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• DANIELA ANDREA VARGAS ORTEGA

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INFORME N°8: TRANSFORMACIÓN QUIMICA DE E. Coli CON EL PLÁSMIDO pGLO 1Nelly

Yazmin Agudelo Rozo-1611303; 2Dayron Eliecer Almeyda Pimienta-

1611323; 3Eliana Soto Mendez-1611324; 4Daniela Andrea Vargas Ortega-1611329. [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]

Universidad francisco de paula Santander, facultad de ciencias agrarias y del ambiente, ingeniería biotecnológica, 12 de Junio del 2019

INTRODUCCIÓN La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula (Galván, 2014). A nivel de laboratorio algunas cepas bacterianas de Escherichia coli son las más utilizadas, gracias al vasto conocimiento que se tiene acerca de su genética, bioquímica y biología molecular, siendo generalmente el primer sistema que se escoge para la expresión de proteínas recombinantes en bacterias. También estas son empleadas para múltiples actividades, que van desde la conservación y propagación del ADN plasmídico de clones hasta la creación de grandes bibliotecas para la determinación de la secuencia de un genoma (Gómez et al., 2018). La transformación genética se usa en muchas áreas de la biotecnología. En agricultura, se pueden introducir en las plantas, por transformación, los genes que codifican características como la resistencia al frío, a los pesticidas o a la sequía. En biodegradación, las bacterias se pueden transformar con genes que las hagan capaces de digerir los vertidos accidentales de petróleo. En medicina, las enfermedades originadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia génica, mediante la

transformación de las células del paciente con copias del gen que carecen de la anomalía que produce la enfermedad (BIO-RAD). OBJETIVOS 

Conocer los principios básicos y las aplicaciones de la transformación bacteriana de E. coli k12.



Familiarizarse con la técnica de transformación de células tratadas con calcio.



Analizar e interpretar los resultados experimentales y calcular la eficiencia de la transformación.



Comprender la regulación de la expresión genética de operón arabinosa.

METODOLOGIA 1.Transformación de E.coli con pGlO Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar.Se marcaron dos microtubos: uno con pGLO (-) y otro con pGLO (+). Con una pipeta estéril, se añadieron a cada tubo 100 µl de la solución transformadora (CaCl2). (se colocaron los tubos en hielo). Luego de esto, usando un asa estéril se tomó una colonia de la caja inicial de E. Coli y se llevó hasta el tubo pGLO (+) y al pGLO(-) y se agitó un poco hasta que la colonia quede dispersó en la solución transformadora. Con otra asa estéril, se añadió el plásmido al tubo pGLO (+). Se incubaron los tubos en hielo durante 10 minutos asegurando que los tubos estén en contacto con el hielo.

2.Se etiquetaron las placas de agar en la base de la siguiente forma: una placa LB/amp y una LB/amp/ara como +pGLO y otra LB/amp/ara como –pGLO.

3.Choque Térmico Se transfirieron los dos tubos a baño maría a 42°C por 50 segundos. Seguidamente, se colocaron en hielo durante 2 minutos.

4. Se agregó con una micro pipeta esteral 100 µl de caldo LB a los tubos de +pGLO y – pGlO y se incubo por 10 minutos a temperatura ambiente.

5. Se procedió a agitar los tubos y con una micro pipeta estéril se tomó 50 µl de cada tubo a alas placas correspondientes y con una asa estéril, se extendió el líquido en forma de estría por toda la superficie de la placa y por último se llevó a incubar a 37°C en posición invertida por 24 horas.

6. Luego de 24 horas de incubación se llevó las placas a observar en el equipo de transluminador UV y en el ChemiDoc

RESULTADOS

pGLO (-): LB

pGLO (-): LB/AMP

pGLO (+): LB/AMP

pGLO (+): LB/AMP/ARA

Fig. 1: Placas del grupo A3 y A4 antes de la observación por medio del Transiluminador.

pGLO (-): LB

pGLO (-): LB/AMP

pGLO (+): LB/AMP

pGLO (+): LB/AMP/ARA

Fig. 2: Placas del grupo A3 y A4 observadas en el Transiluminador.

pGLO (-): LB

pGLO (+): LB/AMP

pGLO (-): LB/AMP

pGLO (+): LB/AMP/ARA

Fig. 3: Placas del grupo A3 y A4 observadas en el ChemiDoc.

