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UPIBI-IPN

[Guía de Prácticas Biotecnología Farmacéutica]

[2014] INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA Departamento de Bioprocesos Academia de Biotecnología

Realizado por: M.en C. Flor Selene Villalobos escobedo M.en E. Hernán cortés arroyo M. en E. Héctor molina Jiménez Dra. Estela Flores Gómez

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

ÍNDICE REGLAMENTO DEL LABORATORIO

4

PRÁCTICA 1. OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO DE HONGOS

5

I.

5

OBJETIVOS

II. INTRODUCCIÓN

5

III.

MATERIAL Y REACTIVOS

5

IV.

METODOLOGÍA

6

V. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

8

VI.

CUESTIONARIO PREVIO

8

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

9

PRACTICA 2. TIPIFICACIÓN SANGUÍNEA ABO Y FACTOR RH

10

I.

10

OBJETIVOS

II. INTRODUCCIÓN

10

III.

MATERIAL Y REACTIVOS

10

IV.

METODOLOGÍA

11

V. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

12

VI.

CUESTIONARIO PREVIO

12

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

13

PRACTICA 3. LECTINAS

14

I.

14

OBJETIVOS

II. INTRODUCCIÓN

14

III.

EQUIPO Y MATERIALES

14

IV.

METODOLOGÍA

15

V. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

18

VI.

CUESTIONARIO PREVIO

18

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

19

PRÁCTICA 4. PRODUCCIÓN DE PENICILINA EN DIFERENTES SISTEMAS DE FERMENTACIÓN

20 2

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

I.

OBJETIVOS

20

II. INTRODUCCIÓN

20

III.

MATERIALES Y MÉTODOS

20

IV.

METODOLOGÍA

21

V. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

22

VI.

22

CUESTIONARIO PREVIO

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

22

PRACTICA 6. ELISA (ENZYME- LINKED INMUSORBENT ASSAY) 23 I.

OBJETIVOS

23

II. INTRODUCCIÓN

23

III.

MATERIAL Y REACTIVOS

24

IV.

METODOLOGÍA

24

V. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

24

VI.

CUESTIONARIO PREVIO

24

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

25

3

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

REGLAMENTO DEL LABORATORIO El laboratorio representará el 30% de la calificación final de la asignatura de Biotecnología Farmacéutica La calificación de laboratorio se distribuirá de la siguiente manera: 1. TRABAJO PRÁCTICO 40% - Asistencia al laboratorio. - Puntualidad. Se dará un máximo de tolerancia de 10 minutos. - Limpieza de su mesa de trabajo y tarja al inicio y fin de clase. - Cada alumno deberá presentarse a la sesión de laboratorio con bata y con el manual de prácticas engargolado en el cual deberán anotar todos los resultados obtenidos en las prácticas. - El material se entregará una vez llenado de manera correcta el vale correspondiente. - El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estará regido por el reglamento interno del Laboratorio de Biotecnología. - Cooperación con el grupo (esterilización de material, lavado y preparación de reactivos así como asistencia extraclase) 2. INFORME POR EQUIPO 30% Este porcentaje se divide en: - Introducción 10% - Objetivo - Resultados 15% - Discusión de resultados 20% - Cuestionario 20% - Conclusiones 30% - Referencias 5% (diferentes a las mencionadas en la práctica) 3. EXAMEN DE LABORATORIO 20% Consistirá en una evaluación del conocimiento adquirido durante las prácticas 4. DISCUSIÓN 10% Consistirá en la participación activa de cada alumno durante la sesión de discusión.

4

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

PRÁCTICA 1. OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO DE HONGOS I.

OBJETIVOS

Objetivo General 

Extraer ADN genómico de Hongos con importancia Farmacéutica.

Objetivos específicos

II.



Comprender los fundamentos del proceso de extracción de ADN genómico



Analizar la calidad del ADN genómico a través de la electroforesis en gel de agarosa



Analizar la pureza y concentración del ADN genómico



Obtener el Peso Molecular del ADN genómico



Discutir la importancia de la Ingeniería Genética dentro de la Farmacéutica

INTRODUCCIÓN

La producción de antibióticos ha resultado ser una de las más lucrativas actividades de la industria farmacéutica en los últimos cincuenta años, razón por la cual en este tiempo se han conseguido los mayores avances en el conocimiento de la biosíntesis de la mayoría de dichos compuestos (la penicilina es un buen modelo y un ejemplo, a este respecto). El conocimiento de los mecanismos básicos de biosíntesis de antibióticos (fundamentalmente los denominados beta-lactámicos) ha permitido la puesta a punto de importantes procesos de producción a gran escala. A medida que se optimizaron la composición del medio de cultivo, las condiciones de temperatura, aireación, etc. o se mejoraron las cepas productoras, por medio de técnicas de mutagénesis al azar, se consiguió aumentar en varios órdenes de magnitud la producción de antibiótico. La Biología Molecular supone una herramienta avanzada en cuanto a la posibilidad de mejora genética de las cepas de producción industrial. Estas técnicas posibilitan la modificación controlada del genoma del microorganismo, permitiendo en todo momento asignar una relación causa-efecto entre la alteración introducida y el resultado observado (algo mucho más complicado de analizar en el caso de las mutaciones inducidas por “métodos clásicos”).Gracias a esta disciplina, se puede observar el efecto de cambios introducidos en todos los niveles de la ruta de biosíntesis (incorporación de los compuestos precursores, ensamblaje de los productos intermediarios de la vía y secreción al medio). Pueden observarse, asimismo, los efectos de la introducción de factores que afecten de forma global al proceso e incluso obtenerse compuestos que anteriormente no eran producidos por el microorganismo. La utilización de las técnicas de Ingeniería Genética ha permitido dar un nuevo impulso al desarrollo de cepas con mayor producción de antibióticos, pero también ha servido para conocer en detalle la naturaleza de los cambios ocurridos durante los procesos de mutagénesis al azar (tanto en los casos en los que se consigue aumentar la producción como en los que ésta resulta disminuida) y la localización específica de tales cambios en el genoma del microorganismo.Se puede hablar a este nivel de dos tipos de mecanismos relacionados con la producción de antibióticos: por un lado los mecanismos directamente relacionados con este proceso, es decir los que intervienen de modo fundamental en la producción del antibiótico y por otro los que podríamos denominar como indirectamente relacionados (que afectarían de modo pleiotrópico al proceso o modificarían éste por completo).

