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Manual de Prácticas de Bioquímica NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 1.

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El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual debe de ser blanca y de manga larga. Es indispensable portar la bata abotonada. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc. Está terminantemente prohibido el uso de audífonos durante la práctica, salvo que estos se requieran por deficiencia auditiva del estudiante Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de seguridad disponibles. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos. En ningún momento se permitirá la aplicación de cosméticos, fumar, comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que ellos se contaminen con productos químicos. Limpiar las mesas de trabajo antes y después de cada práctica. Para evitar quemaduras, se deberán apagar mecheros, planchas calientes o ambos cuando éstos no se utilicen. Así mismo, se deberán emplear gradillas o pinzas para sostener o transportar tubos calientes. Mantener las sustancias químicas inflamables alejadas del fuego, planchas calientes o ambos. No se deberá olfatear, probar reactivos o ambos o las soluciones. No se debe mirar nunca la interior de un tubo de ensayo que se esté calentando, ni apuntar hacia alguna persona porque el contenido podría proyectarse en cualquier momento. La misma precaución debe tomarse cuando se mezclan reactivos o se agiten vigorosamente los tubos. Utilizar pipetores o perilla de goma para la medición de los líquidos corrosivos, ácidos, bases, sustancias volátiles, venenos entre otros. No aspirar con la boca. Evitar agregar agua sobre ácidos para evitar quemaduras por proyección. Para diluir cualquier ácido, se vierte el ácido sobre el agua y nunca agua sobre ácido. Emplear baño de hielo o baño de agua fría para preparar soluciones diluidas de ácidos. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar derrames. Usar guantes desechables cuando se manipulen muestras biológicas. Considerar que cualquier material biológico es potencialmente infeccioso aún cuando proceda de personas aparentemente sanas. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del laboratorio. No se puede hacer ningún experimento no autorizado. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.

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Manual de Prácticas de Bioquímica ACCIONES QUE SE DEBEN TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE 1. 2.

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En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojos o boca, se recomienda enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir su acción por dilución. En caso necesario llamar inmediatamente a los teléfonos de emergencia: Compañía de Bomberos (119), Cruz Roja Arequipa (Telefax: 054-204343, Móvil: 95-9576843, RPM: #842761). En caso de ingestión de corrosivos NUNCA provocar vómito. Si existe ingestión de ácidos hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (2 cucharadas soperas en 2 vasos con agua); en caso de ingestión de soluciones cáusticas (hidróxido de sodio o de potasio) ingerir una cucharada de vinagre o 25 ml de jugo de limón en agua. Al ingerir otras sustancias químicas hacer vomitar a la persona accidentada. Vigilar que exista una ventilación adecuada y mantener las vías áreas permeables mientras se traslada al hospital. Si existe derramamiento de un ácido, neutralizar agregando bicarbonato de sodio y en caso de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza.

RECOMENDACIONES PARA TENER EXITO EN LAS PRÁCTICAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

El alumno deberá leer la práctica completa y la discutirá con el profesor antes de la realización de la misma. Los útiles y objetos personales deberán ser colocados en la parte inferior de las mesas de trabajo. El material con el que se trabajará deberá estar perfectamente limpio antes y después de la práctica. Antes de preparar las mezclas de reacciones etiquetar adecuadamente cada uno de los tubos de ensayo con marcador indeleble. Por ningún motivo alterar el orden de adición de reactivos en la práctica. Utiliza agua destilada en todos los experimentos en los que se solicite agregar agua. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar contaminación o vaporización de los mismos. Utilizar sólo la cantidad requerida de reactivos para evitar el desperdicio de los mismos. Evitar regresar excedentes de reactivo al frasco de donde se extrajo el mismo.

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Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA 1 USO DE MATERIAL, EQUIPOS DE LABORATORIO Y PREPARACIÓN DE SOLUCIONES OBJETIVOS 1. Identificar los materiales y equipos comúnmente empleados en un laboratorio de Bioquímica 2. Utilizar apropiadamente algunos de los equipos de laboratorio 3. Preparar soluciones porcentuales, molares y normales 4. Preparar soluciones valoradas INTRODUCCIÓN La aplicación de algunos de los conocimientos teóricos obtenidos en el salón de clase se logran mediante prácticas de laboratorio en las que se requiery el manejo apropiado de equipos de laboratorio como: espectrofotómetro, baño maría, agitador magnético, centrífuga, pHmetro, pipetas (serológicas y automáticas), material de vidrio, etc. Así mismo el estudiante debe emplear el vocabulario apropiado y conceptos comúnmente empleados en el laboratorio. SOLUCIONES Una solución es una mezcla homogénea formada por dos componentes: solvente y soluto; el solvente disuelve al soluto y está en mayor proporción. Las soluciones, físicamente se clasifican en: a) Líquidas.- Sólido en líquido, líquido en líquido y gas en líquido. b) Gaseosas.- Sólido en gas, líquido en gas y gas en gas. c) Sólidas.- Sólido en sólido, líquido en sólido y gas en sólido. Los factores que afectan la solubilidad son las propiedades del soluto y del solvente como la polaridad y el carácter iónico. Los factores que afectan la velocidad de disolución son: tamaño de partícula, cantidad de soluto, agitación, temperatura. La concentración de una sustancia es la cantidad de uno de los componentes de la solución (casi siempre el soluto) disuelto en la unidad de solución. La medida de la concentración puede hacerse empleando unidades químicas o unidades físicas. SOLUCIONES NORMALES Son las que contienen un equivalente gramo de sustancia por litro de solución.

Así, una solución normal de HCl, contiene un átomo gramo (1.008 g.) de hidrógeno, y una solución normal de base contiene un gramo del radical hidroxilo (17.008 g.) por litro de solución. Las soluciones valoradas se corresponden volumen a volumen; así, un mililitro de solución normal de ácido neutraliza exactamente a 1 ml. de solución normal de base. La normalidad de una solución es el número de equivalentes de soluto por litro de solución. Una solución 1 N de un ácido contiene un equivalente de ese ácido por litro, o un mol de iones de hidrógeno ionizables por litro de solución. La normalidad de una solución se encuentra dividiendo el peso de la sustancia contenida en un litro de solución entre el equivalente gramo de dicha sustancia. 3

Manual de Prácticas de Bioquímica PESO EQUIVALENTE Llamado también equivalente gramo (Eq), es la cantidad de elemento o compuesto que se combina o equivale a 1.008 g. de hidrógeno o a 8.00 g. de oxígeno, así:

Ejm. H2SO4 HNO3

Peso fórmula gramo

Peso equivalente gramo

98 g. 63 g.

49 g. 63 g.

Ejm. KOH Ca(OH)2

Peso fórmula gramo

Peso equivalente gramo

56 g. 74 g.

56 g. 37 g.

La milésima parte del peso equivalente gramo, es el miliequivalente y se expresa en miligramos. Así, el miliequivalente de H2SO4 es: 49 / 1000 = 49 mg.; el milequivalente se abrevia como mEq. SOLUCIONES PORCENTUALES Representa la proporción del soluto que se encuentra en una solución utilizando la base 100 expresada en gramos o en mililitros. Existen cuatro diferentes formas para referirse a la concentración porcentual como se muestra a continuación: 1. Porcentaje en peso (%p/p): número de gramos de soluto en 100 g de solución 2. Porcentaje en volumen (%v/v): número de mililitros de soluto en 100 mililitros de solución 3. Porcentaje en peso-volumen (%p/v): número de gramos de soluto en 100 mililitros de solución 4. Porcentaje en moles (%Moles): número de moles de soluto en 100 mililitros de solución SOLUCIONES MOLARES Número de moles en un litro de solución

Mol: se define como el peso molecular de una sustancia expresado en gramos. La masa molecular o peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de cada uno de los pesos atómicos de cada uno de sus componentes; por ejemplo el peso molecular del ácido sulfúrico (H2SO4) es de 98 g/Mol. SOLUCION ESTANDAR Es una sustancia de composición química conocida, de alto grado de pureza, de gran estabilidad química en el ambiente, que se puede pesar directamente para formar soluciones utilizadas para la titulación exacta de soluciones cuya concentración normal es desconocida. 4

Manual de Prácticas de Bioquímica Debe además, tener un peso equivalente gramo alto para que el error en la pesada sea lo mas bajo posible. Ejm.: ácido oxálico (HOOC-COOH.2H2O, P.M. 126.0480), su peso equivalente será 126.048/2 = 63.024 g. de ácido oxálico que disuelto al volumen de un litro corresponde a la concentración de una solución 1 N. Otro ejemplo de patrón primario es el ftalato ácido de potasio (biftalato de potasio: KHC8H4O4), P.M. 204.228 g. que disuelto en un volumen de 1000 ml en un matraz aforado (fiola), nos proporciona una solución 1N; el carbonato de sodio, etc. SOLUCIONES DE PARTES POR MILLÓN Representa la proporción de las moléculas de un soluto presentes en un millón de moléculas de una mezcla. Es utilizada en situaciones en las cuales un soluto se encuentra en concentraciones extremadamente bajas. Por ejemplo la cantidad de Mercurio en suelo. CENTRÍFUGA La centrífuga es un método empleado para separar partículas en base a la velocidad de sedimentación de cada una de ellas como resultado de la fuerza centrífuga a las que son sometidas. El equipo empleado para realizar la centrifugación es la centrífuga (Fig. 1), la cual está constituida de un motor eléctrico que lleva un dispositivo que gira alrededor de un eje vertical, el rotor y cuyo resultado es el aumento de la atracción gravitacional en el fondo del tubo que contiene la muestra. El resultado de toda centrifugación es la separación de 2 fases, una fase insoluble denominada residuo, precipitado o “debris celular” y una fase líquida llamada sobrenadante.     

El uso adecuado de la centrífuga implica: Los tubos de la centrífuga deben colocarse por pares uno al frente del otro y deben tener el mismo volumen o peso La velocidad y el tiempo de ser programado en el panel de la centrífuga Colocar el rotor adecuado al tipo de tubo a usar Antes de prender la centrífuga debe estar tapada Levantar la tapa cuando ésta esté totalmente detenida

Figura 1. Centrifuga refrigerada

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Manual de Prácticas de Bioquímica POTENCIÓMETRO O pHMETRO Es un medidor de pH (Fig. 2), que permite determinar la concentración de iones hidrógeno midiendo la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solución problema, y un electrodo de vidrio sensible a hidrogeniones. El uso del potenciómetro depende del modelo. Sin embargo en forma general debe tener los siguientes cuidados:  Los electrodos deben lavarse antes y después de utilizarse, y no se deben tocar con la mano  Antes de ser utilizado debe ser calibrado con soluciones de referencia (pH 4, pH 7º pH 10)  Los electrodos o electrodo debe mantenerse en agua destilada cuando no estén en uso y evitar que se sequen. Si esto ocurre, los electrodos deben ser sumergidos en agua destilada y calibrarse varias veces antes de proceder hacer las mediciones.

Figura 2. pHMETRO

ESPECTROFOTÓMETRO Aparato que sirve para medir la intensidad de luz absorbida por una solución, en un estrecho intervalo de longitudes de onda del espectro UV/Visible.

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Manual de Prácticas de Bioquímica En general consta de: a) una fuente de luz (UV, visible, infrarrojo); b) un monocromador, que mediante un prisma o red de difracción dispersa la luz en un espectro, y luego selecciona una longitud de onda o un cierto intervalo de ese espectro y lo dirige hacia la sustancia problema y; c) un sistema de detección que transforma la energía luminosa que recibe, en energía eléctrica (Fig. 3, 4).

Figura 3. Diagrama de un espectrofotómetro

En resumen, la luz monocromática pasa por una cubeta que contiene la solución problema y la luz transmitida es medida empleando una célula fotoeléctrica. La corriente eléctrica producida por la luz transmitida es proporcional a su intensidad, y se lee la corriente en un galvanómetro. Con estos aparatos es posible obtener un espectro de absorción, determinando la absorbancia a diferentes longitudes de onda.

Figura 4. Espectrofotómetro

PIPETAS AUTOMÁTICAS En bioquímica, la habilidad para medir de manera exacta y reproducible y transferir volúmenes pequeños de líquidos son críticos para obtener resultados útiles. Para los volúmenes menores de 1 ml, el método más común para medir líquidos requiere el uso de un dispositivo conocido como micropipeta (Fig. 5). Las pipetas que usa pueden no parecerse a las mostradas. Las micropipetas usadas en este laboratorio vienen en tres diferentes presentaciones. 7

Manual de Prácticas de Bioquímica   

P1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000 µL P200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 µL. P20 es útil para volúmenes de 0.5 hasta 20 µL.

Figura 5. Micropipetas

Asegúrese que está usando la micropipeta correcta para el volumen que necesita. También, asegúrese que la micropipeta está realmente lista para el volumen que necesita revisando la “ventana de volumen”, y, si es necesario, cambiando el volumen mediante el “dispositivo” del control o mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la necesita). No Trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta. Toda micropipeta utiliza puntas desechables (no utilice la pipeta sin usar la punta apropiada, hacer esto contaminará la micropipeta y la puede dañar). No utilizar la micropipeta con líquidos que atacan el polipropileno. No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores. La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C. Al poner la punta, asegúrese que la punta sea del tipo correcto y que está correctamente ajustada. Generalmente para P1000 las puntas son azules, para P200 son amarillas y para P20 pueden ser amarillas o blancas.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO 1: PREPARACION Y TITULACION DE UNA SOLUCION DE NaOH 0.1 N Para preparar una solución de NaOH, es necesario partir de una solución saturada preparada con anticipación. SOLUCION SATURADA DE NaOH.- Pesar 100 g. de NaOH, disolver en 100 ml. de agua destilada libre de CO2; colocar este preparado en un frasco provisto de un tapón de jebe y dejar en reposo por una semana para sedimentar los carbonatos. Decantar el líquido claro y guardar en frasco parafinado y rotular con fecha. Esta solución es aproximadamente 19 N. 8

Manual de Prácticas de Bioquímica SOLUCION PATRON DE ACIDO OXALICO 0.1 N.- Pesar con precisión 6.302 g. de ácido oxálico desecado en estufa a 110ºC por 10 minutos y colocarlo en un matraz aforado (fiola) de 1000 ml; añadir agua destilada, agitando continuamente hasta una completa disolución del ácido oxálico. Agregar agua hasta el aforo y homogenizar. Como la concentración es conocida con precisión, se denomina solución estándar (= patrón) y servirá para estandarizar las soluciones. SOLUCION 0.1 N de NaOH.- Medir 0.6 ml. de solución saturada de NaOH y colocar en un matraz aforado de 100 ml. Completar con agua destilada hasta la marca y homogenizar. Proceder a la titulación de esta solución, pasando a un Erlenmeyer 10 ml de ácido oxálico 0.1 N, exactamente medidos. Agregar 3 gotas del indicador fenolftaleina al 1%. Lleve este preparado debajo de una bureta que ha sido previamente llenada con la solución de NaOH aproximadamente 0.1 N; se deja caer esta solución graduando la velocidad de caída y agitando continuamente la solución patrón hasta la aparición de un color rosado estable. Para hallar la normalidad de la solución, se puede aplicar la siguiente expresión: V1 x N1 = V2 x N2 Donde: V1 = Volumen conocido N1 = Normalidad conocida V2 y N2 = Uno de ellos se desconoce Ejm. Supongamos que se ha gastado 9.5 ml de solución de NaOH aproximadamente 0.1 N, tendremos: 10 x 0.1 = 9.5 x N2 N2 = 10 x 0.1 / 9.5 N2 = 0.105 La normalidad de la solución es 0.105 N, pero queremos que la solución sea exactamente 0.1 N; para eso, debemos agregar una determinada cantidad de agua para corregir la normalidad aplicando la siguiente regla: ml de agua = A x B / C Donde: A = Volumen de la solución a corregir. Ej. 90.5 ml de NaOH 0.105N B = Volumen patrón primario, menos solución a corregir gastada. Ej. 10 - 9.5 = 0.5 C = Volumen de la solución a corregir, gastado durante la titulación. Ej. 9.5 ml. Se deduce que quedan 90.5 ml de NaOH aproximadamente 0.1 N, que se ha necesitado 9.5 ml para neutralizar 10 ml de solución de ácido oxálico 0.1 N y que la diferencia entre 10 ml y 9.5 ml es igual a 0.5 ml. Entonces tendremos: ml de agua = 90.5 x 0.5 / 9.5 ml de agua = 4.34 Bastará con añadir 4.34 ml de agua destilada para obtener una solución exactamente 0.1 N de NaOH.

EXPERIMENTO 2: PREPARACION Y TITULACION DE UNA SOLUCION DE HCl 0.1N Se considera la valoración de ácido clorhídrico con NaOH 0.1, por lo siguiente: a) Respecto al ácido clorhídrico: posee más ventajas frente a otros ácidos minerales. b) Respecto al NaOH: Fue valorado frente a un patrón primario, lo cual garantiza mayor precisión en los resultados. 9

Manual de Prácticas de Bioquímica El HCl concentrado tiene las siguientes características: PM = 36.5, pureza 37%, gravedad específica 1.19, lo que da a entender que 1 ml. de esta solución pesa 1.19 g. Si 1.19 x 0.37 da 0.44 g. de HCl puro, el volumen necesario para obtener una solución normal será: 36.5 / 0.44 = 83 (82.95 ml) de HCl, que serán disueltos hasta obtener un volumen de 1000 ml. Para preparar 100 ml de solución 0.1 N, se toma 0.83 ml de HCl y se disuelve hasta obtener un volumen de 100 ml, en fiola. Para la titulación se llenará una bureta con esta solución, mientras que en un beaker de 100 ml, se verterá 10 ml de solución de NaOH exactamente 0.1 N y 3 gotas de anaranjado de metilo. Se deja caer la solución de NaOH 0.1 N (patrón), agitando constantemente hasta viraje del indicador. Se anota el gasto y se calcula la normalidad con la expresión: V 1 x N1 = V2 x N2. Si hay necesidad de corregir el volumen, se aplica la regla ya conocida. Cuando se trata de elementos o sustancias monovalentes, las soluciones normales son a la vez molares, porque tienen la misma concentración.

CUESTIONARIO: 1. Se dispone de una solución de NaOH 0.14 N, cuanto se debe medir de esta solución para preparar 500 ml exactamente 0.10 N ? 2.

Se quiere preparar 250 ml se solución de H2SO4 0.02 N a partir de una solución concentrada, cuya densidad es 1.84 gr/ml y con 96% de pureza. Cuántos ml se debe tomar de esta solución ?

3.

Cuántos ml de una solución concentrada de HCl serán necesarios medir para preparar 500 ml de HCl 0,035 N ?

4.

Cuántos ml de HCl 0.5 N se requieren para que reaccionen exactamente con 2 g. de hidróxido de calcio ?

5.

Calcular la normalidad de una solución de HCl, sabiendo que 50 ml de esta solución necesitan 60 ml de NaOH 0.1 N para neutralizarse.

6.

Cuántos moles de NaCl hay en 100 ml de solución 2 M ?

7.

Cuál es la normalidad de una solución que se prepara disolviendo 58.5 g. de NaCl en 500 litros de agua ?

8.

Qué volumen de HNO3 0.85 N se necesitará para neutralizar 36 ml de NaOH 0.86 N ?

9.

Cuál es la molaridad de una solución que contiene 250 g. de CaCl 2 en 1500 ml de solución?

10. Cuántos ml de una solución de H2SO4 0.05 M, serán necesarios para titular completamente 250 ml de NaOH 0.075 N?.

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Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA 2 COLORIMETRIA Y FOTOMETRIA Muchos experimentos en bioquímica dependen de la absorción de la luz monocromática, de una solución, en la región visible y ultravioleta del espectro electromagnético. Muchas moléculas de interés biológico absorben la luz en la longitud de onda comprendida entre 200 - 800 nm ó 2000 - 8000 Å. Por ejm., purinas, pirimidinas y ácidos aromáticos, así mismo los ácidos nucleicos y las proteínas. Otros ejm., son las hemoproteínas (citocromos, hemoglobina y mioglobina) carotenoides y esteroides. Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda; pero en otras casos es necesario transformar la sustancia a un derivado coloreado, usando un reactivo adecuado. Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución pueden usarse como medida de su concentración. La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material de concentración desconocida se compara, mediante el color, con un estándar que contiene una concentración conocida del mismo material. Hoy se usa poco ésta técnica. La mayor parte de procedimientos analíticos usan el principio fotométrico, es decir, la medida de potencial transmisor de luz de una solución coloreada, a una longitud de onda espectral específica. Muchos aparatos llamados "colorímetros" son realmente fotómetros según la estricta definición. Si la longitud de onda puede seleccionarse a lo largo de un intervalo continuo, interponiendo un prisma o una red de dispersión, entre la fuente de luz y la muestra, el instrumento se denomina "espectrofotómetro". En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través de una solución que contiene materiales absorbentes con la transmisión de la misma luz a través de otra solución que solo contiene disolvente. Esta última se denomina solución de referencia o reactivo blanco o simplemente blanco; debe ser idéntica a la primera excepto en que carece de los materiales absorbentes de la luz que han de estudiarse. Ambas soluciones deben medirse bajo idénticas condiciones de longitud de onda, intensidad de luz incidente y anchura de cubeta (longitud de paso de luz). 1. ENERGIA RADIANTE Las radiaciones electromagnéticas, conocidas corrientemente como luz, están compuestas por paquetes de energía llamados fotones o cuantos. De acuerdo a la longitud de onda, se conocen tres zonas: a) Ultravioleta (UV), comprende radiaciones de 100 a 300 nm de longitud; b) Luz Visible (color), está constituida por radiaciones electromagnéticas de 390 a 770 nm de longitud de onda y c) El Infrarrojo, entre 2000 a 30000 nm. Una onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que están en fase, pero son perpendiculares a la dirección de propagación. La longitud de onda, de la luz, se da en cm y se relaciona con la velocidad de luz en el vacío, en cm/seg, y con la frecuencia, en ciclos/seg:

Longitud de onda (), es la distancia entre los nudos de dos ondas de radiación adyacente. Se mide en cm, nm, mm, mm, Å. La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor al atravesar sustancias transparentes. La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en ciclos/seg. 11

Manual de Prácticas de Bioquímica La luz interacciona con la materia principalmente a través del campo eléctrico oscilante. Para fines de absorción debe tenerse en cuenta que la luz es un paquete de energía o fotón hv, donde h es la constante de Planck, 6.627 x 10-27 ergios segundo, y v es la frecuencia. De aquí se desprende que la energía de la luz es directamente proporcional a la frecuencia:

y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda. Hay absorción de luz cuando la energía del fotón, hv, corresponde a la diferencia entre los niveles de energía de la molécula. 2. LEYES DE ABSORCION En Química Biológica se emplea la fotometría principalmente para regular o controlar la concentración de diversas especies en mezclas de reacción. La absorción de luz a una longitud de onda dada, está relacionada con la concentración de especies absorbentes por medio de dos leyes. 2.1. Ley de Lambert. Lambert estudió la cantidad de luz monocromática absorbida por un cuerpo y enunció la ley que dice: "la fracción de luz absorbida es proporcional al espesor del absorbente x, e independiente e la intensidad de luz", o en otros términos, "la proporción de luz incidente, absorbida por el medio, es independiente de su intensidad y cada sucesiva capa unidad de medio, absorbe una fracción igual de la luz que pasa a través de él". Por ejm., si la luz incidente es 100% y cada capa unidad de espesor x, absorbe el 20% de la luz incidente, la luz transmitida es el 80%. Para otras capas unidad de espesor x, la luz transmitida disminuirá 0 1 2 3 como sigue: 64%, 51.2%, etc. que es la secuencia (0.8) , (0.8) , (0.8) , (0.8) , etc. Lo que conduce a la expresión matemática:

Donde: I0 = Intensidad e la luz incidente I = Intensidad de la luz transmitida x = grosor de la capa en cm α = coeficiente de absorción del medio En forma logarítmica tenemos:

Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se convierte en coeficiente de extinción molar k o sea

por tanto

Donde: log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente proporcional a x. 2.2. Ley de Beer. Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una sustancia coloreada sobre la transmisión de la luz monocromática y halló la misma relación entre la transmisión y el espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la luz se absorbe solamente cuando un fotón choca con una molécula, la ley de Beer puede anunciarse 12

Manual de Prácticas de Bioquímica como sigue: "cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, la cantidad de luz absorbida o la probabilidad de absorción es proporcional al número de moléculas c, contenidas en el haz de luz".

donde: c = concentración en mol/l. Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el número de moléculas absorbentes. Por ejm., en el caso anterior se hizo variar el espesor de la capa, ahora si hacemos que el espesor de la capa sea constante, es decir que sea 1 cm y variamos la concentración de la solución de la sustancia coloreada tenemos que: si consideramos la Io como 100% y la absorbancia de cada una de las concentraciones c, es 50% de la luz incidente, la luz transmitida es 50%. Para otras concentraciones c, la luz transmitida disminuirá como sigue: 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, etc. La ley de Beer es exacta sólo para luz monocromática y en muchos casos no se cumple sobre todo a concentraciones altas. 2.3. Ley de Beer-Lambert. Es evidente que pueden combinarse las leyes de Beer y Lambert, ya que tanto c como K incluyen un factor de concentración, de donde:

E = coeficiente de extinción molar c = concentración en moles/litro De aquí se deduce:

por consiguiente:

La ley combinada de Beer-Lambert nos dice que: "la fracción de luz incidente absorbida por una disolución, a una determinada longitud de onda, está relacionada con el espesor de la capa absorbente x, y con la concentración c, de la especie que absorbe". La Ley de Beer Lambert supone que la luz incidente es paralela y monocromática, y que las moléculas del disolvente y del soluto están orientadas al azar. 2.4. Coeficiente de extincion molar. Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la densidad óptica (log10 I0 / I) de una solución 1 M de la sustancia con un recorrido luminoso de 1mol/l 1 cm y generalmente se escribe E 1cm . La densidad óptica carece de dimensión, por lo que E se expresa en términos de litros (concentración x longitud). E se expresa en unidades de -1 -1 2 litros moles cm ; es decir, en cm / mmol y es numéricamente equivalente a la densidad óptica de una solución milimolar de la sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm. Con 1% frecuencia se utiliza el término E 1cm , que es la extinción de una solución al 1% (1 g/100 ml) cuando el camino recorrido por la luz es igual a 1 cm. 2.5. Coeficiente de extincion específica. En muchas ocasiones no se conoce el peso molecular de algunos compuestos tales como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una mezcla y entonces se acostumbra expresar la concentración en g/l. En estos casos, se emplea el coeficiente de extinción específico. Se le define como la densidad óptica de una solución al 13

Manual de Prácticas de Bioquímica 10% (10g/l) del compuesto cuando el recorrido de la luz es 1 cm, E

10g/l 1cm

.

