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• Fabian Adamex

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ADN RESUMEN El presente informe, representa una actividad de extracción del ADN, que será de gran utilidad en muchas aplicaciones de la medicina. Ya que la medicina del futuro es la genética, y el estudio de la genética comienza analizando el genoma, es importante conocer diferentes métodos que nos permitan extraerlo para poderlo analizar. Es objetivo de este informe: 

Denotar los diferentes métodos disponibles para la extracción del DNA.

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Ejemplificar un método que permitirá conocer como es que funciona la técnica en este tipo de procedimientos.

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Aprender la metodología utilizada para la extracción del DNA.

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Profundizar en la teoría para conocer algunos aspectos de aplicaciones clínicas y saber qué técnicas nos ofrecen mejor rendimiento.

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Obtener DNA con un máximo grado de pureza, basado en la buena aplicación del método.

MARCO TEÓRICO La molécula de ADN (que es la que se va a extraer en este laboratorio) está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN, se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas. La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno, y este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura de un determinado ADN está definida por la "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de nucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético. La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria. REPLICACIÓN DEL ADN Es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o réplicas de su molécula. Este proceso es fundamental para la transferencia de la información genética de generación en generación. Las moléculas se replican de un modo semiconservativo. La doble hélice se separa y cada una de las cadenas sirve de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. El resultado final son dos moléculas idénticas a la original.

Existen varios métodos para la purificación del ADN. Por ejemplo, con la extracción directamente de 300 ml. de sangre completa se puede utilizar el Kit comercial"Wizard genomic DNA purification kit" que sirve para purificar material genético de humanos, células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias. Para la realización de este y otros métodos se debe seguir las instrucciones del fabricante, (esta técnica es la que vamos a utilizar en este laboratorio para purificar DNA, y se describirá posteriormente sus pasos para la obtención de dicho material). Con esta técnica, podemos utilizar posteriormente los análisis de DNA tales como amplificación (PCR), digestión con endonucleasas de restricción, southern blot o Dot blot. Otros métodos son: Método comercial InstaGene Matrix: donde también se extrae DNA a partir de sangre entera, diseñado para aislar DNA que posteriormente será utilizado en reacciones de PCR. En un tubo Eppendorf se agrega solución de Lysis Buffer (pH: 7.9) y sangre entera. Luego de varios lavados y centrifugaciones con este buffer, se descarta el sobrenadante y se agrega el InstaGene Matriz al pellet obtenido. Por último, se realizan dos incubaciones, una a 70ºC y otra a 95ºC. Las muestras son guardadas a -20ºC hasta la realización de la técnica de PCR, digestión con endonucleasas de restricción, southern blot o Dot blot. Método Salting Out: En este método se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K ( Tris-HCl, pH 8.3,Tween 20, Nonidet P40, Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el DNA presente en soluciones con alta concentración de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la adición de alcohol etílico a dichas soluciones. Extracción de DNA de sangre periférica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB): El fundamento es similar al método anterior, pero en este caso no se utiliza el buffer con Proteinasa K y, la liberación de los ácidos nucleicos se realiza con una solución de homogeinización (CTAB, NaCl, b-mercaptoetanol, EDTA, Tris-HCl pH 7.5). El CTAB es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran magnitud molecular, y tiene propiedades detergentes; se conocen con el nombre de jabones invertidos, debido a que su actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y no a uno negativo, como sucede en los sulfatos de alquilo e hidrógeno, que son los detergentes usuales. Luego se realizó la extracción de los ácidos nucleicos con cloroformo: alcohol isoamílico, y la posterior precipitación del DNA con etanol absoluto primero, y posteriormente con etanol 70%. Esta es considerada por muchos la una técnica que reúne los requisitos fundamentales para purificación del DNA, ya que sirve para amplificación PCR, mostrando una pureza muy alta del material que separa. La purificación del DNA es importante porque permite: 

Identificar mutaciones.

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Ver características propias de los tipos de DNA (Polimorfismo).

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Para clonar (Genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos).

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Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno.

