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• AndriiMaragaño

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UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA

Laboratorio: Actividad Enzimática. Invertasa de levadura Introducción Las enzimas catalizan las reacciones disminuyendo la energía libre de activación necesaria para que las mismas ocurran. La molécula sobre la cual la enzima actúa se denomina sustrato, esta molécula se transforma obteniéndose el producto. La molécula de enzima no se modifica al término de la reacción y puede continuar catalizando la misma repetidas veces. La conformación de una enzima es mantenida por las interacciones que se establecen entre las regiones específicas de los aminoácidos que componen la cadena polipeptídica. Debido a ello la misma es susceptible ante cambios en el ambiente en el cual se encuentra, siendo dos de los factores más importantes la temperatura y el pH. Cuando estos varían de forma tal que la conformación de la proteína es alterada, la enzima pierde su actividad. Esto provoca que cada enzima tenga sus condiciones óptimas de funcionamiento tanto de pH como temperatura. Invertasa de levadura La sacarosa, comúnmente conocida como azúcar de mesa, es un disacárido compuesto por -D-glucosa y -D-fructosa unidos mediante enlace glicosídico -1,2. Cuando este enlace es roto en la reacción de hidrólisis, se genera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa. La sacarosa puede ser hidrolizada en presencia de una enzima comúnmente denominada invertasa o sacarasa (Figura 1):

Figura 1. Estructuras químicas generadas por la hidrólisis de sacarosa, catalizada por la enzima invertasa (o sacarasa).

La denominación sistemática de la invertasa es -fructofuranosidasa, (β-Dfructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa), debido a que la reacción catalizada por esta enzima es la hidrólisis del residuo terminal -fructofuranósico. Existe otra enzima, la -D-glucosidasa, que también cataliza esta reacción, escindiendo la unidad terminal de la glucosa. La sacarosa también puede ser hidrolizada de manera no enzimática en medio ácido. La invertasa es una enzima muy utilizada en la industria alimenticia ya que debido a su sabor más dulce y a que no cristaliza tan fácilmente, se prefiere a la fructosa sobre la sacarosa. Un amplio rango de microorganismos sintetizan invertasa pudiendo, por lo tanto, emplear la sacarosa como nutriente. A escala comercial es biosintetizada por las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carsbergensis. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de las enzimas más conocidas. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cinética se estudió en profundidad (estudios clásicos de Michaelis-Menten) y que fue utilizado industrialmente. A diferencia de otras enzimas, la invertasa presenta actividad relativamente elevada en un rango amplio de pH (desde 3,5 a 5,5) con el óptimo en pH= 4,5. En cuanto a la temperatura, el máximo de actividad se registra alrededor de los 55°C. El valor de la constante de Michaelis-Menten varía según las diferentes isoformas entre 2 mM y 5 mM. La actividad de la invertasa es inhibida en presencia de metales pesados, por ejemplo 1+

los iones Ag atacan a la histidina de la cadena peptídica inactivándola. El sulfato de cobre en concentraciones elevadas también presenta un efecto inhibidor. Objetivo: En el presente trabajo práctico se realizará la extracción de la invertasa de levadura y, posteriormente, se verificará su acción sobre una solución de sacarosa. La misma se comprobará mediante el test de Fehling, el cual permite detectar la presencia de los productos de la hidrólisis de este disacárido (glucosa y fructosa).

Protocolo de trabajo: A- Obtención de la enzima Colocar 7,5 g de levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) en un mortero y homogeneizar en 15 ml de bicarbonato de sodio 0,1M (buffer de extracción). Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 20' agitando periódicamente. Filtrar cuidadosamente y recuperar el filtrado, el cual contiene la enzima, y será el extracto enzimático (EE) a utilizar. Tomar una alícuota de 2 ml del EE y hervirla a calentando directamente al mechero, este será el extracto enzimático hervido (EEH) B- Proceso enzimático Realizar una batería de tubos de ensayo siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 2

Vsacarosa Vsucralosa VAlmidón VCuSO4 VNaOH VEE 0,02 M (mL) 0,5% (mL) 1% (mL) 0,5% (mL) 0,25%(mL) (mL) 2 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0,5 2 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 2 0 0 0,25 0 1 2 0 0 1 0 1 2 0 0 0 0,25 1 2 0 0 0 1 1 0 2 0 0 0 0 0 2 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 0 2 0 0 1

VEEH (mL) 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

Dejar reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente. C- Detección de los productos de la catálisis Agregar a cada tubo 1 ml del reactivo A de Fehling y 1 ml del reactivo B de Fehling. Calentar los tubos directamente al mechero por aproximadamente 1 min, retirarlos y dejarlos enfriar en la gradilla y observar los resultados.

D- Resultados Los productos de la hidrólisis de la sacarosa -fructosa y glucosa- dan resultado positivo para el test de Fehling, lo cual es indicado por la aparición de un precipitado rojo ladrillo. Compare los resultados obtenidos en los distintos tubos -aparición o no del precipitado y cantidad del mismo- y trate de explicarlos en base a los reactivos agregados en cada uno. Inicio de la reacción

si da positivo:

ejemplos (dos positivos y uno negativo)

Actividades complementarias 1- ¿Qué es el reactivo de Fehling y que es lo que reconoce? 2- ¿Por qué la reacción de Fehling es negativa con sacarosa y positiva con los productos de la hidrolisis por invertasa? 3- En el protocolo experimental realizado, cuál es el rol del NaOH agregado a algunos de los tubos? a. Es el sustrato sobre el que actúa la enzima. b. Acelera la reacción entre la enzima y el sustrato. c. Desnaturaliza la enzima por alterar su sitio activo. d. Bloquea el sitio activo de la enzima. 4- ¿Cuál es el objeto de realizar el primer tubo de la serie -el cual contiene sólo sacarosa? 5- ¿Cuál es la estructura de la sucralosa y que esperabas que ocurra con la invertasa?