III.

MATERIAL Y REACTIVOS

5

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

- Mortero estéril y altamente frío. - Pistilo para mortero estéril previamente enfriado. - Micropipeta 1 ml, 20 mL - Puntas para micropipeta 1 ml y 20 mL estériles - Tubos eppendorf estériles - un cuadrito de parafilm - Cepa de hongo de importancia farmacéutica. - Guantes EQUIPO - Microcentrífuga - Espectrofotómetro - Celdas de cuarzo. - Cámara de Electroforesis - Campana de extracción REACTIVOS - Arena de cuarzo blanca - Buffer de extracción (100 mM TrisHCl pH 8.0, 20 mM Na2EDTA, 0.5M NaCl, 1% SDS) - Fenol (25 partes): Cloroformo (24 partes): Isoamilico (1 parte) - Isopropanol frío - Acetato de sódio 3.0 M pH 5.2 - EtOH 70 % - Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0) - Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. acético glacial, Na 2EDTA pH 8.0) - Buffer de carga (Tris, azul de bromofenol y glicerol) -Gel red (Rojo Texas) - Marcador de peso de 1Kb como control.

IV.

METODOLOGÍA

Obtención de ADN genómico de hongos Método modificado de Chow and Kafer (Fungal Genet. Newsl. 40:25-27) utilizando Arena de cuarzo blanca usada como agente pulverizante. 1. COLOCARSE GUANTES Y CUBREBOCAS 2. Se coloca 1 gr del micelio y esporas en un mortero se añade N 2 líquido y se muele la muestra, en caso de no tener N2 líquido se coloca el mortero en un recipiente con hielo. 3. Antes de que se descongele se añade 2 gr de arena por gramo de tejido.

6

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

4. Posteriormente se añade 4 ml de buffer de extracción y se muele durante 5 minutos. 5. Se corta una punta azul estéril para micropipeta de 1 ml con unas tijeras (alrededor de 0.5 cm de la punta). 6. Se pasa 1.0 ml de ésta suspensión de hongo y arena a tubos para micro centrifuga (eppendorf) estériles. Mínimo 4 tubos por equipo 7. Se añade a cada tubo eppendorf 0.5 ml de la mezcla fenol:cloroformo:isoamilico. 8. Se mezcla vigorosamente durante 30 segundos con un pistilo estéril ó se agita el tubo en el vórtex. NOTA: El fenol es corrosivo y quema la piel. Usa guantes. 9. Los tubos se centrifugan a 13 krpm por 5 min a T amb. 10. El debris celular y la arena se van al fondo del tubo formando un pellet. Por encima de éste se encuentra la mezcla de fenol:cloroformo:isoamílico y encima se forma una capa de proteínas que no debes romper cuando tomes la fase de acuosa que ésta hasta arriba. 11.Ésta fase acuosa se transfiere a un tubo eppendorf nuevo (ADN). NOTA: Se puede hacer otra extracción con fenol:cloroformo:isoamilico si se desea antes de la precipitación con isopropanol 12.Se añade 0.1 V de acetato de sodio, se agita suavemente y se añade 0.6 V de isopropanol frío. 13.Se incuban las muestras a 4°C (hielo) ó en un ultracongelador (-20°C ó -80°C) por 15 min. 14.Centrifugar a 12krpm por 10 min para recuperar el precipitado. 15.Se lava el pellet con 500 µl de EtOH 70%, agitando en el vórtex. 16.Centrifugamos 13krpm, 1 min para recuperar la pastilla. 17.Decantamos sobrenadante y se deja secar el pellet por 20 min. (si se desea se vuelve a realizar el lavado) 18.Una vez seco el pellet (ADN) se resuspende en 200 ul de buffer TE ó agua estéril.

Electroforesis en gel de agarosa. La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de agarosa al 1%. 1. Pesar 1 gr de agarosa y añadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml. 2. Se funde en un horno de microondas, se enfría un poco y se añade 1 ul de Rojo Texas 10000X. Nota: La adición del Rojo Texas puede hacerse de diferentes formas. 3. Se deposita en el carro con el peine para crear los pozos en el gel. 4. Se deja solidificar en una campana de extracción. 5. Se desmonta y se coloca en la cámara de corrimiento con Buffer TAE 1X cuidando que cubra el gel de agarosa. 6. Para cargar la muestra, se coloca 5 ul de ADN y una gota de buffer de carga (6X) sobre un cuadrito de parafilm, se mezclan y se cargan en el gel. Nota: se puede colocar marcador de peso en el primer carril (1Kb). 7. Se carga el gel de agarosa. 8. Se conecta la fuente de poder y se corre el gel a un voltaje de 70-90 V según el tamaño de la cámara. 9. Una vez que se separaron los dos colorantes y estos llegaron ¾ partes del gel, se saca el gel de la cámara de corrimiento y se observa en el transiluminador con la luz UV. 10. Reportar tu imagen con pie de figura indicando el PM (pb) de cada banda del Marcador de Peso Molecular 1kb; indicar la muestra de cada carril.

Estimación de la concentración de ADN

7

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

a. Diluir 20 l de muestra de ADN en 980 l de agua desionizada y estéril (dilución 1/50) b. Medir absorbancia por espectrofotometría a 260 nm usando celdas de 1 ml de cuarzo. c.

