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Norma Española

UNE-EN ISO 13843 Marzo 2018

Calidad del agua Requisitos para el establecimiento de las características de funcionamiento de los métodos microbiológicos cuantitativos (ISO 13843:2017) Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico CTN 77 Medio ambiente, cuya secretaría desempeña UNE.

Asociación Española de Normalización Génova, 6 - 28004 Madrid 915 294 900 [email protected] www.une.org

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UNE-EN ISO 13843 Calidad del agua Requisitos para el establecimiento de las características de funcionamiento de los métodos microbiológicos cuantitativos (ISO 13843:2017) Water quality. Requirements for establishing performance characteristics of quantitative microbiological methods (ISO 13843:2017). Qualité de l'eau. Exigences pour l'établissement des caractéristiques de performance des méthodes microbiologiques quantitatives (ISO 13843:2017).

Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 13843:2017, que a su vez adopta la Norma Internacional ISO 13843:2017.

Las observaciones a este documento han de dirigirse a:

Asociación Española de Normalización Génova, 6 28004 MADRID-España Tel.: 915 294 900 [email protected] www.une.org Depósito legal: M 7806:2018  UNE 2018 Publicado por AENOR INTERNACIONAL S.A.U. bajo licencia de la Asociación Española de Normalización. Reproducción prohibida

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EN ISO 13843

NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE EUROPÄISCHE NORM

Julio 2017

ICS 07.100.20

Sustituye a ENV ISO 13843:2001 Versión en español

Calidad del agua Requisitos para el establecimiento de las características de funcionamiento de los métodos microbiológicos cuantitativos (ISO 13843:2017) Water quality. Requirements for establishing performance characteristics of quantitative microbiological methods. (ISO 13843:2017)

Qualité de l'eau. Exigences pour l'établissement des caractéristiques de performance des méthodes microbiologiques quantitatives. (ISO 13843:2017)

Wasserbeschaffenheit. Anforderungen zur Bestimmung von Leistungsmerkmalen von quantitativen mikrobiologischen Verfahren. (ISO 13843:2017)

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2017-06-05. Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN/CENELEC, o a través de sus miembros. Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestión de CEN/CENELEC, tiene el mismo rango que aquéllas. Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Antigua República Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN European Committee for Standardization Comité Européen de Normalisation Europäisches Komitee für Normung CENTRO DE GESTIÓN: Rue de la Science, 23, B-1040 Brussels, Belgium  2017 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

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Índice Prólogo europeo .................................................................................................................................6 Declaración ...........................................................................................................................................6 Prólogo ...................................................................................................................................................7 0

Introducción ........................................................................................................................8

1

Objeto y campo de aplicación........................................................................................8

2

Normas para consulta ......................................................................................................9

3

Términos y definiciones..................................................................................................9

4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5

Conceptos básicos .......................................................................................................... 14 Generalidades .................................................................................................................. 14 Caracterización ............................................................................................................... 14 Verificación ....................................................................................................................... 16 Comparación de métodos ............................................................................................ 17 Muestras ............................................................................................................................ 17

5

Especificaciones: algunos valores guía ................................................................... 18

6

Diseños para la determinación de las características de funcionamiento de un método................................................................................... 19 Consideraciones generales ......................................................................................... 19 Determinación de la sensibilidad, especificidad, eficiencia, selectividad y tasas de falsos positivos y de falsos negativos......................... 19 Tipo de muestras a utilizar ......................................................................................... 19 Número de muestras ..................................................................................................... 19 Procedimiento ................................................................................................................. 20 Características de funcionamiento de categoría ................................................. 20 Ejemplo práctico ............................................................................................................. 22 Determinación del límite superior y consideración del límite inferior de detección ..................................................................................................... 23 Rango de trabajo ............................................................................................................. 23 Límite superior en relación con la linealidad ...................................................... 23 Tipo y número de muestras a utilizar ..................................................................... 24 Ejemplo práctico ............................................................................................................. 25 Límite inferior de detección ....................................................................................... 26 Estimación de la precisión: determinación de la repetibilidad y de la reproducibilidad............................................................................................................. 26 Generalidades .................................................................................................................. 26 Repetibilidad.................................................................................................................... 27 Reproducibilidad intralaboratorio .......................................................................... 29 Robustez ............................................................................................................................ 31 Generalidades .................................................................................................................. 31 Diseños experimentales para efectos debidos al tiempo y a la temperatura ..................................................................................................................... 31 Tasa de recuperación relativa ................................................................................... 32

6.1 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 6.3.5 6.4 6.4.1 6.4.2 6.4.3 6.5 6.5.1 6.5.2 6.6

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6.6.1 6.6.2 6.7 6.7.1 6.7.2 6.7.3 6.7.4 6.7.5 7 7.1 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.3 7.4 7.5

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Generalidades .................................................................................................................. 32 Determinación de la tasa de recuperación relativa ........................................... 33 Incertidumbre del recuento ....................................................................................... 33 Generalidades .................................................................................................................. 33 Diseño experimental para la evaluación de la incertidumbre del recuento de colonias ..................................................................................................... 34 Ejemplo de incertidumbre individual (o personal) del recuento de las colonias........................................................................................................................ 34 Ejemplo de incertidumbre intralaboratorio del recuento de las colonias .............................................................................................................................. 35 Ejemplo de incertidumbre intralaboratorio de lectura de NMP ................... 35 Diseños para la verificación de un método por un solo laboratorio ........... 36 Consideraciones generales ......................................................................................... 36 Cálculo de la sensibilidad, especificidad, eficiencia, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos ....................................................... 37 Tipo de muestra a utilizar ........................................................................................... 37 Número de muestras ..................................................................................................... 37 Procedimiento para la confirmación ...................................................................... 37 Características de funcionamiento de categoría ................................................. 37 Determinación de la repetibilidad ........................................................................... 39 Incertidumbre del recuento ....................................................................................... 39 Procedimiento para la verificación por un único laboratorio ....................... 39

Anexo A (Informativo)

Modelos matemáticos de variación........................................ 43

Anexo B (Normativo)

Evaluación de los límites inferiores ....................................... 53

Anexo C (Normativo)

Evaluación del límite superior................................................. 57

Anexo D (normativo)

Determinación de la variabilidad operacional en las condiciones de repetibilidad y de reproducibilidad intralaboratorio ............................................................................ 58

Anexo E (Normativo)

Incertidumbre de recuento ....................................................... 62

Anexo F (Normativo)

Determinación de la variabilidad operacional (reproducibilidad interlaboratorios) en un estudio colaborativo de funcionamiento ............................................. 64

Anexo G (Informativo)

Glosario de los principales símbolos ..................................... 73

Bibliografía ........................................................................................................................................ 75

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Prólogo europeo El texto de la Norma EN ISO 13843:2017 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 147 Calidad del agua en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 230 Análisis del agua, cuya Secretaría desempeña DIN. Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de enero de 2018, y todas las normas nacionales técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de enero de 2018. Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén sujetos a derechos de patente. CEN no es responsable de la identificación de dichos derechos de patente. Esta norma anula y sustituye a la Norma ENV ISO 13843:2001. De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Antigua República Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

Declaración El texto de la Norma ISO 13843:2017 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 13843:2017 sin ninguna modificación.

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Prólogo ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas internacionales normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho de estar representado en dicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y privadas, en coordinación con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todas las materias de normalización electrotécnica. En la parte 1 de las Directivas ISO/IEC se describen los procedimientos utilizados para desarrollar esta norma y para su mantenimiento posterior. En particular debería tomarse nota de los diferentes criterios de aprobación necesarios para los distintos tipos de documentos ISO. Esta norma se redactó de acuerdo a las reglas editoriales de la parte 2 de las Directivas ISO/IEC. www.iso.org/directives. Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de cualquiera o todos los derechos de patente. Los detalles sobre cualquier derecho de patente identificado durante el desarrollo de esta norma se indican en la introducción y/o en la lista ISO de declaraciones de patente recibidas. www.iso.org/patents. Cualquier nombre comercial utilizado en esta norma es información que se proporciona para comodidad del usuario y no constituye una recomendación. Para obtener una explicación sobre el significado de los términos específicos de ISO y expresiones relacionadas con la evaluación de la conformidad, así como información de la adhesión de ISO a los principios de la Organización Mundial del Comercio (OMC) respecto a los Obstáculos Técnicos al Comercio (OTC), véase la siguiente dirección: www.iso.org/iso/foreword.html. El comité responsable de esta norma es el ISO/TC 147, Calidad del agua, Subcomité SC 4, Métodos microbiológicos. Esta primera edición de la Norma ISO 13843 anula y sustituye al Informe Técnico ISO/TR 13843:2000, que ha sido revisada técnicamente.

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0 Introducción Se consideran microbiológicos los métodos en los cuales la estimación cuantitativa se sustenta en el recuento de partículas microbiológicas, bien sea directamente con ayuda de un microscopio o indirectamente sobre la base del crecimiento (multiplicación) de colonias, turbidez, cambio de color o fluorescencia. Los fundamentos y procedimientos dentro del campo de aplicación de este documento se conocen comúnmente como recuento microscópico, número más probable (NMP) y recuento de colonias. La mayoría de los procedimientos para la determinación de las características de funcionamiento descritas en este documento son aplicables a los tres tipos de métodos. No obstante, allí donde no son aplicables los procedimientos, se sugieren métodos alternativos dentro del cuerpo del propio documento o en los anexos D y E (sobre repetibilidad, reproducibilidad e incertidumbre del recuento). En la mayoría de los casos, los recuentos de placas de bacteriófagos son similares a los de recuento de colonias bacterianas. Algunos de los métodos microbiológicos "más novedosos" tales como los que utilizan la hibridación in situ fluorescente (FISH) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden también estar cubiertos por este documento. Sin embargo, pueden requerir consideraciones especiales, dependiendo de cómo se empleen. En estas situaciones, las cuestiones importantes comprenden el mecanismo de determinación del número de microorganismos presentes (por ejemplo, la curva de calibrado para la PCR o el recuento microscópico para el método FISH) y la viabilidad de los organismos detectados. Si se utilizan técnicas de este tipo para confirmación, como parte de un método, son entonces pertinentes todos los capítulos de este documento. Aunque no es esencial, durante la caracterización de métodos microbiológicos puede resultar beneficioso generar datos empleando organismos estresados. Pueden emplearse varios métodos para estresar organismos, pero los dos más útiles para el agua son los que utilizan los desinfectantes para estresar los organismos (habitualmente estrés por cloro) y la disminución de los nutrientes causada por organismos en un ambiente en el que hay escasez de nutrientes (es decir, agua potable y otras aguas oligotróficas) durante un periodo previo al ensayo. El efecto sobre algunas de las características de funcionamiento de los organismos "estresados" es casi totalmente dependiente del tipo y del nivel de estrés aplicado y es inapropiado incluir tal grado de detalle en este documento. No obstante se encuentran en la literatura descripciones que pueden seguir los laboratorios en caso de que debieran determinar las características de funcionamiento de un método con células estresadas.

1 Objeto y campo de aplicación Este documento trata sobre la caracterización de los métodos microbiológicos. En lo que respecta a este documento caracterización significa el estudio de parámetros que pueden medirse para describir el modo en el que los métodos son susceptibles de aplicación en un conjunto de condiciones dado, que pueden ser descritas como características de funcionamiento. El documento describe procedimientos para la determinación de características de funcionamiento que pueden utilizarse en la validación o en la posterior verificación de los métodos. Este documento pone el énfasis sobre los métodos cuantitativos selectivos y es aplicable a todos los tipos de agua. Para los métodos que no están basados en el recuento microscópico directo, en el recuento de colonias o en número más probable, la aplicabilidad de los procedimientos descritos en este documento debería verificarse en profundidad.

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2 Normas para consulta En el texto se hace referencia a los siguientes documentos de manera que parte o la totalidad de su contenido constituyen requisitos de este documento. Para las referencias con fecha, solo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición (incluida cualquier modificación de esta). ISO 17994:2014, Calidad del agua. Requisitos para la comparación de la tasa de recuperación relativa de microorganismos por dos métodos cuantitativos.

3 Términos y definiciones Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes. ISO e IEC mantienen bases de datos terminológicas para su utilización en normalización en las siguientes direcciones: – Plataforma de búsqueda en línea de ISO: disponible en http://www.iso.org/obp – Electropedia de IEC: disponible en http://www.electropedia.org/ 3.1 exactitud; exactitud de la medida: Grado de acuerdo entre un valor medido y un valor asignado de un mesurando. NOTA 1 El concepto “exactitud de la medida” no es una cantidad y no se expresa numéricamente. Una medida se dice que es más exacta cuando proporciona un error de medida más pequeño. NOTA 2 En algunas ocasiones "exactitud de medida" se entiende como el grado de acuerdo entre los valores medidos y los atribuidos al mesurando.

[FUENTE: Guía ISO/IEC 99/2007, 2.13[16], modificado – sustitución de "…un valor verdadero" por "…un valor asignado"; añadidas las notas 1 y 2 al término] 3.2 analito: Componente representado en el nombre de una cantidad medible. NOTA En microbiología del agua, el analito se define idealmente como una lista de especies definidas taxonómicamente. En la mayoría de los casos prácticos, el analito solo puede definirse en la práctica por designaciones de grupo menos precisas que las definiciones taxonómicas.

[FUENTE: ISO 17511:2003, 3.2[14]] 3.3 porción analítica; porción de ensayo: Volumen de suspensión de partículas (muestra) inoculado en una unidad de detección (placa de agar, filtro de membrana, tubo de ensayo, porta cuadriculado para microscopía). 3.4 sesgo; sesgo de la medida: Estimación de un error sistemático o de la diferencia sistemática entre el valor cuantitativo asignado y la media de los resultados de replicados de una medida.

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3.5 características de categoría: Característica de funcionamiento de un método, expresada numéricamente en forma de frecuencia relativa basada en una clasificación P/A o +/-. 3.6 unidad formadora de colonias, UFC; Unidad formadora de partículas, UFP; partícula formadora de colonias: Organismo (o grupo de organismos que pueden formar una colonia en determinadas condiciones especificadas. NOTA Originalmente estos términos se introdujeron para transmitir la idea de que una colonia puede provenir no solamente de una única célula, sino también de una cadena sólida o de un agregado de células, de un grupo de esporas, de un trozo de micelio, etc. Erróneamente, el número de colonias observado se iguala con el número de entidades vivientes sembradas en el medio. Los términos unidad de crecimiento, partículas viables, propágulo y germen tienen un significado similar, pero transmiten mejor la idea original y son aplicables no solamente a los métodos de recuento de colonias sino también a los de número más probable (NMP).

3.7 funcionamiento colaborativo de un método: Estudio de las características de funcionamiento del método o del laboratorio, para el cual varios laboratorios se agrupan para realizar un experimento planificado y coordinado por un laboratorio central. NOTA 1 Existen principalmente dos tipos de estudios colaborativos. Los ejercicios de intercalibración que se realizan para permitir a los laboratorios la comparación de sus resultados analíticos con los de los otros laboratorios participantes. NOTA 2 Los ensayos de funcionamiento de un método permiten estimar la precisión (repetibilidad, reproducibilidad) partir de los datos recogidos cuando varios laboratorios participantes estudian muestras idénticas con un método estrictamente normalizado.

3.8 recuento de colonias confirmado; recuento de colonias verificado: Recuento presuntivo de colonias, corregido con los falsos positivos. NOTA Matemáticamente:

pc =

k c n

donde c

es el recuento presuntivo;

p

es la tasa de verdaderos positivos;

n

es el número de presuntos positivos aislados para confirmación;

k

es el número confirmado.

3.9 recuento corroborado: Recuento obtenido cuando se utiliza un procedimiento secundario de confirmación.

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3.10 nivel de detección: Concentración mínima de organismos que producen evidencia de crecimiento con una probabilidad de P = 0,95, cuando se inoculan en un medio de cultivo específico y se incuban en condiciones definidas. NOTA El nivel teórico conforme a esta definición es una media de tres células viables en un volumen de inóculo.

3.11 serie de detección: Combinación de placas o de tubos sobre los que está basada la estimación cuantitativa de la concentración microbiológica de la muestra. NOTA La serie de detección es el conjunto de placas o tubos utilizados para la estimación numérica de un único valor.

EJEMPLO

Placas paralelas de una suspensión, placas de diluciones consecutivas, sistema por NMP de 3  5 tubos, microplaca.

3.12 detector; detector de partículas: Placa de matriz sólida o tubo de líquido que contiene un medio nutritivo para el recuento o detección de partículas biológicamente activas. 3.13 eficiencia, E: Fracción de colonias que están correctamente asignadas como positivas y negativas. NOTA Matemáticamente: E=

a+d n

donde a

es el número de colonias típicas confirmadas como pertenecientes al organismo objetivo (verdaderos positivos);

d

es el número de colonias atípicas confirmadas como no pertenecientes al organismo objetivo (verdaderos negativos);

n

es el número total de colonias ensayadas para su confirmación.

3.14 falso negativo: Resultado indicado por el método de ensayo como negativo y al respecto del cual se demuestra posteriormente que sí contiene el organismo objetivo. 3.15 falso positivo: Resultado indicado por el método de ensayo como positivo y al respecto del cual se demuestra posteriormente que no contiene el organismo objetivo. 3.16 germen: Entidad capaz de actividad biológica (por ejemplo, respiración o reproducción en un medio nutritivo). 3.17 límite de determinación: Concentración mínima media analito, por porción analítica, para la cual la incertidumbre de la desviación típica esperada iguala a un valor especificado. 3.18 recuento definido por el método: Recuento obtenido utilizando únicamente los procedimientos del método descrito.

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3.19 distribución binomial negativa: Una distribución estadística de los recuentos con particular “sobredispersión”. 2

2 2

NOTA 1 Su varianza puede expresarse como s = x + u0 x ( x = media) . NOTA 2 En este documento el cuadrado de la desviación estándar operativa relativa (u0) se sustituye por el inverso del exponente (1/k) de la fórmula estándar de la distribución binomial negativa.

3.20 valor aberrante: Elemento de un conjunto de valores que es inconsistente con el resto de los elementos de dicho conjunto. NOTA Un valor extremo que normalmente aparece al azar en menos del 1% de los ensayos replicados, pero con mayor frecuencia cuando se producen situaciones anómalas. Pueden utilizarse ensayos estadísticos para cuantificar esta probabilidad.

3.21 sobredispersión: Variación excesiva con respecto a la aleatoriedad de Poisson. NOTA Se detecta cualitativamente por el índice de dispersión de Poisson y se mide cuantitativamente mediante la estimación del parámetro u (factor de sobredispersión), de la distribución binomial negativa.