Tabla 1. Conteo del número de colonias.

NUMERO DE COLONIAS INCOLORAS (UFC)

NUMERO DE COLONIAS TRANSFORMADAS (UFC)

pGLO (-): LB

Incontable: >1600 UFC/50 µl CE

0 UFC/50µl

pGLO (-): LB/AMP

0 UFC/50 µl

0 UFC/50 µl

pGLO (+): LB/AMP

15 UFC/50 µl

0 UFC/50 µl

pGLO (+): LB/AMP/ARA

0 UFC/50 µl

16 UFC/50µl

1- Determinación del número total de colonias verde fluorescente que crecen en placa LB/amp/ara. Número total de células = 16 colonias verdes fluorescentes. 2- Determinación de la cantidad total de plásmido pGLO en las células bacterianas y presente en la placa LB/amp/ara. a) Determinación de la cantidad total de plásmido pGLO ADN (µg) = Concentración de ADN (µg/µl) * Volumen ADN (µl) ADN (µg) = 0,08(µg/µl) * 10µl Cantidad total de ADN (µg) = 0,8µg

b) Determinación de la fracción de ADN realmente trasferido a la placa LB/amp/ara. Fracción ADN utilizada = Volumen en la placa (µl)/Volumen total del tubo (µl) Fracción ADN utilizada= 50(µl)/210(µl) Fracción ADN utilizada= 0,2380 ADN pGLO transferido (µg) = Cantidad total de ADN pGLO usada (µg)* fracción de ADN pGLO ADN pGLO transferido (µg) = 0,8µg * 0,2380 ADN pGLO transferido (µg) = 0,1904 µg

3- Tasa de transformación = Nº total de células que crecen en placa/ Cantidad de ADN (µg) en la placa Tasa de trasformación = 16 células transformadas/ 0,1904 µg Tasa de trasformación = 84,03361 células transformadas/ µg

DISCUSIONES Las colonias de E.coli como era lo esperado crecieron e los medios de cultivo de pGLO (-): LB; pGLO (+): LB/AMP

y pGLO (+): LB/AMP/ARA; Pero en

pGLO (-):

LB/AMP como también era lo esperado no crecieron colonias. Los plásmidos de pGLO contienen un gen de resistencia al antibiótico ampicilina, al igual que incorpora un sistema especial de regulación genética. Este es usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas, al añadir la azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las colonias. La bacteria Escherichia coli puede realizar intercambios de material genético de forma natural para adquirir genes que la ayuden a sobrevivir los diversos medios en donde habitan, y es por esta razón que se utilizaron los plásmidos presentes en su citoplasma. (Betancor, et al, 2001). Para poder determinar si la transformación había ocurrido fue necesario observar las cajas Petri bajo luz ultravioleta, para poder distinguir si había sufrido la transformación, y de esa misma manera poder percibir si podían sobrevivir bajo los medios con ampicilina. Como consecuencia de esto para que el gen pueda expresarse es necesario que existan condiciones adecuadas; como la presencia de arabinosa, para que el gen se active. La proteína verde fluorescente ha sido utilizada como un indicador de expresión genética y determinador de proteínas (Barrera & Ovalle, 2009). El plásmido pGLO contiene, además de la proteína GFP, el gen para la producción de beta-lactamasas, lo que hace a la bacteria portadora de este gen ser resistente a la ampicilina. Las beta-lactamasas son enzimas producidas y excretadas por las bacterias que contienen estos plásmidos. Estas enzimas inactivan la ampicilina presente en el agar LB, permitiendo el crecimiento bacteriano. Únicamente las bacterias transformadas con el plásmido y que expresan las betas-lactamasas sobrevivirán en las placas que

contienen ampicilina. Solo un reducido porcentaje de células captan el plásmido (Güerri, 2004)

BIBLIOGRAFIA -

Barrera, L., Ovalle, I. (2009). Regulación de la expresión genética de las proteínas verde fluorescente y la beta-lactamasa a través de la inserción del plásmido pGLO en la bacteria Escherichia. coli como mecanismo de resistencia a

la

ampicilina.

