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Autor: Dra. Thelvia I. Ramos Gómez Dra. en Medicina. Especialista de 2do grado en Genética Clínica y Molecular Máster en Tendencias de la Biotecnología Contemporánea Mención Ensayos Clínicos.

Objetivos de la Clase General:  Identificar los aportes del Genoma Humano y su repercusión en la Biotecnología Humana. Específicos  Analizar los antecedentes y la historia de la determinación del Genoma Humano.  Identifica los aportes de las investigaciones realizadas que permitieron elaborar la secuenciación del genoma humano. Conocer la genómica estructural, funcional y evolutiva con sus respectivas ramas.  Caracterizar la era post-genómica y sus avances a partir del conocimiento de los marcadores poblacionales.  Conocer la utilidad práctica y el impacto en la salud y otras áreas de la biología de los marcadores poblacionales.

Resultados del Aprendizaje.  Aplica los conocimientos adquiridos sobre el

genoma Humano en la asignatura de Biotecnología Humana.  Comprende la responsabilidad ética y moral de la investigación en humanos.  Comprende temas contemporáneos relacionados con la Genómica, a través del Genoma Humano y su aplicación en las investigaciones.

Contenido de la Case 1. Antecedente del Genoma Humano. 2. Aporte del proyecto Genoma Humano:  Genómica estructural  Genómica Funcional  Genómica Evolutiva. 1. Era Post- Genómica variaciones genéticas. 2. Variaciones Moleculares:  SNPs  HLA  Ancestralidad por mezcla génica

Vinculación de la genómica a través de los aportes científicos del genoma Humano y la era post genómica con la Biotecnología Humana. La secuencia del genoma humano ha marcado un hito en la Historia de la Humanidad. El desarrollo tecnológico y el conocimiento de los genes humanos, permite en la actualidad analizar a mas de 30.000 genes en un único experimento. Este avance biotecnológico modificará progresivamente y cada vez con más fuerza la práctica de la medicina en las próximas décadas y en este contexto es imprescindible que se incorporen desde ahora estos conocimientos y tecnologías.

Introducción

Niveles de análisis de la función génica NIVEL DE ANALISIS

GENOMA

DEFINICION

METODOS DE ANALISIS  Secuencia de ADN

Conjunto de Genes de un organismo y sus organelos

Independiente de contexto

TRANSCRIPTOM A

Conjunto de RNA mensajeros presentes en una célula, tejido o organo

Depende del contexto

 Northern  SAGE  Hibridización de arrays

PROTEOMA

Conjunto de proteínas presentes en una célula, tejido o organo Conjunto de metabolitos proteínas presentes en una célula, tejido o organo

Depende del contexto

 Geles de dos dimensiones, Espectrometria de masas  Sistema two-hybrid  Espectroscopia infraroja  Espectrometria de masas  Resonancia magnética nuclear

METABOLOMA

Depende del contexto

Introducción

1 ó varios genes

Cientos o miles de genes

Introducción

Familias

Mapeo Genético fino

Mapeo físico & clonación

mRNA

Identificación del gen

Clones Marcadores genéticos

Búsqueda de mutación Gen de interés

Introducción

¿ Cuesta trabajo entender esto? ¿verdad?

Nos sentimos bastante diferentes a nuestros antepasados, tanto desde el punto de vista físico como intelectual

Genes

Accidentes de tránsito

Cáncer de piel

Cáncer de pulmón

Enfermedades cardiovasculares

Asma

Diabetes

Enfermedad de Alzheimer

Cáncer de mama

Cáncer de colón

Hemofilia Fibrosis quística

Introducción

Medio ambiente

Desarrollo

2000: Análisis del Genoma Humano

HGP

Celera

Tres Subproyectos Específicos  El mapa genético  La obtención del mapa físico humano, colección de clones de todos los cromosomas.  La secuenciación del genoma humano y caracterización estructural de todos los genes que lo componen.

Desarrollo

Secuenciar el genoma humano es conocer el orden en que se encuentran los nucleótidos de adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T) en el ADN.

Desarrollo

• 2000:–Borrador –Secuencia del 90% del genoma eucromático –Muchos espacios (147,821) –Errores en el ensamblaje Nature. 2000 Jun 29;405(6790):981.

Desarrollo

¿Qué hemos aprendido de la secuenciación del genoma humano? Solo el 1,5%, es decir, 48 millones de nucleótidos de un total de 3.200 millones de genes codifica a proteínas. La mayor parte es ADN basura (junk ADN) ¿ Existirá alguna función para este ADN?

GCGGCCGCATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCGCGCTTGCAGCCAAGCTAATTCCGGGCGAATTTC TTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTA TTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGCGGCCGCATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGG TTTTTTGCGCGCTTGCAGCCAAGCTAATTCCGGGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATAC AAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGCGGCCGCATAA CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCGCGCTTGCAGCCAAGCTAATTCCGGGCGAATTTCTTATGATTTATG ATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAA CTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGCGGCCGCATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCGCG CTTGCAGCCAAGCTAATTCCGGGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAA GTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGCGGCCGCATAACTAGCATAA 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Mapa físico

ESTRUCTURA DE UN GEN

Desarrollo

Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico

Promotores Sitio de inicio de la Transcripción

Realzadores Exones

Intrones

< 100 Kb

Sitio de terminación de la Transcripción

La función del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIÓN (FT) que activan a las ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripción General (se unen a secuencias promotoras genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras específicas). Los FT pueden encenderse o apagarse en respuesta a estímulos del entorno del individuo. Entre los promotores de los genes que desarrollan la capacidad cerebral o talento de los individuos están la alimentación, la salud, el estímulo temprano con experiencias motivadoras (el juego), el amor.

Desarrollo

Región pseudoautosómica. Eventos de recombinación

Genética. 2000;109(1-2):113-23.

Desarrollo

¿Qué diferencia a un organismo de otro? ADN ARN

Surge: De la regulación génica Proteína Del procesamiento de proteínas En las interacciones entre las proteínas

Proteómica: caracterización sistemática a

gran escala de las proteínas presentes en una célula, tejido u organismo determinando las proteínas específicas para los distintos genes así como la función de las mismas Expert Rev Proteomics. 2004 Jun;1(1):19-28

“Splicing alternativo”

Desarrollo

Fig 24.4 Alternate splicing of transcripts from the rat troponin T gene.

Result in slightly different action of muscle Nat Commun. 2014 Feb 28;5:3306

Desarrollo

GENÖMICA INDIVIDUAL ¿Somos todos Mutantes? El 99% del genoma humano es igual para todos, patrones comunes PGH

Solo el 0,1% se caracteriza por patrones de cambio (SNPs) HapMap

…. PERO ESE 0,1% DE CAMBIO DETERMINA LA GENÓMICA INDIVIDUAL

Desarrollo

¿Cuántos genes tenemos?

H. sapiens

21626 Genomics. Genes (Basel). 2014 Jan 24;5(1):33-50

Desarrollo

GENOMAS

El genoma de un organismo es el juego completo de ADN. La planificación del Proyecto Genoma Humano se inició en 1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000, se presentó el 90% del borrador con la secuenciación de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases. Los genes son un 2% del genoma humano. Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

IDENTIDAD GENÉTICA

60% De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila.

20%

70%

95% idéntico

Humanos 30,000 genes

Chimpancé 30,000 genes

Ratón 30,000 genes

A. thaliana 25,000 genes

C. elegans 19,000 genes

D. melanogaster 13,000 genes

Genomes Project. Genome Biol Evol. 2014 Mar 28

Desarrollo

Genómica Evolutiva La genómica evolutiva estudia los mecanismos y procesos que han llevado a la formación de caracteres en el ser humano, desde el nivel de posiciones de un codón hasta la organización y estructura de un organismo.

Am J Hum Genet 69:936–950, 2001

Genómica Evolutiva

Desarrollo

1.23% de diferencia por cambios y sustituciones de nucleótidos o bases nitrogenadas. Los cromosomas 1,4,5,9,12,15,16,17 y 18 del ser humano tienen grandes tramos invertidos . 585 sustituciones con respecto a la respuesta inmune y la reprodución. Inserciones deleciones (Indels), duplicaciones de los dos genomas.

BMC Genomics. 2014 Feb 13;15(1):131

Desarrollo

VARIACIONES GÉNICAS

SNPs STR Microsatélites & VNTR Minisatélites

Elementos transponibles Alteraciones Estructurales

Desarrollo

Variaciones estructurales

Ploidy (Down’s Syndrome)

Inversiones Translocaciones Duplicación de segmentos

Minisatélite: repeticiones en Tándem de una secuencia que varia entre 14 a 100 nucleótidos en extensión

Polimorfismo: número variable de repeticiones Microsatélites: corta secuencias de repeticiones en Tándem, e.g. repeticiones CA

SNP Polimorfismo de simple nucleótido

Polimorfismo: sustitución de un solo nucleótido ( e.g. C A)

Desarrollo

Definición de marcadores moleculares  Una secuencia o fragmento de DNA o proteína que

revela atributos claves de su estado o composición y por tanto puede ser usada para revelar variaciones. Mutación Variación genética a nivel de ADN

Subsecuentemente la mutación que lleva a una Variación genética a nivel de ADN, se refleja en un cambio a nivel de proteína.