3.22 recuentos paralelos: Número de partículas o de colonias en porciones analíticas iguales procedentes de la misma suspensión. 3.23 distribución de Poisson: Distribución totalmente aleatoria de los números de partículas, cuando se muestrea una suspensión perfectamente homogenizada. NOTA La probabilidad, P(k), de observar en una porción de ensayo, cuya media es igual a , exactamente k unidades, se calcula a partir de la siguiente ecuación:

P( k ) 

u

k

k!

e

-μ

3.24 precisión; precisión de la medida: Grado de acuerdo entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos en medidas repetidas del mismo objeto o de objetos similares en condiciones especificadas. NOTA 1 generalmente la precisión se expresa numéricamente por características como la desviación estándar, la varianza o el coeficiente de variación en las condiciones especificadas. NOTA 2 Las condiciones especificadas pueden ser, por ejemplo, condiciones de repetibilidad, condiciones de precisión intermedia o condiciones de reproducibilidad (véase la Norma ISO 5725-3[4]). NOTA 3 La precisión sirve para definir la repetibilidad de la medida, la precisión intermedia de la medida y la reproducibilidad de la medida.

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3.25 proporcionalidad: Correspondencia de los recuentos de partículas efectuados con el volumen (o la dilución) de una serie de porciones analíticas, a partir de una suspensión de raíz común. NOTA La proporcionalidad se calcula para una evaluación estadística como el coeficiente de ajuste logarítmico estadístico, G2, con n-1 grados de libertad.

3.26 tasa de recuperación: Término general utilizado para el número de partículas estimado en una porción de ensayo o una muestra, asumiendo que hay un número real de partículas (aunque sea desconocido) del cual la metodología empleada “recupera” un 100% o menos. NOTA Otro término similar de uso común es productividad (véase la Norma ISO 11133 [12]).

3.27 tasa de recuperación relativa: Relación de los recuentos de colonias obtenidos por dos métodos sometidos a evaluación sobre porciones iguales de ensayo de la misma suspensión. 3.28 desviación estándar operativa relativa, u0: Variabilidad operativa, expresada como una incertidumbre estándar relativa, asociada a las etapas técnicas del procedimiento operativo de análisis. NOTA La desviación estándar operativa relativa se expresa frecuentemente en forma de porcentaje.

3.29 varianza operativa relativa, u02 : Constante de sobredispersión, el cuadrado de la desviación estándar operativa relativa. 3.30 desviación estándar relativa, urel: Estimación de la desviación estándar de una población para una muestra de n resultados dividida por la media de dicha muestra. 2 3.31 varianza relativa, u rel : Cuadrado de la desviación estándar relativa.

3.32 repetibilidad; repetibilidad de la medida: Precisión de la medida según un conjunto de condiciones de repetibilidad. 3.33 condiciones de repetibilidad: Condición de medida dentro de un conjunto de ellas que comprenden el mismo procedimiento de medida, los mismos operadores, el mismo sistema de medida, las mismas condiciones de funcionamiento y el mismo lugar, así como medidas replicadas sobre el mismo objeto u objetos similares durante un periodo de tiempo reducido. 3.34 reproducibilidad; reproducibilidad de la medida: Precisión de la medida según un conjunto de condiciones de reproducibilidad. NOTA Los términos estadísticos relevantes se dan en las Normas ISO 5725-1[2] e ISO 5725-2[3].

3.35 condiciones de reproducibilidad: Condición de medida dentro de un conjunto de ellas que comprenden lugares, operadores y sistema de medida diferentes, así como medidas replicadas sobre el mismo objeto u objetos similares.

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3.36 robustez: Insensibilidad de un método analítico a pequeños cambios en el procedimiento. NOTA Para examinar la robustez es aconsejable “forzar” las condiciones del método de un modo controlado.

3.37 sensibilidad: Fracción del número total de cultivos o de colonias positivas correctamente asignadas en el análisis presuntivo. 3.38 especificidad: Fracción del número total de cultivos o de colonias negativas correctamente asignadas en el análisis presuntivo. 3.39 incertidumbre estándar: Incertidumbre del resultado de una medida expresado en forma de desviación estándar. 3.40 incertidumbre del recuento: Desviación estándar relativa de los resultados de repetidos recuentos de las colonias o partículas de la(s) misma placa(s) o del(de los) mismo(s) campo(s) en las condiciones estipuladas (la misma persona o personas diferentes en un laboratorio). 3.41 verificación: Realización de una segunda caracterización por un laboratorio diferente para confirmar los resultados de la caracterización inicial.

4 Conceptos básicos 4.1

Generalidades

En lo que concierne a los cálculos estadísticos de las partículas, los recuentos microscópicos obedecen a las mismas leyes que los recuentos viables pero, con excepción de los métodos de microcolonias, no presentan los problemas biológicos asociados con el crecimiento. Los colorantes de diferenciación, en particular los complejos de marcaje concebidos para este fin u otros agentes utilizados para identificar el organismo buscado no cambian los principios de base. Pueden aplicarse los mismos principios de validación que para los métodos selectivos de recuento de colonias. Para mejor comprensión de la teoría y aplicación de las fórmulas utilizadas en este documento, en el anexo A se describe la base matemática de la variación obtenida en todos estos tipos de métodos.

4.2

Caracterización

La caracterización de un método microbiológico se basa en gran parte en el examen y expresión de las características de funcionamiento de dicho método. La caracterización es un proceso consistente en proporcionar información sobre las características de funcionamiento probables de dicho procedimiento en un conjunto específico de circunstancias. No es el propósito de este documento proporcionar valores guía para cada una de las características de funcionamiento especificadas; su objeto es dar líneas directrices sobre los parámetros que deberían determinarse y sobre la mejor manera de proceder para su deducción con fines comparativos. Métodos con unas características de funcionamiento "pobres" también pueden ser útiles de todos modos.

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La caracterización es un proceso exploratorio cuyo objetivo es determinar el conjunto de características de funcionamiento probables de un método nuevo, modificado o insuficientemente caracterizado de otra manera. Debería resultar en especificaciones numéricas y descriptivas de las características de funcionamiento e incluir una descripción detallada e inequívoca del objetivo de interés (tal como una colonia positiva, tubo o placa). Sin embargo, los valores generados no deberían usarse como límites, ya que pueden variar dependiendo del laboratorio, de la matriz o incluso de muestras específicas. La caracterización se realiza en primera instancia por un único laboratorio para determinar las características de funcionamiento probables de un método de ensayo en un laboratorio específico. Puede realizarse un estudio colaborativo del funcionamiento del método como paso adicional para evaluar las características de funcionamiento interlaboratorios. NOTA Un laboratorio que esté desarrollando un método propio o una variante de una norma existente podría seguir las etapas de caracterización.

Es imperativo que los técnicos involucrados en la caracterización de un método tengan considerable experiencia con otros métodos microbiológicos. Las características de funcionamiento tratadas en este documento se listan en la tabla 1. Tabla 1 – Características de funcionamiento descritas en el documento Parámetro

Definición

Sensibilidada, b, c

fracción de positivos totalese correctamente asignados en el recuento presuntivo

Especificidada, b, c

fracción de negativos totalesf correctamente asignados en el recuento presuntivo

Tasa de falsos positivosa, b

fracción de resultados positivos (por ejemplo, colonias típicas) que posteriormente se ha comprobado que corresponden a organismos distintos del objetivo

Tasa de falsos negativosa, b

fracción de resultados negativos (por ejemplo, colonias atípicas) que se ha comprobado que corresponden a los organismos objetivo

Selectividada, b, c

relación entre el número de colonias objetivo y el número total de colonias en el volumen de muestra

Eficienciaa,b

fracción de las colonias totales que ha sido correctamente asignada en el recuento presuntivo

Límite superiora

extremo superior del rango de trabajo para el cual es útil el método (es decir, el número máximo de colonias que pueden contarse en cada placa u otros sistemas de detección)

Repetibilidada, b, c

precisión en condiciones de repetibilidad (los mismos operadores, las mismas condiciones operativas, periodo de tiempo corto,...)

Reproducibilidada

precisión en condiciones de reproducibilidad intralaboratoriod

Robusteza

medida de la capacidad e un ensayo para mantenerse inafectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en las condiciones de ensayo (por ejemplo, la temperatura)

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Parámetro

Definición

Tasa de recuperación relativaa

eficiencia con la que un método recupera organismos objetivo de una muestra cuando se compara con otro procedimiento (Esta comparación debe realizarse cuando exista un método alternativo para el mismo organismo. Resulta preferible la comparación con un método ISO de referencia.)

Incertidumbre del recuentoa, b

Desviación estándar relativa de recuentos repetidos del organismo objetivo, obtenida a través de recuentos repetitivos (placas, campos, tubos, etc.) en condiciones estipuladas (misma persona, diferente persona, mismo laboratorio, etc.)

a

Requerido para la determinación de las características de funcionamiento.

b

Requerido para la verificación por un único laboratorio.

c

Especificaciones y líneas directrices dadas.

d

En el Anexo F se describen los métodos relativos a la reproducibilidad y a la precisión interlaboratorios. El empleo de estos métodos debería considerarse cuando son primordiales las características de funcionamiento interlaboratorios, por ejemplo, en el desarrollo de métodos con fines de determinación del cumplimiento de la normativa.

e

Positivos pueden ser recuento de colonias, recipientes con reacción positiva (NMP) o recuentos celulares.

f

Negativos pueden ser colonias atípicas, recipientes con reacción negativa (NMP) o células sin las características específicas requeridas.

Mientras que la reproducibilidad y la precisión interlaboratorios no forman parte de las características de funcionamiento descritas en el cuerpo de este documento, en determinadas situaciones el conocimiento de estos parámetros es muy deseable. Entre dichas situaciones se encuentra el caso de los métodos que se usan para comprobar el cumplimiento normativo o aquellos en los que se está comparando los datos obtenidos en un conjunto de laboratorios para diferentes propósitos. Por esta razón, en el anexo F se describen los métodos recomendados para determinar la reproducibilidad interlaboratorios.

4.3

Verificación

La verificación tiene lugar cuando un laboratorio procede a implementar un método que ha sido desarrollado externamente. La verificación se centra en proporcionar evidencia de que el laboratorio es capaz de producir datos de funcionamiento similares a los establecidos en la caracterización primaria. No resulta útil establecer los límites relativos a los distintos componentes de la caracterización de un método, ya que dichos componentes pueden variar en función de numerosos aspectos del método, el tipo de muestra y el laboratorio que realiza el trabajo. Los datos de verificación deberían utilizarse para establecer el tipo y calidad probable de los datos a generar por el laboratorio con un determinado procedimiento y cualquier tipo de muestra dada. Como regla general, la verificación utiliza formas seleccionadas y simplificadas de los mismos modos operatorios que los utilizados para la caracterización del método pero, a veces, distribuidos en un periodo prolongado. Las muestras naturales constituyen los materiales de ensayo por excelencia y el trabajo solo precisa dirigirse a los aspectos de funcionamiento del método que presenten interés para el laboratorio. Los requisitos relativos a la verificación para un único laboratorio se especifican en el capítulo 7.

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4.4

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Comparación de métodos

El funcionamiento del método comprende muchos aspectos. No existe ni ensayo único para la comparación de los métodos ni criterio numérico correspondiente. Un método puede revelarse superior en cuanto a su especificidad pero inferior en cuanto a su tasa de recuperación. Todo el conjunto de la información relativa a robustez, precisión y especificidad recogida durante los ensayos de caracterización puede utilizarse para la comparación de los métodos. Es preciso evaluar los métodos en paralelo únicamente para las comparaciones de la tasa de recuperación. Es necesario aplicar dos métodos en paralelo sobre las mismas muestras cuando se está desarrollando un método interno y también cuando se recopila información justificativa del empleo de un método alternativo. Los estudios de tasa de recuperación relativa de un método alternativo frente a otro de referencia, organizados conforme a la Norma ISO 17994, implican preferentemente una amplia gama de muestras así como la participación de un número importante de laboratorios que permitan la extensión del rango de muestras sobre amplias zonas geográficas. No obstante, a veces puede resultar necesario verificar el resultado de un estudio de tasa de recuperación de un método alternativo en condiciones ecológicas o en zonas geográficas que no estén representadas en el ensayo interlaboratorios anterior. Cuando un laboratorio solamente precisa confirmar el resultado de comparación de un método ya evaluado y oficialmente aceptado, puede sacar pleno provecho de los resultados del ensayo previo. El laboratorio debería tener acceso al informe del estudio colaborativo de comparación. En consecuencia, debería tener a su disposición las estimaciones de la media y de la desviación estándar de la diferencia relativa. La fórmula (3) dada en la Norma ISO 17994:2014, 5.4.3 puede aplicarse para estimar el número de muestras recomendado. No obstante, sea cual sea el resultado del cálculo, el número de muestras no debería ser inferior a treinta. El método que proporcione la tasa de recuperación de organismos objetivo confirmados más elevada es evidentemente el mejor cuando se precisa confirmación para su utilización en rutina. Puede ser preferible un método que proporcione una tasa de recuperación algo inferior pero que no requiera confirmación. Si no pueden corregirse durante la caracterización las elevadas tasas de falsos positivos o de falsos negativos observadas por definiciones más detalladas de las colonias objetivo o por otros procedimientos, el método puede ser considerado inválido. La comparación de dos métodos microbiológicos debería incluir una comparativa de sus características de funcionamiento (es decir, caracterización) junto con una comparación en paralelo de la tasa de recuperación utilizando muestras contaminadas de forma natural o enriquecidas, tal y como se especifica en la Norma ISO 17994.

4.5

Muestras

Es una cuestión generalmente admitida que la caracterización y la comparación de métodos se efectúen con muestras naturales con concentraciones naturales de microbios. Aunque conceptualmente este es el criterio, en ciertas circunstancias hay algunas excepciones. Las muestras artificiales (materiales de referencia y muestras enriquecidas) se emplean en sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos para garantizar la competencia básica de los laboratorios participantes en los ejercicios de caracterización de métodos. El enriquecimiento de las muestras puede resultar útil, e incluso necesario, en la verificación o siempre que resulta difícil encontrar muestras que contengan los organismos objetivo. El rango óptimo de concentraciones para la caracterización de métodos microbiológicos es más estrecho que el rango de trabajo proyectado. Resultan innecesarias las concentraciones elevadas. Tales muestras son comparables a cultivos puros y no permiten verificar las características de funcionamiento del método o del laboratorio sometido a ensayo.

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Es necesario estudiar muestras con contenidos bacterianos muy débiles por razones de salud pública pero, por razones estadísticas, estas muestras no se adaptan perfectamente a la comparación de métodos ni a los otros ejercicios de caracterización. De todos modos, su utilización es inevitable en numerosas situaciones. En particular, cuando un método pretende identificar dos organismos objetivo en la misma placa (por ejemplo, coliformes totales y E. coli); generalmente es inevitable tener números de organismos bajos. El número y la variedad de las muestras examinadas deben ser los apropiados. Sin ayuda de la estadística no existe ningún medio objetivo para la toma de decisiones. En ciertos casos, la primera muestra estudiada puede indicar que el método no es lo suficientemente bueno. Sin embargo lo normal que se precisen más muestras. La selección de un número de muestras demasiado bajo puede dar lugar a la carencia de resultados representativos. En el apartado 6.1 se dan líneas directrices específicas sobre el número y tipo de muestras (junto con su contenido microbiológicos.

5 Especificaciones: algunos valores guía Históricamente, las normas no han servido de mucha ayuda para los laboratorios que buscaban asegurarse de una correcta aplicación de los métodos y que con ellos obtenían resultados válidos. Lo que parece que falta es un documento conciso que presente qué es lo que deberían hacer los laboratorios para asegurarse de que el método funciona igual en su caso y como distinguir que datos de características de funcionamiento son buenos o malos. Debe incluirse un capítulo relativo a las características de funcionamiento en todas las normas ISO que versen sobre métodos microbiológicos de análisis del agua y hacer referencia a microbios o grupos de microbios definidos. El formato de los métodos de recuento de colonias podría incluir los elementos siguientes: a)

Sensibilidad: generalmente superior al 90%;

b) Especificidad: generalmente superior al 80%; c)

Selectividad: en general, los resultados no son válidos si la selectividad es inferior al 10%;

d) Incertidumbre de recuento: la incertidumbre de recuento individual (una persona) normalmente se mantiene inferior a urel = ± 0,03. La incertidumbre de recuento intralaboratorio normalmente es inferior a urel = ± 0,05. Una incertidumbre de recuento intralaboratorio superior a 0,1 es indicativa de que existen problemas o dificultades; e)

Repetibilidad (utilización de placas paralelas): la variación se sitúa en los límites de la distribución de Poisson. En caso contrario, debería indicarse la amplitud de la sobredispersión;

f)

Límite superior: para los métodos de filtración en membrana, un rango que se ha citado es de 0 UFC a 80 UFC, mientras que para los métodos de recuento en placas Petri de 90 mm, el rango puede ser de 0 UFC a 300 UFC. El área superficial de un filtro de membrana de 47 mm es aproximadamente el 25% del de una placa Petri de 90 mm. Estos límites superiores dependen del crecimiento bacteriano de fondo (no objetivo) del número de tipos diferentes de organismos objetivo (por ejemplo coliformes totales y E. coli) y del tamaño de las colonias.

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6 Diseños para la determinación de las características de funcionamiento de un método 6.1

Consideraciones generales

Mientras que generalmente es mejor utilizar muestras contaminadas con los organismos objetivo de modo natural, en algunas situaciones esto no facilita la determinación de la característica de funcionamiento de interés. En tales casos, puede resultar apropiado el uso de materiales de referencia. Alternativamente, las muestras pueden ser "enriquecidas" con números conocidos de organismos objetivo obtenidos a partir de fuentes comerciales. Cualquiera que sea el procedimiento de preparación de las muestras utilizado, debería prestarse atención a realizar un mezclado adecuado para facilitar la distribución al azar de los organismos. El número deseado de organismos objetivo en la muestra depende del método de interés pero, generalmente, un rango entre 10 y 60 unidades formadoras de colonias por porción de ensayo puede resultar práctico. El número es un compromiso entre uno deseablemente mayor y el número de colonias que resulta práctico para una membrana o una placa.