2.6. Transmitancia (T). Es la capacidad de una solución para transmitir la luz. Se define como la relación entre la intensidad de la luz que sale de la solución y la intensidad de luz entra a ella.

Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este valor es tanto menor de 1 cuanto mayor sea la luz absorbida por la solución. Se acostumbra, también, expresar la transmitancia como porcentaje, es decir, porcentaje de luz transmitida:

Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a 100%, la expresión de Beer - Lambert será:

2.7. Absorbancia (A) o Densidad Óptica (D.O) o Extinción (E). Es la cantidad de luz absorbida por una solución, equivalente al logaritmo negativo de la transmitancia y se mide en unidades de 0 a 2 en la escala de absorción; 2 es el logaritmo de 100% de transmitancia. Este es ó puede también calcularse restando a 2 el logaritmo del porcentaje de transmitancia;

Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la absorbancia es directamente proporcional a la concentración. La pendiente de la recta es Ex, y el valor de la ordenada para c = 0 se considera cero. Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con agua (blanco); la lectura de una solución de K2Cr2O7 en el mismo espectrofotómetro indica que T% = 50 y la absorbancia es 0.301. Solución: Hemos dicho que -log T ó -log I/I0 se denomina absorbancia. En este ejemplo:

Como:

tenemos:

reemplazando tenemos:

14

Manual de Prácticas de Bioquímica Ya que en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la absorbancia se puede calcular a partir de:

2.8. Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Aunque la ley de Lambert se cumple en todos casos hasta hoy estudiados, la de Beer tiene algunas alteraciones. Algunas veces la relación lineal entre la absorbancia y la concentración predicha por la ley de Beer, no se cumple. Los tres tipos de desviaciones son: a) instrumentales, que pueden ser ópticos, mecánicas o ambas, b) las relacionadas con las muestras y; c) experiencia del investigador. 2.8.1. Desviaciones Instrumentales. La ley de Beer solo se cumple para luz monocromática. En la práctica nunca se obtiene luz totalmente monocromática. La monocromaticidad puede variar cambiando el ancho de la rendija. Para la región visible del espectro se usan los fotocolorímetros. Difieren de los espectrofotómetros en que usan filtros para obtener luz monocromática en lugar de un prisma o red y una rejilla. Los filtros dejan pasar una ancha banda de luz; por ejm., un filtro de 540 nm deja pasar una luz que oscila entre 525 y 555 nm. Por el contrario las rendijas de los espectrofotómetros ayudan a seleccionar mejor la longitud de onda a usarse, por lo cual se puede suponer que con estos aparatos la ley de Beer tiene una menor desviación. También, la ley de Beer se desvía con la luz no paralela. 2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra. Se deben al cambio en la concentración efectiva de la especie absorbente o la interferencia debida a los productos de alguna reacción secundaria. Muchas especies absorbentes contienen grupos ácidos o básicos. Puesto que los conjugados del par ácido-base tienen una absorción diferente, si no se controla el pH habrá desviaciones. De igual modo, si el equilibrio de la especie depende de la temperatura, habría desviaciones si la temperatura sufre cambios. Si las moléculas del absorbente se absorben a las paredes de la celda durante el curso de la observación, disminuyen la concentración efectiva en la disolución y producen desviaciones aparentes de la ley de Beer, Los disolventes también pueden cambiar las características de absorción. Las soluciones muy concentradas, que originan un color muy intenso, también originaran desviaciones ya que la ley se cumple solo hasta cierto límite máximo de concentración, característico para cada sustancia. 2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador. Principalmente se deben a una mala elección de longitud de onda. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución. Esto permite también conseguir la sensibilidad óptima. 3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION Es muy difícil medir la concentración de las soluciones con exactitud por espectrofotometría, ya que en algunos casos la intensidad de radiación transmitida I, es muy pequeña, mientras en otras es muy alta. En la práctica, I debe de estar entre el 10% y el 90% de Io (es decir, la absorbancia debe de estar entre 1.0 y 0.05), pero las medidas más seguras se realizan cuando I » 50% de Io (es decir, absorbancia = 0.3). Estas condiciones pueden conseguirse modificando la concentración del compuesto, el espesor de la célula o cambiando la longitud de onda de la radiación (es decir, variando E). El primer procedimiento es el que se realiza con más frecuencia. 4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA Existen tres formas de cálculo. 4.1. Mediante el factor de calibracion (Fc). Resulta de dividir la concentración del estándar entre la absorbancia del estándar: 15

Manual de Prácticas de Bioquímica

el factor obtenido se multiplica por la lectura o absorbancia del o de los tubos que contienen la solución problema, obteniéndose así la concentración de la muestra o muestras. Para expresar la concentración en porcentaje, se toma en cuenta el volumen utilizado 100/V. Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:

donde: Ast = absorbancia del estándar o patrón Am = absorbancia de la muestra problema Cst = concentración del estándar o patrón teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la misma sustancia el coeficiente de extinción K, será el mismo. Relacionando las dos expresiones tenemos:

despejando:

Ya que tanto la lectura del problema como del patrón son equivalentes a la absorbancia, se tiene:

Nótese que Cst / Ast es un constante y puede usarse como un factor sobre todo cuando se va a determinar la concentración de una serie de muestras. Por tanto, la ecuación anterior se puede reducir a :

donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje se escribe:

v = volumen de la muestra utilizada para la determinación. 4.2. Mediante curvas de calibración. En este caso se utilizan varios patrones de concentraciones progresivas y un blanco (el blanco contiene todos los componentes de la muestra menos la sustancia a determinar). Luego se realiza la lectura (de absorbancia) usando el filtro o la longitud de onda para la cual la sustancia tiene la máxima absorción. Se registra el valor de absorbancia en una tabla. Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las lecturas correspondientes a los patrones en el eje de las "y" (eje de ordenadas) y las concentraciones de los mismos en el eje de las "x" (eje de abscisas), con lo cual se obtiene una recta, que pasa por cero si la sustancia obedece la ley de Beer-Lambert. La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el eje de las ordenadas de la gráfica anterior, luego por este punto se traza una perpendicular a

16

Manual de Prácticas de Bioquímica dicho eje hasta encontrar la curva (trazada con la lectura y concentración de los patrones). En seguida, por este punto de intersección se traza una paralela al eje de ordenadas hasta tocar el eje de abscisas (eje de concentración). Por lo tanto, la concentración de la muestra problema está dada directamente por este punto del eje de abscisas. En la curva de calibración puede observarse que hay una parte de la curva dentro de la que se cumple perfectamente la ley de Beer-Lambert, es la parte recta que corresponde a una función lineal. Sin embargo, puede también aplicarse a valores superiores por extrapolación siempre que las desviaciones con respecto a la recta no sean muy grandes. Además el uso de la gráfica elimina los errores que podrían aparecer como consecuencia del uso del cálculo de proporcionalidad en una región donde no se cumple la ley de Beer-Lambert. Esto último corrobora la norma general que preconiza el uso de soluciones patrón para las comparaciones colorimétricas cuyas densidades ópticas sean lo más cercanas posible al valor del problema. 4.3. Mediante la ecuación A = Ecx. Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de Beer-Lambert (en la que x es un valor constante por ser los tubos uniformes, o por usarse una sola cubeta para hacer la lectura). Para esto se calcula una E relativa mediante , para los patrones, (los valores hallados deben ser iguales si la sustancia cumple la ley de Beer). El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo de concentraciones de patrones y problemas. Una vez obtenido un valor E, la concentración de la muestra se determina mediante la ecuación que sigue:

5.

ESPECTROS DE ABSORCION. Se llama espectro de absorción a la gráfica que representa la absorbancia en función de la longitud de onda. Muchos compuestos contienen espectros característicos de absorción en la región visible y ultravioleta, lo cual hace posible la identificación de dichos materiales en una mezcla.

Figura 1. Espectros de Absorción del naftaleno, antraceno y tetraceno

6. VALORACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS. El curso de una reacción química o la posición de un equilibrio pueden determinarse en forma rápida con un espectrofotómetro si puede medirse la absorción de uno de los componentes. Como ejemplo tenemos las curvas de valoración de los indicadores: 17

Manual de Prácticas de Bioquímica

donde las formas protonizadas o no protonizadas (o ambas) son coloreadas. Los máximos de absorción para las dos formas suelen estar separados, por lo que se puede medir la concentración de cualquiera de las formas. Si se disuelven cantidades iguales del indicador en tampones de diverso pH y se mide la absorbancia en uno de los máximos de absorción, se puede calcular el pK. La determinación espectrofotométrica del pK es el mejor método. El pK se debe determinar a diversas concentraciones para comprobar las desviaciones de la ley de Beer. 7. ESPECTROFOTOMETRIA Y ENZIMAS. Por las grandes ventajas de comodidad, sensibilidad, amplio espectro espectral y una selección fina de longitud de onda, el espectrofotómetro se utiliza en enzimología, principalmente, en tres tipos diferentes de determinaciones: a) se puede determinar la concentración de un compuesto midiendo la densidad óptica a una longitud de onda bajo condiciones en que no ocurran cambios y suponiendo que el coeficiente de extinción del compuesto es conocido; b) se puede seguir el curso de una reacción en un sistema completo de ensayo, midiendo la velocidad de formación o desaparición de un compuesto absorbente de luz. Para este tipo de medidas se dispone de espectrofotómetros que representan gráficamente la densidad óptica frente a tiempo; c) un tercer tipo de medida interesante para la identificación de compuestos requiere la determinación de la densidad óptica en función de la longitud de onda. También este caso se dispone de instrumentos que trazan la curva automáticamente.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N° 1. ESPECTROS DE ABSORCION Y LONGITUD DE MAXIMA ABSORBANCIA DE ALGUNAS MOLÉCULAS. OBJETIVO: 2+  Realizar la curva espectral del rojo de fenol, complejo Cu -proteína, y SBA 2+

 Determinar la longitud de onda de máxima absorbancia del rojo de fenol, complejo Cu proteína, y SBA

FUNDAMENTO Si se mantiene constante el espesor (x) y la concentración (c), la absorbancia (A) dependerá de la longitud de onda (λ); esto permite hallar la curva espectral, así como la longitud de onda de máxima absorción de las diferentes moléculas. Puesto que los compuestos coloreados presentan espectros de absorción característicos, la selección cuidadosa de las longitudes de onda de máxima absorción permitirá analizar los componentes de las sustancias. MATERIAL Espectrofotómetro. Tubos de ensayo Gradillas Pipetas -4 Solución de rojo de fenol 1 x 10 M Reactivo de biuret Solución de albúmina de suero bovino 1 mg/ml METODO DE TRABAJO Calibrar el espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco. Luego, 18

Manual de Prácticas de Bioquímica determinar la extinción de cada solución, usando todo el rango espectral del equipo. Medir en un tubo de ensayo 1 ml de rojo de fenol adicionarle una gota de NaOH y mezclar. Medir en un tubo de ensayo 1 ml de SBA Medir en un tubo de ensayo 0.8 ml de proteína, adicionar 2 ml de agua destilada, 1 ml de NaOH 6% y 0.2 ml del reactivo de Biuret. Mezclar. Anote las absorbancias para cada longitud de onda y para cada solución, teniendo especial cuidado de anotar la longitud de onda de máxima absorbancia DATOS EXPERIMENTALES 

Rojo de fenol

Biuret-Proteína

SBA

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUCIÓN, BIBLIOGRAFÍA Para obtener los espectros de absorción y la longitud de máxima absorbancia, utilice papel milimetrado y grafique los valores de absorbancia de cada solución (corregidos para la 19

Manual de Prácticas de Bioquímica absorción del disolvente, si se usó otro en vez de agua) en las ordenadas en función de la longitud de onda que se coloca en las abscisas. Luego unir los puntos con un trazo suave. Anotar en la gráfica, la longitud de onda de máxima absorbancia para cada solución. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que arriba y la bibliografía consultada.

EXPERIMENTO N° 2. DEMOSTRACION DE LA LEY DE BEER Y CONSTRUCCION DE CURVAS DE CALIBRACION OBJETIVOS Poner en evidencia la ley de Beer-Lambert haciendo uso de concentraciones progresivas del rojo de fenol. FUNDAMENTO Si se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia dependerá de la concentración MATERIALES Espectrofotómetro. Tubos de ensayo Gradillas Pipetas -4 Rojo de fenol 1x10 M Buffer borato 0.1 M, pH 9.8 Solución estándar de SBA 2mg/ml Hidróxido de sodio 6% Agua destilada METODO DE TRABAJO a) Curva de calibración para el rojo de fenol. Prepare un sistema de tubos como se indica a continuación y lea a 540 nm: TUBO N° Buffer borato 0.1 M, pH 9.8 -4 Rojo de fenol 1 x 10 M Agua destilada

Bl 4.0 -1.0

1 4.0 0.1 0.9

2 4.0 0.2 0.8

3 4.0 0.4 0.6

4 4.0 0.6 0.4

5 4.0 0.8 0.2

6 4.0 1.0 --

DATOS EXPERIMENTALES Tubo N°

Concentración de Rojo de Fenol (M)

Ab

Fc

Bl 1 2 3 4 5 6

b) Curva Estándar para proteínas. Micrométodo de biuret (Brewer y col 1974). Prepare un sistema de tubos como se indica a continuación e incube por 15 minutos a 37 °C. Transcurrido este tiempo se lee a 330 nm frente a un blanco apropiado.

20

Manual de Prácticas de Bioquímica TUBO N° Proteína (ml) Agua destilada (ml) NaOH 6% (ml) Reactivo de Biuret (ml)

1 0.10 1.9 1.0 0.2

2 0.30 1.7 1.0 0.2

3 0.50 1.5 1.0 0.2

4 1.0 1.0 1.0 0.2

5 2.0 0.0 1.0 0.2

Blanco 0.0 2.0 1.0 0.2

DATOS EXPERIMENTALES Tubo N Bl 1 2 3 4 5

[Proteína] mg/ml 0.2 0.6 1.0 2.0 4.0

Ab

Fc

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Para obtener las curvas de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores de absorbancia en las ordenadas y la concentración del colorante en las abscisas. Debe tener en cuenta que el tamaño de los ejes en el plano deben ser del mismo tamaño, independiente de la escala, para obtener una línea recta de aproximadamente 45°. Determinar el factor de calibración promedio. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que arriba y la bibliografía consultada.

EXPERIMENTO N° 3. DETERMINACION FOTOMETRICA DEL pK DEL ROJO DE FENOL. FUNDAMENTO: El rojo de fenol es un ácido débil y la variedad donadora de protones se disocia en solución, dando un protón y una variedad aceptora de protones:

Amarillo

Rojo

Según la ecuación de Henderson-Hasselbalch, tenemos;

Sea

igual a la suma de las variedades aceptora y donadora de

protones del ácido, o sea, la cantidad total de ácido existente. Por tanto, Reemplazando estos valores en la ecuación se tiene:

.

Esta es una ecuación de una recta, de tipo y = ax + b, donde b = pK; a = 1; y = pH; x = log [A ] / [T] - [A ]. Por tanto, si se construye una gráfica con el pH en las ordenadas y los valores de la expresión log [A ] / [T] - [A ] en las abscisas, tendremos una recta cuya intersección con el eje vertical representa el pKa. Puede suponerse que en un medio ácido el rojo de fenol no está ionizado, en solución alcalina está totalmente ionizada [A ], y en solución

21

Manual de Prácticas de Bioquímica tampón de pH 7.8 (ó 7.6) las dos formas se hallan en igual concentración. Se ha encontrado que la variedad aceptora de protones presenta un máximo e absorción cerca de 550 nm. Para esta longitud de onda, la variedad donadora absorbe muy poca luz, por tanto, podemos aceptar que la absorción total a 550 nm corresponde casi totalmente a la variedad aceptora. A 550 nm, la absorción de la luz por el rojo de fenol sigue la ley de Beer-Lambert, o sea: donde se incluye la constante correspondiente al trayecto luminoso. Por tanto, si se construye una gráfica poniendo en las ordenadas una serie de valores de absorbancia a 550 nm, para distintas concentraciones conocidas de A , y en las abscisas los valores de concentración, se obtiene una recta. A partir de esta curva de calibración es posible, midiendo la absorbancia, determinar A en una solución de concentración desconocida, o medir la proporción entre A y AH, en una solución donde se conoce la concentración total del indicador. Si se mide la concentración de A para algunos valores conocidos de pH, en una solución cuya concentración total del colorante se conoce, se obtiene una curva que permite deducir el pK del indicador. MATERIALES Espectrofotómetro. Tubos de ensayo Gradillas Pipetas -4 Rojo de fenol 1x10 M Buffer fosfato 0.1 M Agua destilada METODO DE TRABAJO El pK del rojo de fenol es aproximadamente 7.8. Prepare el siguiente sistema de tubos: TUBO N° Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2 Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.6 Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.8 Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.0 Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.4 Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.8 -4 Rojo de fenol 1 x 10 M Agua destilada

Bl 4.0 ------1.0

1 4.0 -----0.5 0.5

2 -4.0 ----0.5 0.5

3 --4.0 ---0.5 0.5

4 ---4.0 --0.5 0.5

5 ----4.0 -0.5 0.5

6 -----4.0 0.5 0.5

DATOS EXPERIMENTALES -

Tubo

Ab

[A ] Moles

-

[T] - [A ]

-

-

[A ] / [T] - [A ]

-

log [A ] / [T] - [A ]

pH

Bl 1 2 3 4 5 6

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUCIÓN, BIBLIOGRAFÍA En papel milimetrado se construye una curva del pH en las ordenadas en función del 22

Manual de Prácticas de Bioquímica -

-

valor correspondiente de log [A ] / [T] - [A ] en las abscisas. Se traza una línea recta por los puntos experimentales, y se extrapola esta recta hasta el eje vertical. El punto de intersección de la recta con el eje de pH representa el pK del indicador. Obsérvese que al extrapolar hasta el eje vertical, queda implícito que a este nivel de esta intersección, log [A ] / [T] - [A ] vale cero. Por tanto, [A ] / [T] - [A ] debe ser igual a 1 en este punto. Ya se sabe que pH = pK cuando las variaciones donadora y aceptora de protones de un ácido débil tienen la misma concentración en la solución. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que arriba y la bibliografía consultada. CUESTIONARIO 1. Un compuesto presenta un máximo de absorción a 660 nm. Para una concentración 0.75 µM se obtuvo una absorbancia de 0.4. Sabiendo que el límite de sensibilidad del método utilizado es de 0.1 µM a 3 µM, calcule la concentración de este mismo compuesto correspondiente a una absorbancia de 0.85. -5

2.

Una disolución de ATP 10 M tiene una transmitancia de 0.702 (70.2%) a 260 nm en una cubeta de 1 cm de espesor. Calcular a) la transmitancia de la disolución en una cubeta de -5 3 cm, b) la absorbancia y la transmitancia de una disolución de ATP de 5 x 10 M en una cubeta de 1 cm.

3.

Un filtro óptico permite solamente el paso de la luz roja lejana, con una longitud de onda media de 6500 Å. Calcular a) la longitud de onda en nm y en cm, b) el número de ondas -1 en cm , y c) la frecuencia.

4.

El coeficiente de absorción específico de un complejo de glucógeno-iodo a 150 nm es 0,20. Calcular la concentración de glucógeno en una disolución del complejo yodado que tiene una absorción de 0.38 en una cubeta de 3 cm de espesor.

5.

Un enzima puro que contiene molibdemo tiene un coeficiente de absorción específico de 1.5 en una cubeta de 1 cm de espesor. Una disolución concentrada de la proteína se vio que contenía 10,56 mg de Mo/ml. La misma disolución diluida 1:50 tenía un valor de absorbancia a 280 nm igual a 0.375. Calcular el peso molecular mínimo de la enzima. El peso atómico del Mo es 95.94.

6.

Una disolución que contiene NAD y NADH tiene una densidad óptica, en una cubeta de 1 cm de espesor de 0.311 a 340 nm y de 1.2 a 260 nm. Calcular las concentraciones de las + formas oxidada y reducida del coenzima en la disolución. Ambos (NAD y NADH) absorben a 260 nm, pero a 340 nm solo absorbe el NADH. Los coeficientes de extinción se dan en la siguiente tabla:

+

COMPUESTO

260 nm

340 nm

NAD NADH

18000 15000

~0 6220

23

Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 3 pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS INTRODUCCION Los procesos celulares son sensibles a los cambios de pH y se realizan en un medio cuyo pH está controlado. Por ello, el estudio de los mismos y su reproducción "ïn vitro" requiere el uso de medios que regulen el pH. Debido a que el agua constituye más del 50% de la mayoría de los tejidos tanto de plantas como de animales, las reacciones bioquímicas se verifican en medio acuoso, y la mayor parte en un medio que se mantiene cercano a la neutralidad. Por lo tanto, es fundamental conocer a fondo las propiedades de los ácidos y las bases de un sistema amortiguador. Puesto que el agua no solo es el componente celular más abundante, sino que tiene además carácter de compuesto indispensable para la vida, es conveniente hacer notar que esta sustancia presenta muchas propiedades excepcionales que la facultan para desarrollar su tarea de solvente de la vida. De estas propiedades, las que permiten explicar el rol biológico del agua, son las siguientes: punto de ebullición, calor de vaporización y punto de fusión más alto que los correspondientes a otras sustancias relacionadas (H 2S, etanol, metanol, HF, etc.) y además, capacidad calórica y calor de fusión elevados.

1. LEY DE ACCION DE MASAS Y EQUILIBRIO QUIMICO En 1864 GULDBERG y WAAGE establecieron una relación entre la velocidad de una reacción química y las concentraciones moleculares de las sustancias reactantes, llamada ley de acción de masas, que dice: "La velocidad de una reacción química en un tiempo dado, es proporcional a la concentración molecular (moléculas / unidad de volumen) de las sustancias reactantes presentes en ese tiempo". Considerando la reacción química reversible siguiente:

donde para la reacción de ida, los reactantes son A y B y los productos que se originan son C y D. La velocidad para esta reacción será proporcional a las concentraciones moleculares de A yB

Introduciendo una constante de proporcionalidad (k1) que mida la afinidad química propia de la reacción, la ecuación anterior puede escribirse:

Para la reacción de vuelta, en forma análoga, se tendrá:

donde k2 es la constante de proporcionalidad que mide la afinidad química de la reacción de derecha a izquierda. Cuando la reacción alcanza el equilibrio, las concentraciones de las cuatro sustancias ya no se modifican, lo que quiere decir que la velocidad de la reacción de ida, se hace igual a la velocidad de la reacción de vuelta. 24

Manual de Prácticas de Bioquímica Por tanto,

lo que también puede escribirse así:

donde K es otra constante, que expresa la relación k 1 /k2 y que se conoce como constante de equilibrio, que expresa matemáticamente la relación entre las concentraciones de las sustancias reactantes en el estado de equilibrio. Cuando la constante de equilibrio se aplica a reacciones de ionización recibe el nombre de constante de ionización. Aplicación de la ecuación de equilibrio.- El valor numérico de K es específico y característico para reacción, sea cuales fueren las concentraciones relativas, siempre que la temperatura se mantenga constante. Cuando K es alta, las concentraciones de C y D son altas en el equilibrio en relación a las concentraciones de A y B, indicando que la afinidad entre A y B es grande y que la reacción hacia la derecha predominará. Por otro lado, un valor pequeño de K, indica un predomino de la reacción hacia la izquierda y una afinidad grande entre C y D.

2. ACIDOS Y BASES 2.1. DEFINICIONES.- Por costumbre se define a un ácido como aquella sustancia que en + solución aporta hidrogeniones (H ) al medio y base aquella que al disolverse da iones oxidrilos (OH ). El concepto moderno de ácidos y bases de BRÖNSTED, LOWRY y otros, define un ácido como un donador de protones y una base como un aceptor de protones. Por lo tanto, cada ácido tiene una base conjugada.

El concepto de BRÖNSTED es idéntico al concepto clásico en lo que se refiere a los + ácidos, puesto que un protón es lo mismo que un hidrogenión H (es decir un átomo de hidrógeno sin su electrón orbitario) pero es muy diferente en lo que se refiere a las bases. De acuerdo con esta teoría, un ácido se disocia en un protón y una base. Esta última puede regenerar al ácido al reaccionar con un protón. Un ácido y su base se llaman conjugados. ALCALI.- El término álcali se reserva para aquellos compuestos que al disociarse generan iones hidroxilo:

Se comprende fácilmente que las bases clásicas, como el KOH, NaOH, etc. no pueden ser consideradas como tales según la teoría de BRÖNSTED puesto que no aceptan protones; + sin embargo funcionan como bases porque al disociarse en K y OH , el grupo oxidrilo OH , + que es la verdadera base, acepta un protón H para formar H2O. Es decir, el ion OH- es base pero la molécula de KOH no lo es. ANFOLITOS.- Son especies iónicas que pueden actuar como ácidos y como bases; por ejemplo el agua y los aminoácidos (Tabla N° 1). Se dice también que son anfóteros. Aún cuando es cómodo escribir el equilibrio ácido-base en la forma indicada arriba, el protón no existe como tal sino que está solvatado. Por ejm. en medio acuoso el hidrogenión 25

Manual de Prácticas de Bioquímica +

existe como hidronio (H3O ).