Recuperado

de:

https://www.feriadelasciencias.unam.mx/anteriores/feria17/10.pdf -

Betancor, L., Gadea, P., Flores K. (2001). Genética Bacteriana. Instituto de Higiene. Universidad de Montevideo.

-

BIO-RAD. Kit de transformación bacteriana con pGLO. Recuperado de: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/4006097ES.pdf

-

Galván, A.; Tejada, M.; Camargo, A.; Higuera, J. & Fernández, E. (2014). Transformación

de

Escherichia

coli

con

un plásmido recombinante.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Córdoba. Recuperado de: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACION%20E%20COLI%20CON%20PLASMIDO%20RECOM BINANTE.pdf

-

Gómez, L.; Gómez, S. & Núñez, V. (2018). Estandarización de protocolos de transformación genética en Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens para la generación de una colección de constructos génicos. Ciencia en Desarrollo, Vol. 9 No. 2. Recuperado de: http://www.scielo.org.co/pdf/cide/v9n2/0121-7488cide-9-02-9.pdf

-

Güerri, M. (2004). Estudio de la resistencia a antibióticos (beta)- lactamicos en aislamientos clínicos de Salmonella typhimurium. Universidad Complutense de Madrid,

Facultad

de

Medicina.

Recuperado

de:

https://www.researchgate.net/publication/39158968_Estudio_de_la_resistencia_ a_antibioticos_betalactamicos_en_aislamientos_clinicos_de_salmonella_typhimurium

CUESTIONARIO a. ¿Puedo modificar genéticamente un organismo? ¿Qué organismo? Si se puede modificar genéticamente un organismo, este puede ser una planta, animal, hongo o bacteria a la que se le ha agregado por ingeniería genética uno o unos pocos genes con el fin de producir proteínas de interés industrial o bien mejorar ciertos rasgos, como la resistencia a plagas, la calidad nutricional, la tolerancia a heladas, entre otras características. La posibilidad de transferir genes de una especie a otra y patentar organismos vivos genéticamente modificados con utilidad industrial ha posibilitado el crecimiento enorme de la biotecnología y generado intereses comerciales con un amplio poder de empresas biotecnológicas. OGM: Maíz dulce, Arroz dorado, Tomate de larga duración, Fresas, piñas, pimientos y plátanos son otros ejemplos de productos alimenticios modificados genéticamente por los científicos para que se mantengan frescos durante más tiempo.

b. Para modificar genéticamente un organismo, se debe insertar un nuevo gen en cada célula del

organismo. ¿Qué organismo será

más apropiado para ser

modificado genéticamente, uno pluricelular o uno unicelular? La complejidad de los genomas eucarióticos hace que el estudio de un gen y de su expresión sea muy difícil. Las bacterias además de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos. El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosos para la sobrevivencia de la bacteria.Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética por la facilidad con la que se manipulan. Los plásmidos usados en Ingeniería Genética contienen uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos (marcadores selección) y permiten seleccionar clones recombinantes.