6.2 Determinación de la sensibilidad, especificidad, eficiencia, selectividad y tasas de falsos positivos y de falsos negativos 6.2.1

Tipo de muestras a utilizar

Se preparan muestras apropiadas que contengan de 20 a 80 unidades formadoras de colonias (de 10 a 60 UFC de organismos objetivo) por porción de ensayo. A continuación se examinan las muestras por el procedimiento objeto de estudio. Se recuentan las colonias típicas y atípicas (es decir, las que tienen el aspecto típico del organismo objetivo y las que no tienen dicho aspecto típico del organismo objetivo). Se identifican todas las colonias, tanto típicas como atípicas, utilizando para ello un procedimiento adecuado que puede incluir kits comerciales de identificación microbiana, técnicas de secuenciación de ADN u otros métodos apropiados. El método de preparación de las muestras variará en función del método y de los tipos de muestras típicamente analizadas. Si existe disponibilidad de muestras con contaminación natural con un nivel apropiado de organismos objetivo, éstas deberían utilizarse. No obstante, en muchos casos no hay disponibles muestras naturalmente contaminadas (por ejemplo, para los métodos diseñados para agua potable). En tales casos puede utilizarse para la preparación de muestras material contaminado en laboratorio por adición de microorganismos (utilizando cepas apropiadas de los organismos objetivo como en el agua de río o en agua residual). Este método presenta la ventaja de incluir organismos no objetivos susceptibles de encontrarse en el agua potable contaminada en una relación similar a la que puede observarse en condiciones reales. Debería evitarse el uso de materiales de referencia porque la selección de las cepas utilizadas tiene una influencia directa sobre el resultado del experimento. 6.2.2

Número de muestras

Debería utilizarse un número de veinte muestras como mínimo procedentes de distintos orígenes. Si se emplea agua superficial o agua residual para preparar el material enriquecido por adición, deberían proceder de tres orígenes, como mínimo. En la realización de este trabajo es importante examinar un número adecuado de colonias "atípicas", aunque cuando el método es muy selectivo, éstas pueden ser difíciles de encontrar.

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6.2.3

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Procedimiento

Las muestras se incuban y todas las colonias "confirmadas" conforme a los procedimientos apropiados para el método (por ejemplo, para la Norma ISO 9308-1[10] todos los coliformes presuntivos tienen que ensayarse al respecto de la producción de citocromo oxidasa). Cuando los métodos no tengan procedimientos de confirmación (por ejemplo, la Norma ISO 9308-2[11]) descrito, los resultados se registran tal y como se describe en el método y sin confirmación. Las colonias (o unidades de reacción: pocillo, tubos, etc.) se registran como positivas o negativas. Cuando se determinan los parámetros sensibilidad, especificidad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos, es necesario aplicar un test adicional para confirmar o rechazar los resultados generados en el método de ensayo. Este ensayo confirmativo adicional se denomina confirmación secundaria. Estos métodos pueden incluir kits comerciales de identificación, otros métodos fenotípicos (por ejemplo, ensayos para un cierto rasgo o sistema enzimático), test de composición química (por ejemplo, MALDI-TOF) o métodos moleculares. La selección del método tendrá influencia sobre el resultado de los datos y debería prestarse particular atención a la selección de estos procedimientos ya que definen el objetivo. Siempre que sea posible, el procedimiento utilizado para dar soporte al ensayo confirmatorio original debería estar basado en un procedimiento válido o en ensayos que reflejen la definición de los microorganismos objetivo, como se describa en la norma pertinente. Por ejemplo, en la caracterización de un ensayo para Escherichia coli, los aislados pueden ser sometidos a una secuenciación de ARN ribosómico 16S para determinar si se trata verdaderamente de E. coli. Alternativamente, los aislados podrían examinarse con la tinción de Gram y analizados al respecto de la expresión de la citocromo-oxidasa funcional, de la β-D-galactosidasa y de la β-D-glucoronidasa. Los organismos que son bacilos Gram negativos, negativos a la citocromo-oxidasa y positivos de la β-D-galactosidasa y a la β-D-glucoronidasa, serán considerados como E.coli. 6.2.4

Características de funcionamiento de categoría

6.2.4.1 Cuando el método incluye una etapa de confirmación, los datos de identificación pueden dividirse en cuatro categorías: a)

número de colonias típicas confirmadas como el organismo de ensayo en el ensayo confirmativo primario, cuya identidad viene soportada por el test de identificación secundaria (verdaderos positivos);

b) número de colonias atípicas, o de colonias típicas que son negativas en el primer ensayo confirmatorio identificadas como del organismo objetivo en el test de identificación secundario (falsos negativos); c)

número de colonias típicas confirmadas como del organismo objetivo en el ensayo confirmativo primario y que posteriormente se determina que no pertenecen al organismo objetivo por el test de identificación secundario (falsos positivos);

d) número de colonias atípicas o de colonias típicas que son negativas en el ensayo primario de confirmación que posteriormente a través del test de identificación secundaria se demuestra que no son del organismo objetivo (verdaderos negativos); 6.2.4.2 Para métodos sin procedimiento de confirmación, los datos de identificación pueden dividirse en cuatro categorías: a)

número de colonias típicas identificadas como del organismo objetivo a través de un test de identificación externo (verdaderos positivos);

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b) número de colonias atípicas identificadas como del organismo objetivo a través de un test de identificación externo (falsos negativos); c)

número de colonias típicas identificadas como no pertenecientes al organismo objetivo a través de un ensayo de identificación externo (falsos positivos);

d) número de colonias atípicas identificadas como no pertenecientes al organismo objetivo a través de un ensayo de identificación externo (verdaderos negativos). 6.2.4.3

Las frecuencias de estas categorías pueden expresarse en una matriz de 2  2. Recuento presuntivo

Recuento confirmado

+

−

+

a

b

a+b

−

c

d

c+d

a+c

b+d

n

El número total de ensayos es a + b + c + d = n. La sensibilidad, especificidad, selectividad, tasas de falsos positivos y de falsos negativos para el organismo de ensayo pueden calcularse de la siguiente manera: Sensibilidad = a / (a + b) Especificidad = d / (c + d) Tasa de falsos positivos = c / (a + c) Tasa de falsos negativos = b / (b + d) Selectividad = a / n Un parámetro adicional, la eficiencia (E), que da la fracción de colonias correctamente asignadas, puede calcularse de la siguiente manera: E = (a + d)/n. El recuento confirmado se refiere a los organismos caracterizados por un cierto método, descritos en el procedimiento como los organismos objetivo. Cuando el método incluye dentro de él un procedimiento de confirmación (por ejemplo, la producción de indol a partir de triptófano para E. coli), este método bastará. Cuando el procedimiento no incluye etapa de confirmación (por ejemplo, la Norma ISO 9308-2[11]), puede utilizarse otra etapa de confirmación (confirmación secundaria). Tales métodos pueden incluir kits de identificación comerciales, otros métodos fenotípicos (por ejemplo, ensayos de un cierto rasgo o sistema enzimático), ensayos de composición química (por ejemplo, MALDI-TOF) o métodos moleculares. La selección del método tendrá influencia sobre el resultado de los datos y debería prestarse particular atención a la selección de un procedimiento de confirmación ya que define el objetivo. NOTA Para métodos NMP, puede aplicarse el mismo sistema. El término "colonias" puede cambiarse por "alícuotas", "típica" por "positivo" y "atípica" por "negativo".

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6.2.5

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Ejemplo práctico

El método ISO 9308-1[10] utiliza un medio que contiene sustratos cromógenos para la β-D-galactosidasa y la β-D-glucoronidasa. En consecuencia, las colonias de coliformes se colorean en tono rosa rojizo, las colonias de E.coli de color azul violeta y las colonias no objetivo deberían quedar incoloras. No se requiere ninguna etapa de confirmación de E.coli cuando se utiliza este método. Para la caracterización primaria del método en cuanto a la tasa de recuperación de E.coli, puede utilizarse una secuenciación de ARNr 16S como procedimiento de confirmación secundaria. En una validación, todas las colonias azules/violetas, rosas/rojizas e incoloras se someterían a examen por secuenciación de ARNr 16S. En un experimento de caracterización primaria, se secuenciaron 300 colonias azul/violeta y 285 resultaron ser E.coli. Se sometieron a secuenciación un total de 600 colonias rosa/rojizo y 30 resultaron ser E.coli. Un total de 300 colonias incoloras fueron sometidas a secuenciación y ninguna de ellas resultó ser E.coli. En la tabla 2 se muestran los resultados de 20 muestras analizadas para la caracterización primaria del método anteriormente citado. Tabla 2 – Tabulación de recuentos para la determinación de características categóricas Muestra

a

b

c

d

1

15

3

1

42

2

8

0

0

33

3

4

1

0

26

4

15

3

1

50

5

16

1

0

45

6

12

5

0

48

7

6

0

1

38

8

10

1

1

29

9

14

2

0

53

10

18

0

2

51

11

17

2

0

45

12

19

0

1

63

13

13

2

2

40

14

11

3

1

39

15

13

0

0

35

16

25

3

2

33

17

21

1

0

54

18

16

0

1

55

19

15

1

2

40

20

17

2

0

51

Suma

285

30

15

870

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En este escenario, se generarían los siguientes datos: Recuentos definidos por el método

Recuentos corroborados

+

−

+

285

30

315

−

15

870

885

300

900

1 200

El recuento definido por el método procede del recuento obtenido siguiendo los métodos descritos en el procedimiento original. Las cuentas corroboradas se obtienen tras confirmación secundaria. El número total de ensayos (n) es 1 200. La sensibilidad, especificidad, selectividad, tasas de falsos positivos y de falsos negativos para el organismo de ensayo pueden calcularse de la siguiente manera: Sensibilidad = a / (a + b), es decir, 285/315 = 90,5% Especificidad = d / (c + d), es decir, 870/885 = 98,3% Tasa de falsos positivos = c / (a + c), es decir, 15/300 = 5,0% Tasa de falsos negativos = b / (b + d), es decir, 30/900 = 3,3% Selectividad = a / n, es decir, 285/1200 = 23,8% Un parámetro adicional, la eficiencia (E), que da la fracción de colonias correctamente asignadas, puede calcularse de la siguiente manera: E = (a + d)/n, es decir, 1 155/1 200 = 96,3%.

6.3 Determinación del límite superior y consideración del límite inferior de detección 6.3.1

Rango de trabajo

El rango de trabajo de un método con frecuencia se especifica en la descripción inicial del procedimiento operatorio o viene definido por el fabricante cuando se trata de un test comercialmente disponible. No obstante, esos datos pueden no siempre ser exactos y variar para distintos tipos de muestras. Para métodos de tipo NMP, el rango de trabajo estará determinado por el tamaño de la muestra empleada y el número de recipientes de reacción usados. Se ha excedido el límite superior práctico cuando todos los tubos de todas las diluciones han dado resultado positivo. 6.3.2

Límite superior en relación con la linealidad

Teóricamente, en los métodos de recuento de colonias, la precisión va mejorando de manera regular en función del número de colonias objetivo observadas en la serie de detección. Los límites superiores vienen definidos por requerimientos de espacio y la consiguiente interacción de las colonias microbianas.

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En la práctica los métodos de recuento de colonias tienen un límite superior por detector que varía con la situación de ensayo. El detector de recuento de colonias (placa de agar, filtro de membrana) puede estar "colmatado" o saturado por varias razones, constituyendo el número de colonias objetivo tan solo una de ellas. Cada método tiene un límite superior fiable. No se trata de un número determinado de manera clara, sino de un rango de número de colonias en el cual los recuentos por placa se vuelven demasiado inciertos para poder basar en ellos un recuento válido. Un diseño experimental basado en una serie finamente graduada de diluciones o de volúmenes con repetición de placa y de recuento proporciona los datos necesarios para la determinación del límite superior de trabajo. Una muestra líquida perfectamente homogenizada se diluye previamente hasta una densidad tal que del número previsto de colonias por placa sobrepase el límite superior supuesto de funcionamiento del detector. Se prepara una serie de seis o siete diluciones consecutivas a partir de la dilución inicial, cada vez con un nivel de dilución 1:2. Se siembran tres placas en paralelo por cada dilución. Únicamente se tienen en cuenta las placas que presenten una media superior a 20 colonias. Se analizan los datos para determinar la proporcionalidad y la sobredispersión de las placas en paralelo asumiendo como base de la evaluación de que se ha realizado un reparto aleatorio perfecto en cada etapa. Un único valor del ensayo G2 es de una utilidad más bien limitada. La realización de ensayos de proporcionalidad similares sobre diferentes muestras ayuda a determinar el recuento máximo de colonias, cuando la proporcionalidad del método es suficiente. 6.3.3

Tipo y número de muestras a utilizar

El rango de trabajo de un método puede determinarse por utilización de muestras naturalmente contaminadas, de cultivos puros o de muestras a las que se ha añadido un material contaminado que contenga el organismo objetivo (por ejemplo, agua residual urbana para los organismos entéricos). En el caso más práctico debería ser un cultivo puro. Se requiere el examen de un mínimo de 20 muestras. Cuando se emplean aguas residuales urbanas o aguas superficiales, deberían utilizarse tres fuentes como mínimo. NOTA 1 La determinación del rango de trabajo puede ser complicada para métodos en los que hay dos organismos objetivo investigados en la misma placa, por ejemplo la detección simultánea de coliformes totales y E. coli en un único filtro de membrana. En tales circunstancias, el rango de trabajo puede ser diferente para coliformes totales y E. coli, si E. coli está presente en la muestra conjuntamente con otros coliformes totales. Al determinar el rango de trabajo para este tipo de métodos, dicho rango puede reportarse como el número total de colonias objetivo presentes, ya que la relación entre E. coli y los otros coliformes variará de una muestra a otra. NOTA 2 La selectividad del método constituye otro factor de confusión en la determinación del rango de trabajo. Por ejemplo, un método basado en filtración en membrana para la detección de los coliformes totales y/o de E. coli que es un método de baja selectividad podrá permitir el crecimiento de muchos otros organismos distintos al objetivo. El crecimiento de dichos organismos puede enmascarar o inhibir el crecimiento de los organismos objetivo. En tales casos, el rango de trabajo podría acotarse en términos del número total de colonias objetivo y no objetivo sobre la membrana, ya que el rango de trabajo está significativamente impactado por el crecimiento de organismos distintos al objetivo.

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6.3.4

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Ejemplo práctico

6.3.4.1

Preparación

Una muestra natural ha sido previamente diluida a un nivel adecuado y sometida a una serie de 6 etapas sucesivas de dilución 1:2. Se han preparado tres placas paralelas para cada dilución con ayuda de la técnica de siembra en superficie. Tras la incubación, se ha realizado el recuento de las colonias y los resultados se presentan en la tabla 3. Tabla 3 – Tabulación de los recuentos en un experimento de linealidad Dilución

Recuentos paralelos

Suma

Media

Volumen relativo

Si

x

Ri

Si/Ri

2-1

121

204

162

487

162,3

32

15,2

2-2

109

128

148

385

128,3

16

24,1

2-3

111

114

97

322

107,3

8

40,3

2-4

56

60

68

184

61,3

4

46,0

2-5

36

29

24

89

29,7

2

44,5

2-6

11

13

17

41

13,7

1

41,0

Total:

1 508

63

–

NOTA La fórmula utilizada para los cálculos se indica en el anexo C, fórmula (C.1).

6.3.4.2

Ensayos de proporcionalidad general

El grado de acuerdo de las sumas de números de colonias en paralelo con los volúmenes relativos respectivos 32/16/9/4/2/1 se calcula usando sumas de recuentos paralelos y del G2 general (fórmula (C.1)), de la siguiente manera: G52 = 2 [487ln(487/32) + 385ln(385/16) + 322ln(322/8) + 184ln(184/4) + 89ln(89/2) + 41ln(41/1) – 1 508ln(1 508/63)] = 292,526 El ensayo estadístico comporta 6 – 1 = 5 grados de libertad. El valor del índice se compara con la distribución χ2 con 5 grados de libertad, que corresponde a 11,070 para el 5% y a 15,086 para el 1%. El valor calculado excede el valor teórico para el 1% (15,086) lo que es indicativo de que la linealidad general de los resultados es deficiente. 6.3.4.3

Interpretación de los datos y etapas posteriores

El sistema de detección no era lineal para esta muestra en el rango de recuento de colonias de 41/3 = 14 hasta 487/3 = 162 colonias por placa. A partir del examen de los recuentos por volumen relativo (Si/Ri), puede observarse que los números de colonias elevados se desvían mucho con respecto a lo esperado. En las cuatro diluciones de 2-3 a 2-6 los recuentos por volumen relativo (Si/Ri) eran aproximadamente constante, aproximadamente 43 como media. Un cambio brusco se produjo ente las diluciones 2-3 y 2-2.

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El detector no resulta ya funcional, incluso antes de alcanzar las 160 colonias por placa ya que, para las diluciones 2-2 y 2-1, se ha desarrollado un número de colonias inferior al previsto. La relación 2:1 entre las diluciones sucesivas no se ve en los recuentos de colonias a las concentraciones superiores, lo que es indicativo que a elevadas concentraciones de colonias, los resultados no son lineales. Puede repetirse el mismo análisis de proporcionalidad sin los recuentos de la primera dilución. Se calcula la correspondencia de las sumas para las cinco diluciones: G42 = 2 [385ln(385/16) + 322ln(322/8) + 184ln(184/4) + 89ln(89/2) + 41ln(41/1) – 1 021ln(1201/31)] = 81,933 Con cuatro grados de libertad, los valores de referencia para el ensayo estadístico son 9,488 para el 5% y 13,277 para el 1%. Estadísticamente, la proporcionalidad estaba todavía considerablemente fuera de control cuando el recuento medio más alto era de 128. La siguiente etapa es el ensayo de proporcionalidad para cuatro diluciones: G32 = 2 [322ln(322/8) + 184ln(184/4) + 89ln(89/2) + 41ln(41/1) – 636ln(636/15)] = 2,328 Los valores de referencia para tres grados de libertad de 7,815 para el 5% y de 11,345 para el 1% son bastante más elevados que el valor observado de 2,328. No queda ningún signo de desviación sistemática de la proporcionalidad en las cuatro diluciones comenzando con el recuento medio de 107. Puede concluirse que solamente se observa linealidad cuando la muestra es más diluida. El punto al cual no se observa linealidad, poco después de que el número de colonias por placa sea superior a 100 aproximadamente, determina el límite superior del método. Un plan similar debería repetirse con un mínimo de veinte muestras con objeto de determinar el rango de trabajo. Esta metodología solamente es aplicable a los métodos de recuento de colonias. 6.3.5

Límite inferior de detección

El límite inferior de detección no puede determinarse experimentalmente con fiabilidad y, en gran parte, es una cuestión de definición y del volumen de muestra analizado. En el anexo B se da una explicación detallada al respecto.

