• Author / Uploaded
• Connie Esturain

Citation preview

Universidad especializada de las Américas Facultad de ciencia clínica Departamento ciencia naturales y exacta

Asignatura: Biología Informe de biología # 4

Título de experiencia Extracción de ácidos nucleicos

Elaborado por: Cedeño Mónica Córdoba Dialineth De León Caroline Domínguez Gabriel Esturain Hyalette Hamilton Allison Grupo: 1°a En consideración a: Lurys Martínez 2019 En el campo de la observación, la oportunidad sólo favorece a la mente preparada. Louis Pasteur

INTRODUCCIÓN Los ácidos nucléicos constituyen el material genético de los organismos y son necesarios para el almacenamiento y la expresión de la información genética. Existen dos tipos de ácidos nucléicos química y estructuralmente distintos: el ácido desoxirribonucléico (ADN) y el ácido ribonucléico (ARN); ambos se encuentran en todas las células procariotas, eucariotas y virus. El ADN funciona como el almacén de la información genética y se localiza en los cromosomas del núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos de las células eucariotas. En las células procariotas el ADN se encuentra en su único cromosoma y, de manera extra cromosómica, en forma de plásmidos. El ARN interviene en la transferencia de la información contenida en el ADN hacia los compartimientos celulares. Se encuentra en el núcleo, el citoplasma, la matriz mitocondrial y el estroma de cloroplastos de células eucariotas y en el citosol de células procariotas. El descubrimiento de los ácidos nucléicos se debe a Johan Friedrich Miescher, que en el año 1869 aisló de los núcleos de las células una sustancia ácida a la que llamó nucleína, nombre que posteriormente se cambió a ácido nucléico. Composición de los ácidos nucléicos La unidad básica de los ácidos nucléicos es el nucleótido, una molécula orgánica compuesta por tres componentes:   

Base nitrogenada, una purina o pirimidina. Pentosa, una ribosa o desoxirribosa según el ácido nucléico. Grupo fosfato, causante de las cargas negativas de los ácidos nucléicos y que le brinda características ácidas.

Para la extracción simple del ADN de células animales y vegetales utilizamos diferentes reactivos como:  el detergente  la sal (NaCl)  el alcohol de 95% frio. Ya que cada uno tiene su función, que en conjunto hacen posible la extracción de los ácidos nucléicos. Al realizar la extracción del ADN pudimos observar su estructura fibrilar.

RESULTADOS Procedimiento A

EXTRACCIÓN DE DNA DE MUESTRAS VEGETALES. En este procedimiento logramos observar que el ADN se encuentra en los genes, es un componente de todas las células. Una vez que empezamos el procedimiento tomamos la muestra y la amasamos se rompen las células, todo el material celular queda libre, en presencia del detergente (ayuda a romper la membrana celular que está compuesta por lípidos) y la sal (separa las proteínas del ADN), así separando los componentes en base a su solubilidad. El ADN se precipita con alcohol y se separa del resto de los componentes. Observamos que cuando agregamos el alcohol de 95% (frío) a las paredes del tubo de ensayo que estaba inclinado, se hacían 2 capas en donde la capa de abajo era el tomate y la de arriba era el alcohol. Al transcurrir los minutos observamos que el ADN se precipita (cambiando de color y va a subir hasta la superficie.

1)Muestra tomate

2) Amasar el tomate

3)Agregar sal gruesa y el vel

4) filtrar la muestra 5)Distribuir 10 ml de 6)Inclinar levemente el tubo y muy con colador de tela ensayo despacio dejar escurrir 10 ml de etanol 95% frio

7. Esperar 10 minutos sin mezclar las capas y observar el ADN que precipita en la interfase de las dos capas y llega hasta la superficie.

8. Retir ar el ADN con una varilla de madera o con una aguja de crochet Este no se realizo

A los 25 minutos pudimos observar

Procedimiento B EXTRACCION DEL DNA DE LA MUCOSA ORAL

1. La extracción se realizará con células del epitelio bucal de un estudiante de cada grupo que haya cepillado sus dientes, recientemente. 2. Enjuague la boca varias veces antes de hacer la extracción de la muestra, para eliminar los posibles restos de comida que puedan interferir en el resultado.

3. Para colectarlas células de la mucosa oral enjuague la boca por uno o dos minutos, con la solución de extracción o lisis 5 ml, que se encuentre en el tubo de ensayo marcado para tal fin. Para optimizar la recolección de células, frote la lengua en las paredes de la boca varias veces durante el enjuague.

4. Vierta la solución en el vaso químico y añada una gota de detergente líquido. Mezcle con la varilla de vidrio para homogenizar el detergente, se debe mezclar

suavemente con él para evitar la formación de espuma.

5. Con la pipeta transfiera 2 ml de la solución del lisado celular, al tubo de ensayo que contenía la solución de extracción. 6.

Cierre muy bien la tapa y agite con ayuda por 30 segundos.

7.

