiedades físicas y químicas. a) El enlace peptídico se forma de la reacción de condensación que se lleva a cabo entre el grupo amino de una aminoácido (aa 1) y el grupo carboxilo de otro aminoácido contiguo (aa2), por lo cual se forman enlaces covalentes entre estos dos aminoácidos, es el único enlace covalente existente entre los aminoácidos, la unión de estos constituye el esqueleto de las proteínas, la estructura lineal, dicha estructura también recibe el nombre de estructura primaria de las proteínas. b) Estructura secundaria. Se refiere al arreglo espacial de la cadena polípeptidica, arreglo dado por los ángulos de rotación alrededor del enlaces N-C denominado (phi)  y C-C denominado (psi). Todas las estructuras secundarias queda descrita mediante los ángulos de los enlaces  y , y se visualizan el la representación de Ramachandra, algunas de estas estructuras son: a. La hélice alfa. Esta es la forma helicoidal, donde el esqueleto polipeptídico se encuentra enrollado compactamente a lo largo del eje 52

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

longitudinal de la molécula, y los grupos R, sobresalen del esqueleto helicoidal. En este tipo de estructura secundaria se observa una periodicidad cada 0.56 nm, y tiene ángulos de enlace = -45° a –50° y  = -60°, cada giro de la molécula incluye 3.6 aa. Esta estructura se estabiliza por la formación de puentes de hidrógeno internos entre el hidrógeno unido al N y el O unido al C del enlace peptídico del cuarto aminoácido que se encuentra en posición N-terminal en la cadena péptidica, al acumularse la fuerza de puentes de hidrógeno a lo largo de la cadena péptidica esta se hace más estable. b. Hoja beta plegada. Es la conformación más extendida en las cadena polipeptídicas, en este caso el esqueleto de la cadena péptidica se encuentra extendido en zig-zag en lugar de plegarse como una hélice, lo que da la impresión de formar una hoja plegada. Al igual que la conformación antes mencionada se forma por la formación de puentes de hidrógeno entre el hidrógeno de grupo imino y el oxígeno del carbono del enlace peptídico, pero estos enlaces pueden ser intracatenarios (en la misma cadena) o intercatenarios (entre diferentes cadenas). Los grupos R de aminoácidos adyacentes sobresalen de la estructura en zigzag en direcciones opuestas dando lugar a la alternancia. c) A pesar de que las proteínas fibrosas tienen generalmente un solo tipo de estructura secundaria, las proteínas globulares presentan diversos tipos dentro de la misma molécula. La estructura terciaria se forma cuando la proteína que ya adquirió su estructura secundaria se pliega sobre sí misma originando una conformación globular. Es el resultado de interacciones entre los grupos R de los aminoácidos, estas interacciones generalmente son interacciones débiles, como pueden ser: puentes de hidrógenos entre grupos polares, interacciones electrostáticas, entre los grupos cargas, e interacciones hidrofóbicas de tipo Van der Walls y a veces mediante enlaces de puentes disulfuro. 53

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

d) La estructura cuaternaria de las proteínas, se forma cuando dos o más cadenas polipeptídicas o subunidades proteicas separadas, se unen a través de interacciones entre los grupos R libres. Las subunidades péptidicas pueden ser idénticas o diferentes: por ejemplo la hemoglobina se forma con 4 polipéptidos (2 cadenas α globina y 2 β).

OBJETIVO GENERAL: El alumno aprenderá la técnica de sangrado en diversos animales domésticos, así como la diferencia existente entre suero y plasma.

OBJETIVOS ESPECIFICOS: 1) El alumno conocerá el principio químico usado para realizar la determinación de la concentración de proteínas en suero. 2) El alumno aprenderá a realizar la determinación de la concentración de proteínas en suero, haciendo una curva tipo de albúmina.

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA:

1. Los alumnos observarán cual es la mejor forma de sangrar a diversas especies domésticas. 2. Y de uno de ellos se tomarán 10 ml de sangre venosa, en tubos de ensayo sin anticoagulante. 3. Dejar coagular la sangre sin agitación, para evitar la hemólisis. 4. Posterior a este paso centrifugar a 6,000 g, para separar el coagulo del suero. 5. Antes de la realización de la cuantificación de proteínas, hacer una curva tipo utilizando diluciones de albúmina sérica bovina. a. Protocolo para la elaboración de la curva de Albúmina Sérica Bovina i. Preparar un estándar de BAS, pesando 1.6 mg/ml de BSA. 54