6.4 Estimación de la precisión: determinación de la repetibilidad y de la reproducibilidad 6.4.1

Generalidades

La serie de Normas ISO 5725 fue desarrollada para servir como documento guía para la caracterización de la variabilidad de los métodos de medida normalizados. Dos medidas de variabilidad (o de precisión), la repetibilidad y la reproducibilidad, se aceptan en muchas disciplinas como representativos de los datos obtenidos en los procesos de medida. La caracterización de un nuevo método debería proporcionar los valores iniciales de sus estimaciones de precisión. Otros laboratorios precisan información para la verificación del método y establecer posteriormente los sistemas de control de calidad analítico.

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Para su aplicación a los métodos de análisis microbiológico del agua, las Normas ISO 5725-1[2], ISO 5725-2[3] e ISO 5725-3[4] necesitan cierta adaptación, ya que sus principios básicos se aplican originalmente a datos continuos y no a datos discretos (recuentos). Sus principales niveles de precisión se evalúan generalmente en dos condiciones diferentes: – las condiciones de repetibilidad que hacen referencia a la variabilidad de las medidas efectuadas sobre muestras idénticas en condiciones idénticas. En casos ideales para determinaciones microbiológicas, estas condiciones de análisis se espera que se ajusten a la distribución de Poisson. En la práctica no siempre es éste el caso. Pueden detectarse experimentalmente casos de sobredispersión entre recuentos paralelos (véanse el anexo D y el apartado 6.4.2); – las condiciones de reproducibilidad hacen referencia a la variabilidad de medidas efectuadas sobre materiales idénticos en condiciones diferentes por laboratorios diferentes empleando el mismo método de medida. En teoría, la reproducibilidad incluye los efectos debidos a diferencias entre los equipos de medida, los reactivos, los operadores, los laboratorios y las condiciones ambientales. La evaluación de este nivel de precisión para los métodos microbiológicos conduce a una varianza operativa relativa que comprende la variabilidad máxima de los factores de incertidumbre (véase el anexo F). Una tercera medida de la precisión de un método puede evaluarse en un laboratorio con un plan experimental específico (descomposición del sesgo en componentes elementales tales como los operadores, el equipo, los efectos del material, etc.). Se conoce como la reproducibilidad intralaboratorio o precisión intermedia (para más detalles, véanse el apartado 6.4.3 y el anexo D). 6.4.2

Repetibilidad

6.4.2.1

Diseño

El diseño para la determinación de las características de funcionamiento de un método en cuanto a repetibilidad consiste en analizar 10 replicados de la misma muestra en condiciones de repetibilidad, es decir, el mismo técnico, en el mismo día, a la misma hora aproximadamente e incubando todas las muestras en la misma estufa. Deberían prepararse un mínimo de tres series de datos de repetibilidad, utilizando tres fuentes diferentes del microorganismo objetivo. Se recomienda utilizar muestras naturales. 6.4.2.2

Ejemplo práctico: presentación tabulada de los recuentos

La tabla 4 presenta 3 series de 10 medidas obtenidas en condiciones de repetibilidad con un método de recuento en placas. Tabla 4 – Presentación tabulada de los recuentos en 3 experimentos de repetibilidad Muestra

Medidas replicadas (placas)

1

63

65

77

59

69

61

55

65

33

90

2

47

60

40

57

24

39

57

52

35

54

3

21

16

20

24

21

34

23

26

18

14

NOTA Las fórmulas utilizadas para los cálculos siguientes se indican en el anexo A, fórmula (A.8) y en el anexo D, fórmulas (D.1) y (D.2).

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6.4.2.3 Ejemplo práctico: detección de la sobredispersión por aplicación del índice de dispersión de Poisson Para la muestra 1, el valor observado de

x r21 = [10 × (632+652+772+…+332+902/(63+65+77+…+33+90)] – (63+65+77+…33+90) = 30,582. Para la primera serie: Media aritmética ( x ) = 63,7; Varianza (S2) = 216,456; Varianza operativa relativa ( u02 ) = (216,456-63,7)/63,72 = 0,038. La tabla 5 presenta los valores calculados de la varianza operativa relativa para las tres muestras analizadas Tabla 5 – Cálculo de la varianza operativa relativa Muestra

Media aritmética

Varianza

Valor observado de

Varianza operativa relativa

x

S2

 r21

u 02

1

63,7

216,456

30,582

0,038

2

46,5

136,278

26,376

0,042

3

21,7

31,789

13,184

0,021

Conforme a la distribución de χ2, el valor crítico de probabilidad de 0,05 para (10-1) grados de libertad es: 16,919. El valor observado de  r21 es superior al valor crítico de probabilidad de 0,05 para las muestras 1 y 2; en consecuencia, se ha detectado que hay una sobredispersión notable en la serie de medidas. La varianza operativa relativa u02 da un orden de magnitud de la variabilidad operativa cada serie de medidas repetidas. Para la muestra 3, el valor observado de  r21 es inferior al valor critico de probabilidad de 0,05. La variabilidad observada entre los recuentos paralelos es conforme a la distribución de Poisson. Incluso si no es estadísticamente significativa, la varianza operativa relativa puede conservarse para la muestra 3 para evaluación posterior. La varianza operativa relativa media para las tres muestras es igual 0,034. La expresión final de la desviación estándar relativa de repetibilidad es en % la raíz cuadrada de la varianza operativa relativa media (18,4%). Corresponde al funcionamiento del método para el material de ensayo en condiciones de repetibilidad.

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6.4.3

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Reproducibilidad intralaboratorio

6.4.3.1

Diseño

La reproducibilidad intralaboratorio se conoce también como reproducibilidad intermedia (o precisión intermedia). Se evalúa realizando series de replicados, en condiciones lo más diferentes posible, dentro de un único laboratorio (por ejemplo, diferentes técnicos, diferentes estufas y diferentes lotes de medio…). Puede utilizarse el diseño experimental descrito en la Norma ISO 29201[15]. El proceso analítico completo se duplica utilizando máxima variación de los parámetros de laboratorio. Siempre que sea posible deben estudiarse muestras naturales. Se recomienda un mínimo de 30 muestras. 6.4.3.2

Ejemplo práctico para recuento de colonias

La tabla 6 muestra los resultados del análisis de 10 muestras en dos replicados x1 y x2, realizado en condiciones lo más diferentes posible dentro de un laboratorio (condiciones de reproducibilidad intralaboratorio). Tabla 6 – Presentación tabulada de los recuentos de colonias para 10 muestras analizadas por duplicado Muestra

Replicados

Media aritmética

Varianza

Varianza operativa relativa 2

x1

x2

x

S2

u0

1

34

23

28,5

60,5

0,039

2

17

15

16

2

-0,055

3

11

27

19

128

0,302

4

40

21

30,5

180,5

0,161

5

42

25

33,5

144,5

0,099

6

43

38

40,5

12,5

-0,017

7

25

12

18,5

84,5

0,193

8

34

28

31

18

-0,014

9

58

39

48,5

180,5

0,056

10

37

48

42,5

60,5

0,010

NOTA 1 La fórmula utilizada para los cálculos de la tabla 6 viene dada en el anexo D, fórmula (D.2). NOTA 2 Teóricamente la varianza no puede ser nunca negativa. No obstante, tal cosa puede suceder cuando se obtiene una estimación de la varianza por sustracción y cuando las varianzas experimentales están basadas en pequeños números de replicados.

La varianza operativa relativa media obtenida a partir de la serie de 10 pares de recuentos es igual a 0,077. La raíz cuadrada de la varianza operativa relativa media (27,8%) corresponde al funcionamiento del método para el material de ensayo en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio.

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6.4.3.3

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Ejemplo práctico para sistemas NMP

Se analizaron por duplicado 10 muestras por un método de tipo NMP. Para cada muestra, las medidas de los dos replicados se han realizado en condiciones intralaboratorio, con el fin de estimar la variabilidad máxima de las condiciones de análisis en el seno del laboratorio. Los datos obtenidos se presentan en la tabla 7. Tabla 7 – Presentación tabulada de resultados de NMP para 10 muestras analizadas por duplicado Muestra

Medidas

Límite de confianza inferior

Límite de confianza superior

Límite de confianza inferior

Límite de confianza superior

Solapamiento de los intervalos de confianza en condiciones de reproductibilidad intralaboratorio

M1

M2

T0,1

T1,1

T0,2

T1,2

1

600,1

176,1

419,3

858,9

97,2

319,1

no

2

2 086,6

1 148,4

1 560,4

2 790,4

850,7

1 550,3

no

3

1 885,3

1 362,8

1 413,0

2 515,5

1 017,3

1 825,5

si

4

76,8

110,0

31,9

184,9

52,5

230,6

si

5

1 672,6

2 094,8

1 254,0

2 230,9

1 566,3

2 801,6

si

6

799,8

311,8

576,6

1 109,5

196,4

494,9

no

7

196,7

143,8

111,8

346,3

74,9

276,2

si

8

1 202,0

1 316,6

892,5

1 618,7

981,6

1 765,8

si

9

7 100,7

7 682,9

4 488,8

11 232,5

4 845,4

12 181,9

si

10

7 682,9

3 421,3

4 845,4

12 181,9

2 450,4

4 777,0

no

La tabla 8 presenta las varianzas operativas relativas para los resultados de NMP.

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Tabla 8 – Cálculo de la varianza operativa relativa para resultados de NMP Muestra

Reproducibilidad intralaboratorio

Variabilidad intrínseca del primer replicado

Variabilidad intrínseca del segundo replicado

Variabilidad intrínseca media

Varianza operativa relativa

u R2

u d21

u d2 2

u d2

u 02

1

0,752

0,034

0,092

0,063

0,689

2

0,178

0,022

0,023

0,023

0,156

3

0,053

0,022

0,022

0,022

0,031

4

0,065

0,201

0,143

0,172

-0,107

5

0,025

0,022

0,022

0,022

0,004

6

0,444

0,028

0,056

0,042

0,402

7

0,049

0,083

0,111

0,097

-0,048

8

0,004

0,023

0,022

0,023

-0,019

9

0,003

0,055

0,055

0,055

-0,052

10

0,327

0,055

0,029

0,042

0,285

NOTA Las fórmulas utilizadas para los cálculos de la tabla 8 vienen dadas en el anexo D, fórmulas (D.4), (D.5), (D.6), (D.7).

La varianza operativa media calculada a partir de la serie de 10 pares de recuentos es igual a 0,134. Su raíz cuadrada (36,6%) corresponde a la variabilidad del método observada en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio.

6.5 6.5.1

Robustez Generalidades

La robustez se refiere a la tolerancia existente en cuanto a pequeños cambios en el procedimiento o hacia variaciones inevitable en las condiciones ambientales del laboratorio. La determinación de la robustez varía según el tipo de procedimiento a estudiar. Se requieren estudios específicos. El propósito de tales estudios es especificar límites dentro de los cuales puede esperarse que un método se ajuste al uso previsto. Las consideraciones sobre la robustez pueden conducir a limitaciones relativas al rango de aplicación y las condiciones de utilización del método. 6.5.2

Diseños experimentales para efectos debidos al tiempo y a la temperatura

Para la mayoría de los métodos microbiológicos son importantes la temperatura y el tiempo de incubación. La interacción entre las membranas y los medios y/o entre los medios y las unidades de reacción pueden ser igualmente importante. Para los kits de ensayo comerciales, el tiempo de conservación del producto puede también ser un parámetro de interés, así como el periodo de conservación de los medios preparados.

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En el estudio de la robustez de un método deberían analizarse replicados de muestras contaminadas, de forma natural o por adición, en los extremos del parámetro objeto de estudio. Algunas placas pueden leerse repetidamente, retornando las placas a la estufa para posterior incubación tras su lectura. Por ejemplo, si el procedimiento operativo de un método especifica un rango de temperatura de (35 ± 1) °C, las muestras deberían analizarse a 34 °C y a 36 °C. Si el periodo de incubación está comprendido entre 18 h y 22 h, deberían entonces leerse las muestras al cabo de 18 h y de 22 h. Puede resultar preferible obtener datos sobre la robustez en forma de matriz utilizando (por ejemplo) las temperaturas de incubación máxima y mínima durante los periodos de incubación máximo y mínimo. Otro plan es preparar una serie de placas paralelas, colocarlas en diferentes partes de la estufa de incubación y sacar una cada vez tras diferentes periodos en la incubadora. El segundo diseño mide también los efectos espaciales de la incubación (véase la Norma ISO 29201 [15]). Si la persona que desarrolla un método reivindica la aplicabilidad del mismo sobre un rango de temperaturas considerable, se requieren experimentos especiales que incluyen varias incubadoras programadas a diferentes temperaturas. Debería tomarse un mínimo de 30 puntos de datos para cada parámetro. Los datos deberían recogerse utilizando un mínimo de tres orígenes de los organismos objetivo, sean cultivos de referencia o se trate de materiales con adición preparados en laboratorio. Para el análisis de los datos pueden utilizarse métodos gráficos y ensayos estadísticos normalizados como los test de inferencia paramétricos o no paramétricos, que se hayan generado por recuentos microscópicos directos, NMP o recuento de colonias.

6.6 6.6.1

Tasa de recuperación relativa Generalidades

La veracidad hace referencia al grado de acuerdo entre los resultados observados y el valor verdadero, pero la veracidad absoluta de un resultado de ensayo microbiológico no puede demostrarse. La mejor solución consiste en acordar por consenso un valor verdadero. Puede tratarse del resultado obtenido por otro método, de la media de un material de referencia certificado suministrado por el fabricante o de la media de las observaciones en diferentes laboratorios en el curso de trabajos relacionados con el aseguramiento de la calidad. La tasa de recuperación comparada con la referencia aceptada, también llamada tasa de recuperación relativa, es lo mejor que puede hacerse para la determinación cuantitativa del sesgo (desviación con respecto al valor verdadero). Cuando el método utiliza filtros de membrana, éstos tienen que utilizarse para la comparación de rendimientos. No obstante, los filtros de membrana pueden contribuir en parte al sesgo y tener consecuentemente incidencia sobre la tasa de recuperación relativa. Para mayor información sobre las comparaciones de tasas de recuperación, véanse la Norma ISO 11133[12] y la Norma ISO 7704[8]. Además, la interacción entre los filtros de membrana y el medio nutritivo es una cuestión de interés y puede contribuir significativamente al sesgo.

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6.6.2

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Determinación de la tasa de recuperación relativa

Puede calcularse una aproximación de la tasa de recuperación real por medio de ensayos sobre cultivos puros o de muestras esterilizadas enriquecidas utilizando un método no selectivo como referencia (véase también la Norma ISO 11133[12]). También hay materiales de referencia disponibles para este propósito. Estas aproximaciones, no obstante, dependen en la eficiencia de la recuperación de los métodos utilizados para el ensayo del material de referencia o en la determinación del valor de referencia. Las eficacias de la recuperación de distintos métodos microbiológicos pueden variar considerablemente y pueden también verse significativamente afectadas por efectos de matriz. Por lo tanto, es prudente determinar la tasa de recuperación relativa de los métodos con las diferentes matrices a ensayar. Para la determinación de la tasa de recuperación relativa pueden emplearse muestras contaminadas naturalmente, muestras enriquecidas o cultivos puros. En el caso de métodos para el análisis de agua potable, a la hora de seleccionar las muestras a utilizar en este tipo de estudios, la cantidad de organismos objetivo añadidos a la muestra enriquecida debería ser superior en un orden de magnitud como mínimo, a los que se presentan típicamente de manera natural. Para otras matrices, tales como aguas para usos recreativos, biosólidos y aguas residuales, el número de organismos objetivo que habitualmente se encuentra es con frecuencia adecuado, pero tales muestras pueden requerir dilución. Deberían utilizarse al menos tres organismos diferentes para los experimentos con muestras enriquecidas y deberían recogerse un mínimo de treinta puntos de datos. Para ser lo más realista posible, la tasa de recuperación relativa debería estudiarse a partir de muestras naturalmente contaminadas preferiblemente a materiales de ensayo artificiales. Alternativamente, pueden utilizarse muestras enriquecidas con materiales que presentan contaminación natural. Para evitar interpretaciones subjetivas, la comparación debe estar basada en recuentos confirmados obtenidos por confirmación de todas las colonias. El procedimiento descrito en la Norma ISO 17994 está recomendado para la determinación el funcionamiento de la tasa de recuperación relativa del método (tanto recuento de colonias como NMP).

6.7 6.7.1

Incertidumbre del recuento Generalidades

La base de la fiabilidad de los recuentos se estudia por medio de recuentos repetidos de las colonias de las mismas placas durante un periodo breve. Las observaciones realizadas sobre la incertidumbre del recuento proporcionan una primera impresión de los problemas potenciales en caso de utilización extendida del método. De conformidad con la Norma ISO 29201[15], deben evaluarse la repetibilidad y la reproducibilidad intralaboratorio del recuento, es decir, estimaciones numéricas individuales o colectivas de la incertidumbre del recuento, expresadas en forma de desviación estándar relativa. La incertidumbre del recuento se utiliza como un valor base para la estimación de otras características de robustez como la sensibilidad al tiempo.

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Para los métodos basados en sistemas de NMP, puede estudiarse igualmente la incertidumbre de lectura intralaboratorio por diferentes operadores, conforme a la Norma ISO 29201[15]. Los resultados del mismo sistema de tipo NMP pueden ser leídos por diferentes operadores. Se efectúan los cálculos de incertidumbre utilizando los valores de NMP obtenidos por cada operador. 6.7.2

Diseño experimental para la evaluación de la incertidumbre del recuento de colonias

– Se leen repetidamente las mismas placas en condiciones uniformes, es decir, dentro de un intervalo de tiempo claramente más corto que la tolerancia admitida para el método. En la práctica, esto significa un intervalo máximo de tiempo de una hora. – Deberían seleccionarse de manera aleatoria las placas para el recuento repetido, ignorando las que contengan menos de 20 colonias y no seleccionando aquellas que contengan colonias que no son habituales. Si no, las placas elegidas deberían ser representativas de rango de trabajo completo del método. – Para una estimación general fiable, deberían estar disponibles al menos 30 placas. 6.7.3

Ejemplo de incertidumbre individual (o personal) del recuento de las colonias

Un técnico que esté familiarizado con el método microbiológico debería efectuar la lectura de diferentes placas por duplicado y en un intervalo corto de tiempo (por ejemplo, menos de una hora. Los datos de los recuentos por duplicado, denominados x1 y x2, se muestran en la tabla 9. Tabla 9 – Incertidumbre del recuento de colonias 2

Placa

x1

x2

x1−x2

x1+x2

u rel,L

1

129

122

7

251

0,002

2

417

377

40

794

0,005

3

73

80

-7

153

0,004

4

49

52

-3

101

0,002

5

86

81

5

167

0,002

6

37

39

-2

76

0,001

7

112

115

-3

227

0,000

8

204

214

-10

418

0,001

9

66

71

-5

137

0,003

10

306

299

7

605

0,000

Suma

1 479

1 450

0,020

NOTA La fórmula utilizada para los cálculos de la tabla 9 viene dada en el anexo E, fórmula (E.2).