La concentración de ADN a A260 = 1.0 en una celda de 1 cm equivale a 50 g de ADN por ml de agua. Para calcular la concentración de la muestra: [ADN] = 50 g / ml x A260 x factor de dilución (50) [ADN total] = [ADN] x volumen eluído en ml

Estimación de la pureza del ADN El grado de pureza o ausencia de proteínas y otros contaminantes de una disolución de ADN puede estimarse calculando el cociente A260/A280. Cuando este se encuentra entre 1.8-2.0 la muestra contiene casi exclusivamente ADN.

Cálculo del Peso Molecular (pares de bases, pb) a) Gráficar en el eje de las Y, el log 10 del PM (pb) y en el eje de las X, la distancia en cm a cada banda. Es importante medir de arriba hacia abajo tomando como base el borde superior del gel. Sacar la ecuación de la regresión lineal y=mx+b, sustituir la distancia a la banda del DNAg y sacar el antilogaritmo del valor Y para tener el PM en pb.

V.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

a) Lleve a cabo un diagrama de flujo del procedimiento efectuado y coloca del lado derecho la función de cada solución utilizada en el proceso de obtención de ADN. b) Discute los resultados obtenidos en tu práctica: 

Obtención de ADN



Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicación de tu carril de corrimiento)



Espectrofotometría (Concentración y pureza del ADN)

c) Elabore un dibujo de la cámara de electroforesis donde muestras el corrimiento de tu gel y las características de la corrida.

VI.

CUESTIONARIO PREVIO 1. ¿Cuál es la importancia de los hongos en la Industria Farmacéutica (IF)? 2. ¿Cómo utilizarías la Ingeniería Genética en el ADN obtenido en ésta práctica? 3. ¿Para qué se usa el buffer de corrimiento TAE? 4. ¿Cuáles son las características del buffer de carga?

8

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5. ¿Cómo funciona el Rojo Texas? 6. ¿Existen otros colorantes además del Rojo Texas para hacer visible el ADN en el gel de agarosa? 7. ¿Por qué se utilizan celdas de cuarzo y no de plástico para leer ADN en el espectrofotómetro? 8. ¿Por qué se lee el ADN a una absorbancia de 260 y 280 para valorar su pureza? 9. ¿Cómo se llama el equipo que te permite visualizar el ADN genómico? 10. ¿Cuál es el porcentaje adecuado de agarosa para realizar tu gel de acuerdo al PM (pb)?

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

http://www.fgsc.net/fgn44/weiland.html http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/extraccionADN.htm Fernández-Perrino F.J.. Sobreproducción de antibióticos en hongos filamentosos utilizando técnicas de Ing. Genética Depto de Biotecnología. UAM-Iztapalapa. México D.F. (PDF)

9

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PRACTICA 2. TIPIFICACIÓN SANGUÍNEA ABO Y FACTOR RH I.

OBJETIVOS

Objetivo General 

Analizar la reacción antígeno- anticuerpo a través de la tipificación ABO y Factor Rh de acuerdo a su importancia nivel farmacéutico

Objetivos específicos

II.



Tipificar el grupo sanguíneo de una población determinada (grupo de clase)



Comprender el fundamento de la reacción Ag-Ac en la tipificación ABO



Discutir las aplicaciones de la tipificación ABO y factor Rh

INTRODUCCIÓN

El descubrimiento del grupo sanguíneo ABO en el año 1900 por el científico austriaco Karl Landsteiner, causó gran entusiasmo en la comunidad científica de la época. Hasta entonces, toda la sangre se consideraba igual en todas las personas y no se entendían las consecuencias a menudo trágicas de las transfusiones de sangre.(1). Los antígenos ABO son glúcidos unidos a proteínas y lípidos de la superficie celular que sintetizan enzimas glucosiltransferasas polimórficas, cuya actividad varía en función del alelo heredado. Los sujetos que expresan un antígeno ABO particular toleran ese antígeno, pero los sujetos que no expresan ese antígeno producen anticuerpos naturales que reconocen el antígeno. (2) Los reactivos para tipificar los antígenos del sistema ABO, se basan en anticuerpos monoclonales producidos por líneas celulares de hibridomas murinos y ofrecen todas las ventajas de los reactivos monoclonales actuales, es decir, un comportamiento parejo y un abastecimiento seguro. Dado que estos reactivos no provienen de fuentes humanas, el riesgo de transmisión de enfermedades tales como Hepatitis o Sida es nulo (3). En la reacción Ag- Ac, los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM por lo que son altamente aglutinantes. Propiedad que se emplea para su identificación (4). En 1939 Levine y Stetson, luego de que una mujer diera a luz un feto muerto, hallan en el suero de la misma un anticuerpo que aglutinaba a los glóbulos rojos del marido y a los del 80% de la población ABO compatible. En 1940 Landsteiner y Wiener inyectan hematíes de Macaco Rhesus a un conejo y observan que éste desarrolla un anticuerpo que aglutina no solo a los eritrocitos del mono sino que también, a los eritrocitos, del 85% de la población caucásica de Nueva York. Quienes suponen que se trata del mismo anticuerpo descubierto el año anterior, por lo tanto, proponen como nombre "Sistema Rh" por analogía con el antisuero producido por el conejo luego de la sensibilización con el Rhesus. En 1942 utilizan el suero del animal como suero anti-Rh. Se necesitaron casi 20 años para demostrar que los anticuerpos humanos y los animales no reaccionaban con el mismo antígeno (Rho), reasignándole a este nuevo sistema el nombre de LW en honor a sus descubridores; los antígenos de éste sistema son más frecuentes en individuos Rh-positivos que en Rh-negativos, de allí la concordancia que originó la confusión. El anticuerpo humano descubierto por Levine y Stetson está dirigido entonces hacia el antígeno "D" (Rho) del sistema.(5)

10

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

III.

