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Trabajo practico N°5: Fraccionamiento subcelular

Alumnos: Sofía Oporto Escalona. Tomás Vidal Vásquez. Sección: 702 Profesores: Felipe Campos E. Eric Herdocio C.

Introducción

Las células son las unidades orgánicas y básicas fundamentales de todo ser vivo. Su nombre se lo denomino Robert Hooke el cual observo con un microscopio un trozo de corcho, en el cual vio una especie de celdillas en forma de panal de abeja a la cual le denomino célula. Es la unidad vital de los seres vivos al igual que es la porción mas pequeña de estos, toda célula proviene de una célula preexistente, es al igual la unidad funcionas y estructural. “los tipos de células se dividen en dos grandes grupos según su estructura, de las cuales pueden ser células eucariotas o también llamadas eucariontes y células procariotas o procariontes”1, La célula eucariota es un tipo de célula que se caracteriza por tener material genético el cual es organizado en cromosomas y encerrado en un núcleo envuelto por una doble membrana, existen dos tipos de células eucariontes que son, la eucarionte vegetal y la eucarionte animal. Las células eucariontes animal “son unidades morfológicas y funcionales pequeñas, son todas las células que si dotación genética esta contenida en un núcleo diferenciado”2. Las células eucariontes vegetales son similares a las eucariontes animal con la diferencia que estas contienen no centriolos, contienen cloroplastos, pared celular y una gran vacuola. Algunos organelos de estas células son, el núcleo que es el cual almacena la mayor parte del genoma humano, actúa comandando las acciones las cuales debe realizar la célula. La mitocondria es un organelo que es capaz de transformar el alimento en energía la cual será utilizada por la célula, además tiene su propio material genético. Los cloroplastos se encuentran en plantas y algas, no en animales ni hongo, “es mas compleja que le mitocondria esta formado por numerosos sacos los cuales se llaman estromas que juntos forman la grana, en ellos ocurre la fotosíntesis”3. El retículo endoplasmático es un sistema de membrana en forma de sacos aplanados y túbulos interconectados, los cuales se encargan de procesar determinadas moléculas para la célula, se encuentra el Retículo endoplasmático liso que es el encargado de la síntesis de lípidos y el Retículo endoplasmático rugoso que es el encargado de la síntesis de proteínas al cual se asocian ribosomas. Los ribosomas son orgánulos de pequeño tamaño encargado de sintetizar proteínas, se encuentras adheridos al retículo endoplasmático rugoso o flotando sobre el citosol. El aparato de Golgi son cisternas discoidales aplanadas, paralelas y superpuestas, formadas por membranas lipoproteicas, es el encargado de la modificación, empaquetamiento y destinación de macromoléculas. Los lisosomas son vesículas membranosas encargadas de la digestión molecular. Los peroxisomas son al igual que los lisosomas vesículas en las cuales se produce H2O2. El citoesqueleto el cual está formado por filamentos de proteínas formados por microtúbulos, filamentos intermedios y filamentos de actina los cuales le dan la forma y movimiento a la célula y la membrana plasmática que es la envoltura externa de la célula, la cual esta compuesta por una bicapa de fosfolípidos. Objetivos 1. 2. 3. 4.

Aprender cómo funciona la técnica de fraccionamiento subcelular. Aprender a separar organelos mediante centrifugaciones. Conocer nuevos métodos de tinción. Aprender a separar sobrenadante del pellet de un homogenizado

Materiales y métodos

En la primera actividad se realizó un homogenizando total y homogenizado crudo, el cual fue realizado por los profesores. Se mantuvo el homogenizado crudo (HC) dentro de un tubo de falcón en hielo, y se deposito 1 ml del HC en un tubo de eppendorf de 2ml y se conservó igual en hielo, el resto ( 9ml ) posteriormente se centrifugo a 2.000 RPM por 10 minutos, del cual se obtuvo el pellet 1 (Fracción nuclear) y sobrenadante 1, los cuales se separaron mediante una micropipeta y el sobrenadante 1 se depositó en un tubo de eppendorf, se le agrego 1 ml de Buffer IBc al pellet 1 para resuspenderlo, y se mantuvo en hielo. Se deposito sobrenadante 1 en dos tubos de eppendorf los cuales fueron centrifugados a 13.000 RPM durante 15 minutos. Nuevamente se separó el pellet 2 (Fracción mitocondrial) del sobrenadante 2 con la ayuda de la micropipeta, los cuales se depositaron en dos tubos de eppendorf y se mantuvieron en hielo. Se resuspendio el pellet 2 con 500 uL de buffer IBc cada tubo y luego junto todo en un mismo tubo. En la actividad dos se realizó una observación microscópica de la fracción nuclear, en la cual en un portaobjeto se deposito una gota de la fracción nuclear (pellet 1), sobre la cual se agrega una gota de azul de tripán con un gotero, se cubrió la muestra con un cubreobjetos, la cual se observo con el objetivo a 40X. En la tercera actividad se realizó una detección de mitocondrias a través de reacción de SDH en las fracciones, se rotularon 6 tubos de ensayo los cuales se depositaron en hielo, en el cual se le agrego a cada uno 1 ml de agua destilada, 1 ml de azul de succinato y 1 ml de azul de metileno, a las cuales posteriormente se le agrego, Agua, HC (homogenizado crudo), Fracción nuclear (pellet 1), sobrenadante 1, Fracción mitocondrial (pellet 2)y sobrenadante 2, luego se agitaron y se les agrego 200 uL de vaselina liquida con la ayuda de una pipeta Pasteur, posteriormente se llevo los tubos a un baño termorregulado a 37°C por 10 minutos, finalizado los 10 minutos se observó si algún tubo debajo presentaba o no una coloración blanca.

