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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA E. A. P.

: INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

“PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO” ASIGNATURA

: Laboratorio de Bioprocesos

DOCENTE

: M.S. Augusto Castillo Calderón

INTEGRANTES :  Anticona Alcántara Dreisy E.  Chávez De la Cruz Yonathan.  Cruz Pérez Sheyla.  Guzmán Valverde Diane C.  Ruiz Sanchez Ana Isabel CICLO: VII

GRUPO: A2

NUEVO CHIMBOTE – 2018

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO I.

RESUMEN:

El presente trabajo tiene como objetivo diseñar y realizar una experiencia de fermentación en cultivo celular por lote de KLUVEROMYCES MARXIANUS NRRL Y-7571, en un medio optimizado que contiene extracto de yacòn, a fin de producir la enzima inulinasa y medir el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a distintas condiciones de agitación. Para la realización de esta práctica, se utilizó el método dinámico, la experiencia se realizó en un volumen de medio de trabajo de 2L, controlado a 30ºC y operándose a condiciones de agitación(N) y velocidad superficial de aire (Vs) a 250 rpm. La matriz de valores obtenidos de KLa fueron correlacionados a un modelo que tuvo como variable dependiente a N y Vs. Por ende, en las condiciones de operaciones ensayadas el valor del K La obtenido mostro ser más dependiente de la velocidad superficial de aireación que de la velocidad de agitación.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO II.

INTRODUCCION:

En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces importante el conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus productos. Para ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como también el seguimiento de la cinética nos proporciona datos mucho más prácticos y exactos sobre la velocidad y características del crecimiento del microorganismo tratado. La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos

y

para

el

mantenimiento

celular.

No

obstante

que

los

microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar. Es así que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento de un microorganismo (KLUVEROMYCES MARXIANUS NRRL Y-7571), iniciando desde su siembra partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico, empleando un medio de extracto de yacòn como fuente de carbono y de energía, procurando su rápida activación, para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo; es decir con los mínimos requerimientos; en el cual es más factible determinar la cinética de crecimiento. La fermentación de la KLUVEROMYCES MARXIANUS NRRL Y-7571, se puede efectuar a través de cultivo por lotes, la cual se refiere a un sistema completamente cerrado donde todos los materiales requeridos están cargados en el fermentador, previamente desinfectados antes del proceso de fermentación y los residuos removidos al final. Los únicos materiales extraídos y agregados durante el curso de una fermentación por lotes son el intercambio de gases y las soluciones de control de pH, respectivamente. (Hernández, 1994). En este modo de funcionamiento, las condiciones están cambiando continuamente con el tiempo, y el fermentador es un sistema de estado inestable.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar. Las cuales incluyen a los macronutrientes (fuente de C, N, S, P, K y Mg), micronutrientes (Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co) y factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc. Al tener los requerimientos de fermentación se da el crecimiento de microorganismo. En un cultivo discontinuo de microorganismos en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano como es la fase latencia o de adaptación, en la cual los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo); la fase exponencial o logarítmica, en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo, durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio; la fase estacionaria: En ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo), los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano; y finalmente la fase de muerte, en la cual se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo. (Kosaric et al, 1987). Pero para el crecimiento, las cuales se obtendrá productividades existen factores fisicoquímicos que afectan o influyen en la rapidez de crecimiento, siendo el Ph. Es importante conocer cuál es el pH óptimo para el crecimiento, sin embargo durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio de cultivo, P á g i n a 4 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO normalmente haciéndolo disminuir, por tal motivo es frecuente incluir en las medias sustancias que actúen como reguladoras (soluciones tampón citrato) a fin de evitar que el pH se aleje del óptimo. (Zaragoza, 1989). La temperatura, esta ejerce una influencia determinante en el conjunto de la actividad celular microbiana, un incremento de ésta resulta una mayor velocidad de reacción, esto se traduce en un aumento de pH con la temperatura, pero por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor decrece rápidamente, la temperatura óptima resulta de la interacción de estos dos efectos. Por otra parte se encuentra otros factores que son el potencial de redox y el oxígeno, siendo factores determinantes del crecimiento y del metabolismo del cultivo, el potencial redox del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es sus características oxidantes o reductoras; uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno, O2, existiendo microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores; un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos) o anaerobios aerotolerantes; el rendimiento Yx/s de los procesos fermentativos es menor que el de los respiratorios: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. Otros factores son la concentración de compuestos necesarios para el crecimiento y la aireación. La aireación existente en un fermentador dependerá del tipo de proceso en el que se está trabajando, en general es común que dicha aireación sea con el oxígeno que se encuentra en el mismo aire y no inyectar oxígeno puro dado que encarece los costos. A mayores condiciones de aireación favorece al crecimiento de biomasa, sin embargo en condiciones microaireadas favorece a mayor obtención de productos. Se define así que existe una transferencia de oxigeno desde las burbujas hacia el líquido, teniendo que el área de contacto corresponde a la suma del área de todas las burbujas en contacto con el líquido. Entonces tenemos que todo proceso de transferencia ocurre a una velocidad determinada la cual es dependiente del área de contacto y como en este caso dicha área (volumen por la burbuja) no es calculable se define un coeficiente