TABLA N° 1. EJEMPLOS DE ACIDOS Y BASES BRÖNSTED ACIDO BASE CONJUGADA HCl CH3COOH + NH4 H2CO3 HCO3 H2O + H3O

+

H + H + H + H + H + H + H

+ + + + + + +

-

Cl CH3COO + NH3 HCO3 — CO3 OH H2O

2.2. FUERZA DE ACIDOS Y BASES.- Se deben distinguir dos términos: concentración que es la cantidad de ácido o base disuelto en un determinado volumen de agua (mol / litro) y fuerza de un ácido o una base es la medida de la efectividad con que un compuesto se comporta como ácido o como base. 2.2.1. Fuerza de un ácido.- La fuerza de un ácido esta dada por su capacidad para ceder protones. Por ejemplo, los ácidos clorhídrico y nítrico se disocian casi completamente en solución acuosa y por l o tanto serán ácidos fuertes. Por el contrario, los ácidos acético y fórmico, que están solo ligeramente disociados en solución, serán ácidos débiles. De otro lado, se considera que un ácido es fuerte cuando tiene una constante de equilibrio superior a 10-2 (Ka mayor que 10-2). O en otras palabras, puesto que pKa = - log Ka, es evidente que cuanto menor es el valor de pKa de un ácido, más fuerte es el mismo (Ka = constante de disociación de un ácido). Acidos fuertes:

Acidos débiles:

2.2.2. Fuerza de una base.- La fuerza de una base está dada por la magnitud en que se disocia en solución acuosa para dar lugar a iones hidroxilo o por la capacidad para aceptar protones. Por ejemplo, el NaOH y el KOH que están completamente ionizados en solución acuosa (de manera que la concentración de OH es la misma que la de la base), son bases fuertes y tienen alta afinidad por los protones. Por el contrario, la anilina que esta sólo ligeramente disociada en solución, será una base débil; tiene escasa afinidad por los protones (Ejm. el Cl del HCl):

Se considera bases fuertes aquellas que tienen una constante de equilibrio superior a 10 -12 (Kb mayor de 10 ).

-12

La capacidad del solvente de combinarse con el hidrogenión afecta la capacidad de disociación de un ácido o una base y así, un mismo compuesto puede actuar como un ácido débil en un solvente y como ácido fuerte en otro. 26

Manual de Prácticas de Bioquímica Es importante, también, señalar que la fuerza de un ácido depende de qué tan fuerte es su base conjugada, así como de la constante dieléctrica del medio. En un ácido fuerte, como el HCl, su base conjugada (base débil, Cl ) tiene escasa afinidad por los protones, prefiriendo estos combinarse con el solvente y determinar un alto grado de disociación del ácido. En el caso de los ácidos débiles sus bases conjugadas (base fuerte) tienen gran afinidad por los protones, prefiriendo estos seguir combinándose con el solvente y determinan un escaso grado de disociación del ácido.

3. CONCENTRACION DE IONES HIDROGENO Y pH 3.1. DEFINICION DE pH.- La concentración de iones hidrógeno da el grado de acidez de una solución, de allí que la forma más racional de expresar la acidez de una solución sea en función de la concentración de hidrogeniones expresada en normalidad, es decir, en equivalentes gramo de hidrogeniones/litro. Por ejm., una solución con 1 g. de hidrogeniones/litro, tendrá una acidez 1 N. Sin embargo, en los líquidos biológicos las concentraciones de hidrogeniones son muy bajas y su manejo es fastidioso y expuesto a errores y difíciles de memorizar; así la concentración de hidrogeniones en el plasma es de 0.0000000389 N. Si omitimos un solo cero, la concentración de hidrogeniones se alterará 10 veces. Por estas consideraciones, Sörensen en 1909 introdujo el término pH (potencial de hidrogeniones) como una forma adecuada de expresar la concentración de hidrogeniones, utilizando solo el exponente con signo positivo. Así, una solución con una concentración 0.0000001 de hidrogeniones, en vez de escribir esa cifra, Sörensen propuso escribirla como -7 10 y utilizar solo el exponente con signo positivo, es decir 7 como la medida de iones hidrógeno. El pH se define entonces, como el logaritmo negativo de la actividad de hidrogeniones, pero en la práctica se le denomina concentración de hidrogeniones, ya que la concentración y la actividad son prácticamente las mismas, excepto en soluciones fuertemente ácidas.

Ejm. La concentración de hidrogeniones del plasma es 0.0000000398 N. Esta cantidad puede -10 escribirse, también, de esta otra forma 398 x 10 . Por lo tanto el pH del plasma será:

3.2. DISOCIACION DEL AGUA 3.2.1. Derivación de Kw.- El agua purísima prácticamente no es conductora, pero en realidad tiene una pequeñísima conductividad, reveladas por las medidas de conductividad. Esta débil + conductividad indica que el agua debe estar ligeramente disociada en iones H y OH .

Sin embargo, puesto que el H correctamente como:

+

+

(el protón) está hidratado, podemos escribir más

+

(el H3O se conoce como ion "hidronio"). El propio H3O se halla hidratado mediante el 27

Manual de Prácticas de Bioquímica +

establecimiento de más enlaces de hidrógeno formando el ion H 3O4 . La pequeña disociación del agua se debe a que el átomo de hidrógeno tiene una masa pequeña, y a que su único electrón se halla fuertemente retenido por el átomo de oxígeno. Por esto el átomo de hidrógeno difícilmente puede disociarse del átomo de oxígeno al que se halla unido covalentemente en una molécula de agua y "saltar" al oxígeno de la molécula de agua adyacente a la cual se halla unido por enlace de hidrógeno. En esta reacción se producen dos + iones el ion hidronio (H3O ) y el ion hidroxilo (OH ). -7

+

En un litro de agua pura, a 25 °C, existen solo 1 x 10 mol de iones de H3O y una cantidad igual de iones OH , según muestran las medidas de conductividad eléctrica. El agua destilada común contiene impurezas que la hacen mucho más conductora. Una buena agua destilada, recientemente obtenida por destilación con contacto del aire, puede tener una -6 conductividad específica de 0.7 x 10 l/ohm cm (esto es 20 veces mayor que el valor mínimo -6 hallado 0.038 x 10 l/ohm cm). La constante de equilibrio para la disociación del agua está dada por:

Como un litro de agua pura contiene 55.5. moles de agua (1000/18 = 55.5) esto es, número de gramos de agua en un litro dividido por el peso molecular gramo) y solo 0.0000001 -7 mol (= 1 x 10 a 25 °C) se halla disociado, es natural que podrían variar enormemente los + valore de [H ] y [OH ] sin que la [H2O] se altere perceptiblemente. Por ejm., si la concentración de estos iones aumentara en 1'000,000 de veces, los moles de agua no disociados por litro descendería de 55.5 55.4. De manera que sin incurrir en error apreciable, se admite que la concentración de las moléculas (H2O) es constante y su actividad es 1. Según esto, la constante de equilibrio para el agua puede escribirse:

y el término [55.5][K] puede sustituirse por una constante "global" Kw llamada producto iónico del agua, entonces: puesto que al disociarse el agua

En el agua pura

produce iguales cantidades de ambos iones (neutra) como será también -14 , de donde se deduce que para el agua pura a 25 °C el producto iónico es 10 .

-14

-7

-7

+

-

Puesto que 10 = 10 x 10 , se comprende que al aumentar la [H ] la [OH ] debe + -3 disminuir y viceversa. Por ejm., si al agua pura añadimos HCl hasta aumentar la [H ] a 10 , la -11 [OH ] disminuirá a 10 , así:

Para evitar dificultades en el uso de números decimales, aplicando los logaritmos negativos correspondientes, tenemos: 28

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donde se observa que el producto de la igualdad se convierte en una suma y así, al tomar el logaritmo negativo: y para el ejemplo: +

En conclusión, la suma de los logaritmos negativos de las concentraciones de iones H y OH en una solución acuosa es una constante de valor 14 a 25 °C. Así el pH del agua pura a 25 °C es 7 (neutra). -

3.2.2. Temperatura y Kw.- El pH neutro no es 7 a cualquier temperatura, puesto que Kw cambia con la temperatura y otros factores. Por ejm., el cambio de temperatura de 37 °C a 40 + °C, causa un incremento de 8% en iones H y en iones OH . Esto indica que cualquier elevación o descenso de la temperatura puede producir un cambio biológico profundo en los + organismos vivos sensibles a la [H ] (Tabla N° 2).

TABLA N° 2. PRODUCTO IONICO DEL AGUA Y pH DE NEUTRALIDAD A DIFERENTES TEMPERATURAS °C 0 25 37 40 75 100

Kw -14

pH de neutralidad -14.94

0.12 x 10 = 10 -14 -14.00 1.03 x 10 = 10 -14 -13.60 2.51 x 10 = 10 -14 -13.53 2.95 x 10 = 10 -14 -12.77 16.90 x 10 = 10 -14 -12.32 48.00 x 10 = 10

7.97 7.00 6.80 6.77 6.39 6.16

4. MEDICION DEL pH El pH puede determinarse por mediciones catalíticas, espectrofotométricas, de la tensión superficial y de la conductividad. Pero estos procedimientos no se usan. En cambio describiremos los métodos colorimétricos y electrométricos. La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y utilizados en bioquímica, ya que el pH determina muchas características de la estructura y la actividad de las macromoléculas biológicas y, por tanto, de la conducta de las células y de los organismos. 4.1. METODOS COLORIMETRICOS.- Si se desea tener una medida aproximada del pH de una solución se puede usar los llamados indicadores. 4.1.1. Teoría de los Indicadores.- Los indicadores son base o ácidos débiles cuyo color depende del pH de la solución. Este otro. Si se considera el indicador como un ácido, como sucede con los compuestos nitrados, + fenolftaleína, etc., al disociarse en una solución acuosa, desprenderá iones H :

y según la ley de acción de masas: 29

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Si usamos la ecuación de Henderson-Hasselbalch, como para cualquier ácido débil:

Cada indicador tiene su constante de disociación Kin y su (-logKin)pKin. Cuando el pH de la solución es igual al pKin del indicador, la relación [I ]/[HI] es igual a 1, por lo tanto existen en igual medida los dos colores. Las dos formas del indicador tienen colores diferentes y como parecerá claro al observar la última ecuación, el color de la solución dependerá del pK in y del pH. El mayor cambio de color se obtiene alrededor del pKin y este es el intervalo de pH donde el indicador es más útil. Por ejm., si un solución tiene un pH aproximado de 6, entonces el púrpura de bromocresol, que tiene un pKin de 6, es el mejor indicador para el caso. Pero debido a que el cambio de color ocurre en un rango amplio de pH, los indicadores tan solo dan una medida aproximada del pH. Otra desventaja de los indicadores se debe a que son afectados por agentes oxidantes, agentes reductores, concentraciones de sal y de proteína. Además, al usarlos, se debe agregar solo pequeñas cantidades a la solución que se examina, o de lo contrario, el equilibrio ácido-base de la muestra puede desplazarse y el pH cambiar. El uso más importante de los indicadores es la determinación del punto final de una titulación. En las titulaciones, se selecciona un indicador que cambie de color en el punto de equivalencia, el cual, depende de la titulación que se efectúa. Por ejm., cuando se titula ácido acético con NaOH el ácido es transformado totalmente en sal alrededor de pH 9; por l tanto debe usarse fenolftaleína como indicador. En la misma forma, el rojo de metilo se usa cuando se titula amoniaco con HCl, puesto que el punto final de titulación es pH 5. En la Tabla N° 3 se consignan los indicadores más usados, sus valores de pK in y los límites de pH entre los que se produce el cambio de color. Los límites de viraje de un indicador determinan la llamada zona útil o zona de viraje, que corresponde a dos colores diferentes que evidencian el predominio de la forma ácida o alcalina del colorante para un determinado pH. Como ya se menciona, la zona de viraje varía según los colorares, puesto que la constante de disociación pKin varía según su naturaleza. Comparando el color obtenido con la solución desconocida con el color "estándar" correspondiente, se tiene el pH de la solución desconocida. En la práctica, se cuenta con series de colorantes para la determinación del pH, como la propuesta por Clark y Lubs que permite el estudio de sustancias cuyo pH estén comprendidos entre 1 y 10; los colorantes de la serie de Clark y Lubs son derivados de la Sulfonaftaleína y son amarillos del lado ácido, y rojos o azules del lado alcalino. Los colorantes de la serie de Michaelis son monocromáticos, es decir, va del incoloro al coloreado, o viceversa, y comprenden colorantes nitrados o fenolftaleína. +

El pH aproximado de una solución cuya concentración de iones H es totalmente desconocida, se puede determinar con el llamado indicador universal o de Bogen, que es una mezcla de varios colorantes, los cuales, a medida que el pH aumenta en la solución de estudio, van apareciendo los colores como del espectro. Así; pH 2, rojo; pH 4, anaranjado; pH 6, amarillo; pH 8, verde; pH 10, azul; pH 12, violeta. Una vez establecido el pH aproximado de la solución, se recurre al colorante de la serie de Clark o de Michaelis cuyo viraje se produce en esa zona y de esta manera se puede precisar más exactamente el pH de la solución. La determinación del pH utilizando soluciones buffer, consiste en comparar el color que 30

Manual de Prácticas de Bioquímica toma el indicador el la solución cuyo pH se quiere conocer, y el color que toma este mismo indicador agregado a soluciones buffer, como por ejm., del tipo de McIlvaine, de pH conocido. El pH de las soluciones buffer se determina exactamente mediante el método electrométrico. Papeles impregnados con determinados indicadores toman las coloraciones correspondientes cuando se mojan en la solución cuyo pH se quiere conocer. El tono adquirido por el papel depende del pH de la solución y se puede comparar con los colores estándar que llevan los tubos portapapeles. Los papeles a utilizar deben variar dentro del pH de la solución. Así, por ejm., el papel impregnado con rojo de fenol cuya zona de viraje está entre 6.8 y 8.4 permite determinar el pH de una solución comprendido dentro de estos valores. 4.1.2. Errores del Método Colorimétrico.- La adición de un colorante a una solución puede modificar el pH de esta, dada la naturaleza ácida o básica del indicador y por la presencia de sales o proteínas que modifican su viraje. En las soluciones coloreadas o turbias, la coloración que da el indicador no es la misma que en una solución clara e incolora; por ello, en tales casos se usan comparadores; es decir, cajas especiales donde se disponen los tubos que contiene la solución de pH desconocido, una solución coloreada estándar y el agua. La turbiedad o el color del medio que se ensaya se superponen en los tres campos de visión, y por sustitución de los tubos de colores estándar se llega a un tono que coincide con el tubo central y que establece su pH. El método colorimétrico no es rigurosamente exacto, y su precisión es de 0.1 pH, que puede llegar a 0.03 pH si se procede con técnicas cuidadosas.

TABLA N° 3. INDICADORES DE pH INDICADOR Violeta de metilo Rojo cresol ácido Púrpura de metacresol Azul de timol Tropeolina Violeta de metilo Amarillo de metilo Azul de bromofenol Anaranjado de metilo Rojo congo Verde de bromocresol Azul de bromocresol Rojo de metilo Tornasol Rojo de clorofenol Púrpura de bromocresol Azul de bromotimol Rojo de fenol Rojo de cresol Púrpura de metacresol Azul de timol Fenolftaleína Amarillo de alizarina Sulfo naranja Carmín de índigo

PKin 0.8 1.0 1.5 2.0 2.2 2.4 3.5 3.8 3.4 4.1 4.7 5.0 5.2 6.4 5.9 6.0 6.8 7.6 8.0 8.2 8.8 9.1 11.3 11.8 12.8

LIMITES DE pH 0.1 - 1.5 0.2 - 1.8 0.5 - 2.5 1.2 - 2.8 1.3 - 3.0 1.5 - 3.2 2.9 - 4.0 3.0 - 4.6 3.1 - 4.4 3.0 - 5.2 3.8 - 5.4 4.2 - 5.8 4.2 - 6.2 4.5 - 8.3 5.1 - 6.7 5.2 - 6.8 6.1 - 7.7 6.8 - 8.4 7.2 - 8.8 7.4 - 9.0 8.0 - 9.6 8.2 - 10.0 10.4- 12.2 11.0 - 12.6 11.6 - 14.0

CAMBIO DE COLOR Acida Alcalina Amarillo Rojo Rojo Rojo Rojo Azul Rojo Amarillo Rojo Azul Amarillo Amarillo Rojo Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Incoloro Amarillo Amarillo Azul

Azul Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Violado Amarillo Azul Amarillo Rojo Azul Azul Amarillo Azul Rojo Azul Azul Rojo Rojo Violeta Azul Rojo Rojo Naranja Amarillo

31

Manual de Prácticas de Bioquímica TABLA N° 4. COMPOSICION DE LOS INDICADORES UNIVERSALES I Y II INDICADOR

Azul de timol Azul de bromotimol Dimetilaminoazobenceno Rojo de metilo Fenolftaleína Alcohol etílico

CANTIDAD (g) I II 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 1000.0

0.4 0.2 0.8 1000.0

TABLA N° 5. COLORACION DE LOS INDICADORES UNIVERSALES I Y II INDICADOR I pH COLOR

INDICADOR II pH COLOR

1 4 6 8 10

4 5 6 7 8.5 10.0

rojo naranja amarillo verde azul

rojo naranja amarillo verde azul violeta

4.2. METODO POTENCIOMETRICO.- Es el método más conveniente y confiable para medir el pH. Requiere de un instrumento llamado potenciometro o pHmetro, que permite determinar la concentración de iones hidrógeno midiendo la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solución problema, y un electrodo de vidrio sensible a hidrogeniones (Fig. 1).

Fig.1. Sistema de electrodos para medición de pH

32

Manual de Prácticas de Bioquímica Un pHmetro de lectura directa, consta de dos electrodos: a) El electrodo de referencia externa, el más usado es el electrodo de calomel; en este, la solución acuosa que está en contacto con mercurio metálico y cloruro de mercurio sólido se halla saturada con cloruro de potasio. b) El electrodo de referencia interna, es el de vidrio, específicamente de membrana de vidrio. Consta de un bulbo de vidrio especial de paredes muy finas sensibles a la actividad del ion hidrógeno, que se halla soldado a un tubo de vidrio ordinario. En el interior del bulbo se halla un alambre de plata recubierto de cloruro de plata, sumergido en una solución de HCl 0.1 M. El tubo de vidrio se halla lleno de una resina que sirve para el contacto eléctrico con el circuito externo. La membrana de vidrio consta de dos capas de vidrio concéntricas hidratadas: externa e interna que encierran una capa de vidrio seca. 4.2.1. Electrodo de Vidrio.- Este electrodo en combinación con el de calomel, al ser introducido en la solución problema proporciona una celda galvánica útil para las mediciones prácticas de pH; el esquema de una celda es el siguiente:

Cada línea vertical indica un límite de fases a través del cual se desarrolla una fuerza electromotriz total constituida por 5 partes a la que se suma un potencial de asimetría. Los diferentes potenciales son los siguientes: 1. El potencial del electrodo Ag - AgCl 2. El potencial entre la solución de HCl en el interior del electrodo de vidrio y la pared interna de la membrana. 3. El potencial entre la pared externa de la membrana de vidrio y la solución de pH desconocido. 4. El potencial de contacto líquido entre la solución de pH desconocido y el electrodo de calomel saturado. 5. El potencial del electrodo de calomel saturado y el potencial de asimetría. Los potenciales 1, 2 y 5 son invariable, debido a que la composición de la solución en el interior del electrodo de vidrio se mantiene constante y la f.e.m. del electrodo de calomel tiene un valor fijo. El desplazamiento de la f.e.m. total observado en la celda galvánica, cuando se introduce una solución de pH desconocido se debe a las variaciones de los potenciales 3,4 y asimétrico. El potencial del electrodo de vidrio (Ev) en relación con el electrodo de referencia externa (Eref), se relaciona con el pH en la siguiente ecuación:

33

Manual de Prácticas de Bioquímica La respuesta del electrodo de vidrio debe calibrarse frente a soluciones amortiguadoras de pH conocido, como las de la Tabla N° 6.

TABLA N° 6. SOLUCIONES DE pH CONOCIDO PARA LA CALIBRACION DE UN MEDIDOR DE pH SAL 1. Tartrato monobásico de potasio saturado 2. Ftalato monobásico de potasio 0.05 M 3. Fosfato de potasio monobásico 0.025 M Fosfato de sodio dibásico 0.025 M 4. KH2PO4 0.0087 M Na2HPO4 0.304 M 5. Tetraborato sódico (bórax) 0.01 M

pH A 25 °C

pH A 37 °C

3.56 4.01

4.02

6.86

6.84

7.41 9.18

9.06

4.2.2. Cuidados del Electrodo de Vidrio.- Debe ser lavado bien después de cada determinación de pH, especialmente después de trabajar con soluciones de proteínas, pues estas, al adsorberse en la superficie de la membrana de vidrio causan serios errores. Otro motivo de errores puede presentarse por deshidratación parcial de las soluciones no acuosas sobre la membrana de vidrio, lo que determina cambios en la diferencia de potencial. Las soluciones amortiguadoras se deben agitar vigorosamente durante las mediciones, a fin de evitar que se forme una delgada capa de solución en la interfase entre el vidrio y la solución.

5. pH DE ACIDOS, BASES Y SOLUCIONES SALINAS 5.1. pH DE ACIDOS FUERTES Y DE BASES FUERTES.- Los ácidos fuertes, como el HCl, en disolución acuosa se ionizan completamente, por tanto, la concentración de hidrogenión es igual a la concentración del ácido. En consecuencia sus valores de la constante de disociación (Ka) se aproxima al infinito y todos tiene una fuerza aproximadamente igual. El pH de una disolución acuosa de un ácido fuerte, es el logaritmo negativo de su concentración.

El pH de una solución 1N de ácido monobásico fuerte es cero y la solución aumenta en una unidad de pH por cada décuplo de dilución del ácido. Similarmente, las bases fuertes tales como NaOH, se ionizan completamente en solución y por tanto la concentración del ion OH- es igual a la concentración de la base. El pH de una solución 1 N de una base monobásica es 14, y el pH decrece e una unidad por cada décuplo de dilución. El pH se calcula según la siguiente ecuación:

5.2. pH DE ACIDOS Y BASES DEBILES.- Los ácidos débiles se disocian solo en pequeñas + proporciones en las soluciones muy diluidas. El grado de ionización y la [H ] y la [OH ] están determinados por su constante de ionización. El pH de los ácidos débiles está dado por:

34

Manual de Prácticas de Bioquímica o puede calcularse el pH a partir de: donde: C = Concentración total del ácido Y el pH de las bases débiles se calcula a partir de:

el pH de una solución 1 N de base débil = 14 - pKb/2, decreciendo e una unidad de pH por cada céntuplo (cien veces) de dilución de la base. De igual modo el pH = pKa/2 para una solución 1 n de un ácido débil monobásico y el pH aumenta en una unidad por cada cien veces de dilución del ácido. 5.3. pH DE SOLUCIONES SALINAS.- Los iones de iones de ácidos y bases débiles reaccionan con el agua para formar el ácido o la base no disociados. Esto altera la concentración de iones H+ del agua y a menudo las soluciones salinas no poseen pH 7. 5.3.1. pH de Sales de Acido Fuerte y de Base Fuerte.- Estas soluciones salinas, como la de NaCl, dan reacción neutra con el tornasol. Ninguno de los iones presentes reacciona con el agua y por tanto la concentración del ion hidrógeno del agua permanece inalterada (pH 7). 5.3.2. pH de Sales de Acido Fuerte y Base Débil.- Estas soluciones salinas, como la solución de NH4CL, dan reacción ácida con el tornasol. El catión reacciona con el agua y forma l base débil no disociada; esto causa un exceso de iones H + en la solución. Si consideramos una solución de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una base débil. Por ejm., la solución de NH4Cl:

(KH = constante de hidrólisis. El agua es constante por eso se le omite).

35

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ésta ecuación da el pH de una solución de sal formada a partir de un ácido débil y una base débil. El pH de este tipo de soluciones salinas se incrementan en una unidad de pH por cada céntuplo de dilución de la sal 5.3.3. pH de Sales de Base Fuerte y Acido Débil.- Estas soluciones salinas, como el acetato de sodio, dan reacción alcalina con el tornasol. El anión experimenta hidrólisis para formar el ácido débil no disociado; esto causa un exceso de iones OH en la solución. El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base fuerte está dado por:

EL pH de este tipo de soluciones salinas decrece e una unidad de pH por cada céntuplo de dilución de la sal. 5.3.4. pH de Sales de Acido Débil y de una Base Débil.- Estas soluciones salinas, como el NH4CN, pueden dar reacción neutra, ácida o alcalina con el tornasol. Tanto el anión como el catión experimentan hidrólisis, el grado de la cual depende de la fuerza relativa del ácido y de la base a partir de los cuales se deriva la sal. Si Ka = Kb, la solución dará reacción neutra; si Ka > Kb, la solución salina tendrá pH menor de 7; a la inversa se Ka < Kb, la solución salina tendrá un pH mayor de 7. El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base débil está dado por:

El pH de este tipo de soluciones salinas es independiente de la concentración.