MATERIAL Y REACTIVOS 

Reactivos monoclonales para tipificación de grupos sanguíneos anti - A, Anti - B, anti AB, anti D



Los reactivos se han formulado de acuerdo a las normas de la FDA de Estados Unidos y se entregan coloreados de Azul y Amarillo, Anti-A y Anti-B respectivamente, reactivo Anti-A,B. Todos los reactivos se suministran estandarizados y listos para ser usados en técnicas de hemoaglutinación en tubo o en lámina)



Reactivo Monoclonal Anti-D (Anti-Rho)



El reactivo Anti-D es una mezcla monoclonal IgM + IgG para técnica en microplaca, en lámina y en tubo.(3)



Palillos de madera



Frasco gerber con un poco de cloro para desechos de torundas con sangre, palillos.



Un frasco gerber con torundas de algodón con alcohol



Un frasco Gerber con torundas de algodón secas



Portaobjetos desengrasados (con alcohol)



Lancetas



Guantes

Nota: Desechar las lancetas en el contenedor de punzocortantes

IV.

METODOLOGÍA

Toma de muestra 1. Lavarse las manos con agua y jabón (analista y paciente) 2. Preparar la lanceta o pinchador. 3. Masajear colocando el dedo hacia abajo 4. Desinfectar con una torunda con alcohol el dedo que se va a picar con la lanceta. 5. e)Dejar secar el alcohol y pinchar el dedo de forma rápida en la parte lateral manteniendo la mano hacia abajo (figura 1). 6. f)Repartir en un portaobjetos desengrasado previamente de 3 a 4 gotas de sangre de forma equidistante

Figura 1. Técnica para toma de muestra sanguínea. Fuente: http://www.chospab.es/cursos_on_line/insulino/pagina_25.htm

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Aplicación de reactivos para tipificación ABO y Factor Rh 1. Añadir una gota del anticuerpo Anti A, B, AB o Rh al lado de la gota de sangre según sea el caso. CUIDADO de no tocar con el gotero la gota de sangre ya que contaminas el reactivo. 2. Mezclar suavemente con un palillo y observar la aglutinación. 3. Reportar positivo en donde se encuentre aglutinación, por ejemplo, si aglutina con el anticuerpo A será grupo sanguíneo A. 4. Colocar los portaobjetos de cada equipo sobre una hoja blanca y tomar foto para el reporte.

V.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

a) Fotografía rotulada con el nombre del estudiante, anticuerpo utilizado en cada gota y finalmente el tipo sanguíneo con los resultados del equipo Figura 2.

Figura 2. Tipificación ABO y Factor Rh. Fuente: http://mesa8labd.blogspot.mx/2009/10/pru ebas-pretransfunsionales.html

b) Tabla con los resultados del grupo

Alumno

VI.

Edad

Sexo

Grupo sanguíneo

Rh

CUESTIONARIO PREVIO 1. ¿Qué son los antígenos del grupo sanguíneo ABO? Describe cada uno. 2. ¿En qué células se encuentran estos antígenos? 3. Realiza un cuadro con el tipo de Ag presente en la célula, que anticuerpo se produce en el plasma y el tipo sanguíneo

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Antígeno A

Antígeno B

(*)

(°)

Antígeno AB (*°)

Sin Antígeno

Célula

Anticuerpo en el suero

Anti-

Anti-

Ninguno ó ambos

Ninguno Ambos

ó

Tipo Sanguíneo 4. ¿Qué tipos de Ig se producen contra estos antígenos? ¿Qué importancia tienen estos anticuerpos en el pasaje a través de la placenta de la madre al feto? 5. ¿Qué tipos de reacciones pueden provocar una incompatibilidad de grupo sanguíneo ABO? 6. ¿Qué significa Rh y como se descubrió? 7. ¿Qué otras tipificaciones hay y qué importancia clínica tienen? 8. Realiza tu árbol genealógico con 3 generaciones de acuerdo al tipo sanguíneo. Complementa buscando información del alelo dominante que es heredado. Leyes de Mendel. 9. Investiga el grupo sanguíneo predominante en México y ¿por que es así? 10. Investiga el uso de la Inyección de inmunoglobulina Rho (D) (RhoGAM) 11. ¿Qué es un donante y receptor universal? 12. Describe la reacción Ag-Ac que ocurre en la tipificación ABO y factor Rh

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2009/myl097-8c.pdf http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/guia-11.pdf http://ingemeci.com/productos.html http://microeinmuno.files.wordpress.com/2011/10/grupos-sanguineos-eisohemaglutininas.pdf http://www.aathi.com.ar/pdfs/sis_rh_lo_que_hay_que_saber.pdf http://www.galactose.org http://www.joel-sistem-xd.blogspot.mx/2007/10/herencia-gentica-cromosomas.html http://mesa8labd.blogspot.mx/2009/10/pruebas-pretransfunsionales.html http://www.cnts.salud.gob.mx/

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PRACTICA 3. LECTINAS I.

OBJETIVOS

Objetivo general 

Adquirir los conocimientos teórico-prácticos para la obtención de compuestos proteicos con actividad hemoaglutinante a partir de extractos vegetales

Objetivos específicos 

Determinar la actividad hemoaglutinante de los extractos obtenidos



Investigar el método de conservación no destructivo para las lectinas obtenidas



Confirmar los pesos moleculares de las lectinas obtenidas mediante el uso de geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

II.