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO volumétrico de transferencia de oxigeno o KLa, el que engloba ambos (área y velocidad), el cual es dependiente de las condiciones existentes al interior del fermentador tales como sistemas de aireación, temperatura, presencia de deflectores, etc. En este sentido, el objetivo del presente trabajo es diseñar y realizar una experiencia de fermentación en cultivo celular por lote de KLUVEROMYCES MARXIANUS NRRL Y-7571, en un medio optimizado que contiene extracto de yacòn, a fin de producir la enzima inulinasa y medir el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a distintas condiciones de agitación. III.

OBJETIVOS: OBJETIVO GENERAL: ─

Diseñar y realizar una experiencia de fermentación en cultivo celular por lote de KLUVEROMYCES MARXIANUS NRRL Y-7571, en un medio optimizado que contiene extracto de yacòn, a fin de producir la enzima inulinasa y medir el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a distintas condiciones de agitación.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

─

Identificar y describir las partes, accesorios y geometría de un fermentador

de

laboratorio,

conocimiento

de

su

operación,

esterilización, carga y descarga y toma de muestras. ─

Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automático, así como la calibración de los sensores.

─

Polarización, calibración y caracterización dinámica del electrodo OD.

─

Activación celular y desarrollo del inoculo.

─

Puesta en marcha del CL, seguimiento y determinación de la Umax; Yx/s y Qx.

─

Determinar el KLa por el método Dinámico de Humphry y correlacionar los resultados.

─

Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono, oxígeno disuelto y Ph a través del tiempo total de fermentación en el Biorreactor.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO IV.

MATERIALES Y METODOS:

1.1.

INOCULACIÓN DEL BIORREACTOR

Materiales •

Matraz de 500 ml (de fermentación I inoculado)

•

Matraz de 1 L (de fermentación II)

Instrumentos y equipos •

Shaker

•

Biorreactor

MEDIO DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y FERMENTACIÓN Materiales

•

•

Alcohol 96°

Instrumentos y equipos

•

Tubos de ensayo

•

Mechero bunsen

•

Matraz Erlenmeyer

•

Biorreactor

•

Papel aluminio

•

Centrifuga

•

Pipetas

•

Refrigeradora

•

Tubos de celda

•

Shaker

Papel toalla

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO 1.2. MEDIO DE MANTENCIÓN Nutriente Concentración (g/L) Extracto de levadura 3 Peptona 5 Extracto de Malta 3 Glucosa 10 Agar

20

Peso (g) 0.15 0.25 0.15 0.50 1.00

TABLA. Concentración de Nutrientes para el medio de mantención.



Pesar las cantidades requeridas de cada compuesto.