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

ii. Colocar 60 µL del estándar en el pozo B 12 de la placa de ELISA. iii. Colocar 30 µL de diluyente H2O o RIPA (1:5) en cada pozo de C12 a H12 iv. Hacer diluciones seriales 1:2, de BSA, para lo cual se procederá a pasar 30 µL del estándar BSA del pozo B12 al C12, mezclar bien y pasar 30l, de este pozo al pozo D12 y así sucesivamente hasta terminar la columna. v. En el pozo A1, A2 y A3, colocar 5 µL de diluyente, sin BSA. vi. De cada una de estas diluciones colocar 5 µL de cada pozo en las columnas 1, 2 y 3, a partir de la fila B. 6. Realizar una cuantificación de las proteínas utilizando el método de Löwry, tanto del suero sin tratamiento, como del concentrado del suero, procediendo de la siguiente manera a. Preparación de las muestras i. En cada uno de los pozos vacíos, colocar 5 µL, de muestra (suero tratado o sin tratamiento), así como diluciones 1:5 o 1:10 de las muestras. 7. Preparación de los reactivos del Kit de Lowry (Marca Bio Rad TM) El kit consta de 3 reactivos denominados S, A y B. Contabilizar cuantos pozos se van a utilizar para preparar los reactivos y evitar desperdicios. a. Mezclar 20 µL del reactivo S por cada 1 ml de reactivo A formando un reactivo llamado A'. b. Colocar 25 µL de A' en cada pozo a cuantificar. c. Posteriormente colocar 200 µL del reactivo B en cada pozo. d. Dejar reposado la placa durante 15 minutos. e. Leer en un Lector de Elisa a 630 nm.

55

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

1

2

3

4

5

6

7

8

Semestre: 1

9 10 11 12

A B

1:2

C D E F G H Pozos para preparar las diluciones de BSA Pozos para la curva tipo de BSA

Pozos para el blanco

Pozos para las muestras a cuantificas

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS: MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 8 piezas jeringa con aguja o agujas de vacutainer 8 piezas Tubo para toma de muestra sanguínea 8 piezas Placas de ELISA 8 piezas Bolsas de diálisis REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 300 g Sulfato de amonio

ESPECIFICACIONES 10 mL

OBS.

Con capacidad de 10 mL, sin anticoagulante

ESPECIFICACIONES OBS. Grado analítico 56

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

100 mL EQUIPO CANTIDAD 1 pieza 1 pieza

Reactivo de Löwry

Marca Bio Rad

Semestre: 1

TM

DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS. Centrífuga clínica Lector para placas Rango de longitud de ELISA Biochrom onda: 200 a 100 nm Anthos Zenyth 200rt Microplate Reader

CUESTIONARIO: 1) ¿Qué tipo de proteínas se encuentran en mayor cantidad en el suero? 2) Investiga que otras proteínas componen el suero de los mamíferos. 3) Investiga qué función tiene cada una de las proteínas del plasma de un mamífero. 4) Menciona el nombre de una enfermedad causada por alteraciones en alguna de las proteínas sanguíneas, indicando cual sería la sintomatología que observarías como veterinario.

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1)

III.- BIBLIOGRAFÍA Bohinski, RC.1998. Bioquímica. Reverté, S.A., Barcelona Laguna, J.Y. Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México. Lehninger, A 1998. Bioquímica. Omega, Barcelona.

57

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

Cinética de la enzima ureasa

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

8

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

No. DE SESIONES:

1

5

INTRODUCCIÓN: Con excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico, tal es el caso de las ribozima, todas las enzimas son proteínas. Estás moléculas actúan como catalizadores biológicos, es decir aceleran una determinada reacción química en la que uno o varios sustratos son transformados en uno o varios productos. Algunas de las enzimas solamente requieren de la proteína para ser activas biológicamente, pero en algunos casos requieren de otros componentes químicos como son: iones inorgánicos (Fe2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+) denominado cofactor; otro grupo químico son los complejos orgánicos o metaloorgánicos denominados coenzimas, tal es el caso del FAD, NADH, Co-A; estos actúan como transportadores transitorios de grupos funcionales específicos. Estos pueden o no unirse de manera covalente con la proteína, si se une de manera así se denomina grupo prostético. Una enzima completa junto con la coenzima o cofactor se denomina holoenzima, en tanto que la parte proteica recibe el nombre de apoenzima o apoproteína. La reacción catalizada por una enzima tiene lugar dentro de los confines dentro de la estructura secundaria de la enzima denominada sitio activo, donde la enzima fija al sustrato, compuesto químico sobre el cual actúa la enzima, formado el denominado complejo enzima-sustrato; una vez formado este complejo se abate la energía de 58

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

reacción Su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación, ya que si esta se pierde (desnaturaliza) se pierde su función. Por esta razón las enzimas presentan actividad únicamente si se mantiene la integridad de su conformación, ya que si esta se pierde (desnaturaliza) se pierde su función. Las enzimas siguen los principios energéticos de la termodinámica, para lo cual cambian la energía inicial de los productos a un estado de energía final de los productos, siempre

formación de productos, la pregunta seria porque no ocurre este proceso entonces, para lo cual es necesario mencionar que para que se lleve a cabo la transformación es necesario primero alcanzar un punto de transición para lo cual es necesario aplicar la denominada energía de activación, que permite que se llegue a un estado energético intermedio (de transición) para que ocurra la reacción enzimático, la energía de activación.

Cinética enzimática La cinética enzimática comprende el estudio de la velocidad de reacción de una enzima determinada y de las condiciones que la modifican. Las variables importantes en los estudios cinéticos son las concentraciones se los sustratos y los productos, la temperatura, la presión, el efecto de ciertos solventes, el pH, la fuerza iónica del medio, el tiempo, la presencia de inhibidores, así como la estereoquímica y la estequiometría de las moléculas involucradas, entre otros factores. 59

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

La cinética enzimática es la rama de la Bioquímica que estudia la velocidad de las reacciones químicas catalizadas por enzimas, considerando que la reacción enzimático se puede ejemplificar: Donde E representa la concentración enzimática, S la concentración del sustrato, P la concentración del producto y ES el complejo enzima sustrato.

