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• MauricioReyes

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LABORATORIO Nº2 MÉTODOS DE SEPARACIÓN: CROMATOGRAFÍA 1. Aspectos teóricos de la cromatografía. La cromatografía es una técnica de separación de solutos de una mezcla, que se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. A este disolvente se le llama fase móvil y el medio poroso puede ser la fase estacionaria, o bien servir de soporte a esta fase. Se habla de cromatografía en columna cuando la fase estacionaria o su soporte están contenidos en una columna. La separación cromatográfica constituye un proceso dinámico que permite un intercambio continuo por desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El diferente reparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria es la causa de la separación de los solutos. El soluto que tiene mayor afinidad por la fase estacionaria se moverá con mayor lentitud. La fase móvil se llama eluyente. Cuando emerge por la salida de la columna se llama eluato. El proceso que consiste en hacer pasar un líquido o un gas a lo largo de la columna de cromatografía se llama elución. El volumen de elución (ve) es el volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto dado de la columna cromatográfica. Se puede clasificar las cromatografías en 5 grandes grupos: • • • • •

Cromatografía de Reparto. Cromatografía de Adsorción. Cromatografía de Intercambio Iónico. Cromatografía de Exclusión. Cromatografía de Afinidad.

Cromatografía de Reparto: Está basada en la separación o reparto de una mezcla de solutos entre la fase móvil (disolvente) y la fase estacionaria soportada sobre un sólido adecuado, de acuerdo a las distintas solubilidades de estos solutos en ambas fases. Si el disolvente es un líquido se denomina cromatografía líquida. Son cromatografía de reparto la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina (TLC). La cromatografía en papel se utiliza para la separación de cantidades mínimas de soluto y también como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de una fase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte sólido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en movimiento. Una vez realizada la cromatografía, la posición de los componentes se determina mediante una técnica que permita “visualizarlos”. Es común revelar el cromatograma mediante reacciones que originen productos coloreados. 8

Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migración con respecto al solvente móvil en condiciones definidas en relación con el comportamiento de patrones. El cromatograma no es alterado por la presencia de otros solutos. Se calcula la razón de migración del soluto con respecto a la fase móvil (Rf ) que se compara con la de los patrones (Ec. 2.1). Rf

=

distancia recorrida por el soluto distancia recorrida por la fase móvil

Ecuación 2.1

El Rf debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su punto de partida hasta el punto medio de la posición de éste una vez corrida la cromatografía, y la distancia recorrida por la fase móvil, también medida desde el punto de partida del soluto hasta el frente del solvente en el papel. Como los Rf son constantes en condiciones definidas y controladas permiten identificar los componentes de una mezcla de solutos, en la medida que los Rf de muestras y patrones se obtengan en un mismo experimento. b. Cromatografía de Adsorción: Está basada en la diferente adsorción y posterior desorción de sustancias contenidas en un disolvente móvil (líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No se debe confundir la adsorción que es un fenómeno de superficie que se manifiesta por el aumento de concentración de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorción que consiste en la penetración de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de cromatografía de adsorción son la cromatografía en columna de alúmina y de carbón activado, la placa de sílica gel. c. Cromatografía de Intercambio Iónico: La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee grupos iónicos unidos covalentemente y contraiones móviles que pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase móvil (líquido). d. Cromatografía de Exclusión Molecular: Las moléculas pueden ser separadas también sobre la base de sus diferentes tamaños al pasar a través de una columna que contiene partículas hidratadas de geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen número de materiales para estos fines, cuya composición y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que moléculas de tamaño relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada selección del tamaño del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partículas pequeñas de dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacáridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de moléculas grandes y pequeñas se colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las moléculas pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino más largo, mientras que las moléculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una 9

separación completa en la que las moléculas grandes salen primero de la columna y por último las más pequeñas. El resultado de la columna cromatográfica se expresa en la forma de un diagrama de elución que muestra la variación de la concentración del soluto en el eluyente versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de elución. El volumen de elución (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un compuesto, ya que varía con el volumen total de la columna (Vt) y la forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav (Ec. 2.2).

K av =

v −v v −v e

0

t

0

Ecuación 2.2

En cromatografía de exclusión el volumen de la fase móvil se llama volumen intersticial (V0). El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una molécula grande e inerte de peso molecular superior al límite de exclusión del gel. El azul de dextrano 2000, un colorante con peso molecular de 2*10 6, se utiliza generalmente con este propósito. Cuando no se dispone de la información adecuada para este cálculo, el Vo se puede estimar como el 35% del volumen total de la columna (Vt). El volumen total de la columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (V t = π · r2 · h ). De los cuatro tipos de cromatografía, en este laboratorio se usará la cromatografía de reparto en papel y la de exclusión sobre Sephadex G-25. 2. Objetivos. Identificar aminoácidos de una muestra problema mediante la cromatografía de reparto en papel. Separar diclorofenol-indofenol y hemoglobina ocupando la técnica de cromatografía de exclusión.