Colocar los nutrientes en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.



Agregar 50 ml de agua destilada, utilizando la probeta graduada.



Llevar a calentar la mezcla de 1-2 minutos en ebullición con agitación constante.



Extraer en caliente, con la ayuda de una pipeta, 7 ml de solución en 6 tubos de ensayo con tapa y cerrarlos inmediatamente.



Colocar los tubos en un vaso de precipitado dentro de la olla a presión, previamente aflojar las tapas para permitir el intercambio de gases, y esterilizar hasta 121°C durante 20 minutos (controlar los 20 min a partir de la primera burbuja en la olla a presión).



Finalizada la esterilización, ajustar las tapas de los tubos y retirarlos de la olla.



Colocar los tubos en posición inclinada a temperatura ambiente hasta el día siguiente.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

MEDIO DE MANTENCIÓN

MEDIR

PESAR

Agua destilada

MEDIR

CALENTAR

AGITAR

Matraz de 250 ml.

Cantidades de cada compuesto. Hasta llegar a los 50 ml que se requiere. En un Mechero Bunsen (flama de coloración azul) Constantemente con una varilla por un minuto (aparición de la primera burbuja).

PREPARAR

6 tubos de ensayo con tapa.

AGREGAR

6 - 7 ml de la mezcla en caliente a cada tubo de ensayo, con pipeta de 10 ml.

ENFRIAR

Una vez tapados los tubos de ensayos, por 1 hora.

COLOCAR

En un vaso precipitado, y llevarlos a la olla a presión (auto clave).

CALENTAR

COLOCAR

121 ºC / 20 min (controlar los 20 min a partir de la primera burbuja en la olla)

Posición inclinada a T. Amb.

CALENTAR

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

1.3 MEDIO DE ACTIVACIÓN

Nutriente

Concentración (g/l)

Peso (g)

Sacarosa (Loba Chemie)

10

0.15

Extracto de levadura (Merck) Peptona

3

0.045

5

0.075

MgSO4.7h2o (sigma)

0.65

0.0098

TABLA. Concentración de Nutrientes para el medio de activación MEDIO DE ACTIVACIÓN

Componentes para el medio

PESAR

AGREGAR

DISOLVER

TAPAR

ESTERELIZAR

Por separado. - Extracto de levadura en un tubo de ensayo. - Peptona en un tubo de ensayo. - Sacarosa en un matraz Erlenmeyer.

Con 5ml de agua destilada

Con papel aluminio los tubos y el matraz

121ºC – 15 min.

ENFRIAR

MEZCLAR

Con los demás componentes en un ambiente aséptico, para evitar la contaminación.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO 1.4 MEDIO DE FERMENTACIÓN

Nutriente

Concentración (g/l)

Peso (g)

Extracto de Yacón

26,2

2.358

Extracto de levadura

10,0

0.9

1,0

0.09

(NH4)2SO4

10,0

0.9

MgSO4.7h2o (sigma)

0.386

0.0347

KH2PO4

TABLA. Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación

MEDIO DE FERMENTACIÓN

Componentes para el medio

PESAR

AGREGAR

DISOLVER

TAPAR

ESTERELIZAR

Por separado. - Extracto de levadura en un tubo de ensayo. -Todas las sales en un tubo de ensayo. - Extracto de yacón en un matraz Erlenmeyer. Con agua destilada

Con papel aluminio los tubos y el matraz

121ºC – 15 min.

ENFRIAR

MEZCLAR

El extracto de levadura, las sales y el extracto de yacón en un ambiente aséptico.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO 1.5 CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA CELULAR

BIOMASA CELULAR

TOMAR

Una muestra de 5ml

MEDIR

La absorbancia debe ser la más cercana a 1.