La estimación media de la varianza relativa del recuento personal es el valor medio de 2 urel,L = 0,020/10 = 0,002. Su raíz cuadrada 0,045 indica así una incertidumbre estándar relativa del 4,5% de la repetibilidad del recuento por esta persona. En este ejemplo de datos reales del recuento total de colonias en un medio no selectivo, la desviación estándar de repetibilidad relativa era mucho mayor que la "ideal" (urel,L < 0,02), pero su valor sigue siendo inferior al límite de 0,1.

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Si el valor es elevado (superior a 0,1), puede resultar interesante volver a la tabla para examinar los valores individuales de urel,L en busca de las causas. Un valor elevado accidental puede ser el origen o puede existir una tendencia en el recuento medio de colonias. Es más sencillo representar en un gráfico que relacione los valores de urel,L con los recuentos de colonias. 6.7.4

Ejemplo de incertidumbre intralaboratorio del recuento de las colonias

Cinco técnicos tomaron parte en una sesión de recuento de colonias. Se tomaron placas estándar de agar de las determinaciones disponibles efectuando su lectura cada participante. Se omitieron las placas con menos de 20 colonias. En la tabla 10 se muestran los resultados de seis placas. NOTA Seis placas no resultan suficientes para efectuar una estimación general fiable, pero permiten ilustrar los cálculos.

Primero se calculan la media (m) y la desviación estándar (s) de cada placa. A partir de estos cálculos se obtienen los valores de urel,L = s/m (penúltima columna). Tabla 10 – Incertidumbre del recuento intralaboratorio 2 rel,L

Placa

A1

A2

B1

B2

B3

m

s

urel,L

1

33

26

33

34

33

31,8

3,271

0,103

0,011

2

160

156

166

176

174

166,4

8,649

0,052

0,003

3

142

128

142

146

139

139,4

6,841

0,049

0,002

4

78

97

81

81

83

84,0

7,483

0,089

0,008

5

89

94

81

94

92

90,0

5,431

0,060

0,004

6

38

44

38

42

40

40,4

2,608

0,065

0,004

Suma

540

545

541

573

561

u

0,031

NOTA Las fórmulas utilizadas para los cálculos de la tabla 10 vienen dadas en el anexo E, fórmulas (E.1) y (E.3). 2 La suma de urel,L (suma de las varianzas relativas) es 0,031 y su media es 0,005. Su raíz cuadrada

0,071 es le incertidumbre intralaboratorio relativa media del recuento, con este método y un grupo de operadores (7,1%). 6.7.5

Ejemplo de incertidumbre intralaboratorio de lectura de NMP

Se realizó la lectura de los resultados de 30 muestras diferentes por dos operadores diferentes. Los resultados de las cinco primeras muestras se muestran en la tabla 11. Tabla 11 – Incertidumbre intralaboratorio de lectura de NMP Muestra

Analista 1

Analista 2

Varianza relativa

1

1 409,3

1 273,8

0,005

2

3 074,5

2 905,3

0,002

3

4 984,2

5 363,5

0,003

4

1 114,0

1 047,1

0,002

5

651,1

778,3

0,016

Media

0,006

NOTA La fórmula utilizada para los cálculos de la varianza relativa en la tabla 11 se indica en el anexo E, fórmula (E.1) utilizada elevada al cuadrado.

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La raíz cuadrada de la varianza relativa media es el valor medio de la incertidumbre relativa de la lectura de NMP por operadores diferentes. En el ejemplo numérico, su valor es de 0,077 (7,7%).

7 Diseños para la verificación de un método por un solo laboratorio 7.1

Consideraciones generales

Este apartado describe los procedimientos a llevar a cabo a fin de verificar que el método está funcionando adecuadamente en un laboratorio dado. Los estudios de las características de funcionamiento (véase la tabla 12) no son tan amplios como los utilizados para la determinación inicial de las mismas y el número de puntos de datos requeridos es generalmente inferior. Tabla 12 – Características de funcionamiento mínimas requeridas para la verificación de un método por un solo laboratorio Parámetro

Definición

Sensibilidad

Fracción de todos los resultados positivosa correctamente asignados en el recuento presuntivo

Especificidad

Fracción de todos los resultados negativosb correctamente asignados en el recuento presuntivo

Tasa de falsos positivos

Fracción de resultados positivos (por ejemplo, colonias típicas) que posteriormente se ha comprobado corresponden a organismos distintos al objetivo

Tasa de falsos negativos

Fracción de resultados negativos (por ejemplo, colonias atípicas) que se ha comprobado que son organismos objetivo

Selectividad

Relación entre el número de colonias objetivo y el número total de colonias en el volumen de muestra

Eficiencia

Fracción de las colonias totales que ha sido correctamente asignadas en el recuento presuntivo

Repetibilidad

Precisión bajo condiciones de repetibilidad (los mismos operadores, las mismas condiciones de funcionamiento, periodo de tiempo corto…)

Incertidumbre de recuento

Desviación estándar relativa de recuentos repetidos del objetivo obtenidos por recuento repetido (placas, campos, tubos, etc.) bajo condiciones estipuladas (misma persona, personas diferentes, mismo laboratorio, etc.)

a

Los resultados positivos pueden ser los recuentos de colonias, unidades de reacción positiva (NMP) o los recuentos de células.

b

Los resultados negativos pueden ser colonias atípicas, las unidades de reacción negativa (NMP) o las células sin las características específicas requeridas.

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7.2 Cálculo de la sensibilidad, especificidad, eficiencia, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos 7.2.1

Tipo de muestra a utilizar

Se preparan muestras que contengan de 20 a 80 organismos objetivo por volumen examinado. Siempre que sea posible, para la preparación de la muestra es preferible utilizar materiales contaminados de forma natural. Para las bacterias indicadoras de contaminación fecal, puede utilizarse agua superficial contaminada por aguas residuales o un efluente de aguas residuales. Las muestras se examinan a continuación aplicando el procedimiento que está siendo objeto de estudio. Se efectúa el recuento de las colonias típicas y atípicas (es decir, aquellas que presentan la apariencia típica del organismo objetivo y aquellas que no presentan dicha apariencia). A continuación, se identifican tanto las colonias típicas como las atípicas utilizando los procedimientos apropiados, que pueden incluir kits de identificación microbiana disponibles comercialmente, técnicas de secuenciación de ADN u otros métodos apropiados. Los tipos de muestra a utilizar varían según el método estudiado y el organismo objetivo. Por ejemplo, para métodos de coliformes totales, resulta apropiado utilizar agua potable a la que se ha añadido agua superficial o efluente de agua residual. Se realizan diluciones en agua potable hasta obtener de 20 a 80 organismos objetivo en 100 ml. Para los métodos de filtración en membrana que detectan tanto coliformes totales como E. coli sobre la misma membrana, el número objetivo de E. coli podría ser 10 unidades formadoras de colonias o posiblemente incluso menos. 7.2.2

Número de muestras

Deberían enriquecerse un mínimo de cinco muestras de agua potable. El agua superficial o residual utilizada para preparar el material enriquecido debería provenir de al menos dos orígenes. 7.2.3

Procedimiento para la confirmación

Se incuban las muestras y se confirman todas las colonias conforme a los procedimientos apropiados para el método (por ejemplo, para la Norma ISO 9308-1[10] todos los coliformes presuntivos deben someterse al ensayo de producción de citocromo oxidasa). Cuando los métodos no tienen descritos procedimientos de confirmación (por ejemplo, la Norma ISO 9308-2[11]), los resultados se registran tal y como se indica en el método sin confirmación. Las colonias (o unidades reactivas: pocillos, tubos, etc.) se registran como positivas o negativas. Cuando se determinan los parámetros sensibilidad, especificidad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos es necesario aplicar un ensayo de confirmación adicional para confirmar (corroborar) o refutar los resultados generados por el método de ensayo. Son recomendables los ensayos basados en kits de identificación disponibles comercialmente u otros métodos fenotípicos (por ejemplo, los ensayos para un determinado rasgo o sistema enzimático), mientras que el empleo de ensayos de composición química (por ejemplo, MALDI-TOF) o de métodos moleculares pueden usarse principalmente para la caracterización primaria. 7.2.4

Características de funcionamiento de categoría

7.2.4.1 Cuando se incluye una etapa de confirmación en el método, los datos de identificación pueden dividirse en cuatro categorías: a)

número de colonias típicas confirmadas como pertenecientes al organismo objetivo en el ensayo de confirmación primario cuya identidad es corroborada por el ensayo de identificación secundario (verdaderos positivos);

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b) número de colonias atípicas, o de colonias típicas que son asignadas como negativas en el ensayo de confirmación primario y cuya identidad como organismo objetivo es corroborada por el ensayo de identificación secundario (falsos negativos); c)

número de colonias típicas confirmadas como pertenecientes al organismo objetivo en el ensayo de confirmación primario que posteriormente se ha comprobado que no pertenecen al organismo objetivo mediante el ensayo de identificación secundario (falsos positivos);

d) número de colonias atípicas, o de colonias típicas que son asignadas como negativas en el ensayo de confirmación primario que posteriormente se ha comprobado que no pertenecen al organismo objetivo mediante el ensayo de identificación secundario (verdaderos negativos). 7.2.4.2 a)

Para los métodos sin procedimiento de confirmación:

número de colonias típicas identificadas como pertenecientes al organismo objetivo por un ensayo de confirmación externo (verdaderos positivos);

b) número de colonias atípicas identificadas como pertenecientes al organismo objetivo por un ensayo de confirmación externo (falsos negativos); c)

número de colonias típicas identificadas como no pertenecientes al organismo objetivo por un ensayo de confirmación externo (falsos positivos);

d) número de colonias atípicas identificadas como no pertenecientes al organismo objetivo por un ensayo de confirmación externo (verdaderos negativos). 7.2.4.3

Las frecuencias de estas categorías pueden expresarse apropiadamente en una matriz 2 × 2: Recuento presuntivo

Recuento confirmado

+

−

+

a

b

a+b

−

c

d

c+d

a+c

b+d

n

El número total de ensayos es a + b + c + d = n. La sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos para el organismo objetivo puede calcularse de la siguiente manera: Sensibilidad = a / (a + b) Especificidad = d / (c + d) Tasa de falsos positivos = c / (a + c) Tasa de falsos negativos = b / (b + d) Selectividad = a / n

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Un parámetro adicional, eficiencia (E), que proporciona la fracción de colonias correctamente asignadas, puede calcularse como E = (a + d) / n. NOTA Para los métodos de NMP puede aplicarse la misma aproximación. El término “colonias” puede cambiarse por “alícuotas”, el término “típico” por “positivo” y el término “atípico” por “negativo”.

7.3

Determinación de la repetibilidad

El diseño para la determinación de las características de repetibilidad de un método comprende 10 replicados de una misma muestra que son analizados bajo condiciones de repetibilidad, es decir, por parte del mismo operador en el mismo día, aproximadamente a la misma hora y con todas las muestras incubadas en la misma incubadora. Deberían prepararse un mínimo de tres series de datos de repetibilidad utilizando diferentes fuentes y niveles de organismos objetivo. Es preferible utilizar muestras contaminadas de forma natural. A continuación se recogen y se examinan las tres series de datos utilizando el procedimiento descrito en el apartado 6.4.2.2.

7.4

Incertidumbre del recuento

La fiabilidad de los recuentos se determina mediante recuentos repetidos de las colonias de las mismas placas, o de los pocillos/tubos positivos del mismo sistema de NMP, dentro de un intervalo de tiempo corto. Las observaciones sobre la incertidumbre de los recuentos proporcionarán una indicación de los problemas potenciales derivados del uso del método. La incertidumbre del recuento puede determinarse con un único o con múltiples analistas. En caso de que habitualmente el ensayo se lleve a cabo por múltiples analistas, se debería determinar la incertidumbre del recuento también con múltiples analistas (véase 6.7).

7.5

Procedimiento para la verificación por un único laboratorio

Las características mínimas requeridas para la verificación por un único laboratorio se presentan en la tabla 13.

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Tabla 13 – Requisitos detallados para el procedimiento de verificación Características de funcionamiento de categorías Número mínimo de muestras, colonias/UFC y replicados

Repetibilidada

5 muestras: 3 muestras: 20 a 80 colonias 1 vez 10 replicados cada típicas/muestra. una de 20 UFC a 80 UFC 100 a 400 colonias típicas (y colonias atípicas asociadas) en las cinco muestras. No más de 300 colonias por placa de 90 mm o de 80 por filtro de membrana de 47 mm. Sin replicados.

Incertidumbre del recuento 30 placas (preferible, pero no necesariamente de diferentes muestras) Recuentos > 20 UFC. No más de 300 colonias por placa de 90 mm o de 80 por filtro de membrana de 47 mm. Un analista: 30 muestras  2 recuentos. Múltiples analistas: Cada analista cuenta las 30 placas una sola vez.

Tipos de muestras Muestras contaminadas de (por orden de forma natural (muestras preferencia) reales). Agua potable a la que se ha añadido agua superficial o efluente de agua residual. (En caso de material enriquecido, deberían proceder al menos de dos fuentes).

Muestras contaminadas de forma natural (muestras reales). Agua potable a la que se ha añadido agua superficial o efluente de agua residual. Materiales de referencia. Agua enriquecida con varias cepas (cultivos puros) o colonias típicas y atípicas aisladas en el laboratorio.

Muestras contaminadas de forma natural (muestras reales). Agua potable a la que se ha añadido agua superficial o efluente de agua residual. Materiales de referencia. Agua enriquecida con varias cepas (cultivos puros) o colonias típicas y atípicas aisladas en el laboratorio.

Analistas

Uno o más analistas. Si en el laboratorio trabajan varios analistas, es preferible la opción de múltiples analistas.

El mismo analista, mismo (o similar) momento y la misma incubadora por muestra (pero las muestras diferentes pueden ser preparadas por diferentes analistas). La repetibilidad debería calcularse para un único analista.

Según las prácticas habituales del laboratorio, la incertidumbre del recuento puede calcularse para un analista o para varios (todos) los analistas (N). Recuentos repetidos de las colonias en las mismas placas en un intervalo corto de tiempo.

Para el cálculo del(de los) parámetro(s) necesario(s)

Para obtener cultivos puros Para comparar los a partir de colonias típicas y recuentos microbiológicos. atípicas y confirmar/identificar las cepas diferentes utilizando los procedimientos apropiados.

Para comparar los recuentos microbiológicos.

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Características de funcionamiento de categorías Procedimiento

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Repetibilidada

1) Si el método tiene un sistema de confirmación: confirmar TODAS las colonias / cepas.

Para cada muestra (10 replicados), se calcula: Media aritmética

2) Si el método no tiene un sistema de confirmación: identificar TODAS las colonias / cepas utilizando los sistemas apropiados.

x

Se obtienen 4 clases (y números) de colonias: Colonias típicas confirmadas / identificadas como pertenecientes al organismo objetivo (verdaderos positivos). Colonias atípicas confirmadas / identificadas como pertenecientes al organismo objetivo (falsos negativos). Colonias típicas confirmadas / identificadas como no pertenecientes al organismo objetivo (falsos positivos). Colonias atípicas confirmadas / identificadas como no pertenecientes al organismo objetivo (verdaderos negativos).

x i

10 Varianza

( x i  x  s2 

2

n1 Varianza operativa relativa u02 

s2  x

x2 Índice de dispersión de Poisson (para 10 replicados, r−1= 9)

 r21



x i2  x i x i

10

Se comparan (empleando las tablas estadísticas apropiadas) el valor 2

observado de  r 1 A los límites teóricos de la distribución  2 con 9 grados de libertad con: Valores críticos al 5%

 r21;0,05 Valores críticos al 1% 2 observado de  r 1;0,01

Incertidumbre del recuento UN ANALISTA Se calcula para cada placa, la suma (x1 + x2) y la diferencia (x1 – x2) de ambos recuentos replicados. La varianza relativa de cada par de recuentos (x1 y x2) es: 2

 x1  x2    x1  x2 

2

u rel,L  2 

La estimación media de la varianza del recuento personal (un analista) es la media aritmética de las varianzas relativas de los diferentes pares de recuentos. Su raíz cuadrada (urel,L) × 100 (expresada en %) es la incertidumbre estándar de la repetibilidad de recuento para esta persona. N ANALISTAS Para cada placa, se calcula la varianza relativa: s 2 u rel,L  m donde m y s son, respectivamente, la media aritmética y la desviación típica de los N valores replicados (correspondientes a los N analistas) para la misma placa. La estimación media de la varianza de recuento relativa es la media aritmética de las varianzas relativas de las diferentes placas. La raíz cuadrada (urel,L) × 100 (expresada en %) de la media aritmética de las varianzas relativas de todas las placas es la incertidumbre de recuento intralaboratorio estimada.

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Características de funcionamiento de categorías Resultados

SENSIBILIDAD a / (a + b) ESPECIFICIDAD d / (c + d) TASA DE FALSOS POSITIVOS c / (a + c) TASA DE FALSOS NEGATIVOS b / (b + d) SELECTIVIDAD a / (a + b + c + d) EFICIENCIA (a + d) / (a + b + c + d)

Repetibilidada 1) Si el valor observado

 r21

  r21;0,05

la dispersión no difiere significativamente de aquella prevista por la distribución de Poisson.

Incertidumbre del recuento UN ANALISTA El valor ideal de urel,L es < 0,02 pero se aceptan los valores < 0,1. Si los valores son > 0,1, se examinan los valores 2 individuales de u rel,L a fin de

encontrar las causas.

2) Si  r21;0,05 < observado N ANALISTAS Los niveles aceptables varían  r21   r21;0,01 dependiendo no solo del la dispersión es método sino también del significativamente superior número de analistas. No a la prevista por la obstante, un valor guía para distribución de Poisson. múltiples analistas es 0,1. 3) Si  r21;0,01 < observado

 r21 la dispersión es muy significativamente superior a la prevista por la distribución de Poisson. Consultar los ejemplos de caracterización primaria a

Véase el ejemplo práctico en Véase el ejemplo práctico en Véanse los ejemplos prácticos el apartado 6.2.5 el apartado 6.4.2 en los apartados 6.7.3 (un analista) y 6.7.4 (varios analistas)

Para los métodos de NMP, debería seleccionarse un rango apropiado basado en el diseño específico del procedimiento NMP (número de tubos/pocillos/diluciones).