6. CURVAS DE VALORACION Si se va añadiendo poco a poco una base, a una solución de ácido, el pH de la solución se incrementará con cada adición de base. Si se representa gráficamente el pH en función de la cantidad de base añadida, se produce una subida brusca en el punto de equivalencia; en el que el ácido está neutralizado exactamente. La región de subida brusca se llama punto final y el conjunto del proceso de adición de la base y determinación del punto final se llama valoración. El diagrama que representa la variación del pH durante la valoración se llama curva de valoración. En la figura 2 se ha dibujado diversas curvas de valoración de 20 ml de algunos ácidos 0.1 N, con NaOH 0.1 N. Obsérvese que aunque el punto final se produce exactamente al añadir 20 ml de NaOH, las curvas difieren en su forma y también en el pH del punto final. La curva tiene s subida más brusca en la valoración de un ácido fuerte (HCl) con una base fuerte (NaOH) y menos brusca en la valoración de un ácido débil (CH3COH) con base fuerte (NaOH). 6.1. NEUTRALIZACION DE UN ACIDO FUERTE CON UNA BASE FUERTE.- La naturaleza del proceso de neutralización, se entiende mejor por la forma en que cambia el pH cuando se titula una disolución acuosa de ácido fuerte (HCl) con una base fuerte NaOH). El NaOH actúa con una concentración equivalente de iones OH . Por lo tanto, la interacción del HCl con el NaOH puede representarse por: 36

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Los productos de la neutralización son el ácido excesivamente débil H 2O y la base infinitamente débil Cl . Por tanto, la neutralización será completa, ya que la reacción inversa ocurrirá en una magnitud no significativa y la ecuación de neutralización será:

Esto indica que: 1. Cuando se haya añadido menos de una cantidad equivalente de NaOH la concentración de + iones H será igual a la concentración de HCl que queda sin neutralizar, ya que el HCl está completamente disociado en agua. 2. En el punto de equivalencia, el pH de la mezcla será 7, ya que contiene además de agua, + solo iones Na y Cl que son insignificantemente ácidos o básicos (el pH 7 es, por tanto, el pH de una disolución acuosa de cloruro de sodio). + 3. Cuando se añade más de un equivalente de NaOH, la concentración de iones H residual es inversamente proporcional a la concentración de NaOH presente en exceso. La forma de la curva indica que al ir añadiendo base se producen tan solo pequeños cambios en el valor de pH hasta cuando se obtiene la neutralización completa; pero en este punto un exceso de base causa un cambio brusco en el pH. En efecto, el ácido fuerte está impidiendo el cambio en el pH, en otras palabras, está actuando como una solución amortiguadora. La zona donde adiciones grandes de álcali producen cambios pequeños de pH, se denomina zona de tampón ácida.

Fig. 2. Curvas de titulación para 20 ml de soluciones de algunos ácidos 0.1 N.

6.2. NEUTRALIZACION DE UN ACIDO DEBIL CON UNA BASE FUERTE.- Si titulamos ácido acético con NaOH, el proceso de neutralización se escribe:

37

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-

El otro producto de la neutralización, a parte del agua, es el ion acetato (CH3COO ), es la base conjugada del ácido débil CH3COOH, o sea:

Es decir el pH de una disolución de ácido acético, a la que se le añadió menos de un equivalente de NaOH, dependerá o solo de la cantidad de ácido acético que queda sin disociar, sino también de la magnitud en la que se disocia, la cual está dada por la concentración del ion CH3COO en la solución. Por tanto, el curso del cambio del pH durante la titulación reflejará: 1. la eliminación, por neutralización del ácido acético, con la consiguiente producción de CH3COO , 2. el progresivo incremento de la represión de la disociación del ácido acético residual debido a la progresiva subida de la concentración del ion CH3COO producida por (1). El efecto cuantitativo, de estos acontecimientos sobre el pH durante la neutralización se puede calcular a partir de la ecuación que define la constante de disociación de un ácido débil:

De acuerdo con la ley de acción de masas, la constante de disociación Ka se define como:

Sacando los logaritmos negativos,

ó

En términos generales:

Esta es la llamada ecuación de Henderson-Hasselbalch. En la práctica significa que la curva de titulación de ácido débil-base fuerte tendrá la forma mostrada en la figura anterior para la titulación de ácido acético con NaOH. En esta curva se observa que el pH del punto de equivalencia es mayor de 7. En segundo lugar, la zona de cambio rápido del pH alrededor del punto de equivalencia tiene una extensión menor que en la titulación de un ácido fuerte con NaOH. Pero el hecho más notable es que esta curva de titulación tiene forma sigmoidea en el lado ácido de la equivalencia con una inflexión en el punto medio de este brazo. En este punto, la mitad del ácido inicial se ha 38

Manual de Prácticas de Bioquímica convertido en su base conjugada y la mitad queda sin neutralizar. Por tanto, en este punto [base conjugada] = [ácido], y el pH es igual a (pKa + log 1) = pKa (ya que el Log de 1 = 0). Por tanto, midiendo el pH en el punto de media equivalencia, cuando se titula un ácido débil con álcali, se obtiene un valor experimental (aparente) para el pKa del ácido. El pH en esta curva cambia sólo lentamente por la adición de álcali (o de ácido fuerte) aunque cerca del principio y cuando se aproxima a la equivalencia el pH cambia más rápido. Es decir, las mezclas en medio del margen de pre-equivalencia tienen una mayor capacidad tamponante que las situadas en los extremos. La forma sigmoidea de la curva de titulación obedece a la ecuación de Henderson-Hasselbalch. El cambio de pH por adición de álcali depende solo del cambio ejercido por esta adición en el valor de la relación [base conjugada]/[ácido], puesto que pKa es constante en cualquier titulación. En el punto de media equivalencia [base conjugada]/[ácido] es 1, y la adición de una décima parte de un equivalente de álcali a esta mezcla, solo producirá un pequeño cambio en la proporción, y por tanto, un ligero incremento en el pH (la proporción sería 1.5 log de 1.5 = 0.176). Por otra parte, la adición de esta cantidad de álcali a mezclas en las que [base conjugada]/[ácido], es inicialmente de 10 o de 1/10 producirá un cambio mucho más grande en la proporción y por tanto en el pH. Entonces, la alteración del pH producida por una pequeña cantidad de álcali (o de ácido fuerte) es mínima en el punto de mínima equivalencia y aumenta cuando más difiere de la proporción [base conjugada]/[ácido]; de aquí la forma sigmoidea de la curva de titulación. De igual modo se puede concluir que: a) una mezcla en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es 1, y el pH e igual al pKa del ácido componente, es la mezcla tampón más eficiente. b) la capacidad tamponante de una mezcla disminuye cuanto más difiere su pH del pK del ácido débil componente. En la práctica, se considera que una mezcla de un ácido débil y su base conjugada forman un tampón satisfactorio en el margen de pH que va desde a . De la curva de titulación, se puede hacer predicciones bastante exactas respecto a la capacidad relativa tamponante de mezclas que tienen iguales concentraciones del mismo ácido débil y su base conjugada. Estas son: 1. La mezcla cuyo pH es igual al pKa del ácido débil, en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es 1, es la mezcla tampón óptima en el sentido que hace mínimo el cambio de pH por la adición de una pequeña cantidad de álcali o ácido fuerte. 2. Una mezcla cuyo pH se igual a (pKa - 1), en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es 0.1, es un tampón efectivo "contra" un álcali, pero poco efectivo "contra" un ácido fuerte. 3. La mezcla cuyo pH es igual a (pKa + 1) y cuya proporción [base conjugada]/[ácido] es 10, es un tampón efectivo "contra" ácidos fuertes, pero poco efectivo "contra" álcalis. No obstante, la capacidad real tamponante de una disolución sólo está determinada por la proporción inicial [base conjugada]/[ácido], sino también por la magnitud real de estas concentraciones. Se nota también que la misma curva de titulación de "pre-equivalencia" se obtendrá si se titula una disolución de acetato sódico con un ácido fuerte, aunque ahora el pH descenderá. Para el cálculo de pH, en la práctica, no es deseable generalmente aplicar la ecuación de Henderson-Hasselbalch a disoluciones acuosas de pH menor de 4 o mayor de 10, pues esta ecuación solo da valores aproximados.

7. SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Y SU CAPACIDAD DE AMORTIGUACION Solución amortiguadora es aquella que se opone a los cambios de pH cuando se agrega álcali o ácido. Los mejores tampones en el margen de pH de 4 a 10 son los que contiene un ácido débil con su base conjugada; o una base débil con su ácido conjugado. Son importantes las siguientes propiedades de los tampones: 39

Manual de Prácticas de Bioquímica (a) aquella mezcla que tenga una proporción [base]/[ácido] = 1, tiene el máximo de tamponamiento contra ácidos fuertes y bases fuertes y su pH es igual al pKa del ácido componente; (b) las mezclas con una proporción [base]/[ácido] entre 0.1 y 10, tiene un tamponamiento significativo y su pH cae entre 1 unidad por arriba y por debajo del pKa del ácido componente; (c) el pH de cualquier mezcla de este tipo se calcula aplicando al fórmula de HendersonHasselbalch, pH = pKa + log [base]/[ácido], donde pKa es el valor de pKa del ácido componente. En la elección de un tampón para estabilizar el pH de una mezcla de reacción, se debe cuidar que sus componentes no interfieran con la reacción de ninguna forma. De varias mezclas tampón no perjudiciales, se escogerá aquella cuyo componente ácido posea, a la temperatura de trabajo, un valor de pka muy cercano al pH requerido. Para preparar una mezcla tampón, en vez de neutralizar parcialmente un ácido débil con álcali, es más conveniente mezclar una determinada cantidad de ácido débil en solución, con una cantidad de su sal cuyo anión es su base conjugada y cuyo catión sea neutro La composición real de un tampón requerido se calcula a partir de la ecuación de HendersonHasselbalch y la concentración de sus componentes elegidos para dar una mezcla con capacidad tampón lo suficientemente grande como para mantener un pH constante durante el tiempo que dura el experimento. 7.1. ACCION BUFFER.- Si consideramos la acción buffer de un ácido débil (HX) y su sal (NaX):

El ácido se ioniza solo en una cantidad muy limitada y la sal se considera completamente ionizada. Por tanto, si consideramos un tampón formado por ácido acético y acetato de sodio, la concentración de ácido es casi la misma que se agregó a la mezcla, y de igual modo la concentración del ion acetato puede ser considerado igual a las concentraciones de la sal añadida. +

-

En este caso, los iones H son absorbidos por la sal y los iones OH son absorbidos por el ácido. +

La adición de iones H (como HCl, que se disocia completamente), produce la reacción + 1 "en la dirección inversa"; los iones H se combinan con los aniones CH3COO (X ) procedentes de la sal para formar el ácido no disociado (HX) o CH 3COOH y, por esto, la + concentración del ion H permanece más o menos constante.

-

Inversamente, la adición de OH (como NaOH) hace que la reacción 1 vaya hacia la + derecha; los iones OH se combinan conos iones H para formar agua y por tanto, la + concentración del ion H permanece más o menos constante. (En buffer de una base débil y + su sal, es la base la que tampona frente a los iones H y la sal frente a los iones OH ).

40

Manual de Prácticas de Bioquímica -

Como el NaOH se disocia en forma completa, por ser bases fuertes, su OH forma H2O + con el H del ácido acético. La mayor parte del ácido acético no está disociado porque es + débil, pero como sus H son captados inmediatamente por el OH para formar agua, esto permite que la disociación del ácido acético continúe y continúe hasta que finalmente todo el ácido acético es convertido e acetato de sodio. +

El constituyente del buffer que absorbe iones H es frecuentemente referido como "reserva alcalina" y el constituyente que absorbe los iones OH es la "reserva ácida". Los buffer tienen una capacidad tamponante limitada. Cuando se añade una cantidad equivalente de ácido a la "reserva alcalina", la acción tamponante es pobre en la región ácida. A la inversa, cuando se añade una cantidad equivalente de base a la "reserva ácida" la acción amortiguadora es baja en la región alcalina. 7.2. CAPACIDAD TAMPON.- Las soluciones amortiguadoras difieren en su capacidad para resistir los cambios de pH, por lo que Van Slyke introdujo el término capacidad tampón, que se define como los equivalente gramo por litro de ácido fuerte o base fuerte que se requieren para alterar 1 unidad de pH a 1 litro de amortiguador 1 N. Está dad por la reacción:

siendo dB el incremento (en equivalente gramo por litro) de base o ácido fuerte añadido a la solución tampón; y el dpH el incremento resultante de pH. Una solución tiene una capacidad tampón de 1 cuando un litro de la misma necesita 1 equivalente gramo de un ácido o de una base fuerte para experimentar un cambio de pH en una unidad. 7.3. FUERZA IONICA Y AMORTIGUADORES.- La constante Ka (constante de ionización del ácido) depende en gran parte de la concentración total de iones en la solución. Los iones tienden a atraer iones de carga opuesta. Alrededor de un ion dado existe una "atmósfera iónica" formada por iones de carga opuesta. Por tanto, el pKa varía según la fuerza iónica (I). La fuerza iónica se define como:

donde Ci es la concentración de la variación iónica i y Zi es la carga de este ion. Por tanto, para sales monovalentes, la fuerza iónica es igual a la concentración molar de la sal. Ejm. Prepare amortiguador acetato de sodio, de pH 5 con un fuerza iónica de 0.1. Método 1: Disuelva 0.1 mol de NaOH o de acetato de sodio en 800 ml de agua aproximadamente. Añada ácido acético hasta pH 5. Afore a 1 litro. Método 2:

41

Manual de Prácticas de Bioquímica

En vista de que sal = 0.1 M, ácido = 0.05 M. Añada 0.1 mol de acetato de sodio, 0.05 mol de ácido acético, y afore a un litro. Ejm. Prepare un amortiguador fosfato de pH 7.4 con una fuerza iónica de 0.05.

Como el pKa del fosfato es 6.8, para una fuerza iónica de 0.05,

tomando antilogaritmos:

Para que se respete la neutralidad eléctrica:

Introduciendo estas dos últimas ecuaciones en la primera:

-

=

por tanto, [H2PO4 ] = 0.00385. Empleando la tercera ecuación se despeja [HPO 4 ]. Para obtener un amortiguador que tenga la fuerza iónica buscada, diluya hasta 1 litro 0.00385 mol de NaH2PO4 y 0.0154 mol de Na2HPO4. 8. CUESTIONES PRÁCTICAS SOBRE CURVAS DE TITULACION 8.1. LIMITES PRACTICOS DE LAS CURVAS DE TITULACION.- Si en la titulación se usan ácido fuertes o bases fuertes 0.1 M, las curvas se aproximan asintóticamente al pH 1 o a pH 13, después de producirse la neutralización completa. En forma similar, los límites para las soluciones 0.01 M serán pH 2 o pH 12 y por tanto, valores de pKa por debajo de 2 o por encima de 12 no pueden ser determinados usando soluciones 0.01 M. 8.2. CORRECCION POR SOLVENTE.- Se deben corregir las curvas experimentales de titulación para tomar en cuenta la cantidad de ácido o base usados en la titulación del solvente, que generalmente es agua destilada. esto se hace de la siguiente manera: a. Dibuje las curvas de titulación para los mismos volúmenes de muestra. b. Seleccione un valor cualquiera de pH en la curva para la muestra y anote el volumen de ácido o base usado; denomine esto X ml. En la misma forma, anote la cantidad de ácido o base consumida para llevar el agua al mismo valor de pH; denomine esto Y ml. c. La cantidad neta de ácido o base consumida en la titulación de la muestra está dada por (X - Y) ml. Repita esto para varios valores de pH y haga la curva correcta de titulación. 8.3. DETERMINACION DE pKa.- Es esencial el conocimiento del pKa de un ácido, para su 42

Manual de Prácticas de Bioquímica debido uso como tampón. Los valores de pKa pueden obtenerse por varios métodos, a partir de la curva de titulación: a. El pH en el punto de inflexión en una curva de pH frente a equivalentes de base o ácido añadidos, es igual al pKa y se puede leer directamente. Una forma más conveniente consiste en hacer el gráfico de dB / dpH, que es el valor amortiguador en función del pH y cuando se obtiene un máximo este corresponde al pKa. b. El pKa es igual al pH al cual se ha titulado la mitad de ácido, es decir [HA] / [A ] = 1 . Este punto de titulación medio se obtiene fácilmente de la curva de titulación si puede determinarse o calcularse el punto final (conociendo los equivalentes de ácido añadido, o superponiendo 2 unidades de pH por encima del punto aproximado de inflexión). c. El pKa se puede calcular de cualquier punto de la curva de titulación sustituyendo los valores experimentales de pH, [HA] y [A ] en la ecuación:

ó

Estos cálculos pueden hacerse para diferentes puntos de la curva de titulación, y tomarse para pKa la medida de estos valores. A valores extremos de pH (por encima de 10 y por debajo de 3) el ácido o base requerido para titular el disolvente solo a cada pH debe respetarse la cantidad añadida a la solución. d. El cociente sal / ácido puede calcularse experimentalmente y se puede hacer un gráfico de log10 sal / ácido en función de pH. La intersección en el eje es el valor de pKa.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N° 1. DETERMINACION DEL pH MEDIANTE USO DE INDICADORES y pHMETRO MATERIAL: 1. Indicador Universal, Fenolftaleína Anaranjado de metilo. 2. Muestras diluidas 1:10 de agua, soluciones de diferentes ácidos, jugo de naranja, limón, bebidas gasificadas, agua embotellada, etc. METODO DE TRABAJO En un tubo de ensayo pipetee 2 ml de cada muestra, agregue dos gotas de indicador universal y observe el color. Repita el experimento con otros indicadores comparando los colores de las muestras con las formas ácida, intermedia y básica del indicador (tabla 3 y 5). DATOS EXPERIMENTALES Indicador Universal Color pH

Fenolftaleína Color

pH

Anaranjado de metilo Color pH

pHmetro pH

Agua destilada HCl 0.1 N Jugo de limón NaOH 0.1 N Bebida gaseosa

43

Manual de Prácticas de Bioquímica RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Presentar figuras (fotos) que representen el tipo de muestra y el indicador de pH utilizado.

EXPERIMENTO N° 2. TITULACION DE UN ACIDO FUERTE CON UNA BASE FUERTE MATERIALES Buretas pHmetro de inmersión Beakers de 50 ml Baguetas Pipetas de 5 ml HCl 0.1 N (solución valorada) Fenolftaleína 1% NaOH o KOH 0.1 N (solución valorada) Anaranjado de metilo 0.1% METODO DE TRABAJO En un beaker de 50 ml pipetee 10 ml de HCl 0.1 N y mida el pH con ayuda del pHmetro, agregue 3 gotas de fenolftaleína. Seguidamente titule esta solución con NaOH 0.1 N y mida el pH después de agregar alícuotas de 1 ml de álcali. Cuando se aproxime al punto final de la titulación, reduzca la cantidad de álcali agregada, hasta obtener un cambio razonable en el pH. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados y calcule los valores de pH teóricos para cada mililitro de NaOH añadido. NaOH 0.1 N (ml)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

pH Exper. pH Teór.

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA En papel milimetrado construya la curva de titulación de los valores de pH del ácido clorhídrico frente al volumen de NaOH añadido. En el mismo sistema grafique los valores teóricos encontrados. Compare las gráficas.

EXPERIMENTO N° 3. TITULACION DE UN ACIDO DEBIL CON UNA BASE FUERTE: DETERMINACION DEL pKa DEL ACIDO ACETICO MATERIAL Beakers de 50 ml pHmetro Bagueta Acido acético 0.1 N NaOH 0.1 N METODO DE TRABAJO Titúlese 10 ml de ácido acético 0.1 N con NaOH 0.1 N y anote el pH para cada mililitro de álcali añadido. Durante la práctica calcular teóricamente, los valores de pH para 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ml de álcali añadido, usando las fórmulas de disociación de ácidos 44

14

Manual de Prácticas de Bioquímica débiles, la ecuación de Henderson-Hasselbalch y la de disociación de sales. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados y calcule los valores de pH teóricos para cada mililitro de NaOH añadido. NaOH 0.1 N (ml)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

pH Exper. pH Teór.

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Presentar gráficamente, en papel milimetrado, los valores de pH del ácido acético frente al volumen de NaOH añadido. En el mismo sistema grafique los valores teóricos encontrados. Compare las gráficas. Determine el valor de pKa del ácido acético.

EXPERIMENTO N° 4. BUFFER FOSFATO Y CAPACIDAD TAMPON MATERIALES Beakers de 50 ml pHmetro Goteros Bagueta Pipetas de 10 ml Solución 0.2 M de fosfato monobásico de sodio, pKa 6.8 (27.8 g de NaH 2PO4 en 1000 ml de agua destilada) Solución 0.2 M de fosfato dibásico de sodio (53.65 g de Na 2HPO4 ó 71.7 g de Na2HPO4.12H2O en 1000 ml de agua destilada) METODO DE TRABAJO Calcular la relación y los ml de NaH2PO4 0.2 M y de Na2HPO4 0.2 M requerida para obtener 100 ml de una solución de pH 6. Diluir estos 100 ml hasta 200 ml para obtener un buffer fosfato 0.1 M. DATOS EXPERIMENTALES Tome 10 ml de la solución anterior y mida el pH utilizando un pHmetro. RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Incluya figuras (fotos) o haga un esquema del experimento.

CUESTIONARIO 1. Calcule los valores de pH y trace la curva de titulación de 500 ml de ácido acético 0.010 M (pKa 4.76) con KOH 0.010 M. 2. Calcular la concentración de protones, en moles por litro de una solución 1M de ácido -5 acético, sabiendo que la Ka del ácido acético a 25°C es de 1.86 x10 3. Cuál es el pH de las siguientes mezclas de soluciones tampón? a) Acido acético 1 M más acetato sódico 0.5 M b) Acido fosfórico 0.3 M más KH2PO4 0.8 M

45

14

Manual de Prácticas de Bioquímica 4. Supóngase que quiere conseguir un tampón de un pH exactamente 7.00 utilizando KH2PO4 y Na2HPO4. Si tiene una solución de KH2PO4 0.1 M. Qué concentración de Na2HPO4 necesitaría? 5. Una muestra de 500 ml de tampón formiato 0.100 M, pH 3.75, se trata con 5 ml de KOH 1.00 M. Qué pH se obtiene tras dicha adición?. 6.

Describa la preparación de 2.0 litros de tampón glicina 0.100 M, pH 9.0, a partir de glicina (PM en forma de zwitterion, 75.07 g/mol) y NaOH 1.00 M. El pK de la glicina es 9.6.

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Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 4 CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE CARBOHIDRATOS INTRODUCCIÓN Los carbohidratos están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el reino vegetal. Constituyen los productos finales de la fotosíntesis en las plantas verdes. Los animales, incapaces de tal acumulación de energía solar, aprovechan las sustancias acumuladas por las plantas. Los carbohidratos participan en la construcción de las estructuras del organismo vivo, sirve como material para la biosíntesis de otro tipo de compuestos y juega un papel importante en la bioenergética de la célula. Los carbohidratos entran a formar parte de los ácidos nucleicos las glicoproteínas, glicolípidos y de algunas vitaminas y coenzimas. Como integrantes de las glicoproteínas, participan en la formación de la capa externa adyacente a la membrana, que desempeña un papel importante en la protección de las células contra la penetración en ellas de microorganismos y virus. Estos carbohidratos están relacionados con las propiedades inmunoquímicas de los tejidos. Los carbohidratos son compuestos polifuncionales que contiene grupos carbonilo (aldehído o cetónico) y grupos hidroxilo alcohólicos. Por esto; poseen propiedades de aldehídos y cetonas y de alcoholes polihidroxílicos. Los carbohidratos se dividen en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos pueden unirse entre sí mediante un proceso denominado síntesis por condensación o deshidratación. En dicho proceso se unen dos o más monosacáridos para formar un disacárido, trisacárido, tetrasacárido, etc. liberándose una molécula de agua. La fórmula general de los carbohidratos es (CH2O)n. Todos los monosacáridos naturales que tienen átomos de carbono asimétrico, son ópticamente activos y desvían el plano de la luz polarizada. Los oligosacáridos y los polisacáridos son carbohidratos complejos, los cuales al ser calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se desintegran en monosacáridos. Los polisacáridos poseen una masa molecular muy elevada, son insolubles en agua y la mayoría de ellos forman soluciones coloidales.

PARTE EXPERIMENTAL

1.

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS CARBOHIDRATOS

EXPERIMENTO N° 1. FORMACION DE FURFURALES FUNDAMENTO Esta reacción es general para los hidratos de carbono y se aplica para detectar su presencia en los materiales biológicos. El ácido sulfúrico concentrado hidroliza enlaces glicosídicos para dar monosacáridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural a partir de pentosas y 5-hidroximetilfurfural a partir de las hexosas. Estos productos se combinan luego con α-naftol sulfonato originando un complejo púrpura o con timol dando una coloración roja.

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Manual de Prácticas de Bioquímica

MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Timol al 1% en alcohol etílico Acido sulfúrico concentrado Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa, sacarosa, etc. METODO DE TRABAJO En cada uno de los tubos de ensayo colocar 2.0 ml de solución de carbohidrato. Añadir 4 gotas de -Naftol o Timol. Luego añadir, por las paredes del tubo, 2.0 ml de ácido sulfúrico concentrado teniendo cuidado que no se mezcle con la capa acuosa. Lleve a baño en ebullición por 1 min, Retire y observe en la interface la aparición de una coloración roja. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados en la siguiente tabla CARBOHIDRATO Glucosa Sacarosa Almidón

OBSERVACIÓN

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Además comente la utilidad de la reacción en muestras biológicas

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Manual de Prácticas de Bioquímica EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE REDUCCION: PRUEBA DEL HIDROXIDO CUPRICO. FUNDAMENTO Los carbohidratos que en su molécula poseen un grupo carbonilo libre, se llaman reductores. Estos azúcares, en un medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse, reduciendo +2 + a su vez las sales de óxido cúprico (Cu ) a sales de óxido cuproso (Cu ). Esta es la base para una serie de métodos de determinación cualitativa y cuantitativa de carbohidratos. En solución alcalina los monosacáridos y disacáridos reductores reducen el hidróxido cúprico (II) en óxido cuproso (I).

MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Reactivo alcalino de cobre Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa, sacarosa, etc. METODO DE TRABAJO En los tubos de ensayo vierta 2.0 ml de solución de carbohidratos; luego añada 2.0 ml del reactivo de cobre y agite. Colocar en baño maría hirviente. La aparición de un precipitado de color rojo (óxido cuproso) indica la presencia de carbohidratos reductores. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados en la siguiente tabla: CARBOHIDRATO

TIPO DE HIDRATO DE CARBONO Monosac. Oligosac. Polisac.

REDUCTOR

NO REDUCTOR

GLUCOSA SACAROSA ALMIDÓN

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Además comente la utilidad de la reacción en muestras biológicas

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Manual de Prácticas de Bioquímica 2.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

EXPERIMENTO N° 3. HIDROLISIS ACIDA DEL ALMIDON FUNDAMENTO Durante el calentamiento del almidón con HCl diluido, este se descompone en fragmentos de diferente tamaño llamados dextrinas. Estas se distinguen entre sí por la masa molecular y por el color que dan en presencia de yodo. A continuación se da un esquema de la hidrólisis ácida del almidón: Almidón Amilodextrinas Eritrodextrinas Acrodextrinas Maltodextrinas Maltosa Glucosa

+ + + + + + +

I2 I2 I2 I2 I2 I2 I2

Azul Violeta azul Pardo rojiza Incolora Incolora Incolora Incolora

MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Almidón al 1% Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua) Reactivo alcalino de cobre HCl concentrado METODO DE TRABAJO Vierta 10.0 ml de solución de almidón en un tubo de ensayo. Añada 0.5 ml de ácido clorhídrico concentrado. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada, agite y añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño maría hirviente. Después de 10 minuto se toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo de ensayo que contiene 5.0 ml de agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. El color azul violeta indica la presencia de amilodextrinas en la solución. Repita la misma operación cada 10 minutos, hasta que la prueba con lugol sea negativa. Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un precipitado rojo ladrillo. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados en la siguiente tabla: TIEMPO (minutos) 0 10 20 30 40 50 60

COLOR

50

Manual de Prácticas de Bioquímica RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Además comente la utilidad de la reacción en la industria alimentaria

EXPERIMENTO N° 4. HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON FUNDAMENTO Por acción de la amilasa el almidón se hidroliza para dar lugar al disacárido maltosa, que luego se hidroliza por acción de la maltasa hasta glucosa. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Almidón al 1% Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua) Reactivo alcalino de cobre Solución de saliva diluida (1:5) METODO DE TRABAJO Verter en un tubo de ensayo 5.0 ml de la solución de almidón; añadir 1.0 ml de solución de saliva diluida. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada, agite y añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño maría a 37 °C. Después de 20 segundos se toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo de ensayo que contiene 5.0 ml de agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. Se repita la misma operación cada minuto, hasta que la prueba de lugol nos dé negativa. Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un precipitado rojo ladrillo. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados en la siguiente tabla: TIEMPO (SEGUNDOS) 0 20 40 60

COLOR

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Además comente la utilidad de la reacción en la industria alimentaria.

3.

DETERMINACION COLORIMETRICA DE AZUCARES

EXPERIMENTO N° 5. DETERMINACION DE ACIDO ASCORBICO EN ORINA FUNDAMENTO El ácido ascórbico es oxidado por el colorante 2,6-diclorofenolindofenol. Al mismo 51

Manual de Prácticas de Bioquímica tiempo, el colorante se reduce a un compuesto incoloro permitiendo determinar fácilmente el punto final de la reacción. Además del ácido ascórbico otros compuestos pueden decolorar el pigmento, pero la especificidad puede aumentar hasta cierto punto efectuando la reacción en solución ácida en la cual las sustancias que interfieren reaccionan muy lentamente. La determinación de ácido ascórbico nos puede determinar escorbuto haciendo una prueba de saturación. MATERIAL Matraz Pipetas Bureta Solución de 2,6-diclorofenolindofenol 1mM (pesar 32.6 mg de 2,6-diclorofenolindofenol y disolverlo en agua destilada hasta 100 ml) Solución patrón de ácido ascórbico (20 mg/ 1000 ml). (Prepárese en el momento de usarse) Acido acético glacial Muestra de orina METODO DE TRABAJO Para colectar la muestra de orina, se indica al paciente que bebe realizarse una higiene de los genitales, previa a la recolección de la muestra, para la cual se debe utilizar un frasco de boca ancha (esterilizado). En un matraz pipetear 0.5 ml de orina y agregar 4.5 ml de agua destilada (dilución 1:10), luego agregar 0.5 ml de ácido acético glacial y titular con 2,6-diclorofenolindofenol hasta obtener un color rosa estable. Anotar el volumen usado en la titulación (T). Repetir por lo menos dos veces. Asimismo, titule dos tubos, usando para el blanco 5.0 ml de agua destilada (Bl) y 5.0 ml de solución patrón de ácido ascórbico (Pt). Además, agregue a ambos 0.5 ml de ácido acético glacial y titule como en el caso anterior. El contenido de vitamina en la muestra se determina utilizando la siguiente fórmula:

DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados en la siguiente tabla: TUBO

2,6-DICLOROFENOLINDOFENOL (ml añadidos)

T Bl Pt RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Además comente la utilidad de la reacción en patología clínica.

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Manual de Prácticas de Bioquímica EXPERIMENTO N° 6. DETERMINACION DE GLUCOSA POR EL METODO DE TRINDER FUNDAMENTO La reacción de Trinder (Trinder, 1969) ha sido ampliamente usada para determinar glucosa enzimáticamente. Esta reacción involucra la oxidación de la glucosa en presencia de glucosa oxidasa a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno, y la formación de una quinonimina roja (4(p-benzoquinona-imino) aminofenazona) por reacción del peróxido con 4-aminofeazona y fenol en presencia de peroxidasa. La quinonimina formada se determina espectrofotométricamente a 505 nm.

MATERIAL Tubos de ensayo Espectrofotómetro Baño maría Amortiguador de fosfatos 100 mmol/l pH 7.0. A 800 mL de agua destilada se agregaron 12.95 g de fosfato disódico dihidratado, 4.95 g de fosfato de potasio anhidro y 0.5 g de azida de sodio. Los reactivos se disolvieron, se ajustó a un pH de 7.0 y la solución se llevó a un volumen final de 1 L. Reactivo de color. A 100 ml del amortiguador de fosfatos se añadieron 16 mg de 4aminofenazona, 1,800 U de glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4), 100 U de peroxidasa (EC 1.11.1.7), 105 mg de fenol y 50 µL de tween 20. Solución estándar de glucosa 100 mg/dl Muestra problema (Suero) METODO DE TRABAJO A 1.0 ml de reactivo de color se adicionaron 10 µl de suero, estándar o agua para preparar los problemas, estándares o blanco respectivamente. Las mezclas de reacción se incubaron durante 10 min a 37°C y se realizaron las lecturas espectrofotométricas de los problemas y estándares a 510 nm, calibrando el espectrofotómetro contra el blanco de reactivos. El contenido de glucosa en las muestras se determinan utilizando la siguiente fórmula:

DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados en la siguiente tabla: 53

Manual de Prácticas de Bioquímica

TUBO

Absorbancia

Muestra 1

1,789

Muestra 2

0.820

Estándar

0.868

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Además comente la utilidad de los resultados en patología clínica.

CUESTIONARIO 1. Describa la interacción de hormonas y enzimas en el control de las concentraciones de glucógeno. 2. Cuál es la función de la vitamina C en el organismo. 3. Describa un método para determinar carbohidratos totales en plantas (Investigue!!!).

54

Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 5 ANALISIS DE LIPIDOS Se llama lípidos a un conjunto de moléculas orgánicas, la mayoría biomoléculas, compuestas principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno. Tienen como característica principal ser insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos como el benceno. Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos emparentados, con los ácidos grasos. Son constituyentes importantes de la alimentación no solo por su elevado valor energético, sino también por las vitaminas liposolubles y los ácidos grasos esenciales contenidos en la grasa de los alimentos naturales. SOLUBILIDAD Es importante tener presente que la solubilidad de los lípidos, en general, dependen de la relación numérica entre el número de grupos hidrófilos de hidrófobos de los ácidos grasos, mientras que los grupos hidrófobos están representados por el resto de la cadena hidrocarbonada. De esto se desprende que, cuanto más larga sea la cadena hidrocarbonada del ácido graso, la relación entre los grupos mencionados será tanto menor y menos soluble, en agua, será el ácido graso. La solubilidad en los solventes orgánicos, por el contrario, depende de la afinidad del solvente por la cadena carbónica no funcional. INDICE DE ACIDEZ Se define como el número de mg de KOH necesarios para neutralizar 1 gr. de grasa. Está en relación con la cantidad de ácidos grasos libres presentes en la grasa. Tiene interés porque nos indica el estado de conservación y el grado de ranciamiento de una grasa, puesto que todo tipo de grasa tiene una cantidad característica de ácidos grasos libres, más allá del cual significa alteración. INDICE DE SAPONIFICACION Se define como el número de mg de KOH, que se requiere para saponificar completamente 1 gr. de grasa. Depende del tamaño de las moléculas de los ácidos grasos que forman parte de la grasa en estudio. Las relaciones son inversas. Puesto que las grasas son mezclas de glicéridos, la mayoría de tipo mixto, el índice de saponificación da un promedio del tamaño molecular de los ácidos grasos presentes en los glicéridos constituyentes de dichas grasas. Es decir, que su importancia reside en la relación existente entre el índice de saponificación y la longitud de la cadena de los ácidos grasos del triglicérido.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N° 1. SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS FUNDAMENTO Los grupos principales de los lípidos tienen características de solubilidad diferentes y esta propiedad se usa en su extracción y purificación a partir de materiales biológicos. La mayoría de los lípidos son solubles en etanol al 95%, pero forman una emulsión de gotas pequeñas cuando se les agrega agua. Esto da a la suspensión una apariencia lechosa característica y constituye una prueba muy sencilla para grasas. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Alcohol 55

Manual de Prácticas de Bioquímica Acetona Eter Dietílico Cloroformo Aceite de Oliva METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: TUBOS Agua Destilada (ml) Alcohol Frío (ml) Alcohol Caliente (ml) Eter (ml) Acetona (ml) Aceite de Oliva (gotas)

1 2.0 4.0

2 2.0 4.0

3 2.0 4.0

4 2.0 4.0

5 2.0 4.0

Agitar enérgicamente, dejar en reposo. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus resultados en la siguiente tabla: SOLUBILIDAD Agua Destilada Alcohol Frío Alcohol Caliente Eter Acetona RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Explique a qué se debe la solubilidad o insolubilidad del aceite de oliva en cada uno de los solventes utilizados

EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACION DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA FUNDAMENTO Las grasas almacenadas pueden sufrir enranciamiento debido a la oxidación de los dobles enlaces para formar peróxidos y a su hidrólisis por microorganismos con liberación de ácidos grasos. La cantidad de ácidos grasos libres da, por lo tanto, un índice de la frescura y calidad de la grasa. El presente experimento consiste en disolver la muestra con un solvente neutralizado y en titular la acidez con una solución de KOH de normalidad conocida. Es decir, se titulan los ácidos grasos libres. MATERIAL Matraz Beaker Cloroformo Alcohol al 95% Fenolftaleína al 1% 56

Manual de Prácticas de Bioquímica KOH 0.1 N Aceite de Oliva METODO DE TRABAJO Proceder de la siguiente manera: 1. Neutralización de los solventes.- En un matraz se mezclan 2.5 ml de cloroformo y 5.0 ml de alcohol, se agregan 4 gotas de fenolftaleína, seguidamente se titula con KOH, hasta que aparezca un leve color rosado que persista durante 30 seg. 2. En un beaker previamente tarado, pesar 1.0 g. de grasa (aceite de oliva u otra grasa), agregar la mezcla alcohol-cloroformo neutralizado, mezclar bien la grasa con los disolventes. Se agrega 4 gotas de fenolftaleína y se valora inmediatamente con KOH, hasta que el color rosado pálido permanezca por más de 30 seg. CÁLCULOS

Donde: I.A. = Indice de Acidez n = ml de KOH 0.1 N usados en la titulación. 1 ml de esta solución es igual a 0.0056 g. de KOH. P = Peso de la muestra problema Si se desea expresar en términos de % de ácidos grasos libres, referidos a ácido oleico, con los mismos datos tendremos:

0.0282 = 1 g. de ácido oleico (PM = 282). DATOS EXPERIMENTALES Anote el número de mililitros gastados de álcali en la siguiente tabla: Aceite de oliva Gasto de KOH (ml)

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Explique qué indica el valor de índice de acidez, respecto al estado de conservación y aptitud para el consumo de la grasa utilizada?

EXPERIMENTO N° 3. INDICE DE SAPONIFICACION DE UNA GRASA FUNDAMENTO Este índice nos da la medida de los ácidos grasos producidos durante la hidrólisis alcalina de una mezcla de grasa natural. Dado que una molécula de triglicérido requiere 3 moléculas de KOH (PM = 56), para saponificarse, independientemente del peso molecular de los ácidos grasos presentes, este hecho ha sido usado para tener una información del peso molecular medio de los ácidos grasos presentes en una grasa. MATERIAL Matraz Aceite de Oliva 57

Manual de Prácticas de Bioquímica Mantequilla u otra grasa Solución de KOH alcohólico 0.5 N HCl 0.5 N METODO DE TRABAJO Proceda como se indica a continuación: Beaker Aceite de Oliva (g.) Mantequilla (g.) Sol. KOH en Alcohol 0.5 N (ml)

1 1.0 10.0

2 1.0 10.0

3 10.0

Colocar los beakers en baño de agua hirviente, durante 30 ó 45 minutos, agitar continuamente para favorecer un mejor contacto. Transcurrido el tiempo indicado, se deja enfriar. Seguidamente se agrega 4 gotas de fenolftaleína en cada beaker y se titula con HCl. DATOS EXPERIMENTALES Anote el número de mililitros gastados en cada una de las titulaciones: Aceite de oliva

Mantequilla

Sol. KOH en Alcohol

Gasto de HCl (ml)

CÁLCULOS Calcule el índice de saponificación usando la siguiente fórmula:

Donde: I.S. = Indice de saponificación V = ml gastados en el blanco V' = ml gastados en la muestra (1 ml de solución de KOH = 0.2805 g. de la misma sustancia = 28.05 mg). Si se desea saber el peso molecular medio de los ácidos grasos presentes en la muestra problema usar la siguiente fórmula:

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Explique qué indica el valor de índice de Saponificación de la grasa utilizada y cuál es su utilidad. CUESTIONARIO 1. ¿Por qué la trioleína, a temperatura ambiente, se encuentra en estado líquido, y la tripalmitina se encuentra en estado sólido a la misma temperatura? 2.

Las grasas y aceites son moléculas apolares, ¿y los fosfolípidos? Razona la respuesta.

3.

¿Qué tipo de ácidos grasos preferentemente contendrá el tocino de cerdo?

58

Manual de Prácticas de Bioquímica 4.

El aceite de oliva, como sabes, se obtiene a partir del fruto del olivo, la aceituna. ¿Puede tener este aceite colesterol? Razona la respuesta.

5.

La mantequilla y la margarina son productos alimenticios sólidos a temperatura ambiente. La mantequilla se fabrica a partir de la leche, mientras que las margarinas a partir de aceites vegetales. En la etiqueta de una determinada margarina se indica que se ha fabricado a partir de aceites vegetales hidrogenados. ¿Cómo es posible que ambos productos sean sólidos a temperatura ambiente?

6.

El índice de saponificación de una muestra de mantequilla es 230. Calcular el peso molecular de los triglicéridos

7.

El índice de yodo de una muestra de mantequilla es 68. Si el índice de saponificación de la muestra es210. Cuántos dobles enlaces, hay en una molécula de triglicérido?

59

Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 6 CARACTERIZACION DE AMINOACIDOS Los aminoácidos son los sillares de construcción de las proteínas. El número de aminoácidos comunes se reduce a 20. Todos con excepción de la prolina, tiene un grupo carboxilo libre y un grupo amino libre no sustituido unido al carbono a. Difieren unos de otros en la estructura de su cadena lateral que se denomina grupo R. Siendo su estructura general:

Los aminoácidos son importantes en la alimentación humana. En forma de proteínas los aminoácidos realizan una multitud de funciones estructurales, hormonales y catalíticas esenciales para la vida. Por lo tanto, no sorprende que defectos genéticos en el metabolismo de los aminoácidos pueden conducir a transtornos graves como el retraso mental y muerte temprana. Además de sus actividades como proteínas, los L-aminoácidos y sus derivados participan en funciones intracelulares tan diversas como transmisión nerviosa, regulación del desarrollo celular y en la biosíntesis de porfirinas, purinas y pirimidinas así como urea.

REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS Los aminoácidos presentan reacciones de significación biológica que evidencian su capacidad de interactuar covalentemente entre sí mediante el grupo -carboxilo de una molécula y el -amino de otra molécula para formar un enlace peptídico. Los aminoácidos participan además en una gran variedad de reacciones químicas que incluyen la alquilación, arilación y acilación del grupo amino, la formación de ésteres y anhídridos que implican al grupo carboxilo y reacciones similares en las que interviene los grupos reactivos de las cadenas laterales. El conocimiento de estas reacciones es útil en varios aspectos importantes de la química proteica: a. Para identificar y analizar los aminoácidos en un hidrolizado proteico. b. Para identificar la secuencia de los aminoácidos en las proteínas. c. Para la identificación de los residuos específicos de aminoácidos requeridos para la función biológica de las proteínas. d. Para producir cambios en la actividad biológica de la proteína mediante modificaciones químicas de los residuos de los aminoácidos constituyentes. e. Para la síntesis química de los polipéptidos. Dentro de las principales reacciones podemos mencionar: 1. REACCION CON ACIDO NITROSO.- El ácido nitroso reacciona con los grupos amino primarios alifáticos con liberación de nitrógeno para formar alcoholes. Esta reacción puede ser usada para estimar cuantitativamente los aminoácidos midiendo la cantidad de nitrógeno liberado.

60

Manual de Prácticas de Bioquímica 2. REACCION CON NINHIDRINA.- Usada para la determinación cuantitativa de los aminoácidos y péptidos. Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina para dar un característico color azul violáceo llamado azul de Ruheman con una absorción máxima a 540 nm a excepción de la prolina e hidroxiprolina que dan un color amarillo, con una absorción máxima a 440 nm. La ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado. La determinación cuantitativa puede hacerse también midiendo el CO 2 desprendido.

3. REACCION CON EL DINITROFLUOROBENCENO (DNB).- El grupo amino reacciona con el DNB en condiciones alcalinas para formar un derivado amarillo. Esta reacción es importante en la determinación del grupo amino terminal en proteínas, lo que permite identificar el aminoácido iniciador de la cadena polipeptídica. Ya que al realizar la hidrólisis ácida de la proteína se libera el aminoácido N-terminal arilado; pudiendo ser identificado por cromatografía en papel o capa fina.

4. REACCION CON CLORURO DE DANSILO.- Un grupo amino libre reacciona con el cloruro de dansilo para formar un compuesto fluorescente que puede detectarse y medirse en cantidades pequeñas, mediante métodos fluorimétricos.

61

Manual de Prácticas de Bioquímica

5. REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.- Es la reacción de Edman para determinar el Nterminal de una cadena polipeptídica. El fenilisotiocian -aminoácidos para dar los ácidos feniltiohidantóicos correspondientes. Estos ácidos al ser tratados con solventes no hidroxilados, como el nitrometano; se ciclan para dar las feniltiohidantoínas; las cuales son reconocidas por cromatografía de gas-líquido, de papel o de capa fina.

6. REACCION CON CLORURO DE TRIOFLUOROACETILO.- Se utiliza en la cromatografía de gas-líquido. Los derivados trifluoroacéticos se volatilizan fácilmente sin descomponerse para separarse por cromatografía gas-líquido mientras que los aminoácidos libres se descomponen.

Las reacciones antes señaladas son comunes a todos los aminoácidos. Pero los aminoácidos presentan reacciones que dan color y dependen de su cadena lateral y por lo tanto, son más específicas en la identificación de aminoácidos. Entre las reacciones químicas que se usan para la detección o estimación de algunos aminoácidos específicos tenemos: reacción xantoproteica, reacción de millon, reacción del acetato de plomo, reacción de sakaguchi, etc. Cuyo fundamento se explica en la parte experimental.

62

Manual de Prácticas de Bioquímica DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO EN LOS AMINOACIDOS Los aminoácidos presentan propiedades eléctricas por lo que son considerados como anfolitos, puesto que poseen un grupo ácido y un grupo básico. En solución existen como moléculas cargadas. En su punto isoeléctrico, existen en forma de zwitterion o ion dipolar (sal); a pH menor que el punto isoeléctrico existen como cationes, que actúan como ácidos; y a un pH mayor, existe como un anión, que actúa como base. Estas formas no tienen una acción + buffer buena o total y la adición de pequeñas cantidades de H ó OH alteran rápidamente el pH de la solución . Cuando el aminoácido existe como una mezcla de la sal y la forma ácida o básica en concentraciones aproximadamente equimolares (en la región de sus valores de pK), el sistema actúa como un buffer estable. Como se mencionó anteriormente el punto isoeléctrico es el pH al que el aminoácido no lleva carga neta; es en esta forma que los aminoácidos no poseen acción buffer. La acción tamponante es más grande cuando la concentración de la forma de la sal iguala a la concentración de la forma ácido o de la forma de base. Considere la reacción:

El pK = pH cuando la [sal] = [ácido]. Esto en el rango de pH ácido para la mayor capacidad tamponante. Similarmente para la reacción:

El pKb = pH cuando la [base] = [sal]. Esto en el rango de pH alcalino para la mayor capacidad tamponante. En el punto isoeléctrico la concentración de ácido iguala a la concentración de base:

Por lo tanto:

63

Manual de Prácticas de Bioquímica

Si disponemos de una solución que contiene 1 mol de un aminoácido monocarboxílico y monoaminado a un pH de 0 y le agregamos progresivamente alícuotas de una solución de NaOH con el objeto de hacer variar el pH de la solución, se podrá obtener una gráfica como la que muestra la Fig. 1.

12

10 pKb

8 pH 6

4

Punto isoeléctrico pKa

2

ml de ácido

0

ml de álcali

Fig.1. Curva de titulación de la glicina. Se puede notar dos sectores en donde la curva tiende a la horizontalidad, es decir en donde ocurren las menores variaciones en el pH, no obstante que la cantidad de NaOH añadida, es la misma que para otros sectores de la curva. Si reparamos en que pH ocurren estos sectores de casi horizontalidad de la curva, notaremos que están muy próximos a 2.3 y 9.6; lo que quiere decir que en las proximidades del pK de sus grupos ionizables, el aminoácido tendrá una mayor acción amortiguadora del pH. Esto nos permite anotar que de los diferentes aminoácidos, la histidina (por su núcleo imidazol) es el más importante en el control del pH de los líquidos extracelulares, que como se sabe es de aproximadamente 7.4. En el punto isoeléctrico los aminoácidos son menos solubles en agua y no migran a ningún electrodo bajo la influencia de una corriente eléctrica.

AISLAMIENTO Y SEPARACION DE AMINOACIDOS Los aminoácidos pueden ser separados por Cromatografía de intercambio iónico, en este procedimiento las moléculas de las soluciones son separadas por diferencias en sus propiedades ácido-base. Para tal fin, se usan columnas con resinas sintéticas, la cual tiene grupos químicos con una carga determinada. Una de las más usadas corresponde al poliestireno, con grupos de ácido sulfónico (SO 3 ) unidos coovalentemente a los anillos bencénicos. Esta resina, por intermedio de sus grupos sulfónicos puede captar cationes e intercambiarlos con otros cationes (resina de intercambio catiónico). En virtud de la propiedad de los aminoácidos de adoptar determinada forma eléctrica 64

Manual de Prácticas de Bioquímica según el pH del medio en que se encuentren, los aminoácidos pueden ser separados fácilmente por Electroforesis. La técnica consiste en suspender a los aminoácidos en un medio de pH determinado y colocar la solución sobre un soporte, que puede ser simplemente papel y someterlo a la acción de un campo eléctrico. Según la intensidad de carga y secundariamente según su tamaño, los aminoácidos migrarán a uno u otro polo y con mayor o menor velocidad. Existe otro método muy usado para la separación de aminoácidos y que no está basado en sus propiedades eléctricas sino en la diferente solubilidad que tienen en una mezcla de solventes no miscibles. Cuando un aminoácido se disuelve en una mezcla de solvente no miscible se reparte entre ellos de acuerdo a su grado de solubilidad, que en la práctica corresponde a su coeficiente de partición o de reparto. Este principio se aplica en la técnica denominada Cromatografía de Papel y Cromatografía de Capa Fina.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N° 1. REACCION CON NINHIDRINA FUNDAMENTO Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina dando un color azul violáceo. En esta reacción la ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina, cisteína, histidina, arginina, tirosina, triptofano y cistina) Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%) Ninhidrina 0.1% en etanol de 95% METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N° Aminoácidos 0.1 M Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% Agua destilada Ninhidrina 0.1%

1

2

3

4

0.5 1.5

0.5 1.5

0.5 1.5

05 1.5

Mezclar mediante agitación suave y llevar a baño de agua hirviente por 10 minutos. Retire y enfríe. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según corresponda. REACCIÓN Caseína Ovoalbúmina Agua destilada 65

Manual de Prácticas de Bioquímica RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos de la reacción y explique los resultados.