E+S

K1 K-1

ES

K2

P+E

En forma práctica, la velocidad de reacción de una enzima puede determinarse utilizando cualquiera de los siguientes procesos: a) Medir la disminución en la concentración del sustrato en una unidad de tiempo determinada. b) Medir el aumento en la concentración del producto final en una unidad de tiempo determinada. c) Medir el cambio en la concentración de una coenzima en una unidad de tiempo determinada, como medición indirecta de la actividad de la enzima. La forma de realizar las mediciones puede ser por muestreo discontinuo, el la cual se toman muestras de las mezclas de reacción en diferentes intervalos de tiempo, se para la reacción y se hace la determinación del sustrato, producto o coenzima. También puede ser una medición continua, en donde se hace uso de una propiedad física distintiva del sustrato, producto o coenzima, la cual se puede medir sin interferir con el desarrollo de la reacción. La curva de desarrollo de la reacción así obtenida muestra que la reacción desciende con el tiempo, debido a: a) Si la reacción es significativamente reversible, la velocidad de la reacción inversa aumentará en tanto aumente la concentración del producto. b) La enzima puede desnaturalizarse a lo largo de la reacción enzimática c) El producto de la reacción pude inhibir la actividad enzimática. 60

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Por lo tanto para medir la actividad catalítica máxima de una cantidad de enzima es necesaria: a) Medir la velocidad inicial de la reacción preferiblemente por un método continuo. b) Realizar la prueba usando un exceso de sustrato. c) Mantener las condiciones óptimas de reacción (pH y temperatura) d) Determinar la velocidad de la reacción sin enzima (desnaturalizándola) Siguiendo estas recomendaciones, cuando graficamos los valores de la velocidad inicial contra los valores de la concentración de sustrato, se obtiene una hipérbola, que demuestra que para valores bajos de [S] la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato, pero a valores altos la velocidad inicial ya no se modifica, por lo tanto la ecuación que define la actividad enzimático se escribe de la siguiente forma. V0 =

VMzx[S] [S] + Km

Esta ecuación se conoce como la ecuación de Michaelis-Menten y Km es la constante de Michaelis, y es específica para cada enzima Enzima Ureasa Fue una de las primeras enzimas en ser caracterizada (Sumner, 1926). Tienen especificidad absoluta por un sustrato, la urea. La ureasa cataliza la reacción que hidroliza este compuesto nitrogenado en dos molécula del ión amonio y una de bióxido de carbono, dicha reacción se muestra en la figura 1. Para llevar a cabo su actividad requiere del ión Ni2+. O NH2

C Urea

2NH4+

NH2 2H2O

2CO2

Es importante señalar que la urea es producida naturalmente en el hígado en el llamado 61

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

ciclo de la urea y en el caso de los animales ureotélicos es un compuesto clave para la eliminación del exceso de N metabólico; adicionalmente , en los rumiantes puede ser reciclada y ya sea por vía sanguínea o salival, retornada al rumen, donde la ureasa producida por algunas bacterias ruminales permite obtener el ión amonio que es reabsorbido como amoníaco y utilizado para la formación de aminoácidos. Conocida esta propiedad fisiológica de los rumiantes con fines zootécnicos de alimentación se ha extendido la práctica de suministrar urea como fuente de nitrógeno no proteico, especialmente en explotaciones intensivas. La ureasa tiene un peso molecular de 483 kDa y un punto isoeléctrico de 5.0. Consta de seis subunidades idénticas. Además de ser producida por las bacterias del rumen, también es producida por diversos invertebrados marinos, así como ciertas plantas leguminosas como el frijol de soya y el haba.

OBJETIVO GENERAL: El alumno determinará cuáles son los diversos factores que influyen en la actividad enzimática y la manera en la que pueden ser observados o medidos en el laboratorio

OBJETIVOS ESPECIFICOS: El alumno determinará la influencia en la actividad enzimática del inhibidor cloruro de mercurio (HgCl2), en la reacción catalizada por la ureasa.

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: 1. A cada equipo se le proporcionará un tubo de ensaye con extracto de ureasa de soya previamente centrifugado.

1. Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa. 62

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

a. Se prepara la siguiente serie de tubos: Tubo

1

2

3

4

5

6

Urea 0.25 M

0.5

1.0

2.0

5.0

7.5

7.5

11.0

10.0

7.0

4.5

4.5

A. fosfatos pH 7.2 11.5 HgCl2 al 1%

4 gotas

Incubar en baños María durante 5 min. A 50 °C Ureasa

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Incubar en baños María durante 5 min. A 50 °C HgCl2 al 1%

4 gotas 4 gotas

4 gotas

4 gotas

4 gotas

Nota. El volumen indicado es en ml, con excepción en donde se indica gotas.

b. Para la titulación se pasará 5 ml del tubo 6 (blanco) a un matraz Erlenmeyer de 125 ml. c. Se agregarán 2 gotas del indicador rojo de metilo y se observará la coloración obtenida. Si hubo actividad, se habrá formado hidróxido de amonio (NH 4OH), que es la base y la solución se verá amarilla. Si no hubo actividad enzimática, entonces la solución tendrá un color rosa y no será titulada. d. Cuando la solución sea amarilla, se procederá a su titulación, agregando lentamente al matraz ácido clorhídrico al 0.1 N por medio de la bureta, hasta que el color del indicador vire a canela. Es necesario anotar los ml de HCl utilizados en la titulación. e. Después se procederá a titular 5 ml de cada uno de los tubos restantes de este experimento en su respectivo matraz, tal como se hizo con el control. f. A continuación se calculará el valor de titulación corregido (VTC) de cada tubo. Para esto se debe restar al valor de cada tubo, el valor del tubo control, ambos de ml.

2. Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa. a. Se prepara la siguiente serie de tubos: 63

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Tubo

1

2

3

4

5

Urea 0.25 M

7.5

7.5

7.5

7.5

7.5

A. fosfatos pH 7.2 3.5

3.5

3.5

3.5

3.5

Agua destilada

0.7

0.5

0.3

0.1

2.0

2.5

4 gotas

4 gotas

0.9

Incubar en baños María durante 5 min. A 50 °C Ureasa

0.5

1.0

1.5

Incubar en baños María durante 5 min. A 50 °C HgCl2 al 1%

4 gotas

4 gotas

4 gotas

b. Se procederá con la titulación de cada tubo, y al cálculo del VTC como se indica en el punto II, incisos e y f de esta metodología.

3. Determinación del efecto de la variación en la temperatura sobre la velocidad de reacción de la ureasa. a. Se prepara la siguiente serie de tubos: Tubo

1

2

3

4

Urea 0.25 M

7.5

7.5

7.5

7.5

A. fosfatos pH 7.2

4.5

4.5

4.5

4.5

20 °C

50 °C

80 °C

0.5

0.5

0.5

20 °C

50 °C

80 °C

4 gotas

4 gotas

4 gotas

Incubar

en

baños 0 °C

María durante 5 min. Ureasa Incubar

0.5 en

baños 0 °C

María durante 5 min. HgCl2 al 1%

4 gotas

b. Se procederá con la titulación de cada tubo, y al cálculo del VTC como se indica en el punto II, incisos e y f de esta metodología.

64

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

4. Determinación del efecto de la variación del pH sobre la velocidad de reacción de la ureasa. a. Se prepara la siguiente serie de tubos: Tubo

1

2

3

4

5

Urea 0.25 M

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5

7

8.5

10

0.5

0.5

4 gotas

4 gotas

7 ml de fosfatos 3 pH

Incubar en baños María durante 5 min. A 50 °C Ureasa

0.5

0.5

0.5

Incubar en baños María durante 5 min. A 50 °C HgCl2 al 1%

4 gotas

4 gotas

4 gotas

b. Se procederá con la titulación de cada tubo, y al cálculo del VTC como se indica en el punto II, incisos e y f de esta metodología.

RESULTADOS 1. Calcular los µM de urea inicial en cada tubo de los experimentos, se debe considerar que esta se preparó a 0.25 M, es decir, hay 25 µM por cada ml y cada tubo tiene un volumen final de 12.5 ml. Por lo que para realizar el cálculo utilice la siguiente fórmula: (250 µM)(ml de urea al 0.25 M)/125 ml. 2. Para calcular la concentración de urea hidrolizada (en µM), se debe de multiplicar el valor de VTC por 50. Esto se debe a que cada molécula de urea da origen a dos moléculas de NH4OH, cada una de las cuales reacciona a su vez con una molécula de HCl. Como la solución de HCl está a 0.1N, esto significa que hay 100 µM /ml, por lo que cada ml dicha solución equivale a 50 µM/ml (100/2) de moléculas de urea hidrolizada. Este cálculo se hará en cada una de las variaciones manejadas en este experimento. 3. Una vez realizados todos los cálculos, completar las siguientes tablas: 65

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

1. Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa. Tubo

M de urea inicial VTC

M

en cada tubo

hidrolizada

de

urea

1 2 3 4 5 6 Se procederá a graficar en Excel los M de urea hidrolizada en el eje de las ordenada (y) y los ml de sustrato inicial en el eje de la abscisas (x). Se verificará si con los datos obtenidos se puede trabajar con los métodos de MichaelisMenten y Lineveaver-Burk para determinar la afinidad de la enzima por el sustrato.

2. Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa. Tubo

M de urea inicial en

VTC

cada tubo

M de urea hidrolizada

1 2 3 4 5 Se procederá a graficar en Excel la M de urea hidrolizada en el eje de las ordenada (y) y los ml de enzima inicial en el eje de la abscisas (x).

66

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

3. Determinación del efecto de la variación en la temperatura sobre la velocidad de reacción de la ureasa. Tubo

M de urea inicial en

VTC

cada tubo

M de urea hidrolizada

1 2 3 4 Se procederá a graficar en Excel la M de urea hidrolizada en el eje de las ordenada (y) y la temperatura en el eje de la abscisas (x).

4. Determinación del efecto de la variación del pH sobre la velocidad de reacción de la ureasa. Tubo

M de urea inicial en cada tubo

VTC

M de urea hidrolizada

1 2 3 4 5 Se procederá a graficar en Excel los M de urea hidrolizada en el eje de las ordenada (y) y el pH del medio en el eje de la abscisas (x).