INTRODUCCIÓN

Las lectinas son proteínas naturales de origen no inmune, ampliamente distribuidas en el reino Plantae y que muestran una serie de actividades biológicas que las hacen poderosas herramientas biotecnológicas. Las semillas leguminosas son una rica fuente de lectinas y varios géneros de la subtribu Diocleinae y Phaseoleae, han sido la principal fuente de extracción de ellas. Las lectinas están presentes en casi todos los seres vivos, pues se han encontrado en el reino vegetal, animal y en microorganismos. En las plantas se han detectado, principalmente en los cotiledones y endospermos de las semillas y constituyen del 2 al 10 % del total de las proteínas de éstas. En el reino animal se han encontrado en invertebrados, tales como cangrejos, camarones, caracoles, lombrices y moluscos. En el humano están presentes fundamentalmente en la hemolinfa y órganos sexuales. Las lectinas comparten en común la propiedad de enlazarse de forma específica y reversible a carbohidratos, ya sean libres o que formen parte de estructuras más complejas. Contienen al menos dos sitios de unión, de ahí que puedan enlazarse en primer lugar a un azúcar específico y en forma secundaria a una molécula glicosilada. Su importancia se debe fundamentalmente a sus propiedades biológicas, tales como aglutinación de eritrocitos y otras células como linfocitos, espermatozoides, plaquetas, bacterias, inducción de mitosis en linfocitos, efectos citotóxicos sobre linfocitos, aglutinación de virus y otras. Actualmente se han estudiado en detalle 9 lecitinas con efecto mitogénico sobre los linfocitos, entre las que se destacan las provenientes de Phaseolus vulgaris (PHA), Canavalia ensiformis (Con A), Pisum sativum (PSA) y Fitolaca americana (PWM). Estos mitógenos pueden activar de forma diferente los linfocitos T y B, por ejemplo la PHA y Con A inducen mitogenicidad en células T, mientras que el mitógeno de carmín (PWM) estimula ambos tipos de células. No se conoce lectina alguna que estimule sólo a los linfocitos B humanos. Las lectinas se emplean igualmente en la caracterización de grupos sanguíneos humanos, así como en la identificación de nuevos grupos sanguíneos. Aunque también hay evidencia de que la mayoría de las lectinas juegan un importante papel en la defensa de las plantas contra diferentes tipos de organismos herbívoros.

III. 

EQUIPO Y MATERIALES Centrifuga 14

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

             

Bomba de vacio para solventes Campana de extracción de humos Cámara de Electroforesis vertical Fuente de poder para cámara de electroforesis Mortero con pistilo Papel filtro Whatman No. 1 Tubos Falcon de 50 mL Tubos Eppendorf de 1.5 mL Vasos de p.p. de plástico de 50 mL Probeta de 100 mL Matraces Kitasato Embudo Buchner Juego de micropipetas Recipiente de plastico

REACTIVOS              

IV.

Solución isotónica (NaCl 0.85%) Solución amortiguadora (PBS 0.015 M, pH 7.2, 0.15 M NaCl) Acetona fría Solución de Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8% Amortiguador del gel separador pH 8.8 Amortiguador del gel separador pH 6.8 Amortiguador de corrida 5X / SDS Amortiguador de muestra pH 6.8 Persulfato de amonio al 10% p/v TEMED Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL Solución teñidora Solución desteñidora Marcadores de peso molecular para proteínas

METODOLOGÍA

1. Seleccionar, por equipo, una de las especies de leguminosas que se listan a continuación; las cuales son productoras de lectinas. 1)

Canavalia ensiformis

6)

Lens culinaris

2)

Phaseolus vulgaris

7)

Triticum vulgaris

3)

Phytolacca americana

8)

Glycine max

4)

Pisum sativum

9)

Eritrina coralloides

5)

Vicia faba

10)

Ricinus communis

(En caso de no encontrar la especie seleccionada proponer una especie productora de lectinas) 2. De cada especie listada adquirir 50 g, lo mas fresco posible, lavarlas y poner a remojar durante una hora en una solución isotónica; en caso de que sean semillas secas poner 15

Guía de Prácticas de Biotecnología Farmacéutica

a remojar con la menos cantidad posible de solución isotónica durante unas 4 horas; en ambos casos, la solución debe estar contenida en una matriz que proporcione suficiente humedad pero que no permita que las semillas estén sumergidas (embebidas) en la solución, por ejemplo con torundas de algodón. 3. Transcurrido este tiempo y de ser posible, separar con mucho cuidado el epitelio de la semilla, y ponerlos a remojar -junto con los cotiledones- durante toda la noche previa a la sesión de laboratorio en un volumen 1:1 v/m en una solución buffer (PBS 0.015 M, pH 7.2, 0.15 M NaCl) o cuando menos en una solución isotónica (ATENCIÓN: conservar la solución de remojo de toda la noche que será la solución de extracción A), en el caso de la Triticum vulgaris dejar en remojo el mayor tiempo posible hasta que germine de ser posible. 4. En la sesión de laboratorio retirar de la solución de remojo a los epitelios y los cotiledones y molerlos en un mortero por separado. En caso de que el cotiledón sea muy pequeño el material crudo se molerá finamente junto con su epitelio. Después del molido se colocan en 50-100 mL de solución de remojo por una hora (extracción B), transcurrido ese lapso se filtra e igual que la solución de remojo (solución extracción A) de toda la noche se les hace una extracción con acetona fría para remover lípidos (2:1, líquido:líquido). Si se requiere se puede hacer una remoción de sólidos con papel filtro del No. 1. 5. Se remueven las partículas que aparezcan usando una combinación de centrifugación a 200 g 20 minutos y filtrado al vacío con papel Whatman No.1. Se puede optar por remover los restos de la acetona dejando la muestra dentro de una camapana de extracción de humos. 6. El sobrenadante claro (y probablemente amarillezco), se toma una alícuota de 1 mL para la prueba de hemaglutinación y otros 5 mL para determinación de proteínas por el método de Lowry (Hartree, 1972) ó el de Bradford 7. Determinar el peso molecular aproximado de los compuestos proteicos mediante electroforesis (SDS-PAGE).

Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Tratamiento de la muestra. 1. A una muestra de concentración conocida de proteína se le adiciona amortiguador de muestra hasta un volumen final de 85 µL 2. Añadir 10 µL de solución de azul de bromofenol y 5 µL de β-mercaptoetanol. 3. Incubar en baño maría a ebullición durante 5 minutos.

Preparación del Gel 1. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes. 2. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel. 3. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando el persulfato de amonio y el temed al final. 4. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formación de burbujas, y alcanzando un nivel 3 cm por debajo del borde superior. Dejar polimerizar de 20 a 30 minutos. 5. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo. 6. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formación de burbujas. Dejar polimerizar de 15 a 20 minutos.