CENTRIFUGAR

AGREGAR

COLOCAR

El precipitado a los capachos

Los capachos en la estufa por 10 horas

PESAR 1.6 MONTAJE DEL FERMENTADOR AUTOMATIZADO BIOSTAT-A PLUS

BIOSTAT-A PLUS

POLARIZAR

CALIBRAR

ESTILIZAR

ACTIVAR

El electrodo OD

En la autoclave

Activar el fermentador con las g i n a 5 | 33 muestrasPyaá preparadas.

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

SEGUIR

Hacer el seguimiento para determinar KLa

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA: MÉTODO DE BRADFORD La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la proteína.  Reactivo de Bradford  MATERIALES:  Reactivo de azul brillante de coomassie G-250 

50 ml de etanol 95 %.



Ácido fosfórico al 85 %(w/v).



Agua destilada



Tubos de ensayo



Espectrofotómetro Matraces

REACTIVO DE BRADFORD

0.1 g de azul brillante de Coomassie G-250

DISOLVER

En vaso de precipitado conteniendo 50 ml de etanol.

AÑADIR

100 ml de ácido fosfórico al 85%

AFORAR

Con agua destilada hasta 1 L

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BRADFORD

En un tubo de ensayo

AGREGAR

•

•

Biorreactor

•

Centrifuga

AÑADIR

• Espectrofotómetr o

MEZCLAR

Refrigeradora

En untubo de ensayo

LEER

100 µL de muestra diluida en tampón buffer

• Biorreactor 5 ml de reactivo Bradford (a cada muestra) • Centrifuga •

Biorreactor • Dejar reaccionar 5 min Espectrofotómetr • Centrifuga o A una longitud de • • deEspectrofotómetro Refrigeradora onda 595 nm de ensayo •En untubo Biorreactor •

Refrigeradora

de ensayo •En untubo Centrifuga

• Espectrofotóm etro

•

Refrigeradora

En untubo de ensayo

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES: PLAN DE MUESTREO

Grupo Responsable: …………………………………………………………………… Día de la experiencia: 27-28 Miércoles, 27-28 de junio del 2018. Microorganismos: KLUVEROMYCES MARXIANUS NRRL Y-7571 Fuente Carbono: Extracto de Yacón T °C: 30 °C

pH0: 4.0

N rpm: 400 rpm

Fuente: Dr. Augusto Castillo Calderón

FECHA 27.06.2018

N°

HORA TIEMPO ABS (640nm)

OD

Ph

OBSERVACIONES

1 2 3

16:00 17:50 20:00

0 2 4

0.076 0.086 0.091

101 100 100

3.99 3.97 3.97

4 5 6

00:00 02:00 08:00

8 10 16

0.112 0.141 0.862

98.2 95.8 30.9

3.97 3.97 3.87

2.4

3.69

0

3.27

28.06.2018

CLA 01

10:00

18

02

13:00

21

3 4 5 6

15:00 17:10 20:09 22:01

23 25 27 29

1.018 0.767 1.448 1.266 1.124 0.991 0.804 0.838 0.802 0.726

0 0 0 0

3.12 3.11 3.24 3.29

1:2 1:3 1:3 1:4 1:5 1:6 1:10 1:12 1:14 1:15

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

Determinación de Biomasa. Tabla1. Valores experimentales de Biomasa (g/L) celular. TIEMPO (hr) 0 2 4 8 10 16 18 21 23 25 27 29

ABSORVABCIA CONCENTRACION (640nm) X(g/l) 0.076 0.0631544 0.086 0.0714642 0.091 0.0756191 0.112 0.0930696 0.141 0.117168 0.862 0.7163038 0.767 1.9120824 CLA 0.991 4.9410005 0.804 6.6810703 0.838 8.3563237 0.802 9.330231 0.726 9.0493601

CINETICA DE BIOMASA CELULAR

X(G/L)

3.1.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

CL

0

5

10

CLA

15

20

25

30

35

TIEMPO

Grafica 1. Cinética de Concentración de Biomasa Celular.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

3.2.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS – MÉTODO DE BRADFORD Tabla2. Determinación experimental del S (g/L)

N°

[] (g/L)