CONCLUSIONES El alumno identificará como se afecta la actividad enzimática por cada uno de los factores probados en esta práctica y analice que es lo que ocurre en cada factor.

67

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:

MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 36 piezas Tubos de ensaye 6 piezas Pipeta graduada 6 piezas

Pipeta graduada

6 piezas

Pipeta graduada

18 piezas

Matraz Erlenmeyer

6 piezas 6 piezas 6 piezas 6 piezas 6 Piezas

Bureta Soporte universal Pinza de bureta Propipeta Gradilla para tubos de ensaye

REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 50 g Urea 0.25 M

200 mL

10 mg

Amortiguador de fosfatos 0.5 M, pH 7.2 Bicloruro de mercurio al 0.1%

ESPECIFICACIONES OBS. 15 mL de capacidad De vidrio de 1 mL de capacidad De vidrio de 5 mL de capacidad De vidrio de 10 mL de capacidad De vidrio de 125 mL de capacidad 50 mL de capacidad

ESPECIFICACIONES OBS. Grado de pureza: para biología moleular Grado reactivo

500 mL 5 mg

Ácido clorhídrico Rojo de metilo

Grado reactivo 97% de pureza, adecuado para cultivo celular. Grado reactivo Grado reactivo

200 mL

Etanol

Grado reactivo

Solución al 0.1% en agua Solución 0.1 N Solución al 0.04% en etanol

68

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

500 U

Extracto de ureasa

500 mL EQUIPO CANTIDAD 1

Agua desionizada DESCRIPCIÓN Baño maría

Semestre: 1

Urease from Canavalia ensiformis (Jack bean) Type III, powder, 15,00050,000 units/g solid (Sigma)

ESPECIFICACIONES OBS. Con tapa, Rango de temperatura 5 a 180°C

CUESTIONARIO: 1) ¿Por qué a inicialmente la temperatura aumenta la velocidad de la actividad enzimática? 2) ¿Qué es lo que ocurre cuando al aumentar la temperatura la velocidad enzimática se vuelve 0? 3) ¿Cuál es el pH óptimo de acción de la ureasa? 4) ¿Cómo explica que el pH produzca un cambio en la actividad enzimática? 5) ¿Cuál es el pH óptimo de acción de la ureasa? 6) ¿Cuál fue el valor de Km y Vmax para la ureasa? 7) Qué tipo de técnica de muestreo se utilizó en esta práctica. 8) Investiga que equipos comerciales usan las técnicas de muestreo continuo. 9) Investiga cuales son las unidades usadas para medir la actividad enzimática y como se define.

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1)

69

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

III.- BIBLIOGRAFÍA Moris, JG.1982. Fisicoquímica para biólogos. Ed. Reverté, S.A., Barcelona. España Laguna, J. Y. Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México. Lehninger, A. 1998. Bioquímica. Omega, Barcelona. Alquicira, CJA; Barrón, G.M.C.; García, L.E; Ocampo, L.J. Manual de Prácticas de Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. FES Cuautitlán, UNAM, México.

70

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

Determinación de glucosa

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

9

No. DE SESIONES:

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

1

5

INTRODUCCIÓN: Los carbohidratos también conocidos como glúcidos son las biomoléculas más abundantes den la naturaleza, en general son sumamente importantes ya que de ellos se obtiene la mayor parte de energía de las células no sintéticas, aunque pueden presentar diversas funciones. Los monosacáridos son sólidos incoloros y cristalinos, solubles en agua, con sabor dulce. Su estructura básica es una cadena de carbonos unidos por enlace simple, uno de los carbonos se encuentra unido a un átomo de O por un doble enlace, formado un grupo carbonilo; y los demás carbonos unidos a un grupo hidroxilo y un hidrógeno, por lo que también se le conoce como polialcoholes; su fórmula reducida es CH 2O, lo que indica su naturaleza de hidratos de carbono. Esto se puede clasificar: 1. Por el número de carbonos que presentan en: Triosas (3), tetrosasas (4), pentosas (5), hexosas (6), heptosas (7). 2. Y por el grupo químico del que se forman: a. Grupo aldehído.- se denominan como aldosas, b. O, grupo cetona.- se denominan como cetosas. Los monosacáridos pueden unirse a través de enlaces glucosídicos, este tipo de enlace se forma por la reacción de esterificación que ocurre cuando un grupo –OH (hidroxilo) de

71

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

un monosacárido reacciona con el carbono anomérico de otro monosacárido, uniéndose ambos a través de un enlace covalente. Por el número de monosacáridos que se unen pueden ser: a. Oligosacaridos consisten de cadenas cortas de monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos, los más abundantes son los disacáridos. b. Polisacáridos, formados por a veces cientos de monosacáridos, los cuales pueden se lineales como es el caso de la amilopectina y la celulosa; o ramificados como el caso del glucógeno y la amilosa. Los monosacárido y algunos disacáridos son capaces de reducir a o agentes oxidantes suaves como el ión férrico (Fe 2+) o el cúprico (Cu2+), en estos azúcares el grupo aldehído se oxida para formar un grupo carboxilo, dando reacciones coloridas características. Cuando los disacáridos al unirse por enlace glucosídico a veces pierden la capacidad de reducción, solo en el caso de que presenten el carbono anomérico mantienen su capacidad de reducir a estos agentes oxidantes. El principal carbohidrato en el metabolismo de los animales es la glucosa, el cual se requiere este en una concentración adecuada ya que el cerebro requiere de este carbohidrato para su funcionamiento. Para lograr este objetivo diversas vías metabólicas estan encargadas de mantener la homeostasis de la glucosa, cuando alguna de ellas falla se presenta una patología.

