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• margarita_gómez

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Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Ingeniería Enzimática Problemario de Cinética Enzimática 1. Empleando los datos que se presentan en la tabla, determinar las constantes cinéticas de la enzima por el método gráfico. [S] V 0.5 0.33 1 0.6 1.5 0.82 2 1 3 1.29 5 1.67 7 1.91 10 2.14 12 2.25 15 2.37 2. Determinar las constantes cinéticas por el método gráfico y por medio de las 3 linearizaciones para los siguientes datos. Discutir a qué se deben las diferencias entre los valores obtenidos. [S] M x 102 2.5 2.27 1.84 1.35 1.25 0.73 0.46 0.204

Vo (M/L min)x103 1.94 1.91 1.85 1.8 1.78 1.46 1.17 0.779

3. La 6- fosfato isomerasa puede catalizar glucosa, fructosa y galactosa. En base a los datos de la tabla determinar las constantes cinéticas para cada sustrato y ordenarlos de mayor a menor afinidad a la enzima. V mM/min [S] mM Gluc Fruc Gala 100 272.73 342.86 206.90 200 444.44 533.33 352.94 500 714.29 800.00 612.24 750 825.69 900.00 731.71 1000 895.52 960.00 810.81 1500 978.26 1028.57 909.09 2000 1025.64 1066.67 967.74 3000 1077.84 1107.69 1034.48 4000 1105.99 1129.41 1071.43 7000 1144.41 1158.62 1122.99 10000 1160.54 1170.73 1145.04

4. Se determina la velocidad inicial de la invertasa para diferentes concentraciones de sustrato obteniéndose los datos que se presentan en la tabla. Determinar vmax y km por medio de la linearización de Lineweaver-Burk. Si [E]T=1nM/L ¿Cuántas moléculas de sustrato puede procesar una molécula de enzima por minuto? Calcular kcat/km ¿Es una enzima eficiente? [S] μM/L Vo μM/Lmin 5 22 10 39 20 65 50 102 100 120 200 135 5. Durante el daño hepático severo, una enzima es liberada al torrente sanguíneo. Durante el ejercicio intenso, una enzima que cataliza la misma reacción también es liberada al torrente sanguíneo. Ambas son fácilmente distinguibles por la diferencia en sus valores de km (la muscular presenta km=2x10-5 M). La muestra de sangre de un paciente inconsciente generó los resultados de la tabla. ¿Qué presenta el paciente? [S] M V (μM/mL min) 5x10-5 43 -5 7x10 57 1x10-4 75 -4 1.5x10 100 2x10-4 120 -4 3x10 150 6x10-4 200 6. Una preparación de proteasa posee 0.208 mgprot/μL. Si 150 μl de la dilución 1:10 de la preparación liberan 30 mM de tirosina en 10 min, ¿cuál es la actividad específica de la preparación? (U=μM/h). 7. Se produce una aminoacilasa, cuya dilución 1/50 (30 μL) es capaz de isomerizar 30 nM/L min. Determinar la actividad específica considerando que la unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para transformar 1μM/h y que la preparación original posee 20 ngprot/μL. 8. Una lipasa comercial posee una actividad de 30,000 U/mL. Si la leche posee una concentración de lípidos de 300mM, cuánta enzima será necesario agregar a 300 L de leche para remover el 90% de lípidos en 2.5h. (U=μM/h). Suponer que la velocidad no cambia al agotarse el sustrato. 9. Una polimerasa logró, en dilución 1:50, integrar 350nM de dNTP´s en 45 min. La mezcla de reacción contenía 700μL de sustratos, sales y buffer y 300 μL de la dilución de enzima. Si la dilución 1:15 de la polimerasa contiene 0.1 mgprot/μL ¿Cuál es la actividad específica de la enzima? (U=integrar a material precipitable 1 nM/3min). 10. A partir de una fermentación con Bacillu subtillis se produce α-amilasa. Se emplea como fuente de carbono 15 g/L de almidón, y se adicionan 0.3 g/L de biomasa como inóculo. Para la determinación de la actividad, se adicionan 0.05mL de solución de enzima a 950 μL de sustrato y se deja reaccionar por 3 min. Al terminar la fermentación, se tienen 5 g/L de biomasa, restan 0.5 g/L de almidón y se presentan 678 μgprot/mL. El medio de cultivo recién inoculado libera 0.58 μM de residuos reductores, mientras que la dilución 1:32 del caldo agotado libera 378 mM de residuos reductores. Calcular la actividad específica del caldo agotado, y los rendimientos Yx/S, YP/S, YP/x. (Unidades internacionales).

