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• Xavier Quispe

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INMUNOHEMATOLOGÍA

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DEFINICIÓN: Es la parte de la hematología que estudia los procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos sanguíneos. Uno de los aspectos más importantes de la inmunohematología es el estudio y cuantificación de los grupos sanguíneos eritrocitarios que son componentes antigénicos presentes en la superficie de los hematíes, ya que se relaciona directamente con la terapéutica transfusional y la prevención de accidentes hemolíticos graves.



En primer termino se identificaron sobre los hematíes, pero luego se describieron determinantes antigénicos plaquetarios, leucocitarios y séricos.



Los genes determinantes de los grupos sanguíneos transmiten, generalmente, caracteres codominantes ( se expresan en homocigotos y heterocigotos).



Existen genes “amorfos” que no generan productos que puedan ser identificados como antígenos ( ej: gen d)



Todos los antígenos de los grupos sanguíneos han sido definidos serológicamente por la presencia de sus anticuerpos correspondientes.

Grupos Eritrocitarios y sus Antígenos GRUPOS SANGUÍNEOS

ANTÍGENOS MAS IMPORTANTES

ABO

A, B, AB, O

Rh

D, C, c, E, e

MNS

M, N, S, s, U

Lewis

Lea, Leb

P

P1, P2

Lutheran

Lua, Lub

Kell

K, k, Kpa, Kpb

Duffy

Fya, Fyb

Kidd

Jka, Jkb

Karl Landsteiner (1868-1943) GRUPOS SANGUÍNEOS 1900

LOS GRUPOS SANGUÍNEOS SON ALOGÉNICOS. 

La mayoría de los individuos desarrollan anticuerpos frente a los antígenos ABO alogénicos aunque no hayan sido expuestos a eritrocitos extraños; esta sensibilidad se debe al contacto con epítopes idénticos que casualmente expresan de forma rutinaria una gran cantidad de microorganismos.



Los anticuerpos frente a los antígenos ABO son muy frecuentes, lo que hace especialmente importante la verificación de los grupos del donante y del receptor antes de llevar a cabo una transfusión sanguínea.

SISTEMA ABO: GENÉTICA. Interacción con el sistema Hh 

Un sistema de grupo sanguíneo consiste en un locus génico que codifica un Ag de la superficie de las células sanguíneas (generalmente de los eritrocitos). En cada uno de los sistemas puede haber 2 o mas fenotipos. Por ejemplo, en el sistema ABO existen 4 fenotipos ( A, B, AB y O ), por lo tanto son posibles 4 grupos sanguíneos.



Un individuo con un determinado grupo sanguíneo es capaz de reconocer los eritrocitos que posean antígenos de un grupo sanguíneo alogénico y producir ANTICUERPOS contra ellos.







El locus ABO tiene tres alelos: A, B y O, y por el hecho de ser diploide todo individuo será portador de dos alelos. Los genes A y B son codominantes,y producen enzimas que actuan como transferasas específicas, capaces de transformar por glicocilación la SUSTANCIA H, presente en todos los hematíes en los ÁNTIGENOS A y B, mientras que el gen 0 es recesivo, no expresando ningún producto antigénico. Ello hace que existan seis genotipos diferentes (AA, AO, BB, BO, AB y OO) pero solo cuatro fenotipos posibles: A, B, AB y 0.

SISTEMA ABO: Genotipos posibles para cada Fenotipo. Grupo sanguíneo ( fenotipos)

Genotipos posibles

Antígenos

Anticuerpos séricos frente a ABO

Frecuencia (%)

A1 A2

A1A1 A1A2

A

Anti-B

45,56

A1 O A2 A2 A2 O B

BB BO

B

Anti-A

8,65

A1B A2B

A1B A2B

AyB

ninguno

3,57

O

OO

H

Anti-A y Anti-B

42,10

SISTEMA ABO: GENÉTICA   

Los genes A y B controlan la expresión de las sustancias A y B. El gen 0 se denomina “amorfo” por no corresponderle ningun antígeno. Sin embargo, los hematíes del grupo 0 expresan un “antígeno H”, que es reconocido por determinados antisueros y lectinas vegetales.