ABS

1

0.5

0.185

2

0.4

0.152

3

0.3

0.126

4

0.25

0.111

5

0.2

0.089

6

0.1

0.046

7

0.05

0.025

Grafica 2. Cinética de Concentración de Sustrato (g/L)

CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS 0.25

ABS(nm)

0.2

y = 0.3533x + 0.014 R² = 0.9881

0.15

0.1

0.05

0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

g/l P á g i n a 10 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

Datos obtenidos en la experiencia N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ABS (595nm) 0.005 0.010 0.016 0.018 0.022 0.024 0.025 0.027 0.019 0.026 0.019 0.020

P (g/L) 0.028110 0.041124 0.056741 0.061947 0.072358 0.077564 0.080167 0.085372 0.064550 0.082769 0.064550 0.067153

Obtención de Proteínas 0.090000 0.080000

P (g/L)

0.070000 0.060000 0.050000 0.040000 0.030000

0.020000 0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (horas)

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

HALLAMOS EL KLA POR EL MÉTODO DINÁMICO DE HUMPHREY: DETERMINACION DEL KLA. VAORES OBTENIDOS EN LA PRÁCTICA. TIEMPO 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165

VELOCIDAD DE AGITACION 500 450 400 57.2 40.9 33.7 57.1 40.8 32.7 57.4 40.8 31.9 57.5 40.4 31 57.3 39.5 30.2 57 37.8 28.5 56.1 36 25.8 55.1 33.9 22.3 53.8 31.4 18.8 52.2 29 14.8 50.8 25.7 11.6 49 23 8.6 47.3 19.8 6.4 45.4 16.7 4.8 43.3 14 3.7 41.5 10.8 3.4 39.4 8.7 3.6 37.4 6.3 6 35.3 5.3 9.4 32.9 6.3 11.3 30.8 5.3 11.2 29 6.4 10.5 27.1 6.4 10.6 25.3 8.5 11.2 23 12.4 11.6 21.5 13.2 11.9 19.3 13.3 12.9 17.7 13.7 11.9 16 14.6 11.9 14.9 14.7 11.8 13.1 17 12 12.3 18.7 12.1 10.8 20.2 12.2 9.5 21.4 12.3

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360 365 370 375 380 385

8.2 7.8 8.4 9.9 12.3 15.1 17.6 21.1 23.6 26.4 29.1 31.6 33.6 38 40.3 42.2 43.9 45.2 46.3 47.7 48.3 49.5 50.7 51.5 52.3 53.3 54.1 54.7 55.3 55.7 56.1 56.3 56.4 56.6 56.8 57 57.1

23 24.3 25.3 26.6 28 29 30.5 31 31.4 31.8 32.1 32.4 33 33.3 33.6 33.8 34 34.4 34.7 35.3 35.6 35.8 36.2 36.3 36.8 37 36.9 37.1 37.2 37.4 37.6 37.6 37.6 37.6 37.6 37.7 38 38.1 38.2 38.3

12.5 12.6 12.8 12.9 13.1 13.2 13.4 13.4 13.9 14.4 14.5 14.3 14.1 14.2 14.5 14.8 14.8 14.6 14.4 14 13.8 13.7 13.6 13.6 13.5 13.3 13.6 13.6 13.7 13.8 13.7 13.2 13.1 13.1 13.1 12.9 12.9 13 13.2 13.8 14 14 13.9 14.1

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO 390 395 400 405 410 415

14.1 14.1 14.4 14.7 14.7 14.8

Tabla N°04: Toma de data por medio de cronometro y el equipo Biostad Aplus. 70 60

OD(%)

50 40 30 20

10 0

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

TIEMPO 500 rpm

450rpm

400 rpm

GRAFICO N°03: Perfil de oxígeno disuelto en el tiempo a diferentes velocidades de agitación y una velocidad de aireación de 2lt/hora, a 30°C. 70 60

OD(%)

50 40 30 20 10 0 0

50

100

150

200

250

300

350

400

TIEMPO 500 rpm

GRAFICO N°03: Perfil de oxígeno disuelto en el tiempo a 500 rpm y una velocidad de aireación de 2lt/hora, a 30°C.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO DESGASIFICACIÓN: Tomaremos el tiempo a partir de los 20 segundos, con el fin de obtener un R cercano a 1. Tabla 4. Datos obtenidos durante la desgasificación en el proceso.