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Anexo A (Informativo) Modelos matemáticos de variación

A.1 Generalidades La variación aleatoria del número de partículas entre dos porciones de ensayo paralelas es considerable incluso si la suspensión está perfectamente homogeneizada (completamente aleatoria) y no se tienen en cuenta incertidumbres técnicas de la medida. Esta variación intrínseca inevitable es una propiedad de las suspensiones y es la misma para todos los métodos de recuento microscópicos y de recuento de colonias. La variación puede ser objeto de modelización matemática por la distribución de Poisson. La distribución de Poisson no describe completamente la variación intrínseca de los recuentos NMP.

A.2 Precisión intrínseca de los recuentos de colonias La varianza de la distribución de Poisson es igual a la media. La igualdad de la media y de la varianza no demuestra que los datos sigan una distribución de Poisson, pero la disparidad es una prueba de que no la siguen. La compatibilidad se verifica tradicionalmente mediante la utilización del índice de dispersión de Poisson  r21 o el coeficiente estadístico de relación logarítmica de verosimilitud G2 (véanse también los anexos C y D). La varianza relativa de la distribución de Poisson está en relación inversa respecto al recuento medio, o más generalmente al recuento total, de colonias en el detector. Esto significa que con métodos de recuento de colonias, la precisión no es una característica de funcionamiento constante. La incertidumbre relativa intrínseca puede reducirse incrementando el número de colonias.

urel 

s x 1 1    x x x x

u

rel 2



s2 x

2



x x

2



1 x

(A.1)

donde urel

es la desviación estándar relativa;

s

es la desviación estándar;

x

es el número de colonias observadas.

EJEMPLO 1 Un recuento de una sola placa procedente de una muestra de una suspensión perfectamente homogeneizada, es de por ejemplo 48 colonias, presenta una precisión relativa teórica de urel = 1/√48 = ± 0,14 (14%).

La dependencia de la precisión relativa (urel, desviación estándar relativa) respecto al recuento de partículas se ilustra en la figura A.1. La incertidumbre relativa aleatoria aumenta rápidamente en el momento que el recuento se reduce por debajo de veinte.

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Leyenda x Número de colonias observadas urel Desviación estándar relativa

Figura A.1 – Desviación estándar relativa (expresada en %) del número de colonias en una suspensión perfectamente homogeneizada que sigue la distribución de Poisson La gráfica muestra la razón por la cual números de colonias tales como 20, 25 o 30 han sido tradicionalmente considerados los recuentos mínimos estadísticamente fiables. En el rango de recuentos por debajo de 10, que resulta ser de considerable interés para la salud pública, las medidas individuales son tan imprecisas que difícilmente pueden ser caracterizadas como algo más que semicuantitativas. Sin embargo, la precisión relativa puede mejorarse llevando a cabo recuentos repetidos. EJEMPLO 2 Se inocularon cinco placas paralelas con porciones de ensayo de 1 ml procedentes de la misma muestra de laboratorio. El número de colonias contadas fueron: 6, 7, 11, 6, 9. Suma de recuentos: 6 + 7 + 11 + 6 + 9 = 39 Media de recuentos: 39/5 = 8 Precisión relativa teórica de urel = 1/√39 = ± 0,16 (16 %). La desviación estándar relativa teórica de una medida única de 8 colonias sería urel = 1/√8 = ± 0,35 (35%).

Puede utilizarse el modelo de Poisson para la estimación la incertidumbre estadística mínima teórica de cualquier recuento de colonias e inversamente para calcular el recuento mínimo teórico para alcanzar una precisión estadística estipulada (véase también el anexo B).

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A.3 Precisión intrínseca de los recuentos NMP A.3.1 Generalidades La precisión relativa de los métodos NMP depende, además del recuento en sí mismo, sino también de la selección del número de tubos paralelos. Se supone que la distribución de Poisson es válida en cada suspensión, pero la probabilidad de presencia-ausencia de las reacciones positivas se suma a la variabilidad intrínseca.

A.3.2 Sistema NMP con dilución única La precisión relativa de una serie de diluciones únicas de nt tubos en términos de desviación estándar en la escala de logaritmos neperianos se expresa por la fórmula (A.2):

1  e  u(ln M )  x

(A.2)

x np e  x

La x es la fórmula representa el número más probable de organismos por tubo, que se estima mediante la fórmula (A.3).  nt x  ln   n t  np 

   

(A.3)

donde M

es el valor NMP;

x

es el número de organismos por tubo;

nt

es el número de tubos;

np

es el número de tubos positivos.

NOTA Las fórmulas A.2 y A.3 pueden combinarse, lo que da lugar a una fórmula que muestra que la precisión relativa está completamente definida por el número total de tubos y el número de tubos positivos.

u rel ( M )  u ln( M ) 

1



nt

 nt

 np

ln 

  





np

nt nt  np



La figura A.2 ilustra la forma en la que la precisión relativa (logarítmica) de una estimación NMP varía en función del número de tubos positivos.

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Leyenda np Número de tubos positivos urel Desviación estándar relativa

Figura A.2 – Desviación estándar relativa (expresada en %) de un ensayo NMP de dilución única con 50 tubos paralelos La figura 2 muestra que la precisión relativa de las estimaciones de NMP presenta un mínimo cuando el 80% de los tubos son positivos. Conforme a las fórmulas (A.2) y (A.3), la mejor precisión que puede alcanzarse (menor desviación estándar relativa) es, por consiguiente, función del número de tubos paralelos, de acuerdo a la fórmula (A.4): umin (ln M ) 

1,24 nt

(A.4)

La incertidumbre de una estimación NMP no puede ser inferior a este valor. Cuando la proporción de positivos difiere del 80%, la incertidumbre estándar relativa se hace más grande, aunque tal y como muestra la figura A.2, existe un parte relativamente larga casi plana de la curva de precisión que se extiende entre el 60% y el 95% de positivos.

A.3.3 Sistema NMP con diluciones múltiples A.3.3.1 Precisión “exacta” Con recuentos NMP de diluciones múltiples la precisión relativa toma la forma de una curva ondulada. Existen tantos valores mínimos locales como niveles de dilución en el detector. A modo de ejemplo, se calculó la desviación estándar relativa para el detector NMP 3 × 10 tubos. Los valores mínimos se producen cuando la primera, segunda y tercera serie de tubos paralelos alcanzan sucesivamente el 80% de positivos.

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Leyenda np Número de tubos positivos urel Desviación estándar relativa

Figura A.3 – Desviación estándar relativa (expresada en %) para un detector NMP de 3 × 10 tubos El eje horizontal representa el número de tubos positivos en la serie completa. La curva ondulada muestra la desviación estándar relativa calculada. La precisión relativa de un recuento NMP con dilución múltiple depende en gran parte del número de tubos paralelos por dilución. No obstante, las diluciones no están totalmente exentas de efecto. A título de ejemplo, la figura A.3 muestra que el mínimo más bajo (el primero de los observados) para los sistemas NMP 3 × 10 tubos presenta un valor de 0,350 (35%) mientras que la desviación estándar relativa mínima para un sistema NMP de dilución única de diez tubos, conforme a la ecuación A.4, es de 0,392 (39%). A.3.3.2 Precisión característica aproximada Cochran propuso una desviación estándar constante aproximada para el rango completo NMP. Según la ecuación de Cochran, la precisión de la estimación NMP en escala logarítmica depende simplemente del número de tubos por dilución (nt) y del factor de dilución (f) entre diluciones consecutivas. s lg( M )  0,58

lg f nt

(A.5)

La constante 0,58 fue elegida “de visu” para diluciones decimales. Si el factor de dilución entre diluciones es menor de 10, entonces puede utilizarse la constante 0,55.

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En la figura A.3 la aproximación de Cochran viene indicada por la línea horizontal. Se aprecia que el resultado exacto se desvía más de la aproximación cuando la mayoría de los tubos de la serie son negativos. La desviación estándar de cualquier valor individual de NMP se calcula fácilmente en la actualidad mediante un programa informático apropiado. A pesar de su naturaleza aproximativa, la fórmula de Cochran resulta de utilidad en las planificaciones experimentales y las comparaciones de métodos (véase el ejemplo a continuación). Proporciona una idea de la precisión característica de un sistema NMP. EJEMPLO

En el supuesto de una determinación basada en un sistema de detección NMP de 3 × 32 pocillos en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Suponiendo además un factor de dilución de f = 3 entre diluciones consecutivas. La desviación estándar de Ig NMP, conforme a la fórmula de aproximación de Cochran es s lg( M )  0,55

lg3 32

 0,55 0,014 9  0,067

La conversión a la escala de logaritmos neperianos da lugar a u ln(M) = 2,303 × 0,067 = 0,155, es decir una precisión relativa de aproximadamente el 15%.

A.4 Sobredispersión A.4.1 Generalidades En el modelo de Poisson, se asume la ausencia de cualquier incertidumbre técnica y de otras incertidumbres adicionales asociadas al procedimiento. Sin embargo, la preparación de la suspensión inicial, la dilución, la inoculación, la incubación y el recuento de las colonias no están totalmente exentos de incertidumbre. Cada etapa técnica contribuye a la variabilidad total de la medida. Las determinaciones en paralelo que implican el procedimiento analítico completo no siempre cabe suponer que sigan la distribución de Poisson. La sobredispersión, es decir, la variación que supera la variación totalmente aleatoria (en el sentido de Poisson), puede observarse entre las determinaciones en paralelo. Esta variación adicional es parcialmente dependiente del método. Otro factor que provoca una variación superior a la de Poisson es el empleo de una confirmación parcial. La sobredispersión debida a la confirmación parcial depende de la muestra y del número y tipo de colonias seleccionadas para la confirmación, no del método en sí mismo. Este factor forma parte de la incertidumbre de la medida (véase la Norma ISO 29201[15]). Por estas razones, la sobredispersión es el estado normal de los resultados de los ensayos microbiológicos y la distribución de Posisson constituye una aproximación simplificada. No obstante, el modelo de Poisson funciona en ocasiones. Esto ocurre cuando la incertidumbre debida a la variación intrínseca es muy grande a causa a los bajos recuentos. En estos casos las incertidumbres técnicas son ínfimas en comparación.

A.4.2 Modelo binomial negativo Las causas habituales de sobredispersion, aparte de los errores espurios, tienen unos efectos que son aproximadamente proporcionales a la media o realmente al número de colonias. Previamente se han descrito otras razones para el mismo patrón de sobredispersión. Como la precisión intrínseca debida a la distribución aleatoria de las partículas en la suspensión sigue la distribución de Poisson, la varianza total puede expresarse de la manera siguiente:

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s 2  x  u02 x 2

(A.6)

donde

x

es el número medio de objetos (partículas, colonias…) contados;

u0

es la sobredispersión, la desviación estándar operacional relativa.

La primera parte de la varianza se debe a procesos de Poisson y el resto es debido al efecto combinado de todos los factores de sobredispersión aleatoria. Una distribución estadística con este modelo de varianza se denomina distribución binomial negativa (otras denominaciones son distribución Gamma Poisson y distribución de Pascal). La desviación estándar relativa de la distribución es: urel 

1  u02 x

(A.7)

La figura A.4 muestra el efecto de diferentes grados de sobredispersión sobre la precisión relativa total (desviación estándar relativa).

Leyenda x Número medio de colonias urel

Desviación estándar relativa

Figura A.4 – Efecto de la sobredispersión sobre la precisión relativa total (desviación estándar relativa expresada en %)

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Curva inferior: modelo de Poisson sin sobredispersión; curvas superiores: binomial negativa con 15% y 30% de sobredispersión (variación adicional moderada u0 = 0,15 y 0,30). El número medio de colonias requerido para alcanzar una precisión relativa total dada es considerablemente mayor en una situación de sobredispersión que en el caso totalmente aleatorio (Poisson). El número medio de colonias x requerido puede calcularse a partir de la fórmula A.7. EJEMPLO

Para alcanzar la desviación estándar relativa urel2 = 0,2 cuando la sobredispersión es u0 = 0,15, conforme a la fórmula A.7, el número de colonias x = 1/(0,22 – 0,152) = 1/(0,04 – 0,022 5) = 57. La misma precisión se alcanza en una situación totalmente aleatoria (Poisson) con el número de colonias x = 1/0,22) = 1/0,04 = 25.

NOTA Queda claro que una precisión total inferior a la sobredispersión no puede alcanzarse con una sola determinación. El procedimiento completo podría repetirse en caso de que se requiriera una mejor precisión. Con r determinaciones paralelas la desviación estándar relativa puede estimarse de manera aproximada a partir de la fórmula siguiente

x  u

1 rel

2

u

0

2

donde

x

es el número total de colonias registradas;

u0

es la sobredispersión, la desviación estándar operacional relativa.

A.5 Detección de la sobredispersión La existencia de una desviación estadísticamente significativa respecto a la distribución de Poisson puede verificarse aplicando el índice de dispersión de Poisson sobre una serie de recuentos paralelos.

 r21



r

ni2   ni  ni

2



ni2  n i ni

r

(A.8)

o mediante el correspondiente coeficiente estadístico de relación de verosimilitud, que puede ser calculado a partir de:

 Gr21  2   

  ni ln ni     ni  ln   

ni    r  

(A.9)

donde, para ambas fórmulas: r

es el número de observaciones paralelas;

ni

es la observación iésima (i = 1…r).

Teóricamente, los dos índices siguen (asintóticamente) la distribución de chi-cuadrado, lo que permite extraer conclusiones estadísticas sobre la presencia de una sobredispersión (o una infradispersión).

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NOTA El término infradispersión indica una correspondencia “muy próxima” de recuentos paralelos. Existen algunas razones naturales que lo explican. Puede producirse cuando las porciones de ensayo consumen una gran parte de la suspensión de ensayo. También se ha observado que ocurre cuando el analista sabe que placas pertenecen a la misma serie paralela y, al conocerlo, aproxima los recuentos de unas y otras de forma voluntaria o inadvertida. La infradispersión desaparece si las placas se codifican de forma ciega y se mezclan con el resto de placas para el recuento.

A.6 Cuantificación de la sobredispersión A.6.1 Método 1 de Anscombe El primer método de Anscombe es aplicable cuando se dispone de suficientes observaciones independientes de una misma muestra que permitan basar una estimación fiable de la varianza y la media. El método de Anscombe es adecuado para el rango de valores medios y varianzas operacionales relativas de interés en la utilización y evaluación de métodos de recuento de colonias. Este método consiste en resolver la fórmula (A.6) para u02 : u02 

s2  x x2

(A.10)

Para resultar eficiente, las observaciones deberían encontrarse en el rango óptimo de recuento. La media no debería ser inferior a 20. Esto es de aplicación especialmente cuando el objetivo es la estimación de la variabilidad operacional en un único experimento. Si se dispone de varios experimentos, se tendrá precaución para verificar la variabilidad operacional procedente de los recuentos bajos.

A.6.2 Planteamiento por regresión Siempre que se disponga de observaciones paralelas de la misma muestra, es posible calcular una estimación de la varianza y de la media. Una solución, también basada en la fórmula (A.6), consiste en emplear los datos replicados procedentes de varias muestras. Resulta ventajoso que las medias cubran un amplio rango. Se recomienda la utilización de series con más de dos paralelos. Deberían estudiarse al menos treinta muestras. El cálculo del ratio entre la varianza y la media (K) a partir de varios juegos de replicados proporciona un número de pares ( x , K). La curva de regresión ajustada a estos datos proporciona una estimación de la varianza operativa relativa. La división de ambas partes de la fórmula (A.6) entre el número medio de colonias proporciona una ecuación de una recta. Su pendiente representa la varianza operacional relativa. 2 2

s 2 x  u0 x K   1  u02 x x x

(A.11)

La dispersión aleatoria es inevitablemente considerable si las estimaciones de la media y la varianza se basan en números pequeños de determinaciones paralelas. La ventaja de este planteamiento radica en basar la estimación de la sobredispersión en una gran selección de diferentes muestras. Conforme a la fórmula (A.11), la ordenada en el origen es previsible que tenga el valor 1. Es posible que este no sea el caso cuando la ecuación de regresión ha sido ajustada. Una ordenada en el origen es significativamente superior a 1 indica sobredispersión al nivel del detector, es decir, en las suspensiones de ensayo.

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NOTA La fórmula A.11 se aplica únicamente cuando la media se basa en números de colonias (o de partículas) no transformados. Los factores de dilución y/o logaritmos no se utilizan.

A.6.3 Planteamiento basado en el índice de dispersión (χ2 o G2) El cálculo de índice de dispersión de determinaciones paralelas se aplica de forma sistemática para fines de aseguramiento de la calidad en muchos laboratorios. En consecuencia, es posible disponer de forma automática de grandes cantidades de datos de precisión adecuados para el cálculo de la sobredispersión. El tercer método de estimación emplea este tipo de datos. La relación entre la media, la varianza y el índice de dispersión es la siguiente:

 n21 

s2  n  1 x

(A.12)

El ratio de la varianza respecto a la media multiplicado por los grados de libertad proporciona el valor del índice (de Poisson) de dispersión. El valor del correspondiente coeficiente estadístico de relación logarítmica de verosimilitud G2(n-1) puede legítimamente reemplazarle. La división de las dos partes de la fórmula (A.12) entre los grados de libertad (n-1) proporciona el ratio de la varianza respecto a la media.

K

 2n1   n 1



s2 x

(A.13)

Asumiendo que el modelo binomial negativo es la descripción más probable de la variación estadística de las determinaciones paralelas, es posible incorporar el valor del ratio de la varianza respecto a la media indicado en la fórmula (A.11): K

s2  1  u02 x x

(A.14)

Despejando la varianza operativa relativa y resolviendo, se obtiene: u02 

K 1 x

(A.15)

La media de muchas estimaciones (respetando el signo algebraico) de varianzas operacionales relativas a partir de diferentes muestras proporciona un valor para una constante de sobredispersión general. En este planteamiento, se da por hecho que las suspensiones de ensayo siguen la distribución de Poisson (véase A.6.2).

A.6.4 Sobredispersión al nivel del detector Habitualmente se observa que los recuentos paralelos a partir de una sola suspensión pueden variar más de lo previsto por la distribución de Poisson. A este nivel, la sobredispersión está causada por errores en el manejo de la pipeta, a la incertidumbre del recuento y a errores espurios (“accidentales”), y posiblemente a propiedades de la muestra y condiciones de incubación. La sobredispersión al nivel del detector constituye una útil medida de aseguramiento de la calidad. También depende hasta cierto punto del método. Puede detectarse por los índices de dispersión (χ2, G2) (véase A.6.3).