Plantilla de Resultados Práctico “Fraccionamiento subcelular”

Actividad A.2.1.

Título: Muestra de Fracciones nucleares Dibujo N°: 1 Nombre: Fracción nuclear Tipo de muestra: Fresca Tinción: Azul tripán Aumento del objetivo: 40x Aumento Total: 400x

Observaciones: 1) Se observan puntos azules más oscuros en mucha cantidad

2) Se observaron núcleos, gracias al azul de tripán. 3) Se observa una gran burbuja, producto de cuando se puso el cubreobjetos.

Actividad A.2.2.

Tubo Nº

Succinato

Azul Metileno

Agua

0,1 M

Muestra

Muestra

Reacción

volumen

nombre

(+) ó (-)

1

Control

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

AGUA

-

2

HC

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

HC

-

3

P1

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

P1

-

4

SN1

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

SN1

-

5

P2

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

P2

-

6

SN2

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

SN2

-

Discusión

El fraccionamiento celular es un método que nos permite separar distintos niveles sub celulares de ciertas muestras, uno de los objetivos a llevar acabo era el aprender el funcionamiento de esta técnica lo cual se logró gracias a los materiales entregados por nuestros profesores y la práctica del contenido en cuestión, no obstante a la preparación previa se obtuvieron algunos resultados diferentes a los esperados en este experimento , ya que en las muestras HC , S1 y P2 al introducir los tubos en la centrifuga estos subieron de temperatura activando en las muestras las enzimas proteasas y lipasas que rompen todos los organelos de la fracción mitocondrial de la célula , por ello en estas tres muestras a diferencia de los demás nos resultaron negativas , no así como con el fraccionamiento nuclear queda los resultados si fueron los esperados ya que “el experimento se mantuvo a 4ºC paraqué no exista degradación de las estructuras de la célula”4.Se puede apreciar si el resultado es negativo o positivo gracias al azul de tripán que es un método de tinción que “ayuda a los estudios de histología y citopatologicos “5 , esta tinción se deberá ver de color azul si es negativo , como nos ocurrió a nosotros y verde si es positivo , en otras palabras si la muestra presenta organelos “vivos”. La separación de organelos se logró centrifugando en diferentes ocasiones y luego de con la ayuda de una micropipeta logramos la separación del pellet y del homogenizado que se obtuvo en el paso anterior, este paso “se basa en el principio de dos partículas de suspensión con masas y volúmenes diferentes quedando separadas en el fondo del tubo “6 , diferenciando el pellet del homogenizado.

Conclusión

Al finalizar el laboratorio se concluye que al realizar las distintas actividades de fraccionamiento subcelular, se logró observar los núcleos de la fracción nuclear (pellet 1), gracias al azul de tripán que fue tinción utilizada, ninguna de las muestras reacciono (resultados como -), por lo que los objetivos propuestos en este laboratorio no se cumplieron ya que deberían haber muestras que si debieron reaccionar como el caso del Homogenizado Crudo, sobrenadante 1 y pellet 2, el hecho de que no reaccionaron se puede deber a que no se llego a centrifugar bien, no se utilizo adecuadamente el material del laboratorio, o simplemente estos estaban contaminados, las mitocondrias en alguno de los procesos no se haber desnaturalizado, al momento de separar el sobrenadante del pellet se pudo utilizar mal la micropipeta, y probablemente por la temperatura en la cual se estuvo trabajando, no era en la cual se debía haber trabajado, la cual era de 4°C.

Bibliografia 1. Lifeder. (2018). Tipos de célula: Procariontas y Eucariotas (con imágenes)- lifeder. [online] Available at: https://www.lifeder.com/tipos-celulas/ 2. (30 noviembre, 2015). Celula eucarionte animal. Recuperado de https://www.paradais-sphynx.com/animales/zoologia/celulas-eucariotasanimales.htm 3. Botanica.cnba.uba.ar. (2018). Cloroplastos. [online] Available at: http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/3er/LaCelula/Cloroplasto.htm 4. Universidad Andrés Bello, Guía de Laboratorio N°5 organización subcelular,Laboratorio de Biología Celular, BIOL035, 2018. 5. Repetto, G. U. I. L. L. E. R. M. O., & Repetto, M. A. N. U. E. L. (1995). Métodos alternativos: estudios toxicológicos in vitro.Madrid: Ediciones Díaz de Santos. 6. Lodish, H. (2005). Biología celular y molecular. Ed. Médica Panamericana.