EXPERIMENTO N° 2. REACCION XANTOPROTEICA FUNDAMENTO Es una prueba positiva para aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptófano). Se basa en la nitración del núcleo de benceno (anillo aromático) dando derivados amarillos, cuando se calientan con ácido nítrico concentrado; estos derivados se tornan anaranjados por adición de NaOH (se forman sales). MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, tirosina y triptofano) Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%) Caseína 1% Acido nítrico concentrado NaOH 1 N METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N° Aminoácidos 0.1 M Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% Agua destilada Ácido Nítrico

1

2

3

4

1.0 1.0

1.0 1.0

1.0 1.0

1.0 1.0

Agite suavemente y lleve a baño maría por 10 minutos. Retire y enfríe. Adicione 1.0 ml de NaOH. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según corresponda. REACCIÓN Caseína Ovoalbúmina Agua destilada RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos de la reacción y explique los resultados.

EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE MILLON FUNDAMENTO Esta prueba para ser positiva requiere la presencia de un radical hidroxibenceno, y por lo tanto, es específica para tirosina y sus derivados ya sea que estén libres o en una proteína o en sus productos de hidrólisis. Esta reacción también se emplea en la cuantificación de 66

Manual de Prácticas de Bioquímica tirosina. El reactivo de Millon es una solución de nitratos mercuriosos y mercúricos, conteniendo ácido nítrico. Las proteínas del tipo de las albúminas de huevo, que precipitan por ácidos minerales fuertes, producen un precipitado blanco que se va volviendo rojo a medida que se calienta. Otras proteínas como las proteosas y peptonas solo producen una coloración roja en las mismas condiciones, debido a que las soluciones contienen sales inorgánicas (Cl ) en gran cantidad, precipitando el reactivo de Millon, este método no se emplea para determinar proteínas en la orina MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Solución de aminoácidos 0.1 M (tirosina) Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%) Reactivo de Millon METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N° Aminoácidos 0.1 M Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% Agua destilada Reactivo de Millon

1

2

3

4

1.0 1.0

1.0 1.0

1.0 1.0

1.0 1.0

Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 5 minutos. Retire y enfríe. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según corresponda. REACCIÓN Caseína Ovoalbúmina Agua destilada RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos de la reacción y explique los resultados.

EXPERIMENTO N° 4. REACCION CON ACETATO DE PLOMO FUNDAMENTO Cuando un compuesto orgánico que contiene azufre, es tratado con una solución fuerte de NaOH, este se hidroliza según:

Este sulfuro inorgánico es altamente ionizable y como resultado de esto se puede obtener algún test de precipitación para el ion sulfuro. Uno de los más comunes es la 67

Manual de Prácticas de Bioquímica precipitación por el plomo. En efecto, la adición de acetato de plomo causa la formación de sulfuro de plomo (negro o pardo). El azufre de la cisteína reacciona fácilmente con el acetato de plomo en cambio el azufre de la metionina a causa de su gran estabilidad no ennegrese con el plomo. La mayor parte de las proteínas contienen azufre formando parte de la metionina. Son excepciones las queratinas, insulina y ciertas seroalbúminas que contienen azufre en forma de cistina o cisteína. La fibroína de la seda y algunas protaminas no contienen azufre. La ergotioneina también contiene azufre y puede dar esta reacción. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Solución de aminoácidos 0.1 M (cisteína, cistina y metionina) Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%) NaOH 40% Acetato de Plomo 0.5 M METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N° Aminoácidos 0.1 M Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% Agua destilada NaOH 40% Acetato de plomo 0.5 M

1

2

3

4

2.0 1.0 0.5

2.0 1.0 0.5

2.0 1.0 0.5

2.0 1.0 0.5

Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 3 minutos. Retire y enfríe. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según corresponda. REACCIÓN Caseína Ovoalbúmina Agua destilada RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos de la reacción y explique los resultados.

EXPERIMENTO N° 5. REACCION McCARTHY-SULLIVAN FUNDAMENTO Sirven para identificar la presencia de metionina. Para tal efecto se utiliza nitroprusiato de sodio (Na2NOFe(CN)5) desarrollándose una coloración roja en presencia de dicho aminoácido. MATERIAL Tubos de ensayo 68

Manual de Prácticas de Bioquímica Pipetas Gradillas Baño maría Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina) Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%) NaOH 6 N Nitroprusiato de sodio (20 g/L. Prepárese fresco). HCl 2 M METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N° Aminoácidos 0.1 M Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% Agua destilada NaOH 6 N Nitroprusiato de sodio

1 1.0 1.0 0.5

2 1.0 1.0 0.5

3 1.0 1.0 0.5

4 1.0 1.0 0.5

Lleve los tubos a baño maría a temperatura no mayor de 40°C durante 10 minutos. Luego enfríe y por las paredes del tubo deslice 1.0 ml de HCl. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según corresponda. REACCIÓN Caseína Ovoalbúmina Agua destilada Luego agite los tubos y observe otra vez RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos de la reacción y explique los resultados.

EXPERIMENTO N° 6. REACCION DE HOPKINS-COLE FUNDAMENTO Esta prueba es positiva para aminoácidos que poseen un anillo indol como el triptofano. El grupo indol del triptofano reacciona con el ácido glioxílico (CHO-COOH) del reactivo en presencia del ácido sulfúrico dando un color púrpura o violeta en la interfase de los dos líquidos. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Baño maría Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, triptofano) Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%) Acido sulfúrico concentrado Reactivo de Hopkins-Cole 69

Manual de Prácticas de Bioquímica METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N° Aminoácidos 0.1 M Caseína 1% Ovoalbúmina 0.1% Agua destilada Reactivo Hopkins-Cole

1

2

3

4

1.0 0.5

1.0 0.5

1.0 0.5

1.0 0.5

Color observado

Después de añadir el reactivo de Hopkins-Cole agite y agregue a cada tubo, deslizando por las paredes, 1.0 ml de ácido sulfúrico concentrado, luego lleve al baño de agua hirviente por 3 minutos. Retire y enfríe. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según corresponda. REACCIÓN Caseína Ovoalbúmina Agua destilada RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos de la reacción y explique los resultados.

CUESTIONARIO 1. Calcular el punto isoeléctrico de los siguientes aminoácidos: a) glicina, b) ácido glutámico y c) lisina. Desarrolle las reacciones de disociación 2.

Cuáles son las movilidades electroforéticas relativas a pH 5.68 de alanina, arginina, ácido glutámico, serina y triptófano.

3.

Una solución que contiene ácido aspártico (pI=2.98), glicina (pI=5.97), leucina (pI=5.98) y lisina (pI=9.74) en tampón citrato pH=3 es aplicada a una columna cambiadora de cationes equilibrada con el mismo tampón. En qué orden eluirán los aminoácidos de la columna?

4.

Un determinado péptido fue tratado con el reactivo de Sanger y al realizar la hidrólisis se observó que el 1-fluoro, 2,4-dinitrobenceno (DNFB) no reaccionó con ningún aminoácido, Cómo explica?

5.

Al hidrolizar el péptido X, se obtuvo la siguiente composición: Lis, His. Asp, Glu (2), Ala, Pro, Val, Tir. Al tratar el péptido con DNFB dio Asp-DNF y al ser tratado con Carboxipeptidasa A, liberó valina. La digestión del péptido con Tripsina produjo dos péptidos: 1) Lis, Asp, Glu, Ala, Tir y 2) His, Glu, Pro, Val. Éste último dio His-DNF al ser tratado con DNFB. Cuando se trató con Quimotripsina se obtuvo otros dos péptidos: 1) Asp, Ala, Tir y 2) Lis, Pro, His, Glu (2), Val. Con una tercera enzima se aisló el dipéptido His, Glu. Con los datos proporcionados, deduzca la estructura primaria del péptido X e indique a que polo migrarán los péptidos obtenidos con la digestión con Tripsina si el pH de la corrida es 6.2.

6.

Calcular las concentraciones de las especies iónicas de una solución de histidina 0, 25 M a pH 2. (pK1= 1.82, pK2= 6, pK3= 9.17)

70

Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 7 CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras formadas por una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y combinaciones que se pueden obtener a partir de los 20 aminoácidos es enorme y por esto el número posible de proteínas es realmente muy grande. Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones. Actúan como transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan también como enzimas, hormonas, anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades estructurales, fuentes de energía, etc. Muchas proteínas son lábiles y fácilmente modificables por una serie de agentes: variaciones del pH, radiaciones ultravioleta, calentamiento en solución acuosa, solventes orgánicos, etc., que determinan cambios dentro de su molécula (alteraciones de la disposición de las cadenas peptídicas) y modificaciones en sus propiedades, constituyendo la llamada “desnaturalización”. Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación de proteínas para su caracterización y cuantificación posterior. I. PRECIPITACION DE PROTEINAS Las proteínas son coloides liofílico (en particular, hidrofílicos); se hallan estabilizadas por ambas cargas y por interacciones proteína-solvente. Cuando una de estas influencias estabilizadoras es removida, la proteína precipita algunas veces; cuando ambas de estas influencias son eliminadas, la proteína siempre precipita. 1.1. Precipitación en el Punto Isoeléctrico. Las proteínas, como los aminoácidos, son menos solubles en su punto isoeléctrico. Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas ajustando el pH de la solución al punto isoeléctrico de la proteína. 1.2. Precipitación por Sales. La adición de una sal neutra causa la precipitación de las proteínas. Las diferentes proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. El efecto de la sal es eliminar el agua de solvatación, lo cual disminuye la interacción proteína-agua y aumenta la interacción proteína-proteína, causando así la precipitación. La sal comúnmente usada para este tratamiento es el sulfato de amonio, pues es extremadamente soluble. 1.3. Precipitación por Solventes Orgánicos. La adición de ciertos solventes orgánicos, como etanol y acetona, precipitan las proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan agua, así disminuyen la interacción proteína-agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo a 0°C, de otro modo puede ocurrir desnaturalización. 1.4. Precipitación por Aniones Complejos. Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico, pícrico, tánico, tungstico, fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación probablemente se debe a la neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre. Este tipo de precipitación causa muchas veces desnaturalización debido al pH extremo al que se le lleva a la proteína. 1.5. Precipitación por Metales Pesados. Los cationes de metales pesados como mercurio, plomo, cobre, plata, oro, platino, etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El catón libre disminuye la carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos 71

Manual de Prácticas de Bioquímica iones algunas veces desnaturalizan las proteínas porque reaccionan con los grupos SH para formar sulfuros.

II. DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier fuerza que altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del enlace peptídico causa desnaturalización. Las proteínas desnaturalizadas tienen propiedades diferentes a las proteínas nativas y ellas ya no poseen actividad fisiológica. Además, la desnaturalización disminuye la solubilidad de las proteínas en agua, porque el arreglo de los grupos hidrofílicos, orientados hacia la superficie, está destruido. Son comunes agentes desnaturalizantes, el calor, pH extremo, oxidación y reducción los cuales afectan el enlace disulfuro, agitación, radiación y urea. Las proteínas presentan diferentes susceptibilidades para cada agente desnaturalizante. La desnaturalización puede ser un proceso reversible. Algunas veces, cuando se remueve el agente, como en el caso de la urea, a proteína nativa es restaurada.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N° 1. DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO Y SOLUBILIDAD DE LA CASEINA. FUNDAMENTO El punto isoeléctrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la proteína es eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son muy insolubles y precipitan, pero otras permanecen en solución (ovoalbúmina, gelatina). En este punto la carga neta de todos los grupos disociables, como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc., es igual a cero. La superficie de la proteína siempre posee una carga eléctrica que depende del pH, de los electrolitos presentes y del solvente, en particular del agua, y de los puentes hidrógenos; pero existe un conjunto de condiciones, basado en las relaciones de todos estos factores, para el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas. En este momento el número de moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva o negativa es mínimo o nulo. Como las cargas del mismo signo se rechazan, en estas condiciones algunas moléculas pueden formar agregados en lugar de rechazarse. Pero a ambos lados del punto isoeléctrico, todas las moléculas tienen una carga neta positiva o negativa; estas moléculas se rechazan, y es mínima la tendencia a la agregación y precipitación. Por tanto, en general, el pH coincide con la solubilidad mínima de las proteínas. Los solventes orgánicos como el etanol, también causan precipitación de proteínas de un proceso que puede ser atribuido generalmente a la acción deshidratante. Cada proteína tiene un determinado punto isoeléctrico (Tabla 1) que puede ser determinado aprovechando algunas propiedades de las proteínas que están comprometidas, utilizando por lo general efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas. Algunas proteínas, como la caseína de la leche son fácilmente precipitables, ajustando el pH de la solución a su pI, por lo cual este procedimiento se describe como “precipitación isoeléctrica”.

72

Manual de Prácticas de Bioquímica Tabla 1. Punto Isoeléctrico de algunas proteínas PROTEÍNA Ovoalbúmina Tiroglobulina Caseína Gelatina Seroalbúmina (humana) Fibrinógeno Seroglobulinas Homoglobulina (caballo) Mioglobina (caballo)

pI 4.6 4.6 4.7 4.7 4.8 5.5 6.4 – 7.2 6.9 7.0

MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N Acido acético 1 N Acido acético 0.1 N Acido acético 0.01 N NaOH al 10% METODO DE TRABAJO Preparar el siguiente sistema de tubos: Tubo Nº Agua destilada

1 8.38

2 7.15

3 8.75

4 8.5

5 8.0

6 7.0

7 5.0

8 1.0

9 7.4

Ac. Acético 0.01 N

0.62

1.75

-

-

-

-

-

-

-

Ac. Acético 0.1 N

-

-

0.25

0.5

1.0

2.0

4.0

8.0

-

Ac. Acético 1.0 N Caseína 1%

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.6 1.0

DATOS EXPERIMENTALES Agitar los tubos antes y después de agregar la solución de caseína. Haga el cálculo del pH teórico para cada uno de los tubos. Anote los resultados, marcando la falta de turbidez con 0, los grados de la misma con signos + (emplee hasta ++++ con la máxima turbidez), según corresponda para cada tubo. Determinar con la mayor precisión el tubo que presenta el máximo de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene un pH próximo al punto isoeléctrico y al de solubilidad mínima de la caseína. Observar a los 10 minutos y 20 minutos, anote los cambios. Seguidamente calentar los tubos en baño maría a 37 °C y anote sus apreciaciones. Agregar NaOH al 10% gota a gota y observe los cambios. Tubo Nº

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH teórico Turbidez inmediata Turbidez a los 10 min Turbidez a los 20 min Turbidez y precipitado después de calentar NaOH 0.1 N 73

Manual de Prácticas de Bioquímica RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos y explique los resultados.

EXPERIMENTO N° 2. DESNATURALIZACION DE PROTEINAS FUNDAMENTO Una proteína está en su estado nativo cuando existe en su forma natural dentro de las células. El aislamiento de proteínas tiene por objeto no alterar este estado nativo y si este se altera se dice que la proteína se ha desnaturalizado. La desnaturalización proteica se debe a la ruptura de los enlaces secundarios, como puentes de hidrógeno y enlaces de tipo iónico, lo que hace que la estructura globular de la proteína se altere desenrollándose la molécula, ocurriendo la precipitación. En el estado desnaturalizado, las proteínas se vuelven menos solubles. Esta solubilidad puede ser restablecida por acción de álcalis o bases. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Solución de albúmina da huevo al 1% Acido acético Acido clorhídrico Nitrato de plata Nitrato de potasio METODO DE TRABAJO a) Desnaturalización de las proteínas por acción del pH: En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo 1 agregue 10 gotas de HCl concentrado, al tubo 2 agregue 10 gotas de ácido acético glacial y al tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Tubo 1 Albúmina + HCl

Observación

Prueba de Biuret

2 Albúmina + CH3COOH 3 Albúmina + Agua destilada b) Desnaturalización de las proteínas por acción de los metales pesados: En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo 1 agregue 10 gotas de nitrato de plata, al tubo 2 agregue 10 gotas de nitrato de potasio y al tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Tubo 1 Albúmina + Nitrato de plata

Observación

Prueba de Biuret

2 Albúmina + Nitrato de potasio 3 Albúmina + Agua destilada 74

Manual de Prácticas de Bioquímica c) Desnaturalización de las proteínas por acción de la temperatura: En un tubo de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina. Lleve el tubo al calor (llama de mechero). Luego realice la prueba de Biuret. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Tubo 1 Albúmina + Calor

Observación

Prueba de Biuret

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos, analice los resultados anote sus conclusiones

EXPERIMENTO N° 3. PRECIPITACION POR SALES DE METALES PESADOS Y IONES NEGATIVOS. FUNDAMENTO Las proteínas pueden ser precipitadas de una solución con varios iones positivos o negativos. Los iones positivos comúnmente usados son aquellos de metales pesados, tales como el zinc, cadmio, mercurio, fierro, cobre y plomo. Estos iones precipitan las proteínas de soluciones alcalinas, porque a este pH la proteína está disociada como proteína (anión), la cual se combina con los iones metálicos positivos para dar un precipitado insoluble de proteinato de metal. Estos iones metálicos pueden ser removidos del proteinato de metal por acidificación, lo cual convierte a la proteína negativa en proteína positiva. Los iones negativos (aniones) más usados son el tungstato, fosfotungstato, tricloroacetato, picrato, tanato, ferrocianato y sulfosalicilato. Estos precipitan proteínas de soluciones ácidas, es decir, cuando la proteína está carada positivamente (catión), formando sales de proteínas. Muchas de estas sales son insolubles y son la base de los métodos de desproteinización. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Solución de caseína al 1% Solución de ovoalbúmina al 1% Cloruro de mercurio al 5% Acetato de plomo al 10% Ácido acético al 5% Ferrocianuro de potasio al 10% Ac. Tricloroacético al 10% METODO DE TRABAJO Preparar el siguiente sistema de tubos: TUBO N° Caseina 0.5% Ovoalmúmina 1% Cloruro de mercurio 5% Acetato de plomo 10%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2.0 0.5 -

2.0 0.5

2.0 -

2.0 -

2.0 -

2.0 0.5 -

2.0 0.5

2.0 -

2.0 -

2.0 75

Manual de Prácticas de Bioquímica Ac. Acético 5% Ferrocianuro de potasio 10% Ac. Tricloroacético 10%

-

-

0.5 -

0.5 -

0.5

-

-

0.5 -

0.5 -

0.5

DATOS EXPERIMENTALES Anote los resultados en la tabla. Luego a los tubo 3, 4, 7 y 9 agregue NaOH 10% gota a gota y observe los resultados. Caseina

Ovoalmúmina

NaOH

Cloruro de mercurio Acetato de plomo Ferrocianuro de potasio Ac. Acético Ac. Tricloroacético RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente fotos, analice los resultados anote sus conclusiones.

EXPERIMENTO N° 4. ESTIMACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE PROTEINAS. DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BIURET FUNDAMENTO Este método colorimétrico es una prueba confiable para determinar la concentración de proteínas, pero requiere cantidades relativamente grandes de proteínas. El reactivo de Biuret es sulfato de cobre diluido en una solución alcalina. Los compuestos que tienen dos o más enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos para dar un complejo que tiene un característico color púrpura o violáceo. No está demás recalcar, que la proteínas dan un color violeta intenso, las proteosas y peptonas (que son productos de la hidrólisis de las proteínas solubles en agua y no coagulables por el calor) dan color rosado intenso y los péptidos dan un color rosado claro. La gelatina da un color azul, y; de los aminoácidos, la histidina es el único que da positiva la reacción de biuret. MATERIALES Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Espectrofotómetro Estándar de proteínas (Albúmina de suero Bovino) 10 mg/ml en NaOH 1 N NaOH 1 N Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de Tartrato de sodio y potasio en 500 ml de agua destilada. Añadir agitando constantemente 300 ml de NaOH al 10%. Completar a 1000 ml con agua destilada PROCEDIMENTO a) Determinación cualitativa de proteínas. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 2 ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Si la prueba es positiva se desarrollará un color violeta. b) Curva Estándar para proteínas. A una cantidad de proteína en un rango comprendido entre 2 a 10 mg se le adiciona NaOH para obtener un volumen final de 1.0 ml. Luego se le agrega 4.0 ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Transcurrido este tiempo se lee en el fotocolorímetro frente a un blanco apropiado (1.0 ml de NaOH más 4.0 ml de Biuret). Anote sus resultados. Determinar el factor de calibración. 76

Manual de Prácticas de Bioquímica DATOS EXPERIMENTALES Tubo N Bl 1 2 3 4 5

[Proteína] mg/ml 2 4 6 8 10

Ab

Fc

Para obtener la curva de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores de absorbancia en las ordenadas y la concentración de proteína en las abscisas. c) Determinación cuantitativa de proteínas. Se toma 1.0 ml de suero diluido 10 veces (1:10). Se añade 4.0 ml del reactivo de Biuret, se agita y se deja en reposo durante 30 minutos a 37 °C. Transcurrido este tiempo se lee en espectrofotómetro a 540 nm frente a un blanco apropiado. Determinar la cantidad de proteína en mg/ml teniendo en cuenta el factor de calibración determinado anteriormente. *En los cálculos no se olvide de la dilución realizada*

CUESTIONARIO 1. Al titular 2.0 ml de una solución de proteína al 7% entre pH 11.5 y 13.5, se gastaron 1.8 ml de NaOH 0.001N. Estimar el número de residuos de arginina que tiene dicha proteína, sabiendo que su peso molecular es de 93.330. 2.

Qué pH eligiría para separar mediante electroforesis una mezcla de las siguientes proteínas: Mezcla A: Ureasa (pI = 5.0) y Seroalbúmina (pI = 4.9) Mezcla B: Mioglobina (pI = 7.0) y Citocromo C (pI = 10.6)

3. La insulina es sintetizada en las células ß del páncreas a partir de la proinsulina, que es un polipéptido de una sola cadena. Señale los métodos que Ud. utilizaría para realizar la separación de ambas proteínas, teniendo en cuenta los siguientes datos fisico-químicos. Indique los resultados que esperaría encontrar al usar cada uno de los métodos que propone. Proinsulina: PM = 6000, pI = 5.3; Insulina: PM = 9000, pI = 6.4. 4. Una muestra de suero sanguíneo tiene 6.7 g de proteínas totales. Mediante la electroforesis en papel se analizan sus fracciones proteicas y se encuentran los siguientes porcentajes: Albúmina 55%, -1-Globulina 6%, -2-Globulina 9%, -Globulina 11% y -Globulina 19%. Encontrar el contenido de cada fracción proteica en g%. Determine si existe alteración en la concentración de cada una de estas proteínas.

77

Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 8 EXTRACCION E IDENTIFICACION DE DNA La Biología Molecular contemporánea se centra en: 1) como la información está ordenada en el cromosoma, 2) como se procesa la información, 3) como se reproducen a sí mismas la información cada vez que la célula se divide, y 4) como puede modificarse la información para generar nuevas instrucciones. La regulación y el control de cada una de estas transacciones de información constituyen otro aspecto de la biología molecular, disciplina que nos permite conocer la vida al facilitarnos la comprensión de las funciones que desempeñan las macromoléculas. Hoy se sabe que una sola molécula, el DNA, puede explicar en su totalidad los fenómenos de codificación, procesamiento, replicación y modificación de la información. El DNA por lo tanto es el responsable de la transmisión de la información de una generación a otra para conservar la continuidad genética entre progenitores y descendientes Uno de los procedimientos básicos en la biología molecular es la extracción y purificación de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer paso a posteriores análisis. Son varios los métodos utilizados para la extracción de DNA, todos ellos por lo general tienen el mismo principio, es decir, empiezan con una lisis celular, seguido por una remoción de proteínas y por último la obtención del DNA de alta pureza por precipitación etanólica. Entre las técnicas más comunes de extracción de DNA, se considera: - Hervir la muestra en agua destilada - Acción de detergentes - Acción de NaOH - Acción de enzimas proteolíticas - Uso de solventes orgánicos - Sonicación - Congelamiento y descongelamiento Después de la extracción y purificación del DNA, el paso siguiente es la cuantificación del DNA. Esta cuantificación es importante para posteriores análisis como PCR, secuenciación hibridación, etc. Tres son los métodos más utilizados para la cuantificación, los cuales se diferencian en la precisión, así como en la cantidad de muestra requerida. Dichos métodos son: - Espectrofotometría - Fluorometría - Fluorescencia en Bromuro de Etidio Otros métodos sólo nos determinan la presencia de bases nitrogenadas (espectrofotometría), la identificación de desoxirribosas y la identificación de grupos fosfato.