Marcadores DNA

Marcadores Proteínas

Desarrollo

Motivación para estudiar las variaciones genéticas.  Genética poblacional. La evolución de las especies y su

historia.  Comprender la genética de la enfermedades, por ejemplo las más comunes y complejas, tales como diabetes, cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas.  Ensayos de identidad, forense y paternidad.  Permitir el tratamiento personalizado. Localización de genes en cromosomas

Marcadores Fenotípicos

Marcadores Moleculares

Desarrollo

Características ideales de los marcadores moleculares  Codominantes (pueden distinguir los      

homocigotas de los heterocigotos) Ensayo no destructivo. Penetrancia completa Expresión fenotípica de aparición temprana Altamente polimórfico Distribución al azar por el genoma. El ensayo puede ser automatizado.

Desarrollo

Variaciones moleculares      

Polimorfismos de simple nucleótido. SNPs Inserciones-delesiones2.Short Indels. Secuencias simples repetitivas. SSR, STR Número variable de repeticiones en tandem. VNTR Número de copias variantes. CNV Pérdida de la Heterocigosidad. LOH

Microsatellite. SSR, STR (2-9 bp repetición core)

Minisatellite. VNTR (10-60 bp repetición core)

Número variante de copias

SNP

Desarrollo

 RESUMEN: Hasta aquí hemos visto todos los

avances que se obtuvieron en la Investigación a través del proyecto genoma.  Ahora vamos a entrar en la Era Post- genómica y todo el desarrollo que se ha suscitado a partir de este conocimiento. Nos vamos a centrar en algunos marcadores dirigidos fundamentalmente a la caracterización de las poblaciones.

Pregunta: 1. ¿ Que marcadores moleculares de caracterización poblacional ustedes conocen que hayan visto en otras asignaturas? 2. Alguno conoce los proyectos o las aplicaciones que estos están teniendo en la Biotecnología Humana.

Desarrollo

Una variación en la secuencia de ADN que ocurre cuando un solo nucleótido (A,T,C o G) es alterado en la secuencia del genoma. •Están distribuidos por todo el genoma y se pueden llagar a hacer mapeos con 1Kb.

Clin Genet. 1999 Oct;56(4):247-58. Review.

Desarrollo

Cuantos SNPs hay en el genoma Humano en la actualidad?  Tasa de mutación humana ~2.5 x 108 mutaciones/sitio/gen.  ~150 mutaciones/genoma diploide/generación.  6.3 billones de personas en el mundo= 945 000, 000, 000, mutaciones en el mundo de hoy. • Con 3 mil millones de nucleótidos = cada

nucleótido en el mundo de hoy está mutado 315 veces.

Nat Biotechnol. 2001 Mar;19(3):209-11.

Desarrollo

Cuantos se han encontrado?

Desarrollo

Que información nos dan los SNPs  Desequilibrio de ligamiento  Recombinación  Estudios de asociación

 Mapeo de fenotipos complejos  Mapeo fino de cromosomas  Eventos demográficos

 Búsqueda de genes candidatos  Estudios de selección.

Desarrollo

Proyecto HapMap  Haplotipo–Grupo de variantes en un cromosoma que tienden a        

heredarse en bloque. Proporciona una colección de SNPs que representan todo el genoma. Estudia la correlación (LD, desequilibrio de ligamiento) entre los SNPs. Sirve de guía para los estudios de asociación del genoma completo. Lanzado en el 2002. En la primera fase se genotiparon1.1 millones de SNPs de 296 individuos de cuatro grupos étnicos. La segunda fase se genotiparan 4.6 millones de SNPs. El objetivo es encontrar la mayoría de los SNPs con frecuencias de al menos 5% en los principales grupos étnicos de la población humana y realizar el mapa de LD por grupo. Permite reducir el número de SNPs en los estudios de asociación al crear los Tag SNPs Genomics Proteomics Bioinformatics. 2013 Apr;11(2):77-85.