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Montaje de la cámara de electroforesis y corrimiento del gel. 1. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel, en su base, y esta en la cámara. 2. Preparar amortiguador de corrida 1x. 3. Llenar con amortiguador de corrida la cámara interna hasta el límite y la externa hasta cubrir los electrodos. Revisar que no existan fugas de la cámara interna antes de llenar la cámara externa 4. Retirar con cuidado el peine. Cargar aproximadamente 20 µL de muestra y 5 µL marcador de peso molecular en los pozos. 5. Colocar la tapa de la cámara y conectar a la fuente de poder. 6. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador. 7. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida alcance el final del gel. 8. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar la cámara. 9. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocarlo en la solución teñidora durante 3 horas 10. Transcurrido el tiempo, desteñir el gel con la solución desteñidora hasta la aparición de las bandas. 11. Medir el frente de corrimiento y obtener el Rf de las muestras para obtener el peso molecular de las bandas.

ANEXO I Tabla 1. Volumenes para preparar el gel separador (para un volumen de 15 mL) Sol. stock (mL) / Conc. gel (%)

5

6

7

8

9

10

12

13

15

Sol. Acrilamida – bisacrilamida

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

6.0

6.5

7.5

Amortiguador pH 8.8

3.75

3.75

3.75

3.75

3.75

3.75

3.75

3.75

3.75

Agua desionizada

8.75

8.25

7.75

7.25

6.75

6.25

5.25

4.75

3.75

Persulfato de amonio

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

TEMED

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL) Sol. Acrilamida – bisacrilamida Amortiguador pH 6.8 Agua desionizada Persulfato de amonio TEMED

0.26 mL 0.5 mL 1.22 mL 0.01 mL 0.2

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PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8% Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en agua bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4° C. Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotóxico. Amortiguador del gel separador pH 8.8 Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente. Amortiguador del gel separador pH 6.8 Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente. Amortiguador de corrida 5X / SDS Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada y aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X. Amortiguador de muestra pH 6.8 Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a 100 mL. Persulfato de amonio al 10% p/v Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario. Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar en refrigeración. Solución teñidora Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de agua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie R-250. Disolver el azul de Coomassie en el metanol y adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada. Solución desteñidora Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de agua desionizada.

V.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

a) Elabore un dibujo de la cámara de electroforesis donde muestras el corrimiento de tu gel y las características de la corrida. b) Realiza un cuadro comparativo de cada una de las muestras utilizadas en la práctica c) Discute sobre las aplicaciones de las lectinas en la industria farmacéutica

VI.

CUESTIONARIO PREVIO 1. ¿Qué es la liofilización y que utilidad tiene como método de conservación? 2. Investigue si las lectinas son productos que se pueden liofilizar 3. Investigue los fundamentos de la metodología experimental

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4. Investigue el fundamento de la técnica de Lowry y la de Bradford 5. ¿Qué es hemoaglutinación? 6. ¿Cuáles son las aplicaciones que tienen las lectinas en la industria farmacéutica?

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Agrawal BBL, Goldstein IJ. 1972. Concanavalin A, the jack bean (Canacalia ensiformis) phytohemagglutinin, In V Purification of carbohidrate-beinding protein. Ginsberg (ed.), Methods in enzymology, XXVIII . Academic Press Inc., New York. 313-318. Dahanukar SA, Kulkarni RA, Rege NN. 2000. Pharmacology of medicinal plants and natural products. Indian Journal of Pharmacology. 32: S81-S118 Goldstein IJ. Hollerman CE. Merrick JM. 1965. Protein-carbohydrate interaction. I. The interaction of polysaccharides with concanavalin A. Biochim. Biophys. Acta 97:68-76. Hartree EF. 1972. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Analyt. Biochem. 48: 422-427 Hernández-Díaz P, Martín-González O, Rodríguez-de-Pablos-Vélez Y, Ganem-Báez FA. 1999. Aplicaciones de las lectinas. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 15(2):91-5 Mccabe MM, Smith EE. 1975. Relationship between cell-bound dextransucrase and the agglutination of streptococcus mutans. Infection and Immunity. 12 (3): 512-520. Monteiro ACO, Walbert E. Muniz-Filho WE, Horta ACG, Beltramini LM, Moreira RA. 1998. Isolation and partial characterization of a lectin from Canavalia dictyota seeds. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 10(3):167-172. Wu C, Lovrien R, Matulis D. 1998. Lectin Coprecipitative Isolation from Crudes by Little Rock Orange Ligand. Analyt. Biochem. 257: 33-39. Peumans WJ, Van Damme EJM. 1995. Lectins as PIant Defense Proteins. Plant Physiol. 109: 347-352

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PRÁCTICA 4. PRODUCCIÓN DE PENICILINA EN DIFERENTES SISTEMAS DE FERMENTACIÓN I.

OBJETIVOS

Objetivo General 

Obtener penicilina por varios sistemas de fermentación.

Objetivos específicos

II.



Comparar el rendimiento de la fermentación sólida y la fermentación líquida.



Determinar ventajas y desventajas de la producción y de la extracción del antibiótico.

INTRODUCCIÓN

Existen diferentes clases de antibióticos los cuales tienen un valor económico importante debido a su aplicación clínica, sobre todo en los países como México en el cual actualmente las enfermedades de etiología infecciosa representan el tercer lugar de causa de mortalidad (1), siendo los de mayor demanda la cefalosporina, penicilinas y tetraciclinas, estas últimas representan el 17.5% en ventas del mercado mundial de antibióticos (2) y están considerados dentro del Cuadro Básico de Medicamentos del Sector Salud. La producción de tetraciclina se realiza por fermentación líquida con altos costos de operación lo que se refleja en el valor agregado de los productos, por lo que resulta interesante generar procesos de producción de antibióticos con aplicación de biotecnologías alternativas que resulten más rentables como en el caso de la fermentación en estado sólido o con el uso de soportes semisólidos, las cuales son ampliamente utilizadas en los países orientales y presenta ventajas sobre la fermentación sumergida (4). La fermentación sólida se realiza sobre soportes que generalmente son seleccionados de acuerdo a sus características, utilización y abundancia regional, siendo México un país con generación de una gran cantidad de residuos agroindustriales con poco o ningún aprovechamiento de los mismos, la utilización de estos residuos como soportes en fermentaciones sólidas para la producción de metabolitos microbianos representa una alternativa para su aprovechamiento y una mejora ambiental, así como económica, de las regiones en las que se producen. El salvado de trigo por su consistencia y bajo costo, ha sido utilizado como soporte para la producción de metabolitos en estado sólido de enzimas, ácidos orgánicos, entre otros.