OBJETIVO GENERAL: Se realizará una determinación de glucosa en diversos animales domésticos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: 1. Reacción de Fehling: 

Con cada uno de los carbohidratos, prepara un soluciones al 1%, y tomar 3 ml de 72

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

esta solución. 

Añade 1 ml del reactivo de Fehling A y 1 cc. de Fehling B. El líquido del tubo de ensayo adquirirá un fuerte color azul durante 3 minutos.



Calentar el tubo a baño María. a) La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo. b) La reacción será negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azulverdoso.



Ahora bien, al tubo de sacarosa adiciona 10 gotas de ácido clorhídrico al 10% (HCl)



Calienta al mechero durante un par de minutos.



Neutraliza la reacción con bicarbonato.



Dejar enfriar y realizar la Prueba de Fehling nuevamente.



Observa nuevamente tu tubo.

2. Reacción del Lugol: Este método se usa para identificar a polisacáridos como el almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. 

Poner en un tubo de ensayo unos 3 ml de las soluciones de carbohidratos usada en el punto anterior.



Añadir 5 gotas de lugol. a. Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reacción es positiva.



Observa los tubos

CONCLUSIONES Analiza él porque de cada una de las reacciones e investiga cual es el fundamento de cada una de las reacciones realizadas en este laboratorio

73

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS: MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 10 piezas Tubos de ensayo 1 piezas Mechero Butsen 1 piezas Tripie con rejilla 2 piezas Vaso de precipitados 1 Gradilla REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN 100 mL Reactivo de Fehling AyB 10 mL Lugol 1 mL Ácido clorhídrico 10 g Sacarosa 10 g Maltosa 10 g Glucosa 10 g Almidón 10 g Lactosa EQUIPO CANTIDAD DESCRIPCIÓN

ESPECIFICACIONES 10 mL de capacidad

OBS.

De vidrio de 200 mL de capacidad

ESPECIFICACIONES Grado reactivo

OBS.

Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo ESPECIFICACIONES

OBS.

CUESTIONARIO: 1) ¿Qué entiendes por azúcares reductores? 2) Explica porque la sacarosa y el almidón no son azúcares reductores. 3) ¿Por qué después del tratamiento con HCl las sacarosa ya reacciona con el reactivo de Fehling? 4) ¿Cómo explicas que únicamente el almidón de positiva la prueba del lugol? 5) Qué utilidad tiene que tu conozcas estos datos en tu vida profesional como Médico Veterinario Zootecnista.

74

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1)

III.- BIBLIOGRAFÍA Bohinski, RC.1998. Bioquímica. Reverté, S.A., Barcelona Laguna, J.Y. Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México. Lehninger, A 1998. Bioquímica. Omega, Barcelona.

75

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

I.-

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

No. DE PRÁCTICA:

Extracción y cuantificación de DNA

10

No. DE SESIONES:

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

1

5

INTRODUCCIÓN: La información genética de los organismos se almacenada dentro de una molécula de características ácidas y rica en bases nitrogenadas denominada ácido desoxiribonucleico (DNA), dado el tamaño del núcleo celular, esta se encuentra compactada por medio de proteínas

(histonas)

en

el

núcleo

celular.

El

DNA

es

un

polímero

de

desoxiribonucleotidos. Cuando la base nitrogenada (negro) se une al Carbono 1’ del azúcar (azul), se forma el desoxinucleósido, que reciben el nombre de desoxi-adenosina, desoxi-guanosina, desoxi-citidina y desoxi- timidina.. Finalmente si al desoxinucleosido se le une un grupo fosfato (rojo) en el Carbono 5,’ del azúcar, se forman los desoxiribonucleótidos, los cuales se denominan desoxiadenilato, desoxiguanilato, desoxitimidilato y desoxicitidilato.

76

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

H C N

CH

HC

CH

O O

P

O

N

C5’

H C

O

O

A

N

C

HC

C

N CH

O

N

N O

P

O

O

O

B

C3’

La polimerización de desoxinucleótidos para la formación del DNA se hace a través de la formación de un enlace covalente entre el grupo –OH del C3’ del azúcar, uno de los grupos –OH del fosfato, este tipo de enlace se conoce con el nombre de enlace fosfodiéster (línea punteada). Por lo tanto, de esto podemos sacar dos conclusiones: 1. Que los ácidos nucleicos presentan dirección, de manera similar a lo que ocurre con las proteínas, pero en este caso van de 5’(donde no hay ningún nucleótido unido, solo el fosfato final), a 3’ (donde no hay fosfato unido, sino un grupo –OH libre). NOTA: en realidad en los extremos pueden unirse uno a más fosfatos u otros grupos. 2. Los esqueletos covalentes de los ácidos nucleicos consisten de unidades repetidas de azúcar y grupo fosfato, en tanto que las bases nitrogenadas se encuentran hacia el exterior del esqueleto carbonado, semejando los grupos radicales de los aa. Debido al fosfato, los ácidos nucleicos son hidrofilicos, formando puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, debido a que el pK del grupo fosfato es cercano a 0, a pH de 7 se encuentra ionizado, por lo que presenta una carga neta negativa, siendo buenos donadores de protones, lo que les confiere su característica ácida. Estas cargas