Desarrollo

NATURE |VOL 411 | 10 MAY 2001 |

Proyecto HapMap LD LD y puntos calientes

Tag SNP

Desarrollo

Principales técnicas aplicadas para la detección de marcadores moleculares:  Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)  Electroforesis  Hibridación

 Secuenciación de DNA  Microarrays  Taqman

 Pirosecuenciación  Espectrometría de masas

Desarrollo

HLA  Región multigénica, altamente polimórfica.  Participación en la tolerancia a los

trasplantes.  La región cromosómica contiene más de 40 genes y pseudogenes y ocupan un largo segmento de DNA, con una extensión de 3.500-4.000 kb.  Los productos de estos genes se expresan en la membrana celular como heterodímeros polipeptídicos de tipo globulinas.  Están asociados a la etiología de las enfermedades.

. Int J Legal Med. 119(3):137-41, 2005.

Desarrollo

Estructura de los genes Clase I y II En su parte superior y media se muestra el cromosoma 6 y una extensión de su brazo corto indicando la región del MHC, y en su porción inferior la ubicación de los genes clase II.

Desarrollo

Donde se localiza la variabilidad

Desarrollo

Asociaciones de HLA con enfermedades

Desarrollo

J Neuroimmune Pharmacol. 2013 Sep;8(4):857-66

Estudio población cubana

Desarrollo

Annals of Human Biology, November–December 2010

Desarrollo

Resumen  El complejo HLA está asociado a numerosas

enfermedades. Es un factor de predisposición.  Marcador altamente polimórfico y con un fuerte desequilibrio de ligamiento, útil en estudios de asociación.

Desarrollo

ANCESTRALIDAD POR MEZCLA GÉNICA La migración del Homo sapiens sapiens y el LD.

Relación del desequilibrio de ligamiento con la distancia de áfrica. Science. 2014 Feb 14;343(6172):747-51.

Desarrollo

Historia del nuevo mundo.

Desarrollo

Creación de una población mezclada  Se crean nuevos bloques de genes en desequilibrio de ligamiento de mayor tamaño pertenecientes a la población de origen.  Estos bloques de más de 20 CM se distribuyen de manera no aleatoria.  Estos bloques son temporales. Am, J. Phys. Anthropol. 28(suppl.):239, 1999

Desarrollo

Tipos de marcadores seleccionados Tipo Pueden ser genes, SNPs, STRs, RFLP y VNTR Aplicación  Estudios antropológicos: 100 a 200 marcadores, incluyendo mtDNA y cromosoma Y.  Control de estratificación en la población: 100 a 200 marcadores  Estudio de asociación a genoma completo: 2100 marcadores SNPs.

Am J Hum Genet 73:1402–1422, 2003

Desarrollo

Ventajas del uso de admixture  Se puede identificar y controlar la estratificación en las muestras.  Se pueden utilizar entre 200 y 500 veces menos marcadores para el mapeo de genes en enfermedades con diferencias en diferentes poblaciones.  Menor número de muestras para mapeo de genes.  Se pueden hacer estudios de ligamiento de solo casos.

Limitaciones Hay que conocer las frecuencias alélicas de las poblaciones.

 No se puede aplicar para alelos con menos del 10% de frecuencia en una de las poblaciones ancestrales  Solo se puede aplicar en poblaciones mezcladas recientemente

Desenlace

Aplicaciones del Admixture Determinación del riesgo genético dadas las características de admixture individuales. Detectar ligamiento de genes que se expresan diferente en diferentes grupos raciales. Controlar la estratificación de la población en los estudios caso control. Modelado de la estructura haplotípica del genoma en estudios caso control. Estudios antropológicos, mezclas y migraciones de poblaciones.

Desenlace

En el Ecuador Análisis de frecuencias alélicas de 32 microsatélites (STR) en muestras de 9 poblaciones ecuatorianas a través de la Técnica de PCR múltiplex. Apunte-Ramos K1, Nicholls-Andrade G2 , Guevara-Espinoza A2 , Ramos-Gómez T1. 1

Escuela Politécnica del Ejército-Carrera de Ingeniería en Biotecnología General del Estado-Laboratorio de ADN.

2 Fiscalía

Desenlace

Conclusiones Como pueden observar han sido mucho los aportes obtenidos a través del proyecto Genoma Humano, que ha permitido un gran paso de avance en las Biotecnología Humana al aplicarlo como una herramienta más. En la próxima clase vamos a continuar con el desarrollo de otros marcadores pero ya dirigidos más bien a la respuesta a los fármacos y como la respuesta genética e inmunológica de un individuo lo predispone a una respuesta ante un fármaco. Además veremos a través de estos marcadores la aplicación que tiene para el apoyo de una medicina individualizada.

Bibliografía.

Desenlace

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