EXPERIMENTO N°1. EXTRACCION DE DNA A PARTIR DE BULBO DE CEBOLLA OBJETIVO Purificar DNA de células vegetales FUNDAMENTO Una característica importante del DNA es el hecho de que sus dos cadenas pueden ser 78

Manual de Prácticas de Bioquímica separadas cuando se rompen los puentes de hidrógeno que unen sus bases. Esto se puede conseguir, por ejemplo, por medio del calentamiento de una solución de DNA a altas temperaturas. El punto medio de una serie de temperaturas en las cuales las cadenas de un DNA se separan se conoce como temperatura de fusión o Tm (melting temperature). Esta separación puede ser monitoreada por el aumento de densidad óptica de la solución de DNA o por la pérdida de la viscosidad. Cada molécula de DNA tiene una temperatura de fusión característica que depende principalmente de la proporción de pares G-C. Debido a que cada par G-C presenta tres puentes de hidrógeno, es más estable que el par A-T que forma dos puentes de hidrógeno. Cuanto más pares G-C estén presentes en el DNA mayor será la energía necesaria para separar las dos hebras. El valor de Tm aumenta cerca de 0.4ºC cada vez que la cantidad de pares G-C aumenta en 1%. Una solución de DNA en condiciones fisiológicas, por lo general, presenta un valor de Tm de 85-95ºC. Un DNA con 40% de pares G-C (típico del genoma de mamíferos) presenta una Tm de 87ºC, mientras que un DNA con 60% de G-C tiene un Tm de 95ºC, ambos en condiciones fisiológicas. El enfriamiento de la solución que contiene el DNA desnaturalizado, permite que se vuelvan a formar los puentes de hidrógeno y que el DNA readquiera las propiedades que pueden ser medidas tanto por la disminución de la densidad óptica como por el aumento de la viscosidad. El hecho de que el DNA se desnaturaliza y se re naturaliza por la variación de la temperatura permitió el establecimiento de la técnica de PCR (polymerase chain reaction). REACTIVOS Solución de lisis Alcohol etílico al 95% Reactivo de difenilamina PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS 1. Solución de lisis: mezclar 0.1% de dodesilsulfato de sodio (detergente SDS) en 25 mmol/L de EDTA pH 8.0 2. Reactivo de difenilamina: Disolver 1 g de difenilamina en 100 ml de ácido acético glacial y adicionar 2.75 ml de ácido sulfúrico concentrado. PROCEDIMIENTO 1. Descascarar un cebolla de tamaño medio 2. Rallar la cebolla con un rallador común. Es importante que no haya grandes pedazos de cebolla. 3. Pesar unos 50 g de cebolla rallada y adicionar 100 ml de la solución de lisis. 4. Dejar la mezcla a temperatura ambiente por 10 a 20 minutos. 5. Filtrar la suspensión a través de un embudo que contiene algodón, y recoger el filtrado en una probeta. Anotar el volumen. 6. En un tubo de ensayo colocar 4 ml del filtrado. Adicionar 2 volúmenes de etanol al 95%, procurando no mezclar las dos soluciones. Observar en la interface, la formación de un precipitado blanquecino. Con la ayuda de una varilla de vidrio enrollar el material blanquecino. 7. Transferir el material de la varilla de vidrio a otro tubo de ensayo y disolverlo en 0.5 ml de agua. A esta solución, adicionar 1.5 ml de reactivo de difenilamina. 8. En otro tubo de ensayo adicionar 0.5 ml de agua y 1.5 ml de reactivo de difenilamina. Colocar los dos tubos en baño maría hirviente por 10 minutos. Comparar los resultados obtenidos. 9. El filtrado restante (ítem 5) debe ser transferido a un beaker y a esta solución se le añade 2 volúmenes de etanol al 95%. El material blanquecino formado en la interface de las dos soluciones debe ser enrollado en una varilla de vidrio y transferido a otro tubo deensayo. 10. Disolver el precipitado en 5 ml de agua con el auxilio de la varilla de vidrio. Dividir esta solución en dos tubos para observar cambios de viscosidad n diferentes condiciones. 11. Pipetear la solución de uno de los tubos con una pipeta graduada de 0.2 ml y cronometrar el tiempo de desplazamiento de la solución a partir de la marca 0 ml hasta la marca 0.15 ml. 79

Manual de Prácticas de Bioquímica 12. El otro tubo debe ser mantenido en baño maría hirviente por 10 minutos. Después del periodo de calentamiento, proceder como en el ítem 11, anotando el tiempo de desplazamiento. 13. Enfriar la solución en hielo por 15 minutos y repetir el procedimiento 11. 14. Interpretar los resultados. 15. Esquematice lo realizado.

EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACION DE BASES NITROGENADAS a) Método 1: Tomar 2 ml del extracto de DNA y leer su absorbancia en el espectrofotómetro a 260 nm. Si está muy concentrado diluir en etanol. b) Método 2: Agregue gotas de Hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un medio básico y algunas gotas de Nitrato de Plata 0.1 M a una pequeña cantidad del precipitado obtenido que ha sido colocado en un tubo de ensayo. Observe y anote sus resultados EXPERIMENTO N° 3. IDENTIFICACION DE AZUCARES MATERIAL Solución ácida de difenilanima Ribosa 1% Reactivo de bial Tubos de ensayo Pipetas Baño maría Hielo a) IDENTIFICACION DE DESOXIRRIBOSA Utilizando el reactivo de Dische, se toma en un tubo de prueba 2 ml del extracto de DNA, añadir 4 ml de la solución ácida de difenilamina, mezclar bien y colocarlos por 10 mim en baño de agua hirviente. Retirar y enfriar en hielo y observar la reacción. Anote sus resultados. b) IDENTIFICACIÓN DE LA RIBOSA Tome 4 tubos de ensayo y agregue lo siguiente en cada uno: Tubo 1

Sustrato 1 ml Agua destilada

Reactivo de Bial 1 ml

HCL concentrado 2.5 ml

2

1 ml de ribosa 1%

1 ml

2.5 ml

3

1 ml de ribosa 0.5%

1 ml

2.5 ml

4

1 ml del precipitado

1 ml

2.5 ml

Lleve al calor por 5 minutos o hasta que observe un cambio de color. El reactivo de Bial está compuesto por iones férricos, etanol y orcinol. Consiste en la formación de un producto de color azul-verdoso entre el furfural y el orcinol en medio clorhídrico. Es específico de pentosas. Anote sus resultados. EXPERIMENTO N° 5. IDENTIFICACION DEL GRUPO FOSFATO MATERIAL Acido perclórico 7.5 N Molibdato de amonio 2.5% Acido 1-amino-2,4-naftol sulfónico Hidróxido de amonio 80

Manual de Prácticas de Bioquímica Acido nítrico Molibdato de amonio Tubos de ensayo Pipetas Embudo Perlas de vidrio Baño maría Hielo PROCEDIMIENTO a) Método 1: Se procede colocando en un tubo de ensayo 0.5 ml del extracto de DNA y 0.5 ml de ácido perclórico 7.5 N. Colocar en el tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio. Colocar en baño maría hirviente por 30 min. Dejar enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente forma: colocar en un tubo de ensayo 0.5 ml del contenido del tubo anterior, añadir 3.5 ml de agua destilada, luego 0.5 ml del reactivo de molibdato de amonio al 2.5% y finalmente 0.5 ml del reactivo reductor (Acido 1-amino-2,4-naftol sulfónico). Dejar reposar por 5 min. El color azul nos indica la presencia de fosfato inorgánico. Anote sus resultados. b) Método 2: Agregue un poco del precipitado en un tubo de ensayo y añada Hidróxido de Amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un medio básico, acidifique con algunas gotas de HNO3 y agregue Molibdato de Amonio (1mL). Observe y anote sus resultados. CUESTIONARIO 1. Cuál es los componentes de la solución de lisis y para que se usan cada uno de ellos? 2. A qué se debe la diferencia de viscosidad del DNA observada en los experimentos? 3. Si las temperaturas altas desnaturalizan al DNA, porqué en la extracción de DNA a partir de tejidos vegetales se requiere de temperatura de 65 °C? 4. Para la extracción de DNA se puede utilizar proteinasas?. Si su respuesta es afirmativa, explique a que componente podría reemplazar o en que paso sería apropiada utilizarla durante la extracción de DNA. 5. ¿Qué condiciones físicas conducen a la desnaturalización del DNA?. ¿Por qué se observa un incremento en la absorción de luz UV (efecto hipercrómico) al desnaturalizarse el DNA?

81

Manual de Prácticas de Bioquímica PRÁCTICA N°9 EFECTO DE CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO: DETERMINACIÓN DE Km y Vmax DE LA FOSFATASA ÁCIDA DE QUINUA Las enzimas son moléculas proteicas especializadas, que aceleran las reacciones químicas llevándolas más rápidamente a su posición de equilibrio. Las fosfatasas ácidas denominadas también Monoéster Ortofosfórico Fosfohidrolasa, actúan en un rango de pH entre 5.0 y 6.5, hidrolizan sustratos que tienen un enlace fosfoéster, liberando como productos de la reacción fosfato inorgánico y un alcohol, el cual varia dependiendo del sustrato utilizado. Estas enzimas no necesitan de metal alguno para evidenciar su actividad. Son varios los factores que afectan la actividad enzimática, haremos mención de alguno de ellos: 1. EFECTO DEL TIEMPO. La cantidad de producto formado en una reacción enzimática es proporcional al tiempo de incubación. La reacción es lineal en el tiempo hasta un período determinado en que se puede expresar la actividad enzimática en términos de velocidad, o sea la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Generalmente la velocidad se expresa en micromoles de producto formado por minuto. 2. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA. Cuando el sustrato se encuentra en exceso, a concentraciones saturantes, la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de la enzima. 3. EFECTO DEL pH. La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el cual su actividad es máxima, a ese pH se le denomina pH óptimo, y se define como el pH en el cual la enzima y el sustrato presentan una conformación estructural adecuada para la actividad catalítica. Por encima y por debajo de este pH la actividad declina, adoptando una forma característica de campana. 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA. La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas generalmente se incrementa con la temperatura dentro del margen de estabilidad y plena actividad de la enzima. Cuando la temperatura alcanza un cierto valor, variable, según la enzima que se trate, esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de la reacción empieza a disminuir. La temperatura a la que se alcanza ese valor máximo se denomina temperatura óptima. 5. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO. Es el más importante, ya que determina la velocidad de la reacción. En la mayoría de los casos, cuando se representa la velocidad en función de la concentración de sustrato, manteniéndose constante la concentración de enzima, se obtienen curvar hiperbólicas en las cuales puede observarse que para valores muy pequeños de concentración de sustrato [S], la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración del propio sustrato.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N°1. EFECTO DE CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas 82

Manual de Prácticas de Bioquímica Espectrofotómetro Baño maría a 37 °C Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 5 -2 -3 Sustrato: p-Nitrofenilfosfato 1 x 10 M y 1 x 10 M Enzima: Fosfatasa ácida NaOH 1 N PROCEDIMIENTO: Prepare un sistema de tubos por duplicado tal como se indica a continuación: -2

Conc. Inicial de p-NO2ϕ-P Conc. Final de p-NO2ɸ-P Buffer Acetato 0.1 M pH 5 (ml) p-NO2-P (ml) Agua Destilada (ml) Preincubar 2 min a 37 °C Enzima Incubar 3 min a 37 °C NaOH 1 N (ml)

-3

1 x 10 M 1x10

-3

B

5x10

1 x 10 M -4

B

2x10

-4

B

1x10

-4

B

5x10

-5

B

1.0 0.2 0.7

1.0 0.2 0.8

1.0 0.1 0.8

1.0 0.1 0.9

1.0 0.4 0.5

1.0 0.1 0.6

1.0 0.2 0.7

1.0 0.2 0.8

1.0 0.1 0.8

1.0 0.1 0.9

0.1

-

0.1

-

0.1

-

0.1

-

0.1

-

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

Leer en espectrofotómetro a 400 nm.

CÁLCULOS 4 -1 -1 Coeficiente de Extinción Molar del p-Nitrofenol: 1.8 x 10 M cm

DATOS EXPERIMENTALES Anotar las absorbancias para cada concentración de sustrato utilizada ABSORBANCIAS Blanco Tubo 1 Tubo 2

Abs Neta

Velocidad µMoles/min

1/ µMoles/min

[p-Nitrofenol] Moles -4 10x10 -4 5x10 -4 2x10 -4 1x10 -4 0.5x10

1/[p-Nitrofenol]

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA Presente figuras de velocidad frente a concentración de sustrato (Diagrama de MichaelisMenten), y 1/V frente al 1/[S] (Diagrama de Lineweaver-Burk). A partir de ésta última determina Km y Vmax. Analice los resultados anote sus conclusiones.

CUESTIONARIO 1. Describa el mecanismo de la reacción enzimática de la fosfatasa ácida 2. Se ha determinado la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente para diversas concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes: [S] (mol/L) 5 10 20

-

V [(mol/L) min ] 22 39 65 83

Manual de Prácticas de Bioquímica 50 102 100 120 200 135 Estime Vmax y Km utilizando las representaciones gráficas de Michaelis-Menten y LineweaverBurk 3. El efecto de la temperatura en la hidrólisis de la lactosa mediante una ß-galactosidasa se muestra a continuación. Calcular la energía de activación y también Q 10. T (°C) 20 30 35 40 45

Vmax (uM/min/mg de proteína) 4.50 8.65 11.80 15.96 21.36

4. Se estudia la cinética del estado estacionario de una enzima en ausencia y en presencia de un inhibidor (inhibidor A). La velocidad inicial viene dada en función de la concentración de sustrato en la siguiente tabla: -1

a) b) c) d) e)

[S] (mmol/L)

Sin inhibidor

1.25 1.67 2.5 5.00 10.00

1.72 2.04 2.63 3.33 4.17

-1

V[(mmol/L) min ] Inhibidor A Inhibidor B 3 mM 0.98 1.25 1.17 1.54 1.47 2.00 1.96 2.86 2.38 3.7

Inhibidor B 5 mM 1.01 1.26 1.72 2.56 3.49

Qué tipo de inhibición produce el inhibidor A? Determina Vmax y Km en presencia y ausencia del inhibidor A Qué tipo de inhibidor es el inhibidor B? Determine Vmax y Km para cada concentración del inhibidor B Estime Ki a partir de estos datos.

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Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 10 TRANSPORTE ELECTRONICO: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA Y DE LACTATO DESHIDROGENASA OBJETIVO 1. Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo intermediario y la acción de las enzimas de oxido-reducción, haciendo uso de un aceptor de electrones como el azul de metileno. 2. Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del cianuro a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.

ESTUDIO DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA INTRODUCCIÓN Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de oxido-reducción y transferencia de electrones a través de una serie de sistemas enzimáticos. En las oxido-reducciones se produce transferencia de electrones a partir de un dador hasta un aceptor. Algunas veces el transporte de electrones es realizado mediante la transferencia de átomos de hidrógeno o bien átomos de hidrógeno y un electrón. Las enzimas que realizan este tipo de reaccione son las deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD, NADH) o flavina (FAD) dependientes; además existen los citocromos que son de naturaleza ferroporfirínica y se encuentran ordenados de acuerdo a su potencial de oxido reducción constituyendo la llamada "Cadena de Transporte Mitocondrial". Algunos compuestos orgánicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en leucoderivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de oxido-reducción es +0.01 y el 2,6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de oxido-reducción es +0.22. La succinato deshidrogenasa (SHD) es una flavoproteína unida a hierro no hémico. El metal tiene como finalidad actuar como enlace para conservación de energía y desacoplar los dos equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por la flavina y, finalmente estabilizar la forma semiquinoide de la flavina. Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de oxidoreducción. Por ejemplo, el malonato actúa específicamente inhibiendo a la succinato deshidrogenasa por un mecanismo competitivo; por lo tanto la prueba experimental con azul de metileno será negativa, es decir no se decolora por no haber movilización de electrones. El cianuro, actúa impidiendo la reoxidación de los citocromos, pues se combina específicamente con el Fe++ de la citocromo oxidasa; por ello los citocromos permanecen reducidos e incapaces de seguir actuando y se bloquea la respiración. PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL Sucrosa 0.25 M Succinato de sodio 0.1 M Malonato de sodio 0.5 M Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M Azul de metileno 0.05% Aceite mineral Tubos de ensayo 85

Manual de Prácticas de Bioquímica Pipetas Morteros Centrífuga METODO DE TRABAJO A) Preparación del homogenizado. Colocar un mortero sobre hielo picado, luego pesar 10.0 g. de hígado, corazón o músculo de rata o de conejo; picarlo y colocarlo sobre el mortero. Añadir 90.0 ml de sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría, homogenizar y luego centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. Decantar el sobrenadante en un beaker y guardarlo e frío hasta su uso. Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N°

1

2

3

4

-

0.5

0.5

0.5

2.0

2.0

2.0

2.0

Malonato de sodio

-

-

0.5

-

Cianuro de potasio 0.1 M

-

-

-

0.5

Agua destilada

1.5

1.0

0.5

0.5

Azul de metileno 0.05%

0.5

0.5

0.5

0.5

Extracto enzimático

0.5

0.5

0.5

0.5

Aceite mineral

1.0

1.0

1.0

1.0

Succinato de sodio 0.1 Buffer fosfato pH 7.4

El contenido de cada uno de los tubos se mezcla rápidamente antes de agregar el aceite mineral, el cual tiene la función de crear un medio libre de oxígeno. Llevar a baño maría a 37°C observar el decoloramiento de cada tubo cada 5 min. Discuta los resultados.

CUESTIONARIO 1. Haga un esquema de la oxidación del succinato por acción de la succinato deshidrogenasa, además acople la cadena respiratoria para indicar el destino final del hidrógeno y de los electrones del succinato. 2.

Cuál es el efecto de cada uno de los siguientes inhibidores sobre el transporte electrónico y la formación de ATP en la cadena respiratoria. a) Azida b) Atractilósido c) Rotenona d) Monóxido de carbono f) Antimicina A

3.

Que son los desacopladores ed la fosforilación oxidativa. Ponga por lo menos dos ejemplos.

4.

Asumiendo que las concentraciones mitocondriales de succinato y fumarato son respectivamente de 0.0002 M y 0.00003 M, estimar el potencial redox en estas condiciones. Considere que el proceso se estudia a pH 7.0 y a 25°C.

86

Manual de Prácticas de Bioquímica 5.

En el estudio de la reacción catalizada por la fosfoglucomutasa se encontró que en el equilibrio las concentraciones de glucosa-1-fosfato y glucosa-6-fosfato fueron 4.5 mM y 96.0 mM respectivamente. Calcular la constante de equilibrio y el G°' para esta reacción que se procesa a 25 °C.

6.

Cuando el citrato es descompuesto para dar acetato y oxalacetato, el G°' es de -680 cal/mol. Para la reacción catalizada por la citrato sinteasa la constante de equilibrio es de 0.000032. Estime con estos datos la constante de equilibrio para la reacción de hidrólisis del acetil CoA y el G°'.

7.

La reacción de hidrólisis de la lactato deshidrogenasa tiene un G°' de -3.8 Kcal/mol. Encontrar la constante de equilibrio para dicha reacción que se realiza en condiciones estándar.

87

Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 10 GLICOLISIS PRODUCCION DE ACIDO PURIVICO DURANTE LA FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR LA LEVADURA Y SU IDENTIFICACION INTRODUCCION La glucólisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a Etanol y CO2, y/ó a ácido láctico dependiendo del organismo que lo efectúe. Ambas rutas de fermentación son similares hasta la formación de piruvato, manteniendo idénticas las etapas de conservación de energía que conducen a la formación de ATP. La glucólisis no solo es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa que conduce a la producción de Acetil−Co−A y a su oxidación en el ciclo del ácido cítrico, sino que también proporciona una vía importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. La característica de la glucólisis de proporcionar ATP en ausencia de oxígeno es de significado crítico biomédico, porque permite al músculo esquelético hacer un trabajo sumamente eficiente aún cuando la oxidación aeróbica se vuelva insuficiente, a la vez que los tejidos con capacidad glucolítica pueden sobrevivir a episodios de anoxia. Inversamente, el músculo cardíaco, que está adaptado al trabajo aeróbico, tiene una capacidad glucolítica relativamente deficiente y supervivencia escasa bajo condiciones de isquemia. Hay un número pequeño de enfermedades en las que las enzimas del sistema glucolítico como por ejemplo la piruvatocinasa muestran actividad deficiente; estas anomalías se manifiestan principalmente como anemias hemolíticas. En las células cancerosas que proliferan con rapidez, la glucólisis procede a una velocidad mucho mayor que la requerida por el ciclo del ácido cítrico; por tanto, se produce más piruvato que el que puede ser metabolizado. El resultado es una producción excesiva del lactato, que favorece un entorno local relativamente ácido en el tumor, situación que puede tener implicaciones con ciertos tipos de terapéutica contra el cáncer. También se produce acidosis láctica por deficiencia de piruvato deshidrogenasa.

OBJETIVOS - Demostrar la formación de ácido pirúvico durante la fermentación de la glucosa por levadura. - Producir e identificar ácido pirúvico a partir de glucosa. - Observar el comportamiento reaccionante del sistema.

MATERIAL Tubos de ensayo Tubos de centrifuga Trípode, rejilla con asbesto, mechero Baño maría Pipetas Centrifuga Vasos de precipitados de 250 y 600 ml. Pinzas para tubos de ensayo. Solución de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0 y 2.0% Suspensión de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentación antes de su utilización). Acido tricloroacético al 10% Nitroprusiato de sodio. 88

Manual de Prácticas de Bioquímica 2,4 dinitrofenil−hidracina. Hidróxido de amonio concentrado. Hidróxido de sodio 0.1N Sulfato de amonio sólido. Nota: un día antes de la práctica llevar su levadura para fermentarla

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N° 1. FORMACIÓN DE PIRUVATO  Marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml de las soluciones de glucosa a las diferentes concentraciones (0.5, 1.0, 2.0%) a ambas series.  A una de las series de tubos adicionarles 3 ml de suspensión de levadura con fosfatos de sodio (0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml de la suspensión de levadura con fosfatos de potasio (0.09 g/100 ml) y marcarlos como B.  Colocar todos los tubos en baño maría a 37ºC por 30 minutos y añadir posteriormente a cada tubo 1 ml de TCA al 10%. Mezclar vigorosamente y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10 minutos. Separar el sobrenadante y desechar el precipitado.

EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACIÓN DE PIRUVATO 1. Reacción con nitroprusiato de sodio. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del sobrenadante obtenido y hervirlo. Adicionarle 0.5 g de sulfato de amonio sólido y agitar. Agregar dos gotas del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de hidróxido de amonio concentrado, hasta la formación de dos capas. La formación de un anillo verde o azul en la interfase indica que la reacción es positiva. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Esquematice e interprete sus resultados. 2. Reacción con 2,4 dinitrofenil−hidracina. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml del reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la mitad de la mezcla formada, y adicionar 1 ml de NaOH 0.1N. La aparición de un color rojo indica reacción positiva. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Observar la coloración e intensidad de la misma en cada caso. Esquematice e interprete sus resultados. CUESTIONARIO 1. Señale cinco características que usted considere más importa con respecto a la vía glicolítica 2.

De qué manera la glicólisis influye en el transporte de electrones?

3.

Cuántos enlaces fosfato de alta energía surgen en el catabolismo de la glucosa? Tanto aeróbica como anaeróbicamente.

4.

Calcular la constante e equilibrio para la fosforilación de la glucosa si el G°´ para la hidrólisis de glucosa-6-fosfato es de -3 Kcal/mol. Indicar si la formación de la glucosa-6fosfato a partir de la glucosa es un procesos exergónico o endergónico.

5.

Describa los principales centros de control de la vía glicolítica.

89

Manual de Prácticas de Bioquímica PRACTICA N° 12 FOTOSINTESIS Es el proceso químico más importante de la biología. Incluye todos los procesos por los que: a) la luz solar absorbida se utiliza para impulsar las biosíntesis; b) el CO 2 es reducido hasta glucosa por las plantas verdes y; c) el agua es oxidada para liberar oxígeno. Por esta razón, el fenómeno global de la fotosíntesis se representa por la siguiente ecuación: Energía solar 2H2O + CO2

Clorofila

(CH2O) + H2O + O2

G°'= +118000 cal/mol de CO2 reducido El agua es el donador de electrones que se emplea para reducir el CO2 y el fenómeno está acoplado al desprendimiento de oxígeno. Este proceso se realiza en los cloroplastos, los cuales contiene los pigmentos que absorben la luz y las enzimas necesarias. Los cloroplastos se asemejan a las mitocondrias por poseer capas apiladas de membranas internas en las que las transferencias de electrones se asocian con fosforilación; también tienen su propio DNA y los sistemas para la síntesis de proteínas. Los cloroplastos elaboran glucosa y la acumulan como almidón durante las horas de luz; las mitocondrias oxidan el piruvato desde residuos de glucosa, especialmente durante la noche, para proporcionar energía a la planta. CENTROS DE REACCION. Para una eficaz absorción de la luz solar, los cloroplastos contienen los carotenos y las clorofilas que tienen estructuras altamente resonantes. La energía de excitación pasa desde un pigmento a otro hasta que llega a un centro de reacción, donde los complejos de clorofila "a" se hallan asociados con otras proteínas necesarias para la utilización de la energía. La clorofila "a" en el centro de reacción pierde la energía de excitación y es oxidada por la transferencia de electrones hasta un aceptor. FOTOFOSFORILACION CICLICA. En los centros de reacción tipo I los electrones desplazados por fotooxidación son transferidos de nuevo desde sus receptores hasta la clorofila oxidada. La transferencia se da a través de varios transportadores a la vez que son utilizados para generar ATP. En este mecanismo, los electrones desplazados por la luz absorbida son devueltos continuamente a la clorofila original pero la recombinación ocurre por el aparato de fosforilación oxidativa. PRODUCCION DE OXIGENO. Los electrones necesarios para llevar la clorofila oxidada del PS I a su estado inicial, también pueden ser donados por el agua. Para que suceda esto, la luz es absorbida por el PS II, en el que la clorofila oxidada después de la eliminación de un electrón reaccionará con los iones hidroxilos del agua y liberará oxígeno. Los electrones también se transfieren desde el PS II al PS I a través de parte del aparato de fosforilación oxidativa, y en este caso se genera por lo menos un ATP por cada par de electrones transferidos. REDUCCION DE FERREDOXINA. El uso del agua como donador de electrones permite a los electrones ser liberados del sistema para otros fines, dejando atrás el oxígeno. El aceptor inmediato de los electrones liberados por el PS I es una sustancia reductora de ferredoxina, la cual es reducida por la SRF y es utilizada en las plantas verdes para reducir NADP hasta NADPH. REDUCCION DEL DIOXIDO DE CARBONO. La glucosa se elabora a partir de CO 2, utilizando el NADPH y el ATP producidos en los procesos fotoquímicos. El CO 2 es fijado por la 90

Manual de Prácticas de Bioquímica combinación con ribulosa-1,5-difosfato, esta se escinde para formar dos moléculas de 3fosfoglicerato, las cuales se reducen con NADPH. La pentosa transportadora de CO 2 se regenera por una reordenación de parte de las triosas fosfato obtenidas, y el remanente sirve para formar glcosa-6-fosfato que será utilizada como combustible. La secuencia completa constituye el Ciclo de Calvin, en el que el ATP se utiliza para regenerar ribulosa difosfato y para formar 1,3-difosfoglicerato el que se reducirá a triosa fosfato por el NADPH. El funcionamiento del Ciclo de Calvin depende de la isomerización y epimerización de las pentosas fosfato, a través de una reacción de transcetolasa en la que dos unidades de carbono son transferidas vía tiamina pirofosfato desde un donador cetosa hasta un donador aldosa. RUTA DE HATCH-SLACK. Los cloroplastos están construidos de tal forma que la velocidad del Ciclo de Calvin varía con la concentración de CO 2 atmosférico. Una planta que disminuye su pérdida de agua cerrando los estomas de las hojas, restringe también el suministro de CO 2, excepto algunas plantas evolucionadas que sobreviven en condiciones secas y calurosas, y utilizan el ATP para concentrar el CO2. La ruta de Hatch-Slack comprende la carboxilación de piruvato hasta oxalcetato a expensas de ATP en un anillo externo de las células mesófílicas, seguido de la reducción hasta malato por NADH. El malato se difunde en el interior de un anillo de células de la vaina, donde es descarboxilado oxidativamente por NADP para formar piruvato y una elevada concentración de CO2 para el ciclo de Calvin. ALTERACION DE LA ATMOSFERA. La fotosíntesis es responsable de la oxido-reducción, representada por la acumulación de compuestos de carbonos reducidos en los sedimentos a expensas de carbonatos, y de la acumulación de oxígeno en la atmósfera a expensas del agua. Las alteraciones en el equilibrio de CO 2 y O2 actualmente se autocompensan, siendo el sistema tan masivo que las alteraciones catastróficas debidas a la interferencia del hombre no son sino perturbaciones sencillas en la estequiometría del sistema.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N° 1. AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y FRAGMENTOS DE CLOROPLASTOS. FUNDAMENTO Los cloroplastos enteros y los cloroplastos desintegrados se preparan macerando hojas u otro material vegetal en agua o solución hipertónica, los desechos celulares groseros se remueven por filtración y los otros constituyentes protoplasmáticos por centrifugación diferencial los procedimientos que se describen se basan en que los cloroplastos intactos se obtienen utilizando solución hipertónica de sacarosa, en cambio el uso de agua u otra solución hipotónica acompañada de trituración vigorosa provocan la ruptura de los cloroplastos obteniéndose así los fragmentos de cloroplastos. Los métodos descritos son satisfactorios para preparar suspensiones de cloroplastos a partir de hojas de espinaca, tabaco y algunas otras especies y también a partir de algunas algas. INSTRUCCIONES GENERALES Todas las operaciones se deben realizar a 0°C o a temperaturas cercanas a 0°C (4°C). Se debe lavar varias veces las hojas recientemente colectadas o almacenadas en el frío. Se les deja escurrir y se les coloca en una bolsa plástica en un cuarto frío durante unas horas hasta que las hojas se hinchen. Luego se remueven los peciolos y las levaduras y se secan las hojas entre papel filtro. Si se utilizan algas, estas deben ser lavadas por filtración o centrifugación. Examine las suspensiones de cloroplastos bajo el microscopio (400 a 1000x) antes de usarlas.