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Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patogénicos.

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Identificar resistencia microbiana.

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Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, imunológicos.

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Medicina forense para la identificación de personas.

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Para hacer tests de paternidad.

Hay que tener en cuenta que es muy importante la fuente de células de las cuales voy a extraer el DNA , ya que de esto depende la facilidad para la ejecución del procedimiento, Por ejemplo la extracción del DNA de las células del cabello es difícil de separar su DNA pero es muy fácil conseguir el pelo, o la extracción de DNA de leucocitos es fácil pero para conseguirlos es más dificultoso. CONCEPTOS IMPORTANTES 

Heparina: Heteropolisacárido complejo; posee buena cantidad de grupos sulfato y residuos glucosalina. La heparina inhibe la coagulación de la sangre por activación de la antitrombina III. En cantidades pequeñas la heparina no tiene un efecto significativo en muchas de las determinaciones de laboratorio y se utiliza generalmente como anticoagulante en las muestras de sangre en los laboratorios clínicos. El citrato, la heparina y el EDTA entre otros, son anticoagulantes que imposibilitan la disponibilidad de iones de calcio, que es imprescindible en la coagulación, y ya sin el calcio, la muestra de sangre al centrifugarla no se coagulará y se podrán separar las moléculas sin problema.

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Isopropanol: (CH3 CHOHCH3). Líquido transparente, volátil e incoloro empleado en el laboratorio químico para extraer y disolver lípidos y en histología se usa como solubilizante de los colorantes de grasas y como agente deshidratante. El isopropanol precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratándolo y llevándolo al fondo del tubo.

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Etanol: (CH3CH2OH). Líquido volátil, incoloro, miscible con agua, metanol, éter, acetona y cloroformo. Se emplea principalmente como solvente en muchosprocedimientos de laboratorio, como agente deshidratante en histología como solvente de algunas sustancias 8tinturas) y como desinfectante.

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Solvatación: Interacción estabilizadora de un solvente con un soluto o de un solvente con grupos funcionales en la superficie de un material insoluble.

MATERIALES Y REACTIVOS Tubos vacutainer con EDTA, heparina o citrato Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml Micropipetas Puntas Vortex Microcentrífuga para viales de 1.5 ml Guantes Agua deionizada grado I (MQ) estéril (H2Odd) Baño de agua a 37°C Isopropanol Etanol 70 % METODOLOGÍA

1. 900 µl de Cell Lysis Solution en tubo eppendorf de 1.5 ml. 2. Transferir 300 µl de sangre venosa periférica anticoagulada mezclar por inversión 5 veces. 3. Incubar 10 minutos e invertir tubo 3 veces para lisar los eritrocitos 4. Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente. 5. Remover sobrenadante, sin resuspender el botón de leucocitos. 6. Colocar tubo en vortex fuerte 15 segundos hasta resuspender completamente los leucocitos 7. Adicionar 300 µl de Nuclei Lysis Solution y resuspender 6 veces con pipeta 8. Adicionar 1.5 µl de RNase Solution, mezclar, invertir 25 veces e incubar a 37°C/15 minutos. 9. Adicionar 100 µl de Protein Precipitation Solution y colocar en vortex fuerte por 20 segundos 10. Centrifugar a 16.000 x g/3 minutos/temperatura ambiente. 11. Transferir sobrenadante a tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo, que tiene 300 µl de isopropanol. 12. Mezclar por inversión hasta que el DNA se haga visible 13. Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente. 14. Remover el sobrenadante y adicionar 300 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente. Invertir el tubo varias veces para lavar el botón con el DNA. 15. Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente 16. .Aspirar cuidadosamente el etanol con una pipeta Pasteur o con puntas para secuenciamiento. En este punto se puede perder muy fácilmente el DNA. 17. Invertir el tubo sobre una servilleta y deje secar al aire por 15 minutos. PROCEDIMIENTO Y ANÁLISIS El proceso efectuado en el laboratorio para la purificación del DNA a partir de leucocitos humanos, se basó en la aplicación del método "Wizard Genomic Purification Kit" como ya lo habíamos mencionado anteriormente. 1. Partiendo de una muestra de 300 ml de sangre humana (sacada con una micropipeta graduada previamente y limpiada luego con fluhidróxido de sodio para aumentar el ph y destruir la contaminación biológica que probablemente adquirió) previamente tratada con heparina que es un anticoagulante, se procedió a mezclar con el tampón de cloruro de magnesio (Cell Lysis Solution y el cual tenía una cantidad de 900 ml) que entra en las células y genera una desestabilización osmótica, haciendo que las células se hinchen y se estallen sus membranas celulares. Todo esto se logra en un tiempo de incubación de 10 minutos a 37ºc para favorecer la reacción. Luego procedemos a centrifugar para ayudar con el rompimiento de la membrana y a la vez para sedimentar los núcleos de leucocitos, quedando un sobrenadante compuesto por restos de membrana, organelas celulares, protoplasma y restos de hemoglobina que le da un color rojo con tendencia a oscuro. 2. Se procedió a la extracción del sobrenadante con la micropipeta varias veces para sacar la mayor cantidad posible, evitando succionar los núcleos de los leucocitos. Esta cantidad de núcleos sedimentados es llevada al vórtex por 15 segundos para resuspenderlos y facilitar el mismo proceso. 3. Se agregaron 300ml de Nuclei Lysis Solution la cual es básica (NONIDET P4O) que actúa selectivamente en la membrana nuclear con el objetivo de romperla y liberar los ácidos