77

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

negativas casi siempre se encuentran neutralizadas por las interacciónes de los ácidos nucleicos con cargas positivas de proteínas, iones metálicos o paliaminas. 3. Como las bases se encuentran hacia el exterior del esqueleto hidrocarbonado, ayudan a la estabilización de la cadena a través de las interacciones de van der Walls de las porciones no polares de las bases nitrogenadas, además de estabilizarse por la formación de puentes de hidrógeno, entre los grupos funcionales de los anillos heterociclicos. Entre estas interacciones se encuentran las de tipo Watson-Crick, las más importantes, que se presentan predominantemente en la formación de la doble hélice de DNA.

Determinación de la concentración de DNA por espectroscopia de UV Debido a que las bases nitrogenadas en el DNA absorben la luz ultravioleta (UV) de manera eficiente, teniendo un máximo de absorción a aproximadamente 260 nm; la determinación de la concentración de DNA por espectrofotometría de UV puede ser usada como un método exacto, rápido y no destructivo para determinar la concentración de cantidades tan bajas como 2.5 µg/ml. 78

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

El fundamento de esta técnica radica en el hecho de que las bases nitrogenadas al tener enlaces resonantes absorben la longitud de onda de la UV a 260 nm. Y al hecho de que según la Ley de Lamber-Beer que relaciona la cantidad de luz absorbida con la concentración del componente en una solución, por lo que en condiciones adecuadas, la cantidad de luz absorbida por una sustancia, cuando se ilumina con luz de longitud de onda conveniente, es directamente proporcional a la concentración del componente presente en una solución, y definen esto con la siguiente formula: A=abc donde: a= es la absorción específica. Característica constante de un sistema en particular solutosolvente para una cierta longitud de onda. b= longitud del trayecto luminoso. Depende del tamaño del tubo o de la cubeta que se utiliza. c= Concentración del componente. En determinaciones de concentraciones de DNA se observo que cuando se utiliza un paso de luz de 1 cm, el coeficiente de extinción del DNA a 260 nm de longitud de onda es de 20. Basado en este coeficiente de extinción la absorbancia a 260 nm en una cubera de cuarzo de 1cm de paso de una solución de 50 doble cadena es igual a 1. Por lo que se concluyo que la densidad óptica del DNA a 260 nm (OD 260 DNA/ml] /[1 unidad de OD260]. Con lo que finalmente se llego a la formula de: ) X (factor de dilución).

260

Por lo que de esta forma se calcula actualmente la concentración del DNA cuando se lee con un espectrofotómetro y una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz. Nota: Debe de usarse cubetas de cuarzo debido a que este material no es capaz de absorber la luz UV, por lo que hace posible la lectura espectrofotométrica.

79

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

Determinación de la pureza del DNA por espectroscopia de UV Las proteínas tienen una absorbancia máxima a 280 nm debido principalmente a los residuos de triptófano. Por lo tanto la relación a 260/280, por lo tanto es una medida de la pureza de la preparación de DNA y debe caer entre 1.65 y 1.85. Un valor menor sugiere contaminación de proteína. Si el fenol, el cual tiene una longitud máxima a 270 nm, esta contaminando la preparación de DNA, entonces al A 260 puede ser anormalmente alta, lo que provoca la sobreestimación de la concentración del DNA.

OBJETIVO GENERAL:

OBJETIVOS ESPECIFICOS: Extraer el DNA a partir de glóbulos blancos de la sangre Cuantificar a través de espectrofotometría, el DNA extraído Determinar la pureza de la extracción determinando el radio absorbancia a 260/280 nm PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA: Extracción de DNA partir de sangre total 1. Del tubo de EDTA con sangre, tomar 700 µL, colocarlos en un tubo ependorff de 2 ml. 2. Adicionar 700 µL de buffer TKM1 más 18 µL de Tritón X100 y agitar vigorosamente con el vortex durante 30 segundos. 3. Centrifugar a 3,500 rpm durante 5 minutos, y desechar el sobrenadante.