TIEMPO 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175

Oxígeno Disuelto (%) 57.3 57 56.1 55.1 53.8 52.2 50.8 49 47.3 45.4 43.3 41.5 39.4 37.4 35.3 32.9 30.8 29 27.1 25.3 23 21.5 19.3 17.7 16 14.9 13.1 12.3 10.8 9.5 8.2 7.8

P á g i n a 15 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

DESGACIFICACION y = -0.3554x + 67.153 R² = 0.9944

70 60

O(%)

50 40 30

Series1

20

Linear (Series1)

10 0 0

50

100

150

200

TIEMPO

Grafica 7. Desgasificación en el proceso. DONDE: Obtuvimos la ecuación de la recta.

𝑌 = 𝑦 = −0.3554𝑥 + 67.153𝑍 REEMPLAZANDO: 𝐶𝐿 = −0.3554𝑡 + 67.153 Derivamos la ecuación obtenida con respecto al tiempo: 𝑑𝐶𝐿 = −0.3554 𝑑𝑡

Si se sabe que: 𝑑𝐶𝐿 µ𝑋 =− = −𝑁𝐴 𝑑𝑡 𝑌𝑜2 Entonces la demanda de oxígeno es: 𝑁𝐴 = 0.3554 𝑂2 /ℎ

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO GASIFICACIÓN:

TIEMPO

180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 305 310 315 320 325 330 335 340 345 350

Oxígeno Disuelto (%) 8.4 9.9 12.3 15.1 17.6 21.1 23.6 26.4 29.1 31.6 33.6 38 40.3 42.2 43.9 45.2 46.3 47.7 48.3 49.5 50.7 51.5 52.3 53.3 54.1 54.7 55.3 55.7 56.1 56.3 56.4 56.6 56.8 57 57.1

P á g i n a 17 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

GASIFICACION 70

y = -0.0023x2 + 1.5002x - 189.63

60

R² = 0.908

O(%)

50 40 30 20

10 0 0

50

100

150

200

250

300

350

400

TIEMPO

GRÁFICA 8. Gasificación en el proceso con polinomio de grado 2. Obtuvimos en la gráfica la siguiente ecuación: 𝑌 = −0.0023𝑥2 + 1.5002𝑥 − 189.63 REEMPLAZANDO: 𝐶𝐿 = −0.0023𝑡2 + 1.5002𝑡 − 189.63 Derivamos la ecuación obtenida con respecto al tiempo: 𝒅𝑪𝑳 = −𝟎. 𝟎𝟎𝟒𝟔𝒕 + 𝟏. 𝟓𝟎𝟎𝟐 𝒅𝒕

GASIFICACION 70

y = 8E-07x3 - 0.0029x2 + 1.6531x - 202.34

60 R² = 0.997

O(%)

50 40 30

20 10 0

0

50

100

150

200

250

300

350

400

TIEMPO

GRÁFICA 9. Gasificación en el proceso con polinomio de grado 3.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

Obtuvimos en la gráfica la siguiente ecuación: 𝑌 = 8𝐸 − 07𝑥3 − 0.0029𝑥2 + 1.6531𝑥 − 202.34 REEMPLAZANDO: 𝐶𝐿 = 8𝐸 − 07𝑡3 − 0.0029𝑡2 + 1.6531𝑡 − 202.34 Derivamos la ecuación obtenida con respecto al tiempo: 𝒅𝑪𝑳 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟐𝟒𝒕𝟐 − 𝟎. 𝟎𝟎𝟓𝟖𝒕 + 𝟏. 𝟔𝟓𝟑𝟏 𝒅𝒕 COMPARAMOS LOS R: -