nucleicos ejerciendo así su función detergente. Luego de mezclar la solución con la pipeta, se empezó a observar de consistencia muy viscosa. 4. Adicionamos 1,5 ml de RNase solution y mezclamos invirtiendo el tubo 25 veces para luego proceder a incubar la muestra a 37ºc y por un tiempo de 15 minutos. Este procedimiento se hace con el fin de desintegrar el RNA, quedando así el DNA y varios tipos de proteínas. 5. Pasados los 15 minutos de incubación agregamos 100ml de Protein precipitation solution (proteinasa K) y colocamos en el vórtex por 20 segundos. La solución de precipitación de proteína que es básicamente cloruro de sodio, solvata las proteínas e inicia su precipitación. Centrifugamos por 3 minutos para agilizar este proceso de precipitación. 6. Terminado el proceso de centrifugación, se pudo observar una pequeña porción sedimentada de color rojo oscuro que contiene las proteínas y con ellas la presencia de hemoglobina con su color rojo característico. El sobrenadante es de color transparente y contiene el DNA, aunque aún no visible. 7. Retiramos el sobrenadante y lo mezclamos con 300ml de isopropanol. Luego de haber invertido esta varias veces, buscando la buena interacción de los componentes, pudimos observar el DNA como unas pequeñas fibras de algodón color blanco y esto se logró gracias a que el isopropanol deshidrata el DNA e inicia su sedimentación. 8. Centrifugamos para sedimentar el DNA y sacar la mayor parte posible de isopropanol y le agregamos al DNA sedimentado 300ml de etanol al 70% para rehidratarlo y luego centrifugar por 1 minuto para sedimentar el DNA ya hidratado. 9. Aspiramos cuidadosamente el etanol con la pipeta, e invirtiendo el tubo sobre una servilleta se puede sacar el exceso de etanol quedando el DNA en el tubo. Teniendo así el DNA se debe posteriormente dejar al aire 15 minutos y para conservarlo se agregan 100ml de DNA Rehydration solution e incubar a 65ºc/1 hora y luego incubar la solución a 4ºc APLICACIONES CLÍNICAS 1. Test de paternidad La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción de detergentes, que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas, es decir, se está utilizando un kit cualquiera para este procedimiento. Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centígrados, se produce la ruptura de la estructura celular liberando todo su contenido a la solución. La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgánicos (fenol, cloroformo), que coagulan proteínas y extraen los lípidos, y finalmente el ADN se separa por precipitación con alcohol en medio salino. Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos. Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se deposita sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeños fragmentos del papel (alrededor de 1 mm.) y se extraen las impurezas mediante lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente colocándolo en la mezcla de amplificación. Analizando el DNA existen dos metodologías diferentes: a) Corte con enzimas de restricción, corrimiento electroforético en geles de agarosa, transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento con sondas de locus múltiple o de locus específico. Estas técnicas han caído en desuso, por lo cual no serán tratadas aquí. De