11. 15 μL de una enzima diluida 35 veces catalizan 50 mM de sustrato en 12 min. Si la enzima diluida 15 veces presenta una concentración de proteína de 30 ng/μL, ¿Cuál es la actividad específica de la enzima? (Unidades internacionales). 12. Para determinar la actividad de una preparación de fosfatasa alcalina, se colocan 0.2 mL de dilución 1:200 de la enzima, 200 μL de Buffer de reacción y 1.2 mL de sustrato. A los 20 min, se han liberado 476 mM de fosfato. Determinar la actividad de la preparación si la unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 10 nM de fosfato en 3 min. 13. Se desea producir jarabe de alta fructosa, para lo que se posee una preparación de glucosa isomerasa con 3x104 UI/mL. Si se desea transformar el 75% de la glucosa presente en 3.8 L de glucosa 2.5M, ¿cuánto tiempo tomará el proceso empleando 0.5 mL de la enzima, suponiendo que la velocidad no cambia con la reducción de la concentración de sustrato? 14. Para remover la región constante de los anticuerpos, se emplea una preparación de papaína, con una capacidad de remover 3x1019 regiones constantes cada 7 min usando 35 μL de preparación por mL de mezcla de reacción. Se sabe que la concentración de proteína en la mezcla es de 154 μg/μL, y que el 96% de la proteína presente corresponde al anticuerpo. ¿Cuál es la actividad específica en la preparación de enzima? 15. Se cultiva Escherichia coli recombinante para extraer una acilasa de penicilina. El sustrato limitante se encuentra en el medio a una concentración de 7 g/L, y al término restan 1.2 g/L. Se obtienen 1.2 g/L de biomasa, habiendo inoculado con 2 g de biomasa los 10 L de medio. Una dilución 1:50 del caldo agotado presenta una actividad de 3.4x102 U/mL, mientras que en el medio recién inoculado no se detecta actividad. Calcular las unidades totales producidas, y los rendimientos Yx/S, YP/S, YP/x. 16. Se aplica un inhibidor a la ADNasa, generando los datos de la siguiente tabla. Indique el tipo de inhibición de que se trata. V μM/min [S] μM Sin I I 10 μM 5 13 9.5 10 18.9 14.9 15 22.3 18.4 20 24.6 20.9 30 27.3 24.1 17. Se desea producir leche deslactosada, pero Desafortunadamente, tanto el conservador A como el B que pueden emplearse para conservar la leche hasta el momento de procesarla inhiben a la β-Galactosidasa. En base a la siguiente tabla indique el tipo de inhibición de cada uno de los conservadores y decida cuál de los dos usaría. [I] mM 0 10 mM A 10mM B [S] mM Vo μM/s Vo μM/s Vo μM/s 1 2.5 1.17 0.77 2 4.0 2.1 1.25 5 6.3 4.0 2.0 10 7.6 5.7 2.5 20 9.0 7.2 2.86 18. La enzima X se estudia para analizar el efecto de un inhibidor. Para esto se emplean dos concentraciones diferentes de inhibidor. En base a los datos de la tabla, determinar el tipo de

inhibición, las constantes cinéticas para cada concentración de inhibidor y la constante de inhibición. V (mM/L min) [S] (mM/L) Sin I I (3mM/L) I (5mM/L) 1.25 1.72 1.25 1.01 1.67 2.04 1.54 1.26 2.5 2.63 2.00 1.72 5 3.33 2.86 2.56 10 4.17 3.7 3.49 19. La ARNasa R se prueba con dos concentraciones diferentes de inhibidor. Determinar el tipo de inhibidor, las constantes cinéticas para cada concentración y la constante de inhibición. Diga si utilizaría o no este inhibidor para proteger el ARN durante una extracción. V mM/L min [S] μM/L Sin I I (0.5μM) I (0.8μM) 1250 1.72 1.25 1.01 1670 2.04 1.54 1.26 2500 2.63 2.0 1.72 5000 3.33 2.86 2.56 10000 4.17 3.7 3.49 20. Se analizó una enzima frente a diferentes inhibidores. Determinar la naturaleza da cada inhibidor (tipo de inhibición) y la constante de inhibición de cada uno. V nM/min [S] mM Sin I I (6μM) X (30 μM) Y (4 mM) z (0.2 mM) 0.2 16.67 6.25 5.56 10 8.89 0.25 20 7.69 6.67 11.11 10.81 0.333 24.98 10 8.33 12.5 13.78 0.5 33.33 14.29 11.11 14.29 19.05 1 50 25 16.67 16.67 30.77 2 66.67 40 22.22 18.18 44.44 2.5 71.4 45.45 23.81 18.52 48.78 3.33 76.92 52.63 25.64 18.87 54.06 4 80 57.14 26.67 19 57.14 5 83.33 62.5 27.77 19.23 60.60