Sustancia precursora TIPO I

Gal

Glc-NAC

Gal

Unión 1,3

El precursor de TIPO I tiene una galactosa terminal (Gal) unida a una N-acetilglucosamina subterminal (GlcNac) por una unión 1,3.

Sustancia precursora TIPO II

GR

Gal

Glc-NAC

Gal

Unión 1,4

Los mismos azucares se unen mediante un enlace 1,4 en el precursor de TIPO II.

GR

Sustancia H TIPO I

Gal

Glc-NAC

Sustancia H TIPO II

Gal

GR

Fuc

Gal

Fuc

1,2 fucosiltransferasa

Gen H

Glc-NAC

Gal

GR

1,3 N-acetilgalactosaminiltransferasa

NAcGal

Gal

Glc-NAC

Gal

GR

ANTÍGENO A (TIPO II)

GR

ANTÍGENO B (TIPO II)

Fuc

1,3 galactosiltransferasa

Gal

Gal Fuc

Glc-NAC

Gal

SUBGRUPOS ABO  



Von Durgern y Hirszfeld en 1910 descubrieron estos subgrupos. Al observar que si al suero del grupo B se adiciona sangre del grupo A, hace perder su poder de aglutinación y así mismo podía continuar aglutinando otras sangres de los grupo A y AB. Así surgieron los subgrupos de estos grupos A1, A2, A1B y A2B.

Fenotipo Frecuencia

A1 80 %

Sustancia Precursora

H1 H2 H3 H4

A2 20 % H1 H2

GRUPO BOMBAY 







Los individuos con genotipo HH o Hh producen la enzima 1,2fucosiltransferasa que transforma la sustancia precursora en Sustancia H. Los individuios con fenotipo BOMBAY con genotipo hh no producen dicha enzima, por lo que no pueden modificar la sust. precursora, lo que hace que no puedan sitetizar SUSTANCIA H. Esto condiciona a que los genes del sistema ABO (si los tuviesen ) no pueden expresarse, por lo que parecen ser del grupo O. Presentan de manera constante además de anti-A y anti-B, un anticuerpo natural anti-H muy activo a 37ºC, capaz de hemolisar los hematíes de cualquier individuo que no sea de fenotipo BOMBAY.



El anti­AB producido en individuos de fenotipo O no es una mezcla de anti­A y anti­B, sino que se trata de un tercer anticuerpo que presenta reacción cruzada con un antigeno presente en los hematíes AB. Este antigeno se denomina “Antigeno C” o “Compuesto AB”.



Los títulos de anti­A y anti­B con frecuencia están disminuidos en pacientes ancianos y con hipogammaglobulinemia, por lo que puedo tipificar erróneamente cuando haga el GRUPO SERICO.



Los RN no producen títulos normales de anti­A y anti­B hasta los 3­6 meses de edad, alcanzando el titulo máximo entre los 5 a 10 años de edad.

Grupo sanguíneo

A

B

AB

O

Antígenos AyB

No antígenos

No anticuerpos

Anti-A y Anti-B

Glóbulos rojos

En la membrana En el plasma

Antígeno A

Antígeno B

Anti-B

Anti-A

SISTEMA RH 

En 1939 Levine descubre que una mujer embarazada forma anticuerpos contra un antigeno eritrocitario de su hijo, el Rh (D). Es asi como se descubre la existencia de ALOANTICUERPOS.



En 1940 Landsteiner y Weiner inyectaron glóbulos rojos de primates (Macacus rhesus) en conejos, luego extrajeron suero de los conejos inmunizados y observaron que aglutinaban el 85 % de los hematíes de los primates y el mismo porcentaje en humanos.

FISHER-RACE: 

Se heredan de cada progenitor 3 genes.



Situados en loci próximos.



Los alelos se designan: D y d, E y e, C y c.



Cada gen codifica para un Ag especifico: D, C, c, E , e.