III.

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismo: Penicillium chrysogenum, como productor de penicilina Inóculo: A un cultivo previamente esporulado de P. chrysogenum se adiciona solución salina al 0.85% hasta obtener una solución de 108 esporas por mililitro, lo anterior puede conseguirse ajustando a una absorbancia de 0.5 a una longitud de onda de 540 nm. Soporte sólido: Salvado de trigo (u otro que puedan conseguir los alumnos) Medio de Producción de penicilina Lactosa al 3%, Agua de cocimiento de maíz 5%, Farmamedia 1%, Minerales: Fosfato de potasio monobásico de 0.3%, fosfato de potasio dibásico 0.2%, CaCl 2 0.01% (preparar por separado). Ajustar a pH 5.0. 20

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Sistema sólido: En matraces Erlenmeyer de 125 mL colocar 5 gramos de salvado, 10 mL del medio de cultivo. Inocular con el 3% de la solución de esporas y adicionar 5 ml de agua estéril para conseguir una humedad relativa del 58%. Sistema Células libres o sumergida: En matraces Erlenmeyer de 500 mL colocar 200 mL del medio 1 e inocular con 3% de la solución de esporas e incubar a 28°C con agitación orbital de 150 rpm. Toma de muestra: Se toma muestra cada 24 horas, en el caso de la fermentación sólida se muestrea un matraz cada 24 horas, en caso de la fermentación sumergida se toman 10 ml, en condiciones estériles. Tratamiento de la muestra: En ambos casos se eliminan los sólidos ya sea biomasa y restos del medio. Para el medio sólido se adiciona agua estéril en una proporción 1:5 agitar durante 10 minutos y filtrar, al filtrado medir el pH y guardarlo en refrigeración para cuantificación de azúcares y antibiótico. En al caso de la sumergida se toman los 10 mL y se elimina la biomasa por medio de filtración o centrifugación; el sobrenadante guardar en refrigeración hasta su análisis o uso. ENSAYO PARA ANTIBIÓTICOS Antibióticos Penicilina Microorganismos Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Medios de cultivo Medio para antibióticos No. 1 agar y medio líquido Medio para antibióticos No. 2 Diluyente: Solución Buffer No. 1 (Disolver 2.0 g de fosfato dibásico de potasio y 8.0 g de fosfato monobásico de potasio en 1000 mL de agua. Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o Hidróxido de potasio 10 N a pH 6.0 +/- 0.05)

IV.

METODOLOGÍA

Preparación del estándar Estándar de penicilina Pesar la cantidad necesaria para obtener una solución de 100 U/ml y realizar las diluciones necesarias para obtener por lo menos 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea 1.0 U/ml

Preparación del inóculo En un tubo de agar nutritivo sembrar el microorganismo de prueba e incubarlo 24 h. Añadir solución salina estéril suficiente para obtener una solución ajustada al 25% de transmitancia a 580 nm.

Método del cilindro-placa 1. Añadir 20 ml del medio No. 2 en cada caja de petri, una por cada dilución y dejar solidificar. 2. Añadir al medio No. 1, 0.1 ml del microorganismo de la suspensión del inóculo (ajustada al 25%) por cada 100 ml. (Hacer lo mismo por separado con los dos microorganismos a probar) 21

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3. Añadir 10 ml del medio inoculado sobre la placa gelificada de agar No. 2 y dejar solidificar nuevamente. 4. Colocar 2 cilindros sobre las placas gelificadas y añadir 50 l de cada una de las diluciones, incubar a 37oC por 24 h, medir el halo de inhibición.

V.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

1. Calcule el rendimiento del metabolito con respecto al sustrato. 2. Para el análisis de la fermentación y el comportamiento, comparar las variables pH, el incremento de biomasa, consumo de azúcares y su relación con la producción del analito. 3. Análisis de todos las variables en función del las características del soporte utilizado.

VI.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Investigar los tipos de fermentación utilizada para la obtención de antibióticos en la industria. 2. Investigar los métodos de purificación para el antibiótico obtenido. 3. Investigar el mecanismo de acción para las penicilinas. 4. Investigar cuáles son los microorganismos de prueba para este antibiótico, según la farmacopea de Estados Unidos, y cómo se reportan éstos bioensayos.

VIII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Bowman, W.C. and M.J. Rand, Farmacología, Ed. Interamericana. Manual de Productos Naturales. Farmacopea Nacional de los Estados Unidos.

22

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PRACTICA 6. ELISA (Enzyme- Linked Inmusorbent Assay) I.

OBJETIVOS

Objetivo General 

Determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia de una proteína dada en la muestra problema

Objetivos específicos

II.



Detectar agentes patógenos y su transmisión en muestras.



Detectar antígenos de manera específica.



Evaluar la presencia de anticuerpos dependientes de procesos fisiológicos.