80

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

4. Realizar un lavado con el buffer TKM1, para lo cual adicionar a la pastilla obtenida en el paso anterior 700 µL de buffer TKM1, agitar con el vortex y repetir el paso 3. 5. A la pastillas de leucocitos que se encuentran en el fondo del tubo adicionar 120l de buffer TKM2 más 7 l de solución de SDS 10%. 6. Agitar vigorosamente con el vortex durante 1 minuto. 7. Incubar a 56°C durante 10 minutos. 8. Adicionar 60 µL de solución de NaCl 5M. 9. Agitar con vortex durante 30 segundos. 10. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 minutos. 11. Recuperar en un tubo eppedorf limpio el sobrenadante, midiendo el volumen aproximado que se recupero. 12. Adicionar dos volúmenes de etanol concentrado frío (-20°C) 13. Mezclar por inversión del tubo varias veces. 14. Centrifugar a 3,500 rpm durante 5 minutos, en una centrifuga refrigerada a 4°C, y decantar el sobrenadante. 15. Resuspender la pastilla con 400l de etanol al 70%. Y repetir el paso 14. 16. Dejar secar la pastilla al aire durante 10 minutos. 17. Resuspender la pastilla con 200 ml de TE ó agua destilada estéril. 18. Incubar a 65°C durante 20 minutos y proceder con la cuantificación o almacenar a 20°C. Determinación de la concentración y pureza del DNA 1. Se prepara una dilución 1:100 en agua estéril inyectable de la muestra de DNA que se desee cuantificar. 2. Y se colocan 500 l de la mezcla anterior en una celda de cuarzo, se revisa que no tenga burbujas de aire que interfieran con la lectura. 3. Se enciende el espectrofotómetro Janway 6305 de acuerdo a lo indicado en el instructivo. 4. El blanco de lectura en este caso será agua inyectable estéril. 81

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

5. Leer la absorbancia de la solución problema a 260 nm (lectura de DNA) y a 280 nm (lectura de proteínas) 6. Determina la concentración de DNA en la dilución asumiendo que el dsDNA que tiene una absorbancia (Ab260) de 1 a 260 nm, tiene una concentración de 50

[DNA] (g/ml o ng/l)

=

(Ab260)

X

(50 g/ml) Factor de OD del dsDNA

X

(100) Factor de dilución

µg/ml. 7. La pureza de la muestra al indicar la relación de los valores de lectura a 260/280. El cual debe ser de encontrarse entre 1.65 y 1.85 para DNA puro. Si se obtiene valores menores a 1.7 quiere decir que el DNA está muy contaminado con proteínas y se recomienda realizar una nueva purificación.

Determinación de la concentración y pureza del DNA 1. Adicionar 1 g de agarosa en un matraz 2. Adicionar 100 ml de TAE 1X o TBE 0.5X 3. Adicionar 2 µl de bromuro de etidio al 2.5% 4. Calentar con el microondas hasta la completa disolución de la agarosa y preparar el gel. 5. Correr 2l del DNA extraído con 2 l de buffer de carga, a 100 Volts durante 15 minutos y visualizar en el transiluminnador.

RESULTADOS

1. Menciona cuanto DNA obtuviste de tu extracción. 2. Indica cual fue el grado de pureza el DNA que obtuviste 3. Y menciona que observaste en el gel. 82

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

CONCLUSIONES Analiza cual es la función de cada una de las soluciones usadas en esta practica, y compara tus resultados con los otros obtenidos por tus compañeros y las muestras proporcionadas por el profesor.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:

MATERIAL/UTENSILIOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES 6 piezas Matraces Erlenmeyer 250 mL 6 piezas Vasos de precipitado 12 piezas Pipetas (6 de 5 mL y 6 de 10 mL) 40 piezas Tubos de ensaye REACTIVOS/INSUMOS CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES 6 tubos Sangre de cualquier ser vivo, obtenida por venopunción en tubos con EDTA 200 mL Buffer TKM1 200 mL Buffer TKM2 200 mL Triton X100 200 mL Solución de SDS al 10% 200 mL Solución de cloruro de sodio 5M 500 mL Etanol puro 500 mL Etanol al 70% 200 mL Solución de TE 1000 mL Agua destilada 500 mL Buffer de carga EQUIPO

OBS.

OBS.

83

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

CANTIDAD 1 1

Semestre: 1

DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS. Votex Centrifuga para microtubos Balanza analítica

1 ANEXO Buffer TKM1

10 mM de Tris.HCL pH 7.6, 2 mM de EDTA pH 8 10 mM KCl 10 mM MgCl2

BUFFER TKM2 10 mM de Tris.HCL pH 7.6, 2 mM de EDTA pH 8 10 mM KCl 10 mM MgCl2 mM NaCl

Buffer de corrida 6X (DNA) Glicerol

30%

TBE 10x

50%

Azul de Bromofenol 0.25% Xilecianol

0.25%

Buffer de TBE 10X 0.89 M de Tris-base 0.89 M ácido bórico

84

LICENCIATURA EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Semestre: 1

40 ml de EDTA 0.5 M pH 8 Afora a 1 L de agua

Buffer de TE 10 mM de Tris-HCL, pH 8.0 0.1mM de EDTA

CUESTIONARIO: 1. Explica que es el DNA y cual es su importancia a nivel biológico 2. Explica porque se utilizaron dos diferentes soluciones en esta práctica. 3. Explica porque la lectura del DNA se realiza a 260 nm. 4. Explica que entiendes por coeficiente de extinción del DNA. 5. Investiga otra técnica de extracción diferente a la mencionada en esta práctica, indicando su fundamente y las ventajas y desventajas de dicha técnica con respecto a esta.

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: (Ver practica 1)

III.- BIBLIOGRAFÍA Bohinski, RC.1998. Bioquímica. Reverté, S.A., Barcelona Laguna, J.Y. Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México. Lehninger, A 1998. Bioquímica. Omega, Barcelona. Zyskind, J.W. y Bernstein, S.I. 1992. Recombinant DNA Laboratory Manual. Academia Press, Inc. San Diego.

85