todos modos, si desea información sobre el tema, puede consultar la "Tesis Doctoral", al final del presente resumen. b) Amplificación mediante PCR o reacción en cadena de la polimerasa: es un proceso que consiste en imitar una actividad normal de la célula: la copia de ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en los cuales están ubicadas las regiones variables. Para ello, se coloca en cada tubo una porción del ADN extraído de cada persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que "copia" ADN (denominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable. La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador térmico, que produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión de la cadena copiada, mediante la unión de los nucleótidos que se encuentran en la solución, con la ayuda de la polimerasa. Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior de un soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más rápido que los grandes, produciendo su separación. Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes métodos: - Radiactivos: si uno de los nucleótidos estaba marcado radiactivamente, basta poner el gel en contacto con una película radiográfica, que se revela para observar las variantes. - Tinción con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga positiva son atraídas por la carga negativa de los fragmentos de ADN, y se revela de modo similar a una fotografía. Tanto los métodos radiactivos como los de tinción con plata están cayendo en desuso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que poseen un escaso volumen de trabajo. - Sistemas automatizados: son los de última generación, en los cuales al proceso de electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee mediante un rayo láser los "primers", marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar qué variantes son las que se encuentran en cada muestra. 2. Extracción del DNA de la bacteria que produce la enfermedad de chagas. Usando el método Extracción de DNA de sangre periférica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB), se dejó listo el DNA para ser analizado mediante el método de amplificación PCR, en el siguiente caso: La Enfermedad de Chagas es la infección de mamíferos y de triatomineos, producida por un protozoo flagelado, el Trypanosoma cruzi, protozoo mastigóforo que pertenece a la familia Trypanosomatidae, en cuyo ciclo biológico intervienen mamíferos y un insecto vector. Los huéspedes mamíferos pueden ser el hombre y algunos animales domésticos o silvestres. Este parásito se presenta bajo tres aspectos morfológicos fundamentales: Tripomastigoto, Epimastigoto y Amastigoto. Esta enfermedad se puede diferenciar en tres etapas: período agudo, período latente o indeterminado y período crónico. La metodología de PCR (Polymerase Chain Reaction), permitirá realizar la extracción del DNA del parásito para su posterior correlación con los resultados obtenidos en individuos chagásicos mediante las técnicas convencionales de serología y xenodiagnóstico, a fin de poder evaluar la efectividad del tratamiento, ya que la respuesta humoral contra los antígenos de Trypanosoma cruzi puede permanecer a través de los años, aunque el parásito no sea demostrable por xenodiagnóstico o cultivo (Brito y cols. 1995); es decir que si se realiza un estudio serológico es

este momento, seguramente dará un resultado positivo, por la denominada "cicatriz serológica", a diferencia de la PCR que permite realizar una detección directa del DNA del parásito, indicando efectivamente su presencia y actividad. Por esta razón, la PCR podría en un futuro reemplazar el xenodiagnóstico para la evaluación de la parasitemia en pacientes chagásicos tanto agudos como crónicos. Los porcentajes de sensibilidad de la PCR varían de 96% al 100%, como se puede observar, siempre son mayores que los obtenidos con los exámenes de xenodiagnóstico, los cuales tienen una sensibilidad de aproximadamente 50%. CONCLUSIÓN El método utilizado para la extracción de DNA, permite purificar en un grado relativamente alto (porque depende con la precisión de la toma de muestras y de procedimiento su éxito) y pudimos determinar que es factible utilizarlo en posteriores ocasiones ya que es muy fácil de utilizar y se presta para varias aplicaciones clínicas. AUTOR Julián Esteban Londoño