INTRODUCCIÓN

El uso de la técnica inmunoenzimática “Enzyme- Linked Immunosorbent Assay” (ELISA) está ampliamente difundido para el diagnóstico serológico de las enfermedades. El ensayo inmunoenzimático ELISA se basa en el uso de antígenos o de anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática pudiendo ser revelada mediante la adición de un substrato específico que, en contacto con la enzima, producirá un color observable a simple vista y cuantificable por un lector de densidad óptica. La técnica de ELISA se caracteriza por presentar alta sensibilidad, especificidad, rapidez y economía. Brinda la posibilidad de analizar un gran número de muestras de manera sencilla, rápida y económica, sin mayor infraestructura (Ruiz M. L, 2006). Existen diferentes tipos de ELISAs descritos: ELISAs para detectar antígeno, ELISAs sándwich y ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos. Dando la ventaja de que los reactivos son relativamente estables, el color producido en la reacción puede leerse a simple vista cuando no se dispone de equipo adecuado y puede analizarse grandes cantidades de muestra al mismo tiempo. El sistema inmunológico, característico de animales superiores, es un complejo mecanismo de defensa por medio del cual, éstos se defienden de infecciones causadas por diferentes microorganismos. Las reacciones de defensa ocurren de diversas formas, empleando numerosos mecanismos, y a los efectos del desarrollo de varias técnicas serológicas, los aspectos claves son el reconocimiento del agente invasor como un cuerpo extraño, y la producción de anticuerpos específicos para su eliminación o neutralización. Cualquier sustancia, molécula o microorganismo que entra en el torrente sanguíneo de un animal, y que es capaz de inducir en el organismo invadido una reacción de “defensa” o respuesta inmune, es considerado como un antígeno o inmunógeno. Esta respuesta puede ser variada, y uno de esos mecanismos consiste en que, cuando el antígeno entra en el torrente sanguíneo, es procesado y reconocido por grupos de células guardianas conocidas como glóbulos blancos o linfocitos del tipo “B” y “T”, de cuya interacción son producidos los anticuerpos que reconocen el antígeno de manera específica. El sitio del antígeno que es reconocido por un anticuerpo es denominado determinante antigénico o epítope, pudiendo tener el antígeno más de un epítope.

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III.

MATERIAL Y REACTIVOS Materiales

    

Tubos eppendorf de 2.0ml Micropipetas (50 µl o 20-200 µl) Pipetas plásticas Frascos con tapas Microplacas Reactivos

      IV.

Antígeno (globulina gamma de pollo) Anticuerpo primario (anticuerpo policlonal anti- pollo conejo) Anticuerpo secundario (anticuerpo conjugado anti-conejo cabra a peroxidasa de rábano HRP por sus siglas en inglés) Sustrato enzimático HRP (3,3’, 5,5’- tetrametil bencidina) Solución tampón salina de fosfatos 10 X Tween 20 al 10 % METODOLOGÍA PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN ANTIGENO 1. Agregar el control positivo, el control negativo y la muestra en un pozo cada uno (50 uL). Hacer por triplicado. 2. Incubar durante 5 minutos para permitir la unión del antígeno al pozo. 3. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces). 4. Agregar el anticuerpo primario (50 uL) a los pozos e incubar durante 5 minutos para permitir el reconocimiento del antígeno por el anticuerpo. 5. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces). 6. Agregar el anticuerpo secundario acoplado a la enzima de peroxidasa de rábano (50 uL) e incubar por 5 minutos para permitir el reconocimiento del anticuerpo primario por el anticuerpo secundario. 7. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces). 8. Agregar el sustrato de la enzima (50 uL) y observar el cambio a color azul dentro de los primeros 5 minutos en los pozos donde el antígeno está presente en la muestra. 9. (Opcional) Agregar ácido sulfúrico 0.18M para detener la reacción enzimática después de 5 minutos. La solución azul se tornará amarilla.

METODOLOGÍA PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN ANTICUERPO. 1. 2. 3. 4.

Agregar una muestra de antígeno a cada pozo (50 uL). Incubar durante 5 minutos para permitir la unión del antígeno al pozo. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (2 veces). Agregar la muestra de suero, el control positivo y el control negativo en cada pozo con antígeno por triplicado. Incubar durante 5 minutos para permitir el reconocimiento del antígeno por el anticuerpo presente en el suero de la muestra. 5. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces). 6. Agregar el anticuerpo secundario acoplado a la enzima de peroxidasa de rábano (50 uL) e incubar por 5 minutos para permitir el reconocimiento del anticuerpo primario por el anticuerpo secundario. 7. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces).

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8. Agregar el sustrato de la enzima (50 uL) y observar el cambio a color azul dentro de los primeros 5 minutos en los pozos donde el anticuerpo específico para el antígeno está presente en la muestra de suero. 9. (Opcional) Agregar ácido sulfúrico 0.18M para detener la reacción enzimática después de 5 minutos. La solución azul se tornará amarilla.

V.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS Resultados cualitativos provenientes de observar el cambio o no en el color de la solución debida a la reacción de la enzima de peroxidasa de rábano. Resultados cuantitativos provenientes de la lectura de la absorción a 655 nm en un lector de microplacas (En caso de haber usado ácido sulfúrico leer a 450 nm). Los estudiantes comparan la lectura de sus muestras con las de una curva estándar para estimar la concentración en sus muestras

VI.

CUESTIONARIO PREVIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

VII.

¿Cómo actúa nuestro sistema inmune para protegernos de una enfermedad? ¿Cuáles son las vías por las cuales una enfermedad se extiende o propaga? Escribe 5 ejemplos de enfermedades que atacan el sistema inmune. ¿Qué problemas previene el sistema inmunológico al funcionar adecuadamente? ¿Cuáles son los fármacos inmunosupresores necesarios cuando alguien tiene un trasplante de órgano? ¿Qué significa ELISA? Por sus siglas en inglés y en español. ¿Por qué se usan enzimas en este inmunoensayo? ¿Por qué se requieren controles positivos y negativos durante el ensayo experimental? ¿Qué pruebas basadas en la detección de anticuerpos puedes comprar en una farmacia?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Ruiz M. L., Martínez M. L., Trichinellosis: Técnica Inmunoenzimática de diagnóstico (ELISA). Instituto de Patología, 2006 pg. 84-87 Ezequiel R. et, al. Implementación de la técnica de ELISA para la detección de virus y otros patógenos en plantas en Venezuela, Nuemero.10 2006.

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