c. Los científicos a menudo quieren saber si los organismos modificados genéticamente pueden pasar sus nuevas características a su descendencia y futuras generaciones. Para obtener esta información, ¿Qué organismo será más apropiado para el experimento?,¿uno que crezca y se reproduzca rápidamente, uno que lo haga más lentamente? Las especies que se eligen como modelo tienen las siguientes características en común: Fácil manutención y manipulación en el laboratorio. -Ciclos de vida cortos. -Gran número de descendencia. -Disponibilidad de variabilidad fenotípica y genotípica. -Fenotipo de interés sencillo de observar o medir. -Técnicas de estudio puestas a punto para estas especies

d. La seguridad es otro factor importante al elegir el organismo. ¿Qué características debe tener o no tener el organismo para asegurarnos de que no nos dañara ni a nosotros ni al medio ambiente? Características *No debe presentar riesgos sanitarios, como: Resistencia a antibióticos: riesgo teórico que el gen que da resistencia al antibiótico pase a la bacteria del tracto intestinal humano, directa e indirectamente, un ejemplo, es vía bacterias del tracto intestinal de los animales con maíz transgénico no procesado. Alergenicidad: riesgo de aparición de alergias insospechadas. *No debe presentar riesgos ecológicos. Afectación a la biodiversidad: riesgo de contaminación, ejemplo, por el polen de plantas transgénicas hacia otras no transgénicas del mismo cultivo, pudiendo alterar la diversidad biológica.

Cruzamiento lejano: riesgo de transferencia de la resistencia a herbicidas hacia especies silvestres afines.

Contaminación: como consecuencia del riesgo de transferencia, la resistencia a herbicidas puede difundirse en plantas silvestres que, si son indeseables para los cultivos, podrían dar lugar al incremento de usos de herbicidas, con el riesgo de contaminación de suelos y de aguas. Además, otras de las características se debe a la gran versatilidad en la ingeniería, puesto que los genes que se incorporan al organismo huésped pueden provenir de cualquier especie, incluyendo bacterias e. Teniendo en cuenta las cuestiones anteriores, ¿cuál será la mejor opción para realizar la modificación genética: una bacteria, una lombriz, un pez o un ratón? Razona la respuestaUna bacteria por poseer un genoma sencillo, lo hace fácil de manipular y de esta manera una buena herramienta en ingeniería genética. Una bacteria sería la mejor opción debido a que al realizar el proceso de transformación de células (por ejemplo de E. coli) se demuestra la habilidad de este DNA para modificar permanentemente la herencia genética de las células que lo adquieren, para ello se transformará con un plásmido que contiene su propio ori y un gen de resistencia a antibiótico. Además como se reproducen con rapidez y son fáciles de desarrollar, las bacterias transgénicas producen hoy infinidad de sustancias importantes y útiles para la salud y la industria. En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plásmidos de unas a otras, pudiendo así compartir esos genes beneficiosos (los plásmidos son abundantes en bacterias f. ¿Qué son las células electrocomepetente? Las

células

electrocompetentes

funcionan

mediante

el

proceso

de

electroporación. Los impulsos eléctricos crearon poros que permiten que el material genético impregne la membrana bacteriana. Son ideales para aplicaciones de clonación.

g. ¿Cuáles son las ventajas de la electroporacion comparada con la transformación con calcio? El método del fosfato cálcico es un metodo químico en el cual se realiza una mezcla de DNA con iones calcio, con una subsiguiente adición de fosfato a la mezcla y la presentación de la solución final a las células en cultivo. En esta situación se precipitan el DNA y los iones calcio formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. La eficiencia de transfección puede ser mayor al 50% dependiendo del tipo celular y del tamaño y calidad del precipitado que se forma. Este método tiene como ventaja, frente a los otros métodos, su simplicidad, facilidad de producción y su relativa baja toxicidad. La electroporación es un método físico; ésta técnica que se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto, tiempo durante el cual las células despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA,...). Esta técnica se aplica a millones de células a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones).

a)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3173775/ b) c) d) e) f)https://www.thermofisher.com/co/en/home/life-science/cloning/competent-cellsfor-transformation/electrocompetentcells.html?gclid=CjwKCAjw583nBRBwEiwA7MKvoORuFwDOmNZS7p8whSlIIr ePWbd3c-LSZopKYJInzYgKm8PJtRPmxoC2PsQAvD_BwE&ef_id=CjwKCAjw583nBRBwEiwA7MKvoORu FwDOmNZS7p8whSlIIrePWbd3c-LSZopKYJInzYg-

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