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Parte experimental. 3.1 Materiales • espectrofotómetro / celdas. • 1 cámara cromatográfica • 6 capilares • 1 papel filtro (14 cm de ancho) • 1 pizeta • 2 placas de porcelana • 1 columna cromatográfica de Sephadex G-25 hidratado • 1 manguera y regulador • 1 pipeta graduada de 1 ml • 1 pipeta graduada de 5 ml • 1 vaso precipitado de 250 ml • 1 vaso precipitado de 150 ml • 2 gradillas • 20 tubos de ensayo 3.2 Reactivos • • • •

leucina, glicina, lisina y prolina (1mg/ml) (patrones) solución n-butanol / ácido acético/ H2O en relación 3:1:1 (fase móvil). ninhidrina 0,2 % en etanol. tampón fosfato 67mM pH 7,0 / NaCl 0,1 M .

4. Procedimiento. 4.1 Cromatografía de reparto en papel para separación e identificación de aminoácidos. • •

• •

Coloque con anticipación la fase móvil en la cámara cromatográfica y tape la cámara, de modo que se sature con los vapores de esta fase. Tome el papel de un borde (superior) ocupando guantes de goma para evitar contaminarlo con aminoácidos o proteínas que se encuentren en las manos. Corte el papel filtro como un rectángulo de 30 cm de alto y 14 cm de ancho. Marque con lápiz grafito una línea a lo ancho del papel a 1,5 cm del borde inferior. Marque puntos en esta línea separados por una distancia de 1,5 a 2,0 cm entre si. Coloque con un capilar fino, diferente para cada muestra, las soluciones de los aminoácidos patrones y las muestras problemas sobre la línea marcada. Identifique siempre con lápiz grafito cada aplicación. Enganche la tira de papel filtro en la parte superior de la cámara cromatográfica que se encuentra saturada con los vapores de la fase móvil. Deje el borde inferior del papel sumergido 1,0 cm en la fase móvil. 11

• • • • •

Deje que la fase móvil ascienda unos 15 cm aproximadamente, no permita que el líquido sobrepase el borde superior y saque el papel de la cámara. Deje secar a temperatura ambiente. Revele la cromatografía rociando el papel con ninhidrina y secando el cromatograma en una estufa a 80 – 90ºC. Los aminoácidos aparecen como manchas púrpuras y amarillas. Marque el centro de las manchas de los aminoácidos, mida el avance de cada muestra y del frente del solvente a la altura de cada muestra. Calcule la razón de migración de los solutos con respecto a la fase móvil (R f) (Ec. 2.1).

4.2 Separación de la hemoglobina (Hb) del colorante diclorofenol-indofenol (DCPIP) por cromatografía de exclusión en Sephadex G-25 (1- 5 kD). • • • • • • • •

Abra la llave reguladora del flujo de la columna cromatográfica y deje salir el tampón hasta que quede al nivel del Sephadex, una vez realizado, detenga el flujo cerrando la llave. Agregue 0,5 ml de la muestra problema sobre la superficie del gel de la columna cromatográfica y mantenga el flujo detenido. Recolecte y mida el volumen eluido a partir de este momento. Conecte la columna a la fase móvil y regule el flujo a 10 gotas por minuto mediante las llaves reguladoras. Recoja fracciones de 3,0 ml del eluyente hasta que toda la muestra haya eluido. Mida la absorbancia de todas las fracciones recolectadas a 420 nm (Hb) y 580 nm (DCFIF) Mida la absorbancia de las muestras recogidas a 420 (Hb) y 580 nm ( DCFIF). Grafique en un gráfico la absorbancia versus el volumen de elución a ambas longitudes de onda. Determine el Kav para cada constituyente de la mezcla según la Ec. 2.2.

5. Bibliografía • • •

Robert Bohinski, 1991. Bioquímica, 5ª Edición, Addison-Wesley, Iberoamericana. Donald Voet and Judith G. Voet, 1998. Biochemistry. John Wiley & Sons. A.L. Lehninger, D.L. Nelson and M.M. Cox, 1993. Principles of Biochemistry (Second Edn.) Worth Publishers.

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