Deje reposar la solución por 5minutos sobre la mesa a temperatura ambiente

8. Con el tubo del lisado celular inclinado en un ángulo de 45° y utilizando una pipeta graduada y un gotero, vierta lentamente y por las paredes de tubo 4 ml de etanol 95%frio (el metanol o isopropanol al 95% también servirá,)

9.

El etanol se debe verter de forma q valla resbalando por las paredes del tubo.

10. Observe cuidadosamente como se forman dos fase o capas. Determine el punto en que se juntan las dos capas.

11. Introduzca la punta de la pipeta Pasteur de vidrio justo hasta debajo de la separación entre el alcohol y la solución de extracción, mueva la pipeta en forma circular (hacia delante y hacia atrás) y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de ADN de mayor tamaño. El ADN precipitado parecerá una pequeña bola de hilo blanco

Para poder observar y obtener la muestra, nuestra compañera debía tener la boca limpia y enjuagársela. Este procedimiento lo hizo aproximadamente por 2 minutos , luego de esto, preparamos la solución de extracción o lisis con NaCl y NaHCO3( permite colectar las células de la mucosa). Debía frotar la lengua contra las paredes de la boca varias veces de 2 a 3 minutos. Lugo vertimos esta solución en el vaso químico le agregamos detergente (romper la membrana celular) y lo mezclamos suavemente hasta que se homogenizara, pero sin crear burbujas.

Luego pasábamos con una pipeta 2 ml de la solución de lisis celular al primer tubo, lo dejábamos reposar, lo inclinamos y le añadimos 4ml de alcohol (precipita el ADN) lentamente por las paredes. Y pudimos observar el ADN precipitado.

MATERIALES: • • • • • • • • • • • • •

Un tomate maduro Cuchillo y tabla 2 bolsas plásticas 12 vasos precipitados 1 colador de tela 2 ml de detergente 2 ó 3 granos de sal gruesa Tubos de ensayo y gradilla (sustituibles por frascos pequeños o vasos) 6 pipetas de 10 ml Etanol de 95% bien frio (el etanol debe ser colocado en el congelador al menos un día antes de la realización de la practica). Varilla de madera Solución de NaCl al 1.5% Bicarbonato sódico al 5%. Ambas en agua destilada

PROCEDIMIENTO A: EXTRACCIÓN DE DNA DE MUESTRAS VEGETALES. 1. Cortar el tomate (o material seleccionado) en trozos pequeños. 2. Colocar los trozos del tomate en una bolsa de plástico y amasar bien. Si el tomate no 1. estuviera suficientemente maduro o sacara poco jugo, agregar hasta un volumen equivalente 2. de agua. 3. Agregar la sal gruesa y el detergente a la masa de tomate. Mezclar bien. 4. Luego de 5 a 10 minutos, filtrar la masa de tomate con un colador de tela. 5. Distribuir 10 ml del líquido filtrado en cada uno de los tubos de ensayo. 6. Inclinar levemente el primer tubo y muy despacio dejar escurrir 10 ml de etanol 95% sobre el líquido. El etanol formará una segunda capa por encima de la solución. 7. Esperar 10 minutos sin mezclar las capas y observar el ADN que precipita en la interfase de las dos capas y llega hasta la superficie. 8. Retirar el ADN con una varilla de madera o con una aguja de crochet.

PROCEDIMIENTO B: EXTRACCION DEL DNA DE LA MUCOSA ORAL 1. La extracción se realizará con células del epitelio bucal de un estudiante de cada grupo que haya cepillado sus dientes, recientemente. 2. Enjuague la boca varias veces antes de hacer la extracción de la muestra, para eliminar los posibles restos de comida que puedan interferir en el resultado. 3. Para colectarlas células de la mucosa oral enjuague la boca por uno o dos minutos, con la solución de extracción o lisis 5 ml, que se encuentre en el tubo de ensayo marcado para tal fin. Para optimizar la recolección de células, frote la lengua en las paredes de la boca varias veces durante el enjuague. 4. Vierta la solución en el vaso químico y añada una gota de detergente líquido. Mezcle con la varilla de vidrio para homogenizar el detergente, se debe mezclar suavemente con él para evitar la formación de espuma. 5. Con la pipeta transfiera 2 ml de la solución del lisado celular, al tubo de ensayo que contenía la solución de extracción. 6. Cierre muy bien la tapa y agite con ayuda por 30 segundos. 7. Deje reposar la solución por 5minutos sobre la mesa a temperatura ambiente 8. Con el tubo del lisado celular inclinado en un ángulo de 45° y utilizando una pipeta graduada y un gotero, vierta lentamente y por las paredes de tubo 4 ml de etanol 95%frio (el metanol o isopropanol al 95% también servirá,) 9. El etanol se debe verter de forma q valla resbalando por las paredes del tubo. 10. Observe cuidadosamente como se forman dos fase o capas. Determine el punto en que se juntan las dos capas. 11. Introduzca la punta de la pipeta Pasteur de vidrio justo hasta debajo de la separación entre el alcohol y la solución de extracción, mueva la pipeta en forma circular (hacia delante y hacia atrás) y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de ADN de mayor tamaño. El ADN precipitado parecerá una pequeña bola de hilo blanco