La presencia o ausencia del Ag D determina si un individuo es Rh positivo o Rh negativo.

WIENER:  Herencia de un solo gen procedente de cada progenitor. 

Cada gen con una estructura de mosaico.



Ej.: El gen R1, codificaría factores que corresponden a C, D y e de la nomenclatura Fisher- Race; el gen r produciría los antígenos c y e pero no D, C, ni E.

Comparación de las nomenclaturas para los Ag del Sistema Rh Wiener

Fisher –Race

Rosenfield

Rho

D

Rh1

rh`

C

Rh2

rh”

E

Rh3

h`r

c

Rh4

hr”

e

Rh5

Fisher-Rice Fenotipos Rh

+

Genes CDE Cde cDE cDe

Rh

-

CdE Cde cdE cde

Características del Antígeno D  10.000

a 40.000 sitios D

 Ag de maduración eritroide  Polipeptidos membranales hidrófobos (28-32 Kda)  No están glicosilados ni fosforilados  Poseen residuos palmitilados y acilados  Asociados al citoesqueleto  Marcadores de línea celular



COMPLEJO RH



Polipéptidos Rh



Glicoproteína asociada Rh50



Otras glicoproteínas LW, GPB, CD47 y Banda 3

Complejo Rh

RhD

Antígeno D debil 

El antígeno Du aparece como un Rh(+) con ciertos antisueros y como Rh(-) con otros



El antígeno Du se transmite según las leyes de Mendel



Existen dos tipos de Du:  Alto

grado  Bajo grado (detectados sólo por absorción – elución)

Determinación de Ag D debil 

Coombs Indirecto



Enzimas proteolíticas



Técnicas en gel



Pruebas de absorción-elución (de referencia)

Importancia  Es especialmente importante su detección en los dadores de sangre (el antígeno Du es inmunógeno)  En las mujeres embarazadas (no debe aplicarse la gamaglobulina anti-D) Antígeno relativamente raro en la raza blanca

ANTICUERPOS anti-Rh 

   

Todos los anticuerpos del Sistema Rh provienen de una alo-inmunización por embarazo o transfusión. Son Aloanticuerpos Este sistema no posee anticuerpos naturales Clase IgG (IgG1 ó IgG3) no aglutinantes en salino (enzimas, TCI) No fijan complemento Excepcionalmente IgM fuertemente aglutinantes

El antígenos D es el mas inmunógeno. Los anticuerpos anti-Rh son clínicamente significativos. Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal

Reacción Transfusional

Especificidades Anti-D: es el mas frecuente. Puede causar RT y EHFN severa.  Anti-c: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN severa.  Anti-E: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN severa.  Anti-C: raramente solo; está presente en mezclas: antiC+D. Pueden provocar RT y EHFN.  Anti-Cw: puede causar RT y EHFN.  Anti-e: poco frecuente. Puede causar RT y EHFN. Especificidad encontrada frecuentemente como autoanticuerpos 

Asociación a enfermedades 

Los individuos con fenotipos Rh null padecen anemia hemolítica compensada.



Se ha observado una expresión reducida de los Ag Rh y mosaicismo Rh en leucemias, metaplasia mieloide, mielofibrosis y policitemia.



Los genes Rh y la esferocitosis hereditaria están ligados al cromosoma 1.



En poblaciones del sudeste asiático con ovalocitosis los antígenos del Rh están expresados débilmente.

Determinacion del fenotipo Rh 



 

En la practica clínica se dispone de para la tipificación del fenotipo Rh de : anti-D, anti-C, anti-c, anti-E y anti- e

Determinacion del genotipo Rh La identificacion del fenotipo no siempre permite la deduccion confiable del genotipo, me permite deducir el genotipo mas probable.