Gráfica con polinomio grado 2: Gráfica con polinomio grado 3:

0.908 0.997

HALLANDO LA CAPACIDAD DE AIREACIÓN EN CONDICIONES DADAS (KLA):

DETERMINACION DEL kla 70

O(%)

60 50 40

30 20

y = -50.257x + 65.327 R² = 0.892

10 0 -0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Na+dCL/dt

−𝟏 = 𝑷𝑬𝑵𝑫𝑰𝑬𝑵𝑻𝑬 𝑫𝑬 𝑳𝑨 𝑹𝑬𝑪𝑻𝑨 𝑲𝑳𝑨

−1 = −50.257 𝐾𝐿𝑎 𝑲𝑳𝒂 = 𝟎. 𝟎𝟏𝟗𝟗𝒉−𝟏

P á g i n a 19 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

PH: Conforme se retiró muestras, se sacaron análisis de ph, obteniendo los siguientes valores en distintos periodos de tiempos. TIEMPO

PH

0 2 4 8 10 16 18 21 23 25 27 29

3.99 3.97 3.97 3.97 3.97 3.87 3.69 3.69 3.27 3.27 3.27 3.27

PH 4.5 4 3.5

PH

3 2.5 2 1.5

1 0.5 0 0

5

10

15

20

25

30

35

TIEMPO

Gráfica 8. PH en tiempos donde se sacaron muestras.

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PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

PERFIL DE OXÍGENO DISUELTO EN ELBIORREACTOR

%O EN EL BIORREACTOR 120 100

%O

80

60 40

Series1

20 0 0

5

10

15

20

25

30

35

TIEMPO

Gráfica 8. %O en el Biorreactor durante las horas de análisis

P á g i n a 21 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO DISCUSIONES: 

Según Cuellas A. 2007, los requerimientos de trazas de elementos son difíciles de demostrar porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de éstos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo. Es decir que si la chaqueta que rodea al Biorreactor le proporcionaba un grado centígrado más de temperatura y así continúa aumentando sin regularse, los requerimientos de micronutrientes aumentarán proporcional o hasta exponencialmente. Por esa razón, es controlada la Temperatura con el programa PC – Panel µCDU (Master Panel) y regulada con el paso externo de agua para evitar irregularidades en el requerimiento de micronutrientes.



En concordancia con Durán & Rojas, 2006, La transferencia de oxígeno es el fenómeno mediante el cual se transfiere oxígeno de una fase a otra. En muchos procesos biotecnológicos, tales como fermentaciones; la transferencia suficiente de oxígeno es esencial para garantizar la respiración aeróbica de los microorganismos presentes en dichos sistemas y con ello el buen desempeño de los mismos. Consiguiéndose así un adecuado proceso y la obtención de los productos esperados y programados de acuerdo a las cantidades de los nutrientes utilizados para la cinética y las condiciones aplicadas para el mismo.



De

acuerdo

con

Camacho

et

al.,

(1995),

el

efecto de la

temperatura

es

importante; de modo que la solubilidad de un gas aumenta al disminuir la temperatura. Por ejemplo la temperatura en fermentadores aerobios afecta a la solubilidad de oxígeno y al coeficiente de transferencia de materia. Un aumento de la temperatura produce una disminución drástica de la concentración de gases en el fluido y al mismo tiempo un aumento de la difusividad del oxígeno en la película de líquida que rodea a la burbuja de gas. P á g i n a 1 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

VI.

CONCLUSIONES: 

En la práctica se determinó una concentración de biomasa final de 1.34 g/L en el cultivo por lote.



En el desarrollo de la práctica obtuvimos una cantidad de sustrato inicial (4.36g/L) en el cultivo por lote, siendo casi el mismo determinado teóricamente (4.274 g/L).