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Anexo B (Normativo) Evaluación de los límites inferiores

B.1 Generalidades Los límites de trabajo inferiores de los métodos microbiológicos dependen en gran parte de la definición de los mismos. A concentraciones muy bajas de partículas, todos los métodos microbiológicos se convierten esencialmente en métodos de detección. El nivel teórico de detección física para todos los métodos es una partícula del organismo objetivo en la porción de ensayo o en el sistema de detección, tal como el NMP. Dado que los analitos microbiológicos se componen de partículas, existe una posibilidad estadística distinta para que un microbio se encuentre ausente de una porción de ensayo aun cuando esté presente en la muestra de laboratorio. El nivel de detección se define como la concentración mínima de analito que puede ser detectada de forma fiable (95% de probabilidad de un resultado positivo). El recuento que es conforme a esta definición es, de media, 3 partículas por volumen de material sometido a ensayo (véase una información detallada en el capítulo B.2). El nivel de detección es una propiedad de las suspensiones y es la misma para todos los métodos de recuento de colonias y de NMP. De forma alternativa, cuando es posible determinar una desviación estándar relativa consensuada, puede utilizarse el límite de determinación. Este corresponde a la concentración mínima de analito para la que la desviación estándar relativa es igual a un determinado límite específico (véase también el capítulo B.3). Para los métodos de recuento de colonias, la Norma ISO 8199 menciona un límite de determinación de 10 partículas por porción de ensayo, correspondiente a una desviación estándar relativa de aproximadamente el 32%, en una situación totalmente aleatoria (Poisson).

B.2 Nivel de detección basado en la probabilidad B.2.1 Modelo de Poisson La probabilidad de un resultado positivo p(+) cuando prevalece la distribución de Poisson puede calcularse a partir de la fórmula siguiente: p(  )  1  e  x

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(B.1)

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Resolviendo la fórmula para x se obtiene: x   ln 1  p   

(B.2)

donde e

es la base de los logaritmos neperianos;

x

es el número de partículas por porción analítica.

Una definición usual del nivel de detección es la concentración a la cual la probabilidad de detectar la presencia del analito es igual a 95% [p(+) = 0,95]. Según la ecuación x = -ln(1-0,95) = 3,0. Por consiguiente, para un recuento medio de 3 (partículas por porción de ensayo), las posibilidades de detectar la presencia del analito son iguales a 0,95 (a condición de que prevalezca la distribución de Poisson). El nivel de detección es una propiedad de las suspensiones y no distingue ente un método y otro. El nivel de detección es el mismo para todos los métodos de recuento de colonias.

B.2.2 Métodos NMP Para el nivel de detección de métodos NMP, es posible aplicar el mismo razonamiento que en el caso de los métodos de recuento de colonias. La probabilidad de detección del analito en los sistemas NMP viene dado por la fórmula (B.1). Independientemente de la configuración geométrica, se necesita el mismo número medio de partículas en el sistema para garantizar la detección del analito con una probabilidad seleccionada.

B.2.3 Modelo binomial negativo de sobredispersión El nivel de detección, cuando se define en términos de probabilidad, también puede calcularse a partir de la probabilidad de un resultado negativo. Citando a Anscombe, pero reemplazando los símbolos por los utilizados en este documento, la probabilidad de un resultado negativo (probabilidad de un cero) viene dada por la fórmula (B.3):



p(  )  1  u02 x



1/u02

(B.3)

La resolución de esta ecuación para x proporciona el nivel de detección cuando la probabilidad (frecuencia relativa) de negativos y la varianza operativa relativa han sido indicadas.

x

p(  )

 u02

1

u02

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(B.4)

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Como se desprende de la figura A.4 (A.4.2), el nivel de detección está poco influido por una sobredispersión moderada (véase el ejemplo indicado a continuación). EJEMPLO La concentración bacteriana requerida para alcanzar un 95% de probabilidad de un resultado positivo en una situación de sobredispersión depende de la varianza operativa relativa. Se asume una desviación estándar operacional relativa u0 = 0,30. La sustitución directa de la probabilidad de un resultado negativo p(-) = 1 – p(+) = 1 -0,95 = 0,05 en la fórmula (B.4) resulta en x = (0,05-0,09 -1)/0,09 = 3,44. En este caso, la estimación correspondiente con la distribución de Poisson (sin sobredispersión) sería x = -ln(0,05) = 3,00 (véase B.2.1). NOTA No cabe duda de que algunas causas de sobredispersión podrían también afectar a los resultados NMP paralelos. Actualmente no parecen estar disponibles datos experimentales o modelos matemáticos para un caso de sobredispersión NMP.

B.3 Límite de determinación basado en la precisión B.3.1 Generalidades La concentración media necesaria para una incertidumbre relativa especificada puede calcularse resolviendo las fórmulas de precisión para el número de colonias.

B.3.2 Modelo de Poisson La resolución de la fórmula (A.1) para el número de colonias dado x

1 2 urel

(B.5)

donde x

es el número de colonias observadas en el sistema de detección;

urel

es la precisión relativa objetivo (desviación estándar relativa).

EJEMPLO

En una situación totalmente aleatoria (Poisson), una precisión relativa del 20% se alcanza cuando el número de colonias observado en el sistema de detección es igual a x = 1/0,22 = 1/0,04 = 25.

B.3.3 Modelo binomial negativo La resolución de la fórmula (A.7) para el número de colonias dado x

1 2 urel  u02

donde

x

es el número de colonias observadas en el sistema de detección;

urel

es la precisión relativa objetivo;

u0

es la desviación estándar operacional relativa.

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(B.6)

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EJEMPLO

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Para alcanzar la desviación estándar relativa urel = 0,2 cuando la desviación estándar operacional relativa es u0 = 0,2 se requiere, conforme a la fórmula B.6, el número de colonias medio x = 1/(0,22 – 0,152) = 1/(0,04 – 0,0225) = 1/0,017 5 = 57. (Compárese con el ejemplo del apartado B.3.2).

B.3.4 Niveles de detección según el diseño Con independencia de la técnica de análisis, método u organismo objetivo, el nivel de detección definido en términos de probabilidad varía muy poco. Solo los niveles extremos de sobredispersión podrían modificar el panorama ligeramente. Los ejemplos presentados anteriormente muestran que, por ejemplo una probabilidad del 95% de detección del objetivo requeriría aproximadamente 3 partículas del analito por porción analítica, de media. La porción analítica en este caso corresponde al volumen total de la suspensión de ensayo sembrada en el detector. Un método que puede manejar una porción de ensayo de 100 ml tiene un 95% de probabilidad de detección del objetivo (5% de probabilidad de no detectarlo) cuando el número medio es aproximadamente tres en la porción de ensayo. Otro método que únicamente pueda manejar una porción de ensayo de 10 ml, solo puede detectar el analito con la misma probabilidad a la densidad media de treinta por 100 ml. Estos niveles de detección dependientes del diseño varían entre métodos. Es posible dudar de la validez de un método para un propósito determinado si está estructuralmente limitado de forma que la probabilidad de detección no es suficiente para las concentraciones habitualmente encontradas.

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Anexo C (Normativo) Evaluación del límite superior

C.1 Generalidades El número de organismos objetivo por porción de ensayo cuando la linealidad empieza a deteriorarse se considera como el límite superior del método. El concepto de linealidad significa una relación lineal entre el resultado observado y la concentración del analito. En contextos microbiológicos, la linealidad significa que existe una respuesta lineal entre el recuento y el volumen de la porción de ensayo. Generalmente, la linealidad es buena en los niveles bajos de la escala de trabajo, cerca del nivel de detección.

C.2 Evaluación estadística del límite superior Los cálculos estadísticos se basan en el procedimiento que utiliza el índice G2: Suponiendo n recuentos de colonias x1, x2,…, xn obtenidos a partir de un estudio sobre una misma suspensión de ensayo en volúmenes o diluciones referenciadas como R1, R2,.., Rn. La estimación de la relación logarítmica de verosimilitud de la proporcionalidad (linealidad) de los recuentos puede calcularse a partir de la fórmula siguiente:

 x x x Gn21  2  x 1 ln 1  x 2 ln 2  ...  x n ln n  R1 R2 Rn  

  x   ln  R     

x 

(C.1)

Puede obtenerse un valor de orientación con la referencia de las tablas de χ2 con n-1 grados de libertad. Los valores que superan el valor tabulado indican una desviación de la proporcionalidad al nivel de probabilidad escogido. El número de gérmenes por porción de ensayo cuando se pierde la linealidad puede considerarse como el límite superior. NOTA La linealidad es un aspecto de la veracidad. La desviación respecto a la linealidad se incrementa gradualmente conforme crece el número de colonias.

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Anexo D (Normativo) Determinación de la variabilidad operacional en las condiciones de repetibilidad y de reproducibilidad intralaboratorio

D.1 Caso general: evaluación estadística en un experimento de repetibilidad En el apartado 6.4.2.2 se presenta un ejemplo práctico con el número requerido de datos. Si se incluyen más datos en el experimento de repetibilidad, pueden utilizarse las tablas D.1 y D.2 y las fórmulas de la (D.1) a la (D.3). Tabla D.1 – Tabulación de los recuentos en un experimento de repetibilidad Medidas repetidas n1 a)

n2

…

ni

Detección de la sobredispersión por aplicación del índice de dispersión de Poisson a cada serie de recuentos paralelos.

 r21



r

 ni2    ni   ni

2



 ni2  n i  ni

r

(D.1)

donde r

es el número de observaciones paralelas;

ni

es la iésima observación (i = 1…r).

Teóricamente, el índice de dispersión de Poisson sigue (asintóticamente) la distribución chi-cuadrado que permite extraer conclusiones estadísticas sobre la presencia de sobredispersión (o infradispersión). b) Continuar la comparación entre el valor de  r21 observado y los límites teóricos de la distribución de χ2 con r-1 grados de libertad. Para una evaluación de una cola, los límites teóricos son: – Valor crítico al 5%:  r21;0,05 – Valor crítico al 1%:  r21;0,01 c)

Dependiendo de la posición del valor observado  r21 en relación a los límites de teóricos, se determina para cada serie analítica la significación de la dispersión observada en relación a la prevista por la distribución de Poisson.

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Tabla D.2 – Evaluación estadística de la serie de datos en un experimento de repetibilidad Caso

2 Posición del  r 1 observado en relación a los límites teóricos

Conclusiones de la diferencia entre la dispersión observada y la dispersión prevista por la distribución de Poisson

1

2 2 observado  r 1   r 1;0,05

La dispersión no es significativamente diferente a la prevista por la distribución de Poisson

2

2 2  r21;0,05 < observado  r 1   r 1;0,01

La dispersión es significativamente superior a la prevista por la distribución de Poisson

3

 r21;0,01  observado  r21

La dispersión es muy significativamente superior a la prevista por la distribución de Poisson

Si se observan los casos 2 o 3, la varianza operativa relativa u20 se calcula utilizando el primer método de Anscombe. u02 

s2  x x2

(D.2)

donde s2

es la varianza de las observaciones paralelas;

x

es la media aritmética de las observaciones paralelas.

Si se produce el caso 1, u02 no es significativamente diferente a 0. Para una evaluación global, puede utilizarse la varianza operativa relativa calculada tal y como se ha descrito anteriormente. Para que las observaciones sean eficaces, estas deberían llevarse a cabo dentro del rango óptimo de recuento. La media no debería ser inferior a 20. Esto es de aplicación especialmente si el objetivo es estimar la variabilidad operacional para un único experimento. Si se dispone de varios experimentos, hay que prestar atención para verificar los valores de variabilidad operacional obtenidos a partir de recuentos bajos. Una vez que las diferentes series de datos de repetibilidad han sido estadísticamente procesadas, se calcula la media aritmética de las diferentes varianzas operacionales relativas. Por consiguiente, la variabilidad operacional relativa media corresponde a las características de funcionamiento del método en cuanto a repetibilidad. La expresión final de la repetibilidad en porcentaje puede deducirse a partir de la siguiente fórmula: u0  u02  100

(D.3)

D.2 Caso general: evaluación estadística en un experimento de reproducibilidad intralaboratorio para un método de recuento de colonias En el apartado 6.4.3.1 se presenta un ejemplo práctico limitado (con un número restringido de datos). La tabla D.3 puede utilizarse para el tratamiento de los datos del experimento de reproducibilidad intralaboratorio.

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Tabla D.3 – Presentación tabulada de los recuentos de colonias en un experimento de reproducibilidad intralaboratorio Muestra nº

a)

Medidas

1

x11

x12

2

x21

x22

...

...

...

q

xq1

xq2

Se determina la varianza operativa relativa u02 utilizando el primer método de Anscombe para cada par de recuentos.

b) Se calcula la varianza operativa relativa media a partir de la serie de q pares de recuentos obtenidos a partir de las diferentes muestras sometidas a ensayo. La expresión final de reproducibilidad intralaboratorios, en %, es la raíz cuadrada de la varianza operativa relativa media, multiplicada por 100.

D.3 Caso general: evaluación estadística en un experimento de reproducibilidad intralaboratorio para métodos de NMP En el apartado 6.4.3.2 se presenta un ejemplo práctico. Pueden utilizarse las tablas D.4 y D.5 y las fórmulas de la (D.4) a (D.7) para el tratamiento de los datos del experimento de reproducibilidad intralaboratorio. Tabla D.4 – Presentación tabulada de los resultados NMP en un experimento de reproducibilidad intralaboratorio

Muestra

Medidas

Límite de confianza inferior

Límite de confianza superior

Límite de confianza inferior

Límite de confianza superior

Solapamiento de los intervalos de confianza en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio

M1

M2

T0,1

T1,1

T0,2

T1,2

1

M11

M12

T0,1,1

T1,1,1

T0,2,1

T1,2,1

si/no

2

M21

M22

T0,1,2

T1,1,2

T0,2,2

T1,2,2

si/no

...

...

...

...

...

...

...

…

q

Mq1

Mq2

T0,1,q

T1,1,q

T0,2,q

T1,2,q

si/no

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Tabla D.5 – Cálculo de la varianza operativa relativa para los resultados NMP Reproducibilidad intralaboratorio

Variabilidad intrínseca para el primer replicado

Variabilidad intrínseca para el segundo replicado

Variabilidad intrínseca media

Varianza operativa relativa

u R2 '1

ud21

ud22

ud2

u02

1

uR2 '1

ud21,1

ud22,1

ud2 ,1

2 u0,1

2

uR2 2

ud21,2

ud22,2

ud2 ,2

2 u0,2

...

...

...

...

...

...

q

uR2 q

ud21,q

ud22,q

ud22,q

2 u0,q

Muestra

uR2 '

ud21





 ln M1  ln M2  2

 ln T1,1  ln T0,1   2  1,96 

 

2



 ln T1,2  ln T0,2 ; ud22     2  1,96  

 

2

 

(D.5)

ud21  ud22 2

(D.6)

u02  uR2 '  ud2

(D.7)

ud2 

a)

(D.4)

2

Se determina la varianza operativa relativa u02 para cada par de recuentos.

b) Se calcula la varianza operativa relativa media a partir de la serie de q pares de resultados NMP obtenidos a partir de las diferentes muestras sometidas a ensayo. La expresión final u0 en condiciones de reproducibilidad intralaboratorios (en %) es la raíz cuadrada de la varianza operativa relativa media, multiplicada por 100.

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Anexo E (Normativo) Incertidumbre de recuento

E.1 Generalidades Los métodos no deberían ser excesivamente sensibles al operador. Los efectos del operador se incluyen en los ensayos de reproducibilidad (véase D.2) y en el estudio colaborativo de funcionamiento del método (véase el anexo F) utilizado para evaluar su precisión. Las estimaciones globales de la incertidumbre de la medida también incluyen los diferentes efectos debidos al operador (ISO 29201[15]). Resulta de utilidad evaluar los efectos claramente identificados atribuibles al operador. Los más importantes son las diferencias entre operadores a la hora de interpretar el recuento presuntivo. Las diferencias en la interpretación pueden estudiarse de forma efectiva mediante lecturas ciegas en paralelo de las colonias de la misma placa por el mismo operador o por diferentes operadores (véase E.2 y E.3). Esta operación debería producir estimaciones numéricas individuales o colectivas de la incertidumbre del recuento, expresada como desviación estándar relativa. La desviación estándar relativa calculada a partir de los resultados de diferentes personas es más informativa que la calculada a partir de recuentos duplicados realizados por una misma persona. (Una persona puede habitualmente repetir el recuento, aunque este sea inexacto, con considerable precisión.)

E.2 Determinación estadística de la incertidumbre de recuento de colonias y de lectura de NMP Se supone una placa con un número (desconocido), x, de colonias características, y se designa como x1, x2,…, xn los números observados durante el recuento de la placa repetidamente por parte de la misma persona o por diferentes personas. La incertidumbre de recuento, urel,L, se expresa como la desviación estándar relativa: urel,L 

s( x ) x

donde

 x i  x  sx  n-l

2

NOTA La misma fórmula elevada al cuadrado se utiliza para la determinación de la incertidumbre de lectura de NMP.

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(E.1)

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E.3 Incertidumbre individual (o personal) del recuento de colonias La estimación corresponde a un resumen de los resultados obtenidos por una persona leyendo dos veces la misma placa. La varianza relativa de cada par se calcula utilizando la fórmula (E.2):

2 urel,L

 x  x2   2 1   x1  x2 

2

(E.2)

La estimación media de la incertidumbre personal de recuento elevada al cuadrado es la media aritmética de las varianzas relativas de los pares de recuentos.

E.4 Incertidumbre intralaboratorio de recuento de colonias La media (cuadrática) de los resultados de varias personas de un mismo laboratorio que efectúan las lecturas de las mismas placas:

2 urel,L



2 2 2 urel,L1  urel,L2  ...  urel,Li

n

(E.3)

donde 2 urel,Li

es la varianza relativa de recuento de la placa iésima.

La media cuadrática se toma como la estimación de la incertidumbre relativa media de recuento elevada al cuadrado. Para una estimación fiable, n debería ser como mínimo 30.

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Anexo F (Normativo) Determinación de la variabilidad operacional (reproducibilidad interlaboratorios) en un estudio colaborativo de funcionamiento

F.1 Requisitos para un ejercicio de precisión interlaboratorios Es necesario llevar a cabo un estudio colaborativo de funcionamiento del método en el que participen varios laboratorios para evaluar el parámetro de precisión del método. El diseño estadístico del experimento se organiza con una serie de condiciones, tales como: – varios laboratorios (al menos 8), capaces de demostrar que el método de ensayo está bajo control, analizando las porciones de ensayo procedentes de la misma preparación o de una preparación en la cual los materiales de referencia son muestras del mismo lote; – deberían obtenerse un mínimo de tres series de muestras utilizando diferentes fuentes de organismos objetivo en cada una de ellas; – replicados (medidas repetidas) que demuestren que el método de ensayo está bien controlado dentro de un mismo laboratorio. Se requiere un mínimo de 2 determinaciones.