Frecuencias fenotipicas del Sistema Rh ANTIGENO Rh

Frecuencia ( %)

D (+)

85

D(-)

15

C

70

c

80

E

30

e

98

Otros grupos sanguíneos  





 

 

Sistema Kell: Los antigenos mas importantes de este sistema son: K, k , Kpa, Kpb, Kpc, Jsa y Jsb. Todos de importancia clínica. El anti- K es el anticuerpo irregulas mas común después del antiD, ya que puede causar severas reacciones transfusionales y EHFN. Es un anticuerpo del tipo IgG, que reacciona a 37 C por TCI. El anti- k fue encontrado por primera vez en una mujer cuyo bebe desarrollo EHFN. Tiene las mismas características del anti- K. Sistema Duffy. Sistema Kidd: Puede ocasionar EHFN y reacciones transfusionales hemoliticas. Sistema MNSs :EHFN y reacciones transfusionales hemoliticas. Sistema I/ i

FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUÍNEOS 

Hay diferentes formas de evidenciar una reacción Antígeno-Anticuerpo: AGLUTINACIÓN

RIA

HEMÓLISIS

ELISA

INHIBICIÓN

ABSORCIÓN Y ELUCIÓN

PRECIPITACIÓN 

Dado que los Ags eritrocitarios, se encuentran el la superfície de la células, las formas mas utilizadas para su estudio son: AGLUTINACIÓN y HEMÓLISIS.

ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN La aglutinación se produce en dos etapas: La primera es la unión Ag-Ac  La segunda la formación de puentes intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación. 

PRIMERA ETAPA Está influenciada por las siguientes variables:  Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC  Afinidad entre Ag y Ac  PH optimo :6.5 y 7.6  Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminuciòn de la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag (postzona)  Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac  Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe. 

Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes. Incubación varía : 15 a 60 min

SEGUNDA ETAPA    

Potencial Z Densidad del Ag Clase de Ig involucrada Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn

Potencial Z

Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular    

Papaína Bromelina Tripsina

Eliminan el Acido Sálico

Otras sustancias: ● Albúmina bovina ● Dextrán



GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG.



Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS



Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac. Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la Coombs de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Ac de tipo IgG Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusional y detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios.

  





Antisueros específicos



Anti-A Anti-B Anti-D :pueden ser de origen Humanos,animal o monoclonales,tambien pueden ser extractos de tejidos vegetales (Lectinas).Se debe considerar la especificidad, tìtulo,intensidad de la aglutinaciòn, avidez Anticuerpos obtenidos por inmunizaciòn: Son policlonales (mezcla de Ac contra distintos epitopes d euna misma molècula) Se obtienen por imnunizaciòn de animales o persona sensibilizadas

 





Anticuerpos monoclonales



Se obtienen de los hibridomas son monoclonales (clon de células que poseen especificidad contra un único epitope). Los antisueros hemoclasificadores anti-A, anti-B y anti-AB son monoclonales El antisuero anti-D : mezcla de monoclonal IgM que favorece la reacciòn en placa y un Ac IgG policlonal humano para el TCI en la determinaciòn del Du







Reactivo Antiglobulina Humana



Se obtiene inyectando a conejos con globulinas humanas purificadas Reactivos poliespecíficos : Contiene 2 anticuerpos :anti-IgG y anti-C3d en los estudios de Ac irregulares ,la presencia de anticomplemento favorece la detección de anti-Jka ,antiJKb, anti-K Cuando el test de CD da (+) ,debe investigarse mediante los sueros antiglobulina monoespecificos el tipo de anticuerpo o fracción del complemento unido al GR

 





Reactivo Monoespecifico:



Anti-IgG ,Anti-IgM, Anti-IgA Anti-C3d, Anti-C3b, Anti-C4b Se obtienen de modo análogo ,inyectándolas distintas fracciones separadas y purificadas a los conejos TCD: Sensibilidad : permite detectar entre 100 y 500 moléculas de Ig/GR y entre 400-1100 moléculas de C3d/GR

 

 

PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs) 

Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR.



Existen dos técnicas: a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR “in vivo”. b) Indirecta: Determina Acs existentes en el suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados.