Se concluye que el rendimiento practico en el cultivo por lote (Yx/s=0.2485g/g) es el 50 % del rendimiento teórico (YX/S = 0.468 g/g)



Se determinó que el valor de µMax practico en el cultivo por lote = 0.38 h -1 fue mejor que al µmax teórico=0.33h-1



A partir de los resultados obtenidos en la transferencia de oxígeno, se concluye que las condiciones de operación no nos permitieron obtener los mayores valores del coeficiente de transferencia de oxígeno. KLA=0.006h-1



En cuanto al caudal de aire suministrado al medio de cultivo, no se encontró un efecto significativo de esta variable operacional sobre el crecimiento celular. Aunque, en general, existió una disminución en la velocidad de crecimiento al aumentar el caudal de aire manteniendo constante la velocidad de agitación.



En el desarrollo del CLA, se obtuvo un rendimiento de 4.6878 g/g, concluyendo que el consumo de sustrato para mantención celular fue despreciable.



Entre las condiciones operativas, la disponibilidad de oxigeno se considera el factor más importante que afecta a la fermentación por levaduras azucares, ya que determina la división del flujo de carbono entre el crecimiento y la formación de producto. El establecimiento de un nivel adecuado de oxigeno es por lo tanto de gran importancia para obtener un proceso eficiente con altos valores de conversión y la productividad.

P á g i n a 2 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO VII.

BIBLIOGRAFIA: 

Camacho et al. (1995). Determinación de parámetros de transferencia de oxígeno en fermentadores. Publicado en la revista de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, de Madrid – España.



Cuellas. Biorreactores – Teoría. Universidad Nacional de Quilmes. Buenos Aires, Argentina. (2007) pág 29.



Durán, E & Rojas, G. (2006). Efecto de contaminantes sobre la transferencia de oxígeno en sistemas de aeración analizado mediante un modelo de dos zonas simplificado. Ciencia y Tecnología, 24(2): 129-150.



Yonghong Li, Zongbao (Kent) Zhao, Fengwu Bai. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture.



Anna Karapatsia, Giannis Penlou, Christos Chatzidoukas, Costas Kiparissides. Fedbatch Saccharomyces cerevisiae fermentation of hydrolysate sugars: A dynamic modelbased approach for high yield ethanol production



Richart W. Lombegt (2002). Procesos de Transpofte y Operaciones Unitarias. CECSA. México, D.F.



Dorán P. (1998). Principios de ingeniería de los bioprocesos. Pág. 206- 208.



Silva, J.P., Mussatto, S.I., Roberto, I.C., Teixeira, J.A., 2012. Fermentation medium and oxygen transfer conditions that maximize the xylose conversion to ethanol by Pichia stipitis. Renewable Energy 37, 259–265.



Du Preez, J.C., 1994. Process parameters and environmental factors affecting Dxylose fermentation by yeasts. Enzyme and Microbial Technology 16, 944–956.



Bothast RJ, Saha BC. Ethanol production from agricultural biomass substrates. Adv Appl Microbiol. 1997; 44: 261–286.

P á g i n a 3 | 33

PRODUCCION DE ENZIMA INULINASA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO

VIII.

ANEXOS: CURVA DE CALIBRACION DE BIOMASA

Dilucion 1: 03

PROM

ABS (640nm) 0.985 0.986 0.972 0.986 0.98225

Diluciones 1:40 1:20 1:12 1:10 1:08 1:04 1:03

Kluyveromice Peso capacho inicial 0.15 89 0.16 83 0.15 98 0.15 85

Volumen Peso capacho final 0.16 15 0.17 12 0.1 62 0.16 06

X (g/L) 0.080 0.159 0.238 0.287 0.347 0.608 0.816

3 Peso seco 0.00 26 0.00 29 0.00 22 0.00 21

ml X (g/L) 0.866666 7 0.966666 7 0.733333 03 . 0.81666 7 67

ABS (640 nm) 0.096 0.191 0.286 0.345 0.417 0.732 0.982

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