F.2 Caso general para los métodos de recuento de colonias – evaluación estadística para una serie dada de muestras F.2.1 Planteamiento para el cálculo La Norma ISO 5725-2[3] describe una estimación de la varianza de reproducibilidad utilizando el método de análisis de la varianza S R2  S L2  S r2 donde S L2 es la varianza debida al error interlaboratorios βi (error sistemático) y S r2 es la varianza del error de medida. Este planteamiento se aplica en química a los datos en continuo. El método de cálculo que se presenta en este apartado está adaptado para su empleo específico en el 2 2 recuento de colonias en microbiología. Las varianzas operacionales relativas u0,r y u0,R se estiman simultáneamente mediante un principio simplificado de un análisis de desviación basado en el índice de dispersión de Poisson. Véase la tabla F.1.

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Tabla F.1 – Presentación tabuladas de los recuentos de colonias en un ejercicio de reproducibilidad interlaboratorios Laboratorio

Medidas repetidas en cada laboratorio

1 2

x11 x21

x12 x22

x1p x2p

q

xq1

xq2

xqp

 r21

xi.

Desviación respecto a la distribución de Poisson

u02

2

g.d.l. asociados a  r 1 g.d.l. asociados a Τ1 Τ1

Significación de Τ1

A

g.d.l. asociados a Τ2 Τ2

Significación de Τ2

B

x ..

NOTA xij es la jésima medida repetida del laboratorio iésimo;

F.2.2 Determinación de la repetibilidad individual y global para los laboratorios a)

Se calcula para cada laboratorio: p

xi. 

El número total de colonias observadas

x ij ,

(F.1)

j 1

y, a continuación, el parámetro estadístico

 r21

x i.    p  x ij  p    x i. j 1 p

2



(F.2)

b) Se calculan los grados de libertad (g.d.l.) asociados a  r2-1 : p-1. c)

Se continúa comparando cada valor observado de  r2-1 con la distribución χ2 con p-1 grados de libertad.

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d) Se calcula finalmente para cada laboratorio el valor de u02 :

u02 

e)

2  p   r 1   1  xi.  p 1  

(F.3)

Se finaliza con el cálculo del parámetro estadístico global: q

T1 

 r21

(F.4)

i 1

f)

Se calculan los grados de libertad (g.d.l.) asociados a T1: q · (p-1).

g)

Tal y como se ha realizado previamente, se compara T1 con la distribución χ2 con q · (p-1) grados de libertad.

h) Según la posición de T1 con respecto a los límites teóricos, se determina la significación de la diferencia entre la dispersión global observada y la dispersión prevista por la distribución de Poisson. q

Se calcula finalmente

A

 ur2i

(F.5)

i 1

q

F.2.3 Determinación de la componente de variabilidad interlaboratorios a)

Se calcula el número total de colonias observadas (suma de todas las colonias de los diferentes laboratorios). q

Número total de colonias observadas

x .. 

x i

(F.6)

i 1

A continuación, se calcula el parámetro estadístico

 x ..   q  xi.  q   T2  x .. i 1 q



b) Se calculan los grados de libertad (g.d.l.) asociados a T2: q-1. c)

Se compara T2 con la distribución χ2 con q-1 grados de libertad.

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2

(F.7)

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d) Según la posición de T2 con respecto a los límites teóricos, se determina la significación de la diferencia entre la dispersión global observada y la dispersión prevista por la distribución de Poisson. B

Se calcula finalmente

 q  T2   1 x ..  q  1 

(F.8)

2 2 F.2.4 Determinación de los valores de u0,r y u0,R

Utilizando los valores generados en F.3.1 y F.3.2, pueden calcularse las dos componentes de la precisión, tal y como se muestra en la tabla F.2. 2 2 y u0,R Tabla F.2 – Determinación de los valores de u0,r

si A ≤ 0 si B ≤ 0

Si B > 0

si A > 0

2 tomar u0, r 0

2 A tomar u0,r

2 tomar u0,R  0

2 tomar u0,R  A

2 tomar u0, r 0

2 A calcular u0,r

2 B tomar u0,R

2  AB calcular u0,R

2 La expresión final de la reproducibilidad interlaboratorios, en %, es la raíz cuadrada de u0,R

multiplicada por 100.

F.3 Ejemplo práctico para el método de recuento de colonias F.3.1 Generalidades Se realizó un estudio colaborativo para determinar los parámetros de precisión de un nuevo método desarrollado para lectura en placa. En el estudio interlaboratorios participaron diez laboratorios. Cada uno de ellos llevó a cabo dos medidas repetidas en condiciones de repetibilidad. Véase la tabla F.3.

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Tabla F.3 – Recuentos en un ejercicio interlaboratorios (muestra única) Laboratorio

Medidas repetidas en cada laboratorio

Suma (x1+x2)

Media aritmética

Varianza

Valor observado de

Varianza operacional

 r21

relativa u 0

2

x1

x2

1

51

60

111

56

40,5

0,730

-0,005

2

37

21

58

29

128

4,414

0,118

3

58

63

121

61

12,5

0,207

-0,013

4

57

59

116

58

2

0,035

-0,017

5

35

42

77

39

24,5

0,636

-0,009

6

74

81

155

78

24,5

0,316

-0,009

7

75

73

148

74

2

0,027

-0,013

8

41

47

88

44

18

0,409

-0,013

9

98

81

179

90

144,5

1,615

0,007

10

53

56

109

55

4,5

0,083

-0,017

Suma

-

-

1 162

-

-

T1 = 8,470

0,029

Media

-

-

-

-

-

-

A = 0,003

F.3.2 Determinación de las dispersiones individuales y globales en condiciones de repetibilidad El primer paso consiste en la determinación de la significación de la varianza operativa relativa para cada serie de medidas repetidas, tal y como se menciona en el apartado F.2.2. La detección de un duplicado de laboratorio significativamente diferente del patrón general puede conducir a una investigación específica sobre el origen de estos valores singulares (valores descartados o aberrantes). Conforme a la distribución chi-cuadrado, el valor crítico, de una cola, con una probabilidad de 0,05, para (2-1) grados de libertad es: 3,842. Para la serie de datos presentados en la tabla F.3, solamente un duplicado de un laboratorio muestra un valor superior al valor crítico de probabilidad 0,05 (laboratorio 2). Podría realizarse una investigación sobre la causa de estos datos, a fin de evitar que se mantengan elementos erróneos o problemas técnicos en el conjunto de datos. Una etapa estadística adicional podría ser comparar el valor observado de  r2-1 en el laboratorio 2 con el valor crítico de probabilidad 0,01 para (2-1) grados de libertad (6,635). Como el valor observado de  r2-1 en el laboratorio 2 es inferior al valor crítico de probabilidad 0,01, puede considerarse que la dispersión del duplicado es únicamente dudosa y puede mantenerse para los cálculos posteriores. El segundo paso es la determinación de la varianza operativa relativa global en las condiciones de repetibilidad.

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La suma T1 de los valores observados de  r2-1 para el conjunto total de datos se calcula conforme a la fórmula (F.4). Para los 10 laboratorios, T1 es igual a 8,470. El grado de libertad asociado es igual a 10 × (2-1) = 10. Dado que el valor de T1 es inferior al valor crítico de probabilidad 0,05 de la distribución chi-cuadrado con 10 grados de libertad (18,307), la dispersión observada en condiciones de repetibilidad no es estadísticamente diferente de la dispersión prevista por la distribución de Poisson. Si bien no es estadísticamente significativa, la varianza operativa relativa media (A = 0,003) puede conservarse para cálculos posteriores.

F.3.3 Determinación de la dispersión interlaboratorios en condiciones de reproducibilidad El número total de colonias observadas (1 162) y la suma para cada laboratorio, según la tabla F.3, se utilizan para la determinación de la variación entre laboratorios El parámetro estadístico T2, que corresponde a la contribución de cada laboratorio sobre la variabilidad global, se calcula conforme a la fórmula (F.7). En el ejemplo práctico, T2 es igual a 105,694. El grado de libertad asociado es de (10-1) = 9. Dado que el valor de T2 es superior al valor crítico de probabilidad 0,05 de la distribución chicuadrado con 9 grados de libertad (16,919), la dispersión interlaboratorios observada es estadísticamente diferente de la dispersión prevista por la distribución de Poisson. A continuación se calcula la componente estimada de dispersión interlaboratorios, B, conforme a la fórmula (F.8). El valor correspondiente a la serie de datos presentados en la tabla F.3 es 0,093 (véase F.2.2).

F.3.4 Expresión final de los parámetros de precisión interlaboratorios del método El funcionamiento del método puede expresarse dependiendo de los valores A y B estimados anteriormente (véase también el apartado F.2.3), Como A > 0 y B > 0 para la serie de datos dada, la expresión final de los parámetros de precisión es la siguiente: 2 En condiciones de repetibilidad: u0,r = A = 0,003. 2 En condiciones de reproducibilidad: u0,R = A + B = 0,096. 2 La raíz cuadrada de u0,r (0,055) indica una variabilidad operacional del 5,5% (desviación estándar

operacional relativa) del método en condiciones de repetibilidad, mientras que la raíz cuadrada de 2 u0,R (0,310) indica una variabilidad operacional del 31,0% del método en condiciones de reproducibilidad.

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F.4 Ejemplo práctico para un método NMP Se organizó un estudio colaborativo para evaluar la precisión de un nuevo método desarrollado NMP. En el estudio interlaboratorios participaron doce laboratorios. Cada uno de ellos llevó a cabo dos medidas repetidas en condiciones de repetibilidad. Los valores NMP (NMP1 y NMP2) y sus límites de confianza (T0, T1) se presentan en la tabla F.4. Tabla F.4 – Resultados NMP en un ejercicio interlaboratorios (muestra única) Laboratorio

Medidas repetidas en cada laboratorio

Límite de confianza inferior

Límite de confianza superior

Límite de confianza inferior

Límite de confianza superior

M1

M2

T0,1

T1,1

T0,2

T1,2

Solapamiento de los intervalos de confianza en condiciones de repetibilidad

1

981,2

1 198,2

604,3

1 593,1

754,0

1 904,0

sí

2

1 247,5

1 154,2

787,9

1 975,3

723,8

1 840,5

sí

3

802,7

1 077,1

480,7

1 340,3

670,7

1 730,0

sí

4

438,5

792,4

232,4

827,4

473,6

1 325,7

sí

5

1 013,2

1 043,1

626,4

1 638,6

647,2

1 681,4

sí

6

916,4

1 351,1

559,5

1 501,1

858,6

2 126,0

sí

7

802,7

1 182,1

480,7

1 340,3

743,0

1 880,7

sí

8

744,6

1 247,5

440,6

1 258,3

787,9

1 975,3

sí

9

484,0

619,1

262,7

891,6

354,3

1 081,7

sí

10

1 014,9

1 351,1

627,6

1 641,1

858,6

2 126,0

sí

11

507,3

826,8

278,4

924,4

497,4

1 374,3

sí

12

597,9

583,0

339,8

1 052,0

329,7

1 031,0

sí

Un primer paso consiste en la verificación de la correspondencia entre los resultados obtenidos en condiciones de repetibilidad para cada laboratorio. Un solapamiento de los límites de los intervalos de confianza de las dos medidas repetidas dentro del mismo laboratorio representa un signo indicativo de una repetibilidad aceptable para el método nuevamente desarrollado. Cuando se observa alguna discordancia aislada (el intervalo de confianza de M1 no se solapa con el intervalo de confianza de M2), es recomendable investigar si hubiera podido producirse o no alguna anomalía (problemas analíticos dentro del laboratorio, condiciones de repetibilidad no respetadas…). Cuando se producen discordancias en una considerable proporción de laboratorios, el método evaluado puede ser considerado como no ideal en términos de repetibilidad. Cualquiera que sea el caso, puede realizarse una evaluación de la dispersión en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad utilizando un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) tras la transformación logarítmica de los datos. Es recomendable la utilización de logaritmos neperianos porque los resultados pueden ser directamente interpretados como varianzas relativas. Si se utilizan logaritmos decimales (base 10), se requiere una conversión en varianzas relativas mediante el empleo de la constante multiplicativa 5,302, conforme a la Norma ISO 29201[15]. Véase la tabla F.5.

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Tabla F.5 – Análisis de la varianza con un factor (transformación a logaritmo neperiano de NMP) Fuente de dispersión

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrática

Valor del test estadístico

SS

DF

MS

F

Entre laboratorios

SS,1 = 1,920

(q−1) = 11

MS,1 = 0,175

F1/3 = (MS,1/MS,3) = 2,917

Dentro de los laboratorios (replicados)

SS,3 = 0,716

q(p−1) = 12

MS,3 = 0,060

Total

SS,T = 2,636

(qp−1) = 23

El valor crítico de F, correspondiente a un nivel de significación del 5%, para 11 y 12 grados de libertad es de 2,717. El valor observado de F es superior al valor crítico. Por consiguiente, el error interlaboratorios es estadísticamente significativo. Conforme a la Norma ISO 5725-2[3], las estimaciones de S R2  S L2  S r2 donde S L2 es la varianza debida al error interlaboratorios βi (error sistemático) y S r2 es la varianza del error de medida.

S r2 = MS,3 = 0,060

S L2 = (MS,1 - MS,3)/p = (0,175 - 0,060)/2 = 0,058 S R2 = S L2 + S r2 = 0,058 + 0,060 = 0,118 En la medida en que se han utilizado logaritmos neperianos, S r2 corresponde a la varianza relativa en condiciones de repetibilidad. La variabilidad intrínseca de los resultados NMP (igualmente denominada incertidumbre de distribución relativa) se calcula a partir de los límites de confianza superior e inferior conforme a la Norma ISO 29201[15]. Véanse las fórmulas (F.9) y (F.10) y la tabla F.6.

ud21



 lnT1,1  lnT0,1   2  1,96 

 

2

ud22

y

 

ud2

u 

2 d1

 ud22



 lnT1,2  lnT0,2   2  1,96 



2

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   

2

(F.9)

(F.10)

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Tabla F.6 – Cálculo de la variabilidad intrínseca de los resultados NMP Variabilidad intrínseca para el primer replicado

Variabilidad intrínseca para el segundo replicado

Variabilidad intrínseca media

u d21

u d2 2

u d2

1

0,061

0,056

0,058

2

0,055

0,057

0,056

3

0,068

0,058

0,063

4

0,105

0,069

0,087

5

0,060

0,059

0,060

6

0,063

0,053

0,058

7

0,068

0,056

0,062

8

0,072

0,055

0,063

9

0,097

0,081

0,089

10

0,060

0,053

0,057

11

0,094

0,067

0,080

12

0,083

0,085

0,084

Laboratorio

Media

0,068

2 2 La media de ud2 se utiliza para la determinación de u0,r y de u0,R por sustracción:

2 u0,r  S r2  ud2

y

2 u0,R  S R2  ud2

(F.11)

La varianza operativa relativa en condiciones de repetibilidad es igual a la diferencia entre la varianza 2 relativa S r2 y la variabilidad intrínseca media de los resultados NMP: u0,r = 0,060 – 0,068 = – 0,008.

En condiciones de repetibilidad, la varianza operativa relativa del método NMP es próxima a cero. El solapamiento de los intervalos de confianza de todos los laboratorios constituyó una buena prueba de dispersión ideal en condiciones de repetibilidad. En este ejemplo, la expresión final puede ser u0,r = 0 %. 2  = 0,118 – 0,068 = 0,050. La varianza operativa relativa en condiciones de reproducibilidad es u0,R

Su raíz cuadrada corresponde a u0,R (0,224) indica una variabilidad operacional relativa (desviación estándar relativa) del 22,4% del método en condiciones de reproducibilidad.

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Anexo G (Informativo) Glosario de los principales símbolos

χ2

Distribución estadística utilizada para verificar la hipótesis de proporcionalidad de los recuentos

 r21

Índice de dispersión de Poisson

G2

Ensayo estadístico basado en la relación logarítmica de verosimilitud utilizado para la evaluación de la proporcionalidad

K

Relación de la varianza respecto a la media

M

Valor NMP para un sistema NMP con dilución única o múltiple

ni

iésima observación en una serie (i = 1…r)

np

Número de tubos positivos

nt

Número de tubos

p(+)

Probabilidad de un resultado positivo

p(–)

Probabilidad de un resultado negativo

r

Número de observaciones paralelas

Ri

Volumen relativo

s

Desviación estándar

s2

Varianza

slg(M)

Desviación estándar de NMP en la escala logarítmica decimal

sln(M)

Desviación estándar de NMP en la escala logarítmica neperiana

Si

Suma de recuentos

Σx

Número total de colonias registradas a partir de determinaciones paralelas

T0,i

Límite inferior del intervalo de confianza del 95 % para la iésima medida

T1,i

Límite superior del intervalo de confianza del 95 % para la iésima medida

T1

Suma de los valores observados de  r21 para la serie completa de datos durante un ejercicio interlaboratorios

T2

Contribución de cada laboratorio a la variabilidad global en un ejercicio interlaboratorios

2 udi

Variabilidad intrínseca de la iésima estimación NMP, incertidumbre de distribución relativa

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ud2

Media de la variabilidad intrínseca de las determinaciones NMP repetidas

ud2

Media de la variabilidad intrínseca de las determinaciones NMP para todos los laboratorios

u ln(M)

Precisión relativa de NMP

uminln(M)

Valor mínimo de la precisión relativa de las estimaciones NMP

u0

Desviación estándar operativa relativa

u02

Varianza operativa relativa, constante de sobredispersión

2 u0,r

Varianza operativa relativa en condiciones de repetibilidad

u0,r

Desviación estándar operativa relativa en condiciones de repetibilidad

2 u0,R

Varianza operativa relativa en condiciones de reproducibilidad

u0,R

Desviación estándar operativa relativa en condiciones de reproducibilidad interlaboratorios

urel

Desviación estándar relativa

2 u rel

Varianza relativa

2 urel,L

Varianza relativa de los recuentos, el cuadrado de la incertidumbre estándar relativa de los recuentos

urel,L

Incertidumbre estándar relativa de los recuentos

urel(M)

Desviación estándar relativa de M

u R2 '

Varianza de la reproducibilidad intralaboratorio

x

Un recuento, un número de entidades discretas (colonias, organismos, gérmenes…)

x

Número medio de elementos (partículas, colonias…) contados (media aritmética)

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