DIRECTA: TCD ● Diagnostico de AH y EHRN. ● Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. ● Investigación de enfermedades autoinmunes. INDIRECTA: TCI ● Screening de sueros de donantes y pacientes para Acs. ● Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. ●Identificación y titulación de Acs encontrados en sueros.

PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD

AGLUTINACIÓN Ó HEMÓLISIS EN CUALQ. PASO ( +): INCOMPATIBLE. SUSPENSIÓN HOMOGENEA EN TODOS LOS PASOS ( - ): COMPATIBLE.

DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES

TITULACIÓN

TUBO

SF

1 -

2 10 µL

3 10 µL

4 10 µL

5 10 µL

6 10 µL

7 10 µL

8 10 µL

9 10 µL

100 µL 100 µL 100 µL 100 µL SUEROS 100 µL 100 µL

DEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA SUCECIVA RESERVAR 100 µL DEL TUBO 10

100 µL 100 µL 100 µL 100 µL GR DILUCION

100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL

1

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128 1/256

CRIOAGLUTININAS

TUBOS 1/4

1/16

1/64

1/256

1/1024

1/4096

6 Gts SF 2 Gts Suero

6 Gts SF 2 Gts Suero

6 Gts SF 2 Gts Suero

SERIE 1 6 Gts SF 2 Gts Suero

6 Gts SF 2 Gts Suero

6 Gts SF 2 Gts Suero

SERIE 2 2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

SERIE 3

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

SERIE 1 AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIÓN HEMATIES PACIENTE

SERIE 2 AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIÓN HEMATIES DEL GRUPO O I

SERIE 3 AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIÓN DE HEMATIES DE CORDON O i

Incubar los tubos a 4 º c ---- 24hs

PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES E INCUBARLAS A 37 º C ( 1H ) ,A 20º C ( 4 HS ) y A 4 º C ( 24 HS )

V N : TÍTULO MAYOR 32 SI DÁ (+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y GLÓBULOS DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I SI DÁ ( + ) EN LA SERIE DE AUTOGLÓBULOS Y GLÓBULOS DE CORDÓN , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i SI DÁ ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR .

EHFN

CLASIFICACIÓN Según la especificidad del Ac EHFN: por

acs contra ags del sistema RH ( más severa ) Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D

EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa ) Madres de grupo “ 0 “ EHFN : por acs contra ags de otros sistemas

ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) * Ictericia 

Signos



Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal)

* Anemia * Esplenomegalia * Hepatomegalia

DIAGNÓSTICO : Etapa prenatal   

+ ABO , Fenotipo R D débil ( RH negativo ) Determinación Ag Kell INCOMPATIBILIDAD POTENCIAL Mujer “ O “ C c D E E k Hombre “ A “ C c D e e k INCOMPATIBILIDAD REAL Investigar Acs irregulares ( panel eritrocitario select) - Medio salino - Medio enzimático - LISS / Coombs



ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA

•Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 sem Si es ( - ) repetir 28 / 32 sem Si es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias si aumenta * Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica * Genotipificación R H D fetal * Feto – Ultrasonido -----EC ( hígado- bazo ) _ Muestra sangre fetal ( 18 sem )

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN



* A la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU ) Panel selector ( aloanticuerpos maternos )

* En el niño : Tipificación A B O y R H PCD H b , Hto cordón , BRR I de cordón Reticulocitos

T T O de la mujer aloinmunizada 

PLASMAFÉRESIS ( pueden ser removidos hasta un 75 % de alo Acs pero tienden a rebotar )



ADMINISTRACIÓN DE GAMMA GLOBULINA ( en altas dosis 400mg / kg de peso materno durante 5 días)

El tratamiento del neonato ya afectado depende de la severidad de la condición. LEVE: 

Aumento agresivo de líquidos  Fototerapia usando lámpara de bilirrubina. 

KERNICTERUS: Exanguinotransfusion (pueden requerirse varias)  Fototerapia 

HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO



* Aumento

de reticulocitos . 10- 30 % evidencia de proceso hemolítico compensado * Eritroblastos en sangre periférica 8---15 % * Microesferocitos 80 %