91

Manual de Prácticas de Bioquímica MATERIAL Centrífuga Homogenizador de cuchillas Tejido de nylon o gasa Tubos de ensayo Fiolas Sacarosa 0.5 M Solución buffer fosfato de potasio (solución 0.1 M de KH2PO4 en sacarosa ajustada a pH 6.5) Medio de sucrosa (solución de EDTA en solución buffer fosfato 10 mM, ajustada a pH 6.5) METODO DE TRABAJO 1. Cloroplastos enteros a partir de hojas de espinaca. En la licuadora homogenice 100 g. de hojas de espinaca bien lavadas con 100 ml. de medio de sucrosa por no más de 3 min., poniendo al máximo de velocidad las cuchillas del homogenizador. Filtrar el homogenizado verde a través de una doble capa de tejido de nylon o gasa para remover las paredes celulares y fibras. centrifugar el filtrado a 200 xg por 5 min, para remover las partículas extrañas y las células intactas. Desechar el precipitado. El sobrenadante se centrifuga a 600 xg por 12 min para sedimentar los cloroplastos intactos. Descartar el sobrenadante. El precipitado se resuspende con 20 ml de sucrosa 0.5 M fría y se centrifuga de nuevo a 600 xg durante 12 min. Descartar el sobrenadante. El sedimento así obtenido constituye los cloroplastos enteros. Resuspenda los cloroplastos en 20 ml de sucrosa u otro medio hipertónico (medio de reacción helado) agitándolo suavemente con una varilla de vidrio y almacenándolo sobre hielo hasta cuando lo utilice. Anote el volumen obtenido: 2. Aislamiento de cloroplastos desintegrados a partir de hojas de espinaca. Homogenizar 100 g. de hojas de espinaca en 100 ml de agua destilada a máxima velocidad por 3 a 5 min. Filtra el homogenizado a través de una doble capa de tejido de nylon o gasa. Centrifugar el filtrado a 600 xg por 12 min y descarte el sedimento. Centrifugar el sobrenadante a 15000 xg por 15 min. Descartar el sobrenadante, suspenda el sedimento en agua, centrifugue y descarte el sobrenadante. Resuspenda el precipitado el cual contiene los cloroplastos desintegrados en agua u otra solución.

EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE CLOROFILA. FUNDAMENTO La concentración de clorofila de una suspensión de cloroplastos, de fragmentos de cloroplastos o de algas intactas se puede determinar midiendo la densidad óptica en un extracto de metanol o de acetona. MATERIAL Centrífuga Tubos de ensayo Metanol Acetona al 80% METODO DE TRABAJO 1. Extracto con Metanol. Centrifugue 1 ml de la suspensión verde oscura por 20 min a 20000 xg por 20 min y descarte el sobrenadante. Suspenda el sedimento en 5.0 ml de metanol absoluto a la temperatura del laboratorio, centrifugue y decante el metanol sobrenadante. Extracte el sedimento dos veces, y diluya hasta un volumen final de 20 ml con metanol. a. Método de Warburg. Determine la densidad óptica del extracto de metanol a 578 nm en una cubeta de 1 cm. 92

Manual de Prácticas de Bioquímica Cálculo:

b. Método de Mackinney. Determine en una cubeta de 1 cm., la densidad óptica del extracto de metanol a 665 nm y a 650 nm, la absorción máxima para la clorofila "a" y para la clorofila "b". Cálculo:

-----------------------------------------------------------------------------

Nota: 1 mg de clorofila/ ml = 1.11 x 10-3 M. Método de Warburg

Método de Mackinney

D.O. 578 D.O. 660 D.O. 665 Realice los cálculos necesarios para determinar los mg de clorofila por ml. 2. Extracto con Acetona. Agregue 1 ml de la suspensión de cloroplastos a 10 ml de acetona al 80% v/v en agua, mezcle fuertemente. Filtre a través de papel Whatman N° 1 y recoja en un matraz volumétrico de 25 ml. enjuague los tubos con 5 ml de la solución acuosa de acetona usándola luego para lavar el papel filtro. Repita el lavado una vez más y completa hasta la marca de 25 ml con acetona al 80% v/v. Mida la extinción de la solución verde a 652 nm contra un blanco de solvente. Cálculo:

D.O. 652 Bl Muestra

EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE HILL FUNDAMENTO La síntesis de carbohidratos a partir de CO 2 y agua se da en dos etapas, reacción luminosa y reacción oscura. La reacción luminosa que se demuestra en este experimento se efectúa solo en presencia de luz visible, que es absorbida por la clorofila de los cloroplastos. Los electrones de la clorofila son llevados a niveles más altos de energía y retornan al estado inicial por una serie de reacciones semejantes a las de la cadena respiratoria mitocondrial. Durante este proceso de transporte de electrones se produce ATP. Al mismo tiempo se producen equivalentes reductores en forma de NADPH2 y se libera O2. La fotólisis del agua o "Reacción de Hill" se define como una reacción de oxidoreducción dependiente de luz, catalizada por cloroplastos, fragmentos de cloroplastos, o en algunos casos, células vegetales intactas, en la que el agua es el donador de hidrógeno, se produce oxígeno, y alguna otra sustancia. El CO 2 (reactivo oxidante de Hill es el aceptor de 93

Manual de Prácticas de Bioquímica hidrógenos. La reacción lleva el nombre de Robert Hill, quien fue el primero en observar la reducción del oxalato férrico por cloroplastos iluminados (aislados). La reacción de Hill se puede estudiar: a) siguiendo la evolución del oxígeno, b) por el cambio de la concentración del ion hidrógeno, c) por el cambio del potencial de óxido-reducción; y d) por la reducción de un oxidante. En este experimento usamos el 2,6-diclorofenolindofenol como un aceptor artificial de hidrógenos. La reducción del colorante no se efectúa en la oscuridad. Tampoco se aprecia reducción cuando se usa cloroplastos hervidos. La lenta oxidación espontánea del 2,6-diclorofenolindofenol permite usar una cubeta abierta (de 1 cm. de trayectoria de luz y de 5 a 10 ml de capacidad), como un vaso de reacción o un tubo de ensayo. Sobre la cubeta se enfoca un rayo de luz que proviene de un foco de 100 watt. La cubeta de reacción, a su vez está sumergida e un baño de agua a temperatura constante. MATERIAL Fotocolorímetro Tubos de ensayo Cubetas de vidrio Focos de 100 watt Mezcla de reacción (buffer fosfato de potasio 0.02 M pH 6.5, que contiene KCl 0.05%) 2,6diclorofenolindofenol 0.1 M Ácido Ascórbico Preparación de cloroplastos: diluya los cloroplastos enteros o fragmentados con la mezcla de reacción hasta obtener una concentración de clorofila de aproximadamente 5 mg/ml. METODO DE TRABAJO Mezcle 1.0 ml de suspensión verdosa de cloroplastos con 4.0 ml de la solución de 2,6diclorofenolidofenol. Prepare cuatro tubos de la misma forma. Coloque el primer tubo en la oscuridad durante el experimento. Al segundo tubo añada suficiente ácido ascórbico para reducir completamente el colorante y lea inmediatamente la extinción a 520 nm; esta solución reducida nos da una lectura cero en el instrumento. Lea la extinción del tercer tubo (lectura inicial) frente al al segundo tubo. Introduzca el cuarto tubo (tubo experimental) en el baño de temperatura constante y dejar 5 min en la oscuridad para que se establezca el equilibrio térmico. Para poner en marcha la reacción, se retorna el aparato a la luz (frente al foco de 100 watt). Siga la reducción del colorante midiendo la extinción de las muestras retiradas a intervalos convenientes hasta un tiempo de 30 min. Al final del experimento, lea la extinción del tubo que guardó en la oscuridad. La diferencia entre la lectura inicial y la lectura cero es proporcional al cambio de la DO cuando todo el colorante está reducido. Puesto que se conoce la concentración del colorante, calcule el número de micromoles de colorante reducido. Con los valores de densidad óptica obtenidos durante los 30 min de experimentación, haga una gráfica colocando los datos de densidad óptica en el eje vertical y el tiempo en minutos en el eje horizontal.

EXPERIMENTO 4. HERBICIDAS: INHIBICION DE LA REACCION DE HILL FUNDAMENTO La intensa búsqueda y desarrollo de la industria de agroquímicos, en los 25 años pasados, ha dado lugar a un amplio rango de herbicidas para el control de malezas. Se han hecho considerables esfuerzos para examinar su absorción y translocación en plantas, su destino molecular y los mecanismos bioquímicos a través de los cuales ejercen su actividad herbicida. Moreland indica que muchos herbicidas parecen no específicos y que su 94

Manual de Prácticas de Bioquímica fitotoxicidad es una expresión de varias respuestas bioquímicas deletéreas. Sin embargo, se han revelado algunos sitios bioquímicos particularmente sensibles, sobre los cuales son efectivas concentraciones muy bajas de un herbicida apropiado. La inhibición de la reacción de Hill por amidas sustituidas (ureas, fenilcarbamatos y acilanilidas), s-triazinas y uracilos es un buen ejemplo. METODO DE TRABAJO Los métodos para la preparación de cloroplastos y la reacción de Hill ya han sido descritos: aquí sólo es necesario indicar algunas alternativas adoptadas. La lechuga rinde preparaciones de cloroplastos con buena actividad de Hill y es fácil de conseguir. Cada lechuga provee unos 100 g de tejido foliar útil. Los cloroplastos se aislan por maceración y centrifugación a 4ºC en un cuarto frío. La mezcla de reacción para determinar la actividad de Hill comprende 3 ml de solución salina “alternativa”, 3 ml de DPIP 1 mM, 0.2 ml de etanol o herbicida en solución etanólica, suspensión de cloroplastos (el volumen se ajusta de modo que la preparación exhiba una velocidad no inhibida de reducción del colorante de unos 0.2 umol/min) y agua para un volumen final de 10 ml. La reacción se realiza a 24ºC preincubando los componentes más voluminosos de la mezcla (solución salina, agua y DPIP) en tubos de colorímetro a esta temperatura. El herbicida y los cloroplastos se añaden inmediatamente antes del ensayo. La temperatura no variar más 1ºC. La reacción se sigue iluminando el tubo por periodos de 15 o 30 segundos y registrando, entre sucesivas iluminaciones, la disminución en la absorción de la luz roja. Como referencia se usa un tubo no iluminado, que contiene todos los componentes de la mezcla de reacción y un exceso de ascorbato para reducir el DPIP.

CUESTIONARIO 1. Explique en qué se diferencia el fotosistema I del fotosistema II. 2. Algunas bacterias degradan H2S en vez de H2O durante la fotosíntesis de modo que despiden azufre. Fue durante sus investigaciones acerca de estas bacterias cuando Van Niel se percató de que el oxígeno desprendido por las plantas superiores durante la fotosíntesis proviene del agua y no del CO 2. Qué razonamiento condujo a Van Niel a esa conclusión? 3. Los siguientes datos, describen la cinética de la incorporación de CO 2 por la enzima rubisco en presencia de N2 y con O2 puro. Determine si el O2 es un inhibidor competitivo o no competitivo. [CO2] (mM)

Con N2

Con O2

0.20 0.10 0.067 0.050

16.7 12.5 8.3 7.1

10 5.6 4.2 3.2

95

Manual de Prácticas de Bioquímica PRÁCTICA N°13 HIDROLISIS ENZIMATICA DE LOS LIPIDOS POR LIPASA PANCREATICA FUNDAMENTOS Gran parte de los alimentos que ingiere un individuo está constituido por grasas, en los cuales los triglicéridos constituyen un 90%. Los triglicéridos a nivel del intestino proximal, se hidrolizan en sus componentes debido a la acción de la LIPASA PANCREATICA, cuya acción se incrementa por la presencia de sales biliares que favorecen su emulsión. La lipasa pancreática actúa en un rango de pH de 7.8 a 8.0. Los triglicéridos se hidrolizan en ácidos grasos, glicerol, monoglicéridos y diglicéridos. Todos estos componentes son emulsionados hasta pequeñas micelas que se absorben fácilmente.

Los aceites son lípidos constituidos básicamente de ácidos grasos insaturados, como el palmítico, esteárico y el ácido mirístico. La hidrólisis de los triglicéridos del aceite de oliva usando pancreatina (extracto de enzimas pancreáticas) liberará ácidos grasos que podrán ser titulados. EXPERIMENTO N° 1. HIDROLISIS DEL PANCREATICA.

ACEITE DE OLIVA POR

LA LIPASA

MATERIALES Tubos de ensayo Baño maría Pipetas Buffer fosfato pH 8.0: A 100.00 ml de fosfato monopotásico 0.2 M, se le agrega 93.6 ml de NaOH 0.2 M y se completa a 400.00 ml con agua destilada. Solución de sales biliares al 1% en buffer fostato pH 8 Solución de pancreatina al 1% en suero fisiológico o buffer fosfato pH 8.0 Fenolftaleína al 0.1% Hidróxido de sodio 0.01 N. Emulsión de aceite: Agregar 5 gotas de fenolftaleína a 100.00 ml de aceite de oliva y la cantidad suficiente de hidróxido de sodio 0.01 N para neutralizar. Se detiene la titulación cuando aparece un color rosa tenue. METODO DE TRABAJO Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N°

1

2

3

4

5

6

Emulsión de aceite

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

Buffer fosfato pH 8.0

2.0

2.0

-

-

-

-

Sol. de sales biliares

-

-

2.0

2.0

-

-

2.0

-

2.0

-

2.0

-

Sol. pancreatina hervida

-

2.0

-

2.0

-

2.0

Agua destilada

-

-

-

-

2.0

2.0

Sol. pancreatina

96

Manual de Prácticas de Bioquímica Mezclar y colocarlos en baño maría a 37 °C durante 30 min, agitando los tubos a intervalos. Al finalizar el tiempo de incubación, retirar los tubos del baño maría y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína y realizar la titulación de ácidos grasos liberados, por acción de la lipasa sobre las grasas, con NaOH 0.01 N hasta que aparezca una coloración rosada. Anotar el volumen de álcali gastado en cada tubo. Calcular el número de equivalentes de ácidos presentes en cada tubo. 1

2

3

4

5

6

ml de NaOH gastados Equivalentes de ácido

EXPERIMENTO N° 2. HIDROLISIS DE LOS LIPIDOS DE LA LECHE POR LA LIPASA PANCREATICA. MATERIALES Tubos de ensayo Baño maría Erlenmeyer Pipetas Buffer fosfato pH 8.0: A 100.00 ml de fosfato monopotásico 0.2 M, se le agrega 93.6 ml de NaOH 0.2 M y se completa a 400.00 ml con agua destilada. Solución de sales biliares al 1% en buffer fostato pH 8 Solución de pancreatina al 1% en suero fisiológico o buffer fosfato pH 8.0 Fenolftaleína al 0.1% Hidróxido de sodio 0.01 N. Leche hervida y diluida dos veces METODO DE TRABAJO En dos erlenmeyer de 50.0 ml se colocan 10.0 ml de leche y 1.0 ml de lipasa en cada uno. A continuación, a uno de ellos se le añade 1.0 ml de agua destilada y al otro 1.0 ml de solución de sales biliares y se mezcla rápidamente aspirando con la pipeta. De cada matraz se toman 2.0 ml de mezcla y se colocan en tubos de ensayo, se le añade 2 gotas de fenolftaleína y se valora con NaOH 0.01 N hasta la aparición de un color rosado tenue. La mezcla que quedó en los matraces se incuban a 37 °C y a intervalos de 15 min se toman alícuotas de 2.0 ml y se valora con NaOH 0.01 N. La cantidad de álcali consumido para la neutralización de los ácidos grasos libres formados en el curso de la hidrólisis de la grasa se determina por la diferencia entre los resultados de la primera y las siguientes valoraciones. En base a los datos obtenidos realice un gráfico de la acción de la lipasa frente al tiempo, con y sin sales biliares. Tiempo 0 15 30 45 60

Gasto de NaOH

Con Sales Biliares

Sin Sales Biliares

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Manual de Prácticas de Bioquímica CUESTIONARIO 1. En la solución de pancreatina además de la lipasa, existen otras enzimas que actúan sobre lípidos?. Explique cómo actúa cada una de ellas. 2. Explique qué papel desempeñan las sales biliares en la hidrólisis de los lípidos. 3. Realice un esquema donde se aprecie la absorción y digestión de los triacilglicéridos. 4. Investigue que enfermedades se producen por deficiencia de enzimas y cofactores de la oxidación de los ácidos grasos.

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Manual de Prácticas de Bioquímica PRÁCTICA Nº 14 DETERMINACIÓN DE UREA EN MATERIAL BIOLÓGICO OBJETIVOS  Dosar urea en muestra de orina  Demostrar que la enzima ureasa puede ser utilizada como reactivo específico para la determinación de un metabolito como la urea  Utilizar el reactivo de Nessler en la determinación de amonio  Reforzar lo aprendido sobre aplicación de los métodos fotocolorimétricos  Reforzar los cálculos que implican dilución y factores de corrección FUNDAMENTOS La urea es hidrolizada catalíticamente por la ureasa dando lugar a los productos CO 2 y NH3 que en solución acuosa forman H2CO3 y NH4OH. Estos últimos reaccionan entre sí dando carbonato de amonio. El reactivo de Nessler reacciona con el amoniaco liberado, formando rápidamente un complejo cuya coloración va desde el amarillo hasta el anaranjado intenso, dependiendo de la concentración de amoniaco presente. Este complejo de color, permanece en solución coloidal pero flocula cuando se le deja en reposo, por lo cual se recomienda la inmediata lectura después de la adición del reactivo. El mecanismo de reacción no está del todo aclarado y se admite la formación de H2NHg2I3. La sensibilidad de la técnica espectrofotométrica cuantitativa con el reactivo de Nessler oscila entre 10 a 90 g de nitrógeno. La tasa normal de urea excretada en los mamíferos es de 20 a 30 g en 24 horas. Balance nitrogenado en mamíferos: la urea es el principal producto de excreción nitrogenado en los mamíferos, siendo sintetizada en el hígado (ciclo de la urea) a partir del amoniaco resultante de la desaminación oxidativa de los aminoácidos y a partir de la hidrólisis de los grupos amida presentes en la glutamina y en la asparragina. Este metabolito es excretado por los riñones y su determinación tanto en sangre como en orina indica el estado del balance nitrogenado en los mamíferos. REACTIVOS Solución de ureasa Reactivo de Nessler Solución patrón de amonio PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS 1. Solución de ureasa: disolver 150 mg de ureasa en 100 ml de solución de EDTA al 1%, pH 6.5 2. Reactivo de Nessler: Solución A: disolver 12 g de bicloruro de mercurio en 100 ml de agua destilada a 60ºC. Solución B: disolver 14.8 g de ioduro de potasio en 100 ml de agua destilada a 60ºC. Mezclar las dos soluciones para obtener un precipitado rojo de ioduro de mercurio. Sedimentar y lavar el precipitado varias veces con agua destilada. Adicionar 14 g de ioduro de potasio y agua destilada en cantidad suficiente para disolver el precipitado. Pasar a un balón de 200 ml y agregar 40 g de hidróxido de sodio exento de carbonato, o sea, una solución de NaOH al 40% p/v. completar el volumen a 200 ml. Dejar en reposo en frasco oscuro, durante 48 horas, y decantar el líquido límpido (reactivo de Nessler) en otro frasco oscuro. 3. Solución patrón de sulfato de amonio [(NH 4)2SO4] a 472 mg% (equivalente a 100 mg de nitrógeno): disolver 472 mg de sulfato de amonio desecado al vacio, por 24 horas, en un volumen final de 100 ml con solución de H 2SO4 0.1 mol/L. Para obtener la solución de trabajo, diluir 100 veces la solución original de modo que 10 ml contengan 100 g de nitrógeno disuelto en H2SO4 0.1 mol/L. 99

Manual de Prácticas de Bioquímica Anotar el volumen urinario de 24 horas y diluir la orina con agua en la proporción de 1/100, 1/150, 1/200 y 1/250. PROCEDIMIENTO A. Curva de calibración con solución patrón de sulfato de amonio a 472 mg% (= 100 mg% de nitrógeno). 1. En una gradilla, colocar 6 tubos de ensayo y adicionar los reactivos que se indican en la tabla siguiente. Tubo Solución patrón de (NH4)2SO4 (ml) Agua destilada (ml) Reactivo de Nessler (ml)

Bl 1.0

1 1.5 10.0 1.0

2 2.0 8.0 1.0

3 4.0 6.0 1.0

4 6.0 4.0 1.0

5 9.0 1.0 1.0

2. Mezclar el contenido de cada tubo. Esperar 1 minuto y leer la absorbancia a 415 nm (filtro azul). Calibrar el aparato con el tubo blanco. Determine el factor de calibración. UK

UK neta

Ab

[Nitrógeno] g

Fc

Bl 1 2 3 4 5 3. Trazar un gráfico, ploteando las concentraciones de nitrógeno (g) en el eje de las abscisas y las respectivas lecturas de absorbancia en el eje de las ordenadas.

B. Dosage de urea en orina 1. En dos tubos de ensayo colocar los reactivos que a continuación se indica: al tubo 7 (blanco de la muestra) adicionar 1.0 ml de agua destilada y 2 gotas de solución de ureasa. Al tubo 8 (muestra) adicionar 1.0 ml de orina y 2 gotas de solución de ureasa. 2. Incubar a 50ºC, durante 30 minutos 3. Después de la incubación, centrifugar los contenidos de los tubos y, a los sobrenadantes, añadirles 9.0 ml de agua destilada y 1.0 ml de reactivo de Nessler. Mezclar y leer, después de 1 minuto, la absorbancia del tubo 8 (muestra) a 415 nm (filtro azul), calibrando el parato con el tubo 7 (blanco de la muestra). 4. Calcular el resultado en gramos de urea por 24 horas. NOTA: Para transformar miligramos de nitrógeno ureico en miligramos de urea basta multiplicar por el factor 2.14 (sabiendo que la masa molecular de la urea es 60 y la masa del nitrógeno molecular es 28, la razón 60/28 es 2.14).

CUESTIONARIO 1. Empleando la ecuación anterior, calcular la tasa de excreción de urea suponiendo una orina diluida 50 veces en un volumen urinario de 24 horas de apenas 450 ml. 2. Justifique la utilización de sulfato de amonio como patrón en la determinación de urea. 3. Qué componente de los productos de la reacción catalizada por la ureasa es analizado con el reactivo de Nessler?

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Manual de Prácticas de Bioquímica 4. Porqué la necesidad de dos tubos blancos, el tubo 1 y el tubo 7, para el ensayo? 5. Si la concentración determinada en la muestra excediera el límite de sensibilidad de la técnica (90 g de nitrógeno), qué procedimiento se debe adoptar?.

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