Respuestas: 1. ¿Por qué no se obtienen con este procedimiento los ácidos nucleicos por separados? El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro, ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción “profesional” se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN y que impiden que se unan al ADN. 2. ¿Por qué el etanol debe estar frío, que ocurriría si se utiliza a temperatura normal? Para separar el ADN del resto de moléculas presentes, se añade alcohol frío a la muestra. Como consecuencia, el ADN precipitará porque es menos soluble en alcohol que en agua. Cuanto más frío esté el etanol, menos soluble será el ADN en él. Esto es similar a la solubilidad del azúcar en el té (o en cualquier otra bebida); así, el azúcar se disuelve con más facilidad en té caliente que en té helado. En presencia de altas concentraciones de sal y de alcohol frío, el ADN liberado de la célula precipita y se agrega hasta poder visualizarse ¡a simple vista! Las otras moléculas en el extracto celular, como los aminoácidos y carbohidratos, permanecen disueltas en el alcohol, el agua y no se pueden visualizar. Se necesitan miles de cadenas de ADN para formar una fibra lo suficientemente grande para poder ser visible. Cada cadena tiene miles de genes, así que estaríamos viendo millones de genes a la vez. no obstante, se podrá observar el ADN procedente de miles de células.

3. ¿Por qué se debe usar un detergente durante la preparación de la muestra? Explique detalladamente su respuesta. Detergente: Las membranas de las células están formadas por dos capas de lípidos con proteínas transmembrana a través de estas. El detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear (Imagen 1). Los lípidos de la membrana se descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la membrana junta. Cuando el detergente se pone en contacto con los lípidos éstos se separan de la membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos.

Además, el detergente permite que las proteínas asociadas al ADN de gran longitud, se fraccionen en cadenas más pequeñas y se puedan separar.

4. cuales la función de la sal gruesa? Explique La sal en la solución de extracción: La molécula de DNA es soluble en agua y por tanto invisible, pero si se pone en contacto DNA que haya estado en un medio salado y alcohol frío el DNA se vuelve insoluble y precipita. Por lo tanto, el agua salada ayuda a la precipitación en el alcohol. La sal también ayuda a separar el DNA de las histonas (proteínas básicas).

CONCLUSIÓN En la experiencia hemos podido concluir lo siguiente: • • •

• • • •

•

• • • • •

El ADN puede ser extraído de cualquier célula de un ser vivo. Los reactivos (el detergente, la sal, el alcohol y el agua) son importante ya que cada uno, tiene su función que en conjunto hacen posible la extracción de los ácidos nucléicos. Conocimos la función de cada reactivo: el detergente ayuda a disolver la membrana celular que es una bicapa lipídica, la sal ayuda a separar las proteínas y evitar que precipiten. y el alcohol frio provoca que el ADN se separe del agua y se precipite. El aislamiento del ADN usando el protocolo con sal común y lavaplatos es una alternativa simple, fácil, rápida, económica y no contaminante. Al realizar el experimento sobre la extracción del ADN pudimos observar su estructura fibrilar. Observamos que durante el enjuague bucal con la solución de extracción se recolectó las células que se desprenden de las encías, paredes de la boca y la lengua. Según lo leído y estudiado para poder elaborar este informe el procedimiento que hicimos en el laboratorio es para extraer ácidos nucléicos, no solo ADN. (lo que observamos en los tubos de ensayo es la mezcla de ADN y ARN) Por otra parte, tampoco podemos olvidar que no se hubiese podido llevar a cabo aquel experimento de extracción de ADN si no se llegaba a tomar en cuenta todos los cuidados del manejo de la muestra dentro del laboratorio, por ejemplo: - Las temperaturas adecuadas de las sustancias que fueron utilizadas para el experimento. - A la hora de darle los giros a la muestra, hacerlo con la delicadeza y el tacto apropiado. - También la preparación de la solución salina que fuese una concentración adecuada para llevar acabo el rompimiento de manera adecuada la membrana. - A la hora de que uno de los compañeros ofrecía su muestra de mucosa oral, que se lograra cumplir con la limpieza adecuada para luego tomar la muestras sin que aparezcan restos de alimentos. Todos estos cuidados son muy importantes desde la manipulación de muestra hasta la limpieza de los materiales, para que los resultados fuesen provechosos y se pudiese lograr la observación que se quería lograr, en este caso la del material genético de la célula de un ser vivo.

INFOGRAFIA

Bibliografía María Antonia Malajovich / Guías de actividades María Biotecnología: enseñanza y divulgación http://www.bteduc.bio.br Jesús Viñas López –génica Laura Martínez -1° grado genética –UAB Belén Fernández Maroto/ observando mi propio ADN

Entidad:Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC/María Jesús Martínez y Jose Luis García./IX Feria Madrid es Ciencia (2008) Ana Zita/ Extracción de ADN (experimento casero) / Toda Materia: Contenidos escolares. 2018 - 2019